專利名稱：：表達禽流感病毒的h5血凝素的重組新城疫病毒的制作方法表達禽流感病毒的H5血凝素的重組新城疫病毒本發明涉及一種帶有另外的轉錄單元的單股反鏈病毒目(Mononegavirales)病毒載體，該轉錄單元包括與上游的單股反鏈病毒目病毒基因起始(GS)序列和下游的單股反鏈病毒目病毒基因末端(GE)序列可操作連接的異源基因。本發明進一步涉及一種生產這種重組單股反鏈病毒目病毒載體的方法，并涉及包括這種單股反鏈病毒目病毒載體的疫苗。能在受感染宿主中復制的活病毒，誘導抗它們表達的抗原的強而且持久的免疫應答。它們有效地引起體液和細胞介導的免疫應答，而且刺激細胞因子和趨化因子通道。因此，活的，減毒病毒提供優于基于滅活或亞基免疫原的疫苗組合物的顯著優點，這些疫苗組合物一般主要只刺激免疫系統的體液性抗體手臂(humoralarm)。過去的十年，重組DNA技術已經使DNA與RNA病毒基因組的遺傳工程領域都發生巨大變化。尤其是，引入外源基因到病毒的基因組中現在是可能的，以便新的載體病毒在宿主動物中復制以后，外源基因緊接著表達，在宿主動物中發揮生物學作用。因而，重組載體病毒已經不僅開發用于控制和預防微生物引起的感染，而且用于設計靶治療用于非微生物引起的疾病如惡性腫瘤和基因治療中。通過命名為"反向遺傳學"的技術，完全來自克隆的cDNA的非節段性，負鏈RNA病毒(單股反鏈病毒目目的病毒)的產生(其于1994年首次報道(Schnelletal.，EMB0J13，4195-4203，1994))已經使利用單股反鏈病毒目(MV)的病毒作為栽體成為可能。其后，描述利用MV目的許多病毒作為病毒栽體，以表達來源于病原體的外源抗原的研究已經公開，其目的在于開發抗該病原體的疫苗。單股反鏈病毒目目劃分成4個主要家族副粘病毒科(paramyxoviridae)，彈狀病毒科(Rhabdoviridae)，纖絲病毒科(Filoviridae)和玻那病毒科(Bornaviridae)。屬于這些家族的病毒具有由單股，負(-)正義RNA分子表示的基因組，也即，該RNA基因組的極性與指定為正(+)正義的信使RNA(mRNA)的極性相反。主要的人與獸醫學MV病毒的分類列于下表中表l:單股反鏈病毒目目內病毒的分類<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>目前非常了解，而且多個作者綜述了MV目的病毒的基因組結構和生活周期細節(Neumannetal.，J.Gen.Virology83，2635-2662，2002;Whelanetal.,Curr.Top.Microbiol.Immunol.203，63-119,2004;Conzelmann，K.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.203，1-41，2004)。盡管單股反鏈病毒目病毒具有不同的宿主和不同的形態學和生物學特性，但是它們具有許多共同的特征，如基因組結構和它們的一般復制和基因表達模式所必要的元件，這說明它們起源于一個共同的祖先。它們是包膜病毒，其在細胞的胞漿中復制，并產生沒有剪接的mRNA。單股反鏈病毒目病毒由兩個主要的功能單元組成，核糖核蛋白(RNP)復合體和包膜。已經確定了上述所有家族的屬的典型病毒的全部基因組序列。基因組大小為大約9.OOO個核苷酸到大約19.OOO個核苷酸，而且它們包含5到10個基因。MV病毒的基因組的結構和構造是很類似的，而且取決于它們特別的基因表達模式。所有的MV病毒基因組包括3個核心基因，其編碼核蛋白(N或NP)，磷蛋白(P)和依賴于RNA的RNA聚合酶(L)。病毒包膜由基質(M)蛋白和一種或多種跨膜糖蛋白(例如G，HN和F蛋白)組成，跨膜糖蛋白在病毒裝配/出芽以及在細胞附著和/或病毒侵入中發揮作用。取決于屬，通過在轉錄和病毒復制中顯示某些特異性調節功能，或涉及病毒宿主反應的輔助蛋白(例如，C，V和NS蛋白)，來擴展蛋白庫。MV病毒的基因順序是高度保守的，在位于3，末端或其附近的核心基因N和P，而且在5，遠端位置的大(L)基因。M，表面糖蛋白基因，以及其它的輔助基因，位于N，P與L基因之間。在RNP復合物中，基因組或反基因組RNA用N蛋白緊密包裹，并與由L和P蛋白組成的依賴于RNA的RNA聚合酶相關。感染細胞以后，RNP復合物，而不是棵露的RNA基因組，用作兩個不同的RNA合成功能的模板，也即亞基因組mRNA的轉錄和全長基因組RNA的復制。所有串聯排列的基因，通過所謂的"基因連接"結構隔開。基因連接包括一個保守的"基因末端"(GE)序列，一個非轉錄的"基因間隔區"(IGR)和一個保守的"基因起始"(GS)序列。這些序列都是基因轉錄足夠的和必需的。轉錄期間，每個基因通過依賴于病毒RM的RNA聚合酶連續轉錄成mRNA，該RNA聚合酶在第一個GS序列的基因組RNA的3'末端起始轉錄過程。在每個基因連接中，由于GE序列上的RNA聚合酶的脫離，轉錄被中斷。在隨后的GS序列上發生轉錄的重新起始，盡管以降低的效率。由于這種中斷的過程，也稱為"終止-起始，，過程，轉錄減弱發生在每個基因連接中，結果MV病毒基因組中3，近端的基因比連續的下游基因轉錄得更多。MV病毒基因轉錄的模形式，其中每個基因是獨立的順反子或轉錄單位的部分，使這些病毒非常適基因組中的每個轉錄單位包括下列元件3，-GS-開放閱讀框(0RF)-GE-5，。在3，-和5，基因組末端，所有的MV病毒基因組具有短的非轉錄區，其分別稱為"前導"(大約40-50nt)和"尾隨，，(大約20-600nt)。前導和尾隨序列是必需的序列，其控制基因組RNA的復制，病毒衣殼化和包裝。反向遺傳學技術和感染性MV病毒的拯救，已經使通過它的cDNA拷貝操作它的RM基因組成為可能。合成病毒RNA所需的最小復制起始復合物，是RNP復合物。感染性MV病毒可以通過(反)基因組RNA，和來自(T7)RNA聚合酶驅動質粒的合適支持蛋白的細胞內共表達拯救。1994年Schnell等的初步報告，1994(上文)，根據原來的方案(或其輕微的改變)，已經實現了許多MV病毒種的可靠回收。新城疫和禽流感是禽類的重要疾病，其可能在養禽業世界范圍內引起嚴重的經濟損失。新城疫病毒是MV目內的一種非節段的，負鏈RNA病毒。基因組，其長度為大約15kb,包含6個基因，其編碼核蛋白(NP)，磷蛋白和V蛋白(P/V)，基質(M)蛋白，融合(F)蛋白，血凝素-神經氨酸酶(HN)蛋白和依賴于RNA的RNA聚合酶或大(L)蛋白。NDV基因以3'-NP-P-M-F-HN-L-5，的順序連續排列，并被不同長度的基因間隔區隔開。所有的基因放在基因起始(GS)序列之前，其后面是非編碼區，編碼NDV蛋白的開放式閱讀框，第二個非編碼區和基因末端(GE)序列。NDV基因組的長度是6的倍數，其對于引入外源基因是必須考慮的。禽流感(AI)是一種禽類疾病，其特征在于從輕微呼吸性跡象到高死亡率的嚴重疾病。致病因子是屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的禽流感A病毒(AIV)。AIV包含編碼10個蛋白的8個負極性的基因組RNA節段。根據表面糖蛋白血凝素(HA)和神經氨酸酶(N)的抗原性，對AI病毒劃分了亞型。