專利名稱：：腫瘤的診斷和治療的制作方法
技術領域：
：本發明涉及腫瘤生長和腫瘤類型的領域。本發明涉及腫瘤的抑制物和診斷標志物，以及它們用于癌癥和腫瘤生長的診斷和治療的用途。
背景技術：
：惡性腫瘤(癌)是在美國位居心臟病之后的第二位致死原因(參見例如Boringda/.，C4Ca"ce/J43:7(1993))。癌的特征為衍生自正常組織的異常或贅生性細胞的數目增加，所述細胞增殖形成腫瘤塊；這些贅生性肺瘤細胞侵入鄰近組織；及產生惡性細胞，所述惡性細胞最終經血液或淋巴系統傳播至局部淋巴結并經稱為轉移的過程傳播至遠處。在癌性狀態，細胞在正常細胞不會生長的條件下增殖。癌自身表現為極其多種形式，特征為不同程度的侵襲力和進攻性。多種類型的療法已經被用于治療癌癥。例如，使用手術方法來切除癌性的或死亡的組織。通過縮小實體瘤來起作用的放射療法和快速殺死正在分裂的細胞的化學療法被用作癌癥療法。此外，抗血管發生劑是一種有效的抗癌策略。這些療法也在增強，同時其它療法正在發展，例如免疫療法。現在完全確立了血管發生(angiogenesis)牽涉多種病癥的發病機理。這些包括實體瘤和轉移、動脈粥樣硬化、晶狀體后纖維組織增生、血管瘤、慢性炎癥、眼內新血管疾病諸如增殖性視網膜病例如糖尿病性浮見網膜病、年齡相關黃斑變性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜組織和其它組織的免疫排斥、類風濕性關節炎、和銀屑病。Folkman"a/.，所o/.C/zem,267:10931-34(1992);Klagsb匿efa/.,j畫.iev.尸—'o/.53:217-39(1991);及GamerA.,"Vasculardiseases",于《PathobiologyofOcularDisease.ADynamicApproach》，GarnerA和KlintworthGK編，第2版，MarcelDekker,NY,1994，pp1625-1710。在腫瘤生長的情況中，血管發生對于自增生至瘤形成的轉換，及為胂瘤的生長和轉移提供營養似乎是至關重要的。FolkmanefA^wre339:58(1989)。新血管形成(neovascularization)讓腫瘤細胞獲得了與正常細胞相比的生長優勢和增殖自治。腫瘤通常開始于單個異常細胞，由于與可利用毛細管床的距離，該細胞只能增殖至幾立方毫米的尺寸，而且它能在較長的一段時間里保持"休眠，，狀態而不進一步生長和傳播。有些腫瘤細胞然后轉向血管發生表型以激活內皮細胞，所述內皮細胞增殖并成熟成新的毛細血管。這些新形成的血管不僅讓原發性腫瘤繼續生長，而且讓轉移性腫瘤細胞傳播并再建群(recolonization)。因而，在胂瘤切片中的微血管密度與乳腺癌及數種其它腫瘤的患者存活之間觀察到了相關性。Weidnerefa/.,iV.乂324:1-6(1991);Horak"a/.，丄a"ce"40:l120-24(1992);Macchiarini&a/.，丄a"c^340:145-46(1992)。尚未完全了解控制血管發生轉換的精確機制，但是認為肺瘤塊的新血管形成源自眾多血管發生刺激物與抑制物的凈平衡。Folkman,淑她d1(1):27-31(1995)。血管內皮生長因子(VEGF)作為病理學狀況中血管發生的主要調節物的認識已經引起了許多嘗試來阻斷VEGF活性。VEGF是最好表征的和最強力的血管發生正調節物之一。參見例如Ferrara，N.&Kerbel,R.S.Andoge腦isasatherapeutictarget.A^fwre438:967-74(2005)。在作為血管發生和血管生成(vasculogenesis)中的血管發生因子之外，VEGF作為多效性生長因子展現了在其它生理學過程中的多種生物學效應，諸如內皮細胞存活、血管通透性和血管舒張、單核細胞趨化性和釣流入。FerraraandDavis-Smyth，iev.18:4-25(1997)。此外，研究已經報導了VEGF對數種非內皮細胞類型，諸如視網膜色素上皮細胞、胰管細胞和施旺細胞的促有絲分裂效果。參見例如Guerrin&a/.，JCW/戶/^w'o/.164:385-394(1995);Oberg-Welsh"a/.,Mo/,CW/.五油cn."o/.126:125-132(1997);及Sondella/.,腸r固'.19:5731-5740(1999)。已經有許多嘗試來阻斷VEGF活性。抑制性抗VEGF受體抗體、可溶性受體構建物、反義策略、針對VEGF的RNA適體和低分子量VEGF受體酪氨酸激酶(RTK)抑制物都被提出用于干擾VEGF信號傳導。參見例如Siemeister"a/.,C朋cerMetoWa^iev.17:241-248(1998)。抗VEGF中和性抗體已經顯示了在棵鼠中抑制多種人類腫瘤細胞系的生長(Kim"a/.，TVafwre362:841-844(1993);Warren"a/.,JC//",/we"95:1789-1797(1995);Borgstr6m"a/.,C"艦rL56:4032-4039(1996);及Melnyk，C騰wM56:921-924(1996))，并且還在缺血性視網膜病癥的模型中抑制了眼內血管發生。Adamisda/.,Ac/7.Qp/^/za/mo/.114:66-71(1996)。實際上，人源化抗VEGF抗體貝伐單4元(bevadzumab,AVASTIN,Genentech，SouthSanFrancisco,CA)已經被USFDA批準作為轉移性結腸直腸癌的第一線療法。參見例如Ferrara"a/.，脂,i>wgZXscove3:391-400(2004)。然而，治療性化合物干擾肺瘤生長的長期能力經常受到藥物抗性的發生/發展的限制。已經鑒定了和在功能上表征了針對多種細胞毒性化合物的抗性的數種機制，主要是在單細胞腫瘤模型中。參見例如Longley,D.B.&Johnston,RG.,Molecularmechanismsofdrugresistance.>//to/zo/205:275-92(2005)。此外，宿主基質-腫瘤細胞相互作用可能牽涉藥物抗性表型。基質細胞分泌多種促血管發生因子，而且不傾向于與腫瘤細胞相同的遺傳不穩定性禾口在突變率方面的升高(Kerbel,R.S.，Inhibitionoftumorangiogenesisasastrategytocircumventacquiredresistanc6toanti-cancertherapeuticagents.S/oawa"13:31-6(1991)。纟宗述見Ferrara&Kerbel及Hazlehursta/.于Ferrara，N.&Kerbel，R.S.，Angiogenesisasatherapeutictarget.Atowre438:967-74(2005);及Hazlehurst,L.A.，Landowski,T.H,&Dalton，W.S.，Roleofthetumormicroenvironmentinmediatingdenovoresistancetodrugsandphysiologicalmediatorsofcelldeath.O"coge"e22:7396-402(2003)。在臨床前模型中，利用人源化單克隆抗體貝伐單抗(bevacizumab，AVASTIN,Genentech，SouthSanFrancisco,CA)或貝伐單抗的鼠前體(A4.6.1;產生A4.6.1的雜交瘤細胞系于91年3月29日保藏，ATCCHB-10709)阻斷VEGF信號傳導在所測試的大多數異種移植物模型中顯著抑制了腫瘤生長并降低腫瘤血管發生(綜述見Gerber&Ferrara于Gerber，H.P.&Ferrara，N.，Pharmacologyandpharmacodynamicsofbevadzumabasmonotherapyorincombinationwithcytotoxictherapyinpreclinicalstudies.Ca"ceri^&s65:671-80(2005))。當在腫瘤生長早期階段開始治療時，單一藥劑抗VEGF治療的藥理學效果是最顯著的。如果治療延遲到腫瘤很好地建立，那么抑制效果一般是短暫的，而且紳瘤最終發生/發展出抗性。參見例如Klement,G."/.，Differencesintherapeuticindexesofcombinationmetronomicchemotherapyandananti-VEGFR-2antibodyinmultidrug-resistanthumanbreastcancerxenografts.C//"C朋cwi^s8:221-32(2002)。作為針對抗VEGF治療的此類抗性的基礎的細胞和分子事件是復雜的。參見例如Casanovas,O.,Hicklin，D丄，Bergers,G.&Hanahan,D.,DrugresistancebyevasionofantiangiogenictargetingofVEGFsignalinginlate-stagepancreaticislettumors.CW/8:299-309(2005);及Kerbel,R.S.,Possiblemechanismsofacquiredresistancetoanti-angiogenicdrugs:implicationsfortheuseofcombinationtherapyapproaches.Ca"cerA/etoWaw》Tev20:79-86(2001)。可能牽涉多種因子。例如，與輩巴向VEGF和成纖維細胞生長因子(FGF)信號傳導的化合物的組合治療在胰島癌發生的成因模型中改善了效力且延遲了晚期階段腫瘤中抗性的發作。參見Casanovas,O.,Hicklin，D丄，Bergers,G.&Hanahan,D.，DrugresistancebyevasionofantiangiogenictargetingofVEGFsignalinginlate-stagepancreaticislettumors.Ce//8:299-309(2005)。其他研究人員已經鑒定了腫瘤浸潤性基質成纖維細胞作為可選擇的促血管發生因子的有力來源。參見例如Dong,J.a/.，VEGF-nullcellsrequirePDGFRalphasignaling-mediatedstromalfibroblastrecruitmentfortumorigenesis.￡m6oJ23:2800-10(2004);及Orimo，A.,StromalfibroblastspresentininvasivehumanbreastcarcinomaspromotetumorgrowthandangiogenesisthroughelevatedSDF-1/CXCL12secretion.CW/121:335-48(2005)。炎性細胞可通過分泌炎性細胞因子參與血管發生，所述炎性細胞因子可影響內皮細胞活化、增殖、遷移和存活(綜述見Albinia/.及Balkwi11"a/.于Albini,A.,Tosetti,F.，Benelli,R.&Noonan,D.M.,Tumorinflammatoryangiogenesisanditschemoprevention.Ga"cer65:10637-41(2005);及Balkwill,F.,Charles,K.A.&Mantovani,A.,Smolderingandpolarizedinflammationintheinitiationandpromotionofmalignantdisease.Ca"cerCe〃7:211-7(2005)。數種肺瘤浸潤性炎性細胞分泌促血管發生因子，包括單核細月包/巨p藍細月包(參見傘'H口DePalma,M.da/.,Tie2identifiesahematopoieticlineageofproangiogenicmonocytesrequiredfortumorvesselformationandamesenchymalpopulationofpericyteprogenitors.Ga"cerCe〃8:211-26(2005);及Yang,L.a/.，ExpansionofmyeloidimmunesuppressorGr+CDllb+cellsintumor-bearinghostdirectlypromotestumorangiogenesis.Co"cerCe〃6:409-21(2004))、T和B淋巴細胞(參見例如Freeman，M.R.effl/,,PeripheralbloodTlymphocytesandlymphocytesinfiltratinghumancancersexpressvascularendothelialgrowthfactor:apotentialroleforTcellsinangiogenesis.Qmcer55:4140-5(1995))、血管的白細胞(參見例如Conejo-Garcia,J.R."a/.,Vascularleukocytescontributetotumorvascularization,^/ood105:679-81(2005))、樹突纟田月包(參見例如Conejo-Garcia,J.R.a/.,Tumor-infiltratingdendriticcellprecursorsrecruitedbyabeta-defensincontributetovasculogenesisundertheinfluenceofVegf-A.10:950-8(2004))、嗜中性細胞(參見例如Coussens,L.M,Tinkle,C.L.,Hanahan,D.&Werb,Z.，MMP-9suppliedbybonemarrow-derivedcellscontributestoskincarcinogenesis.Ce〃103:481-90(2000))、及月巴大細月包(參見例3口Coussens,L.M.a/.,Inflammatorymastcellsup-regulateangiogenesisduringsquamousepithelialcarcinogenesis.C7e"esDev13:382-97(1999);及綜述見deVisserandCoussens于deVisser,K.E.,Eichten,A.&Coussens,L.M.,Paradoxicalrolesoftheimmunesystemduringcancerdevelopment.胸ievC朋cer6:24-37(2006))。有提出骨髓衍生的內皮祖細胞(EPC)(參見i"列^口Lyden,D,e"/.，Impairedrecruitmentofbone-marrow-derivedendothelialandhematopoieticprecursorcellsblockstumorangiogenesisandgrowth.淑Afed7:1194-201(2001))和血管周的祖細胞(參見例如Song,S.,Ewald,A丄，Stallcup,W.,Werb,Z.&Bergers，G，PDGFRbeta+perivascularprogenitorcellsintumoursregulatepericytedifferentiationandvascularsurvival.AtoCe〃5/o/7:870-9(2005))在胂瘤生長的有些實驗模型中促進血管發生(綜述見Rafiida/.于Rafii,S.，Lyden,D.,Benezra,R.，Hattori,K.&Heissig,B.,Vascularandhaematopoieticstemcells:noveltargetsforanti-angiogenesistherapyAtoievCa"cer2:826-35(2002))。髓樣譜系造血細胞，包括腫瘤相關巨p藍細胞(TAM),顯示了直接地通過分泌血管發生因子或間接地通過產生細胞外基質降解蛋白酶、繼而釋放被隔離的血管發生因子來刺激血管生成(綜述見Lewis,C.E.&Pollard，J.W.，Distinctroleofmacrophagesindifferenttumormicroenvironments.Ca"cer/esearc/z66:605-612(2006);及Naldini,A.&Carraro,F.，Roleofinflammatorymediatorsinangiogenesis.Cw/r￡)rwgTbrg她/"yfe"徹j〃w^4:3-8(2005))。在髓樣細胞譜系中，分離自攜瘤小鼠脾臟的CDllb+Grl+祖細胞在與肺瘤細胞共注射時促進血管發生(參見例如Yang,L.g,,ExpansionofmyeloidimmunesuppressorGr+CDllb+cellsintumor-bearinghostdirectlypromotestumorangiogenesis.Ca"cerCW/6:409-21(2004)),而且腫瘤浸潤性巨噬細胞數目與有些人類腫瘤中的不良預后有關(綜述見Balkwillda/.于Balkwill,R,Charles,K.A.&Mantovani,A.,Smolderingandpolarizedinflammationintheinitiationandpromotionofmalignantdisease.Ca"cerCe〃7:211-7(2005))。然而，在另一項研究中，巨喧細胞抑制了小鼠中實驗腫瘤的生長，表明它們作為抗癌療法的潛力。參見例如Kohchi，C.a/.，Utilizationofmacrophagesinanticancertherapy:themacrophagenetworktheory.勘f/ca"cer24:3311-20(2004)。盡管髓樣細胞的相對豐度和它們產生前血管生成因子的潛力，它們在針對抗VEGF治療的腫瘤抗性中的作用仍然是未知的。需要發現并了解髓樣細胞的生物學功能、抗性肺瘤、及它們產生的因子。本發明解決了這些和其它需要，在閱讀以下公開內容后將變得顯而易見。發明概述本發明提供了用于診斷和治療抗性腫瘤的方法和組合物。進一步的，提供了使用組合治療來治療抗性胂瘤的方法。例如，一種方法包括向具有抗性腫瘤的受試者施用有效量的VEGF拮抗劑以及有效量的第二藥劑，其中所述第二藥劑包含髓樣細胞減少劑。所述髓樣細胞減少劑能降低或完全消融髓樣細胞，例如CDllb+Grl+髓樣細胞。在本發明的某些實施方案中，髓樣細胞減少劑包括但不限于例如Grl拮抗劑、CDllb拮抗劑、CD18拮抗劑、彈性蛋白酶抑制劑、MCP-1拮抗劑、MIP-la拮抗劑、氯膦酸鹽等。在一個實施方案中，所述拮抗劑是抗體。本發明還提供了用于診斷抗性腫瘤的方法和用于診斷抗性腫瘤的標志物集。在本發明的某些實施方案中，一種方法包括診斷受試者中的抗性肺瘤，所述方法包括從所述受試者提供來自所述受試者的肺瘤或所述受試者的血液的測試細胞群體；測量所述測試細胞群體中CDllb+Grl+細胞的數目或百分比；與參考細胞群體(例如，來自抗VEGF敏感性腫瘤的細胞群體)中CD11b+Gr1+細胞的數目或百分比比較所述測試細胞群體中CD11b+Gr1+細胞的數目或百分比；并，檢測與所述參考細胞群體相比在所述測試細胞群體中CDllb+Grl+的數目或百分比的增加，其中CDllb+Grl+的數目或百分比增加表明所述腫瘤是抗性胂瘤。在一個實施方案中，所述方法進一步包括測量所述受試者的脾臟大小，并與參考脾臟大小(例如，當所述受試者沒有腫瘤時或當所述受試者對VEGF拮抗劑治療敏感時所述受試者的脾臟大小、或對VEGF拮抗劑治療敏感的其他人的脾臟大小的數據庫)比較所述受試者的脾臟大小，其中脾臟大小增大表明所述腫瘤是抗性肺瘤。在又一個實施方案中，所述方法進一步包括測量所述受試者施用VEGF拮抗劑之后所述受試者中腫瘤的血管表面積(VSA)的數目或百分比，與參考血管表面積(例如，來自抗VEGF敏感性腫瘤的血管表面積)比較所述受試者中腫瘤的血管表面積的數目或百分比，其中腫瘤的血管表面積的數目或百分比增加表明所述腫瘤是抗性腫瘤。在一個實施方案中，所述拮抗劑是抗體。在本發明的另一個實施方案中，一種方法包括診斷受試者中的抗性腫瘤，所述方法包括從所述受試者提供來自所述受試者的腫瘤的測試細胞群體；測量所述測試細胞群體中CD19B-淋巴樣細胞或CDllc樹突細胞的數目或百分比；與參考細胞群體中CD19B-淋巴樣細胞或CDllc樹突細胞的數目或百分比比較所述測試細胞群體中CD19B-淋巴樣細胞或CDllc樹突細胞的數目或百分比；并，檢測與所述參考細胞群體相比在所述測試細胞群體中CD19B-淋巴樣細胞或CDllc樹突細胞的數目或百分比的降低，其中CD19B-淋巴樣細胞或CDllc樹突細胞的數目或百分比降低表明所述腫瘤是抗性腫瘤。在又一個實施方案中，一種方法包括診斷受試者中的抗性腫瘤，所述方法包括從所述受試者提供來自所述受試者的骨髓的測試細胞群體；測量所述測試細胞群體中CD90T-淋巴樣纟田月包、CD19B-淋巴樣細胞或CD11c樹突細胞的數目或百分比；與參考細胞群體中CD90T-淋巴樣細胞、CD19B-淋巴樣細胞或CDllc樹突細胞的數目或百分比比較所述測試細胞群體中CD90T-、淋巴樣細胞、CD19B-淋巴樣細胞或CDllc樹突細胞的數目或百分比；并，檢測與所述參考細胞群體相比在所述測試細胞群體中CD90T-淋巴樣細胞、CD19B-淋巴樣細胞或CDllc樹突細胞的數目或百分比的降低，其中CD90T-淋巴樣細胞、CD19B-淋巴樣細胞或CDllc樹突細胞的數目或百分比降低表明所述腫瘤是抗性腫瘤。在本發明的另一個實施方案中，一種方法包括用組合治療來治療受試者中的抗性腫瘤，所述方法包括向具有抗性腫瘤的受試者施用有效量的VEGF拮抗劑以及有效量的髓樣細胞減少劑和有效量的第三藥劑，其中所述第三藥劑是化療劑。在一個實施方案中，所述拮抗劑是抗體。在本發明的某些實施方案中，髓樣細胞減少劑包括但不限于例如Grl拮抗劑、CDllb拮抗劑、CD18拮抗劑、彈性蛋白酶抑制劑、MCP-1拮抗劑、MIP-la拮抗劑、氯膦酸鹽等。在又一個實施方案中，所述化療劑是5FU、吉西他濱或在本文中列出的化療劑。在本發明的一個實施方案中，本發明的方法包括從所述受試者提供來自所述受試者的腫瘤的測試細胞群體；測量所述測試細胞群體中分子的表達、水平或活性；與參考細胞群體中所述分子的表達和/或活性比較所述測試細胞群體中所述分子的表達、水平或活性；并，檢測與所述參考細胞群體(例如，來自抗VEGF治療敏感性腫瘤的細胞群體)相比在所述測試細胞群體中所述分子的表達和/或活性的改變，其中所述分子是編碼蛋白質的核酸或由所述核酸編碼的蛋白質，從而診斷或確定所述受試者中的抗性胂瘤。在某些實施方案中，具有改變的表達和/或活性的蛋白質包括但不限于例如IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13、IL-4R、THBS1、Crea7、MSCA、MIP2、IL-8R、G-CSF、IL10-R2、THBSP-4和JAM-2。在表達和/或活性方面的改變可以是一種或多種蛋白質、兩種或更多、三種或更多、四種或更多、五種或更多、六種或更多、七種或更多、八種或更多、九種或更多、十種或更多、十一種或更多、十二種或更多、十三種或更多、十四種或更多、或所有的蛋白質。在本發明的某些實施方案中，所述分子的表達^Ui調，所述蛋白質包括但不限于例如IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13、IL-4R、MSCA、MIP2、IL-8R和G-CSF。在本發明的某些實施方案中，所述分子的表達被下調，所述蛋白質包括但不限于例如THBS1、Crea7、IL10-R2、THBSP-4和JAM-2。如上所述，在本發明的某些實施方案中，一種方法包括從所述受試者提供來自所述受試者的腫瘤或所述受試者的血液的測試細胞群體；測量所述測試細胞群體中CDllb+Grl+細胞的數目或百分比；與參考細胞群體(例如，來自抗VEGF敏感性肺瘤的細胞群體)中CDllb+Grl+細胞的數目或百分比比較所述測試細胞群體中CDllb+Grl+細胞的數目或百分比；并，；險測與所述參考細胞群體相比在所述測試細胞群體中CDllb+Grl+的數目或百分比的增加，其中CDllb+Grl+的數目或百分比增加表明所述肺瘤是抗性腫瘤。在一個實施方案中，所述方法進一步包括檢測與所述參考細胞群體相比在所述測試細胞群體中分子的表達或活性的改變，其中所述分子是編碼蛋白質的核酸或所述蛋白質，其中所述蛋白質包括但不限于例如IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13、IL-4R、THBSl和Crea7。在某些實施方案中，一種或多種、兩種或更多、三種或更多、四種或更多、五種或更多、六種或更多、七種或更多、或所有的蛋白質的表達和/或活性方面存在改變。本發明還提供了標志物集合來鑒定抗性腫瘤。例如，標志物集合可以包括兩種或更多、三種或更多、四種或更多、五種或更多、六種或更多、七種或更多、八種或更多、九種或更多、十種或更多、十一種或更多、十二種或更多、十三種或更多、十四種或更多、或整個種集合的分子。所述分子是編碼蛋白質的核酸或是蛋白質，所述蛋白質具有改變的表達和/或活性的且選自IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13、IL-4R、THBS1、Crea7、MSCA、MIP2、IL-8R、G-CSF、IL10-R2、THBSP-4和JAM-2。在一個實施方案中，所述分子衍生自CDllb+Grl+細胞，且包括例如IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13、IL-4R、THBSl和Crea7。在另一個實施方案中，所述分子衍生自抗性腫瘤，且包括例如MSCA、MIP2、IL-8R、G-CSF、IL10-R2、THBSP-4和JAM-2。附圖簡述附圖1畫面a-f說明了同基因的腫瘤細胞系針對抗VEGF治療的抗性與它們募集BMMNC的潛力有關。(a)異種移植的LLC、EL4和B16F1腫瘤在用抗VEGF抗體G6-23或對照抗體(抗豚草)治療的C57BL/6，GFP骨髓嵌合小鼠(n=5)中的生長曲線。在第二天，通過IOmg/kg的對照抗體、G-23的腹膜內(IP)施用來開始治療，每周兩次。顯示的數據是來自三個獨立實驗的一個代表的平均值±標準偏差。(b)EL4腫瘤在用對照(10和50mg/kg,IP,每周兩次)或G6-23(10和50mg/kg，IP，每周兩次)治療的米色凈果XID小鼠(n=10)中的生長。治療在腫瘤細胞植入之后第l天開始。統計分析使用ANOVA禾呈序來"^M古，*p《0.05，**p<0.005。(c)LCC月中瘤(n=10)在^口(b)所描述的米色棵XID小鼠中的生長，分別每周兩次地IP施用G6-23(10和IOOmg/kg)和對照(100mg/kg)。(d)治療14天的B16F1、EL4和LLC月中瘤細胞懸浮液(11=4)的FACS分析。在抗VEGF治療的EL4和LLC腫瘤中鑒定出相對于B16F1腫瘤的提高的GFP+BMMNC數目。(e)在用對照或抗VEGF抗體治療14天的EL4、LLC和B16F1肺瘤切片中CD31+和GFP+細胞的免疫熒光染色。與EL4和LCC腫瘤相比，鑒定出在B16Fl腫瘤的基質中GFP+細胞的降低的存在和CD31+血管的數量的顯著降低。顯示的數據是來自三個獨立實驗的每個組的一個代表性切片。(f)在治療14天的腫瘤異種移植物中血管表面積(VSA)的定量。抗VEGF治療的B16F1腫瘤與LLC或EL4肺瘤相比顯示了血管表面積的更顯著的降低。顯示的數據是每個治療組中3到5個腫瘤的9到15個切片的平均值±平均值標準誤差。附圖2畫面a-d說明了肺瘤混合實驗和與分離自GFP嵌合小鼠的骨髓和肺瘤的GFP+混合的B16F1肺瘤的生長曲線。(a)當與分離自帶有EL4、LLC或B16F1腫瘤的小鼠的1(^個BMMNC混合并用對照抗體處理時，2.5x106個B16F1腫瘤細胞的生長。作為對照，顯示了來自用matrigel植入的小鼠或對照小鼠的BMMNC。(n=5)(b)與分離自帶有EL4、LLC或B16F1肺瘤的小鼠并用抗￥￡0抗體處理的0+BMMNC混合的B16F1腫瘤的肺瘤生長曲線。EL4和LLC腫瘤衍生的GFP+骨髓細胞顯著地提高了抗VEGF敏感性B16F1腫瘤的生長(n=4)。(a)和(b)中顯示的數據來自至少兩個獨立實驗的一個代表。(c和d)當與分離自用對照抗體(c)或抗VEGFG6-23(d)處理的14天齡、EL4、LLC或B16F1腫瘤的5x1()5個GFP陽性細胞混合時，2x106個B16F1腫瘤的生長。附圖3畫面a-f說明了在體外的細胞遷移實驗、體內的腫瘤和骨髓中CD1lb、Grl細胞的頻率分析和它們在介導針對抗VEGF的抗性方面的功能作用。分離自帶有EL4和LLC腫瘤的小鼠的CDllb+Grl+細胞是介導針對抗VEGF治療的抗性的主要BM細胞群體。(a)在暴露于來自對照或抗VEGF治療的EL4、LLC或B16F1腫瘤的條件化培養基之后，來自新鮮分離的BMMNC的遷移CDllb+Grl+陽性細胞的數目。兩種抗VEGF抗性腫瘤(EL4、LLC)都誘導了獨立于VEGF的遷移。(b)來自植入有EL4、LLC和B16F1月中瘤、并用對照或抗VEGF治療的小鼠的肺瘤分離物的多譜系分析。EL4和LLC，而不是B16F1腫瘤，顯示了CDllb+Grl+細胞的顯著增力。。顯示的數據來自兩個獨立實驗的一個代表。(c)來自植入有EL4、LLC和B16F1腫瘤的小鼠的腫瘤和骨髓分離物的多語系分析。與腫瘤分離物相反(附圖3b),在攜瘤小鼠的骨髓中沒有CDllb+或Grl+細胞的一致提高。顯示的數據來自兩個獨立實驗的一個代表。(d)與EL4和LLC致敏的、骨髓衍生的CDllb+Grl+細胞混合的、并用抗VEGF(G6-23,每組『5)處理的B16F1腫瘤的生長曲線。CDllb+Grl+細胞是介導抗性所必需的且足夠的，因為消減了CDllb+Grl+細胞的BMMNC顯示了介導抗性的降低的潛力。顯示的數據來自兩個獨立實驗的一個代表。(e和f)與分離自帶有EL4(e)和LLC(f)腫瘤的小鼠的CDllb+GrH細胞相關的肺瘤混合的B16F1細胞的生長曲線。大約地，從帶有EL4或LLC腫瘤的小鼠分離了3x1()5個FACS分選的CDllb+Grl+細胞，與3x106個B16Fl細胞混合并植入C57BL/6小鼠(n=5)中。附圖4畫面a-d說明了骨髓細胞和肺瘤分離物的基因表達分析。(a)分離自小鼠骨髓的CDllb+Grl+細胞的基因表達數據的無監督聚類分析(unsupervisedclusteranalysis),所述小鼠植入有抗VEGF抗性的EL4(ER1-3)、LLC(LR1-3)或抗VEGF敏感性B16F1胂瘤(BR1-3),并用抗VEGF治療。對于分級聚類(hierarchicalclustering)方法，數據針對對照matrigel植入的'J、鼠來標準化。顯示了下調的、不變的和上調的基因。可以鑒定出抗VEGF抗性腫瘤誘導的改變的特征集合，其不同于抗VEGF敏感性腫瘤所誘導的。(b)可能牽涉血管發生或髓樣細胞分化和遷移的調節、在用抗VEGF處理17天的抗VEGF抗性和敏感性腫瘤之間，在骨髓CDllb+Grl+細胞中表達水平顯著改變的(p=0.05,>2倍)基因的展示。(c)從分離自G6-23處理17天后的EL4、LLC和B16F1腫瘤的RNA產生的基因表達數據的無監督聚類分析。(d)潛在牽涉血管發生和/或髓樣細胞分化和遷移的調節、在用G6-23處理17天之后，相對于B16F1肺瘤(BR1-3)在兩種抗VEGF抗性腫瘤(EL4-ER1-3，LLC=LRl-3)中表達水平顯著改變(p《0.05,倍數變化>2)的基因的展示。附圖5畫面a-f說明了組合抗VEGF與靶向Grl+髓樣細胞的抗體(抗Grl)對EL4和LLC腫瘤生長的影響。(a)單獨地或組合地(抗VEGF+抗Grl;組合)用抗VEGF(n=5)或抗Grl(n=4)處理的EL4腫瘤的生長曲線。這些組中動物的數目是3-4只。(b)如(a)中描述的治療17天的EL4腫瘤的通過IHC的血管表面積(VSA)、通過FACS的外周部和腫瘤中的Grl+細胞及CD31+內皮細胞(EC)的頻率、以及末期腫瘤重量的定量。與循環的Grl細胞中幾乎完全降低相反，在抗Grl治療的小鼠的腫瘤中發現了2-3倍的降低。在使用單獨的和與抗GrlMAb組合的抗VEGF治療的EL4腫瘤之間，鑒定出末期腫瘤重量方面的統計學顯著差異。數據是來自至少兩個獨立實驗的一個代表的平均值土SEM。(c)用單獨的或組合(n=4)的抗VEGF(n=5)或抗Grl(n=4)處理的LLC肺瘤的生長曲線。(d)所治療的動物中通過IHC的血管表面積(VSA)、通過FACS的外周部中的Grl+細胞和腫瘤中的Grl+和CD31+內皮細胞(EC)的頻率、以及腫瘤重量的定量。在使用單獨的和與抗GRl組合的抗VEGF治療的LLC腫瘤(c)之間，肺瘤體積和VSA存在著統計學顯著差異。數據是來自至少兩個獨立實驗的一個代表的平均值士SEM。(e&f)與抗VEGF治療組合的彈性蛋白酶抑制劑延遲了EL4(e)和LLC(f)腫瘤的腫瘤抗性。與抗VEGF群組相比，組合治療中的腫瘤體積顯著更小。附圖5所示數據是來自至少兩個獨立實驗的一個代表的平均值±標準偏差。通過ANOVA評估統計分析，*表明卩《0.05。附圖6畫面a-b說明了用于調查BMMNC在針對抗VEGF治療有抗性的腫瘤中的作用的實驗策略以及從實驗動物的腫瘤或骨髓分離GFP+細胞。畫面a示意性地說明了調查BMMNC在針對抗VEGF治療有抗性的腫瘤中的作用的實驗策略。為了監測異種移植物研究中BMMNC募集的動力學，將GFP+BMMNCIV注射入經致死照射的C57Bl/6小鼠(al.)。接著，通過植入matrigel中的敏感性(B16F1)和抗性(EL4和LLC)腫瘤來使嵌合小鼠致敏(all.)。自嵌合小鼠的骨髓(aIII.)和腫瘤(aIV.)分離GFP+細胞，與B16F1細胞混合并注射(SC)入C57BL/6小鼠。將植入有腫瘤的動物用抗VEGF或對照抗體(aV.)治療以確定BMMNC在介導腫瘤針對抗VEGF治療的抗性中的作用。畫面b說明了從接受了植入的小鼠的腫瘤和骨髓中分離GFP+細月包。使用FACS分選，自接受了植入的小鼠的腫瘤和骨髓分離GFP+細胞(策略的步驟all.)(bl.)。使用分選后分析(bll.)來測定從實驗動物的腫瘤或骨髓分離的GFP+細刀包的純度。附圖7說明了從植入有EL4和LLC腫瘤的小鼠的骨髓中純化CD1lbGrl。從植入有EL4或LLC細胞的C57BL/6小鼠分離BMMNC。將BMMNC與抗CD11b偶聯的珠子一起溫育，并穿過大規模磁柱來分離CD11b+和CD11b-級分。將來自每個級分的細胞以及未分選細胞的等分試樣用CDllb和Grl熒光染料偶聯的抗體染色，來測定細胞的純度。附圖8說明了針對抗VEGF治療有抗性的小鼠淋巴瘤腫瘤溶胞物的洗脫序型，所述溶胞物用抗VEGF抗體(G6-31)處理并加載到HiTrapHS柱上。所述柱用漸增的鹽濃度以分步方式洗脫。附圖9說明了在尾靜脈中接受一劑以下各項之后72小時，小鼠中EL4腫瘤大小的改變1)PBS脂質體/豚草，2)PBS脂質體/G6-31;3)氯膦酸鹽脂質體/G6-23,4)氯膦酸鹽脂質體/G6-31，或5)氯膦酸鹽脂質體/PBS。附圖IO說明了當氯膦酸鹽脂質體與抗VEGF(G6-23)組合施用給小鼠時，在具有針對抗VEGF治療有抗性的腫瘤的小鼠中VEGFmRNA表達的降低。附圖ll說明了在用氯膦酸鹽脂質體和抗VEGF(G6-23)治療的、具有針對抗VEGF治療有抗性的肺瘤的小鼠中KC水平的降低。附圖12畫面A和B說明了MIP-la(畫面A)和MCP-1(畫面B)二者在針對抗VEGF治療有抗性的肺瘤細胞系中表達，其中Dil(+)是內皮細胞，CD3(+)代表淋巴樣細胞，F4/80(+)代表巨噬細胞。附圖13畫面A和B說明了MIP-1a和MCP-1在血管發生性出芽和毛細管管腔形成測定法中具有血管發生活性。畫面A說明了內皮細胞對照，其中珠子用VEGF和D551處理10天。畫面B說明了用D551(陰性對照)(左上)、VEGF(陰性對照)(右上)、1.25jag/mlMCP-1和D551(左下)、和1.25ng/mlMIP-la和D551(右下)處理的內皮細胞。附圖14說明了來自用對照或抗VEGF抗體G6-23治療第7天(pl)和第14天(p2)的攜瘤小鼠(B16F1(a)、EL4(b)和LL2(c))的BMNNC的i普系分析。插圖代表對CDllb門選的細胞。抗VEGF治療提高了CDllb+和Grl+細胞的水平，但是所分析的其它細胞類型沒有提高。在第7天和第14天之間提高的細胞類型是CXCR4+、CDllb+、CD31+和CDllb+、CD31+細胞。與之相反，發現在第7和14天之間LL2和EL4而不是B16F1腫瘤中CD19+(B淋巴細胞)和CD90十(T淋巴細胞)細胞降低了。附圖15說明了攜帶抗性和敏感性腫瘤的小鼠中腫瘤和BM中GFP+細胞的多譜系分析。給C57B1/6小鼠植入TIB6、B16F1、EL4和LLC月中瘤，并用抗VEGF或對照抗體治療，如所描述的。從每個小鼠收獲BMMNC和胂瘤分離物，用針對CD19(B淋巴樣)、CD90(T淋巴樣)、CDllc(樹突細胞)以及VEGF受體(R1和R2)的抗體染色。圖表呈現了腫瘤U)和骨髓(b)隔室中每種子集的頻率。附圖16。脾臟是攜帶抗性腫瘤的小鼠中CD1lb+Gr1+細胞的可選歸巢位點。給C57Bl/6-GFP嵌合小鼠植入TIB6、B16F1、EL4和LLC腫瘤，并用抗VEGF或對照抗體治療17天，如所描述的。U)攜瘤動物的分析揭示了在攜帶抗性腫瘤的小鼠中脾臟大小有顯著(p<0.05)增大。(b)使用機械破碎從每個小鼠收獲脾細胞，用裂解緩沖液處理來除去紅細胞。然后將脾臟細胞用抗CDllb和抗Grl抗體染色，在FACS儀器中分析來調查CDllb+Grl+細胞的頻率。數據分析表明攜帶抗性胂瘤的小鼠的脾臟中CD1lb+Grl+細胞的頻率與敏感性腫瘤相比有顯著提高(p《0.05)。華表明用抗VEGF治療的攜帶EL4腫瘤的小鼠與相應的B16F1和TIB6處理動物相比的差異是顯著的(p《0.05)。+表明用抗VEGF治療的攜帶LLC腫瘤的小鼠與B16F1和TIB6處理動物相比有顯著差異(p<0.05)。附圖17說明了(a)只有從用抗性肺瘤致敏的小鼠分離的髓樣細胞能夠介導針對抗VEGF的抗性。圖表呈現了與用B16Fl或matrigd致敏的骨髓衍生的CDllb+Grl+細胞混合、并用抗VEGF治療的B16F1肺瘤的生長曲線(每組n=5)。如所描述的測量腫瘤體積達21天。("血管發生的誘導是001化+01"1+細胞發生針對抗VEGF治療的抗性的一種機制。在帶有B16Fl和CDllb+Grl十或CDllb-Grl-細胞的混合物的小鼠中分析了VSA^表明在比較B16Fl與來自EL4或LLC致敏的小鼠的CD1lb+Grl+細胞的混合物和/人同樣致敏的動物分離的CDllb-Grl-細胞的B16F1混合物時有顯著差異(p《0.05)。附圖18說明了不同機制控制針對抗VEGF和化療劑的抗性。給C57BL/6小鼠(n=5)才直入EL4(a)、LLC(b)、TIB6(c)和B16F1(d)月中瘤，并用抗VEGF抗體、對照抗體、吉西他濱和5FU治療，如所描述的。每周兩次測量腫瘤體積，在第17天分析所有的小鼠。承表明在比較抗VEGF治療的小鼠與5FU或吉西他濱治療的動物時有顯著差異。