專利名稱：：用于合成羅丹明-標記的寡核苷酸的試劑的制作方法用于合成羅丹明-標記的寡核苷酸的試劑1.相關申請的交叉引用此申請根據35U.S.C.§119(e)，要求2006年3月31日提出申請的臨時申請第60/787,777號的權利，其公開整體內容上通過引用被合并于本文。2.背景才支術已發現熒光染料作為檢測標記廣泛用于分子生物學、細胞生物學和分子遺傳學的用途。例如，熒光-標記的寡核苷酸現在在多種不同試驗中被使用，所述試驗包括多核苷酸測序、熒光原位雜交(FISH)、針對核酸陣列的雜交試驗、熒光極化研究和核酸擴增試驗，包括用熒光探針和/或引物進行的聚合酶鏈式擴增試驗。一些熒光標記可被連接到新生的(nascent)或完成的寡核苷酸鏈，其使用熒光亞磷酰胺試劑原位合成。例如，熒光素亞磷酰胺試劑是市場可購買的(參見，如，GlenResearchCorporation,Sterling,VA的2006年產品目錄)。在此類試劑中，熒光素環的3'-和6'-環外氧原子用新戊酰基保護以防止副反應。用這些基團對熒光素(fluorescien)環的修飾也使羧酸酯基團以封閉的螺環內酯形式處于3-位，防止質子從羧酸酯貢獻給亞磷酰胺基團，所述貢獻可將此亞磷酰胺基團轉化為好的離去基團，導致試劑分解。熒光素環也對用于氧化新生的寡核苷酸的條件及對以水相銨的處理穩定，所述水相銨的處理為除去核堿基保護基團及從合成樹脂中剪切合成的寡核苷酸的標準方法。遺憾的是，當使用通常用于氧化和脫保護/剪切合成的寡核香酸的試劑處理時，許多羅丹明染料易受化學修飾，消極影響它們的熒光性質。作為結果，羅丹明染料通常被連接到合成、脫保護及從合成樹脂中剪切之后的23寡核苷酸上。這增加了額外的步驟和人力勞動，導致在羅丹明-標記的寡核苷酸的整體合成中，較大的成本和不便。由于這些及其它限制，目前僅存在兩種市場可購買的作為亞石捧酰胺試劑的羅丹明染料四甲基羅丹明("TAMRA")和羅丹明X("ROX")。期待在劑。3.
發明內容在一方面，本公開提供可用于以包括羅丹明染料的標記標記合成的寡核苷酸的試劑，所述羅丹明染料當用適當波長入射光照射時發熒光。標記可包括單一羅丹明染料，或它們可包括染料網絡，其中至少一種染料是羅丹明染料。試劑可用于在寡核苷酸的分步合成中以含有羅丹明染料的標記直接標記合成的寡核苷酸，因此減少為得到以羅丹明染料標記的寡核香酸的必要的操作步驟。此外，因為標記在分步合成中被直接連接到寡核苷酸上，不需要將未耦合標記從標記的寡核苷酸中HPLC分離，所述分離當使用目前可得的合成后羅丹明標記試劑如羅丹明NHS酯時是需要的。試劑可用于在它的3'-端、在它的5-端和/或在一個或多個內部位置上標記寡核苷酸。所得到的標記可被連接到寡核苷酸的端位羥基、連接到一個或多個包括寡核苷酸的核》威基上，或它可位于兩個包括寡核苷酸鏈的核苷酸之間。因此，試劑可采用非核普合成試劑形式(見，如圖3A、3B和5)、核苷合成試劑形式(見，如圖4和6)、非核苦固相支持體形式(見，如圖7)和/或核苷固相支持體形式(見，如圖8A和8B)。合成試劑一般包括標記部分、磷酸酯前體("PEP，，)基團和任選的將磷酸酯前體基團連接到標記部分的連接體。磷酸酯前體基團一般包括官能團，當其在寡核苷酸的分步合成中使用時，在任選的脫保護和/或氧化之后，最終產生核苷酸間磷酸酯鍵結。適于合成核普酸間磷酸酯鍵結的若干類型化學反應和官能團在本領域中已知，且包括，通過例子的方式且非限制，亞磷酸三酯化學反應，其利用亞磷酰胺PEP基團(見，如Letsinger等人，1969,J.Am.Chem.Soc.91:3350-3355;Letsinger等人，1975，J.Am.Chem.Soc.97:3278;Matteucci&Caruthers，1981,J.Am.Chem.Soc.103:3185;Beaucage&Caruthers，1981，TetrahedronLett.22:1859)、磷酸三酯化學反應，其利用2-氯苯基-或2,5-二氯苯基-磷酸酯PEP基團(見，如Sproat&Gait，"SolidPhasesynthesisofOligonucleotidesbythePhosphotriesterMethod，，(用磷酸三酯方法固相合成寡核香酸),在C^go"wc/eori(ie砂"^2￡57'5*，爿Pra"/ca/如raac/z，Gait，編輯，1984，IRLPress，83-115頁)和H-膦酸酯化學反應，其利用H-膦酸酯PEP基團(見，如Garegg等人，1985，Chem.Scr.25:280-282;Garegg等人，1986，Tet.Lett.27:4051-4054;Garegg等人，1986,Tet.Lett.27:4055-4058;Garegg等人，1986,Chem.Scr.26:59-62;Froehler&Matteucci，1986，Tet.Lett.27:469-472;Froehler等人，1986，Nucl.AcidRes.14:5399-5407)。所有這些不同的PEP基團，及隨后發現的PEP基團，可包括本文描述的合成試劑的磷酸酯前體基團。PEP基團的種類對于成功并不重要，且將取決于預期的用于合成標記的寡核苷酸的化學反應。在一些實施方式中，磷酸酯前體基團包括亞磷酰胺基團。任選的連接標記部分和磷酸酯前體基團的連接體實際上可包括對用于合成標記的寡核香酸的合成條件穩定的原子或官能團的任何組合且在結構上可為直鏈、支鏈或環，或可包括直鏈、支鏈和/或環結構的組合。連接體可被設計為具有指定性質，如可在預期條件下被剪切的能力。合成試劑可任選地進一步包括一個或多個合成片斷(synthesishandle),核苷或其它基團或部分可被連接到所述合成片斷上。合成片斷可包括保護基團，其在標記的寡核苷酸的分步合成中可被選擇性地除去，允許在合成的寡核苷酸從樹脂上剪切之前連接部分到合成的寡核芬酸上，或替代地，合成片斷可包括保護基團，其對被用于脫保護合成的寡核苷酸(0liognucloetide)和/或從合成樹脂上剪切合成的寡核苷酸(oliognucloetide)的條件穩定，允許在合成、脫保護和從合成樹脂上剪切之后連接部分到合成的標記的寡核苷酸上。組成包括多于一種合成片斷的合成試劑的合成片斷可相同或不同。在一些實施方式中，合成試劑包括單一的任選的合成片斷，其包括式-ORe的被保護的羥基，其中Re代表對酸不穩定的保護基團。合成片斷可被連接到標記部分，或它可被包括在任選的連接標記部分和磷酸酯前體基團的連接體中。其中式-ORe的合成片斷被包括在任選的連接體中的實施方式，本質上可為非核苷或本質上為核苷，在其后者情況下，連接體包括核苷且合成片斷被在核苷糖部分上的羥基所提供，所述羥基通常為核香糖部分的5'-羥基。其中連接體包括合成片斷的非核普合成試劑的具體非限制性實施方式在圖5中^皮闡述。其中連接體包括合成片斷的核苷合成試劑的具體非限制性實施方式在圖6中被闡述。固相支持體試劑一般包括標記部分、其中Re如上文定義的式-ORe的合成片斷、固相支持體和將標記部分和合成片斷連接到固相支持體上的連接體。合成片斷提供核苷單體試劑可被偶聯到其上的基團。固相支持體試劑可任選地包括一個或多個額外的合成片斷，其可為相同或不同的。適于在寡核苷酸的固相合成中用作為固相支持體的范圍廣泛的各種物質在本領域中已知，其含有適當的官能團，或其可被衍生化以含有適當的官能團，且包括，例如但不限于，可控孔玻璃(CPG)、聚苯乙烯和各種接枝共聚物。所有這些不同種類物質適于在本文描述的固相支持體試劑中用作固相支持體。固相支持體的形狀不重要。實質上可使用任何形狀。例如，固相支持體可為球形或不規則成形的珠、立方體、長方體、圓柱體、圓柱管或甚至是薄片的形式。固相支持體可有孔或無孔。在一些實施方式中，固相支持體是CPG或聚苯乙烯珠。將標記部分和合成片斷連接到固相支持體的連接體包括本質上對通常用于固相合成寡核苷酸的合成條件穩定的原子或官能團的任何組合且在結構上可為直鏈、支鏈或環，或可包括直鏈、支鏈和/或環結構的組合。連接體可纟皮設計為具有指定性質，如在預期條件下可纟皮剪切的能力。在一些實施方式中，連接體包括在指定條件下可被剪切以從試劑剩余物中釋放固相支持體的鍵結。例如，連接體可包括在寡核苦酸合成條件下穩定并對用于脫保護^皮合成寡核苷酸的條件(例如，在55。C或室溫下，在氫氧化銨中溫育)不穩定的鍵結。此類特定可剪切的鍵結在本領域中眾所周知，且包括，例如但不限于，酯、碳酸酯、二異丙基硅氧基醚、改性的磷酸酯等。如上文對合成試劑的描述，固相支持體試劑的連接體可包括合成片斷，且本質上可為核苷或非核苷。非核苷固相支持體試劑的具體非限制性實施方式在圖7中被闡述。核苷固相支持體試劑的具體非限制性實施方式在圖8A和8B中被闡述。本文描述的合成和固相支持體試劑的標記部分包括羅丹明染料。在羅丹明染料的3'-和6'-位的環外氮原子是未被取代的或被單取代的，因此它們被歸為伯胺或仲胺，且進一步被保護基團取代(在它們的3'-和6'-位具有伯胺或仲胺基團的未被保護的羅丹明染料被本文稱作"NH-羅丹明"，而在它們的3'-和6'-位具有保護基團的羅丹明染料被本文稱作"N-保護的NH-羅丹明")。保護基團實質上可為任何特定可除去的基團，其對將被用于合成標記的寡核苷酸的合成條件穩定，例如通常用于固相合成寡核苷酸的亞磷酸三酯化學反應條件。已發現用形成酰胺(如，例如羧酰胺、磺酰胺、磷酰胺等)的基團保護NH-羅丹明的3'-和6'-仲胺或伯胺，允許N-保護的NH-羅丹明以封閉的內酯形式存在，從而允許羅丹明用于寡核芬酸的分步合成中以方便地合成包括羅丹明染料的寡核普酸而不需要合成后操作或純化。如在工作例子中所闡述的，包括此類N-保護的NH-羅丹明的亞磷酰胺試劑在通常用在寡核苷酸分步合成中的溶劑中是可溶的，對多輪DMT脫保護、偶聯、氧化和加帽的條件穩定且也對用濃氫氧化銨的處理穩定，所述濃氫氧化銨的處理是通常用于脫保護任何環外胺保護基團及從合成樹脂上剪切合成的寡核苷酸的條件。保護基團可為不穩定的，且因此在用于除去合成的標記的寡核苷酸的核tt保護基團的條件下可被除去，或可選擇地，保護基團可對這些條件穩定且對其它條件不穩定。在大多數例子中，使用對用于除去合成的標記的寡核苷酸的核堿基保護基團和/或從合成樹脂上剪切標記的合成的寡核苷酸(oligonucleotodie)的條件不穩定的保護基團將可能為需要的。在一些實施方式中，保護基團是式-C(0)R^的酰基，其中R^選自低級烴基、甲基、-CX3、-CHX2、-CH2X、-CH2-ORb和苯基，其任選地被低級烴基、曱基、X、-ORb、氰基或硝基單取代，其中Rb選自低級烴基、吡咬基和苯基且每一個x是卣素基團，通常為氟、氯或溴。在具體的非限制性實施方式中，R"為叔丁基或三氟甲基。標記部分可進一步包括其它被保護的熒光團，以致于N-保護的NH-羅丹明染料是4支大的、能量傳遞染料網絡的成員。此類能量傳遞染料網絡在本領域中眾所周知，且包括熒光團的組合，所述熒光團的光譜性質是匹配的，或所述熒光團彼此間的相對距離適宜，以致于當用適當波長的入射照射激發時，在網絡中的一個熒光團將它的激發能量傳遞給在網絡中的另一個熒光團，其反過來將它的激發能量傳遞給在網絡中的另外一個其它熒光團，以此類推，導致在網絡中的最終受體熒光團發熒光。此類網絡產生具有長的斯托克斯位移(Stokesshifts)的標記。在此類網絡中，將它們的激發傳遞或貢獻給網絡中另一個熒光團的菱光團被稱作"供體"。從另一個熒光團和相關熒光素試劑接收或接受激發能量的熒光團被稱作"受體"。在僅含有兩種染料的染料網絡中，一個染料通常作為供體起作用且另一個作為受體。在含有三個或更多個不同染料的染料網絡中，至少一種染料作為供體和受體兩者起作用。含有兩個、三個、四個或甚至更多染料的能量傳遞染料網絡在本領域中眾所周知(參見，如US2006/057565)。任何用在這些網絡中的可被適合地保護以用在寡核苷酸固相合成中的染料可包括在本文描述的標記部分中。在本文描述的合成和固相支持體試劑的一些實施方式中，標記部分進一步包括N-保護的NH-羅丹明的適當保護的供體。當脫保護時，此類供體將它們的激發能量傳遞給NH-羅丹明以致于當供體被激發時NH-羅丹明發出熒光。在本文描迷的合成和固相支持體試劑的一些實施方式中，標記部分進一步包括N-保護的NH-羅丹明的適當保護的受體。當脫保護時，此類受體從供體NH-羅丹明接受激發能量以致于當供體NH-羅丹明被激發時受體發熒光。供體或受體的種類(identities)將取決于組成標記部分的NH-羅丹明的種類。能夠作為多種羅丹明染料的供體起作用的焚光團的例子在本領域中眾所周知。此類供體的非限制性例子包括氧雜蒽染料(如，例如熒光素、羅丹明和對曱氨基酚)、芘染料、香豆素染料(例如羥基香豆素和氨基香豆素)、*染料、酞菁染料和鑭系(lanthenide)復合物。能夠作為羅丹明染料受體起作用的熒光團的例子也在本領域中眾所周知。此類受體的非限制性例子包括羅丹明染料和菁染料。任何這些可適當保護以在用于合成寡核苷酸的條件下使用的染料，可被用作本文描述的合成和固相支持體試劑中的供體或受體，所述條件如通常用于固相合成寡核苷酸的亞磷酸三酯化學條件。能量從供體傳遞到受體所依據的機制并不重要。對于此類供體-受體對的可行所必要的是受體響應供體的激發而發熒光。標記部分也可包括不發熒光的受體。此類不發熒光的受體可被用于使組成標記部分的NH-羅丹明或其它熒光染料的焚光全部或部分摔滅。此類可作為羅丹明染料(如本文描述NH-羅丹明)猝滅劑起作用的不發熒光的部分的例子包括但不限于，dabcyl、在WO01/86001中描述的各種不發熒光的猝滅劑和在US2005/0164225中描述的各種不發熒光的猝滅劑，其公開通過引用被合并于本文。在一些實施方式中，標記部分進一步包括供體染料，其反過來包括如本文描述的N-保護的NH-羅丹明染料，或其中環外(exocylic)3'-和6'-氧原子被保護基團保護的熒光素染料，所述保護基團對寡核苷酸合成條件，如通常用于固相合成寡核苷酸的亞磷酸三酯化學條件穩定，且對用于脫保護合成的寡核苷酸的條件不穩定。適合的保護基團在本領域中眾所周知且包括，例如但不限于，酰基碳酸酯和氨基甲酸酯。包括在3'-和6'-環外氧原子上的保護基團的熒光素染料被本文稱為"O-保護焚光素"。在具體的、非限制性實施方式中，在O-保護熒光素上的保護基團是酰基。N-保護的NH-羅丹明或O-保護熒光素供體染料和N-保護的NH-羅丹明受體染料可以各種方位被直接或借助于連接體而彼此連接。在一些實施方式中，供體經由它的2'-、2"-、4'-、5'-、7'-、7"-、5-或6-位，任選地借助于連接體連接到N-保護的NH-羅丹明受體的2'-、2"-、4'-、5'-、7，-、7"-、5-或6-位上。在一些實施方式中，供體和受體以頭對頭、頭對尾、尾對尾或側對側方位彼此連接，如將在稍后章節中更詳細地描述的。連接染料的任選的連接體可包括本質上對寡核香酸合成條件，如通常用于固相合成寡核香酸的亞磷酸三酯化學條件穩定的原子和/或官能團的任何組合。可選擇原子和/或官能團的組合以按需要調整連接體的性質和/或長度。用于將在能量傳遞染料網絡環境中的熒光素和羅丹明染料彼此連接的各種連接體在本領域中已知(參見，如US2006/057565、美國專利第7,015,000號、美國專利第6,627,748號、美國專利第6,544,744號、美國專利第6,177,247號、美國專利第6，150，107號、美國專利第6,028,190號、美國專利第5,958,180號、美國專利第5,869,255號、美國專利第5,853,992號、美國專利第5,814,454號、美國專利第5,804,386號、美國專利第5,728,528號、美國專利第5,707,804號和美國專利第5,688,648號，其公開通過引用合并于本文。)所有這些連接體可被用于將O-保護的熒光素連接到本文描述的試劑中的N-保護的NH-羅丹明上。在一些實施方式中，連接體本質上是剛性的且長度約為8A到16A。合成試劑的標記部分、磷酸酯前體基團和任選的合成片斷，及固相支持體試劑的標記部分、固相支持體和合成片斷可以不影響各種基團和部分展現它們各自功能的能力的任何方式或方位彼此連接。