迄今為止，16個血凝素(H1-H16)和9個神經氨酸酶(Nl-N9)亞型是已知的。H和N的抗體在體液免疫應答中是重要的，并抑制感染或預防疾病。禽流感和新城疫病毒，根據它們的毒性，可以劃分成兩個不同的致病型。由低致病的AIV(LPAI)或緩發型NDV引起的癥狀認為較少相關。相反，由高強毒病毒(NDV:中發型和速發型菌抹)引起的高致病的禽流感(HPAI)和新城疫，是須申報的疾病。盡管用緩發型NDV菌林進行抗NDV的常規疫苗接種，以保護雞抗高毒性的NDV菌林，但是在大多數國家不進行抗HPAI的疫苗接種，因為通過根除策略控制HPAI。但是，疫苗接種可用作一種策略，來最小化損失和降低發病率。疫苗誘導的免疫性是亞型特異性的，其指亞型H5疫苗可以保護免遭H5AIV，但是不能保護免遭其它的H亞型。通常，流感病毒復制只限于肺，因為LPAI病毒的血凝素只能被類胰蛋白酶Clara裂解，類胰蛋白酶Clara是一種局限于肺的絲氨酸蛋白酶。至今，所有的HPAI病毒都是H5和H7亞型。這些HPAI病毒在H切割位點包含許多堿性氨基酸，因此它可以被普遍存在的弗林蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶樣酶裂解成HAi和肛2亞基。這種病毒因此可以在其他的器官中生長。H5和H7亞型疫苗可以為雞和火雞提供保護，免遭HPAI感染以后的臨床征象和死亡。除了常規滅活的基于油的全AIV以外，載體病毒，亞基蛋白和DM疫苗已經用實驗方法顯示有效用于抗AI的免疫。自用于各種病毒的反向遺傳學出現以來，生產用作疫苗載體的重組病毒是一種重要的應用。已經構建了表達外源蛋白的各種重組負鏈RM病毒。并且，AIV的血凝素被插入道各種載體病毒中如傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)(Luschowetal.，Vaccine19，4249-59，2001)，牛瘋病毒(Walshetal.，J.Virol.74，10165-75，2000)和水泡性口膜炎病毒(VSV)(Robertsetal.，J.Virol.247，4704-11，1998)。NDV也用于表達AIV血凝素。流感A/WSN/33的血凝素基因被插入到NDV菌抹HitchnerB1的P與M基因之間。這些重組體保護小鼠免受致命感染，盡管在小鼠中存在可檢測的體重減輕，其在IO天內完全恢復(Nakayaetal.J.Virol.75，11868-73，2001)。具有用于外源基因的相同插入位點的另外的重組NDV，表達LPAI的H7，但是僅僅40°/。的接種雞#皮保護免于速發型NDV和HPAI(Swayneetal.，AvianDis.47，1047-50，2003)。流感HA蛋白，被合成作為前體蛋白(HA。)。前體多肽HA。在保守的精氨酸(Arg)殘基處，被翻譯后裂解成兩個亞基，HAi和HA2。這種裂解有助于病毒的傳染性。(HA前體被裂解得越有效，病毒似乎越有毒力)。已經對不同流感病毒的HA,-HA2連接區進行了分析。發現致病菌林包含與切割位點鄰近的堿性氨基酸序列。(Senneetal.,AvianDiseases,40:425-437，1996;Steinhauser，Virology,258，1-20，1999;KawaokaandWebster,Proc.Nat1.Acad.Sci.USA,85，1988.)。在流感疫苗應該提供的保護方面，高致病病毒是尤其重要的。然而，當這類蛋白，也即，蛋白如致病的H5流感的HA蛋白(在它們的序列中具有堿性的氨基酸序列)插入到單股反鏈病毒目栽體中時，遇到某些問題。首先，基因序列似乎某種程度地不穩定。在NDV載體的幾次繼代之后，該栽體中已經插入了H5基因(NDVH5)，在編碼氨基酸的堿性序列的基因序列部分中發生自發突變。而且，這種堿性氨基酸序列的編碼序列，可能包含被mononegavirus識別為一種基因末端(GE)序列的序列。Whelan提供了單股反鏈病毒目的GE序列的綜述(Curr.Top.Microbiol.Immunol283，61-119,2004)。Monegavirales的GE序列的特征在于共同的保守序列:nUUUU。發現堿性氨基酸序列的編碼序列的部分，如存在于致病性H5型禽流感病毒的HA蛋白的裂解位點附近，與被單股反鏈病毒目載體的聚合酶識別為GE序列的GE序列類似。這可能導致全長蛋白降低水平的蛋白表達，其可能影響基于這種載體的疫苗的功效。本發明的一個目標是提供一種重組MV病毒載體，其顯示由外源基因編碼的蛋白的較高表達水平，該外源基因插入到載體病毒的基因組中，和/或顯示比已知MV病毒載體增加的免疫原性。本發明人已經發現，本發明的重組單股反鏈病毒目病毒可滿足這個目標。本發明提供了一種生產帶有另外的轉錄單位的重組單股反鏈病毒目病毒載體的方法，該轉錄單位包括與上游的單股反鏈病毒目病毒基因起始(GS)序列和下游的單股反鏈病毒目病毒基因末端(GE)序列可操作連接的外源基因，特征在于該外源基因編碼一種蛋白，該蛋白包括至少3個堿性氨基酸的伸展序列，所述伸展序列由精氨酸(Arg)和/或賴氨酸(Lys)殘基組成，并至少l個賴氨酸，其中外源基因的核苷酸序列通過它不包含可以被單股反鏈病毒目病毒的病毒聚合酶識別為基因末端(GE)序列的序列的方式選擇。可以被單股反鏈病毒目病毒的病毒聚合酶識別為基因末端序列的序列，是包含單股反鏈病毒目的大多數GE序列共有的最小保守序列的序列，即a/uCUUUU(在負正義中，其是Mononegavirus的基因組正義(genomicsense))。在正正義中(cDNA7JC平)，該基序是t/aGAAAA。對于使用的特定單股反鏈病毒目載體，將應用本領域已知的特異性GE序列(Whelanetal.上文)。對于例如NDV，Whelan中所列的GE序列是aaucUUUUUUu。(-正義，其是單股反鏈病毒目的基因組正義(genomicsense))。在+正義中(cDNA水平)，該序列因此特征在于腺嘌呤殘基的伸展序列gAAAAAA。在本發明的載體中，這種GE序列不存在于外源蛋白的編碼序列內。本領域技術人員有幾種選擇來實現該目標。可以選擇這樣的外源序列，其本來不含有可被單股反鏈病毒目病毒的病毒聚合酶識別為基因末端(GE)序列的序列。例如，當外源基因序列編碼病毒蛋白時，可從病毒林獲得該外源基因，該病毒林天然攜帶編碼這種蛋白的基因，該蛋白的編碼序列不包含可能的GE序列(但是另一個病毒抹中的相同基因含有可能的GE序列)。但是，由于可以從野生型病毒獲得這種變體基因序列的機會較低，優選通過位點定向誘變使外源基因的野生型序列發生突變，來改變序列到這種可能的GE序列不再存在的程度。得到的重組單股反鏈病毒目病毒載體同樣是本發明的一部分，其中外源基因編碼包含至少3個堿性氨基酸的伸展序列的蛋白，所述的伸展序列由精氨酸(Arg)和/或賴氨酸(Lys)殘基組成，并包含至少1個賴氨酸，該外源基因不包含可被單股反鏈病毒目病毒的病毒聚合酶識別為基因末端序列的序列。需要修飾的外源基因的部分，特別是在當外源蛋白是致病性H5禽流感病毒的HA蛋白的情形中，可以是編碼至少3個堿性氨基酸的伸展序列的野生型外源基因序列的部分。