(e)從每個小鼠分離BM細胞，用CDllb和Grl熒光染料偶聯的抗體來染色。圖表呈現了每種處理中BMCDllb+Grl+細胞的數目。(f)在17天后收獲來自每個小鼠的腫瘤分離物，用相同的抗體染色，來查看每個腫瘤中CDllb+Grl+細胞的頻率和數目。柱條代表平均值士SEM。承表明用抗VEGF治療的攜帶EL4肺瘤的小鼠與相應的B16F1和TIB6處理動物相比的差異是顯著的(p<0.05)。十表明用抗VEGF治療的攜帶LLC腫瘤的小鼠與相應的B16Fl和TIB6處理動物相比有顯著差異(p《0.05)。發明詳述定義在詳細描述本發明之前，應當理解，本發明不限于具體的組合物或生物學系統，其當然可以有所變化。還應當理解，本文中所使用的術語僅僅是出于描述具體實施方案的目的，并非意圖限制。在用于本說明書和所附權利要求書時，單數形式"一個"、"一種"和"所述"包括復數稱謂，除非另有明確說明。如此，例如，"一個/一種分子"任選包括兩個或多個/兩種或多種所述分子的組合，諸如此類。術語"VEGF，，和"VEGF-A"可互換使用，指165個氨基酸的血管內皮細胞生長因子及相關的121個、145個、183個、189個和206個氨基酸的血管內皮細月包生長因子，如Leungefl/.5We"ce,246:1306(1989);Houckefa/.7kfo/.￡>(iocn!>z.，5:1806(1991);及Robinson&Stringer,Jow廠"a/Ce//5b/ewce,144(5):853-865(2001)所記載的，及其天然存在等位形式和加工形式。VEGF-A是包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF畫E、VEGF-F和P1GF在內的基因家族的一部分。VEGF-A主要結合兩種高親和力受體酪氨酸激酶，即VEGFR-1(Flt-l)和VEGFR-2(Flk-1/KDR)，后者是VEGF-A血管內皮細胞有絲分裂信號的主要遞質。術語"VEGF，或"VEGF-A"還指來自非人物種(諸如小鼠、大鼠或靈長類動物)的VEGF。有時，來自特定物種的VEGF表示如下，諸如hVEGF表示人VEGF,mVEGF表示鼠VEGF。術語"VEGF，還用于指包含165個氨基酸的人血管內皮細胞生長因子的氨基酸第8-109位或第l-109位的多肽截短形式或片段。本申請中可能通過例如"VEGF(8-109)"、"VEGF(l-109)，，或"VEGF，65，，來鑒別任何此類形式VEGF。"截短的"天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示的編號。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(曱硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(曱硫氨酸)。截短的天然VEGF具有與天然VEGF相當的對KDR和Flt-1受體的結合親和力。"VEGF拮抗劑"指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF活性(包括其與一種或多種VEGF受體的結合)的分子(肽基或非肽基)。VEGF拮抗劑包括抗VEGF抗體及其抗原結合片段、特異性結合VEGF由此使其隔絕與一種或多種受體結合的受體分子及衍生物(例如可溶性VEGF受體蛋白質或其VEGF結合片段、或嵌合VEGF受體蛋白質)、抗VEGF受體抗體和VEGF受體拮抗劑(諸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制劑)、及融合蛋白(例如VEGF-Trap(Regeneron)、VEGF121-gelonin(Peregine))。VEGF拮抗劑還包括VEGF的拮抗性變體、針對VEGF的反義分子、RNA適體(aptamer)、和針對VEGF或VEGF受體的核酶(ribozyme)。可用于本發明方法的VEGF拮抗劑進一步包括特異性結合VEGF的肽基或非肽基化合物，諸如抗VEGF抗體及其抗原結合片段、特異性結合VEGF的多肽或其片段；至少與編碼VEGF多肽的核酸分子的片段互補的反義核堿基(nucleobase)寡聚物；至少與編碼VEGF多肽的核酸分子的片段互補的小RNA;靶向VEGF的核酶；針對VEGF的肽體(peptibody);及VEGF適體。在一個實施方案中，VEGF拮抗劑將VEGF的表達水平或生物學活性降低或抑制至少10%、20%、30%、40°/。、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在另一個實施方案中，受到VEGF拮抗劑抑制的VEGF是VEGF(8-109)、VEGF(l-109)或VEGF!6s。術語"抗VEGF抗體"或"結合VEGF的抗體，，指能夠以足夠親和力和特異性結合VEGF的抗體，該抗體在耙向VEGF中可用作診斷劑和/或治療劑。例如，本發明的抗VEGF抗體可在靶向和干預其中牽涉VEGF活性的疾病或疾患中用作治療劑。參見例如美國專利6,582,959，6,703,020;W098/45332;WO96/30046;WO94/10202;WO2005/044853;EP0666868B1;美國專利申請20030206899,20030190317,20030203409,20050112126,20050186208和20050112126;Popkovefa/.,Jbwrwa/7mmww/ogfca/A/eAocfe288:149-164(2004);及W02005012359。所選擇的抗體通常具有針對VEGF的足夠強的結合親和力，例如所述抗體可以以介于100nM-lpM之間的Kd值結合hVEGF。抗體親和力可以通過例如基于表面等離振子共振的測定法(諸如BIAcore測定法，如PCT申請公開號WO2005/012359所記載的)；酶聯免疫吸附測定法(ELISA);和竟爭測定法(例如RIA)來測定。所述抗體可以進行其它生物學活性測定法，例如為了評估其作為治療劑的效力。此類測定法是本領域已知的，而且依賴于所述抗體的靶抗原和預期用途。例子包括HUVEC抑制測定法；肝瘤細胞生長抑制測定法(如例如WO89/06692所記載的)；抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)和補體介導的細胞毒性(CDC)測定法(美國專利5,500,362);及激動性活性或造血測定法(參見WO95/27062)。抗VEGF抗體通常不會結合其它VEGF同源物，諸如VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或VEGF-E,也不會結合其它生長因子，諸如P1GF、PDGF或bFGF。在一個實施方案中，抗VEGF抗體包括與雜交瘤ATCCHB10709所生成的單克隆抗VEGF抗體A4.6.1結合相同表位的單克隆抗體；依照Presta"a/.(1997)CancerRes.57:4593-4599生成的重組人源化抗VEGF單克隆抗體，包括但不限于稱為貝伐單抗即"bevacizumab(BV)"、也稱為"rhuMAbVEGF，或"AVASTIN②"的抗體。貝伐單抗包含突變的人IgGl框架區和來自鼠抗hVEGF單克隆抗體A.4.6.1(其阻斷人VEGF結合其受體)的抗原結合互補決定區。貝伐單抗大約93%的氨基酸序列(包括大部分框架區)衍生自人IgGl,而大約7%的序列衍生自鼠抗體A4.6丄貝伐單抗具有約149,000道爾頓的分子量，而且是糖基化的。貝伐單抗和其它人源化抗VEGF抗體進一步記載于2005年2月26日公告的美國專利No.6,884,879。別的優選的抗體包括G6或B20系列抗體(例如G6-23、G6-31、B20-4.1),如PCT申請公開號WO2005/012359所記載的。別的優選的抗體參見美國專利No.7,060,269，6,582,959,6,703,020;6,054,297;W098/45332;WO96/30046;WO94/10202;EP0666868B1;美國專利申請公開號2006009360，20050186208,20030206899，20030190317，20030203409和20050112126;及Popkovefa/.,JournalofImmunologicalMethods288:149-164(2004)。依照本發明的"G6系列抗體"指衍生自依照PCT申請^^開號WO2005/012359的圖7、24-26、和34-35任一的G6抗體或G6衍生抗體之序列的抗VEGF抗體"造血干細胞/祖細胞"或"原始造血細胞，，指能夠分化形成更定型的或成熟的血細胞類型的細胞。"淋巴樣血細胞譜系"指能夠分化形成淋巴細胞(B細胞或T細胞)的造血祖細胞。類似的，"淋巴細胞生成"指淋巴細胞的形成。"紅細胞樣血細胞譜系，，指能夠分化形成紅細胞(紅血球)的造血祖細胞，而"紅細胞生成"指紅細胞的形成。短語"髓(纟田月包)樣血細胞譜系"在用于本文時涵蓋上文所述淋巴樣和紅細胞樣血細胞譜系以外的所有造血祖細胞，而"髓細胞生成，，牽涉血細胞(淋巴細胞和紅細胞以外的)的形成。髓樣細胞群體可以在01~1+/001化+(或CDllb+Grl+)或Grl十/Mac-l+的髓樣免疫細胞中富集。這些細胞表達巨噬細胞譜系的髓樣細胞的標志物即CDllb,和粒細胞的標志物即Grl。Grl+ZCDllb+可以通過免疫粘附淘選例如用針對Grl+的抗體來選4奪。"髓樣細胞減少劑"指能減少或消融髓樣細胞群體的藥劑。典型的是，髓樣細胞減少劑將會減少或消融髓樣細胞、CDllb+Grl+、單核細胞、巨噬細胞等。髓樣細胞減少劑的例子包括但不限于Grl+拮抗劑、CDllb拮抗劑、CD18拮抗劑、彈性蛋白酶抑制劑、MCP-1拮抗劑、MIP-la拮抗劑等。術語"Grl拮抗劑"在用于本文時指能結合Grl并抑制或實質性降低Grl生物學活性的分子。Grl拮抗劑的非限制性例子包括抗體、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機分子、肽沖莫擬物、藥用藥劑及其代謝物、轉錄和翻譯控制序列、諸如此類。在本發明的一個實施方案中，所述Grl拮抗劑是抗體，尤其是能結合人Grl的抗Grl抗體。術語"CDllb拮抗劑"在用于本文時指能結合CDllb并抑制或實質性降低CDllb生物學活性的分子。正常情況下，所述拮抗劑將會(部分或完全)阻斷細胞(例如未成熟髓樣細胞)在其細胞表面上表達CDllb亞基以結合內皮的能力。CDllb拮抗劑的非限制性例子包括抗體、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機分子、肽模擬物、藥用藥劑及其代謝物、轉錄和翻譯控制序列、諸如此類。在本發明的一個實施方案中，所述CDllb拮抗劑是抗體，尤其是能結合人CDllb的抗CDllb抗體。例示性的CDllb抗體包括MY卯4(美國專利No.4,840,793);1B6c(參見Zhangefa/"BrainResearch698:79-85(1995));CB脂1/5和CBRM1/19(WO94/08620)。術語"CD18拮抗劑"在用于本文時指能結合CD18(優選人CD18)并抑制或實質性降低CD18生物學活性的分子。正常情況下，所述拮抗劑將會(部分或完全)阻斷細胞(例如嗜中性細胞)在其細胞表面上表達CD18亞基以結合內皮的能力。CD18拮抗劑的非限制性例子包括抗體、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機分子、肽模擬物、藥用藥劑及其代謝物、轉錄和翻譯控制序列、諸如此類。在本發明的一個實施方案中，所述CD18拮抗劑是抗體。抗CD18抗體的例子包括MHM23(Hildreth"a/.，￡w//mww"o/.13:202-208(1983》；M18/2(IgG2a;Sanches-Madrid"a/.，￡x/.Mdl58:586-602(l983)》H52(美國典型培養物保藏中心(ATCC)保藏物HB10160);Masl91c和10T18(VermotDesrochesd5b朋dJ/mmmo/.33:277-286(1991));及NA-8(WO94/12214)。在一個實施方案中，所述抗體是能結合MHM23或H52所結合的CD18表位的抗體。在本發明的一個實施方案中，所述抗體具有針對CD18多肽的高親和力。在某些實施方案中，所述抗體可以結合CD18胞外結構域中與CDllb相結合的區域，而且所述抗體還可解離a和P鏈(例如所述抗體可解離CDllb和CD18復合物，正如MHM23抗體的情況)。單核細胞趨化蛋白(MCP-1)指牽涉先天免疫和Th2效應器應答，及CD4十T細胞分化的化學因子。參見例如Paul,W.E.,Fw"dame"to//www"o/o",5"五必/o"，LippincottWilliams&Wilkins,(Philadelphia,2003)pp801-840。術語"MCP-1拮抗劑"在用于本文時指能結合MCP-1并抑制或實質性降低MCP-1生物學活性的分子。MCP-1拮抗劑的非限制性例子包括抗體、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機分子、肽模擬物、藥用藥劑及其代謝物、轉錄和翻譯控制序列、諸如此類。在本發明的一個實施方案中，所述MCP-1拮抗劑是抗體，尤其是能結合人MCP-l的抗MCP-1抗體。巨噬細胞炎性蛋白oc和(3(MIP-la和(3)是已知的化學因子。MIP-la牽涉先天免疫和Thl效應器應答，及CD4十T細胞分化。參見例如Paul，W.E.，Fw,7(i函e她//w應wo/ogy,5rt五血》w,LippincottWilliams&Wilkins，(Philadelphia,2003)pp801-840。術語"MIP-la拮抗劑"在用于本文時指能結合MIP-la并抑制或實質性降低MIP-la生物學活性的分子。MIP-lct拮抗劑的非限制性例子包括抗體、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機分子、肽模擬物、藥用藥劑及其代謝物、轉錄和翻譯控制序列、諸如此類。在本發明的一個實施方案中，所述MIP-la拮抗劑是抗體，尤其是能結合人MIP-la的抗MIP-la抗體。術語"拮抗劑"在用于本文時指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾本發明蛋白質的活性(包括其與一種或多種受體的結合(在配體的情況中)或與一種或多種配體的結合(在受體的情況中)的分子。拮抗劑包括抗體及其抗原結合片段、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機分子、肽模擬物、藥用藥劑及其代謝物、轉錄和翻譯控制序列、諸如此類。拮抗劑還包括本發明蛋白質的小分子抑制劑、和融合蛋白、能特異性結合蛋白質由此使其隔絕與其靶物結合的受體分子及衍生物、蛋白質的拮抗性變體、針對本發明蛋白質的反義分子、RNA適體、和針對本發明蛋白質的核酶。"阻斷性"抗體或"拮抗性"抗體指抑制或降低其所結合的抗原的生物活性。"URCGP"指在來自抗VEGF抗性肺瘤的CDllb+Grl+細胞中上調的蛋白質。URCGP包括但不限于嗜中性細胞彈性蛋白酶、CD14、expi、I1-13R、LDLR、TLR-1、RLF、Endo-Lip、SOCS13、FGF13、IL-4R、IL-11R、IL-IRII、IFNTM1、TNFRSF18、WNT5A、分泌載體膜(Secretorycarriermembrane)1、HSP86、EGFR、EphRB2、GPCR25、HGF、血管生成素樣-6、Eph-RA7、腦信號蛋白(Semaphorin)Vlb、神經營養因子5、密蛋白(Claudin)-18、MDC15、ECM和ADAMTS7B。在某些實施方案中，所述URCGP指IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13和/或IL-4R。"DRCGP"指在來自抗VEGF抗性肺瘤的CDllb+Grl+細胞中下調的蛋白質。DRCGP包括但不限于THBS1、Crea7、水通道蛋白(Aquaporin)-1、溶質載體家族蛋白(SCF38)、載脂蛋白E(APOE)、脂肪酸結合蛋白(FABP)、NCAM-140、ni型纖連蛋白、WIP、CD74、ICAM-2、Jaggedl、ltga4、ITGB7、TGF-BII-R、TGFbIEP、Smad4、BMPR1A、CD83、Dectin-l、CD48、E-選擇蛋白、IL-15、細胞因子信號傳導抑制物4、Cytor4和CX3CRl。在某些實施方案中，所述DRCGP指THBSl和/或Crea7。"URRTP"指在抗VEGF抗性腫瘤中上調的蛋白質。URRTP包括但不限于Notch2、DMD8、MCP-1、ITGB7、G-CSF、IL-8R、MIP2、MSCA、GM-CSF、IL-1R、Meg-SF、HSP1A、IL-1R、G-CSFR、IGF2、HSP9A、FGF18、ELM1、Ledgfa、A型清除受體、巨噬細胞C型凝集素、Pigr3、巨噬細胞SRT-1、G蛋白偶聯受體、ScyA7、IL-1R2、IL-1可誘導蛋白質、IL-1卩和ILIXPrecuror。在某些實施方案中，所述URRTP指MSCA、MIP2、IL-8R和/或G-CSF。"DRRTP"指在抗VEGF抗性腫瘤中下調的蛋白質。DRRTP包括但不限于IL10-R2、Erb-2.1、窖蛋白(Caveolin)3、Semcap3、INTG4、THBSP-4、ErbB3、JAM、Eng、JAM、Eng、JAM-2、Pecaml、Tlr3、TGF-B、FIZZ1、Wfsl、TP14A、EMAP、SULF—2、月包夕卜基質2、CTFG、TFPI、XCP2、Ramp2、ROR-a、肝配蛋白(Ephrin)Bl、SPARC樣1、和腦信號蛋白A。在某些實施方案中，所述DRRTP指IL10-R2、THBSP-4和/或JAM-2。"天然序列"多肽包括與衍生自自然界的多肽具有相同氨基酸序列的多酸序列。此類天然序列多肽可以從自然界分離，或者可以通過重組或合成手段來生產。術語"天然序列"多肽明確涵蓋該多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如胞外結構域序列)、天然存在的變體形式(例如可變剪接形式)、及天然存在的等位變體。"多肽鏈"指其中其每個結構域通過肽鍵(不同于非共價相互作用或二硫鍵)與其它結構域相連的多肽。多肽"變體"指與相應的天然序列多肽具有至少約80。/。氨基酸序列同一性的生物學活性多肽。此類變體包括例如其中在多肽的N和/或C末端添加或刪除一個或多個氨基酸(天然存在氨基酸和/或非天然存在氨基酸)殘基的多肽。通常，變體將會與天然序列多肽具有至少約80%氨基酸序列同一性，或至少約90。/。氨基酸序列同一性，或至少約95。/。或更多氨基酸序列同一性。變體還包括天然序列的多肽片段(例如亞序列、截短等)，通常是有生物學活性的。本文中的"百分比(％)氨基酸序列同一性"定義為對比序列并在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與選定序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術范圍內的多種方式進行，例如使用公眾可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)軟件。本領域技術人員可決定用于測量對比的適宜參數，包括對所比較序列全長獲得最大對比所需的任何算法。然而，為了本發明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比較計算機程序ALIGN-2如下所述獲得的。ALIGN-2序列比較計算機程序由Genentech公司編寫，而且已經連同用戶文檔一起提交給美國版權局(USCopyrightOffice,WashingtonD,C.,20559),并以美國版權注冊號TXU510087注冊，7^眾可通過Genentech7^司(SouthSanFrancisco,California)獲取。ALIGN2程序應當編譯成在UNIX操作系統(優選數碼UNIXV4.0D)上使用。所有序列比較參數由ALIGN-2程序設定且不變。為了本發明的目的，給定氨基酸序列A相對于(to)、與(with)、或針對(against)給定氨基Sl序列B的。/。氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對于、與、或針對給定氨基S臾序列B的某一。/。氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計算分數X/Y乘100的氨基酸殘基數，且其中Y是B中的氨基酸殘基總數。可以領會，若氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等，貝'jA相對于B的。/。氨基酸序列同一性將不等于B相對于A的％氨基酉吏序列同一性。術語"蛋白質變體"在用于本文時指上文所述變體和/或在天然蛋白質序列中包含一處或多處氨基酸突變的蛋白質。任選的是，所述一處或多處氨基酸突變包括氨基酸替代。用于本發明的蛋白質及其變體可通過本領域眾所周知的多種方法來制備。蛋白質的氨基酉^f列變體可通過蛋白質DNA中的突變來制備。此類變體包括例如蛋白質氨基酸序列內的殘基刪除、插入或替代。可以進行刪除、插入和替代的任何組合以獲得具有期望活性的最終構建物。將在編碼變體的DNA中進行的突變絕不能將序列置于讀碼框之外，而且優選不會產生能產生二級mRNA結構的互補區。EP75,444A。蛋白質變體的制備任選通過編碼天然蛋白質的DNA中的核苷酸定點誘變或噬菌體展示技術，由此產生編碼變體的DNA,然后在重組細胞培養物中表達該DNA。盡管用于引入氨基酸序列變異的位點是預先決定的，然而突變本身不必預先決定。例如，為了優化給定位點處突變的后果，可以在目標密碼子或區域進行隨機誘變，并對所表達的蛋白質變體篩選期望活性的最佳組合。用于在具有已知序列的DNA中預先決定的位點進行替代突變的技術是眾所周知的，諸如例如位點特異性誘變。本文所述蛋白質變體的制備可通過噬菌體展示技術來實現，諸如那些如PCT出版物WO00/63380所記載的。在選出這樣的克隆后，可以取出突變后的蛋白質區并置入適用于蛋白質生產的載體，一般是可用于轉化適宜宿主的那種類型的表達載體。氨基酸序列刪除的范圍一般是約l-30個殘基，任選1-10個殘基，任選l-5個殘基或更少，而且通常是連續的。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，從一個殘基至長度本質上不受限制的多肽，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內插入。序列內插入(即天然蛋白質序列內的插入)的范圍一般可以是約1-10個殘基，任選l-5個，或任選l-3個。末端插入的例子包括在N-末端融合信號序列(無論對宿主細胞是異源的或同源的)以便于由重組宿主分泌。別的蛋白質變體有那些其中天然蛋白質的至少一個氨基酸殘基已經消除并在它的位置插入了不同殘基的。此類替代可依照表l所示進行。蛋白質變體還可包含本文所述的非天然氨基酸。氨基酸可以根據其側鏈特性的相似性如下分組(A丄.Lehninger,5/oc/^w/Wr_y，第2版,pp.73-75，WorthPublishers,NewYork,(1975)):(1)非極性的Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Tip(W)、Met(M)(2)不帶電荷的、極性的Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)(3)酸性的Asp(D)、Glu(E)(4)石成性的Lys(K)、Arg(R)、His(H)或者，天然存在殘基可以基于共同的側鏈特性如下分組(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)中性的、親水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gin;(3)酸性的Asp、Glu;(4)石成性的:His、Lys、Arg;(5)影響鏈取向的殘基Gly、Pro;(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。表l原始殘基例示替代優選替代Ala(A)Val;Leu;lieValArg(R)Lys;Gin;AsnLysAsn(N)Gin;His;Asp;Lys;ArgGinAsp(D)Glu;AsnGluCys(C)Ser;AlaSerGin(Q)Asn;GluAsnGlu(E)Asp;GinAspGly(G)AlaAlaHis(H)Asn;Gin;Lys;ArgArgHe(I)Leu;Val;Met;Ala;Phe;正亮氨酸LeuLeu(L)正亮氨酸；lie;Val;Met;Ala;PhelieLys(K)Arg;Gin;AsnArg<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>"天然存在的氨基酸殘基"(即由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基)可以選自丙氨酸(Ala);精氨酸(Arg);天冬酰胺(Asn);天冬氨酸(Asp);半胱氨酸(Cys);谷氨酰胺(Gln);谷氨酸(Glu);甘氨酸(Gly);組氨酸(His);異亮氨酸(lie);亮氨酸(Leu);賴氨酸(Lys);甲硫氨酸(Met);苯丙氨酸(Phe);脯氨酸(Pro);絲氨酸(Ser);蘇氨酸(Thr);色氨酸(Trp);酪氨酸(Tyr);和纈氨酸(Val)。"非天然存在的氨基酸殘基"指上文所列天然存在氨基酸殘基以外的，能夠在多肽鏈中與鄰近氨基酸殘基共價結合的殘基。非天然存在氨基酸殘基的例子包括例如正亮氨酸、鳥氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸和其它氨基酸殘基類似物，諸如那些Elhnan"a/"Me仇￡"z，.202:301-336(1991)及美國專利申請出版物20030108885和20030082575中所記載的。簡言之，這些規程牽涉用非天然存在氨基酸殘基活化阻抑型tRNA,接著在體外或在體內轉錄并翻譯RNA。參見例如美國專利申請出版物20030108885和20030082575;Norenefa/.,5W認e244:182(1989);及Ellman"a/.，見上文。"分離的"多肽指已經鑒定且與/由其天然環境的一種成分分開和/或回收的多肽。多肽的天然環境的污染性成分指將會干擾其診斷或治療用途的物質，可包括酶、激素、和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在某些實施方案中，將多肽純化至(1)根據Lowry法的測定，多肽重量超過95%或重內部氨基酸序列的程度，或(3)根據使用考馬斯藍或銀染色的還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE,達到同質。既然多肽的天然環境的至少一種成分不會存在，那么分離的多肽包括重組細胞內的原位多肽。然而，分離的多肽通常通過至少一個純化步驟來制備。術語"抗體"以最廣義使用，明確涵蓋單克隆抗體(包括全長的或完整的單克隆抗體)、多克隆抗體、多價抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段(見下文)，只要它們展現出期望的生物學活性。除非另有說明，表述"多價抗體"貫穿本說明書用于指包含三個或更多抗原結合位點的抗體。多價抗體通常改造成具有三個或更多抗原結合位點，而且一^:不是天然序列IgM或IgA抗體。"抗體片段"只包含完整抗體的一部分，一般包括完整抗體的抗原結合位點，如此保留了與抗原結合的能力。此定義所涵蓋的抗體片段的例子包括(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1結構域；(ii)Fab'片段，其是在CH1結構域的C-末端具有一個或多個半胱氨酸殘基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1結構域；(iv)Fd'片段，其具有VH和CH1結構域及CH1結構域C-末端的一個或多個半胱氨酸殘基；(v)Fv片段，其具有抗體單臂的VL和VH結構域；(vi)dAb片H(Wardda/.,A^Mre341:544-546(1989》，其由VH結構域組成；(vii)分離的CDR區；(viii)F(ab'》片段，即包含通過鉸鏈區的二硫橋相連的兩個Fab'片段的二價片段；(ix)單鏈抗體分子(例如單鏈Fv;scFv)(Bird"a/.,Sc/e"ce242:423-426(1988)和Hustonefa/"尸M4S(T7&4」85:5879-5883(1988));(x)"雙抗體"，其具有兩個抗原結合位點，包含在同一條多肽鏈中相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)(參見例如EP404,097;WO93/11161;和Hollingerefa/"iVoc.淑/.4cad固90:6444-6448(1993));(xi)"線性抗體，，，其包含一對串聯的Fd區段(VH-CH1-VH-CH1)，與互補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapatada/.,Prafe〖"五吸8(10):1057-1062(1995)和美國專利5,641，870)。術語"單克隆抗體，，在用于本文時指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即構成群體的各個抗體是相同的，除了可以以極小量存在的可能突變(例如天然存在突變)外。如此，修飾語"單克隆"表明抗體不是不同抗體混合物的特征。單克隆抗體是針對單一抗原高度特異性的。在某些實施方案中，單克隆抗體典型的包括包含能結合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結合多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結合多肽序列在內的過程得到的。例如，選擇過程可以是從眾多克隆(諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的集合)中選擇獨特克隆。應當理解，所選擇的輩巴物結合序列可進一步改變，例如為了提高對靶物的親和力、將靶物結合序列人源化、提高其在細胞培養物中的產量、降低其在體內的免疫原性、創建多特異性抗體等，而且包含改變后的靶物結合序列的抗體也是本發明的單克隆抗體。與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性之外，單克隆抗體制備物的優點在于它們通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語"單克隆"表明抗體從基本上同質的抗體群獲得的特征，不應解釋為要求通過任何特定方法來生產抗體。例如，將依照本發明使用的單克隆抗體可通過多種^支術來生成，包^^例如雜交瘤法(例如KoherandMilstein，淑,256:495-97(1975);Hongo"a/.，//咖V/蘭a,14(3):253-260(1995);Harlowefa/.,J""6o(i/asvJ丄a60rato7Ma/wa/,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2nded.1988;Hammerlinga/"于Mowoc/o"a//^z^oAesT-Ce//舉",cfo應、563-681,Elsevier,N.Y"1981)、重組DNA法(參見例如美國專利No.4,816,567)、噬菌體展示技術(參見例如Clacksona/.,A^wre352:624-628(1991);Marks/她/.則.222:581-597(1991);Sidhu"a/.，/Mo/.腸/.338(2):299-310(2004);Leeda/.，/Mo/.脂.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,/Voc.A^.Jcad5W."514101(34):12467-12472(2004);及Leeefa/,,/mww,w/.284(1-2):119-132(2004))、及用于在具有部分或整個人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動物中生成人或人樣抗體的技術(參見例如WO1998/24893;WO1996/34096;WO1996/33735;WO1991/10741;Jakobovitsa/"iVoc.編.爿cad5W,腦90:2551(1993);Jakobovitsa/.,TVa^re362:255-258(1993》Bruggemanna/.，/,簡證7:33(1993);美國專利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5，633，425;5,661,016;Marks"a/"所0/rec/7"0/0gy10:779-783(1992);Lonberga/"iVam368:856-859(1994);Morrison,A^^w368:812-813(1994);Fishwilda/.，7Va/wre祝她c/zm/.14:845-851(1996);Neuberger，Atowe歷otec/zwo/.14:826(1996);及LonbergandHuszar,/她m.iev./mmw"o/.13:65-93(1995))。單克隆抗體在本文中明確包括"嵌合"抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或屬于特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或屬于另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現出期望的生物學活性(美國專利No.4,816,567和Morrisonda/"AW/.園81:6851-6855(1984))。非人(例如鼠)抗體的"人源化，，形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)(諸如小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類動物)的高變區殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(FR)殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有找到的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下的可變域，其中所有或基本上所有高變環對應于非人免疫球蛋白的高變環，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區。更多細節參見Jones"a/.，A^wre321:522-525(1986);Riechmannea/"A^ww332:323-329(1988);及Presta，CWr^racA歷o/.2:593-596(1992)。還可參見例如VaswaniandHamilton,Jww.j〃ergy,j"/zma在7m附wwo/.1:105-115(1998);Harris,S〖0c/2em.5bc,rra似ac"ora23:1035-1038(1995);HurleandGross,Cw/r.B/ofec/z.5:428-433(1994);及美國專利No.6,982,321和7,087,409。還可參見vanDijkandvandeWinkel,Cwr.Qp/".P/zarmaco/.,5:368-74(2001)。人抗體可以如下制備，即將抗原施用于轉基因動物，其經修飾而應答抗原挑戰生成此類抗體，但是其內源基因座已經失去能力，例如經免疫的異種移植小鼠(xenomice)(參見例如美國專利No.6,075,181和6,150,584，關于XENOMOUSETM技術)。還可參見例如Li^尸rac.扁.JcW.,,103:3557-3562(2006)，關于經人B細胞雜交瘤技術生成的人抗體。"人抗體"指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對應的氨基酸序列和定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。人抗體可使用本領域已知的多種技術來生成。在一個實施方案中，人抗體是從噬菌體文庫選擇的，該p藍菌體文庫表達人抗體(Vaughanda/.,A^wre5/oto:/zo/ogy14:309-314(1996);Sheets"a/.,/WJS95:6157-6162(1998);HoogenboomandWinter,■/Mo/.腺.227:381(1991);MarksJ,Mo/.組222:581(1991》。人抗體還可通過將人免疫球蛋白基因座導入內源免疫球蛋白基因已經部分或完全滅活的轉基因動物(例如小鼠)來生成。在受到攻擊時，觀察到人抗體生成，它在所有方面與在人體中看到的極其相似，包括基因重排、裝配和抗體全集。這種方法記載于例如美國專利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016，及以下科學出版物Marksda/"歷o/Tec/z"o/ogy10:779-783(1992);Lonberga/"A^ww368:856-859(1994);Morrison,7V<^wre368:812-13(1994);Fishwild"a/"7VafwreBz'ofec/wo/o^14:845-51(1996);Neuberger,淑眺腸欣/wo/，14:826(1996);LonbergandHuszar,/"ter".iev./mm朋o/,13:65-93(1995)。或者，人抗體可通過生成針對靶抗原的抗體的人B淋巴細胞的永生化來制備(此類B淋巴細胞可從個體回卄欠，或者可在體夕卜免疫)。參見如H口Cole"a/"A/b"oc/o"a/v4"fz'6oflfesC朋cw7T7era，AlanR.Liss，p.77(1985》Boernerefo/,，J.147(1):86-95(1991);及美國專利No.5,750,373。術語"可變的"指可變域中的某些部分在抗體間序列差異廣泛且用于每種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作高變區的三個區段。