標記部分通常經由被連接到一個組成標記部分的染料的官能團上的連接體被連接到一個組成特定試劑的其它部分或基團上，或可選擇地，被連接到連接兩個或更多個染料網絡的染料的連接體上。在其中標記部分僅包括單一N-保護的NH-羅丹明熒光團的實施方式中，標記部分可經由NH-羅丹明環上的任何位置被連接到試劑上，所述位置不影響NH-羅丹明環以封閉的螺環內酯形式存在的能力。適當位置包括，但不限于，與環外(exocylic)氮原子臨近的碳原子，或在苯基部分上的原子，如，例如，羅丹明染料的2'-、2"-、4'-、5'-、7，-、7"-、5-或6-位。在一些實施方式中，標記部分經由N-保護的NH-羅丹明染料的5-或6-位被連接到試劑的基團或部分上。在其中標記部分包括染料網絡的實施方式中，標記部分可在組成網絡的任何一個染料的不影響試劑預期功能的任何位置被連接到試劑的任何基團或部分上，或被連接到連接網絡的兩個或更多個染料的連接體上。在一些具體實施方式中，其中標記部分除N-保護的NH-羅丹明受體外，還包括O-保護的熒光素或N-保護的NH-羅丹明供體，標記部分可在供體或受體上的任何可利用的位置被連接到試劑的基團或部分上，所述位置如，例如供體或受體的2'-、2"-、4'-、5'-、7'-、7"-、5-或6-位。在一些實施方式中，標記部分經由供體或受體的5-或6-位被連接到試劑(regent)的基團或部分上。在一些實施方式中，標記部分經由連接供體和N-保護的NH-羅丹明受體的連接體被連接到試劑的基團或部分上。在其它方面，本公開提供了用于合成本文描述的試劑的中間體分子、制造本文描述的試劑的方法、用本文描述的試劑標記的化合物如，例如，標記的(labled)寡核苷酸或多核苷酸，及在各種環境下^f吏用標記的化合物的方法。本公開所有各個方面被下文更詳細地描述。4，圖1A和1B提供可被整合入本文描述的試劑中的母體NH-羅丹明染料的示例性實施方式；圖1C提供了母體熒光素染料的示例性實施方式，所述母體焚光素染料可作為NH-羅丹明供體起作用且其可被整合入本文在實施方式中描述的試劑中，在所迷實施方式中標記部分包括染料網絡；圖2提供了可用于將組成本文描述的試劑的各種不同部分彼此連接的示例性連接體；式；'"、、、、、、、'、圖4提供了不包括合成片斷的核苷合成試劑的示例性實施方式；圖5提供了包括合成片斷的非核苷合成試劑的示例性實施方式；圖6提供了包括合成片斷的核苷合成試劑的示例性實施方式；圖7提供了非核苷固相支持體試劑的示例性實施方式；31圖9A-9D闡述了具體實施方式的合成試劑用于合成寡核苷酸的用途，所述寡核苷酸在它的5'-羥基上用NH-羅丹明染料標記；圖10A-10C闡述了具體實施方式的合成試劑用于合成寡核苷酸的的用途，所述寡核苷酸在它的3'-羥基上用能量傳遞染料標記；圖11A-11D闡述了具體實施方式的合成試劑用于原位合成寡核香酸的用途，所述寡核苷酸在它的5'-羥基上用能量傳遞染料標記；及位合成寡核苷酸的用途，所述寡核苷酸在它的5'-端用能量傳遞染料標記。5.發明詳述將理解前文的概括描述和下文的詳細描述皆僅為示例性及說明性，并不意為是對本文描述的組合物和方法的限制。在此公開中，除非另有說明，使用"或"指"和/或"。相似地，表達"包含(comprise)"、"包含(comprises)"、"包含(comprising)"、"包括(include)"、"包括(includes)"和"包括(including)，，不意為限制。5.1定義如本文所使用的，以下術語和用語意為具有以下含義單獨的或作為其它取代基一部分的"皿"指飽和的或不飽和的支鏈、直鏈或環的單價烴基，其具有指定數量的碳原子(即，Cl-C6指一個到六個碳原子)，其通過從母體烷烴、烯烴或炔烴的單獨碳原子上除去一個氫原子而生成。典型的烴基包括，但不限于，曱基；乙基如乙烷基、乙烯基、乙炔基；丙基如丙烷-l-基、丙烷-2-基、環丙烷-l-基、丙-l-烯-l-基、丙-l-烯-2國基、丙-2-烯-l-基、環丙-l-烯-l-基；環丙-2-烯-l-基、丙-l-炔-l-基、丙誦2-炔-l-基等；丁基如丁烷-l-基、丁烷-2-基、2-曱基-丙烷-l-基、2-曱基-丙烷-2-基、環丁烷-l-基、丁-l-烯-l-基、丁-l-烯-2-基、2-甲基曙丙-l-烯-l-基、丁隱2-烯-l隱基、丁-2-烯-2-基、丁-l,3-二烯-]-基、丁-l,3-二烯-2-基、環丁-l隱l,3-二烯-l-基、丁-l-炔-l-基、丁-1-炔醫3-基、丁-3-炔-l-基等；及類似基團。在意指特定飽和水平的情況下，使用命名"烷基"、"烯基，，和/或"炔基"，其如下文定義。被本文使用的"低級烴基，，指(C1-C8)烴基。單獨的或作為其它取代基一部分的"烷基"指飽和支鏈、直鏈或環烴基，其通過從母體烷烴的單獨碳原子上除去一個氫原子而生成。典型的烷基包括，但不限于，曱烷基；乙烷基；丙烷基如l-丙基、2-丙基(異丙基)、環-l-丙基等；丁烷基如l-丁基、2-丁基(仲丁基)、2-甲基-l-丙基(異丁基)、2-甲基-2-丙基(叔丁基)、環-l-丁基等；及類似基團。被本文使用的"低級烷基，，指(C1畫C8)烷基。單獨的或作為其它取代基一部分的"M4"指不飽和支鏈、直鏈或環烴基，其具有至少一個碳-碳雙鍵，其通過從母體烯烴的單獨碳原子上除去一個氫原子而生成。基團針對雙鍵可為順式或反式構象。典型的烯基包括，但不限于，乙烯基；丙烯基如丙-l-烯-l-基、丙-l-烯-2-基、丙-2-烯-1-基、丙-2-烯國2隱基、環丙誦l-棒國l隱基;環丙-2-烯-l-基；丁烯基如丁-l-烯-l-基、丁-1-烯-2-基、2國甲基隱丙-l畫烯-l畫基、丁-2-烯-l-基、丁國2隱烯-2-基、丁-l,3-二烯-l-基、丁-l,3-二烯-2-基、環丁-l-烯-l-基、環丁-l-烯-3-基、環丁-l,3-二烯-l-基等；及類似基團。被本文使用的"低級烯基"指(C2-C8)烯基。單獨的或作為其它取代基一部分的"炔基"指不飽和支鏈、直鏈或環烴基，其具有至少一個碳-碳三鍵，其通過從母體炔烴的單獨碳原子上除去一個氫原子而生成。典型的炔基包括，但不限于，乙炔基；丙炔基如丙-l-炔-l-基、丙-2-炔-l-基等；丁炔基如丁-l-炔-l-基、丁-l-炔-3-基、丁-3-炔-1-基等；及類似基團。被本文使用的"低級炔基"指(C2-C8)炔基。單獨的或作為其它取代基一部分的"亞烴基"指飽和或不飽和，支鏈、直鏈或環的二價烴基團，其具有指定數量的碳原子(即，Cl-C6指從一個到六個碳原子)，其通過從母體烷烴、烯烴或炔烴的兩個不同碳原子中每一個除去一個氫原子而生成，或通過從母體烷烴、烯烴或炔烴的單獨碳原子上除去兩個氫原子而生成。兩個單價原子團中心或二價原子團中心的每一價可與相同或不同原子形成鍵。典型的亞烴基包括，但不限于，亞甲基；亞33乙基如1,1-亞乙烷基、1,2-亞乙烷基、1,1-亞乙烯基、1,2-亞乙烯基；亞丙基如],]-亞丙基、1,2-亞丙基、2，2-亞丙基、1,3-亞丙基、環-l，l-亞丙基、環-l,2-亞丙基、l,l-亞丙-l-烯基、1,2-亞丙-1-烯基、1,2-亞丙-2-烯基、1，3陽亞丙-l-烯基、環-l,2-亞丙-l-烯基、環-l,2-亞丙-2-烯基、環-l,l-亞丙-2-烯基、1,3-亞丙-1-炔基等；亞丁基如1,1-亞丁基、1,2-亞丁基、1,3-亞丁基、1,4-亞丁基、2,2-亞丁基、2-甲基-l,l-亞丙基、2-甲基-l,2-亞丙基、環-l,l-亞丁基；環-l,2-亞丁基、環-l,3-亞丁基、l,l-亞丁-l-烯基、1,2-亞丁-1-烯基、1,3-亞丁-l-烯基、1,4-亞丁-1-烯基、2-甲基-l,l-亞丙-l-烯基、2-曱叉基-l,l-亞丙基、1,3-丁二烯-1,1-亞基、1,3-丁二烯-1,2-亞基、1,3-丁二烯-1,3-亞基、1,3-丁二烯-1,4-亞基、環-l-丁烯-l,2-亞基、環-l-丁烯-l,3-亞基、環-2-丁烯-1,2-亞基、環-l,3-丁二烯-l,2-亞基、環-l,3-丁二烯-l,3-亞基、1-丁烯-1,3-亞基、l-丁烯-l,4-亞基、1,3-丁二烯-1,4-亞基等；及類似基團。在意指特定飽和水平的情況下，使用命名亞烷基、亞烯基和/或亞炔基。在特別地已定兩個價在同一碳原子上的情況下，使用命名"烴叉基"。在一些實施方式中，亞烴基是(C1-C8)亞烴基。具體實施方式包括飽和脂肪族亞烷基，其中原子團中心在端位碳上，如亞甲烷基(曱烷撐)；1,2-亞乙烷基(乙烷撐)；1,3-亞丙烷基(丙烷撐)；1,4-亞丁烷基(丁烷撐)；及類似基團(也被稱為烴撐(alkylenos),下文定義)。被本文使用的"低級亞烴基，，指(C1-C8)亞烴基。單獨的或作為其它取代基一部分的"烴撐(alkvlene)"指直鏈飽和或不飽和的亞烴基，其具有兩個端位單價原子團中心，其通過從直鏈或支鏈母體烷烴、烯烴或炔烴的兩個端碳原子的每一個上除去一個氬原子而生成，或通過從母體環烴基的兩個不同環原子的每一個除去一個氬原子而生成。如果存在雙一建或三鍵的話，其在特定烴撐中的位標在方括號中指明。典型的烴撐基團包括，但不限于，甲撐(曱烷撐)；乙撐如乙烷撐、乙烯撐、乙炔撐；丙撐如丙烷撐、[l]丙烯撐、[1,2]二丙烯撐、[l]丙炔撐等；丁撐如丁烷撐、[l]丁烯撐、[2]丁烯撐、[1,3]丁二烯撐、[l]丁炔撐、[2]丁炔撐、[1，3]丁二炔撐等；及類似基團。在意指特定飽和水平的情況下，使用命名烷撐、烯撐和/或炔撐。在一些實施方式中，烴撐基團是(C1-C8)或(C1-C3)烴撐。具體實施方式包括直鏈飽和烷撐基團，如甲烷撐、乙烷撐、丙烷撐、丁烷撐及類似基團。被本文使用的"低級烷撐"指(C1-C8)烷撐。單獨的或作為其它取代基一部分的"雜烴基"、"雜烷基"、"雜烯基"、"壘炔基"、"雜亞烴基"和"雜烴撐"分別指烴基、烷基、烯基、炔基、亞烴基和子基團替代。可替代碳原子的典型雜原子和/或雜原子基團包括，但不限于，-O-、-S誦、-S誦O曙、-NR'-、-PH誦、-S(O)-、-S02-、誦S(O)NR'-、-802艦'曙及類似基團，包括其組合，其中R'是氫或取代基，如，例如，(C1-C8)烴基、(C6-C14)芳基或(C7-C20)芳基烴基。單獨的或作為其它取代基一部分的"環烴基，，和"雜環烴基"分別指"烴基"和"雜烴基"基團的環形式(version)。對于雜烴基，雜原子可占據被連接到分子剩余物的位置。典型的環烴基包括，但不限于，環丙基；環丁基如環丁烷基和環丁烯基；環戊基如環戊烷基和環戊烯基；環己基如環己烷基和環己烯基；及類似基團。典型的雜環烴基包括，但不限于，四氫呋喃基(如四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基等)、哌咬基(如哌啶-l-基、哌啶-2-基等)、嗎啉基(如嗎啉-3-基、嗎啉-4-基等)、哌。秦基(如哌、秦-l-基、哌噪-2-基等)，及類似基團。"母體芳香環系統"指具有共軛兀電子系統的不飽和的環或多環環系統。稠環系統被特別地歸入"母體芳香環系統"定義中，在所述稠環系統中一個或多個環是芳香的，且一個或多個環是飽和或不飽和的，如，例如，芴、茚滿、茚、非那烯(phenalene)、四氬萘等。典型的母體芳香環系統包括，但不限于，醋蒽烯、苊、乙亞菲基(acephenanthrylene)、蒽、奠、苯、屈、暈苯、熒蒽、芴、并六苯、己芬、hexalene、引達省(indacene)、對稱引達省(s曙indacene)、茚滿、茚、萘、octacene、octaphene、氯甲橋萘(octalene)、卵苯、并五苯、并環戊二烯、五苯、芘、非那歸、菲、月田、七曜烯、芘、吡蒽、玉紅省、四氫萘、三亞苯(triphenylene)、三聯萘(trinaphthalene)及類4以基團。單獨的或作為其它取代基一部分的"M，，指具有指定數量的碳原子(即，C6-C14指從6個到14個碳原子)的單價芳香烴基團，其通過從母體芳香環系統的單獨碳原子上除去一個氬原子而生成。典型的芳基包括，但不限于，從以下衍生的基團醋蒽烯、苊、乙亞菲基、蒽、奠、苯、屈、暈苯、熒蒽、芴、并六苯、己芬、hexalene、不對稱引達省、對稱引達省、茚滿、茚、萘、octacene、octaphene、氯甲橋萘、卵苯、并五苯、并環戊二烯、五苯、芘、非那烯、菲、月田、七曜烯、芘、吡蒽、玉紅省、三亞苯、三聯萘及類似基團及其各種氫化異構體。具體示例性芳基包括苯基和萘基。單獨的或作為其它取代基一部分的"芳基烴基"指脂肪族烴基，其中與碳原子成鍵的一個氬原子被芳基替代，在一些實施方式中，所述碳原子為端位或s/碳原子。典型的芳基烴基包括，但不限于，千基、2-苯基-l-乙烷基、2-苯基-l-乙烯基、萘甲基、2-萘基-l-乙烷基、2-萘基-l-乙烯基、萘并節基、2-萘并苯基-l-乙烷基及類似基團。在意指具有特定飽和程度的烴基部分的情況下，使用命名芳基烷基、芳基烯基和/或芳基炔基。當指明指定數目的碳原子時，例如(C7-C20)芳基烴基，所述數目指組成芳基烴基的碳原子的總數目。"母體雜芳香環系統"指母體芳香環系統，其中一個或多個碳原子各自獨立地^史相同或不同雜原子或雜原子基團替代。替代/炭原子的典型的雜原子或雜原子基團包括，但不限于，N、NH、P、0、S、S(O)、S02、Si等。稠環系統被特別地歸入定義"母體雜芳香環系統"中，在所述稠環系統中一個或多個環是芳香的及一個或多個環是飽和或不飽和的，如，例如，苯并二噁烷、苯并呋喃、色烷、色烯、吲哚、吲咮啉、氧雜蒽等。那些包括共同取代基的公i/v的環也歸入定義"母體雜芳香環系統"中，如，例如，苯并吡喃酮和l-甲基-l,2,3,4-四唑。典型的母體雜芳香環系統包括，但不限于，吖啶、苯并咪唑、苯并異噁唑、苯并二噁烷、苯并二氧雜環戊烯、苯并呋喃、苯并吡喃酮、苯并噻二唑、苯并噻唑、苯并三唑、苯并噁溱、苯并噁唑、苯并噁唑啉、pf唑、p-。，啉、色烷、色烯、噌啉、呔喃、咪唑、p引唑、吲哚、吲哚啉、吲嗪、異苯并呋喃、異色烯、異吲哚、異吲哚啉、異喹啉、異噻唑、異噁唑、萘啶、噁二唑、噁唑、伯啶、菲啶、鄰二氮雜菲、吩溱、酞"秦、i菜。定、噤。令、吡喃、吡。秦、吡唑、。達漆、吡咬、嗜1^、吡略、敗咯漆扇會峻啉、查啉、會漆、p奎愛啉、曰唾、漆二哇、p塞唾、p塞口分、工峻、氧雜蒽及類似基團。單獨的或作為其它取代基一部分的"^^"指具有指定數目的環原子(如"5-14元"指從5個到14個環原子)的單價雜芳香基團，其通過從母體雜芳香環系統的單獨原子中除去一個氫原子而生成。典型的雜芳基包括，但不限于，/人以下f;f生的基團吖啶、苯并咪唑、苯并異噁唑、苯并二噁烷、苯并間二氧雜環戊烯(benzodiaxole)、笨并吹喃、苯并p比喃酮、苯并p塞二哇、苯并噻唑、苯并三唑、苯并噁嗪、苯并噁唑、苯并噁唑啉、咔唑、P-咔啉、色烷、色烯、噌啉、呋喃、咪唑、吲唑、巧l哚、p引咮啉、巧卜秦、異苯并呋喃、異色烯、異吲哚、異吲哚啉、異喹啉、異噻唑、異噁唑、萘啶、噁二唑、噁唑、伯啶、菲啶、鄰二氮雜菲、吩溱、酞嗪、蝶啶、嘌呤、吡喃、吡口秦、p比峻、p達"秦、吡"定、嗜咬、p比口各、p比略n秦、*峻<#、*啉、*口秦、會鬼啉、四哇、參二唾、遂唾、漆。分、三唾、氧雜蒽，及類似基團，及其各種氫化異構體。單獨的或作為其它取代基一部分的"雜芳基烴基"指脂肪族烴基，其中與碳原子上成鍵的一個氫原子被雜芳基替代，在一些實施方式中，所述碳原子為端位或s/碳原子。在意指具有特定飽和程度的烴基部分的情況下，使用命名雜芳基烷基、雜芳基烯基和/或雜芳基炔基。當指明確定數目的原子時，例如，6-20元雜(hetoer)芳基烴基，所述數目指組成芳基烴基的原子的總l史目。單獨的或作為其它取代基一部分的"卣代烴基"指經基,其中一個或多個氫原子被囟素替代。因此，術語"卣代烴基"意欲包括單卣代烴基、雙卣代烴基、三卣代烴基等直到全卣代烴基。例如，短語"(C1-C2)卣代烴基，，包括氟曱基、二氟甲基、三氟曱基、l-氟乙基、1,1-二氟乙基、1,2-二氟乙基、1,1,1-三氟乙基、全氟乙基等。上文定義的基團可包括前綴和/或后綴，其通常在本領域中使用以產生其它公認的取代基。作為非限制性具體例子，"烴基氧基"和/或"烴氧基"指式-OR"的基團、"烴基胺"指式-NHR"的基團，且"二烴基胺"指式-NR"R"的基團，其中每一個R"是烴基。