堿性氨基酸的伸展序列，限定為包含選自賴氨酸(單字母代碼K)和精氨酸(單字母代碼R)的至少3個氨基酸，其中至少1個氨基酸殘基是賴氨酸。這將包括KKK序列，和2K與1R的組合(KKR，KRK,RKK)，以及1K與2R的組合(KRR，RKR和RRK),而且這里也提到了包括特定的3個氨基酸序列的較長的堿性伸展氨基酸序列。如可以從Steinhauser等(上文)看到的，鄰近致病性流感病毒的HA蛋白中的裂解位點的堿性伸展氨基酸序列可以更長，而且可包括序列如RRKKR或RRRKK。編碼賴氨酸的密碼子是aaa和aag，而編碼精氨酸的密碼子包括aga和agg。已經發現，特別是在H5致病性禽流感病毒的HA蛋白的編碼序列中，編碼鄰近該蛋白的裂解位點的堿性伸展氨基酸序列的編碼序列，可包含GE基序t/aGAAAA。為了修飾存在于野生型外源基因中的GE序列，可以引入至少1個突變，借此GE序列內的腺嘌呤伸展序列的"A，，該GE序列具有共同的基序(t/aGAAAA),原來存在于野生型外源基因序列中)被另一個核苷酸取代。實際上，如果引入突變到"aaaa"序列段中，該"aaaa，，序列段是公認為GE序列的序列的一部分，至少1個腺噪呤核苷酸將必須被另一個核苷酸取代(例如，胍("g，，))。當通過定點誘變改變序列時，這些改變優選是沉默的(意思是該突變沒有導致氨基酸水平的突變)。但是，核酸水平的突變，其導致氨基酸水平的保守突變(指一個堿性氨基酸被另一個堿性氨基酸取代，例如，L變成R,或者R變成L)，也是可接受的。例如，當在編碼堿性氨基酸伸展序列的野生型基因序列的部分中，至少一個賴氨酸殘基由密碼子"aaa"編碼時，在插入到本發明栽體中的修飾的外源基因中，這個密碼子可以突變成"aag"。或者，當在野生型序列中，形成堿性氨基酸伸展序列的部分的特定精氨酸殘基由"aga"編碼時，在成為本發明載體的部分的基因中，這個密碼子可以突變成"agg"。在野生型序列中，至少一個"aaa，，密碼子(編碼賴氨酸)可以被突變，以產生修飾的外源基因序列，其被整合到本發明的載體中。這種突變可包括"aaa"密碼子被"aag"密碼子取代。這樣的載體是優選的，即其中例如堿性氨基酸伸展序列包括并排的(inrow)至少兩個賴氨酸，而且其中這些賴氨酸中的至少一個由密碼子"aag"編碼，但是可以進行兩個或多個突變。例如，當編碼序列包含并排的兩個"aaa"密碼子時，兩個都可能,皮"aag"密碼子取代。特別是考慮到得到的載體的所需穩定性時，優選引入至少兩個突變到外源基因中。當外源基因包含并排的兩個"aaa，，密碼子時，兩個都優選被突變，而且可以被aag密碼子取代。用其中編碼堿性氨基酸伸展序列的外源基因的部分包含一個突變的栽體，獲得了好的結果，其中所述突變存在于每個都編碼堿性氨基酸的3個或4個連續密碼子中。在其中堿性伸展序列僅僅包含3個氨基酸的情況中，可進行3個突變，但是當存在4個堿性氨基酸或更多時，可進行更多突變。例如，當野生型序列包含氨基酸序列RRKK時，其由核苷酸序列agaagaaaaaaa編碼(+正義序列，其中在可能的GE序列基序下劃線)，該編碼序列可以突變成仍然編碼RRKK的ag￡ag￡aagaag。單股反鏈病毒目病毒載體優選為新城疫病毒(NDV)載體，外源基因為致病性H5禽流感病毒的HA蛋白。用NDV載體獲得了好的結果，其中已經整合了修飾的致病性H5禽流感的HA基因(NDVH5m)。HA基因已經整合到NDV載體的NDV融合(F)與血凝素-神經氨酸酶(HN)基因之間的基因間隔區中。HA基因是修飾的H5基因，其中根據本發明的方法，野生型"agaagaaaaaaa"序列已經變成"aggaggaagaag，，序歹甘。該載體產生顯著更多的全長HA轉錄物，表達顯著較高水平的HA，而且在它的包膜中還包含更多的HA蛋白。而且，NDVH5m在超過10次繼代都穩定表達修飾的HA基因。用NDVH5m免疫接種雞，誘導NDV-與AIVH5-特異性抗體，并在分別用致死劑量的速發型NDV或高致病性AIV攻擊以后，保護雞抗臨床疾病。值得注意地，沒有觀察到流感病毒的排毒。而且，用NDVH5m免疫接種，容許根據抗AIV的核蛋白(NP)的抗體，對接種的和AIV領域病毒感染的動物進行血清學區分。因此，重組NDVH5m適合作為抗NDV和AIV的二價疫苗，而且可用作標記疫苗用于控制禽流感(AI)。用于制備重組MV病毒載體的方法(該載體帶有包含外源基因的另外的轉錄單位)是本領域公知的。更特別地，在該方法中，分離的核酸分子和MV病毒的基因組，以它們的cDNA形式(+正義)使用。這允許容易的操作和插入想要的核酸分子到病毒基因組中。一般，基因組的不同部分可用于在兩個基因之間插入外源基因，也即基因間隔區(IGR)，基因的3，或5，非編碼區，以及基因組的3，啟動子近端(N/NP基因之前)或5，遠端(L基因之后)中。外源基因可以有利地插入到N/NP基因之前，NP-P，P-M，M-G/F,G/F-HN，HN-L之間，和L基因之后。最簡單的方法是使用已經現有的限制性內切酶(RE)識別序列，在這些位點之一用酶進行切割并引入合適的轉錄盒。由于天然存在的限制性內切酶識別序列并不總是位于預定位置，通常可以通過定點誘變或PCR誘變，把RE識別位點引入到基因組中。待插入的轉錄盒的組成取決于插入的位點。例如，在轉錄盒被插入到IGR中的情況中，轉錄盒可以包含下列元件3'RE識別位點-GS-非編碼區-0RF(外源基因的)-非編碼區-GE-RE識別位點5，。做為選擇，在引入轉錄盒到天然MV病毒基因的V非編碼區的情況中，轉錄盒可由以下物質組成3，RE識別位點-GE-IGR-GS-非編碼區-0RF(外源基因的)-非編碼區-RE識別位點5，。類似地，在引入轉錄盒到天然MV病毒基因的3'非編碼區的情況中，轉錄盒可由以下物質組成3，RE識別位點-非編碼區-0RF(外源基因的)-非編碼區-GE-IGR-GS-RE識別位點5，。這種轉錄盒的制備和將其插入到MV病毒基因組中，只涉及常規的分子生物技術，如所列的參考文獻中和本實施例中例示的。特別地，技術如定點誘變和PCR誘變可用于該目的(Peetersetal.，1999，上文；CurrentProtocolsinMolecularBiology,eds.:F.M.Ausubeletal.，WileyN.Y.，1995版，頁碼8.5.1.—8.5.9;和Kunkeletal.，MethodsinEnzymologyVol.154，376-382，1987)。更特別地，本發明的重組MV病毒載體，可通過沿用已久的"反向遺傳學"的方法制備，其能進行MV目的非節段，負鏈RNA病毒的遺傳修飾(例如Conzelmann，K丄的綜述，CurrentTopicsMicrobiol.Immunol.203，1-41，2004;andWalpitaetal.，FEMSMicrobiol.Letters244，9-18，2005)。在該方法中，合適的細胞，在足以容許MV(反)基因組和支持蛋白轉錄和共表達，以及重組MV載體產生的條件下，通過包括含有編碼MV病毒的全長基因組，或者，優選，反基因組(正正義)的核苷酸序列的cDNA分子的栽體，和一種或多種包括含有編碼所需支持蛋白的核苷酸序列的cDNA分子的載體共轉染。