可變域中更加高度保守的部分稱作框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR，它們大多采取(3-折疊片構象，通過形成環狀連接且在有些情況中形成(3-折疊片結構一部分的三個高變區連接。每條鏈中的高變區通過FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的高變區一起促成抗體的抗原結合J立點的形成(參見KabatC，5"e《we"cei1yiVote/ra</;wmM"o/o^cfl/第5版,PublicHealthService,NationalInstituteofHealth,Bethesda,MD.(1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結合，但展現出多種效應器功能，諸如抗體在抗體依賴性細胞的細胞毒性中的參與。術語"高變區"、"HVR"或"HV"在用于本文時指抗體中負責抗原結合的氨基酸殘基。例如，術語高變區指抗體可變域中序列上高度可變和/或形成結構上定義的環的區域。通常，抗體包含六個HVR:三個在VH中(Hl、H2、H3)，三個在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗體中，H3和L3展示這六個HVR的最大多樣性，而且認為特別是H3在賦予抗體以精密特異性中發揮獨特作用。參見例如Xu"a/./w/7wmXy13:37-45(2000);JohnsonandWu于M^/zO(is"M/ecw/(3T萬/o/og^248:1-25(Lo,ed.,HumanPress,Totowa,NJ,2003)。事實上，僅由重鏈組成的天然存在camelid抗體在缺乏輕鏈時是有功能的且穩定的。參見例如Hamers-Casterman7W^wre363:446-448(1993);Sheriffda/.Atowre&rw".歷o/.3:733-736(1996)。本文中使用且涵蓋許多HVR的敘述。Kabat互補決定區(CDR)是以序列變異性為基礎的，而且是最常用的(KabatWa/.,尸rafe/rao/7mw朋o/，'co//她mst，5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))。Chothia改為指結構環的位置(ChothiaandLeskj;Mo/.所o/.196:901-917(1987》。AbMHVR代表KabatHVR與Chothia結構環之間的折衷，而且得到OxfordMolecular的AbM抗體建模軟件的使用。"接觸"HVR是以對可獲得的復合物晶體結構的分析為基礎的。下文記錄了這些HVR中每一個的殘基。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>HVR可包括如下"延伸的HVR":VL中的24-36或24-34(Ll)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(Hl)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。對于這些定義中的每一個，可變域殘基是依照Kabat等，見上文編號的。"框架區"或"FR"殘基指可變域中除本文中所定義的高變區殘基之外的那些殘基。術語"依照Kabat的可變域殘基編號方式"或"依照Kabat的氨基酸位置編號方式，，及其變化形式指Kabat"見上文中的用于抗體重鏈可變域或輕鏈可變域編輯的編號系統。使用此編號系統，實際的線性氨基酸序列可包含較少或另外的氨基酸，對應于可變域FR或HVR的縮短或插入。例如，重鏈可變域可包含H2殘基52后的單一氨基酸插入(依照Kabat為殘基52a)及重鏈FR殘基82后的插入殘基(例如依照Kabat為殘基82a、82b和82c等)。給定抗體的Kabat殘基編號方式可通過將抗體序列與"標準"Kabat編號序列對比同源區來確定。貫穿本說明書和權利要求書，Kabat編號系統一般在提及可變域中的殘基(大約是輕鏈殘基1-107和重鏈殘基1-113)時使用(例如Kabatefa/.,5^z/ewces1#7ww7wwo/og/ca//"ferns.5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991))。"EU編號系統，，或"EU索引，，一般在提及免疫球蛋白重鏈恒定區中的殘基時使用(例如KabatWa/.,Se《wewce51_Pra/e/"5o//w附w"o/o^7'ca///Merest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)中報道的EU索引，明確收入本文作為參考)。除非本文中另有說明，提及抗體可變域中的殘基編號指根據Kabat編號系統的殘基編號方式。除非本文中另有說明，提及抗體恒定域中的殘基編號指根據EU編號系統的殘基編號方式(例如參見美國臨時申請No.60/640,323,EU編號方式的圖)。根據其重鏈恒定域的氨基S臾序列，抗體(免疫球蛋白)可歸入不同的類。免疫球蛋白有五大類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進一步分為亞類(同種型)，例如IgG,(包括非A和A同種異型)、IgG2、IgG3、IgG4、IgA,和lgA2。將與不同類的免疫球蛋白對應的重鏈恒定域分別稱作a、5、s、y和P。不同類別免疫球蛋白的亞基結構和三維構造是眾所周知的，一般性記載于例^口Abbasa/.,Ce//w/arawe/Mo/,/mmimo/ogy，4thed.(W.B.Saunders,Co.,2000)。抗體可以是抗體與一種或多種其它蛋白質或肽共價或非共價結合而形成的更大融合分子的一部分。根據其恒定域的氨基酸序列，來自任何脊推動物物種的抗體(免疫球蛋白)的"輕鏈，，可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡巾白(K)和拉姆達(x)。術語"Fc區"用于定義免疫球蛋白重鏈的C端區，其可以是通過木瓜蛋白酶消化完整抗體生成的。Fc區可以是天然序列Fc區或變異Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈Fc區的邊界可以變化，但是人IgG重鏈Fc區通常定義為Fc區自大約Cys226位置或大約Pro230位置的氨基酸殘基至羧基末端的區段。Fc區的C-末端賴氨酸(殘基447，依照EU編號系統)可以消除，例如在生產或純化抗體的過程中，或者通過對編碼抗體重鏈的核酸進行重組工程改造。因而，完整抗體的組合物可包括所有K447殘基都被消除的抗體群、無一K447殘基被消除的抗體群、或者混合了有和無K447殘基的抗體的抗體群。免疫球蛋白的Fc區一般包含兩個恒定域，即CH2結構域和CH3結構域，任選包含CH4結構域。除非本文另有說明，免疫球蛋白重鏈的殘基編號方式是如Kabatda/.,見上文中的EU索引的編號方式。"如Kabat中的EU索引，，指人IgGlEU抗體的殘基編號方式。"Fc區鏈'，在本文中指Fc區兩條多肽鏈之一。人IgGFc區的"CH2結構域"(也稱為"Cg2"結構域)通常自約第231位氨基酸殘基延伸至約第340位氨基酸殘基。CH2結構域的獨特之處在于它沒有與另一結構域緊密配對。而是，有兩個N-連接的分支的碳水化合物鏈介于完整天然IgG分子的兩個CH2結構域之間。推測碳水化合物可能提供結構域-結構域配對的替代且有助于穩定CH2結構域。Burton,Mo/ec./mmwm/.22:161-206(1985)。CH2結構域在本文中可以是天然序列CH2結構域或變異CH2結構域。"CH3結構域"包含Fc區中CH2結構域C端的一段殘基(即自IgG的約第34H立氨基酸殘基至約第447位氨基酸殘基)。CH3區在本文中可以是天然序列CH3結構域或變異CH3結構域(例如在其一條鏈中具有引入的"隆起"(protroberance)而在其另一條鏈中具有相應引入的"空腔，，(cavity)的CH3結構域；參見美國專利No.5，821，333，明確收入本文作為參考)。此類變異CH3結構域可用于生成本文所述多特異性(例如雙特異性)抗體。"鉸鏈區"通常定義為自人IgGl的約Glu216或約Cys226至約Pro230的區段(Burton，Mo/ec./wmw"o/.22:161-206(1985))。其它IgG同種型的鉸鏈區可以通過將第一個和最后一個形成重鏈間S-S鍵的半胱氨酸殘基置于相同位置而與IgGl序列對比。鉸鏈區在本文中可以是天然序列鉸鏈區或變異4交鏈區。變異鉸鏈區的兩條多肽鏈通常每條多肽鏈保留至少一個半胱氨酸殘基，使得變異鉸鏈區的兩條多肽鏈可在兩條鏈之間形成二硫鍵。本文中優選的鉸鏈區是天然序列人鉸鏈區，例如天然序列人IgGl鉸鏈區。"功能性Fc區"擁有天然序列Fc區的至少一項"效應器功能"。例示性的"效應器功能"包括Clq結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)下調等。此類效應器功能一般要求Fc區與結合域(例如抗體可變域)結合，而且可使用本領域已知的用于評估此類抗體效應器功能的多種測定法來評估。"天然序列Fc區"包含與自然界中找到的Fc區的氨基S^列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc區包括天然序列人IgGlFc區(非A和A同種異型)、天然序列人IgG2Fc區、天然序列人IgG3Fc區、及天然序列人IgG4Fc區，及其天然存在變體。"變異Fc區"包含由于至少一處氨基酸修飾而與天然序列Fc區有所不同的氨基酸序列。在某些實施方案中，變異Fc區具有與天然序列Fc區或與親本多肽的Fc區相比至少一處氨基酸替代，例如在天然序列Fc區中或在親本多肽的Fc區中具有約1處至約1O處氨基酸替代，優選約1處至約5處氨基酸替代，例如在天然序列Fc區中或在親本多肽的Fc區中具有約l處至約10處氨基酸替代，優選約1處至約5處氨基酸替代。典型的是，變異Fc區在本文中將與天然序列Fc區和/或親本多肽的Fc區擁有至少約80%序列同一性，或至少約卯％序列同一性，或至少約95。/。或更多序列同一性。抗體"效應器功能"指那些可歸于抗體Fc區(天然序列Fc區或氨基酸序列變體Fc區)且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應器功能的例子包括Clq結合和補體依賴性細胞毒性(CDC);Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC);吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調；和B細胞活化。"抗體依賴性細胞介導的細胞毒性"或"ADCC"指其中結合到某些細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性細胞和巨噬細胞)上存在的Fc受體(FcR)上的分泌型Ig使得這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜帶抗原的靶細胞，隨后用細胞毒素殺死靶細胞的細胞毒性形式。介導ADCC的主要細胞即NK細胞只表達Fc7Rin,而單核細胞表達FcyRI、Fc7RII和FcyRin。RavetchandKinet,J"鼎.Aev.9:457-92(1991)第464頁表3總結了造血細胞上的FcR表達。為了評估感興趣分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定法，諸如美國專利No.5，500，362或5,821,337中所記載的。可用于此類測定法的效應細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。或者/另外，可在體內評估感興趣分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes"a/.,/WAS(X/5L4」95:652-656(1998)中所披露的。"人效應細胞"指表達一種或多種FcR并行使效應器功能的白細胞。在某些實施方案中，該細胞至少表達Fc7Rin并行〗吏ADCC效應器功能。介導ADCC的人白細胞的例子包括外周血單個核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性細胞，一般優選PBMC和NK細胞。效應細月包可以從其天然來源(例如/人血液或PBMC)分離，如本文所述。"Fc受體"或"FcR"描述結合抗體Fc區的受體。在有些實施方案中，FcR是天然人FcR。在有些實施方案中，FcR是結合IgG抗體的FcR(Y受體)，包括屬于FcyRI、FcYRII和FcYRIII亞類的受體，包括那些受體的等位變體和可變剪接形式。FcryRn受體包括FcYRIIA("活化受體")和FcyRIIB("抑制受體")，它們具有相似的氨基酸序列，區別主要在于其胞質結構域。活化受體FcyRIIA在其胞質結構域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FcYRIIB在其胞質結構域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見例如Dagron,爿"層.iev./mmw"o/,15:203-234(1997》。FcR的綜述參見例戈口RavetchandKinet,Jmw.iev./附附wwo/.9:457-492(1991);Capel&"/,:Immunomethods4:25-34(1994);及deHaasea/.,丄a6.Afed.126:330-41(1995)。術語"FcR"在本文中涵蓋其它FcR,包括那些未來將會鑒定的。術語"Fc受體"或"FcR"還包括新生兒受體，FcRji,它負責將母體IgG壽爭牙多纟合月臺JL(Guyer"a/.,J./附mzmo/.117:587(1976)禾口Kim"a/,,//mmwwo/.24:249(1994))并調節免疫球蛋白的體內穩態。測量對FcRn的結合的方法是已知的(參見例如Ghetie1997，Hinton2004)。測量對FcRn的結合的方法是已知的(參見例如GhetieandWard,/附wz/"o/.7b^y18(12):592-598(1997);Ghetie"a/.,iVaZi^e5/ofec/zm/ogy,15(7):637-640(1997);Hintona/.,JC/zew.279(8):6213-6216(2004);WO2004/92219(Hinton可測定人FcRn高親和力結合多肽與人FcRn的體內結合和血清半衰期，例如在表達人FcRn的轉基因小鼠或經轉染人細胞系中，或者在施用了具有變異Fc區的多肽的靈長類動物中。WO00/42072(Presta)記載了對FcR的結合提高或降低的抗體變體。還可參見例如Shields"/.，乂所o/.Cte附.9(2):6591-6604(2001)。"補體依賴性細胞毒性"或"CDC"指存在補體時對靶細胞的溶解。經典補體途徑的激活是由補體系統第一組分(Clq)結合抗體(適宜亞類的)起始的，該抗體已結合至其關聯抗原。為了評估補體激活，可進行CDC測定法，例如如Gazzano-Santoro&a/.,///www"o/.AfeAo<iy202:163(1996)中所記載的。具有更改的Fc區氨基酸序列(具有變異Fc區的多肽)及提高或降低的C1q結合能力的多肽變體記載于例如美國專利No.6,194,551Bl和WO1999/51642。還可參見例如Idusogie自/.,J/畫畫/.164:4178-4184(2000)。"親和力成熟的"抗體指在抗體的一個或多個CDR中具有一處或多處改變、導致該抗體對抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進的抗體。在一個實施方案，親和力成熟的抗體具有納摩爾或甚至皮摩爾量級的對靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可通過本領域已知^L程來生成。Marksda/.,說o/rec/wo/ogy10:779-783(1992)記載了通過VH和VL結構域改組進行的親和力成熟。以下文獻記載了CDR和/或框架殘基的隨機誘變Barbas"a/.,尸麼.淑固91:3809-3813(1994);Schier"a/.，Ge"e169:147-155(1995);Yelton"a/.,乂/wwmw/.155:1994-2004(1995);Jacksonda/.,J./mw頭o/.154(7):3310-9(1995);及Hawkins"a/"乂tWo/.說b/,226:889-896(1992)。"柔性接頭"在本文中指包含兩個或更多通過肽鍵相連的氨基酸殘基且為由其連接的兩段多肽(諸如兩個Fd區)提供更多旋轉自由的肽。所述旋轉自由容許由柔性接頭連接的兩個或更多抗原結合位點各自更高效的接近靶抗原。合適的柔性接頭肽序列的例子包括gly-ser、gly-ser-gly-ser、ala-ser、和gly-gly-gly-ser。"二聚化結構域"是由至少兩個氨基酸殘基(一般是半胱氨酸殘基)或者至少兩個肽或多肽(其可以具有相同或不同的氨基酸序列)結合形成的。所述肽或多肽可以經由共價和/或非共價結合而彼此相互作用。本文中的二聚化結構域的例子包括Fc區；鉸鏈區；CH3結構域；CH4結構域；CH1-CL對；具有"結節，，(knob)和/或"突起"(protmberance)的"界面"，如美國專利No.5，821,333中所記載的，明確收入本文作為參考；亮氨酸拉鏈(例如jim/fos亮氨酸拉鏈，參見Kostelneyefa/"http://mm畫/"148:1547-1553(1992);或酵母GCN4亮氨酸拉鏈)；異亮氨酸拉鏈；受體二聚體對(例如白介素-8受體(IL-8R);和整聯蛋白異二聚體，諸如LFA-l和GPIIIb/IIIa)或其二聚化區；二聚體配體多肽(例如神經生長因子(NGF)、神經營養因子-3(NT-3)、白介素-8(IL-8)、血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D、PDGF成員、和腦衍生神經營養性因子(BDNF);參見Arakawa"a/.乂歷o/.269(45):27833-27839(1994)及Radziejewskie^/.所oc/zem.32(48):1350(1993))或其二聚化區；一對能夠形成二硫鍵的半胱氨酸殘基；一對肽或多肽，各自包含至少一個半胱氨酸殘基(例如約1個、2個或3個到約10個半胱氨酸殘基)使得可以在所述肽或多肽之間形成二硫鍵(下文的"合成鉸鏈")；及抗體可變域。本文中最優選的二聚化結構域是Fc區或鉸鏈區。抗體的"功能性抗原結合位點"指能夠結合靶抗原的位點。抗原結合位點的抗原結合親和力不必像衍生該抗原結合位點的親本抗體那樣強，但是結合抗原的能力必須是使用已知用于評估抗體對抗原結合的多種方法之任一可測量到的。此外，本文中多價抗體的每個抗原結合位點的抗原結合親和力不必定量相同。對于本文中的多聚體抗體，功能性抗原結合位點的數目可以使用超速離心分析來評估。依照這種分析方法，將靶抗原與多聚體抗體以不同比例混合，并計算復合物的平均分子量，其中假設不同數目的功能性結合位點。將這些理論值與得到的實際實驗值進行比較以評估功能性結合位點的數目。具有指定抗體的"生物學特征"的抗體指擁有該指定抗體區別于其它結合相同抗原的抗體的一項或多項生物學特征的抗體。為了篩選能結合抗原上感興趣抗體所結合的表位的抗體，可以實施常規交叉阻斷觀寸定法，諸^口爿w"'6od/as，爿丄a6ora;to^y^fo"z^/,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlowandDavidLane(1988)中所記載的。與一種或多種其它治療劑"組合"施用包括同時(共同)施用和/或任何次序的序貫施用。為了治療目的，"哺乳動物"指歸入哺乳類的任何動物，包括人，家畜和牲畜，及動物園、運動或寵物動物，諸如犬、馬、貓、牛、綿羊、豬等。典型的是，哺乳動物指人。"病癥"指任何會受益于使用本發明分子的治療的疾患。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括那些使哺乳動物傾向于所討"i侖病癥的病理狀況。本文中待治療的病癥的非限制性例子包括任何形式的腫瘤，良性和惡性腫瘤；血管化胂瘤；肥大；白血病和淋巴樣惡性腫瘤；神經元、神經膠質、星形膠質細胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細胞、上皮、基質和嚢胚腔病癥；及炎性、血管發生性和免疫學病癥，源自不當、異常、過度和/或病理性血管形成和/或血管通透性的血管病癥。術語"有效量，，或"治療有效量"指在哺乳動物中有效治療疾病或病癥的藥物量。在癌癥的情況中，有效量的藥物可減少癌細胞的數目；縮小腫瘤的尺寸；抑制(即一定程度的減緩，典型的是阻止)癌細胞浸潤入周圍器官；抑制(即一定程度的減緩，典型的是阻止)肺瘤轉移；一定程度的抑制肺瘤生長；容許治療抗性肺瘤；和/或一定程度的減輕一種或多種與病癥有關的癥狀。根據藥物可阻止現有癌細胞生長和/或殺死現有癌細胞的程度，它可以是細胞抑制性的和/或細胞毒性的。對于癌癥療法，體內功效可以通過例如評估存活持續時間、距疾病進展的時間(TTP)、響應率(RR)、響應持續時間、和/或生活質量來測量。"處理"和"治療"(treatment)指治療性處理和預防性或防范性措施二者。需要治療的受試者包括那些早就患有病癥的以及要預防病癥的。在本發明的某些實施方案中，治療可以指抑制腫瘤血管發生和/或生長，或者延遲抗VEGF抗性發作。術語"生物學活性"和"有生物學活性的，，就本發明的多肽而言指分子特異性結合并調節細胞應答(例如增殖、遷移等)的能力。細胞應答還包括那些經由受體介導的，包括但不限于遷移和/或增殖。在此語境中，術語"調控"包括促進和抑制二者。術語"癌癥，，和"癌性，，指或描述哺乳動物中特征通常為細胞生長不受調節的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤、和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌癥的更具體例子包括腎癌(kidneyorrenalcancer)、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、肺癌(包括小細月包肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌和肺的鱗癌)、鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(gastricorstomachcancer)(包括胃腸癌、胃腸基質腫瘤(GIST))、胰腺癌、頭頸癌、成膠質細胞瘤、成視網膜細胞瘤、星形細胞瘤、泡膜細胞瘤、男性細胞瘤、肝瘤(hepatoma)、血液學惡性腫瘤(包括非何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)、多發性骨髓瘤和急性血液學惡性腫瘤)、子宮內膜癌或子宮癌、子宮內膜異位癥、纖維肉瘤、絨毛膜癌、唾液腺癌、外陰癌、曱狀腺癌、食管癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、肛門癌、陰莖癌、鼻咽癌、喉癌、卡波西(Kaposi)氏肉瘤、黑素瘤、皮膚癌、許旺氏細胞瘤、少突神經膠質瘤、成神經細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨源性肉瘤、平滑肌肉瘤、尿道癌、甲狀腺癌、維爾姆斯(Wilm)氏肺瘤、以及B細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細胞性(SL)NHL、中級/濾泡性NHL、中級彌漫性NHL、高級成免疫細胞性NHL、高級成淋巴細胞性NHL、高級小無核裂細胞性NHL、貯積病(bulkydisease)NHL、套細胞淋巴瘤、AIDS相關淋巴瘤、和瓦爾登斯特倫氏(Waldenstrom)巨球蛋白血癥)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、毛細胞性白血病、慢性成髓細胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病癥(PTLD)、以及與瘢痣病(phakomatoses)、水肺(諸如與腦瘤有關的水腫)和梅格斯氏(Meigs)綜合征有關的異常血管增殖。"腫瘤，，在用于本文時指所有贅生性細胞生長和增殖，無論是惡性的或者是良性的，及所有癌前的和癌性的細力包和組織。術語"抗性腫瘤"指對至少包含VEGF拮抗劑的癌癥療法在癌癥治療療程上完全沒有響應、或者喪失或顯示降低的響應的癌、癌性細胞、或腫瘤。抗性肺瘤還指在本文中"^斷為有抗性的胂瘤(在本文中也稱為"抗VEGF抗性腫瘤")。在某些實施方案中，與對至少包括VEGF拮抗劑的療法敏感的腫瘤相比，抗性腫瘤中CD1lb+Grl+細胞增加。術語"抗肺瘤組合物，，指可用于治療癌癥的組合物，其包含至少一種活性治療劑，例如"抗癌劑"。治療劑(抗癌劑)的例子包括但不限于例如化療劑、生長抑制劑、細胞毒劑、放射療法中所使用的藥劑、抗血管發生劑、凋亡劑、抗微管蛋白劑、毒素、和其它用于治療癌癥的藥劑，例如抗VEGF中和性抗體、VEGF拮抗劑、抗HER-2、抗CD20、表皮生長因子受體(EGFR)拮抗劑(例如酪氨酸激酶抑制劑)、HER1/EGFR抑制劑、erlotinib、COX-2抑制劑(例如塞來考昔(celecoxib))、干擾素、細胞因子、能與ErbB2、ErbB3、ErbB4、或VEGF受體中的一種或多種結合的拮抗劑(例如中和性抗體)、血小板衍生生長因子(PDGF)和/或干細胞因子(SCF)的受體酪氨酸激酶的抑制劑(例如曱磺酸伊馬替尼(imatinibmesylate)(GleevecNovartis))、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有機化學劑等。本發明還包括它們的組合。術語"細胞毒劑"在用于本文時指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質。該術語意圖包括放射性同位素(例如川At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、，和Lu的放射性同位素)、化療劑、和毒素(諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體)。"生長抑制劑"在用于本文時指在體外和/或在體內抑制細胞生長的化合物或組合物。如此，生長抑制劑可以是顯著降低處于S期的細胞百分比的藥劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期行進(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導G1停滯和M期停滯的藥劑。經典的M期阻斷劑包括長春藥類(vincas)(長春新石威(vincristine)和長春石威(vinblastine))、TAXOL⑧、和拓樸異構酶II抑制劑，諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博來霉素(bleomycin)。那些阻滯G1的藥劑也溢出進入S期停滯，例如DNA烷化劑類，諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼斥公(prednisone)、達卡巴。秦(dacarbazine)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、順柏(cisplatin)、曱氨喋呤(methotrexate)、5-氟尿嘧咬(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可參見777eAfo/ecw/"r5as7'so/Cawcer,MendelsohnandIsrael編,第1章,題為"Cellcycleregulation,oncogenes,andantineoplasticdrugs",Murakami"fl/.，WBSaunders,Philadelphia(1995),尤其是第13頁。"化療劑"指可用于治療癌癥的化學化合物。化療劑的例子包括烷化劑類(alkylatingagents)，諸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN環磷酰胺(cyclophosphamide);石黃酉臾烷基酉旨類(alkylsulfonates),諸長口白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)牙口p底泊舒凡(piposulfan);氮丙口定類(aziridines),》者3口苯佐替》泉(benzodepa)、卡;皮酉昆(carboquone)、美妥替;泉(meturedepa)禾口烏瑞替;泉(uredepa);乙撐亞胺類(ethylenimines)和曱基蜜胺類(methylamelamines),包括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemdamine)、三乙撐磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撐疏代石粦酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥曱蜜胺(trimethylolomelamine);番篇才支內酉旨類(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));5-9-四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol),MARINOL);(3"立帕醌(lapachone);拉帕醇(kpachol);秋水仙素類(colchicines);白樺脂酸(betulinicacid);喜杉于石成(camptothecin)(包4舌合成類似、物才乇泊4齊康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan),CAMPTOSAR)、乙酰喜樹堿、東荒菪亭(scopoletin)和9-氨基喜樹;威)；苔蘚抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinicacid);替尼泊芬(teniposide);隱藻素類(cryptophycins)(特另'J是隱藻素1和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;'海纟帛才中素(spongistatin);氮芥類(nitrogenmustards)，i者嘖口苯丁酉交氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、月旦石粦酰胺(cholophosphamide)、站,莫司汀(estramustine)、異環磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮齊(novembichin)、苯芥月旦甾酉孚(phenesterine)、〉發尼莫司、汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧咬氮芥(uracilmustard);亞硝脲類(nitrosoureas),諸i口卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chorozotocin)、4畐莫司、;丁(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素類，諸如蜂二炔類抗生素(enediyne)(例如力。利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素丫ll和加利車霉素coll(參見例如Agnew,O^m./"/7.Ed33:183-186(1994));蒽環類抗生素(dynemicin)，包括dynemicinA;埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)發色團和相關色蛋白烯二炔類抗生素發色團)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素(daunombicin)、地4乇比星(detombicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括ADRJAMYCIN⑧、嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、鹽酸多柔比星脂質體注射劑(DOXIL⑧)和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、^f尹達比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、諾拉霉素(nogalamycin)、椒欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、口票呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結才亥菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex')、凈司4也丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗^Ci射物類，i者如曱氨卩巣口令(methotrexate)、吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR)、替加氟(tegaflir)(UFTORAL)、卡培他濱(capecitabine)(XELODA⑧)、埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物，諸如二曱葉酸(denopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三曱曲沙(trimetrexate);噪"令類似物，諸如氟達4立濱(fludarabine)、6畫巰基噤呤(mercaptopurine)、碌b。米噪p令(thiamiprine)、石克鳥嘌p令(thioguanine);嘧口定類似物，i者如安西他濱(ancitabine)、阿4U包普(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿香(dideoxyuridine)、去氧氟尿苦(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿芬(floxuridine);雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、表疏雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酉旨(testolactone);抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲;各司坦(trilostane);葉酸#卜充劑，i者如亞葉酸(folinicacid);醋葡醛內酉旨(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酉臾(aminolevulinicacid);恩尿口密卩定(eniluracil);安吖。定(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依達曲沙(edatraxate);;也石壽酰胺(defosfamide);3也美可辛(demecolcine);i也p丫酉昆(diaziquone);elfornithine;依利醋4妄(elliptiniumacetate);依4乇才各魯(etoglucid);硝酸4家；羥脲(hydroxyurea);香菇多4唐(lentinan);氯尼達明(lonidamine);美登木素生物石威類(maytansinoids),諸如美登素(maytansine)矛口安絲菌素(ansamitocin);米4乇脈月宗(mitoguazone);米4乇蒽酉昆(mitoxantrone);莫咪達醇(mopidamol);二胺硝吖咬(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);他柔比星(pirambicin);洛索蒽醌(losoxantrone);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴胼(procarbazine);PSK多糖復合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西佐口南(sizofiran);蟲累^走4者(spirogermanium);纟田交《連孑包菌§同酉吏(tenuazonicacid);三亞胺醌(triaziquone);2,2'，2"-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、祝孑包菌素(verrucarin)A、桿孑包菌素(roridin)A和蟲它行菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長春地辛(vindesine)(ELDISINE,FILDESIN);達卡巴漆(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛矛醇(mitolactol);口底泊澳烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞苷(arabinoside)("Ara-C");塞替派(thiotepa);類紫杉醇類(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(TAXOL)、帕利他塞的清蛋白改造的納米顆粒劑型(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel)(TAXOTERE));苯丁酸氮芥(chlorambucil);6-碌u鳥嘌呤(thioguanine);巰基嘌口令(mercaptopurine);曱氨口萊p令(methotrexate);4白類4以4勿，i者長口順4白(cisplatin)和卡4白(carboplatin);長春;咸(vinblastine)(VELBAN);柏(platinum);依托泊苷(etoposide)(VP-16);異環磷酰胺(ifosfamide);米托蒽酉昆(mitoxantrone);長春新石咸(vincristine)(ONCOVIN);奧沙利鉑(oxaliplatin);亞葉酸(leucovorin);長春瑞濱(vinorelbine)(NAVELBINE);能滅瘤(novantrone);依達曲沙(edatrexate);道諾霉素(daunomycin);氨基蝶口令(aminopterin);j尹本膦酸鹽(ibandronate);拓樸異構酶抑制劑RFS2000;二氟曱基鳥氨酸(DMFO);類視黃酸類(retinoids),諸如視黃酸(retinoicacid);任何上述物質的藥學可接受鹽、酸或衍生物；以及兩種或更多上述物質的組合，諸如CHOP(環磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松龍組合療法的縮寫)和FOLFOX(奧沙利鉑(ELOXATINTM)組合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)。