5.2示例性實施方式本公開提供試劑，其可被用于化學合成攜帶包括羅丹明染料的標記部分的寡核香酸。傳統上，化學合成羅丹明-標記的寡核普酸有難度，部分因為缺乏對含有羅丹明的合成試劑的利用率，所述合成試劑對通常用在寡核香酸分步化學合成中的合成和/或脫保護條件穩定。現在已發現，用對堿不穩定的保護基團，如乙酰基，保護NH-羅丹明染料的環外胺基團，可提供N-保護的NH-羅丹明染料，其對通常用在寡核苷酸固相合成中的化學合成和脫保護條件穩定。作為結果，N-保護的NH-羅丹明可被整合入可用于合成以包括羅丹明染料的標記部分標記的寡核苷酸的試劑中，從此避免了合成后附加標記的需要。因為標記在合成中被附加，所產生的標記的寡核香酸無需使用HPLC即可被純化以使用。試劑利用了眾所周知的可用于分步固相合成寡核苷酸的試劑和化學反應的各種特征，且可以合成試劑的形式存在，或以固相支持體試劑形式存在，所述合成試劑在分步固相合成寡核苷酸鏈期間被偶聯到羥基上，核苷單體試劑如核苦亞磷酰胺試劑，和/或任選的其它試劑，在分步方式中被偶聯到所述固相支持體試劑上以生成合成的寡核普酸。合成試劑和固相支持體試劑本質上可為核苷，因為它們可包括核苷部分，或它們本質上可為非核苷。本文描述的所有試劑包括標記部分，其包括N-保護的NH-羅丹明染料或部分。N-保護的NH-羅丹明染料可僅為組成標記部分的染料或可選擇地，它可為兩個或更多個組成較大染料網絡的染料中的一個。固相支持體試劑另外包括固相支持體和一個或多個合成片斷，其它基團可被偶聯到所述合成片斷上。合成試劑另外包括用于將試劑偶聯到伯羥基上的磷酸酯前體基團，且可任選地包括一個或多個合成片斷。組成試劑的各種部分和基團可以允許它們展現它們各自功能的任何方式和/或方位被連接在一起。它們可通過包括在部分上的連接基團被彼此連接，或它們可借助于連接體彼此連接。組成本文描述的包括試劑的各種部分、基團和連接體在下文更詳細地描述。5.3連接體和連接基團組成本文描述的試劑的各種基團和部分通常使用連接體彼此連接。任何特定連接體的種類將部分取決于被彼此連接的部分的種類。一般說來，連接體包括間隔部分，其實質上可包括對用于合成標記的寡核苷酸的合成條件穩定的原子或官能團的任何組合，所述合成條件如通常用于使用亞磷酸三酯方法合成寡核苷酸的條件，且其在結構上可為直鏈、支鏈、或環，或可包括直鏈、支鏈和/或環結構的組合。間隔部分本質上可為單體，或它可以是本質上為聚合物的區域或包括本質上為聚合物的區域。間隔部分可被設計為具有指定性質，如在指定條件下可被剪切的能力，或指定程度的剛性、柔韌性、疏水性和/或親水性。如將在下文中更詳細描述的，本文描述的試劑的許多實施方式通過以指定方式將合成子彼此縮合以產生預期試劑的方式被合成。每個合成子通常包括一個或多個適于形成預期鍵結的連接基團。一般地，連接基團包括官能團Fy,其能夠與另一個官能團Fz反應，或其能夠被活化以致于可以與另一個官能團Fz反應，以產生共價鍵結Y-Z，其中Y代表Fy貢獻的鍵結部分，而z代表FZ貢獻的部分。此類基團Fy和FZ被本文稱作"互補官能團"。能夠彼此形成共價鍵結的互補官能團對在本領域中眾所周知。在一些實施方式中，Fy或Fz中一個包括親核基團，而fy或Fz中另一個包括親電基團。用于形成對各種合成和其它條件穩定的鍵結的互補的親核和親電基團(或其可形成鍵結或可被適當活化以致于形成鍵結的前體)在本領域中眾所周知。可用于實現在各種本文描述的試劑中的鍵結的適合的互補的親核和親電基團的例子，及其所產生的形成的鍵結在下文表1中提供表l親電基團親核基團產生的共價鍵結活化的酯*胺/苯胺羧酰胺酰基疊氮化物**胺/苯胺羧酰胺酰卣胺/苯胺羧酰胺酰由醇/苯酚酯酰基腈醇/苯酚酯酰基腈胺/苯胺羧酰胺醛胺/苯胺亞胺醛或酮肼腙醛或酮羥胺肟胺/苯胺烴基胺烴基卣羧酸酯烴基卣硫醇疏醚烴基由醇/苯酚酯烴基磺酸酯硫醇樣醚烴基磺酸酯羧酸酯烴基磺酸酯醇/苯紛酯酐醇/苯酚酯酐胺/苯胺羧酰胺芳基鹵硫醇^L酚芳基鹵胺芳基胺吖丙啶硫醇硫醚硼酸酯乙二醇硼酸酯羧酸胺/笨胺羧酰胺羧酸酉孚酯羧酸肼酰肼碳二亞胺羧酸N-酰基脲或酐重氮烷羧酸酯環氧化物硫醇硫醚囟代乙酰胺硫醇硫醚囟代三嗪胺/笨胺氨基三嗪鹵代三嗪醇/苯酚三漆醚酰亞胺酯胺/苯胺脒異氰酸酯胺/苯胺脲異氰酸酯醇/苯酚尿烷異硫氰酸酯胺/苯胺硫脲馬來酰亞胺硫醇疏醚亞磷酰胺醇磷酸酯卣代硅醇硅醚磺酸酯胺/苯胺烴基胺磺酸酯硫醇疏醚磺酸酯羧酸酯磺酸酯醇酯磺酰面胺/苯胺磺酰胺石黃酰卣苯酚/醇磺酰酯重氮鹽芳基偶氮*活化的酯，如在本領域中被理解的，一般具有式-C(O)Q,其中Q是好的離去基團(如lL基琥珀酰亞胺基、氧基磺基琥珀酰亞胺基，l-氧基苯并三唑基等)。**酰基疊氮化物可重排為異氰酸酯。因此，連接體合成子一般可被式LG-Sp-LG描述，其中每一個LG與另一個彼此獨立地代表連接基團，而Sp代表間隔部分。在一些實施方式40中，連接體合成子可被式FZ-Sp-FZ描述，其中每一個FZ與另一個彼此獨立地代表如上文描述的互補的親核或親電官能團對的一個成員。在具體的實施方式中，每一個FZ與另一個彼此獨立地選自上文表1中列舉的基團。此類型連接體合成子形成式-Z-Sp-Z-的連接體部分，其中每一個z與另一個彼此獨立地代表如上文描述的^:結的一部分。適于將本文描述的試劑中的特定基團和部分彼此連接的特定連接體將結合試劑的示例性實施方式被更詳細地討論。連接體的非限制性示例性實施方式在圖2中^f皮闡述，所述連接體可用于將組成本文描述的試劑的各種基團和部分彼此連接。在圖中2，Z!和ZZ與另一個彼此獨立地各自代表官能團Fz貢獻的^l建結的一部分，Fz如先前描述，及K選自-CH-和-N-。在圖2中闡述的連接體的一些具體實施方式中，Zi或zS中一個是-NH-，而另一個選自-O-、-(3(0)-和-8(0)2國。5.4標記部分本文描述的所有試劑包括標記部分，其包括在環外胺基團上被具有特定性質的保護基團保護的NH-羅丹明染料。一般地，羅丹明染料以四個主要特性為特征(l)母體氧雜蒽環；(2)環外胺取代基；(3)環外亞銨取代基；及(4)在鄰位上被羧基取代的苯基。環外胺和/或亞銨基團通常位于母體氧雜蒽環的C3和C6碳原子上，雖然也已知"擴展的"羅丹明，其中母體氧雜蒽環包括稠合到C3和C4碳和/或C5和C6碳上的苯并基團。在這些擴展的羅丹明中，特征性的環外胺和亞銨基團位于擴展的氧雜蒽環的對應位置上。被羧酸取代的苯基被連接到母體氧雜蒽環的C9碳上。作為鄰位羧酸取代的結果，羅丹明染料可以兩種不同形式存在(l)開放的酸形式；及(2)封閉的內酯形式。雖然不打算^皮任何操作理論所束綽，因為本文描述的示例性N-保護的NH-羅丹明染料的NMR光譜與封閉的螺環內酯形式的染料一致，相信組成本文描述的試劑的標記部分的N-保護的NH-羅丹明染料是以封閉的、螺環內酯形式存在。因此，本文以它們封閉的螺環內酯形式闡述各種羅丹明及它們未被保護的對應物。然而，應注意到這僅是為了方便而不意為將本文描述的各種試劑限制為內酯形式的染料。在封閉的螺環內酯形式中，母體氧雜蒽環的A環和C環是芳香的，且C3'和C6'取代基兩者皆為胺。包括在本文描述的標記部分中的羅丹明染料的環外胺基團是未被取代的或是單取代的以致于這些胺基團是伯胺或仲胺。此類羅丹明染料被本文稱作"NH-羅丹明"。因此，被本文使用的"NH-羅丹明"一般包括一種以下的母體NH-羅丹明環結構(Ia)(ib)(lc)在上文描述的母體NH-羅丹明環中，使用從通常用于封閉的螺環內酯形式的羅丹明染料中的標號慣例中選用的任意標號慣例為各種碳原子標號。使用此類標號系統僅為了方便，且不意為以任何方式限制。在結構式(Ia)、(Ib)和(Ic)的母體NH-羅丹明環中，R'和R"代表氫或取代環外胺的取代基。113'和/或116'取代基可為相同的或不同的，且可包括基RI2RI2團如被取代的或未被取代的烴基、芳基或芳基烴基。可選擇地，R'和/或R"基團可包括被橋連到鄰近碳原子上的取代基，以致于圖示的氮原子被包括在含有5-或6-環原子的環中。環可為飽和的或不飽和的，且一個或多個環原子可被取代。當環原子被取代時，取代基通常彼此獨立地選自低級烴基、C6-C10芳基和C7-C16芳基烴基。可選擇地，兩個臨近環原子可包括在芳基橋中，如苯并或萘并基團。包括根據結構式(Ia)的母體NH-羅丹明環的羅丹明染料的非限制性示例性實施方式在圖1A中被闡述，在結構式(Ia)中113'和/或116'基團是氫或低級烴基或與臨近碳原子一起被包括在任選地被取代的環中。包括根據結構式(Ic)的母體NH-羅丹明環的羅丹明染料的非限制性示例性實施方式在圖1B中被闡述，在結構式(Ic)中113'和116'基團是氫或低級烴基或與臨近碳原子一起被包括在任選地被取代的環中。在根據結構式(Ia)、(Ib)和(Ic)的母體NH-羅丹明環的Cl'、C2，、C2"、C4，、C4"、C5，、C5"、C7'、C7"和C8'位上的一個或多個碳原子可以彼此獨立地被取代基取代。用于在這些位置上取代羅丹明染料的基團在本領域中眾所周知，且例如在美國專利第4,622,400號、美國專利第5,750,409號、美國專利第5,847,162號、美國專利第6,017,712號、美國專利第6,080,852號、美國專利第6,184,379號和美國專利第6,248,884號中被描述，其公開通過引用合并入本文。所有這些取代基可被用于取代本文描述的母體NH-羅丹明環。在一些實施方式中，取代基彼此獨立地選自低級烴基、(C6-C14)芳基、(C7-C20)芳基烴基、5-14元雜芳基、6-20元雜芳基烴基、-1^和-(012)^^,其中；c是范圍從1到10的整數且Rb選自-X、-OH、-0Ra、-SH、-SRa、-NH2、-NHRa、-NRcRe、-N^ReRCR^全面低級烴基、三卣甲基、三氟甲基、-B(OH)3、-B(ORa)3、誦B(OH)O國、-B(ORa)2CT、-B(OH)(Cr)2、-B(0Ra)(CT)2、-P(OH)2、-p(oh)o-、-p(ora)2、-p(ora)ct、-p(o)(oh)2、隱p(o)(oh)ct、-p(o)(ct)2、-P(0)(ORa)2、-P(0)(ORa)0.、-P(0)(OH)(ORa)、-OP(OH)2、-OP(OH)CT、-OP(ORa)2、-OP(ORa)CT、-OP(0)(OH)2、國OP(O)(OH)O-、-OP(0)(Cr)2、-OP(0)(ORa)2、-OP(0)(ORa)CT、-OP(0)(ORa)(OH)、-S(0)20—、-S(0)2OH、-S(0)2Ra、-C(O)H、-C(0)Ra、-C(S)X、-C(O)O.、畫C(O)OH、-C(0)NH2、43-C(0)NHRa、-C(0)NRcRc、-C(S)NH2、-C(0)NHRa、-C(0)NRcRc、-C(NH)NH2、-C(NH)NHRa和-C(NH)NReRe，其中X是卣素(優選地氟或氯)，每一個Ra是，與其它彼此獨立地，選自低級烴基、(C6-C14)芳基、(C7-C20)芳基烴基、5-14元雜芳基和6-20元雜芳基烴基，且每一個Re與另一個彼此獨立地為Ra，或可選擇地，與相同氮原子成鍵的兩個Re可被采用與氮原子一起形成5-到8-元飽和或不飽和環，其可任選地包括一個或多個相同的或不同的環雜原子，其通常選自O、N和S。可選擇地，Cl'和C2'取代基、C7'和C8'取代基、C5'和C5"取代基和/或C4'和C4"取代基可一起被采用以形成被取代的或未被取代的芳基橋，如苯并橋，條件為C1'和C2'取代基，及C7'和C8'取代基不同時包括在芳基橋中。一般地，被用于取代Cl'、C2'、C2"、C4'、C4"、C5，、C5"、C7，、C7"和C8'碳的基團不應該促進羅丹明染料猝滅，雖然在一些實施方式中，猝滅取代基是預期的。傾向于猝滅羅丹明染料的取代基包括羰基、羧酸酯、重金屬、硝基、溴和碘。位于113'和/或116'的苯基也傾向于導致猝滅。在結構式(Ia)、(Ib)和(Ic)的母體NH-羅丹明環的C4、C5、C6和C7位上的碳原子也可以彼此獨立地包括任選的取代基。這些取代基可選自上文描述的各種取代基。在一些實施方式中，C4和C7位上的碳原子被氯基團取代以致于母體NH-羅丹明染料是NH-4,7-二氯羅丹明染料。包括根據結構式(Ia)、(Ib)和(Ic)的母體NH-羅丹明環的、可包括在本文描述的試劑的標記部分中的大量數目的羅丹明染料在本領域中已知且被描述，例如，在美國專利第6,248,884號；美國專利第6,111,116號；美國專利第6,080,852號；美國專利第6,051,719號；美國專利第6,025,505號；美國專利第6,017,712號；美國專利第5,936,087號；美國專利第5,847,162號；美國專利第5,840,999號；美國專利第5,750,409號；美國專利第5,366,860號；美國專利第5,231,191號；美國專利第5,227,487號；WO97/36960;WO99/27020;Lee等人，1992，Nucl.AcidsRes.20:2471-2483;Arden-Jacob,"NeueLanwelligeXanthen-FarbstoffefiirFluoreszenzsondenundFarbstoffLauer,Springer誦Verlag，Germany,1993;Sauer等人，1995,44Fluorescence5:247-261;Lee等人，1997，Nucl.AcidsRes.25:2816-2822;及Rosenblum等人，1997，Nucl.AcidsRes.25:4500-4504中，其公開通過引用被合并于本文。在這些文獻中描述的其中環外胺為如本文描述的伯胺或仲胺的任何染料或此類NH-羅丹明染料的4,7-二氯類似物可被包括在本文描述的試劑的標記部分中。當包括在標記部分中時，母體NH-羅丹明環的環外胺一皮具有特定性質的保護基團保護。此類被保護的NH-羅丹明作為"N-保護的NH-羅丹明I皮本文提及。對應結構式(Ia)、(Ib)和(Ic)的母體NH-羅丹明環的"N-保護的NH-羅丹明"被下文闡述為結構式(IIa)、(nb)和(IIc:):在結構式(IIa)、(IIb)和(IIc)中，R'是氫或W及R"是氫或R6'，其中R3'和R"如上文為結構式(Ia)、(Ib)和(Ic)所定義，及W代表保護基團。N-保護的NH-羅丹明可包括在C1'、C2'、C2"、C4，、C4"、C5，、C5"、C7'、C7"、C8'、C4、C5、C6和C7中一個或多個位置上的取代基，如先前與根據結構式(Ia)、(Ib)和(Ic)的母體NH-羅丹明環的相關描述。既然本文描述的試劑將用于化學合成標記的寡核苷酸，應使用對用于合成寡核苷酸的有機合成條件穩定的保護基團R9。如上文所提到，以酰胺形式(例如羧酰胺、磺酰胺或磷酰胺)保護胺的保護基團1^9應該被選擇，因為相信以此方式保護環外胺"鎖住"被保護的內酯形式的NH-羅丹明，對本文描述的試劑的穩定性有貢獻。雖然不強加要求，但使用保護基團R"艮方便，其在用于除去保護合成的寡核苦酸的核堿基的環外胺的基團的條件下不穩定，以致于所有保護基團可在單一步驟中被除去。用于合成及脫保護合成的寡核苦酸的條件在本領域中眾所周知且被4葛述，例^口,在CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistry,Vol.1，Beancage等人編輯，JohnWiley&Sons,2002，其公開通過引用被合并于本文。簡要地說，使用亞磷酰胺試劑的合成方法涉及多輪(i)DMT脫保護以顯露游離羥基，其可通過用2.5%或3%的二-或三-氯乙酸的二氯甲烷溶液處理而實現；(ii)核香或其它亞磷酰胺試劑與游離幾基偶聯，其可在含有0.45M或0.5M四唑的乙腈中完成；(iii)氧化，其可通過用12/2,6-盧剔^!t/H20處理而被完成；及加帽，其可通過用6.5。/。乙酸酐的四氬呔喃(THF)溶液處理，隨后通過用10%l-甲基咪唑(NMI)的THF溶液處理而完成。用于在合成中完成各種步驟的其它條件也已知并被使用。例如，亞磷酰胺偶聯可在含有0.25M5-乙硫基-lH-四唑、0.25M4,5-二氰基咪峻(DCI)或0.25M5-節硫基-lH-四唑(BTT)的乙腈中被完成。