在該方法中，編碼全長MV病毒(反)基因組的所述核酸分子，包括如上所述限定的另外的轉錄單位。載體指復制子，如質粒，噬菌體或粘粒，另一個DNA節段可能附著到其上，以便引起附著的DNA節段在用該載體轉染的細胞中復制和它的轉錄和/或表達。優選地，用于全長基因組轉錄的載體是質粒，其包括編碼MV病毒的(反)基因組的cDNA序列，旁臨為位于它的5'末端的T7聚合酶啟動子，和位于它的3，末端的(肝炎Delta)核酶序列，盡管也可以使用T3或SP6RNA聚合酶啟動子。對于合適的支持蛋白的細胞內表達，優選使用包括編碼這些蛋白的cDNA序列的質粒，在合適的表達調控序列例如T7聚合酶啟動子的調控下進行。在用于制備本發明的重組MV病毒載體的一種特別優選的方法中，使用編碼MV病毒的N(或NP)，P和L蛋白的表達質粒。用于這種反向遺傳學技術的轉染支持質粒的量或比例，覆蓋了一個較大的范圍。用于支持質粒N:P:L的比例范圍可以為大約20:10:1到1:1:2，而且每種病毒的有效轉染方案是本領域已知的。通過T7RNA聚合酶啟動子和核酶序列的共同作用，使基因組RNA的精確拷貝在轉染的細胞中進行，而且該RNA接著被共轉染表達質粒提供的病毒支持蛋白包裝并復制。由感染轉染細胞的重組牛痘病毒，尤其是由牛痘病毒vTF7-3，提供T7聚合酶酶是優選的，可是其他的重組痘栽體，如禽痘病毒，例如fpEFLT7po1,或其他的病毒載體也可用于T7RNA聚合酶的表達。來自牛痘病毒的拯救病毒的分離，可以通過簡單的物理技術如過濾很容易地完成。對于仙臺病毒或NDV的拯救，可通過在具胚的卵中接種轉染細胞的上清液來完成。在一個更加優選的實施方案中，細胞系用于轉錄和表達載體的轉染，所述載體組成型表達(T7)RNA聚合酶和/或一個或多個所需的支持蛋白。例如，麻疹病毒的拯救可以在人胚腎細胞系，293-3-46中完成，其表達T7RNA聚合酶和麻療病毒支持蛋白N和P(Radeckeetal.，EMB0J.14，5773-5784，1995)。可有利地用于本發明的另一個4艮有用的細胞系，是基于BSR的細胞，其表達T7RNA聚合酶，也即BSR-T7/5細胞系(Buchholzetal.，J.Virol.73，251-259，1999)。而且，Conzelmann,K.K.(上文)的綜述和實施例1中，^>開了這里用于制備本發明的MV病毒的關于反向遺傳學技術的更詳細的信息。重組MV病毒載體穩定表達外源基因的能力，已經導致了用于預防和治療應用的載體的發展。在本發明的重組MV病毒載體中，外源基因可以根據特定的MV病毒載體種類和病毒載體的應用而改變。外源基因可以編碼(其他的)微生物病原體(例如病毒，細菌或寄生蟲)的抗原，特別是外源基因編碼能引起保護性免疫應答的病原體的抗原。例如，可以插入到本發明的病毒載體中的異源基因序列包括，但不限于流感病毒糖蛋白基因，尤其是，禽流感病毒的H5和H7血凝素基因，來源于傳染性嚢病病毒(IBDV)的基因，特別地(IBDV)的VP2,來源于傳染性支氣管炎病毒(IBV)，貓白血病毒，犬瘟熱病毒，馬傳染性貧血病毒，狂犬病病毒，埃利希氏體屬生物體，特別是犬埃里希氏體，呼吸道合胞病毒，富'J流感病毒，人metapneumoviruses和麻滲病毒的基因。做為選擇，外源基因可以編碼多肽免疫調節劑，其能例如通過共表達細胞因子如白細胞介素(例如IL-2，IL-12，IFN-y，TNF-ot或GM-CSF)增強或調節對病毒感染的免疫應答。MV目包括能在人和動物，或在二者(例如，狂犬病病毒和新城疫病毒)中復制的病毒。因此，外源基因可以選自各種人和獸醫學微生物病原體。盡管所有的MV病毒都可用作本發明的病毒載體，在本發明的一個優選的實施方案中，重組MV病毒載體分別是彈狀病毒科的病毒，優選狂犬病毒屬或彈狀病毒屬的病毒，更優選狂犬病病毒或IHNV種。在一個也優選的實施方案種，重組MV病毒是副粘病毒科，優選Respovirus屬，特別是hPIV3或bPIV3種；Morbillivirus，特別是CDV種；Pne認ovirus,特別是RSV種；和Avulavirus,特別是NDV種的病毒。在本發明的一個特別優選的實施方案中，提供了一種重組MV病毒載體，其中病毒是新城疫病毒(NDV)。由于NDV能在人和動物中，特別是禽類，更特別地雞中復制，本發明的重組NDV載體可包含編碼病原體，特別是呼吸病原體的抗原的外源基因，或包含編碼能在人或任何這些動物中引起合適的免疫應答的免疫調節劑的外源基因。Peeters等(J.Virology73，5001-5009，1999)，R6mer-0berdrfer等(J.Gen，Virol.80，2987-2995，1999)，以及Conzelmann，K.K.(上文)的綜述中，已經公開了特別用于NDV的，NDV的遺傳操作的反向遺傳學方法。而且，已知NDV可用作栽體用于外源基因的表達，例如，用于在用NDV載體感染的動物中引起免疫應答(Nakayaetal.，2001，上文)和Swayneetal"AvianDis.47，1047-50，2003)。外源基因可以有利地引入到NDV基因組中的不同位置，如上面對MV病毒的一般描述的。特別地，在本發明的重組NDV載體中，外源基因(作為合適的轉錄單位的部分)，可以插入到下列NDV基因之間NP-P，P-M，M-F，F-HN，HN-L，而且位于3，近端-和5，遠端的基因座(Zhaoetal.，2003，上文；Nakayaetal.,2001，上文)，優選位于3，近端，P-M，M-F和F-HN區，F-HN區是最優選的。在本發明的一個特定的實施方案中，提供了一種重組NDV載體，其中另外的轉錄單位位于F-HN基因之間。本發明的重組NDV栽體，可有利地用于在禽類，特別是雞中，誘導抗其他的病原體的免疫應答。因此，重組NDV載體，優選包括編碼禽病原體，特別是流感病毒，馬立克氏病病毒(MDV)，傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)，傳染性支氣管炎病毒(IBV)，傳染性嚢病病毒(IBDV)，雞貧血病毒(CAV)，reo病毒，禽逆轉錄病毒，家禽腺病毒，火雞鼻氣管炎病毒(TRTV)，大腸桿菌，Eimeriaspecies,Cryptosporidia,支原體如M.Gallinarum，M.synoviae和M.meleagridis，Salmonella-，Campylobacter-,Ornithobacterium(ORT)或Pasteurellasp的保護性抗原的外源基因。更優選地，重組NDV載體包括編碼AIV,MDV，ILTV，IBV，TRTV，大腸桿菌，ORT或支原體的抗原的外源基因。特別地，重組NDV載體突變體包括流感病毒，優選禽流感病毒(AIV)，更優選高致病性AIV的血凝素(HA)基因，特別是H5或H7AIV的HA基因。原則上，所有的(禽)流感林的HA基因都可用于本發明。本領域已經公開了許多HA基因的核苷酸序列，而且相關的HA基因可以從核酸序列數據庫，如GenBank或NCBI數據庫重新得到。如上所述，最近分離的，高致病性H5N2亞型AIVA/雞/Italy/8/98的血凝素(HA)基因，可有利地用作本發明中的外源基因。