該定義還包括作用為調節、降低、阻斷或抑制可促進癌生長的激素效果的抗激素劑，且常常是系統或全身治療的形式。它們自身可以是激素。例子包括抗雌激素類和選擇性雌激素受體調控物類(SERM),包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX⑧他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)(EVISTA)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LYl17018、奧那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(FARESTON);抗孕酮類；雌激素受體下調劑類(ERD);功能為抑制或關閉卵巢的藥劑，例如促黃體生成激素釋放激素(LHRH)激動劑，諸如醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)(LUPRON⑧和ELIGARJD⑧)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞林(buserelinacetate)和曲普瑞林(triptorelin);其它抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);及抑制在腎上腺中調節雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、醋酸曱地孕酮(megestrolacetate)(MEGASE)、依西美坦(exemestane)(AROMASIN)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏氯峻(vorozole)(RIVISOR)、來曲唑(letrozole)(FEMARA⑧)和阿那曲唑(anastrozole)(ARIMIDEX)。另外，化療劑的這種定義包括二膦酸鹽類(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS⑧或OSTAC⑧)、依替膦酸鈉(etidronate)(DIDROCAL)、NE-58095、唑來膦酸/唑來膦酸鹽(zoledronicacid/zoledronate)(ZOMETA)、阿倫膦酸鹽(alendronate)(FOSAMAX)、帕米膦酸鹽(pamidronate)(AREDIA)、替魯膦酸鹽(tiludronate)(SKELID⑧)或利塞膦酸鹽(risedronate)(ACTONEL);以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環核香胞嘧咬類似物)；反義寡核苷酸，特別是那些抑制牽涉異常(abherant)細胞增殖的信號傳導途經中的基因表達的反義寡核芬酸，諸如例如PKC-ouRaf、H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R);疫苗，諸如THERATOPE⑧疫苗和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN⑧疫苗、LEUVECTIN⑧疫苗和VAXID⑧疫苗；拓樸異構酶l抑制劑(例如LURTOTECAN);rmRH(例如ABARELIX);lapatinibditosylate(ErbB-2和EGFR雙重酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱為GW572016);COX-2抑制劑，諸如塞來考昔(CELEBREX;4-(5-(4-曱基苯基)-3-(三氟曱基)-lH-吡唑-l-基)苯磺酰胺；及任何上述物質的藥學可接受鹽、酸或衍生物。術語"細胞因子"是由一種細胞群釋放，作為細胞間介質作用于另一細胞的蛋白質的通稱。此類細胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統的多肽激素。細胞因子中包括生長激素，諸如人生長激素、N-曱硫氨酰人生長激素、和牛生長激素；曱狀旁腺素；曱狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素類，諸如促印泡激素(FSH)、促曱狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH);肝生長因子；成纖維細胞生長因子；促乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-a和-(3;穆勒氏(Mullerian)抑制性物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；激活素；血管內皮生長因子(例如VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E);胎盤衍生生長因子(P1GF);血小板衍生生長因子(PDGF)(例如PDGFA、PDGFB、PDGFC、PDGFD);整聯蛋白；血小板生成素(TPO);神經生長因子，諸如NGF-a;血小板生長因子；轉化生長因子(TGF),諸如TGF-a和TGF-(3;胰島素樣生長因子-I和-II;紅細胞生成素(EPO);骨誘導因子(osteoinductivefactor);干擾素，諸如干擾素-a、-卩和-y;集落刺激因子(CSF),諸如巨噬細胞CSF(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞CSF(GM-CSF)和粒細胞CSF(G-CSF);白介素(IL),諸如IL-1、IL畫la、IL-lf3、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-ll、IL-12、IL畫13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20-IL-30;分泌珠蛋白(secretoglobin)/子宮珠蛋白；制瘤素M(OSM);腫瘤壞死因子，諸如TNF-a或TNF-(3;及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在用于本文時，術語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白質及天然序列細胞因子的生物學活性等效物。術語"前體藥物"在用于本申請時指與母藥(parentdrug)相比對腫瘤細胞的細胞毒性較小并能夠酶促活化或轉變為更具活性母藥形式的前體或衍生物形式藥用活性物質。參見例如Wilman，"ProdrugsinCancerChemotherapy",BiochemicalSocietyTransactions,14,pp.375-382,615thMeetingBelfast(1986)和Stellaa/.,"Prodrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery",D/recfec/Z>wgDe//ver_y，Borchardtda/.，ed.，pp.247-267,HumanaPress(1985)。本發明的前體藥物包括但不限于含磷酸鹽/S旨前體藥物、含石克代磷酸鹽/S旨前體藥物、含硫酸鹽/酯前體藥物、含肽前體藥物、D-氨基酸修飾前體藥物、糖基化前體藥物、含(3-內酰胺前體藥物、含任選取代苯氧基乙酰胺的前體藥物或含任選取代苯乙酰胺的前體藥物、可轉變為更具活性而無細胞毒性的藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前體藥物。可衍生為本發明使用的前體藥物形式的細胞毒性藥物的例子包括但不限于上文描述的那些化療劑。"血管發生因子，，或"血管發生劑，，指刺激血管發育，例如促進血管發生(angiogenesis)、內皮細胞生長、血管穩定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生長因子。例如，血管發生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成員、P1GF、PDGF家族、成纖維細胞生長因子家族(FGF)、T正配體(血管生成素)、肝配蛋白、ANGPTL3、ANGPTL4等。它還包括加速傷口愈合的因子，諸如生長激素、胰島素樣生長因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生長因子(EGF)、CTGF及其家族成員、及TGF-a和TGF-卩。參見例如幻agsbrunandD，Amore,iev.P/zj^/o/.53:217-39(1991);StreitandDetmar,O"cogewe22:3172-3179(2003);Ferrara&Alitalo，TVa^reMe&c/"e5(12):1359-1364(1999);Tonini"a/.，O"coge"e22:6549-6556(2003)(例如列舉血管發生因子的表l);和Sato,/"f.』a/w.Owco/.8:200-206(2003)。"抗血管發生劑，，或"血管發生抑制劑，，指或是直接或是間接抑制血管發生(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透性的小分子量物質、多核苷酸、多肽、分離的蛋白質、重組蛋白、抗體、或其偶聯物或融合蛋白。例如，抗血管發生劑是上文定義的血管發生劑的抗體或其它拮抗劑，例如VEGF的抗體、VEGF受體的抗體、阻斷VEGF受體信號傳導的小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT/SU11248(sunitinibmalate)、AMG706)。抗血管發生劑還包括天然血管發生抑制劑，例如血管他丁(angiostatin)、內皮4也丁(endostatin)等。參見侈'H口KlagsbmnandD，AmoreTev.尸/7"/0/.53:217-39(1991);StreitandDetmar22:3172-3179(2003)(例如列舉惡性黑素瘤中抗血管發生療法的表3);Ferrara&AlitaloiVamre7We&.c&e5(12):1359-1364(1999);Tonini等(9"cogewe22:6549-6556(2003)(例如列舉抗血管發生因子的表2);及Sato,/"AC7/".8:200-206(2003)(例如列舉臨床試驗中所使用的抗血管發生劑的表l)。術語"免疫抑制劑"在用于本文時指作用于抑制或掩蓋本文所治療哺乳動物的免疫系統的物質。這將包括抑制細胞因子生成、下調或抑制自身抗原表達、或掩蓋MHC抗原的物質。此類藥劑的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(見美國專利No.4,665,077);非類固醇抗炎藥(NSAID);更昔洛韋(gandclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮質激素諸如皮質醇(cortisol)或醛甾酮(aldosterone)、抗炎藥諸如環加氧酶抑制劑、5-脂加氧酶抑制劑、或白三烯受體拮抗劑；噤呤拮抗劑，諸如硫唑。票呤(azathioprine)或麥考酚酸嗎乙酯(mycophenolatemofetil,MMF);烷化劑，諸如環磷酰胺；溴隱亭(bromocryptine);達4L峻(danazol);氨苯石風(dapsone);戊二醛(其掩蓋MHC抗原，如美國專利No.4,120,649中所記載的)；針對MHC抗原和MHC片段的抗獨特型抗體；環孢菌素A;類固醇，諸如皮質類固醇或糖皮質類固醇或糖皮質激素類似物，例如潑尼^Kprednisone)、曱基潑尼4公龍(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone);二氫葉酸還原酶抑制劑，諸如曱氨蝶呤(methotrexate)(口月良或皮下)；#5氯p奎(hydroxycloroquine);杉p氮石黃p比口定(sulfasalazine);來氟米特(leflunomide);細胞因子或細胞因子受體抗體，包括抗干擾素-a、-(3或-y抗體、抗肺瘤壞死因子-a抗體(infliximab或adalimumab)、抗TNFa免疫粘附素(依那西普(etanercept))、抗腫瘤壞死因子-P抗體、抗白介素-2抗體和抗IL-2受體抗體；抗LFA-l抗體，包括抗CDlla和抗CD18抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細胞球蛋白；泛T抗體(pan-Tantibody),優選抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；含有LFA-3結合域的可溶性肽(1990年7月26日公布的WO1990/08187);鏈激酶；TGF-卩；鏈道酶；來自宿主的RNA或DNA;FK506;RS-61443;脫氧精胍菌素(deoxyspergualin);雷帕霉素(rapamycin);T細胞受體(Cohenefa/.,美國專利No.5,114,721);T細胞受體片段(Offner"a/"5We"ce251:430-432(1991);WO1990/11294;Ianeway，A^wre341:482(1989);及WO1991/01133);及T細胞受體抗體(EP340,109),諸如T10B9。47"非類固醇抗炎藥，，或"NSAID"的例子有乙酰水楊酸(acetylsalicylicacid)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、p引咮美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin),包括其鹽和衍生物，等。術語"標記物"在用于本文時指與多肽直接或間接偶聯的可檢測化合物或組合物。標記物自身可以是可檢測的(例如放射性同位素標記物或熒光標記物)，或者在酶標記物的情況中，可催化可檢測的底物化合物或組合物的化學改變。"分離的"核酸分子指已經鑒定且與多肽核酸的天然來源中通常與之關聯的至少一種污染性核酸分子分開的核酸分子。分離的核酸分子不同于在自然界中發現它時的形式或背景。分離的核酸分子因此與存在于天然細胞中時的核酸分子有區別。然而，分離的核酸分子包括通常表達該多肽的細胞中所包含的核酸分子，例如當所述核酸分子在所述細胞中的染色體定位不同于它在天然細胞中的染色體定位時。抗性腫瘤本發明部分地基于導致腫瘤對至少包含VEGF拮抗劑的癌癥療法產生抗性的細胞和分子事件的發現。本文中顯示了在造血骨髓衍生細胞的募集和肺瘤針對抗VEGF治療的抗性的發生之間的關聯。免疫系統包括造血細胞，其包括紅細胞、淋巴細胞和髓樣譜系細胞。這些細胞類型都來自于相同的多能干細胞。在成人中，血細胞生成在骨髓中發生，在那里干細胞偶爾分裂以產生更多的干細胞(自我更新)和多種定型的節因子主要由周圍的基質細胞和在其它組織中產生，包括例如集落刺激因子(CSF)、促紅細胞生成素(EPO)、白介素3(IL3)、粒細胞/巨噬細胞CSF(GM-CSF)、粒細胞CSF(G-CSF)、巨噬細胞CSF(M-CSF)和STEEL因子。已經提出在癌癥患者中免疫系統的改變促進了免疫系統發起對癌癥的成功攻擊的能力喪失或降低，因而容許腫瘤生長的進展。參見例如Gabrilovich"。/.，AntibodiestoVascularEndothelialGrowthFactorEnhancestheEfficacyofCancerImmunotherapybyImprovingEndogenousDendriticCellFunction.C//mWC匿erie廳rc/z5:2963-2970(1999)。腫瘤產生的因子可以導致異常的髓細胞生成，而且可導致對針對腫瘤的48免疫應答的承卩制。參見例3口KusmartsevandGabrilovich，Immaturemyeloidcellsandcancer-associatedimmunesuppression.Cawer7www"o//w附w"o^ra.51:293-298(2002)。本發明提供了來自腫瘤抗性細胞和CDllb+Grl+細胞、可牽涉針對VEGF拮抗劑治療的腫瘤抗性的特定因子。例如，抗性腫瘤的鹽分級也產生了可以直接地或間接地提供抗性的因子。參見例如本文中的附圖8和實施例2。CD11b+Gr1+髓樣細胞的動員(mobilization)和活化可代表針對抗VEGF治療的抗性發生中的兩個步驟。本發明還提供了組合治療方法和組合物，其與抗VEGF—起使用了靶向髓樣細胞的藥劑和化療劑，如本文所述。這些組合治療可以抑制腫瘤血管發生和生長，和/或延遲抗VEGF抗性的發作。CDllb+Grl+細胞CD11/CD18家族在結構和遺傳上與更大的、調控細胞粘附相互作用的、受體的整聯蛋白家族相關，所述細胞粘附相互作用包括胚胎發生、對細胞外基質的粘附、和細胞分化(Hynes,R.O.,Ce〃48:549-554(1987);Kishimotoda/.,Jdv./mmwm/.46:149-182(1989)，Kishimotoefa/.，Ce〃48:681-690(1987);及Ruoslahti"a/.，6W露e238:491-497(1987))。整聯蛋白是一類跨膜異二聚體，其包含非共價相結合的cx亞基和(3亞基。P亞基一般能夠與超過一種a亞基結合，而且享有共同P亞基的異二聚體已經被分類為整聯蛋白群體中的亞家族(LarsonandSpringer,Structureandflmctionofleukocyteintegrins，/麵畫/.Tev.114:181-217(1990))。已經發現了CD11/CD18家族的整聯蛋白分子和它們的細胞配體介導多種細胞-細胞相互作用，尤其是在炎癥中。這些蛋白質已經被證明對免疫系統中的粘附功能是關鍵的(KishimotoWa/,,Wv./mm畫/.46:149-182(1989))。針對LFA-l的單克隆抗體已經顯示了阻斷白細胞對內皮細胞的粘附(Dustin"a/.,J.Ce〃.腺.107:321-331(1988);Smith"a/.，C""./騰W,83:2008-2017(1989))以及氺卩制T細月包活4匕(Kuypersda/.,/mmw"o/.,140:461(1989))、抗原特異性CTL殺傷所需的偶聯物(conjugate)形成(Kishimotoda/.,Jdv./附/;w"o/.46:149-182(1989))、T細胞增殖(Davignon^a/.,J./ww謂o/.127:590-595(1981))和NK細月包殺傷(Krenskya/.,//mmw"o/.131:611416U983);i。粘附受體分子的CD11/CD18家族包括四種高度相關的細胞表面糖蛋白LFA-1(CDlla/CD18)、Mac陽l(CDllb/CD18)、p150,95(CDllc/CD18)和(CDlld/CD18)。這些異二聚體的每一種具有獨特的oc鏈(CDlla、b、c或d)和不變的(3鏈(CD18)。位于白細胞上的CD18整聯蛋白可以結合在血管內皮和其它細胞上表達的細胞間粘附分子-1(ICAM-1)，從而介導白細胞粘附和跨內皮遷移(transendothelialmigration)。LFA-1存在于除了巨噬細胞的子集之外的所有成熟白細胞的表面，而且被認為是主要的淋巴樣整聯蛋白。Mac-l、pl50.95和CDlld/CD18的表達主要限于髓樣譜系的細胞(其包括嗜中性細胞、單核細胞、巨噬細胞和肥大細胞)。CDllb+Grl+是也見于髓樣細胞上的標志物。已經提出，在成熟的和不成熟的髓樣細胞之間的平衡是癌癥的指標，而且在漸進性腫瘤生長中，平衡朝向不成熟的髓樣細胞移動，伴有樹突細胞的目禾口功能的F務孑氐。參見例^口KusmartsevandGabrilovich,Immaturemyeloidcellsandcancer-associatedimmunesuppression.CV"er/wmw"o/7m附w"o/7erfl.51:293-298(2002)。例如，通過在攜瘤小鼠中使不成熟的髓樣細胞分化來移動平孑軒，改善了癌癥疫苗的歲丈果。參見Kusmartseva/.，All々纖-RetinoicAcidEliminatesImmatureMyeloidCellsfromTumor-bearingMiceandImprovestheEffectofVaccination.Ca"cer7g化flrc/;63:4441-4449(2003)。還觀察到，在癌癥患者中，循環中的VEGF水平與不成熟髓樣細胞數目增加有關。參見Almandd,Clinicalsignificanceofdefectivedendriticcellsdifferentiationincancer.CV/w.Qwceri饑6:1755(2000)。本文顯示了，CDllb+Grl+髓樣細胞的動員和活化可導致針對抗VEGF治療的抗性。還顯示了，從攜瘤小鼠分離的骨髓衍生CDllb+Grl+髓樣細胞可以賦予腫瘤以針對抗VEGF治療的抗性，而且來自抗VEGF抗性(而不是抗VEGF敏感性腫瘤)的條件化培養基刺激CDllb+Grl+細胞的遷移。本發明還提供了用于診斷對VEGF拮抗劑治療有抗性的腫瘤的方法和組合物。在本發明的某些實施方案中，本發明的方法比較測試和參考細胞群體中一種或多種CDllb+Gtl+或胂瘤抗性核酸的表達水平。本文公開的序列信息，與本領域已知的核酸檢測方法一起，容許檢測和比較各種已公開的轉錄物。在另一個實施方案中，本發明的方法比較具有抗性腫瘤的受試者的脾臟診斷大小和參考脾臟大小。在一個實施方案中，所述參考脾臟大小是當所述受試者沒有腫瘤時或當所述受試者對VEGF拮抗劑治療敏感時所述受試者的脾臟大小。在另一個實施方案中，所述參考脾臟大小是沒有腫瘤的其他受試者的平均脾臟大小或具有敏感性腫瘤的其他受試者的平均脾臟大小。脾臟大小可以使用本領域已知的方法來測量，包括但不限于非侵入性的成像技術，諸如超聲波、超聲波照相術、一維超聲波照相術(us)、放射性核素掃描、計算斷層照相術(CT)和/磁共纟展成^象。參見例如Yangefa/.，155(1):47-52(1991)。在又一個實施方案中，本發明的方法比較具有抗性腫瘤的受試者中腫瘤的血管表面積和參考血管表面積。在本發明的某些實施方案中，本發明包括提供測試細胞群體，其包括至少一個能夠表達一種或多種如下分子的細胞，所述分子是編碼蛋白質的核酸或是所述蛋白質，其中所述蛋白質是Grl、嗜中性細胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP和/或DRRTP。"能夠表達"意思是所述基因以完整的形式存在于所述細胞中并且可以^皮表達。如果存在，那么然后檢測一種、一些或所有序列的表達，并測量。使用已知序列的數據庫條目或芯片制造商提供的序列信息，可以使用本領域普通技術人員公知的技術來檢測(如果表達)和測量序列。例如，與編碼Grl、嗜中性細胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP的核酸對應的序列數據庫條目內的序列可以用于構建探針，用于在例如Northem印跡雜交分析或特異性地且優選定量地擴增特定核酸序列的方法中檢測相應的RNA序列。又例如，所述序列可以用于構建引物，用于在例如基于擴增的檢測方法諸如基于反轉錄的聚合酶鏈式反應中特異性地擴增編碼Grl、嗜中性細胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列的核酸。當基因表達方面的改變與基因擴增或刪除有關時，測試和參考群體中的序列比較可以通過比較測試和參考細胞群體中所檢查的DNA序列的相對量來進行。表達也可以在蛋白質水平來測量，即通過測量本文所述基因產物所編碼的多肽的水平。此類方法是本領域公知的，包括例如基于針對基因所編碼的蛋白質的抗體的免疫測定法。然后，將測試細胞群體中Grl、嗜中性細胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列的一種或多種的表達水平與來自參考細胞群體的一種或多種細胞中所述序列的表達水平相比較。測試和對照細胞群體中序列的表達可以使用任何本領域公認的用于比較核酸序列表達的方法來進行比較。例如，表達可以使用GENECALLINGRTM.方法來比較，記載于美國專利No.5,871,697和Shimketsefa/.，A^.所ofec/z"o/.17:798-803。在本發明的某些實施方案中，測量編碼Grl、嗜中性細胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP和/或DRRTP的一種、兩種或更多、三種或更多、四種或更多、五種或更多、六種或更多、七種或更多、八種或更多、九種或更多、十種或更多、十一種或更多、十二種或更多、十三種或更多、十四種或更多、十五種或更多、20種或更多、25種或更多、或所有的序列的表達。參考細胞群體包括一個或多個能夠表達所測量的Gr1、嗜中性細胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列、且其所比較的參數(例如對VEGF拮抗劑的敏感性)是已知的細胞。在本發明的某些實施方案中，如果其表達水平在參考細胞群體中的Grl、嗜中性細胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP轉錄物的水平的小于或等于2.0倍的因數之內變動，那么測試細胞群體中的Grl、嗜中性細胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列被認為是在表達水平上與參考細胞群體中的Grl、嗜中性細胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列的表達水平相當。在多種實施方案中，如果其表達水平相對于參考細胞群體的變動超過參考細胞群體中相應Grl、嗜中性細胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列的表達水平的2.0倍，那么測試細胞群體中的Grl、嗜中性細胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP任選地，比較測試細胞群體和參考細胞群體之間差異表達的序列可以針對對照核酸來進行，所述對照核酸的表達獨立于所測量的參數或條件。測試平。適合的對照核酸可以由本領域普通技術人員容易地確定。測試細胞群體可以是任何數目的細胞，即一個或多個細胞，而且可以是體外、體內或離體提供的。在某些實施方案中，參考細胞群體中的細胞衍生自與測試細胞(例如腫瘤細胞)盡可能相似的組織類型。在某些實施方案中，對照細胞衍生自與測試細胞相同的受試者，例如衍生自測試細胞的來源區域鄰近的區域，或衍生自所述受試者對VEGF拮抗劑治療敏感時的時間點。在本發明的一個實施方案中，參考細胞群體衍生自多種細胞。例如，參考細胞群體可以是來自早先測試的細胞的表達樣式的數據庫，所述細胞的VEGF拮抗劑的腫瘤敏感性治療是已知的。評估腫瘤敏感性CDllb+GRl+髓樣細胞的募集、及本文所述URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列的一些的表達與腫瘤對VEGF拮抗劑治療的抗性有關。因而，在一個方面，本發明提供了評估受試者中VEGF拮抗劑敏感性的方法，其中VEGF拮抗劑敏感性是指用抗VEGF治療腫瘤的能力。在本發明的一個實施方案中，一種方法包括提供來自所述受試者的一種或多種測試細胞群體，其包括能夠表達一種或多種與編碼URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP的核酸同源的核酸序列的細胞。將序列的表達與參考細胞群體相比較。可以使用任何參考細胞群體，只要所述參考細胞群體中的細胞的VEGF拮抗劑敏感性狀態是已知的。比較可以對同時地或在時間上不同的時間測量的測試和參考樣品來進行。后者的例子是使用匯編的表達信息，例如序列數據庫，其集合了關于敏感性狀態已知的細胞中已知序列的表達水平的信息。在本發明的某些實施方案中，參考細胞群體是對CDllb+Grl+髓樣細胞富集的。在本發明的某些實施方案中，參考細胞群體是對腫瘤細胞富集的。診斷或標志物集合本發明還提供了標志物集合來鑒定抗性腫瘤。在某些實施方案中，這些標志物集合在試劑盒中提供，用于評估腫瘤對VEGF拮抗劑治療的敏感性或抗性。例如，標志物集合可以包括兩種或更多、三種或更多、四種或更多、五種或更多、六種或更多、七種或更多、八種或更多、九種或更多、十種或更多、十一種或更多、十二種或更多、十三種或更多、十四種或更多、十五或更多、二十種或更多、或整種集合的分子。所述分子是編碼蛋白質的核酸或是蛋白質，所述蛋白質具有改變的表達和/或活性且選自以下Notch2、DMD8、MCP-1、ITGB7、G-CSF、IL-8R、MIP2、MSCA、GM陽CSF、IL-1R、Meg-SF、HSP1A、IL-1R、G-CSFR、IL10-R1、Erb-2.1、窖蛋白3、Semcap3、INTG4、THBSP-4、ErbB3、JAM、Eng、JAM、Eng、JAM-2、Pecaml、Tlr3、嗜中性細胞彈性蛋白酶、CD14、expi、I1-13R、LDLR、TLR-l、RLF、Endo-Lip、S0CS13、FGF13、IL-4R、THBS1、Crea7、水通道蛋白-1、SCF38、APOE、FABP、IL-11R、IL-IRII、IFNTM1、TNFRSF18、WNT5A、分泌載體膜l、HSP86、EGFR、EphRB2、GPCR25、HGF、血管生成素樣-6、Eph-RA7、腦信號蛋白Vlb、神經營養因子5、密蛋白-18、MDC15、ECM、ADAMTS7B、NCAM-140、纖連蛋白III型、WIP、CD74、ICAM-2、Jaggedl、ltga4、ITGB7、TGF-BII-R、TGFbIEP、Smad4、BMPR1A、CD83、Dectin-1、CD48、E-選擇素、IL-15、細胞因子信號傳導的抑制物4、Cytor4、CX3CR1、IGF2、HSP9A、FGF18、ELM1、Ledgfa、清除受體A型、巨噬細胞C-型凝集素、Pigr3、巨噬細胞SRT-1、G蛋白偶聯受體、ScyA7、IL-1R2、IL-1可誘導蛋白、IL-l卩、ILIX前體(ILIXPrecuror)、TGF-B、FIZZ1、Wfsl、TP14A、EMAP、SULF-2、細胞外基質2、CTFG、TFPI、XCP2、Ramp2、ROR-a、肝配蛋白B1、SPARC樣l和腦信號蛋白A。在本發明的一個實施方案中，提供了檢測蛋白質的抗體。在一個實施方案中，所述分子衍生自CDllb+Grl+細胞，而且包括例如IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13、IL-4R、THBSl和Crea7。在另一個實施方案中，所述分子衍生自抗性腫瘤，而且包括例如MSCA、MIP2、IL-8R、G-CSF、IL10-R2、THBSP-4和JAM-2。調控物及其用途VEGF、Grl、嗜中性細胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、CDllb、CD18、URCGP、DRCGP、URRTP和DRTRP的調控物指調控這些蛋白質的活性的分子，例如激動劑和拮抗劑。術語"激動劑，，用于指本發明蛋白質的肽和非肽類似物，以及特異性結合此類本發明蛋白質的抗體，只要它們具有提供激動劑信號的能力。術語"激動劑"是在蛋白質的生物學作用的環境中定義的。在某些實施方案中，激動劑具有本發明的天然蛋白質的生物學活性，例如對于VEGF。術語"拮抗劑"用于指具有抑制本發明蛋白質的生物學活性的能力的分子。拮抗劑可以通過例如對蛋白質活性的抑制來評估。治療用途根據本發明期待的是，調控物的組合(包括VEGF拮抗劑、髓樣細胞減少劑和其它藥劑)可以用于治療多種贅生物或非贅生性疾患。在一個實施方54案中，調控物(例如VEGF拮抗劑、髓樣細胞減少劑、URCGP和URRTP的拮抗劑("本發明的拮抗劑"))用于抑制抗性腫瘤的癌細胞或腫瘤生長。在本發明的某些實施方案中，調控物(例如DRCGP和DRRTP的激動劑("本發明的激動劑))用于抑制癌細胞或腫瘤生長。根據本發明期待的是，本發明的拮抗劑也可以用于抑制腫瘤的轉移。在某些實施方案中，一種或多種抗癌劑可以與本發明的拮抗劑和/或本發明的激動劑一起施用來抑制癌細胞或腫瘤生長。還參見本文中標題為組合療法的小節。下所記載的那些。可以用本發明的拮抗劑治療的非贅生性疾患包括但不限于例如不良或異常肥大、關節炎、類風濕性關節炎(RA)、4艮屑病、銀屑病斑塊、結節病、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化斑塊、來自心肌梗死的水腫、糖尿病性和其它增殖性視網膜病(包括早產兒視網膜病、晶狀體后纖維組織增生癥、新生血管性青光眼、年齡相關的黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、視網膜/脈絡膜新血管形成、角(angle)的新血管形成(虹膜)、眼的新血管病、血管的再狹窄、動靜脈畸形(AVM)、腦膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、曱狀腺增生(包括格雷夫斯氏病(Grave'sdisease))、角膜和其它組織移植、慢性炎癥、肺部炎癥、急性肺損傷/ARDS、敗血病、原發性肺動脈高壓、惡性肺部積液(malignantpulmonaryeffusion)、腦水腫(例如，與急性中風/閉合頭部損傷/夕卜傷相關的)、滑液的炎癥、RA中的血管翳形式、骨化性肌炎、肥厚性骨形成(hypertropicboneformation)、骨關節炎(OA)、頑固性腹水、多嚢性卵巢病、子宮內膜異位癥、第三體液分區疾病(3rdspacingoffluiddiseases)(胰腺炎、間隔綜合征、燒傷、腸病)、子宮的類纖維瘤(uterinefibroid)、早產、慢性炎癥諸如IBD(克羅恩氏病(Crohn'sdisease)和潰瘍性結腸炎)、腎臟同種移植物排斥、炎性腸病、腎病綜合征、不良或異常組織塊生長(tissuemassgrowth)(非癌癥)、肥胖、脂肪組織塊生長、血友病關節、肥厚性瘢痕、毛發生長的抑制、Osler-Weber綜合癥、膿性肉芽腫晶狀體后纖維組織增生癥、硬皮病、沙眼、血管粘連、滑膜炎、皮炎、先兆子癇、腹水、心包積液(諸如與心包炎相關的)和合胸腔積液。組合療法如上所述，本發明提供了組合療法，其中VEGF拮抗劑與另一種療法組合施用。例如，VEGF拮抗劑與本發明的不同藥劑或拮抗劑(和/或本發明的激動劑)組合施用來治療針對抗VEGF治療有抗性的腫瘤。在某些實施方案中，別的藥劑(例如髓樣細胞減少劑、抗癌癥劑或治療劑、抗血管發生劑、或抗新血管形成治療劑)也可以與抗VEGF和本發明的不同拮抗劑組合施用來治療多種贅生性或非贅生性疾患。在一個實施方案中，所述贅生性或非贅生性疾患的特征在于與針對VEGF拮抗劑治療有抗性的異常或不良血管發生有關的病理性疾患。本發明的拮抗劑可以與對那些目的有效的另一種藥劑連續地或組合地施用，或是在同一組合物中或是作為分開的組合物。或者/另外，可以施用本發明的多種拮抗劑、藥劑和/或激動劑。本發明的拮抗劑和/或藥齊"例如髓樣細胞減少劑)的施用可以同時進行，例如作為單一組合物或作為使用相同或不同施用路徑的兩種或多種不同組合物。或者/另外，施用可以連續地、按任何次序進行。在某些實施方案中，范圍從數分鐘到數天、到數周、到數月的間隔可以存在于兩個或多個組合物的施用之間。例如，可以先施用VEGF拮抗劑，接著是本發明的不同的拮抗劑或藥劑(例如髓樣細胞減少劑)(除了VEGF拮抗劑之外)。然而，還涵蓋同時施用或先施用本發明的不同的拮抗劑或藥劑。與VEGF拮抗劑組合施用的治療劑的有效量將處于醫師或獸醫的判斷之內。進行劑量施用和調整來實現待治療疾患的最大管理。劑量將另外取決于這些因素，諸如待使用的治療劑的類型和所治療的特定的患者。VEGF拮抗劑的合適劑量就是當前使用的那些，而且由于VEGF拮抗劑和本發明的不同拮抗劑的組合作用(協同作用)可以降低。在某些實施方案中，抑制物的組合強化了單一抑制物的效力。術語"強化"是指在其常用的或批準的劑量下治療劑的效力方面的改善。還參見本文中標題為藥物組合物的小節。與癌癥相關的抗血管發生療法是一種癌癥治療策略，針對抑制腫瘤血管的發育，腫瘤血管是提供營養物以支持腫瘤生長所需的。由于血管發生牽涉原發性胂瘤生長和轉移二者，本發明所提供的抗血管發生治療能夠抑制腫瘤在原發位點的贅生性生長以及預防腫瘤在繼發位點的轉移，因而容許用其它治療劑攻擊肺瘤。在本發明的一個實施方案中，抗癌劑或治療劑是抗血管發生劑。在另一個實施方案中，抗癌劑是化療劑。許多抗血管發生劑已經被鑒定并且是本領域已知的，包括本文中列出的那些，例3口在定義中歹'J出的，以及由例j口CarmelietandJain,iVafww407:249-257(2000);Ferraraa/.,胸,iev/ei>wgD&cov"3:391-400(2004);及Sato,乂C7/".O歸Z.8:200-206(2003)所列出的。還參見美國專利申請US20030055006。在一個實施方案中，本發明的拮抗劑與抗VEGF中和性抗體(或片段)和/或另一種VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑組合使用，所述VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑包括但不限于例如可溶性VEGF受體(例如VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、神經氈蛋白(neuropillin)(例如NRP1、NRP2))片段、能夠阻斷VEGF或VEGFR的適體、中和性抗VEGFR抗體、VEGFR酪氨酸激酶(RTK)的低分子量抑制物、針對VEGF的反義策略、針對VEGF或VEGF受體的核酶、VEGF的拮抗性變體；以及它們的任何組合。