氧化可在0.1M、0.05M或0.02Ml2的THF/H20/吡啶(7:2:1)溶液中完成。加帽可通過用THF/盧剔巧t/乙酸酐處理，隨后用16%NMI的THF溶液處理而完成；通過用6.5%DMAP的THF溶液處理，隨后用10%Melm的THF溶液處理而完成；或通過用10%Melm的THF溶液處理，隨后用16%Melm的THF溶液處理而完成。46任何保護基團的除去及從合成試劑中的剪切通常可在60。C下通過用濃縮的氫氧化銨處理1-12小時而實現，雖然也已知并使用以可在較溫和條件下除去的基團保護的核香亞磷酰胺試劑，所述條件如在室溫下用濃縮的氫氧化銨處理4-17個小時或用0.05M碳酸鉀的曱醇溶液處理或用25%叔丁基胺的H20/EtOH溶液處理。本領域技術人員將容易地能夠選擇具有適于在特定合成和脫保護和/或剪切條件下使用的性質的保護基團。廣泛種類的胺保護基團被教導，例如在，Greene&Wuts，"ProtectivegroupsInOrganicChemistry",第三版，JohnWiley&Sons，1999(下文"Green&Wuts")在例如，309-405頁中。本領域技術人員可容易地從那些在Green&Wuts中教導的保護基團中選擇具有合適性質的保護基團R9。在一些實施方式中，保護基團RS是式-C(0)R^的酰基，其中R^選自氫、低級烴基、曱基、-CX3、-CHX2、-CH2X、-012-011(1和苯基，其任選地被低級烴基、曱基、-X、-ORd、氰基或硝基單取代，其中Rd選自低級烴基、苯基和吡啶基，且每一個X是卣基團，通常為氟或氯。在一些實施方式中，R^是甲基。在一些實施方式中，F^是三氟甲基。酰基保護基團如那些被-C(0)R^定義的基團可在各種堿性條件下被除去，所述堿性條件包括用于從以"對堿不穩定的"亞磷酰胺試劑合成的寡核苷酸中除去保護基團的溫和條件，如在本領域中眾所周知的。可被使用的示例性條件在上文中^皮詳細說明。如將在后面章節中^皮更詳細地描述的，組成標記部分的N-保護的NH-羅丹明部分可被連接到其它基團或部分上。例如，N-保護的NH-羅丹明可被連接到另一個組成標記部分的染料上、連接到磷酸酯前體基團上、連接到連接體上、連接到合成片斷上、連接到摔滅部分上、連接到起穩定化堿基配對相互作用的功能的部分(如，例如插入染料或小溝結合分子)上或連接到其它部分上。此類鍵結通常經由連接基團LG被實現(上文關于連接體的描述)，所述LG^L連接到用于合成試劑的N-保護的NH-羅丹明合成子上。連接基團LG可連接到N-保護的NH-羅丹明合成子的任何可利用碳原子上，或連接到被連接到這些碳原子中一個的取代基上。連接基團的位置部分取決于基團或部分，N-保護的NH-羅丹明合成子(snython)將被連接到所述基團或部分上。在一些實施方式中，連接基團被連接在N-保護的NH-羅丹明合成子的C2'、C2"、C4'、C5'、C7'、C7"、C5或C6位上。在一個具體實施方式中，連接基團被連接在C4'、C5'、C5或C6位。N-保護的NH-羅丹明合成子(snython)可包括單一連接基團LG,或它可包括超過一種的連接基團LG。在使用超過一種的連接基團的實施方式中，連接基團可為相同的，或它們可以是不同的。包括多種彼此不同的連接基團LG的N-保護的NH-羅丹明合成子可具有運用正交化學連接到母體NH-羅丹明環不同位置上的不同基團或部分。連接基團的種類，在某些例子中，取決于它在母體NH-羅丹明環上的位置。在一些實施方式中，其中連接基團LG被連接在母體NH-羅丹明環的C4'-或C5'-位，連接基團LG是式-(CH2)"-Fy的基團，其中M是范圍為0到io的整數及Fy如上文所描述。在一個具體實施方式中，《是1及FY是-NH2。在一些實施方式中，其中連接基團LG被連接在母體NH-羅丹明環的5-或6-位上，連接基團LG是式-(CH2)"-C(0)ORf的基團，其中Rf選自氫和好的離去基團且n如先前所定義。在一些具體實施方式中，連接基團LG包括NHS酯。在一些具體實施方式中，w是0且Rf是NHS。在一些實施方式中，組成本文描述的各種試劑的標記部分的N-保護的NH-羅丹明被結構式(IIIc)、(IIIb)或(IIIc)描述；如下R5FTR'選自E'和氫；R"選自R"和氫;W是酰基保護基團，任選為式-C(0)R^的酰基保護基，其中R1Q如先前所定義；R'、R2'、R2"、R4'、R4"、R5'、R5"、R7'、RT^aR8',當單獨采用時，每一個彼此獨立地選自氫、低級烴基、(C6-C14)芳基、(C7-C20)芳基烴基、5-14元雜芳基、6-20元雜芳基烴基、-1^和-(012)^111),其中x和Rb如先前所定義，或可選擇地，y和R"或R'和RS'與它們所鍵結的碳原子一起用于形成苯并基團，和/或，W和r""和/或rs'和rs"與它們所鍵結的碳原子一起用于形成苯并基團；y和R6'，當單獨采用時，各自彼此獨立地選自低級烴基、(C6-C14)芳基、(C7-C20)芳基烴基、5-14元雜芳基和6-20元雜芳基烴基，或可選擇地，在結構式(nia)的化合物中的R'和y或W和/或R"和RS'或R71、在結構式(nib)的化合物中的y和f或W和/或r"和rs'或r7"、或在結構式(nic)的化合物中的y和R"或W和/或R"和RS'或R"與它們所鍵結的原子一起用于形成5-或6-元々包和或不^:包和環，其可4壬選地包括:/人1個到4個的其它雜原子(通常選自0、N和S)且其任選地被一個或多個相同的或不同的低級烴基、苯并或吡啶并基團取代；及R4、R5、R6、和R7各自彼此獨立地選自氳、低級烴基、(C6-C14)芳基、(C7-C20)芳基烴基、6-14元雜芳基、7-20元雜芳基烴基、-Rb和-(CH2)jrRb，其中x和Rb如先前所定義，條件為至少一個在結構式(IIIa)的化合物中的R2'、R4'、R5'、R7'、R5或r6、至少一個在結構式(IIIb)化合物中的r2'、r4'、r5'、r7"、r5或r6、至少一個在結構式(IIIc)化合物中的R2"、R4'、R5'、R7"、R或R6，包括式-Y-的基團，其中Y代表包括如上文描述的官能團Fy的連接基團貢獻的鍵結的一部分。在一些實施方式中，組成本文描述的各種試劑的標記部分的N-保護的NH-羅丹明不包括4,7-二氯R6G(5-和/或6-異構體)和/或被結構式(IIIa)描述的羅丹明，其中R'和R"各自為乙基；R、R4'、R5'和r6'各自為氬；R"和lT各自為甲基；114和117各自為氯；且R5或R6中一個是氫且另一個是-C(O)-。在一些實施方式中，根據結構式(IIIa)、(IIIb)和(IIIc)的N-保護的NH誦羅丹明的部分分別選自被結構式(IIIa.l)、(IIIa.2)、(IIIb.l)、(IIIb.2)、(IIIc.l)和(IIIc.2)定義的部分，如下(UIa.l)(mb.i)其中R'、R"、R1、R2'、R2、R3'、R4'、R4"、R5'、R5"、R6'、R7'、R7"、R8'、R4、R5、R6、R7、R9和Y如先前對結構式(IIIa)、(nib)和(IIIc)所定義。被結構式(IIIa)、(IIIa.l)、(nia.2)、(IIIb)、(IIIb.l)、(IIIb.2)、(IIIc)、(IIIc.l)和(IIIc.2)定義的部分的具體示例性實施方式包括具有一個或多個可應用特征的結構，所述特征選自(nic.i)(mc.2)51(i)Y選自畫C(O)-、-S(0)2-、-S-和陽NH-;(n)R4和R7各自為氯；(iii)R"和R8'各自為氫；(iv)R"和R"或W和RS'被釆用以一同形成苯并基團；Cv)R"和lT各自為氫或低級烴基；(vi)R'是R'且R"是R6';(vii)R'是RS'、R"是R"且RS'和RS'與在臨近碳原子上的取代基一起用于形成選自以下的基團-CH2CHr、-CH2CH2CH2-、-C(CH3)2CH=C(CH3)-、-C(CH3)2CH=CH-、陽CH2-C(CH3)2隱和。如先前所討論，標記部分可包括一個或多個額外的染料以致于N-保護的NH-羅丹明一旦脫保護，是較大的能量傳遞染料網絡中的一個成員。此類能量傳遞染料網絡在本領域中眾所周知，且包括熒光染料的組合，所述熒光染料的光語性質是匹配的，和/或其到彼此的相對距離適合，以致于網絡中的一個熒光染料，當被適當波長的入射照射激發時，將它的激發能量傳遞到在網絡中的另外一個焚光染料中，其隨后將它的激發能量傳遞到在網絡中的另外一個熒光染料中，以此類推，導致在網絡中的最終受體染料發熒光。染料網絡提供具有長斯托克斯位移的標記部分。在此類網絡中，將它們的激發能量傳遞或捐獻給在網絡中的另一個熒光團(fluorphores)的熒光團被稱作"供體"。從另一個熒光團接收或接受激發能量的熒光團被稱作"受體"。在僅含有兩個焚光染料的染料網絡中，一個起供體作用及另一個起受體作用。在含有三個或更多個熒光染料的染料網絡中，至少一個染料起供體或受體兩者的作用。染料網絡如何工作的原則，及選擇和連接適于產生此類網絡的獨立染料的標準被眾所周知且被描述，例如，在Hung等人，1997,Anal.Biochem.252:78-88中。在本文描述的包括染料網絡的標記部分中，N-保護的NH-羅丹明染料一旦脫保護，可作為供體或受體起作用，或作為供體和受體兩者起作用，取決于組成染料網絡的其它染料的類別及預期的入射和焚光波長。大量數目的適于用作NH-羅丹明染料的供體和/或受體的染料在本領域中已知，且包括，例如但不限于，氧雜蒽染料(如，例如熒光素、羅丹明和對甲氨基酚染料)、芘染料、香豆素染料(例如羥基香豆素和氨基香豆素)、菁染料、酞菁染料和鑭系(lanthenide)復合物。在能量傳遞染料網絡環境中的這些染料的具體非限制性例子被描述，在Hung等人，1996，Anal.Biochem.238:165-170;Medintz等人，2004，Proc,Nat'lAcad.Sci.USA101(26):9612-9617;美國專利第5,800,996號；Sudhaker等人,2003，Nucleosides,Nucleotides&NucleicAcids22:1443-1445;美國專利第6,358,684號；Majumdar等人，2005，J.Mol.Biol.351:1123-1145;Dietrich等人，2002,ReviewsMol.Biotechnology82(3):211-231;Tsuji等人，2001，BiophysicalJ.81(1):501-515;Dickson等人，1995,J.Photochemistry&Photobiology27(1):3-19;和Kumar等人，2004，DevelopmentsinNucl.AcidRes.1:251-274中，其公開通過引用被合并于本文。任何可根據本文描述的原則被適當保護的這些染料可被用作在包括染料網絡的標記部分中的供體和受體染料。在一些實施方式中，組成網絡的一種或多種供體和/或受體染料可為如本文所描述的N-保護的NH-羅丹明染料。用于將供體和/或受體染料連接到羅丹明染料上以形成染料網絡的具體位置，及用于連接此類染料的具體鍵結和連接體在本領域中眾所周知。具體的例子被描述，例如，在美國專利第6,811,979號；美國專利第6,008,379號；美國專利第5,945,526號；美國專利第5,863,727號；和美國專利第5,800,996號中，其公開通過引用^皮合并于本文。在一些實施方式中，連接供體和受體染料的連接體是陰離子連接體，如在美國專利第6,811,979號中所描述，其公開通過引用凈皮合并于本文(參見，如，在17段25行到18段37行的公開和圖1-17)。在本文描述的試劑的一些實施方式中，標記部分包括NH-羅丹明染料的供體染料。在一些實施方式中，供體染料是熒光素或羅丹明染料，如，例如，本文描述的NH-羅丹明染料中的一個。在具體實施方式中，供體染53料是熒光素染料。熒光素染料在結構上與羅丹明染料類似，不同的是母體氧雜蒽環的3-和6-位(對應結構式(Ia)、(Ib)和(Ic)的NH-羅丹明環的3'-和6'-位)被羥基取代。與羅丹明類似，熒光素也可具有擴展的環結構，其中在母體氧雜蒽環的C3和C4和/或C5和C6位的碳原子被包括在芳基橋如苯并基團中。因此，熒光素一般包括根據結構式(IVa)、(IVb)和(IVc)的化合物，如下(IVa)(lVb)(IVc)與NH-羅丹明類似，在結構式(IVa)、(IVb)和(IVc)的熒光素(fluoroescein)環的Cl'、C2'、C2"、C4'、C4"、C5'、C5"、C7'、C7"、C8'、C4、C5、C6和C7位上的碳可被各種不同取代基取代，如那些先前對NH-羅丹明描述的取代基。當被包括在本文描述的標記部分中時，在C3'和C6'位上的羥基可以被保護基團保護，所述保護基團具有與上文討論的保護NH-羅丹明的環外胺的基團相同的一般特性。因此，在具體的實施方式中，保護基團對用于合54成寡核香酸的條件穩定，所述條件如用于經由亞磷酸三酯方法合成及氧化寡核苷酸的條件，且在通常用于從合成樹脂中脫保護和/或剪切合成的寡核苷酸的條件下不穩定，所述條件如，例如，在室溫下或在55。C下，在濃氬氧化銨中培養。具有適合性質的廣泛種類的保護基團在本領域中已知，且包括，例如但不限于，上文描述的與N-保護的NH-羅丹明染料相關的酰基。在具體實施方式中，保護基團為式-C(0)-R1。，其中R"為如先前所定義。在一些實施方式中，R^是叔丁基。其中C3'和C6'環外羥基包括保護基團的熒光素被本文稱為"O-保護熒光素"。分別對應結構式(IVa)、(IVb)和(IVc)的熒光素的"O-保護熒光素"如結構式(Va)、(Vb)和(Vc)所闡述，如下其中W代表保護基團。在本領域中已知大量的各種不同熒光素染料，其可被適當地保護并被整合入標記部分中，用作NH-羅丹明部分的供體。具體的示例性熒光素染料被描述，例如，在美國專利第6,221,604號；美國專利第6,008,379號；美國專利第5,840,999號；美國專利第5,750,409號；美國專利第5,654,441號；美國專利第5,188,934號；美國專利第5,066,580號；美國專利第4,481,136號;美國專利第4,439,356號；W099/16832;和EP0050684中，其公開通過引用被合并于本文。本領域技術人員將能夠選擇適于用作特定的NH-羅丹明供體的具有光譜性質的熒光素。可被整合入本文描述的試劑的標記部分中的母體熒光素(fluoroescein)染料的具體實施方式在圖1C中被闡述。供體和N-保護的NH-羅丹明受體可以多種方位直接地或借助于連接體彼此連接。在一些實施方式中，其中供體是O-保護熒光素或N-保護的NH-羅丹明，供體經由它的2'-、2"-、4'-、5'-、7，-、7"-、5-或6-位被連接到N-保護的NH隱羅丹明受體的2'國、2"-、4'-、5'-、7，畫、7"誦、5-或6-位。具體的示例性鍵結方位在表2中^皮提供，如下:表2<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>包括染料網絡的標記部分，如表2的供體-受體染料網絡，可在任何可利用的位置上被連接到試劑的剩余物上。在一些實施方式中，包括頭對頭連接的受體/供體對的標記部分經由供體或受體部分的5-或6-位被連接到試劑的剩余物上。在一些實施方式中，包括頭對尾連接的受體/供體對的標記部分經由供體或受體部分的可利用的4'-、5'-、5-或6-位被連接到試劑的剩余物上。在一些實施方式中，包括尾對尾連接的受體/供體對的標記部分經由供體或受體的4'-或5'-位被連接到試劑的剩余物上。在一些實施方式中，包括側對側連接的受體/供體對的標記部分經由供體或受體的4'-、5'-、5-或6-位被連接到試劑的剩余物上。在一些實施方式中，包括側對頭連接的受體/供體對的標記部分經由供體或受體的可利用的4'-、5'-、5-或6-位被連接到試劑的剩余物上。在一些實施方式中，包括側對尾連接的受體/供體對的標記部分經由供體或受體的4'-、5'-、5-或6-位被連接到試劑的剩余物上。不論它們的方位，O-保護熒光素或N-保護的NH-羅丹明供體和N-保護的NH-羅丹明受體通常經由連接體彼此連接。