在真核表達載體pcDNA3(Invitrogen)中逆轉錄，克隆該基因，并進行測序(Luschowetal.，Vaccine,vol.19，p.4249-4259，2001，GenBank登錄號AJ305306)。使用產生人工的RE識別位點的特異性引物，該位點允許把HA基因插入到NDV基因組序列中，從獲得的表達質粒pCD-HA5，通過擴增，可以獲得HA基因。在另一個實施方案中，如上所述，高致病性H7N1亞型AIVA/雞/Italy/445/99的HA基因，可用作本發明的外源基因。HA基因進行逆轉錄，并通過PCR擴增。1711bp產物克隆到Smal消化的栽體pUC18(Amersham)中，并進行領'J序(Veitsetal.，J.Gen.Virol.84.3343-3352，2003;和GenBank登錄號AJ580353)。在本發明的一個特別有利的重組MV病毒載體中，MV載體病毒是減毒的，那就是說，載體病毒對于靶動物是不致病的，或者與野生型病毒相比，顯示毒性的大幅度削減。這里使用的許多MV病毒如病毒載體，具有如活的減毒疫苗如麻滲病毒和NDV—樣的長安全記錄，但是其他的病毒，如SeV和VSV認為對人是不致病的。此外，傳統方法存在以獲得和篩選減弱病毒，其顯示有限的復制或傳染可能性。這種技術包括在異源的基質中連續(冷)傳代病毒，和化學誘變。本發明的重組NDV載體可來源于任何常規的ND疫苗林。這種商業可獲得的ND疫苗中存在的適合的NDV林的例子是Clone-30,LaSota，HitchnerBl,NDW，C2和AV4;Clone-30是優選的林。本發明人還發現，本發明的重組MV病毒載體，能在動物中誘導保護性免疫應答。因此，在本發明的另一個實施方案中，提供了抗微生物病原體的疫苗，其包括如上限定的活或滅活形式的重組MV病毒載體，和藥學上可接受的載體或稀釋劑。本發明的疫苗可通過常規方法制備，如通常用于商業可獲得的活和滅活MV病毒疫苗的那些方法。簡要地，用重組MV病毒載體接種敏感的基質并繁殖，直到病毒復制到想要的滴度，然后收獲含有病毒的物質。接著，把收獲的物質配制成具有免疫特性的藥物制品。能支持重組MV病毒載體復制的每種基質，都可用于本發明。作為基質，可使用來自于原核和真核來源的宿主細胞，取決于MV病毒。合適的宿主細胞可以是脊推動物，例如，靈長類動物的細胞。適合的例子是人細胞系HEK,WI-38,MRC-5或H-239，猿細胞系Vero,嚙齒類動物細胞系CH0，BHK,犬細胞系MDCK或禽CEF或CEK細胞。本發明的重組NDV載體可以在其上面繁殖的特別適合的基質是SPF具胚的卵。具胚的卵，可以用例如0.2mlNDV接種，其包括每個卵中含有至少102°EIDs。的尿嚢液。優選的，9到ll天的具胚卵，用大約105°EIDs。接種，并接著在37C孵育2-4天。2-4天以后，優選可通過收集尿嚢液，收獲ND病毒產物。通過過濾器(100pm)過濾上清液之后，液體其后可以2500g離心10min。本發明的疫苗包括與藥學上可接受的載體或通常用于這種組合物的稀釋劑一起的重組MV病毒載體。可以懸浮液的形式或冷凍干燥的形式，制備和銷售包含活病毒的疫苗。栽體包括穩定劑，防腐劑和緩沖液。稀釋劑包括水，含水的緩沖液和多元醇。在本發明的另一個方面中，提供了包含滅活形式的重組MV病毒載體的疫苗。滅活疫苗的主要優點是它的安全，和可誘導的長期的高水平保護性抗體。繁殖步驟以后收獲的病毒滅活的目標是，消除病毒的繁殖。通常，這可通過/>知的化學或物理方法完成。如果需要，本發明的疫苗可包含佐劑。用于這種目的的適合的化合物和組合物的例子是氫氧化鋁，磷酸鋁或氧化鋁，基于例如礦物油的水包油或油包水乳劑，如BayolF⑧或Marco152@或植物油如維生素E醋酸鹽，和皂草苷。本發明疫苗的給藥可通過任何公知有效的形式進行，而且取決于MV病毒載體的類型。適合的給藥模式包括，腸胃外，鼻內，口服和噴霧接種疫苗。本發明的NDV栽體疫苗，優選通過通常用于NDV疫苗接種的廉價集中使用技術來施用。對于NDV疫苗接種，這些技術包括飲用水和噴霧疫苗接種。本發明的疫苗包括有效劑量的重組MV病毒載體作為活性組分，也即免疫MV病毒物質的量，其將在接種的禽類中誘導抗通過毒性微生物有機體的攻擊的免疫性。免疫性這里定義為，疫苗接種以后，相較于未接種的組，在人或動物群體中，誘導抗致死率和臨床癥狀的顯著較高水平的保護。特別地，本發明的疫苗預防大部分接種的人或動物，以防疾病的臨床癥狀和致死率的發生。一般地，活疫苗可以1()U-1()U組織培養/胚胎感染劑量(TC/EID5。)的劑量施用，優選以104°-10UTC/EID5o的劑量范圍。滅活疫苗可以包含104°-109°TC/EID5。的抗原同等物。本發明還包括聯合疫苗，其包括，除了本發明的重組MV病毒載體以外，能誘導保護以防另外的病原體的疫苗抹。附圖簡述圖1表達AIVH5的重組NDV的構建。轉錄調控信號通過灰色三角形用于轉錄起始進行標記，灰色矩形用于轉錄終止序列進行標記。NDV的HN0RF被AIV的H50RF取代，接著插入HN基因，如材料和方法中所述(步驟A-C)。重組NDVH5(步驟D)包含可信的HA序列，而重組NDVH5m攜帶HA，其中切割位點序列通過沉默突變改變(步驟E-F)。圖2NDV重組體產生的轉錄物的Northern印跡分析。感染8小時以后，制備用NDV克隆30(NDV)，NDVH5,NDVH5m或AIVA/雞/Italy/8/98(H5N2)感染的CEK細胞和未感染細胞(NI)的總RNA。在變性瓊脂糖凝膠中分離RNA，轉移到尼龍膜上，并用NDV-F(左邊)，AIV-H5(中間)和NDV-HN(右邊)的"P標記的基因特異性反義cRM雜交。6jig的各個RNA進行Northern雜交，除了中間印跡的AIV道外，其中僅僅點樣2jig,以避免過度的AIV信號。RNA標記的大小在左邊以千堿基(kb)表示。圖3在感染細胞中產生的，或整合到表達AIV的HA的NDV重組體中的蛋白的Western印跡分析。NDVClone30，NDVH5，NDVH5m或AIV(H5N2)的感染細胞(A)或純化病顆粒(B)的裂解物，用AIV亞型H5特異性抗血清(oc-AIV;上面板)，或用NDV特異性抗血清(ct-NDV;下面的板)孵育。用過氧化物酶綴合的第二抗體孵育以后，通過化學熒光顯示結合。標記蛋白的位置表示于左邊，AIV血凝素的未裂解(HA。)和加工的形式(HAi，HA2)表示于右邊。在AIV感染的細胞或病顆粒中，對應于NP/NA和M的另外的病毒蛋白也是可檢測的。圖4通過HI試驗(A，灰條)或通過IF試驗(A，白條)，測定HA特異性抗體。用速發型NDVHerts(B)或高致病性H5N2AIV(C，D)攻擊以后，用NDVH5m(H5m)免疫一次(B，C)或兩次(D)的雞，和對照動物(C)的死亡率和臨床指數。每天觀察動物的臨床征象，持續10天的時間，并劃分為健康的(O)，生病的(1)，嚴重生病的(2)，或死亡的(3)。計算臨床指數，其顯示每組這段時間的所有雞的平均值。圖5通過NP-ELISA進行血清學檢查。通過間接的NP-ELISA，以1:500的稀釋度，研究雞的血清。對用rNDV/AIVH5-BMUT免疫后(p.i.)21天收集的，和隨后AIV攻擊(p.c.)