或者/另外，在VEGF拮抗劑和其他本發明藥劑之外，兩種或更多血管發生抑制劑可以任選地共施用給患者。在某些實施方案中，一種或多種別的治療劑(例如抗癌劑)可以與本發明的藥劑、VEGF拮抗劑和/或抗血管發生劑組合施用。在本發明的某些方面，可用于使用本發明拮抗劑的組合腫瘤治療的其它治療劑包括其它癌癥療法(例如手術、放射治療(例如牽涉照射或施用放射性物質)、化學療法、使用本文所列的和本領域已知的抗癌劑的治療、或其組合)。或者/另外，結合本文公開的相同的或兩種或更多不同的抗原的兩種或更多抗體可以共施用給患者。有時，可能有益的是還向患者施用一種或多種細胞因子。化療劑在某些方面，本發明提供了阻斷或降低抗性腫瘤生長或癌細胞生長的方法，其通過向易患癌癥或診斷有癌癥的患者施用有效量的VEGF拮抗劑和本發明的拮抗劑以及一種或多種化療劑。多種化療劑可以在本發明的組合治療方法中使用。所涵蓋的化療劑的例示性的和非限制性的列表在本文"定義"中提供。本領域普通技術人員將理解的是，適合劑量的化療劑一般將接近臨床療法中所早就采用的那些，在所述臨床療法中化療劑被單獨地或與其它化療劑組合地施用。劑量的變異將有可能存在，這取決于所治療的疾患。施行治療的醫師將能夠確定各個受試者的適合劑量。復發性腫瘤生長本發明還提供了用于抑制或預防復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長的方法和組合物。復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長用于描述這樣一種狀況，其中正在接受一種或多種當前可用療法或者用一種或多種當前可用療法(例如癌癥療法，諸如化療、放療、手術、激素療法和/或生物學療法/免疫療法、抗VEGF抗體療法，特別是針對特定癌癥的標準治療方案)治療過的患者在臨床上不足以治療該患者，或者該患者不再從治療中接受任何有益效果，使得這些患者需要別的有效療法。在用于本文時，該用語也可以指"非響應性/不應性"患者的狀況，例如這描述了對治療有響應但遭遇副作用的患者、發生抗性的患者、對治療不響應的患者、對治療的響應不令人滿意的患者等。在各種實施方案中，當癌細胞的數目沒有顯著減少或癌細胞的數目增加了，或者腫瘤的大小沒有顯著縮小或腫瘤的大小增大了，或者癌細胞的數目或大小未能進一步減少或縮小時，則癌癥是復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長。癌細胞是否是復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長的確定可以通過用于分析治療對癌細胞的有效性的本領域已知的任何方法、在體內或在體外進行，在上下文中使用"復發性"或"不應性"或"非響應性，，的本領域接受的含義。針對抗VEGF治療有抗性的腫瘤是復發性腫瘤生長的例子。本發明提供了阻斷或降低受試者中復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長的方法，其通過施用本發明的一種或多種拮抗劑來阻斷或降低所述受試者中的復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長。在某些實施方案中，所述拮抗劑可以在癌癥治療劑之后施用。在某些實施方案中，本發明的拮抗劑與癌癥治療(例如化療)同時地施用。或者/另外，拮抗劑治療與另一種癌癥治療交替，其可以以任何次序進行。本發明還涵蓋施用一種或多種抑制性抗體來抑制傾向于患上癌癥的患者中癌癥的發作或復發的方法。一般而言，所述受試者正在接受癌癥治療。在一個實施方案中，所述癌癥治療是使用抗血管發生劑(例如VEGF拮抗劑)的治療。抗血管發生劑包括本領域已知的那些和本文定義中所見的那些。在一個實施方案中，所述抗血管發生劑是抗VEGF中和性抗體或片段(例如人源化A4.6.1，AVASTIN(Genentech，SouthSanFrancisco,CA)、Y0317、M4、G6、B20、2C3等)。參見例如美國專利6,582,959、6,884,879、6,703,020;W098/45332;WO96/30046;WO94/10202;EP0666868B1;美國專利申請20030206899、20030190317、20030203409和20050112126;Popkov，Jow廠"a/o/7;www"o/og/cfl/Me/ZzO(is1288:149-164(2004);及WO2005012359。別的藥劑可以與VEGF拮抗劑和本發明拮抗劑組合施用，用于阻斷或降低復發性肺瘤生長或復發性癌細胞生長，例如參見本文中標題為組合療法的小節。在一個實施方案中，本發明的拮抗劑或降低Grl、嗜中性細胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP或URRTP的表達的其它治療劑被施用來反轉癌細胞對某些生物學的(例如拮抗劑，其是抗VEGF抗體)、激素的、放射的或化學治療的藥劑的抗性或降低的敏感性，從而使所述癌細胞對一種或多種這些藥劑重新敏感，其然后可以被施用(或繼續施用)來治療或管理癌癥，包括預防轉移。抗體本發明的抗體包括本發明蛋白質的抗體和本發明蛋白質的抗體的抗體片段。本發明的多肽或蛋白質包括但不限于VEGF、Grl、MCP-1、MIP-la、CDllb、CD18、嗜中性細胞彈性蛋白酶、URCGP、DRCGP、URRTP和DRRTP。在某些方面，本發明的多肽或蛋白質是針對例如VEGF、Grl、MCP-1、MIP-la、CDllb、CD18、URCGP、DRCGP、URRTP和DRRTP的抗體，見本文中才是供的一般性多肽或蛋白質信息。本發明的抗體進一步包括作為抗血管發生劑或血管發生抑制劑的抗體，作為髓樣細胞減少劑的抗體，VEGF、Grl、嗜中性細胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、CDllb、CD18、URCGP、DRCGP、URRTP和DRRTP的抗體，作為抗癌劑的抗體，或本文所述其它抗體。例示性的抗體包括例如多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、抗體片段、多特異性抗體、異源偶聯抗體、多價抗體、效應器功能工程改造的抗體等。多克隆抗體本發明的抗體可以包括多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法是熟練技術人員知道的。例如，本發明的多克隆抗體通過在動物中一次或多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射相關抗原和佐劑來生成。使用雙功能或衍生化藥劑(例如馬來酰亞胺苯曱酰磺基琥珀酰亞胺酯(通過半胱氨酸殘基偶聯)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R'NONR(其中R和R'是不同的烴基))將相關抗原與在待免疫物種中有免疫原性的蛋白質(例如匙孑U戚血藍蛋白、血清清蛋白、牛曱狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)偶聯可能是有用的。通過將例如10(Vg或5iiig蛋白質或偶聯物(分別用于家兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混和并將該溶液皮內注射于多個部位，將動物針對本發明的分子、免疫原性偶聯物或衍生物進行免疫。一個月后，通過多個部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中初始量l/5-l/10的肽或偶聯物對動物進行加強免疫。7-14天后，采集動物的血液，并測定血清的抗體滴度。對動物進行加強免疫，直到滴度達到平臺(plateau)。典型的是，將動物用相同抗原但與不同蛋白質和/或通過不同交聯劑偶聯得到的偶聯物進行加強免疫。偶聯物還可在重組細胞培養中作為蛋白質融合物來制備。同樣，適當使用凝聚劑(諸如明礬)來增強免疫應答。單克隆抗體針對本文所述抗原的單克隆抗體可以^吏用最初由Kohlerda/.,A^&w256:495(1975)記載的雜交瘤方法來制備，或者可以通過重組DNA方法(美國專利No.4,816,567)來制備。在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它適宜的宿主動物(諸如倉鼠或短尾猴(macaquemonkey))以引發生成或能夠生成如下抗體的淋巴細胞，所述抗體將特異性結合用于免疫的蛋白質。或者，可以在體外免疫淋巴細胞。然后，使用合適的融合劑(諸如聚乙二醇)將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成雜叉瘤纟田月包(Goding,Afowoc/owfl/j"/7'6。(iz'es:/V/wc^/as戶racO'ce,pp.59-103,AcademicPress,1986)。將如此制備的雜交瘤細胞在合適的培養基中接種和培養，所述培養基典型的含有一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質。例如，若親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃噤呤鳥噤呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養基典型的將含有次黃噪呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養基)，這些物質阻止HGPRT缺陷細胞生長。典型的骨髓瘤細胞是那些高效融合、支持所選抗體生成細胞穩定的高水平生成抗體、并對諸如HAT培養基的培養基敏感的。在這些骨髓瘤細胞中，優選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤系，諸如那些可從索爾克研究所細胞分配中心、(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,California,USA)獲4尋的MOPC-21和MPC-11小鼠胂瘤及可從美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,Maryland,USA)獲得的SP-2或X63-Ag8-653細胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系也已記載用于生成人單克隆抗體(Kozbor，/mww"o/.133:3001(1984);Brodeur"a/.,Mo"oc/owa//Vo^cricw7fec/m—as4^//c加bra,pp.51-63,MarcelDekker，Inc.,NewYork,1987)。對雜交瘤細胞正在其中生長的培養液測定針對例如VEGF、Grl、嗜中性細胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、CDllb、CD18、URCGP、DRCGP、URRTP、DRRTP、或血管發生分子的單克隆抗體的生成。可通過免疫沉淀或通過體外結合測定法(諸如放射免疫測定法(RIA)或酶聯免疫吸附測定法(ELISA))測定由雜交瘤細胞生成的單克隆抗體的結合特異性。此類技術和測定法是本領域知道的。單克隆抗體的結合親和力可通過例如MunsonandPollard,歷ocAew.107:220(1980)的Scatchard分析來測定。在鑒定到生成具有期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，該克隆可通過有限稀釋規程進行亞克隆并通過標準方法進行培養(Goding,Mowoc/oa/爿w/7.6o(i/es.,尸〃>7">/&flw<i/Va"/ce,pp.59-103,AcademicPress,1986)。適于這一目的的培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。另外，雜交瘤細胞可在動物中作為腹水瘤進行體內培養。通過常規免疫球蛋白純化規程(諸如例如蛋白A-Sepharose、雍磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析)將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養基、腹水或血清適當分開。單克隆抗體還可以通過重組DNA方法來制備，諸如美國專利No.4,816，567中所記載的。編碼單克隆抗體的DNA易于使用常規規程分離和測序(例如通過使用能夠特異性結合編碼單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞可充當此類DNA的來源。一旦分離，可將DNA置入表達載體，然后將該表達載體轉染入原本不生成免疫^^蛋白蛋白質的宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)以在重組宿主細胞中獲得單克隆抗體的合成。抗體的重組生產在下文中有更詳細的描述。在另一個實施方案中，可以從使用McCaffertyefa/.，A^ww348:552-554(19卯)所記載的技術構建的噬菌體抗體庫分離抗體或抗體片l殳。Clacksonefa/.,胸臟352:624-628(1991)和Marksda/"J.贏編.222:581-597(1991)分別記載了使用噬菌體文庫分離鼠和人抗體。后續出版物記載了通過鏈改組(Marks"歷o/rec/z"o/ogy10:779-783(1992))，以及組合感染和體內重組作為構建非常大的噬菌體文庫的策略(Waterhouse&a/.，^c/^sWay.21:2265-2266(1993)),生成高親和力(nM范圍)的人抗體。如此，這些技術是用于分離單克隆抗體的傳統單克隆抗體雜交瘤技術的可行替代方法。還可以修飾DNA,例如通過替代即用人重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列替換同源鼠序歹'J(美國專利No.4,816,567;Morrison"a/.,7Va"^cad5W.81:6851(1984))，或通過將非免疫球蛋白多肽的整個或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價連接。典型的是，用此類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恒定域，或者用它們替代抗體的一個抗原結合位點的可變域，以產生嵌合二價抗體，其包含對一種抗原具有特異性的一個抗原結合位點和對不同抗原具有特異性的另一個抗原結合位點。人源化抗體和人抗體本發明的抗體可以包括人源化抗體或人抗體。人源化抗體具有一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱作"輸入，，殘基，它們典型的取自"輸入"可變域。人源化可基本上遵循Winter及其同事白勺方法進4亍(Jonesefa/"7Vafwe321:522-525(1986);RiechmanndaZ"7Vafwre332:323-327(1988);Verhoeyen"a/"Sc〖e廳239:1534-1536(1988)),通過用嚙齒類CDR序列替代人抗體的相應序列。因而，此類"人源化，，抗體是嵌合抗體(美國專利No.4,816,567),其中基本上少于整個人可變域用來自非人物種的相應序列替代。在實踐中，人源化抗體典型的是其中一些CDR殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點的殘基替代的人抗體。用于構建人源化抗體的人可變域(包括輕鏈和重鏈二者)的選擇對于降低抗原性非常重要。依照所謂的"最適"(best-fit)方法，用嚙齒類抗體的可變域序列對已知的人可變域序列的整個文庫進行篩選。然后接受與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架(FR)(SimsW"/.,J//wtw"o/.151:2296(1993);Chothiaefa/.，/Afo/.所o/.196:901(1987))。另一種方法4吏用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架。同一框架可用于數種不同的人源化抗體(Carter"a/.,尸rac.iVaf/.5W.OS^89:4285(1992);PrestaWa/.,//mmw"o/.151:2623(1993))。一種典型的方法，通過使用親本和人源源化抗體。三維免疫球蛋白模型是公眾可獲得的，且為本領域技術人員所熟悉。可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構象結構的計算機程序。檢查這些顯示圖像容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。這樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基并進行組合，從而荻得期望抗體特征，諸如對耙抗原的親和力提高。一般而言，CDR殘基直接且最實質的涉及對抗原結合的影響。或者，現在有可能生成在缺乏內源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體完整全集的轉基因動物(例如小鼠)。例如，已經記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(Jh)基因的純合刪除導致內源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉移大量人種系免疫球蛋白基因將導致在4元原J丈擊后生成人4元體。參見例:VJakobovitsefa/.,尸roc.7Va;7.^c^/.Sc/.OS^卯:2551(1993);Jakobovitsda/"胸匿362:255-258(1993);Bmgge羅nn"y麼&/廳諷7:33(1993);及Duchosalefa/.胸廳355:258(1992)。人抗體也可以衍生自p盡菌體展示庫(Hoogenboom&a/.,Mo/.所o/.,227:381(1991);Marksefa/.,JAio/.傷o/.，222:581-597(1991);Vaughan"a/.A/^mm腸fec/z14:309(1996》。人抗體還可以使用本領域已知的多種技術來生產，包括噬菌體展示庫(HoogenboomandWinter,J!Afo/.所o/.227:381(1991);Marksdo/.，Mo/,歷o/.222:581(1991))。依照這種技術，將抗體V結構域基因以符合讀碼框的方式克隆入絲狀噬菌體(諸如M13或fd)的主要或次要外殼蛋白基因，并在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因為絲狀噬菌體顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎進行的選擇也導致編碼展示那些特性的抗體的基因的選擇。如此，噬菌體模擬B細胞的一些特性。噬菌體展示可以以多種格式進行，綜述參見例如Johnson,KS.andChiswell,DJ.，C&所o/3:564-571(1993)。V基因區段的數種來源可用于噬菌體展示。例如，Clackson"a/.,A/afwre352:624-628(1991)從衍生自經免疫小鼠脾的小型V基因隨機組合文庫分離得到大量不同的抗條唑酮抗體。例如通63過基本上遵循Marksda/.,乂Mo/.222:581-597(199l)或Griffith"a/.,12:725-734(1993)記載的技術，可以自未免疫人供體構建V基因全集和分離針對大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見美國專利No.5,565,332和5，573，905。Cole等人和Boerner等人的技術也可用于制備人單克隆抗體(Colefl/.，Afowoc/owa/<3m/G2wcerTTzera/;/,AlanR.Liss,p.77(1985)及Boerner"a/.,J/mmw"o/.147(l):86-95(1991》。還可以由體外激活的B細胞來生成人抗體(參見美國專利No.5,567,610和5,229，275)。抗體片段本發明還包括抗體片段。已經開發了用于生成抗體片段的多種技術。傳統上，通過蛋白水解消化完整抗體來衍生這些片段(參見例如Morimotodfl/.,/owr"a/o/S/oc/remfca/朋(i所op/z戸'ca/Md/zcxis24:107-117(1992);Brennana/.,SWwce229:81(1985))。然而，現在可直接由重組宿主細胞生成這些片段。例如，可從上文討論的噬菌體抗體庫中分離抗體片段。或者，可直接從大腸桿菌回收Fab'-SH片段并化學偶聯以形成F(ab')2片段(Cartera/.，歷o/Tec/2"ofogy10:163-167(1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主細將是顯而易見的。在其它實施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO93/16185;美國專利No.5,571,894;及美國專利No.5,587,458。Fv和sFv是具有完整結合位點、缺少恒定區的唯一類型；如此，它們適于在體內使用時降低非特異性結合。可構建sFv融合蛋白以生成效應器蛋白質在sFv的氨基或羧基末端的禹蟲合。參見爿"&7)oc(v五"g77een'"g,Borrebaeck編,見上文。4元體片段還可以是"線性抗體"，例如如美國專利No.5,641,870中所記載的。此類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。多特異性抗體(例如雙特異性的)本發明的抗體還包括例如多特異性抗體，其具有對至少兩種不同抗原的結合特異性。盡管此類分子通常只會結合兩種抗原(即雙特異性抗體，BsAb),但是此表述在用于本文時涵蓋具有額外特異性的抗體(諸如三特異性抗體)。BsAb的例子包括一個臂針對腫瘤細胞抗原而另一個臂針對細胞毒性觸發分子的BsAb,諸如抗FcyRI/抗CD15、抗pl85HER2/Fc丫RI11(CD16)、抗CD3/抗惡性B細胞(1D10)、抗CD3/抗pl85HE"、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗腎細胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗結腸癌)、抗CD3/抗黑色素細胞刺激激素類似物、抗EGF受體/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神經細胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗葉酸結合蛋白(FBP)/抗CD3、抗泛癌相關抗原(AMOC-31)/抗CD3;—個臂特異性結合腫瘤抗原而一個臂結合毒素的BsAb,諸如抗皂草素/抗Id-l、抗CD22/抗皂草素、抗CD7/抗皂草素、抗CD38/抗皂草素、抗CEA/抗蓖麻毒蛋白A鏈、抗千擾素-a(IFN-a)/抗雜交瘤獨特型、抗CEA/抗長春花生物堿類；用于轉變酶活化的前體藥物的BsAb,諸如抗CD30/抗堿性磷酸酶(其催化磷酸絲裂霉素前體藥物轉變成絲裂霉素醇)；可用作溶纖劑的BsAb，諸如抗血纖維蛋白/抗組織型纖溶酶原激活物(tPA)、抗血纖維蛋白/抗尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA);用于將免疫復合物靶向細胞表面受體的BsAb，諸如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受體(例如FcyRI、FcyRII或FcYRin);用于傳染病治療的BsAb,諸如抗CD3/抗單純皰滲病毒(HSV)、抗T細胞受體:CD3復合物/抗流感、抗FcyR/抗HIV;用于體外或體內腫瘤檢測的BsAb，諸如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗pl85H1^/抗半抗原；作為疫苗佐劑的BsAb;及作為診斷工具的BsAb，諸如抗家兔IgG/抗鐵蛋白、抗辣根過氧化物酶(HRP)/抗激素、抗促生長素抑制素/抗物質P、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗(3-半乳糖苦酶。三特異性抗體的例子包括抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。雙特異性抗體可以制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab，)2雙特異性抗體)。用于生成雙特異性抗體的方法是本領域已知的。全長雙特異性抗體的傳統生產基于兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein"a/.,Atowe305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結構。通常通過親和層析步驟進行的正確分子的純化相當麻煩且產物產量低。類似的規程披露于WO93/08829及Traunecker"a/.，五MBOJ！10:3655-3659(1991)。依照一種不同的方法，將具有期望結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。優選的是，與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區的免疫球蛋白重鏈恒定域進行融合。優選在至少一種融合物中存在包含輕鏈結合所必需的位點的第一重鏈恒定區(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和需要時的免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達載體，并共轉染入合適的宿主生物體。在用于構建的三種多肽鏈比例不等時提供最佳產量的實施方案中，這為調整三種多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比例表達導致高產量時或在該比例沒有特別意義時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體。在該方法的一個實施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了便利的分離途徑，因此發現這種不對稱結構便于將想要的雙特異性復合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法披露于wo94/04690。關于生成雙特異性抗體的進一步詳情參見例如SureshMef/20^y五w^ymo/ogv121:210(1986)。依照WO96/27011中記載的另一種方法，可改造一對抗體分子間的界面，以將從重組細胞培養物回收的異二聚體的百分比最大化。優選的界面包含抗體恒定域的至少部分CH3結構域。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側鏈用較大側鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過將大氨基酸側鏈用較小氨基酸側鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換，在第二抗體分子的界面上產生與大側鏈大小相同或相似的補償性"空腔"。這提供了較之其它不想要的終產物(諸如同二聚體)提高異二聚體產量的機制。文獻中還記載了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術。例如，可使用化學連接來制備雙特異性抗體。Brennan"a/.,5We"ce229:81(1985)記載了通過蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab')2片段的規程。將這些片段在存在二硫醇絡合劑亞砷酸鈉時還原，以穩定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產生的Fab，片段轉變為硫代硝基苯曱酸酯(TNB)衍生物。然后將Fab'-TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復成Fab'-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab'-TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最新的進展便于從大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段，這些片段可化學偶聯以形成雙特異性抗體。Shalabyefa/.,MeA175:217-225(1992)記載了完全人源化的雙特異性抗體F(ab')2分子的生成。由大腸桿菌分開分泌每種Fab'片段，并在體外進行定向化學偶聯以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結合過表達VEGF受體的細胞和正常人T細胞，以及觸發人細胞毒性淋巴細胞針對人乳瘤靶物的溶解活性。還記載了從重組細胞培養物直接生成和分離雙特異性抗體片段的多種技術。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny"a/.，《//mm柳o/.148(5):1547-1553(1992)。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab'部分連接。抗體同二聚體在鉸鏈區還原以形成單體，然后重新氧化以形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。Hollinger"a/.,尸rac.A^/.Jcad5W.t/5^90:6444-6448(1993)記載的"雙抗體"技術提供了生成雙特異性抗體片段的替代機制。該片段包含通過接頭相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VO，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個結構域之間不能配對。因而，迫使一個片段上的VH和Vt結構域與另一個片段上的互補VL和VH結構域配對，由此形成兩個抗原結合位點。還報道了通過使用單鏈Fv(sFv)二聚體生成雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Grubere/.,/152:5368(1994)。涵蓋具有超過兩個效價的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt"fl/.,乂/wm腦o/.147:60(1991)。異源偶聯抗體雙特異性抗體包括交聯或"異源偶聯"抗體，它們是本發明的抗體。例如，異源偶聯物中的一種抗體可與親合素偶聯，另一種抗體與生物素偶聯。例如，此類抗體已經建議用于將免疫系統細胞靶向不想要的細胞(美國專利No.4,676,980),及用于治療HIV感染(WO91/00360，WO92/200373和EP03089)。可使用任何便利的交聯方法來生成異源偶聯抗體。合適的交聯劑是本領域眾所周知的，連同許多交聯技術一起4皮露于美國專利No.4,676,980。多價抗體本發明的抗體包括多價抗體。多價抗體可以比二價抗體更快的受到表達該抗體所結合抗原的細胞的內在化(和/或異化)。本發明的抗體可以是可容易的通過重組表達編碼抗體多肽鏈的核酸而生成的、具有三個或更多抗原結合位點(例如四價抗體)的多價抗體(IgM類別以外的)。多價抗體可包含二聚化結構域和三個或更多抗原結合位點。優選的二聚化結構域包含(或由其組成)Fc區或鉸鏈區。在這種情況中，抗體將包含Fc區及Fc區氨基末端的三個或更多抗原結合位點。本文中優選的多價抗體包含(或由其組成)三個至約八個但優選四個抗原結合位點。多價抗體包含至少一條多肽鏈(優選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個或更多可變域。例如，多肽鏈可包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可變域，VD2是第二可變域，Fc是Fc區的一條多肽鏈，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或l。例如，多肽鏈可包含VH-CHl-柔性接頭-VH-CH1-Fc區鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區鏈。本文中的多價抗體優選進一步包含至少兩條(優選四條)輕鏈可變域多肽。本文中的多價抗體可包含例如約兩條至約八條輕鏈可變域多肽。本文涵蓋的輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域，且任選進一步包含CL結構域。效應器功能工程改造可能希望在效應器功能方面修飾本發明的抗體，從而增強例如抗體在治療癌癥中的效力。例如，可向Fc區中引入半胱氨酸殘基，乂人而使得在該區中形成鏈間二硫鍵。如此生成的同二聚體抗體可具有改善的內在化能力和/或拔_高的補體介導的細胞殺傷和抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)。參見CaronW"/,，乂Exp.7k/^/.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.，J/肌ww"o/.148:2918-2922(1992)。具有增強的抗肺瘤活性的同二聚體抗體還可使用如Wolffda/.,Omcerie"arc/z53:2560-2565(1993)中記載的異雙功能交聯劑來制備。或者，抗體可改造成具有雙重Fc區，由此可具有增強的補體溶解和ADCC能力。參見Stevensonefa/.,J汕'-C朋cerZ)rMgZ)ew'g773:219-230(1989)。為了延長抗體的血清半衰期，可如例如美國專利No.5,739,277中記載的將補救受體結合表位摻入抗體(尤其是抗體片段)。在用于本文時，術語"補救受體結合表位"指IgG分子(例如IgG!、IgG2、IgG3或IgGj的Fc區中負責延長IgG分子體內血清半衰期的表位。免疫偶聯物本發明還涵蓋包含本文所述抗體且其偶聯至細胞毒劑的免疫偶聯物，所述細胞毒劑諸如化療劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶聯物)。多種放射性核素可用于生成放射偶聯抗體。例子包括但不限于例如^Bi、131I、131In、9GY和^Re。可用于生成此類免疫偶聯物的化療劑上文已有描述。例如，BCNU、鏈佐星(streptozoicin)、長春新石威、5-氟尿嘧咬、統稱為LL-E33288復合物的藥劑家族(美國專利5,053,394,5,770,710)、埃斯波霉素類(美國專利5,877,296)等(還可見本文中化療劑的定義)可以偶聯至本發明的抗體或其片段。為了選擇性破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。多種放射性同位素可用于生成放射偶聯的抗體或其片段。例子包括但不限于例如"'At、13'1、1251、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb、川In、Lu的放射性同位素等。在將偶聯物用于診斷時，它可包含放射性原子以用于閃爍照相研究，例如""tc或1231,或自旋標記物以用于核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像(MRI))，諸如喊-123、石典-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、4L、錳或鐵。可以以已知方式將放射性標記物或其它標記物摻入偶4關物。例如，肽可以生物合成，或者可以通過化學氨基酸合成法合成，其中使用牽涉例如以氟-19代替氫的合適氨基酸前體。可以經肽中的半胱氨酸殘基來附著標記物，諸如"、或1231、i"Re、^Re和1111！1。可以經賴氨酸殘基來附著釔-90。IODOGEN法(Frakerea/"所oc/zem.說c^/;^.Commw".80:49-57(1978))可用于才參入石典-123。參見例長口Chatal,Mo"oc/o"a/j""6c^/&s/mmM"osc/""grap/2乂CRCPress,1989,其詳細記載了其它方法。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合性活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(i^ewcfowo"ayaen^'mwa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、a-帚曲霉素(sarcin)、油一同(j/ew"tesybraf/Z)毒蛋白、香石沖個毒蛋白(dianthinprotein)、美洲商陸(尸/^to/acaawen'c朋a)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP陽S)、苦瓜Ofoworafccfc/7ara^/fl)才中制物、麻瘋初于毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制物、白樹毒蛋白(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局卩艮曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、豸斤霉素(neomycin)、依i若霉素(enomycin)和單端孢菌素(trichothecenes)。參見例如1993年10月28日公布的WO93/21232。