先前已發現經由連接體連接此類供體和受體染料可能有利，所述連接體本質上是剛性的和/或其相對長，例如，長度在近似于12-20A的范圍內0皮本文所使用的連接體的"長度，，指被連接部分之間的距離，所述距離通過計算在部分之間界定最短連續路徑的化學鍵長度和而確定)。不打算被任何操作理論所束縛，相信連接體產生適合的有效能量傳遞，所述連接體傾向于使供體和受體彼此保持緊密臨近，而不允許它們的生色團彼此接觸。從這點看，連接體的剛性和長度是有聯系的參數。一般地，較短的連接體(例如具有長度為約5到12A的連接體)應該具有較大程度的剛性。較長的連接體(例如具有范圍為約15到30A長度的連接體)可具有較小程度的剛性，或甚至沒有剛性。應該避免短的、無剛性的(軟的)連接體。剛性可以通過使用基團來實現，所述基團關于它們的鍵具有被限制的旋轉角度，例如通過使用芳撐或雜芳撐部分，和/或包括雙鍵和/或三鍵的烴撐部分。各種用于將在能量傳遞染料環境中的羅丹明和熒光素染料彼此連接的連接體在本領域中已知且^皮描述，例如，在美國專利第5,800,996號中，其公開通過引用^C合并于本文。用于將O-保護熒光素或N-保護的NH-羅丹明供體連接到在本文描述的標記部分中的N-保護的NH-羅丹明受體上的連接體的具體例子包括，例如但不限于，下式的基團(L.1)-Z-(CH2)。-[(Ar)b-(CH2)a]c-Z-;(L.2)-Z-(CH2)。-[C<:-(CH2)]C-Z-;(L.3)-Z-(CH2)。-[OC-(ArX|c-(CH2)fl-Z-;(L.4)-Z-(CH2)rf-NH-C(0)-[(CH2)。-(Ar)-(CH2)fl-C(0)-NH]c-(CH2>Z-;和(L.5)-Z-fCHXCH^OkCH^CH^O-,其中每一個Z與其它彼此獨立地代表被連接基團Fz貢獻的鍵結的一部分，FZ如先前所描述，每一個"與其它彼此獨立地代表范圍為從O到4的整數；每一個/與其它彼此獨立地代表范圍為從1到2的整數；每一個c與其它彼此獨立地代表范圍為從1到5的整數；每一個d與其它彼此獨立地代表范圍為從1到10的整數；每一個e與其它彼此獨立地代表范圍為從1到4的整數；每一個/與其它彼此獨立地代表范圍為從1到10的整數；且每一個Ar與其它彼此獨立地代表任選地被取代的單環或多環環烴撐、環雜烴撐(cycloheteroalkynene)、芳撐或雜芳撐基團。Ar的非限制性示例性實施方式包括衍生自先前所描述的低級環烷烴、低級環雜烷烴、母體芳香環系統和母體雜芳香環系統的基團。Ar的具體的非限制性示例性實施方式包括環己烷、哌喚、苯、萘(napthalene)、苯酚、呔喃、吡咬、旅。定、咪唑、吡咯烷和噁二唑。連接體具體的非限制性示例性實施方式在圖2中被闡述。在圖2中，Zi和22各自彼此獨立地代表被官能團Fz所貢獻的鍵結的一部分，Fz如先前所描述，且K選自-CH-和-N-。在圖2中闡述的連接體的一些具體實施方式中，Z1或Z2中一個是-NH-且另一個選自-O-、-C(O)-和鄰)2誦。在一些實施方式中，連接供體和受體染料的連接體是陰離子連接體，如在美國專利第6,811,979號中所描述，其公開通過引用^皮合并于本文(參見，如，在17段25行到18段37行的公開和圖1-17)。適合的陰離子連接體的具體的非限制性示例性實施方式包括上文的式(L.1)到(L.4)的連接體，其中一個或多個Ar基團被一個或多個取代基所取代，所述取代基在如，例如在約pH7到約pH9的范圍內的pH下使用的條件下具有負電荷。適合的取代基的具體的非限制性例子包括磷酸酯、硫酸酯、磺酸酯和羧酸酯基團。在一些實施方式中，標記部分為式(VI):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage58</formula>其中A代表N-保護的NH-羅丹明受體，D代表供體，例如，N-保護的NH-羅丹明或O-保護熒光素供體，^和Z"代表被包括官能團Fz的連接部分提供的鍵結的一部分，Fz如先前所描述，及Sp代表間隔部分，如先前所描述。在一些具體實施方式中，A選自結構式A.l、A.2、A.3、A.4、A.5和A.6及D選自結構式D.l、D.2、D.3、D.4、D.5和D.6，其在下文中4皮闡述。在一些具體實施方式中，A選自結構式A.7、A.8、A.9、A.IO、A.ll和A.12及D選自結構式D.7、D.8、D.9、D.IO、D.11和D.12,其在下文中被闡述。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage59</formula>A.ll<formula>formulaseeoriginaldocumentpage61</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage62</formula>%;RlR9;yla、ylb、y2a、y2b、Y3a和Y化各自彼此獨立地選自-O-、-S-、隱NH-、國C(0-)和-S(0)2-;及r'、r"、rr、r2'、r2"、r3'、r4'、r4"、r5'、r5"、r6'、r7、r7'、r8'、R4、R5、RS和R如先前為結構式(IIIa)、(lIIb)和(IIIc)所定義，條件為當E1和E2是-OR915,則R和f和f和118'可同時包括苯并和/或吡啶并基團兩者。在根據結構式(VI)的標記部分的一些具體實施方式中，Yla、Y^和Y^是誦NH-;Ylb、Y化和Y3b選自-C(0)陽和-S(0)2-;Z1選自隱C(0)-和隱S(0)2-;Z2是-NH-及Sp是選自以下的基團(Sp.l)-(CH2)a-[(ArMCH2)a]c-;(Sp.2)-(CH2)。-[OC-(C賜-;(Sp.3)-(CH2MCeC-(At)A-(CH2V;(Sp.4)-(CH2VNH-C(0)-[(CH2)a-(Ar)-(CH2)a-C(0)-NH]c-(CH2V;和(Sp.5)-[2)踏012(0€2)-，其中a、Z>、"J、e、/和Ar如先前所定義。在根據結構式(VI)的標記部分的一些具體實施方式中，R9選自-C(0)CH3和C(0)CF3及R9a是隱C(0)C(CH3)3。5.5磷酸酯前體基團本文描述的試劑的許多實施方式包括磷酸酯前體基團("PEP")。當用在分步合成中以合成標記的寡核苷酸時，PEP基團^L偶聯到任何可利用的羥基上，其可為新生的合成的寡核苷酸的5'-羥基，所述寡核苷酸在任何所需的氧化和/或脫保護步驟后，最終貢獻將標記部分連接到合成的寡核苷酸上的鍵結。形成的鍵結可為磷酸酯鍵結或在本領域中已知(know)的被修飾的磷酸酯鍵結。適于將試劑偶聯到伯羥基上以產生磷酸酯或修飾的磷酸酯鍵結的各63種不同基團在本領域中眾所周知。具體的例子包括，例如但不限于，亞磷酰胺基團(見，如Letsinger等人，1969，J.Am.Chem.Soc.91:3350-3355;Letsinger等人，1975,J.Am.Chem.Soc.97:3278;Matteucci&Camthers,1981，J.Am.Chem.Soc.103:3185;Beaucage&Caruthers，1981,TetrahedronLett.22:1859;其公開通過引用被合并于本文)、2-氯苯基-或2,5-二氯苯基-磷酸酯基團(參見，如Sproat&Gait，"SolidPhaseSynthesisofOligonucleotidebythePhosphotriesterMethod,"(通過石岸酸三酉旨方法的寡核苦酸的固相合成)在(9//gowMc/eo".6feS聲/2e57、,Pra"^/^4//7ra"c/^Gait，編輯，1984,IRLPress，83-115頁)，其公開通過引用被合并于本文)和H-膦酸酯基團(參見，如Garegg等人，1985,Chem,Scr.25:280-282;Garegg等人，1986，Tet.Lett.27:4051-4054;Garegg等人，1986,Tet.Lett.27:4055-4058;Garegg等人，1986，Chem.Scr.26:59-62;Froehler&Matteucci，1986，Tet.Lett.27:469-472;Froehler等人，1986，Nucl.AcidRes.14:5399-5407，其公開通過引用被合并于本文)。在具體實施方式中，PEP基團是式(R1)的亞磷酰胺基團OR20I/(P.l)卞P、n-R21IR22其中R"選自直鏈、支鏈或環，飽和或不飽和的含有從1個到IO個碳原子的烴基、2-氛基乙基、含有從6個到10個環碳原子的芳基和含有從6個到10個環碳原子和從1個到10個烴撐碳原子的芳基烴基；及R"和R"各自彼此獨立地選自直鏈、支鏈或環，飽和或不飽和的含有從1個到10個碳原子的爛基、含有從6個到10個環碳原子的芳基和含有從6個到10個環^灰原子和從1個到10個烴撐(aklylene)碳原子的芳基烴基，或可選擇地，R"和R"被采用與它們所鍵結的氮原子一起形成含有從5到6個環原子的飽和或不飽和環，所述環原子中的一個或兩個，除了被闡述的氮原子，可為選自O、N和S的雜原子。在具體實施方式中，R2Q是2-氰基乙基及R21和R22各自為異丙基。5.6合成片斷本文描述的試劑的許多實施方式包括一個或多個合成片斷，其在適當地脫保護后，如果必要，提供可用于其它基團或部分向合成的標記的寡核苷酸的連接的位點。基團可在標記的寡核苷酸的合成過程中被連接到合成片斷上，或可選擇地，合成片斷可在合成后脫保護以顯露官能團，其它基團或部分可被連接到所述官能團上。例如，合成片斷可包括用保護基團保護的伯胺基團，所述保護基團對被用于完成標記的寡核苷酸合成的條件穩定。與除去在合成的寡核苷酸上的各種其它保護基團同時地，或分別進行的合成后除保護基團，可提供伯氨基，其它基團和/或部分可被連接到所述伯氨基上。以適于在寡合苷酸合成中使用的保護基團保護的各種不同類型的反應基團在本領域中已知，且包括，例如但不限于，氨基(以，例如，三氟乙酰基或4-單甲氧基三苯甲基保護)、羥基(以，例如，4，4'-二甲氧基三苯甲基保護)、硫羥基(以，例如，三苯甲基或烴基硫羥基保護)和醛基(以，例如，乙縮醛保護基團保護)。所有這些被保護的反應基團可組成本文描述的試劑的合成片斷。在一些實施方式中，合成片斷包括式-ORe的保護的伯羥基，其中Re代表對酸不穩定的保護基團，其在合成寡核苷酸期間可被選擇性除去。適于在寡核苷酸合成環境下保護伯羥基的對酸不穩定的保護基團在本領域中已知且包括，例如但不限于，三苯基曱基(三苯甲基)、4-單甲氧基三苯甲基、4,4'-二甲氧基三苯曱基、4,4',4"-三甲氧基三苯曱基、雙(對甲氧基芐基)苯甲基、萘基二苯基曱基、對-(對'-溴苯酰氧基)苯基二苯基曱基、9-蒽基、9-(9-苯基)咕吃基和9-(9-苯基-10-氧代)蒽基。所有這些基團可經使用溫和的酸處理而^皮除去，如通過用2.5%或3%雙-或三氯酸且在二氯曱烷中處理。上文列舉的用對酸不穩定的保護基團保護伯羥基的方法被眾所周知。5.7固相支持體本文描述的試劑的許多實施方式包括固相支持體，其它部分和/或基團被連接到所述固相支持體上。通常，使用官能團如氨基或幾基活化固相支持體，攜帶適于連接到其它部分的連接基團的連接體被連接到所述官能團上。各種可用適于連接到各種部分和連接體的官能團活化的物質，與將物質活化以包括官能團的方法在本領域中已知且包括，但不限于，控制的小孔玻璃、聚苯乙烯和接枝共聚物。任何這類物質被用作在本文描述的試劑中的固相支持體。5.8用于端位羥基標記的合成試劑(Regents)本文描述的合成試劑的一些實施方式被結構(stuctural)式(;vn)描述(VII)LM畫L-PEP其中LM代表如本文所描述的標記部分，L代表如本文所描述的任選的連接體，且PEP代表如本文所描述的磷酸酯前體基團。試劑可包括其它基團或部分，如合成片斷。在一些實施方式中，合成試劑包括標記部分和PEP基團，且不包括其它部分或基團。此類合成試劑可在寡核苷酸的分步合成中被偶聯到羥基上，且可用于，在其它用途之中，將標記部分連接到合成的寡核苷酸的端位羥基上，所述端位羥基通常為5'-羥基。PEP基團可被直接連接到標記部分，或它可以借助于連接體被連接到標記部分。因PEP基團一般通過將合適的試劑偶聯到伯羥基上而被連接到分子上，在PEP基團被直接連接到標記部分上的實施方式中，標記部分應該包括包括伯羥基的取代基團。在PEP基團借助于連接體被連接到標記部分的實施方式中，連接體合成子應該包括連接基團，其適于與在標記部分合成子上的連接基團和適于連接PEP基團的伯羥基形成4定結。適合的連接體合成子包括，但不限于，式FZ-Sp-OH的合成子，其中Fz是與在標記部分合成子上的官能團互補的官能團且Sp代表間隔部分。間隔部分可以包括原子和/或官能團的任何組合，所述原子和/或官能團對將用于合成及脫保護標記的合成寡核苷酸的條件穩定。非限制性示例性連接體在圖2中被闡述，其中ZZ是0。在一些實施方式中，Sp是任選地被取代的烴撐鏈，其含有從1個到10個鏈原子。在具體實施方式中，Sp是未被取代的含有從1個到9個碳鏈原子的烴撐鏈。在一些實施方式中，合成試劑是根據結構式(forumula)(Vn)的化合物，其中LM是上文具體示例的標記部分的一個實施方式；L選自-Z-(CH2)3.6-0-、-Z-(CH2)"-[(Ar)HCH2)"]c-0-、-Z-(CH2V[OC-(CH2)。]C-0-、-Z-(CH2)"-[CeC-(A^]c-(CH2)。-0-、-Z-(CH2VNH-C(OM(CH2)a-(Ar)-(CH2)a-C(0)-NH]e-(CH2)rf-0-、-2-/<:112(012)"-和在圖2中闡述的連接體中的一個，其中z2是O;及PEP是亞磷酰胺基團，如，例如上文所描述的結構式P.l的亞磷酰胺基團。在一些具體實施方式中，在連接體L中的Z是-NH-。在一些實施方式中，在根據結構式(VII)的合成試劑中的連接體包括核苷，以致于合成試劑是核苷。在一些實施方式中，核苦合成試劑是根據結構式(VII.1)的化合物(VII.1)其中PEP代表磷酸酯前體基團，B代表核堿基，LM代表標記部分及1^2代表將核堿基B連接到連接體LM的連接體。核堿基B和連接體L的特征和性質在下文更詳細地描述。根據結構式(VII.1)的非限制性示例性核苷合成試劑在圖4中被闡述。合成試劑的合成實施方式的示例性合成圖在下文合成圖(I)中被提供，在所述合成試劑中PEP基團經由任選的連接體被連接到標記部分上，在合成圖中各種R、Fy、Fz、Y、Z和Sp基團如先前所定義67合成圖(I)在合成圖(I)中包括包括官能團Fy的連接基團的母體NH-羅丹明合成子100，以酐IOI乙酰化以生成N-乙酰基保護的NH-羅丹明合成子102。合成子102隨后被偶聯到連接體合成子103上以生成化合物104。合成子102可能需要在偶聯前活化，取決于Fy的種類(identity)。例如，如果FY是羧基，它可在偶聯前^f皮活化為酯，如NHS酯。在化合物104中，-Y-Z-代表通過互補官能團FY和FZ形成的鍵結，其中Y代表被Fy貢獻的部分且Z代表祐LFz貢獻的部分，如先前所描述。化合物104隨后與PEP合成子105反應以生成亞磷酰胺合成試劑106,105在闡述的具體實施方式中為磷化氫。5.9用于內部或3'-末端標記的合成試劑本文描述的合成試劑可任選地包括一個或多個用于連接其它基團和/或部分的合成片斷。包括式-ORe的合成片斷的合成試劑提供伯鞋基，其中Re代表如先前描述的對酸不穩定的保護基團，其它核苷可被連接到所述伯68羥基上。作為結果，包括此合成片斷的合成試劑可用于在5'-羥基、3'-鞋基上或在一個或多個內部位置上標記合成的寡核苷酸。它們也可彼此偶聯，或偶聯到其它亞磷酰胺標記試劑上，以允許含有多個標記部分的寡核苷酸的合成。組成合成試劑的標記部分、PEP基團和合成片斷-ORe可以任何允許它們表現它們各自功能的方式和/或方位連接在一起。作為一個具體的例子，PEP基團和合成片斷各自可任選地經由連接體連接到標記部分上。在一些實施方式中，此類合成試劑為根據結構式(VIII)的化合物(VIII)ReO-L-LM-L-PEP其中每個L與其他彼此獨立地代表任選的連接體，LM代表標記部分及PEP代表磷酸酯前體基團。