以后21d收集的雞血清的提高的P/N-比例進行繪圖。通過虛線標記2.0的截止值。實施例實施例1:包括未修飾的(野生型)H5基因和修飾的H5基因的NDV載體的構建和蛋白的表達。通過反向遺傳學構建表達H5亞型的禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)的新城疫病毒(NDV)。緩發型NDV林Clone30的基因組的克隆全長拷貝用于把編碼高致病性(HP)AIV分離物A/雞/Italy/8/98的HA的開放式閱讀框(H5N2，Genbank登錄號AJ305306)插入到NDV融合(F)基因與血凝素-神經氨酸酶(HN)基因之間的基因間隔區。3次繼代以后，NDVH5重組體的滴度與親代病毒Clone30的相似(109TCID5。/ml)，通過RT-PCR證實插入的H5基因的存在。為了證實外源基因的正確轉錄，進行Northern印跡分析(圖2)。盡管重組NDV與AIV(MN2)中的H50RF是相同的，克隆到NDV中的H5ORF的旁鄰為來源于HN基因的非編碼序列的大約270個核苷酸。因此，NDVH5與AIVmRNA之間的大小差異，分別與~2kb與1.7kbmRNA的預期大小很吻合(圖2，中間)。但是，NDVH5中出現了大約1kb的第二個轉錄物。(圖2，中間，第3道)。如Northern印跡分析顯示的，重組NDVH5m只產生預期大小的2kbHS轉錄物(圖2，中間，4道)，這證實NDVH5中的短轉錄物終止于HA切割位點，而且很可能只代表HAi區。由于修飾的結果，NDVH5m產生比NDVH5多1.8倍的全長HA(HA。)。AIV感染細胞中的全長HA轉錄物，分別比NDVH5m和NDVH5多3.4倍和6倍。不同于NDVH5的H5切割位點序列，其已經在5次傳代中改變，該區內的NDVH5序列在整個試驗的IO次傳代中都保持穩定(表l)。用NDVF和HN探針雜交證實旁鄰NDV基因的正確轉錄，因為親本NDVClone30的F與HNmRNA之間沒有大小差異(圖2)。而且，作為HA0RF插入的結果，只觀察到HN基因轉錄速率的輕微降低(圖2,右)。為了證實NDV重組體的AIVH5的特異性表達，對感染的CEF細胞進行間接IF試驗。用NDV特異性抗血清孵育，顯示用NDVClone30，NDVH5和NDVH5m感染的細胞中顯著的焚光，而用AIV-H5N2感染的細胞中沒有。另一方面，AIV亞型H5特異性抗血清，顯示在用AIV，NDVH5和NDVH5m感染的細胞中特異性表達H5，而用親本NDV感染的細胞是陰性的。盡管AIV感染細胞的H5表達強度顯著高于兩種重組體，但是發現NDV重組體的H5表達水平是顯著的。根據這個，只點樣多3倍的NDVH或NDVH5RNA量到RNA凝膠上，以獲得類似的雜交信號，示于圖2中(中間)，這表明AIV產生大約多3倍的轉錄物，和推測上這么多的蛋白。令人感興趣地，NDVH5m感染細胞的H5表達似乎比用NDVH5感染的細胞中更高效，其可歸因于取消了H5的成熟前轉錄終止的沉默突變。實施例2:AIVH5蛋白整合到NDV顆粒的包膜中。以前的研究表明，在缺乏特異性整合信號時，外源蛋白可能被動地整合到不相關病毒的包膜中(Kretzschmar，E.etal.，1997，J.ofVirology,vol.71，p.5982-5989)。由于這種被動整合的效率主要取決于蛋白的表達水平，我們確定了重組病毒表達的HA蛋白是否正確地裂解，并整合到NDV重組體的包膜中(圖3)。在兩種重組體感染的細胞中，AIV亞型H5特異性抗血清檢測到了大約70，50和25kDa的3種蛋白，其表示未裂解的HA。和裂解的HAi和HA2蛋白(圖3A)。這證明重組體表達的HA可接近蛋白水解酶。用NDVH5病毒感染的細胞中產生的總HA蛋白顯著低于NDVH5m的，而且NDVH5感染細胞總的HA2蛋白幾乎不能看見。正如所料，在NDVClone30感染細胞總沒有檢測到反應性，而在AIV-H5N2感染細胞中檢測到所有對應的HA蛋白種類。由于AI特異性血清抗完整病毒，推測相當于NP/NA和M的其他蛋白種類也在AIV感染的細胞中檢測到(圖3)。有趣地，純化病顆粒的Western印跡分析表明，HA蛋白有效地整合到兩種重組體的包膜中(圖3B)。雖然，對更多的NDVH5病毒蛋白進行了Western印跡分析，整合到NDVH5中的HA2蛋白的量仍然顯著低于NDVH5m病顆粒中的HA2。這證明NDVH5產生和整合少得多的HA2蛋白，大概是由于較少蛋白的可利用性(由于切割位點的成熟前終止的結果)。實施例3:攜帶AIVHA蛋白的重組NDV在雞中是安全的。測定給定的NDV分離物的毒性程度的一種靈敏方法，是腦內接種以后，確定病毒對1天齡雞的致病性(CEC(1992)OfficialJournaloftheEuropeanCommunityL260，1—20.)。最強的病毒將產生指數，其接近2.0的最大分數，而緩發型林將產生接近0.0的值。因為AIV的血凝素是重要的毒性決定子，測定NDVH5和NDVH5m的腦內致病性指數(ICPI)，以評估HPAI病毒的H5的表達是否改變NDV毒性。ICPI值是0.0，在兩種重組體的最大可能分數2之外，這證明除了它自身的蛋白外，AIVH5的表達沒有顯著影響NDV毒性。為了比較，緩發型NDV疫苗林的ICPI必須低于0.5，用于可能的活病毒疫苗應用。實施例4:表達AIVHA蛋白的重組NDV保護雞抗NDV和AIV攻擊。由于NDVH5m較高地表達H5蛋白，在動物試驗中只試驗了該重組體。重組體NDVH5因而以每只動物106EIDs。的劑量，通過眼鼻途徑，施用給25只3周齡的雞。觀察期間，所有的動物都保持健康，而沒有任何有害反應或任何疾病的臨床征象。如通過HI試驗所測定的，AIVH5特異性抗體于疫苗接種以后第14天在28。/。的血清中首次可檢測到，并在第21天增加到92%(圖4A)。但是，使用間接IF試驗，在免疫后第7天在96%的血清中，檢測到抗AI的免疫性的較早發生(圖4A)。為了測定單次疫苗接種的保護作用，5和10個接種動物的組，與合適數量的對照動物，分別進行抗NDV和AIV的第一輪致命攻擊。不出乎意料地，100%的接種動物被保護抗致命速發型NDV攻擊，而所有的對照動物在4天內死亡，其顯示典型的ND征象(圖4B)。高致病性AIV-H5N2攻擊感染，在非免疫雞中引起嚴重疾病，其死亡率為100%。相反，所有的NDVH5m免疫組動物經受致死劑量的高致病性AIV后幸存。10只雞中的7只保持完全健康，而3只動物顯示很輕^:的呼吸癥狀。但是，相較于對照組2.61的臨床分數，0.05的結果臨床分數是可以忽略的(圖4C)。為了確定加強疫苗接種在保護雞抗AI中的作用，剩余的10只雞在第一次疫苗接種以后42天接受第二次免疫，并在其后兩周進行攻擊。致死劑量的同源HPAI病毒以后，所有的動物完全防止臨床疾病，而所有的對照動物發展嚴重疾病，并在4天內死亡，其導致2.66的臨床分數(圖4D)。實施例5:NDV-AI疫苗減少AIV脫落(shedding):對于成功的AI疫苗，除了安全和有效預防疾病以外，該疫苗應該能有效預防病毒脫落。為了確定病毒脫落的數量，在攻擊后的不同時間，對氣管和泄殖腔拭子進行定量實時RT-PCR。