可使用多種雙功能蛋白質偶聯劑來制備抗體和細胞毒劑的偶聯物，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP),琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨基曱基)環己烷-l-羧酸酯，亞氨基硫烷(IT)，亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二曱酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二酪)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯甲酰基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯曱酰基)-乙二胺)、二異硫氰酸酯(諸如曱苯2,6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可以如Vitettada/.,5Wwce238:1098(1987)中所記載的制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標記的l-異硫氰酸苯曱基-3-曱基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體偶聯的例示性螯合劑。參見WO94/11026。接頭可以是便于在細胞中釋放細胞毒性藥物的"可切割接頭"。例如，可使用酸不穩定接頭、肽酶敏感接頭、光不穩定接頭、二曱基接頭或含二硫化物接頭(Charidfl/"Owcwie化arc/z52:127-131(1992);姜國專利No.5,208,020)。或者，可通過例如重組技術或肽合成來生成包含抗VEGF和/或抗本發明蛋白質抗體和細胞毒劑的融合蛋白。DNA的長度可以包含各自編碼偶聯物兩部分的區域，或是彼此毗鄰或是由編碼接頭肽的區域分開，所述接頭肽不破壞偶聯物的期望特性。在某些實施方案中，將抗體與"受體，，(諸如鏈霉親合素)偶聯以用于腫瘤預先靶向，其中對患者施用抗體-受體偶聯物，接著使用清除劑由循環中清除未結合的偶聯物，然后施用與細胞毒劑(例如放射性核苷酸)偶聯的"配體，，(例如親合素)。在某些實施方案中，在抗體與具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA內切核酸酶諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)之間形成免疫偶聯物。美登素和美登木素生物堿類本發明提供了偶聯至一個或多個美登木素生物4^類分子的本發明抗體。美登木素生物堿類是通過抑制微管蛋白聚合來起作用的有絲分裂抑制劑。美登素最初從東非灌木齒葉美登木(Mqytem^"rrato)分離到(美國專利No.3,896,111)。隨后發現某些微生物也生成美登木素生物堿類，諸如美登醇和C-3美登醇S旨(美國專利No.4,151,042)。合成的美登醇及其衍生物和類似物才皮露于例如美國專利No.4,137,230;4,248,870;4,256,746;4,260,608;4,265,814;4,294,757;4,307,016;4，308，268;4，308，269;4,309,428;4,313,946;4,315,929;4,317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;及4,371,533。本發明的抗體可以偶聯至美登木素生物堿類分子且不顯著削弱抗體或美登木素生物堿類分子的生物學活性。每個抗體分子偶聯平均3-4個美登木素生物堿類分子在增強針對靶細胞的細胞毒性中顯示出功效，且對抗體的功能或溶解度沒有負面影響，盡管預計甚至一個分子的毒素/抗體也將較之棵抗體的使用增強細胞毒性。美登木素生物堿類在本領域是眾所周知的，而且可通過已知技術合成或從天然來源分離。例如美國專利No.5,208,020及上文提及的其它專利和非專利出版物中披露了合適的美登木素生物堿類。在一個實施方案中，美登木素生物堿類是美登醇和美登醇分子的芳香環或其它位置經過修飾的美登醇類似物，諸如各種美登醇酯。本領域知道許多連接基團可用于生成抗體-美登木素生物石威類偶聯物，包括例如美國專利No.5'208,020或歐洲專利0425235B1及Charie/。/.，Ca"cw六e化^r/z52:127-131(1992)中所披露的。連接基團包括二硫化物基團、硫醚基團、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團或酯酶不穩定基團，正如上述專利中所披露的，優選二硫化物和硫醚基團。可使用多種雙功能蛋白質偶聯劑來制備抗體與美登木素生物堿類的偶聯物，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡咬基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基—4-(N-馬來酰亞氨基曱基)環己烷-l-羧酸酯，亞氨基硫烷(IT)，亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二曱酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯曱酰基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲酰基)乙二胺)、二異氰酸酯(諸如曱苯2,6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(諸如l，5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。典型的偶聯劑包括N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡卩定基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson"a/.,所oc/^肌J173:723-737(1978))和N-琥珀酰亞氨基-4-(2-吡口定基硫代)戊酸酯(SPP),以提供二硫化物連接。根據連接的類型，可將接頭附著于美登木素生物堿類分子的多個位置。例如，可使用常規偶聯技術通過與羥基的反應來形成酯連接。反應可發生在具有輕基的C-3位置、用羥甲基修飾的C-14位置、用羥基修飾的C-15位置和具有羥基的C-20位置。在美登醇或美登醇類似物的C-3位置形成連接。加利車霉素另一種感興趣的免疫偶聯物包含與一個或多個加利車霉素分子偶聯的本發明抗體。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度產生雙鏈DNA斷裂。關于加利車霉素家族偶聯物的制備參見美國專利No.5,712,374;5,714,586;5,739,116;5,767,285;5,770,701;5,770,710;5,773,001;5,877,296(都屬于美國Cyanamid公司)。可使用的加利車霉素結構類似物包括但不限于y,1、0^、01、n-乙酰基-yi1、PSAG和e、(Hinman"a/.，C""cwi&yewr/253:3336-3342(1993);71Lode"a/.，Omceriesewc/z58:2925-2928(1998);及上述授予美國Cyanamid公司的美國專利)。可以與抗體偶聯的另一種抗腫瘤藥物是QFA，它是一種抗葉酸藥物。加利車霉素和QFA都具有胞內作用位點，且不易穿過質膜。因此，這些藥劑經由抗體介導的內在化的細胞攝取大大增強了它們的細胞毒性效果。其它抗體修飾本文還涵蓋抗體的其它修飾。例如，可將抗體與多種非蛋白質性質聚合物之一連接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物。還可將抗體包載入例如通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠嚢(例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微膠嚢)、膠狀藥物投遞系統(例如脂質體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米月交嚢)、或并且滴乳狀液。此類4支術4皮露于7e附Z"gto"k/TjamwcewWca/)SWe"ces,第16版，Osol,A.編,1980。脂質體和納米顆粒本發明的多肽可以配制成脂質體。例如，本發明的抗體可以配制成免疫脂質體。含有抗體的脂質體通過本領域已知方法來制備，諸如Epstein"a/.,Prac.jVo//.Jcad82:3688(1985);Hwang"a/"A^f/.爿cad5W.77:4030(1980);及美國專利No.4,485,045和4，544,545中所記載的。循環時間延長的脂質體披露于美國專利No.5,013,556。一般而言，脂質體的配制和使用是本領域技術人員所知道的。可以用包含磷脂酰膽石威、膽固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物通過反相蒸發法生成特別有用的脂質體。將脂質體擠過具有限定孔徑的濾器，以產生具有期望直徑的脂質體。可以如Martin&a/.,J歷o/.C/7em.257:286-288(1982)中所述，將本發明抗體的Fab，片段經二硫化物交換反應與脂質體偶聯。任選在脂質體中包含化療劑(諸如多柔比星)。參見Gabizon"a/.，/胸zo"a/Ca鮮r/組81(19):1484(1989)。其它用途本發明的抗體具有多種功用。例如，本發明的抗體可用于診斷測定法，例如用于檢測特定細胞、組織或血清中的蛋白質表達，用于癌癥檢測(例如在檢測抗性腫瘤中)等。在一個實施方案中，抗體用于選擇用本文提供的方法治療的患者群，例如用于檢測具有改變的Grl、嗜中性細胞彈性蛋白酶、MCP-l、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP表達的患者。可以使用本領域已知的多種診斷測定技術，諸如竟爭性結合測定法、直接或間接三明治測定法、和免疫沉淀測定法，以異相或同相進4亍(Zola，Afowoc/ow"/顛'yMfl畫/0/Tec/zm々腦，CRCPress,Inc.,1987，pp.147-158)。診斷測定法中所使用的抗體可以用可檢測模塊(moiety)標記。可檢測模塊應當能夠直接或間接產生可檢測信號。例如，可檢測模塊可以是放射性同位素，諸如3仏14C、32P、3、或1251;熒光或化學發光化合物，諸如異硫氰酸焚光素、羅丹明或營光素；或酶，諸如44性磷酸酶、(3-半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶。可以采用本領域知道的用于將抗體與可檢測模塊偶聯的任何方法，包括Hunter"a/.,淑,144:945(1962);Davida/"腸c/z麵勿13:1014(1974);Paina/.,/m扁"o/.Me仇40:219(1981);及Nygren,歷加c/zem.爿mfCyoc/ze肌30:407(1982)中所記載的那些方法。本發明的抗體還可用于從重組細胞培養物或天然來源親和純化本發明的蛋白質或蛋白質片段。在該過程中，使用本領域眾所周知的方法將針對蛋白質的抗體固定化在合適的支持物上，諸如Sephadex樹脂或濾紙。然后使固定化抗體接觸含有待純化蛋白質的樣品，此后用合適的溶劑清洗支持物，所述溶劑將會基本上清除樣品中除結合至固定化抗體的蛋白質以外的所有物質。最后，用另一種合適的溶劑清洗支持物，所述溶劑將會從抗體上釋放蛋白質。對本發明多肽的共價修飾本發明多肽(例如本發明的蛋白質、本發明蛋白質的抗體、多肽拮抗劑片段、融合分子(例如免疫融合分子)等)的共價修飾包括在本發明的范圍內。如果適用，它們可通過化學合成或者通過酶促或化學切割所述多肽來生成。多肽的其它類型共價修飾如下引入分子，即通過將多肽的目標氨基酸殘基與能夠與選定側鏈或N-或C-末端殘基反應的有機衍生化試劑起反應，或者通過將經修飾的氨基酸或非天然的氨基酸摻入正在增長的多肽鏈，例如Ellmana/.，她仇202:301-336(1991);Noren^a/"Scz.認e244:182(1989);及美國專利申請出版物20030108885和20030082575。半胱氨酰殘基最常見的是與a-卣代乙酸(鹽/酯)(和相應的胺)起反應，諸如氯乙酸或氯乙酰胺，以得到羧曱基或羧酰氨甲基(carboxyamidomethyl)衍生物。半胱氨酰殘基還可以通過與溴代三氟丙酮、a-溴代-l3-(5-imidozoyl)丙酸、氯乙酰基磷酸(鹽/酯)、N-烷基馬來酰亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、曱基2-吡。定基二硫化物、對氯汞苯曱酸(鹽/酯)、2-氯汞基-4-硝基酚或(4-)氯-7-賄基苯并-2-氧-l,3-二唑起反應而衍生化。組氨酰殘基通過與二乙基焦碳酸(鹽/酯)在pH5.5-7.0起反應而衍生化，因為此試劑相對特異于組氨酰側鏈。對溴苯曱酰曱基溴也是有用的；此反應通常在pH6.0的0.1M二曱胂酸鈉中進行。賴氨酰和氨基末端殘基與琥珀酸肝或其它羧酸酐起反應。用這些試劑的衍生化具有逆轉賴氨酰殘基電荷的效果。適于衍生化含a-氨基的殘基的其它試劑包括亞氨基酯，諸如皮考啉亞氨酸曱酯(methylpicolinimidate)、磷酸吡口多醛酯、吡,醛、氯硼氫化物、三硝基苯磺酸、鄰曱基異脲、2,4-戊二酮、和轉氨酶催化的與乙醛酸(glyoxylate)的反應。精氨酰殘基通過與一種或數種常規試劑起反應來修飾，其中有苯曱酰曱醛(phenylglyoxal)、2，3-丁二酮、1，2-環己二酮和茚三酮。精氨酸殘基的衍生化由于胍官能基的高pKa所以需要在堿性條件下進行反應。此外，這些試劑可以與賴氨酸的基團以及精氨酸s-氨基起反應。酪氨酰殘基可以進行特異性修飾，對在酪氨酰殘基中引入光譜標記物特別感興趣，其通過與芳香族重氮化合物或四硝基曱烷起反應。最常見的是，使用N-乙酰基咪唑和四硝基曱烷分別形成鄰乙酰基酪氨酰種類和3-硝基衍生物。用1251或1311碘化酪氨酰殘基以制備帶標記物的蛋白質以用于放射免疫測定法。羧基側基團(天冬氨酰或谷氨酰)通過與碳二亞胺(R-NON-R，)起反應而進行選擇性修飾，碳二亞胺中的R和R，是不同的烴基，諸如l-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮陽離子-4,4-二曱基戊基)碳二亞胺。此外，通過與銨離子起反應將天冬氨酰和谷氨酰殘基轉變成天冬酰胺酰和谷酰胺酰殘基。谷酰胺酰和天冬酰胺酰殘基常常脫酰胺，分別成為相應的谷氨酰和天冬氨酰殘基。這些殘基在中性或堿性條件下脫酰胺。這些殘基的脫酰胺形式落入本發明的范圍。其它修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨酰或蘇氨酰殘基羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈a-氨基的曱基化(T.E.Creighton，Prato'ra.'iSYracweMo/ecw/ar/Vope"/es,W.H.Freeman&Co"SanFrancisco,pp.79-86(1983)),N-末端胺的乙酰化，及任何C-末端羧基的酰胺化。另一類共價修飾牽涉向本發明的多肽化學或酶促偶聯糖苷。這些規程的優點在于它們不需要在具有N-或O-連接糖基化的糖基化能力的宿主細胞中生成多肽根據所使用的偶聯模式，可以將糖附著于(a)精氨酸和組氨酸，(b)游離羧基，(c)游離巰基，諸如半胱氨酸的游離巰基，(d)游離羥基，諸如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的游離羥基，(e)芳香族殘基，諸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。這些方法記載于1987年9月11日公布的WO87/0533O和AplinandWriston，C7CCW,iev,所0c/2e肌pp.259-306(1981)。本發明多肽上存在的任何碳水化合物模塊的消除可通過化學或酶促方法實現。化學的脫糖基化作用需要將多肽暴露于化合物三氟曱磺酸或等效化合物。此處理導致除連接糖(linkingsugar)(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部糖得到切除，而多肽保持完整。化學的脫糖基化作用記載于Hakimuddina/.,J/r/i^/oc/zew.5/o//z>w.259:52(1987)牙口Edgeda/"所0c/2e肌118:131(1981)。碳水化合物模塊(例如抗體上的)的酶促切割可通過使用多種內切和外切;瞎苷酶來實現，記載于Thotakura"a/.，Me仇￡"，0/.138:350(1987)。本發明多肽的另一類共價修飾包括將多肽連接至多種非蛋白質性質聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，以美國專利No.4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4，791,192或4,179,337所列方式。載體、宿主細胞和重組方法
技術領域：
：本發明的多肽可以使用易于獲得的技術和材料而重組生產。為了重組生產本發明的多肽，例如本發明的蛋白質，本發明蛋白質的抗體，例如抗VEGF抗體，分離編碼它的核酸，并插入可復制載體，用于進一步克隆(DNA擴增)或表達。編碼本發明多肽的DNA易于使用常規規程分離和測序。例如，對編碼單克隆抗體的DNA分離和測序，例如通過使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷S殳探針。可以獲得許多載體。載體構件通常包括但不限于下列一種或多種信號序列、復制起點、一種或多種標志基因、增強子元件、啟動子和轉錄終止序列。信號序列構件本發明的多肽不僅可以直接重組生產，而且可以作為與異源多肽的融合多肽，所述異源多肽典型的是成熟蛋白質或多肽的N-末端處的信號序列或具有特異性切割位點的其它多肽。所選擇的異源信號序列典型的是受到宿主細胞識別并加工(即受到信號肽酶切割)的。對于不識別和加工天然多肽信號序列的原核宿主細胞，所述信號序列用例如選自下組的原核信號序列替代堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp或熱穩定腸毒素II前導序列。為了酵母分泌，天然信號序列可以用例如酵母轉化酶前導序列、a因子前導序列(包括糖酵母屬和克魯維氏酵母屬a因子前導序列)、酸性磷酸酶前導序列、白色假絲酵母葡萄糖淀粉酶前導序列、或WO90/13646中記載的信號替代。在哺乳動物細胞表達中，可以利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列，例如單純皰疹gD信號。將此類前體區(precursorregion)的DNA以符合讀碼框的方式與編碼本發明多肽的DNA連接。復制起點構件表達和克隆載體都包含能夠使載體在一種或多種所選擇的宿主細胞中復制的核酸序列。通常，在克隆載體中，這種序列是能夠使載體不依賴于宿主染色體DNA而復制的序列，包括復制起點或自主復制序列。眾所周知多種細菌、酵母和病毒的此類序列。來自質粒pBR322的復制起點適合于大多數革蘭氏陰性細菌，2|1質粒起點適合于酵母，而各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳動物細胞中的克隆載體。一4殳而言，哺乳動物表達載體不需要復制起點構件(SV40起點的使用通常可能只是因為它包含早期啟動子)。選擇基因構件表達和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標志。典型的選擇基因編碼如下蛋白質(a)賦予對抗生素或其它毒素的抗性，例如氨千青霉素、新霉素、曱氨蝶呤或四環素；(b)補足營養缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由復合培養基獲得的必需營養物，例如用于芽孢桿菌的編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。選擇方案的一個例子利用藥物來阻滯宿主細胞的生長。用異源基因成功轉化的那些細胞生成賦予藥物抗性的蛋白質，因而幸免于選4奪方案。此類顯性選擇的例子使用藥物新霉素、霉酚酸和潮霉素。適于哺乳動物細胞的選擇標志的另一個例子是那些能夠鑒定有能力攝取抗體核酸的細胞的選擇標志，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和-II(典型的是靈長類金屬硫蛋白基因)、腺普脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。例如，首先通過將所有轉化子在含有曱氨蝶呤(Mtx)(DHFR的一種竟爭性拮抗劑)的培養基中進行培養來鑒定經DHFR選擇基因轉化的細胞。在采用野生型DHFR時，適宜的宿主細胞是DHFR活性缺陷的中國倉鼠卯巢(CHO)細胞系。或者，可以通過細胞在含有針對選擇標志的選擇劑(諸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418)的培養基中的生長來選擇經編碼本發明多肽、野生型DHFR蛋白質和另一種選擇標志(諸如氨基糖苷3'-磷酸轉移酶(APH))的DNA序列轉化或共轉化的宿主細胞(特別是包含內源DHFR的野生型宿主)。參閱美國專利No.4,965,199。適用于酵母的選擇基因是存在于酵母質粒Yrp7中的fr;^基因(Stinchcomba/.，Atoww282:39(1979))。^7基因為缺乏在色氨酸中生長能力的酵母突變抹(例如ATCCNo.44076或PEP4-1)提供了選擇標志。Jones,Ge""/w85:12(1977)。酵母宿主細胞基因組中存在^;7損傷隨之提供了用于通過在缺乏色氨酸時的生長來檢測轉化的有效環境。類似的，用攜帶丄^2基因的已知質粒補足丄ew2缺陷型酵母菌一朱(ATCC20，622或38,626)。此外，衍生自1.6nm環狀質粒pKDl的載體可用于轉化克魯維氏酵母屬酵母。或者，報導了用于在乳酸克魯維氏酵母中大規模生產重組小牛凝乳酶的表達系統。VandenBerg,歷a/rec/7"0/0w8:135(1990)。還披露了用于由克魯維氏酵母屬的工業用菌抹分泌成熟重組人血清清蛋白的穩定多拷貝表達載體。Fleer"a/"5/。/Tec/wo/柳9:968-975(1991)。啟動子構件表達和克隆載體通常包含受到宿主生物體識別的啟動子，而且它與編碼本發明多肽的核酸可揭:作連接。適用于原核宿主的啟動子包括p/ia4啟動子、(3-內酰胺酶和乳糖啟動子系統、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統、和雜合啟動子(諸如tac啟動子)。然而，其它已知的細菌啟動子也是合適的。用于細菌系統的啟動子還將包含與編碼本發明多肽的DNA可操作連接的Shine-Dalgamo(S.D.)序列。已知真核細胞的啟動子序列。事實上，所有真核基因都具有富含AT區，它位于起始轉錄的位點上游大約25至30個堿基處。在許多基因的轉錄起點上游70至80個堿基處找到的另一種序列是CNCAAT區，其中N可以是任何核苷酸。在大多數真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3'端添力。polyA尾的信號。所有這些序列合適的插入真核表達載體。適用于酵母宿主的啟動序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子，諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶和葡糖激酶。作為具有通過生長條件控制轉錄的額外優點的誘導型啟動子的其它酵母啟動子是醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、及負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區。適用于酵母表達的載體和啟動子進一步記載于EP73,657。酵母增強子也可以有利的與酵母啟動子一起使用。在哺乳動物宿主細胞中由載體轉錄本發明多肽受到例如從病毒(諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、乙肝病毒和典型的猿猴病毒40(SV40))基因組、異源哺乳動物啟動子(例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)、及熱4木克啟動子獲得的啟動子的控制，倘若此類啟動子與宿主細胞系統相容的話。方便的以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動子，該片段還包含SV40病毒復制起點。方便的以HindIIIE限制性片段的形式獲得人巨細胞病毒的立即早期啟動子。美國專利No.4,419，446中披露了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表達DNA的系統。美國專利No.4,601,978中記載了該系統的一種改良。關于在小鼠細胞中在來自單純皰滲病毒的胸苷激酶啟動子的控制下表達人(3-干擾素cDNA還可參見Reyes"A^wre297:598-601(1982)。或者，可以使用勞氏肉瘤病毒長末端重復序列作為啟動子。增強子元件構件常常通過將增強子序列插入載體來提高高等真核細胞對編碼本發明多肽的DNA的轉錄。現在知道來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、曱胎蛋白和胰島素)的許多增強子序列。典型的是，使用來自真核細胞病毒的增強子。例子包括SV40復制起點晚期一側的增強子(bp100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒復制起點晚期一側的增強子、和胨^病毒增強子。關于激活真核啟動子的增強元件還可參見Yaniv，7Va/we297:17-18(1982)。可以將增強子剪接入載體，位于多肽編碼序列的5'或3'位置，但是典型的位于啟動子的5'位點。轉錄終止構件用于真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物體的有核細胞)的表達載體還將包含終止轉錄和穩定mRNA所必需的序列。此類序列通常可以從真核或病毒DNA或cDNA非翻譯區的5'端和偶爾的3'端獲得。這些區域包含在編碼本發明多肽的mRNA的非翻i奪部分中轉錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區段。一種有用的轉錄終止構件是牛生長激素聚腺苷酸化區。參見WO94/11026及其中披露的表達載體。宿主細胞的選4奪和轉化適于克隆或表達本文載體中的編碼本發明多肽的DNA的宿主細胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核細胞。適于此目的的原核生物包括真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科，諸如埃希氏菌屬(&cfehc/n'a)例如大腸埃希氏菌或大腸桿菌(Eco")、腸桿菌屬C&7fera6acfe。、歐文氏菌屬(五nv/w'a)、克雷伯氏菌屬(^:/e^/e〃a)、變形菌屬CPra&w》、沙門氏菌屬(;S"a/wcwe〃a)1"列^口鼠4方寒沙、門氏菌(6"a/mo"e〃a(y尸/n'wwn'"附)、沙、雷氏菌屬(5ferra/7'a)例^口粘質沙雷氏菌(iSferra^2jW3rc^scam1)、志賀氏菌屬(i57w'ge〃(3)、以及芽孢桿菌屬(Sa"7/0諸如枯草芽孢桿菌(及^&///力和地衣芽孢桿菌(及//c/^w/or做'力(例如1989年4月12日公布的DD266,710中披露的地衣芽孢桿菌41P)、假單胞菌屬(尸"^fomo"oy)諸如銅綠假單胞菌CPaerwg/"osa)、和鏈霉菌屬(S/re;to/^caO。典型的是，大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31，446)，盡管其它菌抹諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC31,S:3"和大腸桿菌W3110(ATCC27,325)也是合適的。這些例子是例示性的，而不是限制性的。在原核生物以外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)也是編碼本發明多肽的載體的合適克隆或表達宿主。釀酒糖酵母(Sacc/zaramycescerev^ae)或常用的面包酵母在最常用的低等真核宿主微生物之中。然而，通常可獲得許多其它屬、種和菌抹且可用于本發明，諸如粟酒裂殖糖酵母克魯纟隹酵母屬(A7wyverawyce"宿主，諸^口例3口乳酸克魯維酵母(K/acfc)、脆壁克魯維酵母(尺.#^//&)(^10:l2，424)、保加利亞克魯維酵母(K6w/gan'cw)(ATCC16,045)、威克克魯維酵母(Kw/cferaw7)(ATCC24,178)、AT.wa/"7(ATCC56,500)、果蠅克魯維酵母(Kdrawp/n7aram)(ATCC36,906)、耐熱克魯維酵母(KAermoto/erara)和馬克思克魯維酵母(K.mwx/am^);亞羅酵母屬(JamWa)(EP402,226);巴斯德畢赤酵母(尸Zc/n'a/xwton、)(EP183,070);假絲酵母屬(CW"W&);瑞氏木霉(7>/c/7c^ferma(EP244,234);斗24造月永孑包菌(A^w/w;oracra^a);i午旺酵母屬(6b/zHW7w'cw;)^力，諸如5"c/7vra朋/cwycay禾口絲狀真菌，諸^口仿B口月永孑包菌屬(vVeMros;ora)、青霉屬(尸em'cz'〃/ww)、彎頸霉屬(7b/j^oc/a(iz'i/m)、和曲霉屬(y^^rgz7/w)宿主諸如構巢曲霉(Am^w/am)和黑曲霉G4.m'取r)。適于表達糖基化本發明多肽的宿主細胞衍生自多細胞生物體。無脊推動物細胞的例子包括植物和昆蟲細胞。已經鑒定了許多桿狀病毒抹和變體及相應的允許昆蟲宿主細胞，它們來自諸如草地夜蛾GS^^o//era/ri^i^m^)(毛蟲)、》矣及4尹蟲丈"ec/es"egv/7")(蟲文子)、白纟丈j尹蟲丈"^/esa/6op/"w力(蟲丈子)、,J復果蟲龜(IV(W(9//n7ame/a"ogoster)(果蟲U禾口家蠶(5om6jxwon〕等宿主。眾可獲得多種病毒抹用于轉染，例如苜蓿尺蠖力Wogra;^aca^/brm'caNPV的L-l變體和家蠶5omxmoWNPV的Bm-5抹，而且此類病毒可依照本發明用作本文中的病毒，特別是用于轉染草地夜蛾細胞。還可利用棉、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄和煙草的植物細胞培養物作為宿主。然而，脊推動物細胞得到最多關注，而且培養(組織培養)中脊推動物細胞的繁殖已經成為常規流程。有用哺乳動物宿主細胞系的例子是用SV40轉化的猴腎CVl系(COS-7,ATCCCRL1651);人胚腎系(293或為了在懸浮培養中生長而亞克隆的293細胞，GrahamGe"腸/.36:59(1977));幼倉鼠腎細胞(BHK,ATCCCCL10);中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO,UrlaubWa/"尸rac.Ato/.^cad6W.L/iX477:4216(1980));小鼠塞托利(sertoli)細胞(TM4，Mather,所o/.i甲rad23:243-251(1980》；猴腎細胞(CVl,ATCCCCL70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCCCRL-1587);人宮頸癌細胞(HELA，ATCCCCL2);犬腎細胞(MDCK,ATCCCCL34);牛鼠(buffalorat)肝細胞(BRL3A，ATCCCRL1442);人肺細胞(W138,ATCCCCL75);人肝細胞(HepG2,HB8065);小鼠乳瘤(MMT060562，ATCCCCL51);TRI細胞(Mather"a/.,^f""a^80WUcac/.5W,383:44-68(1982);MRC5細胞；FS4細胞；和人肝瘤系(HepG2)。用上文所述用于生產本發明多肽的表達或克隆載體轉化宿主細胞，并在為了誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼期望序列的基因而適當更改的常類L營養培養基中進行培養。培養宿主細胞可以在多種培養基中培養用于生產本發明多肽的宿主細胞。商品化培養基諸如Ham氏FlO(Sigma)、極限必需培養基(MEM,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培養基(DMEM,Sigma)適于培養宿主細胞。另外，可以使用下列文獻中記載的任何培養基作為宿主細胞的培養基Ham"a/.,TWeA.58:44(1979);Barnesda/"Jwa/.5z.oc/zem.102:255(1980);美國專利No.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5，122,469;WO卯/03430;WO87/00195;或美國專利Re.30,985。任何這些培養基可以根據需要補充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以以適宜濃度包含本領域技術人員知道的任何其它必需補充物。培養條件(諸如溫度、pH等)就是先前為表達而選擇用于宿主細胞的，這對于普通技術人員而言是顯而易見的。多肽純化本發明的多肽或蛋白質可以從受試者中回收。在使用重組技術時，可以在細胞內、在周質空間中生成本發明的多肽，或者直接分泌入培養基。可以從培養物的培養液或者從宿主細胞溶胞液回收本發明的多肽。如果是膜結合的，那么可以用合適的去污劑溶液(例如Triton-X100)或通過酶促切割從膜碎，諸如凍融循環、超聲處理、機械破碎或細胞裂解劑。以下規程是合適的蛋白質純化規程的例子通過離子交換柱上的分級；乙醇沉淀；反相HPLC;硅土上的層析，肝素SEPHAROSETM上的層析，陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱、DEAE等)上的層析；層析聚焦；SDS-PAGE;硫酸銨沉淀；利用例如S印hadexG-75的凝膠過濾；用蛋白ASepharose柱去除雜質諸如IgG;及用金屬螯合柱結合帶表位標簽形式的本發明多肽。可以采用多種蛋白質純化方法，此類方法是本領域已知的，而且記載于1"列3口Deutscher，AfeAcxiy/"jE>2^ymo/ogy,182(1990);Scopes,/Vo&z'"尸Mri/C(3打'cw../V/"")/^尸A3c,/ce,Springer-Verlag，NewYbrk(1982)。戶斤選捧的純化步驟取決于例如所用純化方法的本質和所生成的具體本發明多肽。例如，可以使用例如羥磷灰石層析、凝月交電泳、透4斤和親和層析來純4匕由細胞制備的抗體組合物，典型的純化技術是親和層析。蛋白A作為親和配體的適宜性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc區的種類和同種型。蛋白A可用于純4b基于人yl、Y2或Y4重《連的4元體(Lindmark"a/.,J/mww"o/.62:1-13(1983))。蛋白G推薦用于所有小鼠同種型和人y3(Guss"a/.，五7^S(9乂5:1567-1575(1986))。親和配體所附著的基質最常用的是瓊脂糖，但是可以使用其它基質。物理穩定的基質(諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯)容許獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時間。若抗體包含Ch3結構域，則可使用BakerbondABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg,NJ)進行純化。根據待回收的抗體，也可使用其它蛋白質純化技術，例如上文所述的。還可參見Carter"a/.,A'o/rec/ww/o^10:163-167(1992),其記載了用于分離分泌到大腸桿菌周質空間的抗體的規程。藥用配制劑通過將具有期望純度的分子(例如多肽)與任選的藥學可接受載體、賦形劑或穩定劑(《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第16片反，Osol,A.編，1980)混合來制備本文所述和依照本發明使用的本發明藥劑(VEGF拮抗劑、髓樣細胞減少劑、URCGP拮抗劑、URRTP拮抗劑、DRCGP激動劑、DRRTP激動劑、或抗癌劑)及其組合的治療用配制劑，以凍干劑型或水溶液的形式貯存。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在所采用的劑量和濃度對接受者是無毒的，而且包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二曱基千基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯曱酸烷基酯，諸如對羥基苯曱酸曱酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它82碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；金屬復合物(例如Zn-蛋白質復合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。活性成分還可包載入例如通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠嚢(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微膠嚢)、膠狀藥物投遞系統(例如脂質體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米月交嚢)、或粗滴乳狀液。此類技術4皮露于例如《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第16版，Osol,A.編，1980。用于體內施用的配制劑必須是無菌的。這可容易的通過使用無菌濾膜過濾來實現。可制備持續釋放制劑。持續釋放制劑的合適例子包括含有本發明多肽的固體疏水性聚合物半透性基質，該基質以定型產品的形式存在，例如薄膜或微膠嚢。持續釋放基質的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利No.3,773,919)、L-谷氨酸和y-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構成的可注射微球體)及聚-D-(-)-3-鞋基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能夠釋放分子100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質的時間較短。當膠囊化抗體在體內長時間維持時，它們可能由于暴露于37。C的潮濕環境而變性或聚集，導致生物學活性損失和免疫原性可能改變。可^^艮據相關機制來設計合理的穩定化策略。例如，如果發現聚集機制是經由硫醇-二硫化物互換而形成分子間S-S^t，那么可通過#"飾巰基、由酸性:容液凍干、控制濕度、采用適宜添加劑和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定化。還可參見例如美國專利No.6,699,501,其記載了具有聚電解質覆蓋物的膠嚢。還涵蓋可以通過基因療法將本發明的藥劑(例如VEGF拮抗劑、髓樣細胞減少劑、化療劑或抗癌劑)導入受試者。基因療法指通過給受試者施用核酸進行的療法。在基因療法的應用中，為了實現治療上有效的基因產物的體內合成，例如為了替換缺陷基因，將基因引入細胞。"基因療法"包括通過單次處理實現持久效果的傳統基因療法及牽涉一次或重復施用治療上有效的DNA或mRNA的基因治療劑施用二者。反義RNA和DNA可作為治療劑用于阻斷某些基因的體內表達。早已顯示可以將短反義寡核苷酸輸入細胞，在那里它們起抑制劑的作用，盡管由于細胞膜對它們的攝取受限制因而它們的胞內濃度低(Zamecnikefa/.，7Vaf/.Jcad"6^83:4143-4146(1986》。可以修飾寡核苷酸以增強它們的攝取，例如通過用不帶電荷的基團取代它們帶負電荷的磷酸二酯基團。關于基因療法的方法的一般性綜述參閱例如Goldspiela/.,C//"/ca/P/zarmacy12:488-505(1993);WuandWu,^/c^/zenapy3:87-95(1991);Tolstoshev,」朋.iev.尸/w/tw"co/.7fea.co/.32:573-596(1993);Mulligan,5Wewce260:926-932(1993);MorganandAnderson,Jw.A.oc/zem.62:191-217(1993);及May,7YB7EC^11:155-215(1993)。重組DNA