適合的保護基團Re、連接體L、標記部分LM和磷酸酯前體基團的非限制性例子包括那些上文具體示例的例子。作為另一個具體例子，PEP基團和合成片斷-OR6可連接到支鏈連接體上，所述支鏈連接體被連接到標記部分上。在一些實施方式中，此合成試劑是根據結構式(IX)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage69</formula>其中L代表連接體，LM代表標記部分及PEP代表磷酸酯前體基團。在具體實施方式中，根據結構式(IX)的合成試劑為根據結構式(IX.l)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage69</formula>其中LM代表標記部分，-Z-代表被功能FZ貢獻的連接的一部分，Sp1、SpS和SpS可相同或不同，其每一個代表間隔部分，G代表CH、N,或一個基團，所述基團包括和(and)芳撐、苯撐、雜芳撐、低級環烴撐、環己撐，和/或低級環雜烴撐，及PEP代表磷酸酯前體基團。在一些實施方式中，LM是上文具體示例的標記部分的一個實施方式，Sp1、SpS和SpS每一個彼此獨立地選自含有從l個到9個碳原子的烴撐鏈、Sp.l、Sp.2、Sp.3、Sp.4和Sp.5(上文所定義)，和/或PEP是根據前文的結構式P.l的亞磷酰胺。根據結構式(IX.1)示例性合成試劑的非限制性具體實施方式在圖3A、圖3B和圖4中^皮闡述。在一些實施方式中，合成片斷-ORe被核苦提供，以致于合成試劑是核苷。在此類核苷合成試劑中，標記部分通常借助于連接體被連接到核苷的核堿基上，且在核堿基上的任何環外官能團，如，例如環外胺，是被保護的，所述核堿基在用于合成標記的寡核苷酸的條件下是可反應的。核苷可為可被適當保護以用在寡核苷酸的合成中的任何核苷，且可包括2'-脫氧核糖的糖部分、3'-脫氧核糖的糖部分(用于合成包括2'-5'內部核苷酸4建結的標記的寡核苷酸)、適當保護的核糖部分、任何這些核糖部分的^皮取代形式，或甚至非核糖的糖部分。在一些實施方式中，此類核苷合成試劑是根據結構式(IX.2)、(IX.3)、(IX.4)和(IX.5)的化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>整合入寡核苷酸的各種雜環在本領域中已知且被描述，例如，在Pra"Zca///o"<i6ooA:o/J8Zoc/2ew/>s*&>yaW(imo/ea//ar^8/o/ogy,Fasman編l辱,1989,CRCPress(參見，如385-393頁和本文引用的文獻)，其公開通過引用一皮合并于本文。所有這些各種雜環，及那些隨后被發現的雜環，可被本文描述的核苦合成試劑所包括。當B是在根據結構式(VII.l)、(IX.2)、(IX.3)、(IX.4)和(IX.5)的合成試劑中的嘌呤時，-陂闡述的糖部分通常連接到噪呤的N9位上，且當B是嘧啶時，被闡述的糖部分通常連接到嘧啶的Nl位上。其它核減羞的連接位點對于本領域技術人員將是明顯的。在核堿基上的任何環外胺或其它反應性基團被保護基團保護，所述保護基團對用于合成標記的寡核苷酸的合成條件穩定。各種適于在寡核苦酸合成環境下保護核苷核堿基的環外胺基團的保護基團制備此類被保護的核苷的方法在本領域中眾所周知。例如，已被用于保護腺嘌呤環外胺的基團包括苯甲酰基(benzyol)(Bz)、苯氧乙酰基(Pac)和異丁酰基(iBu)。已被用于保護胞嘧啶(cystosine)環外胺的基團包括乙酰基(Ac)和Bz。已用于保護鳥噪呤環外胺的基團包括iBu、二甲基曱酰胺(Dmf)和4-異丙基-苯氧乙酰基(iPr-Pac)。所有這些保護基團可在55-65。C下通過用氬氧化銨處理2-3個小時而被除去。然而，這些保護基團中某些可在較溫和條件下除去。例如，從A11311、APae、CAe和G^Pae剪切保護基團可在室溫下使用氬氧化銨在4-17小時內實現或用0.05M碳酸鉀的甲醇溶液實現，或用25。/c^又丁基胺的H20/EtOH溶液處理而實現。因為組成本文描述的試劑的某些NH-羅丹明和/或其它染料可能對其它保護基團所需的較苛刻脫保護條件不穩定，優選使用了可在較溫和脫保護條件下被除去的保護基團的核苷試劑。將標記部分LM連接到核減羞B上的連接體I可^皮連接到核減基的任何位置上。在一些實施方式中，當B是噤呤時，連接體被連接到噤呤的8-位上，當B是7-脫氮噤呤時，連接體被連接到7-脫氮噪呤的7-位上，及當B是嘧啶時，連接體被連接到嘧啶的5-位上。在一些實施方式中，用于將LM連接到核堿基上的連接體L2包括乙炔基或烯基tt鍵結，如，例如，選自以下的鍵結-C>C-CH2-NH-、-Ce-C(O)-、-CH=CH-NH-、-CH=CH-C(0)-、《三0<3^畫]^11誦(:(0)-(012)1.6-1^11誦及-CI^CH誦C(0)國NH-(CH2)L6誦NH-C(0)-、炔丙基誦l-乙tt氨基鍵結，如，例如，具有式-OCH-CH2-0-CH2CH2-q-6-NH-的鍵結或剛性鍵結，如，例如，選自以下的鍵結-OC-OC-CH2-0-CH2CH2-0-6-NH-、-OCHAiOw-OC-CHrO-CHzCHHO-CH^Hdo^NH-,-C三C-(ArV2隱0-CH2CH2-[0-CH2CH2〗o.6-NH-和隱C三C誦(Ar)w-0-CH2CHHO-CH2CH2]o-6-NH陽，其中Ar如先前所定義。在一些實施方式中，用于將LM連接到。票呤核堿基上的連接體L2包括烴基胺，如，例如，式-NH-(CH2)w-NH-的鍵結。在一些實施方式中，用于將LM連接到噪呤或嘧咬核堿基(nucleobse)上的連接體I是陰離子連接體，其如在美國專利第6,811,979號中所描述的，其公開通過引用被合并于本文(見，如在17段25行到18段37行的公開和圖1-17)。合成以連接體如那些前文描述的適于整合入本文描述的試劑中的連接體衍生化的核苷的方法被描述，例如，在Hobbs等人，1989，J.Org.Chem.54:3420;Hobbs等人的美國專利第5,151,507號,Khan等人的美國專利第5,948,648號；和Khan等人的美國專利第5,821,356號，其公開通過引用被合并于本文。衍生化的核苷可用作合成核苷試劑的合成子，其將在下文中被更加詳細地描述。連接體-衍生化的核堿基的具體示例性實施方式在下文被闡述，所述核石威基組成本文描述的核苷試劑核苷合成試劑可從連接體-衍生化的核香合成子制備，如在下文合成圖(II)中所闡述合成圖(II)在合成圖(II)中，連接體衍生化的核苷合成子110在5'-羥基上以對酸不穩定的保護基團保護，所述保護基團在合成圖中用示例性氯化物試劑ReCl闡述，其中Re如先前所定義。用堿處理以除去三氟乙酰基保護基團產生合成子112。合成子112與標記部分合成子102反應(見前文的合成圖(I)),隨后通過用PEP合成子105處理以產生核苷合成試劑114，所述合成子105在此闡述的具體例子中是磷化氫(見前文合成圖(I))。上文闡述的完成各種合成步驟的特定條件眾所周知。包括合成片斷，如式-ORe的合成片斷的非核苷合成試劑可通過調整合成圖(II)的路線而制備。5.10固相支持體試劑<formula>formulaseeoriginaldocumentpage75</formula>本文描述的試劑的許多實施方式包括固相支持體。此類試劑一般包括固相支持體、本文描述的標記部分和合成片斷，且可包括其它基團或部分，如其它標記部分、猝滅部分、合成片斷和/或用于穩定化寡核苷二倍體等的基團，如，例如，在核磁羞對間插入的劑(插入劑)和結合二倍體小溝的劑(小溝結合劑或MGB劑)。固相支持體、標記部分、合成片斷和任何任選的其它部分可以以允許它們表現它們各自功能的任何方式或方位彼此連接。在一些實施方式中，固相支持體經由連接體被連接到試劑剩余物上。將固相支持體連接到試劑剩余物上的連接體通常包括鍵結，所述鍵結在特定條件下被選擇性剪切以致于合成后，被合成的標記的寡核苷酸可從固相支持體中釋放。在一些實施方式中，鍵結對用于脫保護合成的標記的寡核苷酸的條件不穩定，以致于寡核苷酸在單一步驟中被脫保護且從固相支持體中被剪切。此類連接體通常包括酯鍵結，但可包括其它鍵結，如，例如，碳酸酯、二異丙基硅氧醚、修飾的磷酸酯等。各式各樣在寡核苷酸合成環境下使用的可被選擇性剪切的連接體及用此類連接體衍生化固相支持體的方法在本領域中已知。所有這些各種連接體可被調整以用于本文描述的固相支持體試劑中。包括示例性連接體的固相支持體試劑的非限制性例子在圖7中4皮闡迷，所述連4妄體在用于脫保護合成的寡核苷酸的堿性條件下可被剪切。與合成試劑類似，固相支持體試劑本質上可為非核苷或核苷。非核香固相支持體試劑的示例性實施方式包括根據結構式(X)的試劑其中LM代表標記部分，L代表任選的可被選擇性剪切的連接體及-ORe代表合成片斷，其中Re是如先前所描述的對酸不穩定的保護基團。在一些實施方式中，結構式(X)的固相支持體合成試劑是根據結構式(X.l)的非核苷試劑(X)(X.l)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage77</formula>其中Z、LM、G、Sp1、SpS和Re如先前對結構式(IX.l)相關的定義及Sp4代表選擇性可剪切的間隔部分。在一些具體實施方式中，可選擇性(selecteively)剪切的間隔部分Sp4包括酯4建結。在一些實施方式中，結構式(X)的固相支持體合成試劑是根據結構式(formuale)(X.2)、(X.3)、(X.4)或(X.5)的核苷試劑<formula>formulaseeoriginaldocumentpage77</formula>(X.2)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage77</formula>(X.3)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage77</formula>(X.4)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage77</formula>(X.5)其中LM、Re、B、L2如先前為結構式(X.2)、(X.3)、(X.4)和/或(X.5)所定義，R"如先前為結構式(IX.4)所定義及Sp"代表如上文所描述的選擇性可剪切的間隔部分，其在一些實施方式中，包括酯鍵結。5.11其它示例性實施方式將理解，本公開通篇描述的各種部分、基團和連接體的具體實施方式可以包括在本文描述的所有試劑中。此外，雖然特定組合已經被具體地示例，各種具體實施方式可以任何組合方式彼此組合。作為一個具體例子，任何一個本文描述的標記部分LM的具體實施方式可纟皮包括在任何本文描述的非核普和核香固相支持體和合成試劑的具體示例的實施方式(embodiemtns)中。作為另一個具體例子，任何一個磷酸酯前體基團PEP的具體實施方式，如前文的結構式(P.1)的亞磷酰胺基團，可被包括在任何本文描述的合成試劑中。5.12試劑的用途本文描述的各種試劑可用在寡核苷酸的分步合成中以合成在合成樹脂上用羅丹明染料直接標記的寡核苷酸。因此，各種試劑提供以各式各樣不同羅丹明合成地標記寡核香酸的能力，避免耗力的合成后修飾的需要。示例性合成試劑合成用NH羅丹明染料標記的寡核苦酸的用途在圖9A-9D中闡述。如將被本領域技術人員所意識到的，由于可利用亞磷酰胺試劑作為羅丹明染料的供體、受體或甚至猝滅劑，本文描述的試劑具有合成以能量傳遞染料和/或原位合成的羅丹明猝滅劑染料對標記的寡核香酸的能力。用NH-羅丹明-熒光素能量傳遞染料對標記的寡核芬酸的示例性合成在圖10A-10C和圖11A-11D中被闡述，所述染料對顯示了本文描述的試劑所提供的通用性。因為本文描述的試劑實質上允許任何NH-羅丹明染料包括在固相支持體和/或合成試劑中，以能量傳遞染料對標記的寡核苦酸可方便地被原位合成，而不需要合成后修飾，所述能量傳遞染料對具有光譜性質且被調整以用于指定應用。此外，用各式各樣不同能量傳遞染料對組合標記的寡核苷酸可以單一單體試劑被合成，避免了制造含有指定染料對的合成試劑的需要。染料對的每一個成員可通過或不通過添加插入連接部分而在逐步方式中被連接到的新生的寡核苷酸中。參照圖9A-9D,連接于支持物的合成的寡核苷酸(oligoncleotide)200用酸處理以除去保護它的5，-羥基的DMT基團，產生5'-脫保護的連接于支持物的寡核苷酸202。偶聯N-保護的NH-羅丹明亞磷酰胺試劑204后，氧化以產生連接于支持物的NH-羅丹明標記的寡核苷酸(oliognucleotide)206。用濃縮的氫氧化銨處理以除去任何保護基團并從固相支持體(樹脂)上剪切合成的寡核苷酸以生成以NH-羅丹明染料標記的寡核苷酸208。參照圖10A-10C,包括作為標記部分的保護的NH-羅丹明-熒光素能量傳遞染料對的固相支持體試劑210可經歷三個合成循環以產生連接于支持物的標記的寡核苷酸212。從固相支持體剪切以產生脫保護的、標記的寡核普酸214。參照圖11A-11D,連接于支持物的新生寡核苷酸220可通過將N-保護的NH-羅丹明亞磷酰胺合成試劑222偶聯到寡核香酸220的5'-羥基上而被原位合成的NH-羅丹明-熒光素染料對標記，所得產物在氧化之后，生成NH-羅丹明-標記的寡核苷酸224。除去DMT基團，隨后用O-保護亞磷酰胺(其在闡述的具體例子中為FAM-亞磷酰胺)偶聯以產生標記的、連接于支持物的寡核苷酸226。剪切并脫保護以生成寡核苷酸228，其以NH-羅丹明-FAM能量傳遞染料對標記。可通過使用亞磷酰胺連接體試劑調整連接供體和受體染料的鍵結的長度和性質。此方面在圖12A-12C中被闡述，在圖中連接體亞磷酰胺230被偶聯到羅丹明-標記的寡核苷酸225上，產生試劑232。用FAM-亞磷酰胺偶聯，隨后氧化、脫保護并剪切以產生寡核苷酸234,其被NH-羅丹明-FAM能量傳遞染料對所標記。在連接體亞磷酰胺230中，"Sp"是如先前所定義的間隔體。例如，"Sp"可代表如先前所定義的(Sp.l)、(Sp.2)、(Sp.3)、(Sp.4)或(Sp.5)。在圖12A-12C闡述的合成圖中，連接NH-羅丹明和FAM染料的連接體的長度和性質可通過在FAM-亞磷酰胺與試劑232偶聯之前將其它連接體亞磷酰胺偶聯到試劑232上而被調整。連接體亞磷酰胺(phosphosphoramites)可相同，或它們可不同。用這種方式，以能量傳遞染料對標記的寡核苷酸易于^皮原位合成，在所述染料對中供體和受體染料及連接供體和受體的連接體出于特定目的被調整。雖然圖11A-11D和圖12A-12C示例了特定的N-保護的NH-羅丹明試劑的用途，本領域技術人員將意識到，可使用作為FAM受體起作用的任何N-保護的NH-羅丹明試劑。此外，可使用其它O-保護熒光素，如可使用其它類型的亞磷酰胺(phosphormidite)染料。既然染料可作為單體被加入，可利用的能量傳遞染料標記的數目比合成它們所必需的亞磷酰胺試劑的數目要大。例如，用不同的能量傳遞染料對標記的寡核苷酸可以3個不同的N-保護的NH-羅丹明亞磷酰胺試劑(試劑A、B和C)和3個不同的0-保護的熒光素亞磷酰胺試劑(試劑1、2和3)合成寡核苦酸-Al、寡核苷酸-A2、寡核苷酸-A3、寡核苷酸-Bl、寡核苷酸-B2、寡核苷酸-B3、寡核苷酸-Cl、寡核苷酸-C2和寡核苷酸-C3。6.實施例實施例l:N-保護的NH-羅丹明亞磷酰胺合成試劑的合成在C5-和C6-位上包括羧基取代基的母體NH-羅丹明染料被合成，如在美國專利第4,622,400號、美國專利第5,750,409號、美國專利第5,847,162號、美國專利第6,017,712號、美國專利第6,080,852號、美國專利第6,184,379號或美國專利第6,248,884號中所描述。母體NH-羅丹明染料隨后在環外(exocylcic)胺上被乙酰基或三氟乙酰基保護基團保護，所產生的N-保護的NH-羅丹明染料經由相應的NHS酯衍生物被轉化為羥基-酰胺衍生物且使用標準過程將羥基官能團轉化為亞磷酰胺。