攻擊后第2天，在兩個對照組的所有未免疫但是攻擊的雞中都檢測到病毒RNA。第一次與第二次AIV攻擊的對照雞的拭子的閾循環(Ct)值，分別為32.2-38.1與29.2-35.5。由于所有的對照動物在攻擊的4天內死亡，對該組沒有進行更進一步的試驗。相反，在大部分免疫動物中沒有檢測到vRNA(60個拭子中的49個)。實施例6:NP-ELISA檢測循環AIV:家禽常規疫苗接種的一個最大的擔憂，是疫苗接種可能使病毒能在禽類中未檢測到的循環。由于重組NDV疫苗只包含HA基因，基于高免疫原性核蛋白基因的ELISA，用于分析從攻擊之前和攻擊之后不同時間的接種動物收集的血清。盡管抗AIVNP的抗體，攻擊感染之前存在于所有動物的血清中，但是分別在AIV攻擊以后的第7和21天在90%和100%的雞中檢測到NP血清轉化(圖5)。這證明基于NP的ELISA試驗不僅能把接種的動物從感染動物區分開，而且便于在接種的禽類中檢測任何循環病毒。實施例7:實施例1-6的材料和方法。病毒和細胞前面已經描述了基于Clone-30疫苗株的重組NDV(Romer-Oberdorfer，A.，Mundt，E.,Mebatsion，T,，Buchholz，U.J.&Mettenleiter，T.C.(1999)，J.Gen.Virol.80(Pt11)，2987-2995.)。流感病毒分離物A/雞/Italy/8/98(H5N2)由I.Capua提供。速發型NDV林Herts33/56和NDVClone30疫苗(Nobi1is)獲自IntervetInt.BV，Boxmeer，TheNetherlands。病毒在無特異性病原(SPF)的10天齡具胚的雞蛋中繁殖。穩定表達噬菌體T7RNA聚合酶的BSR-T7/5細胞(Buchholz,U.J.，Finke，S.&Conzelmann，K.K.(1999)J.Virol.73，251-259)用于從cDM回收感染性NDV。初級雞胚胎成纖維細胞(CEF)，初級雞胚胎腎(CEK)細胞，或鵪鵓肌細胞(QM9-R)，用于研究蛋白表達和病毒復制。表達AIVH5基因的重組病毒的構建質粒pf1NDV-1，其表達Clone30的全長反基因組RNA(Romer-0berdorfer，A.，Mundt，E.，Mebatsion,T.，Buchholz,U.J.&Mettenleiter,T.C.(1999)J.Gen.Virol.80(Pt11)，2987-2995),用于引入AIVH5基因。首先，把Clone30基因組的Notl/BsiWI-片段(4953-8852nt)克隆到pUC18質粒中(步驟A，圖1)。然后使用引物MP1(5'-gacaacagtcctcaaccatggaccgcgccg-V，SEQIDNO:1)和MP2(5'-ctggctagttgagtcaatt^M^gagttggaaagatggc-3'，SEQIDNO:2)，引入新建的Ncol和AfIII位點(步驟B)。通過包含人工Ncol或AfIII限制性位點的特異性引物(PH5F2:5'-ccttccatggagaaaatagtgcttc-3'，SEQIDNO:3，和PH5R2:5'-SEQIDNO:4)，已經從質粒pCD-HA5(Luschow，D.,Werner,0.，Mettenleiter，T.C.&Fuchs，W.(2001)Vaccine19，4249-4259)擴增的AIVH5開放式閱讀框(0RF)，用于在利用NcoI和AfIII消化以后，取代Clone30的HNORF(步驟C)。而且，使用引物MP3(5'-caaaacagctcatggUcgtaatacgggUggacatgg-3'，SEQIDNO:5)和MP4(5'-gaaaaaactaccggcgatcgctgaccaaaggacgatatacggg-3z，SEQIDNO:6),將新的Sgfl-和SnaBI位點引入到L基因前面的基因間隔區中(步驟C)。使用引物MP3和MP5(5'-gaaaaaactaccg￡^￡^￡￡^tgaccaaaggacgatatacggg-3'，SEQIDNO:7)，產生了位于HN基因旁鄰類似的位點(步驟D)，用于克隆H50RF后的HN基因的目的(步驟E)。如圖1的步驟F所示，使用引物MPH5F2(5'-ggaatgtccctcaaagaaggaggaagaagagaggactatttggggc-3'SEQIDNO:8)，通過沉默突變對類似于NDV的轉錄終止序列的H5裂解序列進行修飾。最后，pflNDV-1的Notl/BsiWI-片段被從步驟E或F獲得的類似片段取代，以分別產生全長克隆NDVH或NDVHm(圖1)。得到的克隆的長度(17196個核苷酸)可被6分解，從而滿足"6的規則"。這里描述的所有誘變反應，都使用QuikChangeIIXL定點誘變試劑盒(Stratagene)進4亍。轉染和病毒回收為了回收表達AI的H5的重組NDV，4吏用Lipofectamine2000(Invitrogen),以1:1.5的DM:Lipofectamine2000比率，把全長克隆與表達NP，P和L蛋白的質粒一起轉染到BSR-T7細胞中。病毒繁殖和感染性病毒回收的確認，基本上如前面所述的進行(Romer-Oberdorfer，1999，supra;Engel-Herbert，I.，Werner,0.，Teifke，J.P.，Mebatsion，T.，Mettenleiter,T.C.&Romer-Oberdorfer，A.(2003)J.Virol.Methods108，19-28)。Northern印跡分析以每細胞10的感染復數(MOI)，用麗Clone30，NDVH5，NDVH5m或AIV-H5N2感染CEK細胞，并于37C孵育8h。如其它地方所述的，制備感染和未感染細胞的總RNA(Chomczynski，P.&Sacchi，N.(1987)AnalyticalBiochemistry162，156-159),在變性瓊脂糖凝膠中分離，并用放射性同位素標記的cRNA雜交(Fuchs，W.&Mettenleiter，T.C.(1996)J.Gen.Virol.77(Pt9)，2221-2229)。包含AIV-固2血凝素，NDVClone30F和HN的開放式閱讀框架的質粒，用于"P標記的cRNA的體外轉錄(SP6/T7轉錄試劑盒，Roche)。Western印跡分析以5的M01，用NDVClone30，NDVH5，NDVH5m或AIV-H5N2感染CEK細胞，并于37。C孵育30h。連續蔗糖梯度(30-60%)純化的感染細胞或病顆粒的裂解物，通過SDS-PAGE進行分離，并轉到硝酸纖維素濾膜上(Trans-BlotSDcell,Bio-Rad)。印跡用抗NDV的多克隆兔抗血清，或抗H5亞型的AIV的多克隆雞抗血清(IntervetInt.BV，Boxmeer，NL)進行孵育。使用SuperSignalWestPico化學發光基質(Pierce),在X光膠片(HyperfilmMP，Amersham)上，通過化學熒光檢測過氧化物酶綴合的種特異性第二抗體(Dianova)的結合。