技術領域：
普遍知道的、可以使用的方法記載于Ausubel等人編(1993)Cwwe"/1/Votoco/sz>Mo/ecw/arjBz'o/ogy,JohnWiley&Sons,NY牙口Kriegler(1990)7>朋*/-awe/Er/7/ms7'o"，^Z^orato/^M3"wfl7,StocktonPress,NY。有多種技術可用于將核酸引入活細胞。所述技術可才艮據核酸是在體外轉移入培養的細胞還是在體內轉移入預期宿主的細胞而變化。適于在體外將核酸轉移入哺乳動物細胞的技術包括使用脂質體、電穿孔、顯^鼓注射、細胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸鈣沉淀法等。當前優選的體內基因轉移技術包括用病毒(典型的是逆轉錄病毒)載體進行的轉染和病毒外殼蛋白-脂質體介導的轉染(Dzau7>e"*z>腺ec/z"o/，11:205-210(1993》。例如，體內核酸轉移技術包括用病毒載體(諸如腺病毒、I型單純皰疹病毒、慢病毒、逆轉錄病毒或腺伴隨病毒)和基于脂質的系統(可用于脂質介導的基因轉移的脂類有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)進行的轉染。在基因療法中使用病毒載體的例子可參閱Clowese/a/.，JC7/"./"ve"93:644-651(1994》Kiemda/,，B/ood83:1467-1473(1994);SalmonsandGunzberg，//w廳"Ge"e777erap_y4:129-141(1993);GrossmanandWilson,Q/r.QpZ".z>Gew幼'cs朋(iZ)eve/.3:110-114(1993);Bout"a/.，//wmw7T7era;^5:3-10(1994);RosenfeldW5We"ce252:431-434(1991);Rosenfelda/.，Ce〃68:143-155(1992);Mastrangeli"a/,，乂/m^W.91:225-234(1993);及Walshda/.,尸roc.5bc.Exp.S/o/.Med204:289-300(1993)。在有些情況中希望與靶向靶細胞的藥劑(諸如對細胞表面膜蛋白或靶細胞特異性的抗體、針對靶細胞上受體的配體等)一起提供核酸來源。若采用脂質體，則可以使用與胞吞作用有關的細胞表面膜蛋白結合的蛋白質靶向和/或促進攝取，例如對特定細胞類型有向性的衣殼蛋白或其片段、針對在循環中經歷內在化的蛋白質的抗體、靶向胞內定位并延長胞內半衰期的蛋白質。受體介導的胞吞作用的技術記載于例如Wuda/.,J歷o/.Cfem.262:4429-4432(1987)和Wagnerda/.,尸rac.A^/.^cad5W."&487:3410-3414(1990)。關于基因標記和基因療法方案的綜述參閱Andersond5Wewce256:808-813(1992)。劑量和施用依照已知方法將本發明的藥劑(VEGF拮抗劑、髓4羊細胞減少劑、化療劑或抗癌劑)施用于人類患者，諸如靜脈內施用(像推注或持續一段時間的連續輸注)、肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口服、表面、或吸入路徑，和/或皮下施用。在某些實施方案中，本發明的治療牽涉組合施用VEGF拮抗劑和一種或多種髓樣細胞減少劑或化療劑。在一個實施方案中，存在別的抗癌劑，例如一種或多種不同的抗血管發生劑、一種或多種化療劑等。本發明還涵蓋施用多種抑制劑，例如針對同一抗原的多種抗體或針對本發明不同蛋白質的多種抗體。在一個實施方案中，與VEGF拮抗劑和/或一種或多種髓樣細胞減少劑一起施用不同化療劑的混合物。組合施用包括使用分開的配制劑或單一藥物配制劑的共施用，和/或任一次序的順次施用。例如，VEGF拮抗劑可以在施用髓樣細胞減少劑或化療劑之前、之后、交替，或者可以同時給予。在一個實施方案中，有一段時間所有(兩種或更多)活性劑同時發揮其生物學活性。對于疾病的預防或治療，本發明藥劑的適宜劑量取決于上文定義的待治療疾病的類型、疾病的嚴重程度和病程、施用抑制劑是用于預防還是治療目的、先前的療法、患者的臨床史和對抑制劑的響應、及主治醫師的判斷。將抑制劑一次性或者在一系列治療中適當的施用于患者。在組合治療方案中，本發明的組合物以治療有效量或治療協同量施用。在用于本文時，治療有效量指導致所針對疾病或疾患得到減輕或抑制的本發明組合物的施用量和/或VEGF拮抗劑和一種或多種其它治療劑的共施用量。藥劑組合的施用效果可以是疊加的。在一個實施方案中，施用的效果是協同效應。治療協同量指協同的或顯著的減輕或消除與特定疾病有關的狀況或癥狀所必需的VEGF拮抗劑和一種或多種其它治療劑(例如髓樣細胞減少劑、化療劑或抗癌劑)的量。根據疾病的類型和嚴重程度，大約lpg/kg到50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)VEGF拮抗劑或髓樣細胞減少劑、化療劑、或抗癌劑是施用于患者的初始候選劑量，無論是例如通過一次或多次分開施用，或者是通過連續輸注。典型每曰劑量的范圍可以為大約l(ig/kg到大約100mg/kg或者更多，取決于上述因素。對于持續數天或更長時間的重復給藥，根據疾患，治療維持到直至發生期望的疾病癥狀抑制。然而，其它劑量方案可能也是有用的。典型的是，臨床醫師將會施用本發明的分子，直至劑量達到提供所需生物學效應。可以通過常規技術和測定法來容易的監測本發明療法的進展。例如，血管發生抑制劑(例如抗VEGF抗體，諸如AVASTIN⑧(Genentech))的制備和劑量給藥方案可以依照制造商的說明書使用，或者由熟練從業人員憑經驗確定。在另一個例子中，此類化療劑的制備和劑量給藥方案可以依照制造商的說明書使用，或者由熟練從業人員憑經驗確定。化療的準備和劑量纟合藥方案還記載于C/2ewof/zera;^Serv/ceM.C.Perry,Williams&Wilkins,Baltimore,MD(1992)。治療功效本發明治療的功效可以通過評估贅生性或非贅生性病癥中常用的多種終點來測量。例如，癌癥治療可以通過例如但不限于腫瘤消退、腫瘤重量或大小收縮、距進展的時間、存活持續時間、無進展存活、整體響應率、響應持續時間、生活質量、蛋白質表達和/或活性來評估。因為本文所述抗血管發生劑靶向肺瘤血管結構而不必是贅生性細胞本身，所以它們代表了一類獨特的抗癌藥，并因此可以要求獨特的對藥物的臨床應答的測量和定義。例如，二維分析中大于50%的腫瘤收縮是宣告響應的標準截留。然而，本發明的抑制劑可以引起對轉移性擴散的抑制而沒有原發瘤的收縮，或者可以僅僅發揮抑制腫瘤效果。因而，可采用測定治療功效的方法，包括例如測量血管發生的血漿或尿液標志物和通過放射學成像測量響應。制品在本發明的另一個實施方案中，提供了包含可用于治療或診斷上文所述病癥的物質的制品。所述制品包括容器、標簽和包裝插頁。合適的容器包括例如藥瓶、藥管、注射器等。所述容器可以用多種材料制成，諸如玻璃或塑86料。在一個實施方案中，所述容器裝有有效治療所述疾患的組合物，可以具有無菌存取口(例如所述容器可以是帶有皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或藥瓶)。所述組合物中的至少一種活性藥劑是VEGF調控劑，且至少一種第二活性劑是髓樣細胞減少劑和/或化療劑。容器上或與容器有關的標簽指明該組合物用于治療所選擇的疾患。所述制品可進一步包括第二容器，其中裝有藥學可接受的緩沖液，諸如磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。在另一個實施方案中，所述容器裝有作為檢測抗性肺瘤的診斷劑的標志物集合。所述組合物中的至少一種藥劑是用于檢測Grl、嗜中性細胞彈性蛋白酶、CD19、CD90、CDllc、URCGP、URRTP、DRCGP和/或DRRTP的標志物。容器上或與容器有關的標簽指明該組合物用于診斷對VEGF拮抗劑治療有抗性的腫瘤。本發明的制品可進一步包括從商業和用戶立場出發需要的其它物質，包括別的活性劑、其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。實施例應當理解，在此描述的實施例和實施方案僅用于例示目的，根據這些將為本領域技術人員提供各種修改或變化，它們包括在本申請的精神和范圍、以及所附權利要求的范圍內。實施例l:通過CDllb+Grl+髓樣細胞賦予的針對抗VEGF治療的胂瘤抗性調查了導致實驗性腫瘤針對抗血管內皮生長因子(VEGF)治療的抗性的細胞和分子事件。發現了在骨髓衍生細胞的募集和針對抗VEGF治療的腫瘤抗性的發生之間的相關性。肺瘤混合實驗證明了從攜帶抗VEGF抗性(但不是抗VEGF敏感性)腫瘤的小鼠的骨髓或腫瘤分離的CD11b+Gr1+細胞足以賦予針對抗VEGF治療的抗性。在體外，來自抗VEGF抗性(但不是抗VEGF敏感性胂瘤)的條件化培養基刺激了CDllb+Grl+細胞的遷移。CDllb+Grl+細胞向原發性腫瘤的募集代表了介導針對抗VEGF治療的抗性的細胞機制。肺瘤致敏的CDllb+Grl+細胞的基因表達分析鑒定了由抗性腫瘤調節的獨特基因集合。CDllb+Grl+髓樣細胞的動員和活化可能代表了針對抗VEGF治療的抗性的發生中的兩個步驟。抗VEGF和靶向髓樣細胞的化合物的組合治療進一步抑制了腫瘤血管法生和生長，并延遲了抗VEGF抗性的發作，證明組合把向髓樣細胞和VEGF的化合物有治療效益。方法勿^屑。EL4、LLC、B16F1和TIB6(J558)腫瘤細胞系得自美國典型培養物保藏所(ATCC),并在補充有10%胎兒牛血清(FBS)和2mM谷氨酰胺的高葡萄糖Dulbecco氏改良的培養基(DMEM)中在組織培養中維持。術語"B16F1"和"B16"在此可互換使用，指相同的黑素瘤細胞系。^t體。抗VEGF(諸如G6-23)是結合并中和鼠型和人型VEGF的抗體。衍生自噬菌體展示技術，IgG部分包含鼠同種型IgG2a(參見例如Malik,A.K.ao/.RedundantrolesofVEGF-BandPIGFduringselectiveVEGF-Ablockadeinmice.腸od107:550-7(2006)),除非另有說明，以10mg/kg的劑量每周兩次IP給藥。同種型匹配的對照抗體是抗人類豚草-IgG2a(Genentech，Inc.)。抗CDllb+抗體(eBioSciences)、抗L畫選擇素(BDBiosciences)和抗CXCR4(TorreyPinesLab)被用于FACS實驗中。抗GrlMAb(eBioSciences,CA或BDBiosciences,CA)以10mg/kg每周兩次IP施用。彈性蛋白酶抑制劑(lmg/小鼠；eBiosciences,SanDiego，CA)在植入5x1()6個EL4或LLC細胞之后一天開始向C57Bl/6小鼠(n=5)每天IP施用。兩次/周進行腫瘤測量，測量末期腫瘤重量，如上所述。GF/V方合V、武凝型。年齡6-8周的C57BL/6和增強型綠色熒光蛋白(EGFP)轉基因小鼠(C57BL/6-TgN;ACTbEGFP;lOsb;JAXstock#—003291)分別4尋自CharlesRiverLaboratories禾口JacksonLaboratories。EGFP由卩-肌動蛋白啟動子控制，其在EGFP轉基因小鼠中的所有細胞中是豐富的(參見4列^口Okabe，M.，Ikawa，M.,Kominami,K.，Nakanishi,T.&Nishimune,Y.'Greenmic6'asasourc6ofubiquitousgreencells.F朋S丄幼407:313-9(1997))。通過致死照射(11Gy,Cs-輻射體)C57BL/6小鼠以消融內源骨髓、接著用分離自EGFP轉基因小鼠的5x1()6個BMMNC拯救，來產生C57BL/6GFP嵌合小鼠。如早先所述制備BMMNC(參見Gerber,H.P."a/.VEGFregulateshaematopoieticstemcellsurvivalbyaninternalautocrineloopmechanism.A^e417:954-8.(2002))。嵌合小鼠中的所有腫瘤異種移植物實驗在造血重建之后至少4周進行。對于腫瘤生長實驗，將5x1(^個鼠EL4或LLC腫瘤細胞皮下注射在背部區域。對于在XID小鼠中的實驗，植入lx10"個LLC或EL4肺瘤細月包。5WF/;遂合豸-發。在米色棵XID(HarlanSpragueDawley)或C57BL/6小鼠(JacksonLab,BarHarbor)或者GFP骨髓嵌合小鼠中進行腫瘤生長研究。將5x106個或107個肺瘤細胞(如標明的)重懸浮于200julMatriGel(生長因子減低的；BDBiosciences,CA),并皮下注射在小鼠的背部側翼區域。對于骨髓混合實驗，將106個分離自骨髓的BMMNC或CDllb+Grl+與2.5xio6個B16F1纟田月包在200|a1matrigel(BDBiosciences)中混合，并立即植入C57BL/6小鼠的側部。對于腫瘤0+/001化+01"1+混合實驗，將2x106個B16F1細胞與3x1()5個GFP+細胞混合并如所述地植入。抗VEGF(G6-23)或對照(抗豚草)抗體治療在腫瘤細胞接種以后4天啟動。在腫瘤達到可觸知的大小之后每周2-3次使用游標卡尺評估腫瘤大小。使用公式Pi/6xLxWxW確定肝瘤體積，其中L是最長的直徑，W是在垂直于L的位置的直徑。化夢^f法。給C57B1/6小鼠植入TIB6、B16F1、EL4和LLC細胞系。在植入后的前4天小鼠不接受任何治療以容許腫瘤細胞的建立。包括5-氟尿嘧咬(5FU，AmericanPharmaceuticalPartner,IL;50mg/kg每周一次)和吉西他濱(EliLillyCo,IN,120mg/kg每周兩次)的化療劑IP施用。每周兩次測量腫瘤體積，如所描述的計算。名瘦邀織化夢(7/7C義對于免疫熒光分析，收獲腫瘤，在最佳切割溫度(OCT)介質中冷凍用于低溫切片。總共6jam腫瘤^[氐溫切片在室溫千燥l小時，并在-2(TC在丙酮中固定10分鐘。在室溫風干4分鐘之后，通過將它們在室溫在20%正常山羊血清(NGS，GIBCO#16210-064;在磷酸鹽緩沖鹽水("PBS")中配制)中溫育l小時來封閉非特異性結合位點。切片用在DAKO封閉液(DakoCytomation,CA)中稀釋的以下抗體連續染色，家兔抗GFPAlexaFluor488偶聯物(MolecularProbes)保持在20|ug/ml稀釋度在室溫l小時，山羊抗家兔AlexaFluor488偶聯物(MolecularProbes)保持l:500稀釋度在室溫l小時，大鼠抗小鼠PECAM-1(克隆MEC13.3;BDPharmingen)在1:100稀釋度在4。C保持過夜，以及山羊抗大鼠AlexaFluor594偶聯物(MolecularProbes)保持在1:500稀釋度在室溫1小時。洗滌載玻片并在DAKO熒光制片介質中制片，在裝備有Plan-Neofluar20x物鏡的Nikon顯孩丈鏡上收集免疫熒光圖像，并數字合并。i管襲面承fKS^J^Wf。從CD31染色切片使用20x物鏡的數字圖象測定腫瘤血管表面積。一般地，通過使用ImageJ軟件，使用設置在50-70的預定閾值作為截留，選擇與染色的血管對應的像素。消除污染的(非血管的)離群像素。除非另有說明，每個組分析總共3-5個腫瘤。從每個腫瘤切片采集總共15個圖像，每個圖像覆蓋1502nn^的面積。除非另有說明，每個組的背景染色通過使用帶標記物的對照抗體來確定，并從總血管計數中減去。相對于總圖象面積和總分析面積的聚集血管像素面積報告為°/。血管/表面積。在一個實施方案中，血管表面積可以使用非侵入性定量方法來定量，包括但不限于^f茲共振成像、動態對比強化的》茲共振成像、計算斷層照相術(CT)和電子發射斷層照相術(PET)。參見例如O，Connorea/.,Bn'fe/zJow"a/o/Ca"cw96:189-195(2007)。在某些實施方案中，4L造影藥劑及其f;f生物和復合物可以用于》茲共振成像。^4勿y^j。分離對照和抗VEGF治療的小鼠的腫瘤，通過切石牟肺瘤組織、接著用細胞勻漿器(VWR)處理來產生單細胞懸浮液。BMMNC從植入動物的股骨和脛骨沖洗下，使用ACK裂解緩沖液(Cambrex，MA)進行RBC裂解。通過眼窩后采血收集外周血，取40ial外周血用ACK緩沖液預處理用于紅細胞裂解。來自BM、腫瘤或外周血的細胞用一系列單克隆抗體染色，包括CDllb、Grl、CD19、CD90、VEGFR2、CXCR4、L-選擇素2(全部來自BDBiosciences,CA)、VEGFR1(R&D，CA)、Tie2(eBioSciences，CA)以及合適的同種型對照，來研究每個隔室中的髓樣和淋巴樣級分。FACS數據在FACScalibur上獲得，通過CellQuestPro軟件(BDBiosciences)來分析。為了分離GFP+細胞和/或CDllb+Grl+,從植入小鼠的骨髓或腫瘤提供單細胞懸浮液。細胞用偶聯有APC的抗CDllb和偶聯有PE的抗Grl來染色。GFP、GFP-、CDllb+Grl+和CDllb-Grl-細胞的群體在FACSVantage才幾器中分離，分選后分析確保每個隔室中感興趣群體的純度。微浮/{/。使用qiagenRneasy試劑盒(Qiagen)自骨髓衍生CDllb+Grl十細胞分離RNA。互補RNA(cRNA)的制備和陣列的雜交/掃描的方法由Affymetrix(Affymetrix,Inc.)提供。將5Mg總RNA使用cDNA合成試劑盒(SuperscriptChoice,GIBCO/BRL)和T7-(dT)24寡聚物引物(BiosearchTechnologies,Inc.,CustomSynthesis)轉變成雙鏈cDNA。雙鏈cDNA在親和樹脂(樣品清潔模塊試劑盒，Affymetrix,Inc.)上并通過乙醇沉淀來純化。在第二鏈合成之后，使用T7RNA聚合酶和生物素標記的核苷酸在體外轉錄反應(EnzoBiochem，Inc.)中從cDNA樣品產生帶標記物的cRNA。帶標記物的cRNA在親和樹脂(樣品清潔模塊試劑盒，Affymetrix)上純化。帶標記物的cRNA的量通過測量260nm吸光度，并使用260nm處的1OD對應于40jag/mlRNA的換算關系來測定。取20jiigcRNA通過在40mMtris-乙酸鹽(pH8.1)、100mM乙酸鉀和30mM乙酸鎂中在94。C溫育30分鐘來片段化。然后將樣品在設置在60rpm的電熱輪轉烘箱中在45'C與小鼠基因組4302.0陣列雜交19小時。將陣列在AffymetrixFluidics工作站和掃描器中洗滌，染色，掃描。使用AffymetrixGeneChip分析軟件或Spotfire軟件(Sportfire,MA)來進行數據分析。選擇信號強度比參考RNA高至少1.5倍的基因用于進一步的分析。然后，選擇與相應的B16F1組相比在EL4和LLC樣品中顯著(p<0.05)差異(在CDllb分析中超過1.5倍以及在腫瘤分析中超過2倍)表達的基因用于最終的分析。對所有腫瘤和CDllb數據使用Spotfire(Spotfire)軟件中的算法進行分級基因聚類分析。勿/敏if移W/定法。如關于FACS分析所述分離腫瘤細胞，以lx106個細月包/ml在DMEM、10。/。FCS和4mM谷氨酰胺培養基中平鋪，在032組織培養溫箱中溫育4天。使用Amicon離心柱(Millipore)將培養基按與原始體積的比例來濃縮。取600nl—式三份樣品用于穿孔(transwell)細胞遷移平板(Corning)。將分離自C57BL/6小鼠的2.5x104個新鮮分離的BMMNC重懸浮在DMEM中，并置于穿孔平板的上室，隨后在37。C溫育9小時，通過對下室內的細胞計數來測量BMMNC的遷移能力。鍵#。使用ANOVA來確定顯著差異。認為《0.05的p值是顯著的。結果好;^抗K五GF治《的抗^不^由z義處佳給藥〃趟的，并j^f不依顛于淋為了建立允許評估抗VEGF治療的腫瘤中骨髓衍生細胞(BMC)的身份和相對豐度的實驗模型，將綠色熒光蛋白標記的(GFP+)骨髓單個核細胞(BMMNC)過繼性地轉移給經過致死照射的C57BL/6小鼠(參見例如Okabe，M.efa/.，'Greenmice'asasourceofubiquitousgreencells.i^E^S*丄e"407:313-9(1997))。將C57BL/6同基因腫瘤細胞系植入GFP+骨髓嵌合小鼠中，評估VEGF中和性抗體(G6-23)(參見例如Malik，A.K."a/.，RedundantrolesofVEGF-BandP1GFduringselectiveVEGF-Ablockadeinmice.廣2005))對腫瘤生長和血管發生的影響。這些細胞系包括黑素瘤細胞系(B16F1)、兩種T細胞淋巴瘤細胞系(EL4和TIB6)、和Lewis肺癌(LLC)細胞系。術語"B16F1"和"B16"在本文中可互換4吏用，指相同的黑素瘤細胞系。B16F1胂瘤的生長被抗VEGF(G6-23)阻斷了(附圖la)。在獨立的實驗中，TIB6腫瘤的生長也被抗VEGF顯著地阻斷了。然而，EL4和LLC腫瘤僅短暫地被抑制，而且在起初的生長延遲之后，肺瘤開始快速擴展(附圖la)。類似地，植入免疫受損的米色棵X連鎖的免疫缺陷(XID)小鼠中的EL4(附圖lb)和LLC胂瘤(附圖lc)的G6-23治療在所有測試的劑量引起了僅僅短暫的腫瘤生長延滯。這些發現表明，針對抗VEGF治療的抗性以不依賴T和B淋巴細胞的方式發生。在這個模型中，EL4和LLC腫瘤的抗性不是由次最佳劑量的抗VEGF抗體引起的(附圖lb和lc)。在我K5GF敏J^和在^浙vf的j&f^智溝#缺乏#鑊衍^的力犮i取腔扭/七'f服扁五尸CVEL4和LLC腫瘤分離物的熒光活化的細胞分選(FACS)分析揭示了與抗VEGF敏感性腫瘤相比，在抗VEGF和對照二者治療的小鼠中GFP+骨髓細胞在抗性腫瘤中的頻率提高了(p《0.05),表明針對抗VEGF治療的抗性與BMMNC的募集有關(附圖ld)。為了闡明浸潤性BMMNC是否直接促進鐘瘤血管結構，使用血小板內皮細胞粘附分子(CD31，PECAM)/GFP雙重染色來定量腫瘤切片中的微血管表面積和GFP+A:D31+(PECAM)EPC的數目。在治療的第14天，不論腫瘤類型，在抗VEGF或對照治療的腫瘤中絕大多數的CD31+血管結構缺乏GFP+表達(附圖le)。這些發現表明，BM-EPC向肺瘤血管結構的募集不直接促進抗VEGF抗性或敏感性腫瘤中的腫瘤血管結構的形成。抗VEGF治療的EL4和LLC腫瘤顯示了與對照治療的腫瘤相比血管表面積方面2-3倍降低(附圖lf)，與腫瘤重量方面類似的降低相關。與抗VEGF抗性的EL4和LLC肺瘤中相比，在抗VEGF敏感性B16F1腫瘤中在抗VEGF治療之后CD31+血管的降低更大。此外，血管表面積(VS)的分析顯示了與抗性腫瘤相比，在敏感性腫瘤中抗VEGF治療之后在CD31+血管方面顯著的(p《0.05)降低(附圖lf)。5MMVC的j:襄和致敏對f我K五G尸我'/:^ff要的用抗VEGF敏感性B16F1腫瘤進行腫瘤混合實驗來評估0卩+BMMNC在針對抗VEGF治療的抗性的發生中的功能關聯性(relevance)。對于實驗設計和細胞純度，參見附圖6a和b以及附圖7。為了進行骨髓和腫瘤嵌合實驗，從植入有抗性和敏感性腫瘤的小鼠的腫瘤或骨髓分離GFP+細胞。分選后分析確保了在每個隔室中GFP+細胞的純度。B16F1與抗性胂瘤致敏的BMMNC混合顯示了顯著的(p《0.05)生長剌激效應(附圖2a，b)。與之相反，當與B16F1肺瘤或對照matrigel植入物致敏的BMMNC混合時，B16F1腫瘤的生長速率沒有顯著改變(附圖2a，b)。與來自植入有matrigd或對照的小鼠的BMMNC相比，從攜帶EL4和LLC月中瘤的小鼠的脛骨分離的BMMNC在與B16F1肺瘤混合后顯著提高了腫瘤生長速率(附圖2a)。與對照抗體治療的組(附圖2a)相比，肺瘤生長速率方面的差異在抗VEGF治療的組(附圖2b)中是更顯著的。與之相反，當與用B16Fl腫瘤或對照matrigel致敏的BMMNC混合時，不論治療，B16F1腫瘤中的生長速率沒有顯著提高(附圖2a,b)。類似地，當與抗VEGF敏感性B16F1肺瘤混合時，在生長14天之后分離自EL4和LLC腫瘤的GFP+細胞足以介導針對抗VEGF治療的抗性(附圖2c,d)。當單獨地植入時，GFP+BMMNC或CDllb+Grl+細胞不產生胂瘤，證明了不存在污染性肺瘤細胞。BMMNC和抗VEGF敏感性腫瘤在物理上的接近本身不足以誘導抗性，而且用抗VEGF抗性腫瘤使骨髓細胞致敏是介導腫瘤抗性所需的。組合起來，這些數據表明，BMMNC向腫瘤的募集和通過抗性腫瘤的致敏二者是？I起針對抗VEGF治療的抗性發生的事件級聯中的兩個步驟。^我^,yf放敏的CD77Z)+GW+細應乂介^拔F五GF我^的i要f體舉沐BMMNC包含異質性群體，其包括原始的、髓樣的和淋巴樣的譜系的細月包。Morrison,S丄"a/.,爿mwievCe〃Dev說'o/，11:35-71(1995)。附圖3a-d中顯示的數據表明，代表髓樣群體的CD1lb+Grl+細胞是抗VEGF抗性的發生中主要的BMMNC子集。參見例如Onai,N."a/.，96:2074-2080(2000)。開發了體外細胞遷移測定法來測試暴露于獲自抗性或敏感性腫瘤的可溶性提取物的BMMNC。將腫瘤在用抗VEGF或對照抗體治療的小鼠中培養14天。體外遷移測定法表明了BMCDllb+Grl+細胞朝向抗性肺瘤而不是敏感性腫瘤的可溶性提取物的遷移能力更大(p《0.05)(附圖3a)。因此，髓樣化學吸引因子存在于對照或抗VEGF治療的腫瘤的可溶性提取物中，而且當抗VEGF(10|ig/ml)被添加到培養基中時，保持不受影響。這些發現表明，髓樣細胞募集是腫瘤固有的，不依賴于VEGF,而且不是由治療誘導的。這些發現與來自腫瘤生長實^r的數據(附圖ld)—致，其中抗VEGF治療不能有效地阻斷BMMNC向抗性腫瘤的歸巢，進一步支持了如下觀念，即髓樣細胞募集是腫瘤固有的而不是治療誘導的。考慮到CD1lb+Grl+細胞遷移方面響應于來自抗VEGF抗性腫瘤的條件化培養基而表現出的提高(附圖3a),使用FACS分析來研究向小鼠中生長的EL4和LLC肺瘤募集的造血的、淋巴樣的和髓樣的譜系。當對于CDllb+子集門選時，與B16F1腫瘤相比，EL4和LLC腫瘤顯示了CDllb+Grl+細胞的富集(附圖3b)。在抗VEGF治療的腫瘤中，差異是最顯著的。在B16F1腫瘤中，CDllb+Grl+細胞群體在抗VEGF治療中顯著降低，而它們在EL4或LLC腫瘤中保持了不受影響(附圖3b)。在另一個實驗中，使用FACS儀器和針對CD1lb與Grl的單克隆抗體來分析攜帶TIB6、B16F1、EL4和LLC腫瘤的小鼠中的髓樣隔室。EL4和LLC腫瘤分離物中浸潤性BMMNC的流式細胞術分析顯示了與TIB6和B16Fl胂瘤相比CDllb+Grl+細胞的顯著的(p<0.05)富集。這些結果與抗VEGF敏感性腫瘤中BMMNC水平降低一致(附圖ld),而且提供了在CDllb+Grl+細胞向胂瘤的募集和藥物抗性的發生之間相關性的進一步支持。與來自腫瘤中分離的CDllb+Grl+的數據相反，在攜瘤小鼠的骨髓CDllb+子集中發現了較不顯著的改變(附圖3c)。這些數據表明，在攜帶抗性肺瘤的小鼠中的骨髓和腫瘤之間有獨特的串話(cross-talk),因為它們募集更多的CDllb+Grl+而且還指示骨髓產生更多的髓樣細胞。抗性和敏感性腫瘤中CDllb+Grl+細胞的進一步分析揭示了，已知牽涉髓樣細胞的歸巢和穿內皮遷移的分子(例如分別是CXCR4和L-選擇素)有更高的表達。攜瘤小鼠的BMMNC中CDllb+CD31+(EPC)和CDllb+CXCR4十細胞(嗜中性細胞)、CD19(B細胞)、CD卯(T細胞)、CDllc(樹突細胞)和VEGFR-2的相對數目在治療組和腫瘤類型之間是相似的，除了有些腫瘤中的CD19之外(附圖14)。在CDllb和Grl之外，調查了攜瘤小鼠中其它造血譜系(諸如B和T淋巴樣、CDllc、以及VEGFR1和VEGFR2)的表達(附圖15)。抗性腫瘤中B淋巴樣細胞和樹突細胞的頻率方面的顯著降低(p《0.05)是值得注意的(附圖15a)。此外，數據表明了，在攜帶抗性腫瘤的小鼠的BM中與攜帶相應敏感性腫瘤的小鼠的BM相比B和T淋巴細胞以及樹突細胞的頻率方面有顯著差異(附圖15b)。這些觀察結果表明，抗性腫瘤中髓樣細胞頻率的提高與其它造血譜系的降低有關。在BM和腫瘤之外，調查了攜瘤小鼠的脾臟，因為早先的研究表明脾臟的CDllb+Grl+細胞促進腫瘤擴展。參見例如Kusmartsev,S.&Gabrilovich,D.I.,Ca"cer7mmM"o//mmw"o//2er,51:293-298(2002);Bronte,V.efa/.,腸od,96:3838-3846(2000)。作為對BM和肺瘤數據的支持，發現了與植入有敏感性腫瘤的小鼠相比，在植入有抗性腫瘤的小鼠中CD1lb+Grl+在脾臟中的頻率有提高(p《0.05)且脾臟大小有擴大(p《0.05)(附圖16a和b)。結合在一起，這些觀察結果表明了CDllb+Grl+細胞作為介導針對抗VEGF治療的抗性中的主要細胞群體之一的功能性作用。為了調查髓樣細胞在抗VEGF抗性中的功能關聯性，從用EL4和LLC肺瘤致敏的小鼠的骨髓分離CDllb+Grl+和CDllb-Grl-亞群(附圖17),并將它們與B16F1肺瘤細胞混合。而，消減了CD1lb+Grl+細胞的BMMNC和腫瘤衍生GFP+細胞未能介導抗性。來自用抗VEGF抗性腫瘤致敏的小鼠的骨髓的CDllb+Grl+細胞可以介導針對抗VEGF治療的抗性。因而，附圖3樣明，由抗性腫瘤而不是敏感性胂瘤致敏的CDllb+Grl+細胞介導了針對抗VEGF治療的抗性。然而，與CDllb-Grl-群體相比，B16Fl與從B16Fl或matrigel致敏的小鼠分離的CDllb+Grl+細胞的混合物不能促進針對抗VEGF治療的抗性(附圖17a)。這進一步證明了如下假說，即與敏感性腫瘤相比，抗性腫瘤具有與髓樣隔室的獨特串話。為了調查CDllb+Grl+細胞對肺瘤血管結構的影響，分析了B16F1與CDllb+Grl+和CDllb-Grl-細胞的混合物中的血管表面積(VSA)(附圖17b)。這些發現表明，CDllb+Grl+混合物中的VSA顯著(p<0.05)大于單獨的B16Fl或與CDllb-Gr1-細胞的混合物，表明當混合敏感性細胞系和CD11b+Gr1+細胞時，血管結構的發育是針對抗VEGF的抗性的主要原因之一。當測試自抗性腫瘤分離的胂瘤相關CDllb+Grl+細胞賦予敏感性腫瘤以抗性的能力時，獲得了相似的結果(附圖3e，f)。因而，當在細胞獲取功能(cellular-gain-of-fonction)方法中測試時,BM相關的和肺瘤相關的CD11b+Gr1十細胞都足以賦予針對抗VEGF的抗性。我)^(7尸在#,著^#體0)〃6+(^/+勿應^謬尋7V一定付差^襄合為了檢測攜瘤小鼠的骨髓中CD1lb+Grl+細胞的活化狀態方面的潛在差異，使用DNA陣列進行了基因表達分析。抗VEGF抗性EL4或LLC腫瘤致敏的CDllb+Grl+細胞的無監督聚類分析鑒定了差異調節基因的特征性集合，其不同于抗VEGF敏感性B16F1肺瘤致敏的細胞(附圖4a)。基因本體分析揭示了抗VEGF抗性腫瘤對炎性細胞因子和巨噬細胞/髓樣細胞分化標志物的的富集以及促血管發生和抗血管發生因子水平方面的改變。鑒定了由兩種抗VEGF抗性腫瘤普遍上調的基因集合，其中數種已知牽涉血管發生調節、松弛素樣因子(RLF)(參見例如Silvertown，J.D.,Summerlee，A丄&Klonisch,T.Relaxin-likep印tidesincancer.JOwcer107:513-9(2003))、牙口石舞月旨^L序酵(scramblase)(Endo-Lip)(參見例^口Favre,C丄e/"a/.Expressionofgenesinvolvedinvasculardevelopmentandangiogenesisinendothelialcellsofadultlu股.爿mJP/^w.o/ifeaWCz>c尸/zjWo/285:Hl917-38(2003))。與髓樣細胞的分化和/或活化相關的另一類基因在CDllb+Grl+細胞中被抗VEGF抗性腫瘤顯著上調，包括TLR-1(參見例如Edfeldt，K.,Swedenborg,J.,Hansson，G.K.&Yan，Z.Q.Expressionoftoll-likereceptorsinhumanatheroscleroticlesions:apossiblepathwayforplaqueactivation.C/簡/a"。"105:1158-61(2002))、CD14(參見例如Scott,C.S."a/.FlowcytometricanalysisofmembraneCDllb，CDllcandCD14expressioninacutemyeloidleukaemia:relationshipswithmonocyticsubtypesandtheconceptofrelativeantigenexpression.五z^J/7aemflto/44:24-9(1990))、IL-13(參見4列^口Roy,B.a/.IL-13signaltransductioninhumanmonocytes:phosphorylationofreceptorcomponents,associationwithJaks,andphosphorylation/activationofStats.J丄eioc歷o/72:580-9(2002))和IL-4(參見例如Palmer-Crocker，R丄.，Hughes,C.C.&Pober，J.S,IL-4andIL-13activatetheJAK2tyrosinekinaseandStat6inculturedhumanvascularendothelialcellsthroughacommonpathwaythatdoesnotinvolvethegammacchain./C7/"/"vgW98:604-9(1996))的受體(附圖4)。反之，凝血栓蛋白-1(thrombospondin-1),—種強力的血管發生抑制劑(參見例^口Good,D.a/,Atumorsuppressor-dependentinhibitorofangiogenesisisimmunologicallyandfunctionallyindistinguishablefromafragmentofthrombospondin.逾.Xcat/.<SW.園87:6624-6628(1990);及Imela-Arispe，M丄.，Bornstein,P.&Sage，H.Thrombospondinexertsanantiangiogeniceffectoncordformationbyendothelialcellsinvitro.PracjVa"爿cadSc/t/S」88:5026-30(1991))處在被兩種抗VEGF抗性腫瘤顯著下調的基因中。在又一個微陣列中顯示了，抗性肺瘤表現了不同的基因表達序型。對自才直入有EL4(El-3)、LLC(Ll-3)、B16F1(Bl畫3)和TIB6(Tl-3)腫瘤并用抗VEGF治療的小鼠的骨髓分離的CDllb+Grl+細胞進行了基因樹分析。鑒定了下調的、不變的和上調的基因。鑒定了由抗VEGF抗性腫瘤誘導的改變的特征性集合，其不同于抗VEGF敏感性肺瘤所誘導的。對自攜帶TIB6、B16F1、EL4和LLC腫瘤并用抗VEGF治療17天的小鼠的骨髓分離的CD11b+Gr1+細胞中差異表達的基因進行了陣列分析。鑒定了潛在牽涉血管發生或髓樣細胞分化和遷移的調節、在抗性與敏感性腫瘤中的表達水平顯著改變(p《0.05,>1.5倍)的基因。已知牽涉血管發生的調節的上調基因包括白介素-U受體(IL-IIR)、白介素-l受體II(IL-IRII)、干擾素跨膜l(IFNTM1)、腫瘤壞死因子受體超家族成員18(TNFRSF18)、無翅整合5A(Winglessintegration5A:WNT5A)、分泌載體膜l、熱休克蛋白(HSP86)、表皮生長因子受體(EGFR)、Eph受體B2(EphRB2)、G蛋白偶聯受體25(GPCR25)、肝瘤衍生的生長因子(HGF)、血管生成素樣-6、肝配蛋白受體RA7(Eph-RA7)、腦信號蛋白Vlb、神經營養蛋白5、密蛋白-18、金屬蛋白酶-解聯蛋白MDC15(MDC15)、細胞外基質(ECM)、以及具有凝血栓蛋白基序7B的解聯蛋白和金屬蛋白酶(ADAMTS7B)。