整體合成圖在下文中闡述<formula>formulaseeoriginaldocumentpage81</formula>用乙酰基保護。NH-羅丹明染料酸6(單TEA鹽，1.676mmol)被懸浮于DCM(40mL)和TEA(3.WmL)中。添加乙酸酐(3.13mL)，并在室溫下攪拌反應混合物3天。加入H2O(10mL)并繼續攪拌30min。用DCM(200mL)稀釋混合物，用NaHC03溶液(200mLx2)洗滌，干燥(Na2S04),過濾，并蒸發。在二氧化硅上通過快速色i普純化殘余物(使用梯度為從5:20:75到20:20:60的MeOH/EtOAc/DCM作為洗脫液)。蒸發適當的組分以產生881mg(87%)無色內酯化的雙乙酰基N-保護的NH-羅丹明染料8。用三氟乙酰基保護。NH-羅丹明染料酸6(單TEA鹽，1.5g,2.402mmol)被懸浮在DCM(30mL)和TEA(6.696mL)中。將懸浮液冷卻到0。C并用注射器逐滴加入三氟乙酸酐(2.0mL)。添加完成后，在室溫下攪拌反應混合物10min(并超聲以使染料顆粒破碎)。蒸發所得到的褐色溶液，使其重溶于DCM(50mL)中，并與5%HC1(40mL)—起在室溫下攪拌1h。反應混合物被轉移到分離漏斗中且分兩層。DCM層以鹽水溶液(40mL)洗滌，干燥(Na2S04)，過濾并蒸發。殘余物與MeCN(2x)共同蒸發以產生1.79g粗N-保護的NH-羅丹明染料7。N-保護的NH-羅丹明NHS酯的合成。向雙-乙酰基染料8(588mg,0.968mmol)和NHS(334mg,2.904mmol)的DCM(20mL)的溶液中，加入DCC(599mg，2.904mmol)。反應混合物在室溫下攪拌2小時，并隨后過濾反應混合物。濾液用DCM(80mL)稀釋，用H2O(50mLx2)洗滌，干燥(Na2S04)，過濾并蒸發。在二氧化硅上用快速色語純化殘余物(使用梯度為從1:1:20:78到1:5:20:74的AcOH/MeOH/EtOAc/DCM作為洗脫液)。蒸發適當的組分以產生680mg(100。/o)雙乙酰基N-保護的NH-羅丹明NHS酯10。遵循上文描述的雙乙酰基N-保護的NH-羅丹明NHS酯IO，雙-TFAN-保護的NH-羅丹明染料7(0.322mmol)的過程，以80-90。/o產率產生雙-TFAN-保護的NH-羅丹明NHS酯9。N-保護的NH-羅丹明亞磷酰胺的合成。NHS酯9(0.4mmol)被溶解在DCM(8mL)中。向此攪拌的溶液中，加入6-氨基-l-己醇/DIPEA/DCM(56mg/0.07mL/2mL)的混合物。反應在室溫下攪拌30min。經過濾除去固體副產物并在二氧化硅上用快速色譜純化濾液(使用梯度為從30%到60%的EtOAc/DCM作為洗脫液)。蒸發適當的組分以產生0.344mmol(86%)雙-TFA-己醇胺羅丹明染料11。使用相似的過程將NHS酯10^L轉化為雙-乙酰基-己醇胺NH-羅丹明染料12。向雙-TFA-己醇胺羅丹明染料11(0.338mmol)和2-氰基乙基N,N,N',N'-四異丙基亞磷酰二胺(0.214mL，0.674mmol，2當量)的DCM(10mL)溶液中，一次性加入四唑胺(4mg)。在室溫下攪拌反應混合物20h。揮發性物質經蒸發被除去且殘余物經從DCM/己烷中沉淀三次被純化。固體產物在真空下^皮千燥以產生0.256mmol(76。/。)雙-TFA-N-保護的NH-羅丹明染料亞相似地，雙-乙酰基染料12被轉化為亞磷酰胺(phospharmidite)14。實施例2:異二聚體染料網絡的合成包括連接到N-保護的NH-羅丹明上的O-保護熒光素的染料網絡如下文所闡述被合成16Rw=CH319Rw=CH3雙-乙酰基N-保護的NH-羅丹明NHS酯16(324mg，0.460mmol)被溶解在DMF(8mL)和DIPEA(0.3mL)溶液中。添加熒光素(Fluoresecin)衍生物17(239mg，0.32mmol;如在美國專利第5,800,996號中所描述被合成)且在室溫下攪拌反應混合物1h。混合物一皮蒸發且隨后與MeOH(2x)共同蒸發。殘余物被溶解在10%MeOH/DCM(100mL)中且使用鹽水溶液(IOOmL)洗滌。用10%MeOH/DCM(50mLx3)萃取水層，且干燥合并的有機層(Na2S04),過濾并蒸發。在二氧化硅上使用快速色譜純化殘余物(使用梯度為從10%到30%的MeOH/DCM作為洗脫液)。蒸發適當的組分以產生270mg(63。/o)的異二聚體染料網絡19(以DIPEA鹽形式)。對應的雙-TFA保護的染料網絡18經相似的過程被合成。實施例3:異二聚體染料網絡亞磷酰胺的合成包括作為標記部分的異二聚體染料網絡的亞磷酰胺合成試劑如下文所闡述被合成22R1。=CF324R10CF323R1<I=CH325R10-CH3異二聚體染料網絡19(0.173mmol)、DIPEA(1.028mL)和特戊酸酐(0.702mL)的DCM(IOmL)溶液在室溫下攪拌1天。添加H20(5mL)并繼續攪拌1h。用DCM(50mL)稀釋反應混合物且用H2O(40mL)洗滌。用DCM(40mL)萃取水層。干燥合并的有機層(Na2S04),過濾并蒸發。在二氧化硅上用快速色鐠純化殘余物(使用梯度為從3%到15%的MeOH/DCM作為洗脫液)。蒸發適當的組分以產生0.145mmol(84。/。)雙-乙酰基雙-新戊酰基異二聚體染料衍生物21(以DIPEA鹽形式)。染料衍生物21(0.146mmol)被懸浮在溶解的(adissolvedof)DIPEA(0.2mL)和DCM(8mL)中。添加固體N-羥基琥珀酰亞胺四曱基四氟硼酸脲(88mg)且反應在室溫下攪拌1小時。添加6-氨基-1-己醇(51mg)并繼續攪拌1小時。過濾反應混合物且用DCM(50mL)稀釋濾液。使用鹽水溶液(40mL)洗滌DCM溶液，干燥(Na2S04)，過濾并蒸發。在硅膠上使用快速色譜純化殘余物(使用梯度為從5:20:75到15:20:65的MeOH:EtOAc:DCM作為洗脫液)。蒸發適當的組分以產生0.124mmol(85。/。)染料己醇胺衍生物23(以DIPEA鹽形式)。染料衍生物23(91mg,0.057mmol)和四唑胺(2mg)被溶解在DCM(5mL)中。2-氰基乙基-N，N,N',N'-四異丙基亞磷酰胺(CE二酰胺)(0.04mL),并被加入且反應在室溫下攪拌16小時。使用TEA:EtOAc:DCM(3:20:77，3mL)溶液稀釋反應混合物并用硅膠色譜純化(使用梯度為從3:0:20:77到3:5:20:72的TEA:MeOH:EtOAc:DCM作為洗脫液)。蒸發適當的組分并從DCM/己烷中沉淀以產生75mg(74。/o)的異二聚體染料亞磷酰胺25。實施例4:包括任選的合成片斷的非核苷亞磷酰胺合成試劑的合成包括任選的式-ORe的合成片斷的非核苷亞磷酰胺合成試劑如下文所闡述被合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage85</formula>雙-TFA衍生物9(1.354mmol)被溶解在DIPEA(0.236mL)的DCM(30mL)溶液中。向攪拌的溶液中，加入連接體合成子29和DCM(0.609g，1.355mmol;如在Nelson等人，1992，Nucl.AcidsRes.20:6253-6259的描述中被合成)，所述溶液在室溫下繼續攪拌2h。加入EtOAc并將混合物裝載在二氧化硅柱上。通過使用梯度乂人5:95到1:5的EtOAc:DCM洗脫分離出純凈產物。蒸發適當的組分以產生1.25g(80。/o)的雙-TFA-羅丹明-羥基酰胺30。雙-TFA-羅丹明-羥基酰胺30(1.081mmol)和四唑胺(18.5mg)的溶液被溶解在DCM(35mL)中。添加CE二酰胺(0.685mL)且反應在室溫下攪拌18h。在減壓下除去溶劑且殘余物/人DCM/己烷(3x)中沉淀出來以產生1.081mmol(100。/。)的純凈雙-TFA-羅丹明DMT亞磷酰胺31。實施例5:標記的寡核苷酸的固相合成在AB3900自動化DNA合成儀上，使用標準操作條件，在聚苯乙烯固相支持體上合成以N-保護的NH-羅丹明亞磷酰胺合成試劑標記的寡核苷酸。N-保護的NH-羅丹明亞磷酰胺可溶在乙腈溶劑中以用于偶聯反應，且N-保護的NH-羅丹明染料加合物對重復的合成循環穩定，所述循環使用以二氯乙酸除去DMT、加入核香亞磷酰胺單體、以乙酸酐加帽及用碘氧化以產生核苷酸間磷酸酯鍵。也發現此類NH-羅丹明對用于從固相支持體中脫保護和剪切合成的標記的寡核苷酸的條件穩定(在60。C下用氬氧化銨處理1到2小時)。用于合成標記的寡核苷酸的整體合成圖在下文闡述<formula>formulaseeoriginaldocumentpage87</formula>固相支持體-寡核苦酸5'OHODMTNC31熒光素\亞磷酰胺卡同>—OH除去DMTNC--323HO-Oligo一O-J—0~^~\)一^—Ck^x^^^^NOHOHH利用此工藝，TFA-羅丹明DMT亞磷酰胺31被偶聯到連接于支持物的寡核苷酸的5'-羥基上以生成亞磷酸酯中間體32。熒光素亞磷酰胺(GlennResearch)被偶聯到中間體32的游離羥基上。所產生的標記的寡核苷酸被氧化，在60。C下以濃縮的氫氧化銨處理1-2h而從支持物上被剪切，以乙腈(aceonitrile)/水洗滌并在減壓下干燥以產生標記的寡核普酸(0ligonucleoide)33。使用標準的乙酸鈉/EtOH沉淀方法使寡核苷酸33再沉淀。標記的寡核苷酸33以大于(then)90。/。的純度及大于85%的產率^1生產(從0.2uM支持物得到170,000pM)并無需進一步純化而被使用。實施例6:以合成試劑合成的標記的寡核香晚艮現良好光譜性質用NH-羅丹明或NH-羅丹明-熒光素染料對標記的聚(脫氧胸苷)u)寡核苷酸如上文所闡述4皮合成。剪切后，記錄熒光光譜。所有合成的標記的寡核苷酸展現了良好的熒光性質。雖然前面的發明已經在一定程度上被詳細地描述以促進理解，將很明顯某些改變和修飾可在附帶權利要求的范圍內被實施。因此，描述的實施方式將被考慮為闡述性的而非限制性，且本文描述的各種發明將不限于本文提供的細節。本公開通篇并于本申請。權利要求1.一種用于標記寡核苷酸的試劑，其包括標記部分，所述標記部分包括N-保護的NH-羅丹明部分。2.根據權利要求1所述的試劑，其進一步包括磷酸酯前體基團。3.根據權利要求2所述的試劑，其為根據結構式(VII)的化合物(VII)LM-L-PEP其中LM代表所迷標記部分，PEP代表所述磷酸酯前體基團，且L代表任選的將所述標記部分連接到所述磷酸酯前體基團的連接體。4.根據權利要求3所述的試劑，其中L選自-Z-(CH2)3-6-0-、-Z-(CH2)a-[(ArV(CH2)a]c-0-、-Z-(CH2)a-[C<:-(CH2)a]c-0-、-Z-(CH2)。-[OC-(Ai%]c-(CH2)fl-0-、-Z-(CH2VNH-C(0)-[(CH2V(Ar)-(CH2)"-C(0)-NH]c-(CH2XrO-和-Z^CH^CH^OkCH^CH^O-,其中每個Z與其它彼此獨立地代表官能團Fz貢獻的鍵結的一部分；每個a與其它彼此獨立地代表范圍為從0到4的整數；每個A與其它彼此獨立地代表范圍為從1到2的整數；每個c與其它彼此獨立地代表范圍為從l到5的整數；每個d與其它彼此獨立地代表范圍為從i到io的整數；每個e與其它彼此獨立地代表范圍為從1到4的整數；每個/與其它彼此獨立地代表范圍為從1到io的整數；且每個Ar與其它4皮此獨立地代表任選耳又代的單環或多環的環烴撐、環雜烴撐、芳撐或雜芳撐基團。5.根據權利要求4所述的試劑，其中每個Ar與其它彼此獨立為一個基團，所述基團衍生自環己烷、哌溱、苯、萘、苯酚、呋喃、吡咬、哌咬、咪唑、吡咯烷或噁二唑。6.根據權利要求3所述的試劑，其為根據結構式(VII.1)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中B代表適當保護的核堿基，且I代表將核堿基B連接到標記部分LM的連接體。7.根據權利要求6所述的試劑，其中所述核堿基選自腺噤呤，7-脫氮鳥嘌呤，鳥噪呤，7-脫氮鳥噤呤，胞嘧啶，尿嘧p定，胸腺嘧啶，肌普，氧雜蒽和次黃噤呤。8.根據權利要求7所述的試劑，其中B選自AlBu、APae、CAe、Gipr-Pae、T和U。9.根據權利要求6所述的試劑，其中L2選自-OC-CH2-NH-、-C三C陽C(O)畫、-CH=CH-NH-、-CH=CH-C(0)-、-CEC-CHrNH-CCOHCHsVs-NH-、-CH-CH-CCOyNH-CCH^w-NH-CCO)-、-CeCH-CH2-O-CH2CH2-[O-CH2CH2]0.6-NH-、-OC-OC-CH2-0-CH2CH2-0-6-NH-、-OCHArVrCEC-CHrO-CHiCHHO-C^CH^o-e-NH-、國C三C-(ArV2-0國CH2CH2-。.6-NH誦和-OCHArVrO-CHsCHHO-CI^CHdo-e-NH-,其中Ar如在權利要求4中所定義的。10.根據權利要求6所述的試劑，其中-B-lA選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>11.根據權利要求2所述的試劑，其進一步包括適當保護的合成片斷。12.根據權利要求11所述的試劑,其是根據結構式(VIII)的化合物(VIII)Re。一L一LM—L一PEP其中Re代表對酸不穩定的保護基團，每個L與其他彼此獨立地代表任選的連接體，LM代表所述標記部分，且PEP代表所述磷酸酯前體基團。13.根據權利要求11所述的試劑，其是根據結構式(IX)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中LM代表所述標記部分，L代表連接體，Re代表對酸不穩定的保護基團，且PEP代表所述磷酸酯前體基團。14.根據權利要求13所述的試劑，其是根據結構式(IX.1)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中-Z-代表官能團Fz貢獻的鍵結的一部分，Sp1、SpZ和Sp"可相同或不同，其每一個代表間隔部分，且G代表CH、N或一個基團，所述基團包括芳撐、苯撐、雜芳撐、低級環烴撐、環己撐和/或低級環雜烴撐。15.根據權利要求14所述的試劑，其中Sp1、Sp"和SpS各自彼此獨立地選自含有1到10個碳原子的烴撐鏈、-(CH2)a-[(ArV(CH2)。]c-、-(CH2V[C=C-(CH2)"]C-、-(CH2)。-[OC-(H2)。-、-(CH2)rf-NH-C(OH(CH2V(Ar)-(CH2)a-C(0)-NHMCH2V和-[CH^CH^OlyCH^CI^)-,其中a、Z)、c、么e、/和Ar如在權利要求4中所定義的。16.根據權利要求13所述的試劑，其是根據結構式(IX.2)、(IX.3)、(IX.4)或(IX.5)的化合物其中B代表適當保護的核堿基，！^代表將標記部分LM連接到核石絲B的連接體，且在結構(IX.4)中，RH代表保護基團。17.根據權利要求16所述的試劑，其中所述核堿基選自腺噤呤、7-脫氮鳥噤呤、鳥噤呤、7-脫氮鳥噪呤、胞嘧咬、尿嘧咬、胸腺嘧^定、肌普、氧雜蒽和次黃噪呤。18.根據權利要求17所述的試劑，其中B選自A^、APae、CAe、GlPT—Pae、T和U。19.根據權利要求16所述的試劑，其中L2逸自-CeC-CH2-NH-、-C三C-C(O)-、-CH=CH-NH-、-CH=CH-C(0)-、-OC-CHs-NH-CCOMCH^^NH-、誦CH:CH-C(0)-NH-(CH2V6-NH-C(0).、-CeCH-CH2-O-CH2CH2-[O-CH2CH2]0—6-NH-、OC-OC-CH2-0-CH2CH2-0-6-NH-、-CECMArVrCEC-CHrO-CHsCHHO-CH^iyo—6-NH-、(IX.2)(ix.3)(IX.4)(IX.5)IPEPB—L2—LMB一L2一LM-OCHArVrO-CHzCHHO-CH^H^o—e-NH-和-OCHArVrO-CH^HHO-CHsCiyo-e-NH-,其中Ar如在權利要求4中所定義的。