動物試驗根據歐洲共同體委員會指令中所描述的，通過測定1天齡雞中腦內致病性指數(ICPI),來確定NDV重組體的安全(CEC(1992)OfficialJournaloftheEuropeanCommunityL260，1-20.)。把106EIDs。的NDVH5m通過眼鼻施用給25只3周齡的SPF雞中，來進行疫苗接種實驗。為了評估單次疫苗接種以后，重組體的保護能力，5只接種的與5只另外的對照一起，接種以后3周用1053ELDs。的NDV林Herts33/56進行肌內攻擊。同樣，10只接種的與9只另外的對照動物一起用107'7EIDs。的高致病性AIV-H5N2進行眼鼻攻擊。剩余的IO只雞在第一次接種以后6周接受第二次免疫接種，并在其后2周，與5只另外的對照動物一起進行類似的AI攻擊。免疫接種和攻擊感染以后，每天觀察所有雞的臨床征象，觀察10天。通過實時RT-PCR進行病毒脫落分析收集口咽和泄殖腔拭子，以在攻擊以后第2，4，8和14天，通過實時RT-PCR分析AIV脫落。j吏用NucleoSpin試劑盒(Macherey-Nagel)，或者使用病毒■試劑盒(Qiagen)通過Tecan-Automat人工制備來自口咽或泄殖腔拭子的RNA。為了檢測攻擊感染以后的AIV脫落，使用基于M基因擴增的甲型流感病毒實時RT-PCR方法(18)。通過異源內部控制系統，檢查RT-PCR期間的RNA提取和抑制因子(19)。使用一步RT-PCR試劑盒(帶有鉑@了&8DNA聚合酶的SuperscriptIIIOne-stepRT-PCR系統(Invitrogen))，在MX30Q0p(Stratagene)循環儀上，進行雙重分析。溫度模式是50。C30min,94°C2min,接著進行42個循環的94*C30sec,57°C30sec和68匸30sec。HI和NP-ELISA:為了確定NDV和AIVH5抗體的存在，在第0，7,14和21天收集血樣，并進行血細胞凝集-抑制(HI)試驗，如歐洲共同體委員會指令所述(CEC(1992)OfficialJournaloftheEuropeanCommunityL260，l-20;CEC(1992)OfficialJournaloftheEuropeanCommunitiesL167，1-1620,21)。為了確定免疫接種以后AIV-H5的存在，通過用AIV感染的CEF孵育血清的1:100稀釋物，血清另外用于間接免疫熒光(IF)。通過基于核蛋白的酶聯免疫吸附測定(ELISA)(NP-ELISA)，研究抗AIV核蛋白(NP)的抗體。為了該目的，純化的重組桿狀病毒來源的谷胱甘肽-S-轉移酶-NP融合蛋白，其包含AIVNPgene的全部編碼區，用作抗原。在包含0.05%吐溫20的PBS中以1:300稀釋的血清，以一式兩份進行研究。使用鄰苯二胺，通過顯色反應，檢測第二POD-綴合的山羊-cc-雞IgG(H+L)(ROCKLAND)抗體的結合，并于492nm測定吸收。實施例8:包含修飾的H7基因的NDV載體的構建在基本上與如上所述的那些類似的實驗中，制備攜帶修飾的H7基因的NDV載體構建體。來源于HPH7N1AIV分離物的插入物A/chicken/Italy/445/99，其序列在GenBank中以登錄號AJ5803537>開；也參見Veits，J，etal.2003(J.ofGen.Virol.，vol.84，p.3343)。H7基因插入到NDV載體中的F與HN基因之間，其旁鄰為來自HN基因的非編碼序列。H7HA基因的切割位點區之后，存在可能的基因末端序列。1195-1206核苷酸中的原始序列為atagaaaaaact,其編碼氨基酸IEKT,^皮突變成atagagaa￡act,仍然編碼IEKT。相較于未修飾的H7基因的表達，這導致了通過NDV栽體，修飾的H7序列穩定和提高的表達與呈遞。權利要求1.一種生產帶有另外的轉錄單位的重組單股反鏈病毒目(Mononegavirales)病毒載體的方法，該轉錄單位包括與上游的單股反鏈病毒目病毒基因起始(GS)序列和下游的單股反鏈病毒目病毒基因末端(GE)序列可操作連接的外源基因，其特征在于該外源基因序列編碼一種蛋白，該蛋白包含至少3個堿性氨基酸的伸展序列，所述伸展序列由精氨酸(Arg)和/或賴氨酸(Lys)殘基組成，并包含至少1個賴氨酸，其中按照如下方式選擇外源基因的核苷酸序列，即以它不含有可被單股反鏈病毒目病毒的病毒聚合酶識別為基因末端(GE)序列的序列。2.權利要求l的方法，其特征在于通過定點誘變，對編碼所述至少3個堿性氨基酸的伸展序列的野生型外源基因序列的部分進行突變，以消除可能被單股反鏈病毒目病毒的病毒聚合酶識別為基因末端(GE)序列的任何序列，以產生修飾的外源基因序列。3.根據權利要求2的方法，其特征在于在最初存在于野生型外源基因序列中的t/aGAAAA序列內，引入至少一個突變，借此腺嘌呤伸展序列的"A"被另一個核苷酸取代。4.根據權利要求3的方法，其特征在于突變是沉默的。5.根據權利要求3-4的方法，其特征在于至少一個aaa密碼子被aag密碼子取代。6.根據權利要求3-5的方法，其特征在于進行至少2個點突變。7.根據權利要求3-6的方法，其特征在于至少2個aaa密碼子被aag密碼子取代。8.權利要求3-7的方法，其特征在于編碼序列agaagaaaaaaa被編碼序歹'Jaggaggaagaag取代。9.根據權利要求1-8的方法，其特征在于單股反鏈病毒目病毒載體是新城疫病毒(NDV)載體，而且外源基因編碼致病性H5禽流感病毒的HA蛋白。10.—種帶有另外的轉錄單位的重組單股反鏈病毒目病毒載體，該轉錄單位包括與上游的單股反鏈病毒目病毒基因起始(GS)序列和下游的單股反鏈病毒目病毒基因末端(GE)序列可操作連接的外源基因，其特征在于該外源基因序列編碼一種蛋白，該蛋白包含至少3個堿性氨基酸的伸展序列，所述伸展序列由精氨酸(Arg)和/或賴氨酸(Lys)殘基組成，并包含至少l個賴氨酸，其外源基因不含有可被單股反鏈病毒目病毒的病毒聚合酶識別為基因末端(GE)序列的序列。11.根據權利要求10的重組單股反鏈病毒目病毒栽體，其特征在于外源基因編碼致病性禽流感病毒的血凝素(HA)蛋白，其中堿性氨基酸的伸展序列包含并排的至少2個賴氨酸，而且其中這些賴氨酸的至少一個由aag密碼子編石馬。12.根據權利要求10-11的重組病毒載體，其特征在于堿性氨基酸的伸展序列包含氨基酸序列ArgLysLys，其由核苷酸序列aggaagaag編碼13.—種抗微生物病原體的疫苗，其包含根據權利要求10-12的任一項的重組MV病毒載體和藥學上可接受的載體或稀釋劑。全文摘要本發明提供了一種生產帶有另外的轉錄單位的重組單股反鏈病毒目病毒載體的方法，該轉錄單位包括與上游的單股反鏈病毒目病毒基因起始(GS)序列和下游的單股反鏈病毒目病毒基因末端(GE)序列可操作連接的外源基因，其特征在于該外源基因序列編碼一種蛋白，該蛋白包含至少3個堿性氨基酸的伸展序列，而且編碼這些氨基酸的密碼子的核苷酸序列不含有能被單股反鏈病毒目病毒的病毒聚合酶識別為基因末端(GE)序列的序列。文檔編號C07K14/11GK101421294SQ200780013584公開日2009年4月29日申請日期2007年3月15日優先權日2006年3月15日發明者A·羅默-奧波多弗,J·維特斯申請人:英特威國際有限公司