下調的基因包括神經元細胞粘附分子(NCAM-140)、纖連蛋白III型、Wiskott-Aldrich綜合癥蛋白相互作用蛋白(WIP)、CD74、細胞間粘附分子2(ICAM-2)、Jaggedl、整聯蛋白a-4(Itga4)、整聯蛋白卩-7(ITGB7)、轉化生長因子-PII型受體(TGF-BII-R)、TGFb可誘導的早期蛋白(TGFbIEP)、針對decapentaplegic的母親(MAD)和華麗線蟲(C.e/egara)蛋白SMA-4(Smad4)、骨形態發生蛋白受體1A(BMPR1A)、CD83、Dectin-l、CD48、E-選擇素、白介素-15(IL-15)、細胞因子信號傳導的抑制物4、細胞因子受體相關蛋白質4(Cytor4)和趨化因子(C-X3-C)受體l(CX3CR1)。鑒定了由兩種抗性腫瘤普遍上調的基因集合，其中數種已知牽涉血管發生的調節，包括松弛素樣因子(RLF)(Ho，R丄."a/.Immunologicalresponsescriticaltothetherapeuticeffectsofadrianvycinplusinterleukin2inC57BL/6micebearingsyngeneicEL4lymphoma,(9"co/ie，5:363-372(1993))、神經營養蛋白5(Lazarovici，Ref，Nervegrowthfactor(NGF)promotesangiogenesisinthequailchorioallantoicmembrane,EWof/7e"簡，13:51-59(2006))、石粦月旨^L序酵(Endo畫Lip)(Favre,C丄da/.，Expressionofgenesinvolvedinvasculardevelopmentandangiogenesisinendothelialcellsofadultlung,^wJ^/zj^WZ/eaWOcP/^/o/,285:H1917-1938(2003))、血管生成素樣-6、腦信號蛋白VIb、EphRA7、EphRB2和FGF13。此外，與髓樣細胞的分化和/或活化相關的GM-CSF(Rapoport,A.P.da/.，Granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor(GM-CSF)andgranulocytecolony-stimulatingfactor(G-CSF):receptorbiology,signaltransduction,andneutrophilactivation,祝oodiev，6:43-57(1992))也在自攜帶抗性腫瘤的小鼠分離的CD1lb+Grl+BM細胞中上調。已知牽涉樹突細胞的活化/產生的數種基因在分離自抗性肺瘤的BMCDllb+Grl+中完全下調。這包括CD83、CD48、Crea7和Dectin-l(參見例如Lechmann,Maa/.,CD83ondendriticcells:morethanjustamarkerformaturation,7>e"^s7www"o/23:273-275(2002))、IL-15(參見例如Feau，S.o/.，Dendriticcell-derivedIL-2productionisregulatedbyIL-15inhumansandinmice,說"105:697-702(2005))和CX3CR1(參見例如Mess,J.H.""/.,CX3CR1-mediateddendriticcellaccesstotheintestinallumenandbacterialclearance,5We"cg307:254-258(2005))。分子數據符合BMMNC的多譜系分析(附圖15)，其中在攜帶抗性腫瘤的小鼠中的BM和腫瘤中CDllc+細胞的頻率方面存在顯著(p《0.05)降低。此外，TGF-卩超家族的數個成員(參見例如Derynck，R"a/.，TGF-betasignalingintumorsuppressionandcancerprogression,AtoGe"e29:117-129(2001))(包括Smad4和BMPRlA)處于下調的基因之中，表明在攜帶抗性腫瘤的小鼠中TGF-(3途徑在調節CD1lb+Gr1+細胞的活化/分化方面的作用。此外，進行了來自LL2、EL4和B16F1腫瘤的基因表達分析，分析了在抗VEGF治療的抗性(EL4+LL2)而不是敏感性(B16F1)腫瘤中特異性上調或下調的基因。在所有腫瘤類型之間總體基因表達樣式是不同的。如附圖4d所示，在抗VEGF抗性和敏感性腫瘤之間其表達改變的許多基因屬于趨化因子和細胞因子的類別，表明炎性細胞在抗VEGF抗性腫瘤中的存在。此外，鑒定了多種促血管發生因子或抗血管發生因子。類似地，在抗VEGF治療的TIB6、B16F1、EL4和LLC腫瘤中的其它基因表達分析表明了在所有腫瘤類型之中基因表達的不同序型。上調的基因包括胰島素樣生長因子2、結合蛋白3(IGF2BP3)、熱休克蛋白9A(HSP9A)、成纖維細胞生長因子18(FGF18)、結締組織生長因子相關蛋白WISP-1(ELM1)、晶狀體上皮衍生的生長因子a(Ledgfa)、清除受體A型、巨噬細胞C型凝集素、聚合的免疫球蛋白受體3前體(Pigr3)、巨噬細胞清除受體I型(巨噬細胞SRT-1)、G蛋白偶聯受體、小的可誘導的細胞因子A7(ScyA7)、白介素-l受體2(IL-1R2)、白介素-l可誘導蛋白(IL-1可誘導蛋白)、白介素-ip(IL-113)、LIX(LPS誘導的CXC趨化因子(Scyb5)基因l趨化因子(C-X-C基序)配體5)。下調的基因包括轉化生長因子卩(TGF-B)、Frizzled(FIZZ1)、Wolfram綜合征l同系物(Wfsl)、跨膜蛋白14A(TP14A)、細胞外基質相關蛋白(EMAP)、硫酸酯酶2(SULF-2)、細胞外基質2、結締組織生長因子(CTFG)、組織因子途徑抑制物(TFPI)、抵抗素樣分子amRNAI抹系C57BL/6XCP2蛋白(Xcp2)基因(XCP2)、受體活性修飾蛋白2(Ramp2)、RAR相關的;瓜兒受體a(ROR-a)、肝配蛋白B1、分泌的蛋白酸性和富含半胱氨酸樣l(SPARC-樣l)、腦信號蛋白A。在抗性與敏感性(TIB6+B16F1)腫瘤中差異表達的基因(超過2倍，p《0.05)的分析鑒定了數種已知牽涉BMMNC向外周血動員的細胞因子，包括粒細胞集落刺激因子(G-CSF)(參見例如Rapoport，A.P,"a/.，Granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor(GM-CSF)andgranulocytecolony-stimulatingfactor(G-CSF):receptorbiology，signaltransduction,andneutrophilactivation,5/oodiev6:43-57(1992))禾口單才亥纟田月包化學吸引蛋白(MCP-1X參見例如Leonard,E丄"a/.,Secretionofmonocytechemoattractantprotein-1(MCP-1)byhumanmononuclearphagocytes,爿cfv五xpMed351:55-64(1993))。此外，牽涉炎癥的因子諸如巨噬細胞炎性蛋白(MIP-2)(參見例如Cook，D.N.,TheroleofMIP-1alphaininflammationandhematopoiesis,J丄eMbc5/o/，59:61-66(1996))和IL陽1R(參見例如Dinarello,C.A.,BlockingIL-1insystemicinflammation,/Ex_pMed,201:1355-1359(2005)處在差異表達的基因之中。大多數上述細胞因子諸如G-CSF也已知牽涉造血祖細胞向髓樣細胞的分化(參見例如McNiece，I.K.Wa/.，RecombinanthumanstemcellfactorsynergiseswithGM-CSF，G-CSF，IL-3andepotostimulatehumanprogenitorcellsofthemyeloidanderythroidlineages,鄉//，她/，19:226-231(1991))和增殖(參見例如Lemoli,R.M."a/.,ProliferativeresponseofhumanacutemyeloidleukemiacellsandnormalmarrowenrichedprogenitorcellstohumanrecombinantgrowthfactorsIL-3，GM-CSFandG-CSFaloneandincombination,丄e"A:e附/a，5:386-391(1991))。因而，在致敏和促進造血細胞向外周部動員之外，攜帶抗性腫瘤的小鼠可能享有刺激髓樣細胞分化的能力。這些發現支持了來自CDllb+、Grl+細胞中的基因表達研究的結論，表因子和趨化因子的差異調節可能潛在促進抗VEGF抗性腫瘤的抗性。遂合戎J^GF和于挽體存細應功處的i^,^伊^/^9fA營發蘭和蘭長在EL4(附圖5a-b)和LL2紳瘤(附圖5c-d)的環境中單獨地或與抗VEGF組合地測試了降低外周循環中Grl+髓樣細胞的數目的抗Grl抗體。當單獨施用時，抗Grl治療在降低外周的和腫瘤的Grl+細胞的數目方面是有效的，然而，它不顯著地影響EL4腫瘤的腫瘤生長和血管形成(附圖5a-b)。然而，當抗Gr1抗體與G6-23組合時，我們觀察到與抗VEGF-A治療單獨誘導的效果相比，組合治療組中存在EL4(附圖5b)或LL2(附圖5d)腫瘤朝向延長的腫瘤生長延遲和肺瘤抗性發作的傾向。LL2腫瘤的組織學分析揭示了通過FACS和血管表面積(VSA)測得的朝向Grl+髓樣細胞降低的傾向，其與組合治療組中腫瘤生長速率降低(附圖5c和d)相關。基因表達分析揭示了抗VEGF抗性腫瘤細胞系對腫瘤和CD1lb、Grl+骨髓細胞中嗜中性細胞彈性蛋白酶表達的顯著增加(附圖4b)。嗜中性細胞產生的彈性蛋白酶據記載促進腫瘤細胞增殖、運動性，并且刺激多種腫瘤類型的生長。參見i"列^口Sun，Z.&Yang，RRoleofimbalancebetweenneutrophilelastaseandalpha1-antitrypsinincancerdevelopmentandprogression.Zawce/(9"co/5:182-90(2004)。此外，提出了嗜中性細胞彈性蛋白酶在調節嗜中性細胞動員和血管發生中的作用。參見例如Shamamian,P,a/.ActivationofprogdatinaseA(MMP-2)byneutrophilelastase,cathepsinG,andproteinase-3:aroleforinflammatorycellsintumorinvasionandangiogenesis./CW/尸/戸W189:197-206(2001)。將抗VEGF治療與彈性蛋白酶抑制劑組合。組合治療引起了LLC和EL4肺瘤的肺瘤體積和末期肺瘤重量的顯著降低(附圖5e和f)。類似于抗Grl抗體治療(附圖5a-d),彈性蛋白酶抑制劑^"導了幾乎完全消融的循環髓樣細胞，然而，在腫瘤之內發現了與對照治療相比時2到3倍的降低。根據這一點，我們猜測缺乏CDllb或Grl表達的某些髓樣祖細胞可能不受治療的影響。或者，祖細胞可以潛在地浸潤腫瘤和原位分化成髓樣細胞。在抗100VEGF治療的腫瘤內誘導更深刻的髓樣細胞消融的策略可以進一步提高組合治療的治療效果。組合起來，這些發現表明，抗VEGF與靶向髓樣細胞功能的化合物的組合改善了治療效力，并提供了第一證據，髓樣細胞的促血管發生功能可能促進針對抗VEGF治療的抗性的發生。此外，這些發現支持了如下觀點，即數種途徑可能牽涉髓樣細胞向抗VEGF抗性腫瘤的募集和活化。我^^Vf*CD7"+GW+的衷至V一在根據抗性腫瘤中CDllb+Grl+細胞的獨特功能特征，調查了它們的細胞特性。檢查了已知牽涉造血細胞的動員(CXCR4)(參見例如Orimo,A.，Stromalfibroblastspresentininvasivehumanbreastcarcinomaspromotetumorgrowthandang;iogenesisthroughelevatedSDF-1/CXCL12secretion,CW/，121:335-348(2005)))和穿內皮遷移(L-選擇素)(參見例如Simon，S.I."a/.,L-selectin(CD62L)cross-linkingsignalsneutrophiladhesivefunctionsviatheMac-l(CDllb/CD18)beta2-integrin,J7m羅"o/，155:1502-1514(1995)))的分子的表達。此外，通過F480的表達認識到的TAM已經被描述為具有提高腫瘤生長的潛力的髓樣細胞子集(參見例如Luo,Y."a/.，Targetingtumor-associatedmacrophagesasanovelstrategyagainstbreastcancer,/C7z'"/"veW,116:2132-2141(2006))。使用氯膦酸鹽的TAM消減在攜帶抗性腫瘤的小鼠中改善了抗VEGF治療的效力。并且，Tie2陽性TAM被發現定位在胂瘤血管之內以及介導血管發生(參見例如DePalma，M.da/.,Tie2identifiesahematopoieticlineageofproangiogenicmonocytesrequiredfortumorvesselformationandamesenchymalpopulationofpericyteprogenitors,Ca"cerCe〃，8:211-226(2005))。因而，調查了CXCR4、L-選才奪素、F4/80和Tie-2在抗VEGF治療的抗性和敏感性腫瘤中的髓樣級分中的表達。給C57BL/6小鼠(n二5)植入TIB6、B16F1、EL4和LLC月中瘤，并用抗VEGF或對照抗體治療，如所述的。在17天后收獲來自每只小鼠的腫瘤分離物，用針對CDllb、Grl、CXCR4、F480、L-選擇素和Tie2的抗體染色。當比較攜帶抗性腫瘤和相應敏感性腫瘤的小鼠中腫瘤相關的CDllb+Grl+時，觀察到CXCR4、F480、L-選擇素和Tie2子集的表達有顯著差異(p<0.05)。自攜瘤的小鼠分離BMMNC，用如上所述相同的標志物染色。與腫瘤分^f一致，在抗性和相應敏感性胂瘤群體中，CXCR4、F480、L-選擇素和Tie2子集在GFP+CD1lb+Grl+細胞中的頻率有顯著差異(p《0.05)。流式細胞術分析揭示了，抗性腫瘤中腫瘤相關的CDllb+Grl+對于CXCR4、F480、L-選擇素和Tie2的表達是高度富集的(p《0.05)。當分析自帶攜瘤小鼠分離的BMCDllb+Grl+細胞時，獲得了類似的圖片。這些觀察結果表明，抗性腫瘤中的CDllb+Grl+在動員、穿內皮遷移和歸巢至腫瘤方面是更有力的。^#^/^^,我^:(7尸和化;^^/的我#的不/^在射對針對抗VEGF的抗性的細胞機制的了解提出了如下問題，即髓樣細胞是否也介導針對其它抗癌化合物的抗性。因而，我們調查了肺瘤針對兩種常用化療劑(包括5-氟尿嘧啶(5FU)和吉西他濱)的抗性(參見例如Pasetto,L.M.ea/.,Oldandnewdrugsinsystemictherapyofpancreaticcancer,CW///蘭to/，49:135-151(2004))。抗VEGF抗性和敏感性肺瘤顯示了對化療的不同響應。如附圖18a和b所示，兩種抗VEGF抗性腫瘤(即EL4和LLC)顯示了對5FU的完全響應和對吉西他濱的部分抗性，后者在稍晚的時間點且比針對抗VEGF治療的抗性輕微得多。在抗VEGF敏感性細胞系中，發現TIB6肺瘤對兩種化合物完全敏感，與對抗VEGF治療的響應相比沒有顯著差異(附圖18c)。然而，與抗VEGF治療相比，B16F1腫瘤顯示了針對5FU和吉西他濱兩者的抗性(附圖18d)。因此，數據清楚地表明了，針對抗VEGF的抗性的序型不對應于抗性和敏感性腫瘤中的化療，表明抗血管發生方法與化療劑中抗性的發生牽涉不同的機制。BM細胞的分析顯示了在所有5FU治療的小鼠中CDllb+Grl+細胞的完全耗盡，在吉西他濱治療的動物中達到較低的程度(附圖6e)。然而，在用吉西他濱或5FU治療的B16Fl腫瘤中CDllb+Grl+細胞的缺乏最小化了髓樣細胞在針對化療的抗性的發生中的牽涉(附圖6f)。CDllb+Grl+細胞向原發腫瘤的募集代表了在小鼠的實驗腫瘤子集之內調節針對抗VEGF治療的抗性的細胞機制。基因表達序型分析允許鑒定與抗VEGF敏感性腫瘤相比，在攜帶抗VEGF抗性腫瘤的小鼠的骨髓中的CDllb+Grl+細胞中差異調節的基因集合。在它們之中，發現了在月中瘤致敏期間變得上調的數種促血管發生因子或抗血管發生因子和髓樣細胞活化的標志物。髓樣細胞向肺瘤的募集牽涉藥物抗性的發生，并且代表了事件級聯中最早的步驟之一。靶向腫瘤衍生的因子、調節髓樣細胞的募集和/或活化的化合物可以與抗血管發生化合物組合。當與全身性髓樣細胞消融策略相比時，腫瘤衍生的化學吸引物對髓樣細胞的選擇性阻斷可能是有益的，例如避免延長部分先天免疫系統全身性抑制的潛在并發癥(參見例如Lewis，C.E.&Pollard,J.W.Distinctroleofmacrophagesindifferenttumormicroenvironments.iee化arch66:605-612(2006))。胂瘤浸潤性髓樣細胞分泌的促血管發定功能的靶向因子可以間接地影響腫瘤血管發生并降低腫瘤對抗VEGF治療的抗性。參見附圖5。抗VEGF單克隆抗體貝伐單抗的臨床評估顯示了在多種人類癌癥(包括腎癌和卵巢癌)中的顯著單藥劑活性(參見例如Ferrara,N.,Hillan,K丄，Gerber,H.R&Novotny,W.Discoveryanddevelopmentofbevacizumab，ananti-VEGFantibodyfortreatingcancer.AtoievZ)rwgZ)&c。v3:391-400(2004);及Jain，R.K.，Duda，D.G.,Clark,J.W.&Loeffler，J.S.LessonsfromphaseIIIclinicaltrialsonanti-VEGFtherapyforcancer.tV"C7/"(9"co/3:24-40(2006))。在貝伐單抗在大多數人類腫瘤類型的廣泛臨床開發期間，變得清楚的是，在許多腫瘤中，與化療劑組合時獲得了強烈的治療效果。正在檢驗在與細胞毒性化合物的組合治療中引起提高的治療效益的基礎分子和細胞事件的本質。已經提出的是，作為血管正常化的結果而提高的肺瘤藥物攝取(纟宗述見Jainefa/.于Jain,R.K.Normalizingtumorvasculaturewithanti-angiogenictherapy:anewparadigmforcombinationtherapy.TVafMe"7:987-9(2001))和/或在腫瘤血管結構的細胞毒性破壞之后干擾內皮細胞再生(綜述見Ferraraea/.于Ferrara，N.，Hillan,K丄，Gerber,H.P.&Novotny,W.Discoveryanddevelopmentofbevacizumab,ananti-VEGFantibodyfortreatingcancer.iVafWevDr收iXycov3:391-400(2004))可以說明提高的治療安文益(纟宗述見Ferrara&Kerbel于Ferrara，N.&Kerbel,R.S.,Angiogenesisasatherapeutictarget.Atowe438:967-74(2005))。不限于單一的理論，髓樣細胞在51起針對抗VEGF治療的抗性的機制方面的作用的鑒定提供了對如下觀點的進一步支持，即與大多數細胞毒性化合物相關的骨髓抑制效果可能促進提高的腫瘤生長抑制。觀察到的是，在用化療治療的患者中的原發肺腫瘤內髓樣細月包數目的降低與存活有關(參見例如DiMaio,M.Wa/.Chemotherapy-inducedneutropeniaandtreatmentefficacyinadvancednon-small-celllungcancer:apooledanalysisofthreerandomisedtrials.丄a"ceZ16>"co/6:669-77(2005))。103CDllb+Grl+細胞的DNA陣列分析鑒定出基因表達方面的改變，其在抗VEGF抗性和敏感性腫瘤之間是不同的，證明了在小鼠的側部生長的腫瘤和在骨髓中的細胞子集之間有顯著的串話(附圖4a)。實施例2:來自針對抗VEGF治療有抗性的腫瘤模型的別的因子鑒定了來自腫瘤的、可能向腫瘤直接或間接地幫助或提供抗性的其它因子。將針對抗VEGF治療有抗性的小鼠淋巴瘤腫瘤溶胞物(例如EL4和L1210)用抗VEGF抗體(G6-31)以5mg/kg/周、兩次/周處理2周。在處理之后，將腫瘤合并，并在含有蛋白酶抑制劑的6mlRIPA緩沖液2X(Roche)中均化。將均化物在eppendorf離心機中在14，000rpm離心2x15分鐘。將上清液在20mMTris、pH7.5、50mMNaCl中l:l稀釋，施加至lmlHiTrapHS。將柱用起始緩沖液(20mMTris、pH7.5,50mMNaCl)洗滌，然后用約5倍柱體積的分步提高的NaCl濃度(0.25MNaCl、0.5MNaCl、1MNaCl，和3MNaCl)洗脫。收集每個步驟的峰級分。參見附圖8。在來自EL4和L1210的高鹽級分中發現了多種因子，其促進趨化活性(例如通過單核細胞遷移測定法)或增殖測定法(例如HUVEC增殖測定法)。例如，bFGF發現于在高鹽級分中，在HUVEC增殖測定法中顯示了促進HUVEC細胞增殖，但是在單核細胞遷移測定法中顯示了沒有趨化活性。在高鹽級分中發現的其它因子被發現具有朝向單核細胞的趨化活性。在針對抗VEGF治療有抗性的肺瘤(EL4)中使用減少/消減巨噬細胞的藥劑與抗VEGF治療(G6-23)的組合，發現了該組合延遲腫瘤生長。將小鼠中的EL4腫瘤在尾靜脈中用以下各項治療1)PBS脂質體/豚草；2)PBS月旨質體/G6-31;3)氯膦酸鹽脂質體/G6-23;4)氯膦酸鹽脂質體/G6-31;或5)氯膦酸鹽脂質體/PBS治療。附圖9顯示了在最后一次給藥之后72小時EL4腫瘤體積(通過卡尺測量)的改變。在用氯膦酸鹽脂質體、巨噬細胞消減劑和抗VEGF(G6-23)治療的小鼠中存在著腫瘤體積的降低。在來自氯膦酸鹽-脂質體/抗VEGF治療的動物的血液中也檢測到了巨噬細胞的降低。參見附圖9的底部。根據定量實時PCR(Taqman)的測量，當與抗VEGF(G6-23)組合施用給小鼠時，氯膦酸鹽脂質體也降低了VEGF表達。參見附圖IO。根據ELISA(RDSystems)的測量，在如上所述用氯膦酸鹽脂質體和抗VEGF(G6-23)治療的小鼠中，KC(CXCL1)蛋白表達也降低了。參見附圖ll。KC(CXCL1)是通過它在鼠單核細胞和巨噬細胞中的過量表達而鑒定出的蛋白質。它的合成被TNFa誘導。KC牽涉嗜中性細胞趨化性/活化和翻滾中的(rolling)單核細胞在內皮表面的捕獲(arrest)。血管內皮細胞中KC的合成由凝血酶誘導。KC受體和IL-8B型受體是同系物。所述受體能夠結合KC和MP-2(巨噬細胞炎性蛋白-2)二者。KC由對抗VEGF治療敏感的腫瘤細胞系和對抗VEGF治療有抗性的腫瘤細胞系二者分泌。在來自抗性胂瘤細胞系的高鹽級分中發現了其它促炎性細胞因子，例如MIP-la、MCP-1、IL-la、IL-1卩、IL-7、IL-9、IL-10和IL-13。MCP-1是單核細胞化學吸引蛋白-1(CCL2或JE),它由巨噬細胞、成纖維細^^和內皮細月包分泌。它由M-CSF、IL-1、IFN"/和TGF卩誘導。MIP-la是巨噬細胞炎性蛋白-la(CCL3)，它由巨噬細胞在響應局部炎癥時分泌，它活化嗜中性細胞而產生超氧化物。它還由淋巴細胞和單核細胞分泌。在肝細胞癌發生的小鼠模型中，MIP-la和MCP-l由新血管分泌，并且通過它們的關聯受體以自分泌方式刺激增殖。參見例如Ca"cer尺e.66(1):198-211(2006)。MCP陽1和MIP-la二者都在對抗VEGF治療有抗性的肺瘤細胞系中表達。參見附圖12,畫面A和B,其中Dil(+)是內皮細胞，CD3(+)代表淋巴樣細胞，F4/8(+)代表巨噬細胞。Dil代表Dil-Ac-LDL(用高氯酸l,l'-二十八烷基-3,3,3',3'-四曱基吲哚-羰花青(Dil)標記的乙酰化低密度脂蛋白)(BiomedicalTechnologiesInc)。任何內皮細月包具有攝取這種染料的能力。MIP-1a和MCP-1還被發現在血管發生性出芽和毛細管管腔形成測定法中具有血管發生活性。參見附圖13，畫面A和畫面B第10天。在該測定法中，將HUVEC細胞在之前一天在低傳代數(passagenumber)解凍，之后將細胞包被在珠子上。將細胞在大約80。/。匯合時脫離，在37。C以400個細胞/珠子包被cytodex微珠(交聯右旋糖苷基質)4小時。將珠子和游離的HUVEC細胞轉移到燒瓶中并培養過夜。將珠子脫離，將它們與纖維蛋白原(牛血漿)(250)ag/ml)混合。然后通過添加凝血酶將纖維蛋白原轉變成不溶性纖維蛋白凝膠。約有100個珠子/12孔板。將珠子與40，000個D551成纖維細胞和VEGF(作為陽性對照)、D551或VEGF(作為陰性對照)、MCP-1和D551、或MIP-la和D551—起培養。每天更換培養基。將培養物用生物素化的抗人類CD31和Cy3鏈霉親合素染色過夜，廣泛洗滌。在60小時、6天和10天采集圖片。#一,*^^《移_^定法步驟l:自人類PBMC分離單核細胞。將血液用105PBS1:1(v/v)稀釋。將稀釋的血液慢慢添加到Ficoll的頂部，在室溫(RT)不間斷地在3000rpm離心15分鐘。除去血漿，收集白細胞(9-5ml中間相)。將細胞在含有具有0.5。/。BSA(低內毒素)的PBS的遷移緩沖液中洗滌，在RT在1850rpm(9~800g)離心10分鐘，計數細胞。步驟2:細胞的f茲標記。將細胞團粒重懸浮在含有具有0.5%BSA(低內毒素)和2mMEDTA的PBS的MACS緩沖液中，30jtU每10個細胞。添加FcR封閉劑和生物素-抗體混合物并混勻。然后將細胞在4。C溫育10分鐘，之后每10個細胞再添加30jalMACS緩沖液，添加抗生物素微珠。混勻，在4。C溫育10分鐘。通過再添加10-20倍的標記體積，將細胞用MACS緩沖液洗滌，在300g(1250rpm)離心10分鐘。將細胞以多至l()S個細胞懸浮在2ml緩沖液中。步驟3:使用LS柱的^茲分離。將LS柱(MiltenyiBiotec)置于磁場支架中。將柱用MACS;爰沖液清洗。將細胞懸浮液施加到柱上。收集未標記的流出液，其代表富集的單核細胞級分。將柱用緩沖液洗滌3次，收集流出液，合并。然后將合并液在300g(1250rpm)離心5分鐘。步驟4:用含有具有0.5。/。BSA(低內毒素)加上2mML-谷氨酰胺和抗生素的RPMI的遷移培養基洗滌細胞。將106個細胞添加到具有5微米孔徑的24孔Transwell平板(Corning)中。向外室中添加各種生長因子、細胞因子/趨化因子或其它測試樣品。在37。C溫育2.5小時之后，小心除去濾器，將細胞徹底混勻并轉移到10mlZPAK溶液中來計數。//L^EC增崖趙定法將低于8次傳代的HUVEC用于該研究中。第l天將3000個細胞/孔(96孔板)在具有1.5%FBS的測定培養基(DMEM:F1250:50)中平鋪在1%明膠包被的平板上。第2天更換培養基，將細胞用各種生長因子或條件化培養基處理。第3天以0.5MCi/孔添力^H-胸苷。第4天在早上添加250mMEDTA/孔來停止反應。將細胞收獲到96孔濾板上，并用水洗滌3次。將31"1樣品用TOPCOUNT液體閃爍計數器來計數。舉/^治;^^t^查^^細^g諒減和^9f4這使用鼠淋巴細胞白血病細胞系EL4。治療在棵鼠中植入EL4月中瘤細胞(5x106，在matrigel中0.1ml體積)之后48小時開始。治療如下組l，8只小鼠，每周兩次，PBS-脂質體200|i1IV和豚草IgG2x5mg/kg/周100ulip.;組2,8只小鼠，每周兩次，PBS-脂質體200)i1IV和G6-312x5mg/kg/周100ju1ip.;組3,8只小鼠，每周兩次，氯膦酸鹽-脂質體200ialIV.豚草IgG2x5mg/kg/周100julip.;組4,8只小鼠,每周兩次，氯膦酸鹽-脂質體200julIV.G6-312x5mg/kg/周100nlip.;組5，8只小鼠，每周兩次，氯膦酸鹽-脂質體200nlIV.PBS每周兩次lOOplip.。每個組的3只小鼠預先放出50yl全血用于FACS巨噬細胞群體評估。每個組的3只小鼠在每次PBS-脂質體或氯膦酸鹽-脂質體注射之后l小時放血(眼)100pi全血用于FACS分析。繼續研究直到充分的腫瘤生長(不超過5周)。如果肺瘤長度大于20mm,那么肺瘤生長被定義為充分的。每周測量腫瘤大小(lxwxh)。至少每周兩次地觀察動物。在實驗的終點處死小鼠，腫瘤測量最后一次，然后提取、稱重、然后固定。從所有動物中采集血液、脾臟和肝臟用于進一步的分析，例如FACS分析、RNA分析等。j&;^、,返和,返尹^噬細應莽沐的趁^/，斧為^^勿應諒減的措標在氯膦酸鹽脂質體的第一次i.v.注射之后92小時之后，施用C02來殺死小鼠(FV6轉基因小鼠vs米色棵XID小鼠)(2只來自氯膦酸鹽治療的FV6，2只來自氯膦酸鹽治療的米色棵XID小鼠，1只未治療的米色棵XID小鼠)，收集來自心室的150pl血液，并置入裝有肝素的試管中，在RT保存。如下加工血液1)采集150jal血液樣品并添加lmlACK紅細胞裂解緩沖液(BiosourceP304-100);2)在RT裂解5分鐘;3)在RT在5000rpm離心2分鐘;4)用FACS緩沖液(PBS+2%FCS)洗滌并再次離心；和5)在60)alFACS緩沖液中重懸浮，通過70jLxm篩過濾。如下加工脾臟1)在FACS緩沖液中使用蓋玻片(VWR微玻片48312-002,25x75mm)的磨砂表面制備單細胞懸浮液；2)在1200卬m離心5分鐘；3)用5mlACK(ACK緩沖液0.15MNH4C1，10.0mMKHC03，0.1mMNa2EDTA，pH7.2-7.4，通過0.22pm過濾除菌，保存在RT)懸浮團粒并在RT溫育5分鐘或更久，任選偶爾搖動；4)在溫育之后，添加FACS培養基到15ml;5)再次離心并在0.5-lmlFACS緩沖液中重懸浮細胞(對于FV6小鼠用lml，對于米色棵XID小鼠用0.5ml);和6)過濾。如下加工肝臟1)在FACS緩沖液中切碎肝臟(整塊的1/8)成小塊(在50ml錐形管中)并用45mlPBS洗滌小塊；2)將小塊在1200卬m離心5分鐘并將小塊小心移到磨砂表面來產生單細胞；3)用3mlFACS緩沖液洗滌并離心；和4)在0.5mlFACS緩沖液中重懸浮并過濾。將10jal血細胞稀釋到卯li1FACS緩沖液中用于總細胞計數。對于總細胞計數，采集脾臟樣品并1:10稀釋。來自血液、脾臟和肝臟的50iul樣品放入V形底、具有蓋子的96孔細胞培養簇(Costar3894)中，以lMl/樣品添加封閉用抗體(CD16/32)達15分鐘。將細胞與F4/80-PE抗體(10jal/樣品；Serotec,大鼠抗小鼠F4/80,MCA497PE,1101B)—起溫育來^^測巨噬細胞。用鋁箔覆蓋，將細胞與抗體在冰上溫育20分鐘，之后添加200julFACS緩沖液，將細胞在4。C、1500rpm離心5分鐘。除去緩沖液，使用200julFACS緩沖液重懸浮細胞，再次離心。最后將細胞重懸浮到130julFACS緩沖液中，轉移到小試管(202032202-12)并在BDFACS儀器上讀取。々^產膚,品對備#勿/&#浮濕解剖腫瘤來除去脂肪組織和皮膚，將它放入含有PSGF的EL4培養基中，置于冰上；通過添加15mL/腫瘤用相同的培養基洗滌腫瘤，在180rpm離心10分鐘；除去上清液，再次洗滌組織；并且，將肺瘤切碎成小塊(<lmm),放入10cm組織培養皿中的2ml冷的EL4培養基中。通過添加8ml培養基并過濾通過40jnm尼龍濾網，將來自EL4月中瘤的單細胞收集到50mlFalcon試管中；將含有膠原酶IV、DNA酶和彈性蛋白酶的50ml細胞解離緩沖液/腫瘤添加到細胞，使用2個10cm皮氏培養皿在37。C溫育1.5小時。通過每15分鐘將組織上下吸移來破壞組織。任選地，在半小時后可以添加12.5ml含有LiberaseBlendymeI的細胞解離緩沖液，例如12.5ml中含200ial,以及在1小時后添加額外的膠原酶IV。將組織消化物連續地過濾通過不同大小的尼龍濾網(100、70和40iam);將樣品用EL4培養基洗滌兩次，在4。C在2000rpm離心5分鐘。對細胞進行計數并收集。在一個實-驗中，裂解細胞，分離總RNA(例如其可以通過Taqman來分析)。任選地，將細胞以多至IOOOOOO個細胞AOOju1使用EL4培養基(1.4ml)來重懸浮；對于1000000個細胞，將細胞用2iugFcI/II封閉30分鐘，在RT用F4/80、CD3抗體或CD31標記的抗體來標記l小時，以從樣品分離巨噬細胞、EL4淋巴細胞和其它造血細胞和內皮細胞；將細胞用EL4培養基洗滌兩次，以1OOOOOO個細胞/0.5ml重懸浮用于細胞分選。根據FSC/SSC和熒光強度來門選細胞。所分選的細胞也可以離心，放入適合的培養基，計數并測量細胞生存力。通過使用EL4培養基將細胞平鋪在l。/。明膠包被的或Matrigel包被(30分鐘)的4孔細胞培養載玻片室中并培養過夜，可以制備細胞用于形態學/免疫熒光研究。可以將細胞疏松和裂解(<500000個細胞)來分離RNA。任選地，可以從分選儀器中分離另一種類型的細胞(例如成纖維細胞、肌細胞等)，計數，并測量細胞生存力，以及進一步分析。任選地，可以裂解這些細胞和分離RNA。或靡^i^H舉W^/務和滋^7:將75-95mgL-a-磷脂酰膽堿添加至裝有1Oml曱醇和1Oml氯仿的500ml燒瓶(其早先已經用曱醇和氯仿漂洗過)。添加10-15mg膽固醇。將燒瓶在37°C水浴中旋轉蒸發(Rotovapor),即旋轉(130-150rpm)和低真空(從200mbar逐漸降低到150mbar)直到液體消失和薄膜形成，10分鐘。將薄膜溶于10ml氯仿，再次旋轉蒸發以除去氯仿，在燒瓶的內壁周圍形成乳白色磷脂薄膜，~15分鐘。在有些情況中，即使液體蒸發掉了也不形成薄膜。將磷脂薄膜分散在10mlPBS或2.0g氯膦酸鹽/10mlPBS中，手動旋轉和/或漩渦直到薄膜溶解，其中形成乳白色懸浮液。將乳白色懸浮液在N2氣體中在RT保持1.5-2小時。輕輕地搖動懸浮液，在水浴超聲發生器中超聲處理3分鐘。將懸浮液在N2氣體中在RT保持2小時，或在4。C保持過夜，用于脂質體膨脹。通過10，000xg、15分鐘、16°C(11,600rpm70Ti轉子)的脂質體離心，除去未封裝的氯膦酸鹽。脂質體在懸浮液的頂部形成白色帶。使用移液器除去脂質體之下的氯膦酸鹽溶液。將脂質體用無菌PBS洗滌2-3次，手動漩渦來破壞團粒。將脂質體離心25，000xg,30分鐘，16°C(18，400rpm,使用70Ti轉子)。將團粒重懸浮在4ml無菌PBS中，在N2中保存，可長達4周。在施用給動物之前，輕輕地搖動脂質體，將200^1脂質體藥劑通過尾靜脈施用給每個動物，每周兩次。認為本說明書足以使得本領域技術人員實施本發明。才艮據以上說明，本發明在本文所顯示的和描述的之外的各種修飾對于本領域技術人員而言是顯而易見的，并且落入所附的權利要求的范圍之內。將本文中引用的所有出版物、專利和專利申請收入本文作為參考以用于各種目的。權利要求1.一種使用組合治療來治療受試者中的抗性腫瘤的方法，所述方法包括向具有抗性腫瘤的受試者施用有效量的VEGF拮抗劑以及有效量的第二藥劑，其中所述第二藥劑包含髓樣細胞減少劑。2.權利要求l的方法，其中所述髓樣細胞減少劑包含Grl拮抗劑、彈性蛋白酶抑制劑、MCP-l拮抗劑或MIP-la拮抗劑。3.權利要求2的方法，其中所述拮抗劑是抗體。4.一種診斷受試者中的抗性肺瘤的方法，所述方法包括從所述受試者提供來自所述受試者的肺瘤的測試細胞群體；測量所述測試細胞群體中CDllb+Grl+細胞的數目或百分比；與參考細胞群體中CD11b+Gr1+細胞的數目或百分比比較所述測試細胞群體中CDllb+Grl+細胞的數目或百分比；并檢測與所述參考細胞群體相比所述測試細胞群體中CD11b+Gr1+細胞的數目或百分比的增加，其中CDllb+Grl+細胞的數目或百分比增加表明所述腫瘤是抗性腫瘤。5.權利要求4的方法，進一步包括測量所述受試者的脾臟大小，并與參考脾臟大小比較所述受試者的脾臟大小，其中脾臟大小增大表明所述腫瘤是抗性腫瘤。6.權利要求4的方法，進一步包括在所述受試者已經施用VEGF拮抗劑之后測量所述受試者中腫瘤的血管表面積(VSA)的數目或百分比，并與(參考血管表面積比較所述受試者中腫瘤的血管表面積的數目或百分比，其中肺瘤的血管表面積的數目或百分比增加表明所述肺瘤是抗性腫瘤。7.權利要求6的方法，其中所述拮抗劑是抗體。8.權利要求4的方法，進一步包括從所述受試者提供來自所述受試者的腫瘤的測試細胞群體；測量所述測試細胞群體中CD19B-淋巴樣細胞或CDllc樹突細胞的數目或百分比；與參考細胞群體中CD19B-淋巴樣細胞或CDllc樹突細胞的數目或百分比比較所述測試細胞群體中CD19B-淋巴樣細胞或CD11c樹突細胞的數目或百分比；并，檢測與所述參考細胞群體相比所述測試細胞群體中CD19B-淋巴樣細胞或CDllc樹突細胞的數目或百分比的降低，其中CD19B-淋巴樣細胞或CD11c樹突細胞的數目或百分比降低表明所述腫瘤是抗性胂瘤。9.權利要求4的方法，進一步包括從所述受試者提供來自所述受試者的骨髓的測試細胞群體；測量所述測試細胞群體中CD90T-淋巴樣細胞、CD19B-淋巴樣細胞或CDllc樹突細胞的數目或百分比；與參考細胞群體中CD90T-淋巴樣細胞、CD19B-淋巴樣細胞或CDllc樹突細胞的數目或百分比比較所述測試細胞群體中CD90T-淋巴樣細月包、CD19B-淋巴樣細胞或CD11c樹突細胞的數目或百分比；并，檢測與所述參考細胞群體相比所述測試細胞群體中CD90T-淋巴樣細胞、CD19B-淋巴樣細胞或CD11c樹突細胞的數目或百分比的降低，其中CD90T-淋巴樣細胞、CD19B-淋巴樣細胞或CDllc樹突細胞的數目或百分比降低表明所述腫瘤是抗性腫瘤。10.—種使用組合治療來治療受試者中的抗性腫瘤的方法，所述方法包括向具有抗性肺瘤的受試者施用有效量的VEGF拮抗劑以及有效量的髓樣細胞減少劑和有效量的第三藥劑，其中所述第三藥劑是化療劑。11.權利要求10的方法，其中所述拮抗劑是抗體。12.權利要求10的方法，其中所述髓樣細胞減少劑包含Grl拮抗劑、彈性蛋白酶抑制劑、MCP-l拮抗劑或MIP-la拮抗劑。13.權利要求10的方法，其中所述化療劑是5FU或吉西他濱。全文摘要提供了使用包括抗VEGF抗體在內的組合療法治療癌癥的方法。還提供了診斷抗性腫瘤的方法。文檔編號C07K16/18GK101448856SQ200780018441公開日2009年6月3日申請日期2007年3月28日優先權日2006年3月29日發明者梅甘·鮑德溫,漢斯-彼得·格伯,法博德·肖杰伊,納波萊昂·費拉拉,鐘翠玲申請人:健泰科生物技術公司