20.根據權利要求16所述的試劑，其中-B-I^選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>21.根據權利要求2-20中任一項所述的試劑，其中所述磷酸酯前體基團包括亞磷酰胺基團和H-膦酸酯基團。22.根據權利要求21所述的試劑，其中所述磷酸酯前體基團包括式(P.l)的亞磷酰胺<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中R"選自直鏈、支鏈或環狀的，飽和或不飽和的含有1到IO個碳原子的烴基、2-氰基乙基、含有6到10個環碳原子的芳基和含有6到10個環碳原子及1到10個烴撐碳原子的芳基烴基；及R"和R"各自彼此獨立地選自直鏈、支鏈或環狀的，飽和或不飽和的含有1到10個碳原子的烴基、含有6到10個環碳原子的芳基和含有6到10個環碳原子和1到10個烴撐碳原子的芳基烴基，或可選擇地，R21和R"與它們所鍵結的氮原子一起形成含有5個到6個環原子的飽和或不飽和環，所述環原子中一個或兩個，除了所示氮原子之外，可為選自O、N和S的雜原子。23.根據權利要求22所述的試劑R"各自為異丙基。24.根據權利要求1所述的試劑，護的合成片斷。25.根據權利要求21所述的試劑<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>(X)其中LM代表所述標記部分，體，且Re代表對酸不穩定的保護基團26.根據權利要求25所述的試劑，其中112()是卩-氰基乙基，且R"和其進一步包括固相支持體和適當保,其為根據結構式PQ的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>，L代表任選的選擇性可剪切的連接,其為根據結構式(XI.l)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中Z、G、Sp1、SpS和Re如先前在權利要求14中所定義的，且SpA代表選擇性可剪切的間隔部分。27.根據權利要求26所述的試劑，其中Sp^口SpS各自彼此獨立地選自含有1個到10個碳原子的烴撐鏈、-(CH2)。-[(ArV(CH2)。]c-、-(CH2)CH2)"〗C-、-(CH2MCc-(CH2)a-、-(CH2VNH-C(0)-[(CH2V(ArHCH2)a-C(0)-NH]c-(CH2>和-[CH^CH^OkCH^CI^)-,其中仏6、c、d、e、/和Ar如在權利要求4中所定義的，且SpA包括酯鍵結。28.根據權利要求25所述的試劑，其為根據結構式(X.2)、(X.3)、(X.4)或(X.5)的化合物其中B、I和R"如先前在權利要求16中所定義的。29.根據權利要求28所述的試劑，其中所述核堿基選自腺噪呤、7-脫氮鳥噤呤、鳥噤呤、7-脫氮鳥噪呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嗜啶、肌苷、氧雜蒽和次黃噪呤。30.根據權利要求28所述的試劑，其中B選自AlBu、APae、CAe、Gipr-Pae、T和U。31.根據權利要求28所述的試劑，其中L2選自-C三C-ch2-NH-、國C三C陽C(O)陽、-CH=CH-NH-、-CH=CH-C(0)-、-OC-CHrNH-CCOXCH^w-NH-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>-CNC-(Ar)1.2-0-CH2CH2-。.6-NH-和-(^(^(ArOw-O-CHsCHHO-CI^Ciy^-NH-,其中Ar如在權利要求4中所定義的。32.根據權利要求28所述的試劑，其中-B-L、選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>33.根據權利要求11-32中任一項所述的試劑，其中Re是4'，4"-二曱氧基^L苯甲基。34.根據權利要求1-33中任一項所述的試劑，其中所述N-保護的NH-羅丹明部分包括選自結構式(nic)、(nib)和(nic)的結構<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(!IIc)其中:R'選自R3'和氫；R"選自R"和氬;R"是酰基保護基團；R1,、R2'、R2'.R4'、R4"R3、R)R7'、R7R8'、R4、R5W和R7，當單獨采用時，各自彼此獨立地選自氫、低級烴基、(C6-C14)芳基、(C7-C20)芳基烴基、5-14元雜芳基、6-20元雜芳基烴基、-Rb和-(CH2)jrRb，其中jc是范國從1到IO的整數，且Rb選自-X、-OH、-0Ra、-SH、-SRa、-NH2、-NHRa、-NRCRC、-Wrcrcrc,全卣低級烴基、三卣代甲基、三氟甲基、-B(OH)3、-B(ORa)3、-B(OH)Cr、-B(ORa)2CT、-B(OH)(0—)2、-B(ORa)(CT)2、曙P(0H)2、-P(OH)O.、-P(ORa)2、-P(ORa)0.、-P(0)(OH)2、-P(O)(OH)O-、-P(0)(0-)2、-P(0)(ORa)2、-P(0)(ORa)CT、-P(0)(OH)(ORa)、-OP(OH)2、-OP(OH)CT、-OP(ORa)2、-OP(ORa)0-、-OP(0)(OH)2、畫OP(O)(OH)CT、-OP(0)(0)2、-OP(0)(ORa)2、-OP(0)(ORa)0-、-OP(0)(ORa)(OH)、-S(0)2CT、-S(0)2OH、-S(0)2Ra、-C(O)H、-C(0)Ra、-C(S)X、-C(O)Cr、-C(O)OH、-C(0)NH2、-C(0)NHRa、-C(0)NRcRc、-C(S)NH2、-C(0)NHRa、-C(0)NReRe、-C(NH)NH2、-C(NH)NHR，o-C(NH)NReRe,其中X是鹵素，每個Ra與其它彼此獨立地選自低級烴基、(C6-C14)芳基、(C7-C20)芳基烴基、5-14元雜芳基和6-20元雜芳基烴基，且每個Re與其它彼此獨立地為Ra，或可選擇地，兩個鍵結到相同氮原子的Re可與所述氮原子一起形成5-到8-元飽和或不飽和環，所述環可任選地包括一個或多個相同或不同的通常選自O、N和S的環雜原子，或可選擇地，Ri'和R"或lT和RS'與它們所鍵結的碳原子一起形成任選地被取代的(C6-C14)芳基橋，和/或，114'和W和/或y和rs"與它們所鍵結的碳原子一起形成苯并基團；及r3'和r6'，當單獨采用時，各自彼此獨立地選自低級烴基、(C6-C14)芳基、(C7-C20)芳基烴基、5-14元雜芳基和6-20元雜芳基烴基，或可選擇地，在結構式(IIIa)的化合物中的113'和f或y和/或R"和rs'或R7'、在結構式(III6)的化合物中的R'和y或y和/或R"和RS'或lT'或在結構式(IIIc)的化合物中的y和R"'或W和/或rs'和115'或R"與它們所鍵結的原子一起形成5-或6-元飽和或不飽和環，所述環任選地被一個或多個相同或不同的低級烴基、苯并基團或吡咬并基團取代，條件是，在結構式(IIIa)的化合物中的R2'、R4'、R5'、RT、115或r6中至少一個，在結構式(IIIb)的化合物中的R2'、R4'、R5'、R7"、R5或R6中至少一個和在結構式(IIIc)的化合物中的R2"、R4'、R5'、R7"、115或116中至少一個包括式-Y-的基團，其中Y代表官能團P所貢獻的鍵結中的一部分。35.根據權利要求34所述的試劑，其中所述N-保護的NH-羅丹明部分包^舌選自結構式(IIIa.1)、(IIIa.2)、(IIIb.l)、(IIIb.2)、(11Ic.l)和(IIIc.2)的結構<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中R'、R"、Rr、R2'、R2"、R3'、R4'、R4"、R5'、R5"、R6'、R7'、R7"、R8'、R4、R5、R6、R7、119和Y如先前在權利要求34中所定義的。36.根據權利要求34或35所述的試劑，其中所述N-保護的NH-羅丹明部分具有一個或多個選自以下的可應用特征(i)Y選自誦C(O)-、-S(0)2-、-S-和-NH-;(ii)R4和R7各自為氯；(iii)y和R8'各自為氫；(iv)R"和R"或117>和RS'—起形成苯并基團；(v)R"和R'各自為氫或低級烴基；(vi)R'是R3'且R"是R6';及(vii)R'是R3',R"是r6',且R3'和R6'與鄰近碳原子上的取代基一起形成基團，所述基團選自畫CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-C(CH3)2CH=C(CH3>、-C(CH3)2CH=CH-、誦CH2誦C(CH3)2-和^*^。37.根據權利要求31-34所述的試劑，其中rS是式-C(0)R"的芳基，其中R^選自氬、低級烴基、甲基、-CX3、-CHX2、-CH2X、-012-01111及苯基，其任選地被低級烴基、曱基、-X、-ORd、氰基或硝基單取代，其中Rd選自低級烴基、苯基和吡啶基，且每一個X是卣基團，通常為氟或氯。38.根據權利要求37所述的試劑，其中R"選自甲基和三氟甲基。39.根據權利要求1-38中任一項所述的試劑，其中所述標記部分進一步包括所述N-保護的NH-羅丹明部分的供體和/或受體部分。40.根據權利要求1-38中任一項所述的試劑，其中所述標記部分進一步包括所述N-保護的NH-羅丹明部分的供體部分。41.根據權利要求40所述的試劑，其中所述供體部分包括和所述N-保護的NH-羅丹明部分或O-保護的熒光素部分。42.根據權利要求41所述的試劑，其中所述供體部分的2，-、2"-、4'-、5'-、7'-、7"-、5-或6-位被連接到所述N-保護的NH-羅丹明部分的2'-、2"-、4'-、5'-、7'國、7"-、5-或6-位上。43.根據權利要求42所述的試劑，其中所述供體部分和所述N-保護的NH-羅丹明部分以頭對頭方位^皮連接。44.根據權利要求42所述的試劑，其中所述供體部分和所述N-保護的NH-羅丹明部分以頭對尾方位被連接。45.根據權利要求42所述的試劑，其中所迷供體部分和所述N-保護的NH-羅丹明部分以尾對尾方位被連接。46.根據權利要求42所述的試劑，其中所述供體部分和所述N-保護的NH-羅丹明部分以側對側方位被連接。47.根據權利要求42所述的試劑，其中所述供體部分和所述N-保護的NH-羅丹明部分以側對頭方位—皮連接。48.根據權利要求42所述的試劑，其中所述供體部分和所述N-保護的NH-羅丹明部分以側對尾方位一皮連接。49.根據權利要求42所述的試劑，其中所述標記部分包括結構式(VI):(VI)A-ZL-Sp-Z2-D其中A代表所述N-保護的NH-羅丹明部分，D代表所述供體部分，^和zs可相同或不同，其代表包括官能團Fz的連接部分所提供的鍵結的部分，且Sp代表間隔部分。50.根據權利要求49所述的試劑，其中A選自結構式A.l、A.2、A.3、A.4、A.5和A,6且D選自結構式D.1、D.2、D.3、D.4、D.5和D.6，或A選自結構式A.7、A.8、A.9、A.IO、A.ll和A.12且D選自結構式D.7、D.8、D.9、D.IO、D.ll和D.12:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>D.10D.11D-12其中Ei選自-NHR9、-服3'119和-011%;e2選自-NHR9、-NR6'R、-OR9b;yla、ylb、y2a、y2b、y3a和Y兆各自彼此獨立地選自-O-、-S-、-NH-、-C(O-)和-S(O)r;且r'、r"、rr、r2'、r2"、r3、r4'、r4"、r5'、r5"、r6'、r7、r7"、R8'、R4、R5、R6、W和R"口先前在權利要求34中所定義的，條件是當E1和￡2是-011%時，則W和r"和/或r"'和rs'可僅與它們所鍵結的碳原子一起形成任選取代的(C6-C14)芳基橋。51.根據權利要求50所述的試劑，其中結構式A.1-A.12和/或D.1-D.12具有一個或多個選自以下的可應用特征(i)Yla、Yh和Y"各自彼此獨立地選自《(0)-和-8(0)2-;(ii)Ylb、Y"和Y3b是-NH畫；(iii)R4和R7各自為氯；(iv)W和R8'各自為氫；(v)y和R"或lT和Rs'—起形成苯并基團；(vi)W和FT各自為氫或低級烴基；(vii)R'是R3'且R"是R6';及(viii)R'是R3，，R"是W,且RS'和RS'與鄰近碳原子上的取代基一起形成基團，所述基團選自-012012-、-CH2CH2CH2-、-C(CH3)2CH=C(CH3)-、-C(CH3)2CH=CH-、-(3112-€;(013)2-和^^。52.根據權利要求50所述的試劑，其中Yla、Y^和Y"是-NH-;Ylb、Y化和y3b選自-C(0)-和-S(0)2-;Z1選自-0:(0)-和-3(0)2-;Z2是-NH-且Sp選自-(CH2)a-[(ArV(CH2)o〗c-、-(CH2V[OC-(CH2)。]c-、-(CH2)a-[Cc-(CH2)a-、-(CH2VNH-C(0)-[(CH2)。-(Ar)-(CH2)。-C(0)-NH]c-(CH2V和-[CH2(CH2)eO]/-CH2(CH2)-，其中"、6、c、d、e、/和Ar如先前在權利要求4中所定義的。53.根據權利要求50-52所述的試劑，其中在結構式d.1-d.12中，r1和r"和/或lT和rs'與它們所鍵結的碳原子一起形成苯并橋。54.根據權利要求50-53所述的試劑，其中W和ES各自為-or915。55.根據權利要求54所迷的試劑，其中rM是式-C(0)R^的芳基，其中R艦是低級烴基。56.根據權利要求55所述的試劑，其中r肌是叔丁基。57.根據權利要求50-56所述的試劑，其中W是式-C(0)RW的芳基，其中R^選自氫、低級烴基、甲基、-CX3、-CHX2、-CH2X、-012-01111和苯基，其任選地被低級烴基、甲基、-X、-ORd、氰基或硝基單取代，其中Rd選自低級烴基、苯基和吡咬基，且每一個X是卣基團，通常為氟或氯。58.根據權利要求57所述的試劑，其中R^選自曱基和三氟曱基。59.—種寡核苷酸，其包括標記部分，所述標記部分包括N-保護的NH-羅丹明部分。60.根據權利要求59所述的寡核苷酸，其中所述N-保護的NH-羅丹明部分包括在權利要求31-58中任一項所描述的結構。61.根據權利要求59所述的寡核苷酸，其中所述標記部分被連接到所述寡核苷酸的3'-或5'-羥基上。62.根據權利要求59所述的寡核苷酸，其中所述標記部分被連接到所述寡核苷酸的核威基上。63.根據權利要求59所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被連接到固相支持體上。64.根據權利要求59所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸進一步用所述N-保護的NH-羅丹明部分的供體和/或受體部分標記。65.根據權利要求59所述的寡核苷酸，其中所述寡核香酸進一步用猝滅劑部分標記。66.根據權利要求59所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸進一步用小溝結合部分標記。全文摘要本公開提供一種試劑，其可用于以羅丹明染料或含有羅丹明染料的染料網絡標記合成的寡核苷酸。文檔編號C07D405/00GK101454315SQ200780019599公開日2009年6月10日申請日期2007年4月2日優先權日2006年3月31日發明者喬納森·M·卡塞爾,保羅·M·肯尼,克利須那·G·優波達亞,斯科特·C·本森,瑞明·N·鄒申請人:應用生物系統有限公司