專利名稱：：抑制肉質食品中致病細菌生長的含有蛋黃免疫球蛋白的組合物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種食品添加劑的制備方法及其應用，該食品添加劑含有IgY(蛋黃免疫球蛋白)，能夠抑制肉質食品中致病細菌的生長。技術背景為了提高肉質加工食品(如火腿、香腸和烤肉)的質量，基于這些食品來自不同的肉質來源(如豬肉、羊肉、牛肉和雞肉)的事實，需要適用于廣大領域的核心工藝。在改進肉質加工食品的整體性質上起到了重要作用的工藝包括各種各樣的工藝，例如，基于使用新的香料的改善口感的工藝，基于使用具有較高持水能力的蛋白質基原料的降低成本的工藝，基于添加酶或蛋白質基原料的改善質地和風味的工藝，以及能夠將由熱導致的變質最小化的非熱能滅菌工藝。在這些工藝中，通過將熱處理最小化對肉質食品進行滅菌的非熱能滅菌工藝對于顯著提高肉質食品的質量是最至關重要的。目前正在開發的兩類處理工藝包括利用天然的抗微生物的物質的化學處理工藝和使用電場、磁場、超高壓或光能的物理處理工藝。關于當前的技術水平以及不穩定的生產成本，利于天然的抗微生物的物質的非熱能滅菌工藝在食品工業中的應用更具有優勢。包括細菌素(bacteriocine)提取物、藥用殼聚糖(Chitosan)、藥用溶菌酶、藥用鈣(calciummedicine)、各種有機酸、葡萄柚籽提取物、聚賴氨酸(polylysine)以及維生素B1衍生物在內的各種天然的抗微生物的物質己經被開發并可以商購得到。目前使用2%-3%的有機酸(例如乳酸鉀和乳酸鈣)來防止細菌從而確保肉質食品的安全。但是，大多數商購抗菌物質具有滅活機能，即表面活性劑能損傷在細菌細胞的疏水性和親水性區域的細菌細胞膜，使微生物滅活，但是，問題在于，表面活性劑的抗菌效果在蛋白質基食品中(例如含有大量極性基團的肉質加工食品)受到了極大地妨礙。正是因為食物中的具有極性基團的蛋白質預先使抗菌物質的表面活性劑不能有效地到達并與細菌的細胞膜結合，因而不能實現有效地滅菌。由于在培養基上表現出優異的滅菌或抑制生長效果的商購抗菌物質在真正的食品(特別是蛋白質食品)中出現了效果減弱的重大缺陷，因此除了從有機酸中獲得的天然抗菌物質外，能夠被用在肉質加工食品中的抗菌物質受到了很大的限制。因此，最重要的是開發并安全使用能夠應用于以蛋白質為主要成分的肉質加工食品的具有滅菌和抑制細菌生長功能的天然抗菌物質。這也將是非熱能滅菌的基礎，因為開發和安全使用有效的天然抗菌物質將是將變質和由二次熱處理滅菌引起的產量下降最小化的差異化技術。關于前述方面，通過開發抑制肉質食品中致病細菌生長的含有IgY的組合物而完成了本發明，該組合物具有不同的抗菌機理并且能夠用作肉質加工食品的有效的天然防腐劑，研究并分析本發明組合物應用于肉質加工食品時的抑制生長的效果。IgY是一種抗體，是一種特異性免疫球蛋白，它能從母雞母體通過蛋黃傳遞給胚胎。天然抗菌物質和表面活性劑在制備方法和功能機理上是完全不同的。為了產生IgY，將待殺滅的或抑制生長的靶向致病細菌(例如螺旋桿菌(//e/z'co6a"er)，大腸埃希氏菌(￡.co//)，金黃色葡萄球菌d//z;/ococ薦m^ew)和沙門氏菌(5WmoMe〃a))注射到母雞母體內以在蛋黃中產生一種能夠抵御靶向細菌的特異性免疫球蛋白(抗體)。這種在蛋黃中積聚的特異性免疫球蛋白被稱為IgY，有別于一般的抗菌素，它的特點是對人體沒有副作用，并且對細菌也沒有耐受性。迄今為止，IgY只是主要被用于功能蛋、奶制品、豆奶、功能餐和功能性化妝品產品。在先前的案例中沒有如本發明所建議的將IgY用于肉質食品中。沒有在先嘗試以殺滅和抑制多種能夠在肉質食品安全和質量方面起到負面作用的致病細菌為目而使用IgY，或者將IgY加工成粉末狀或液態物質。目前在韓國以及國外存在的研究和開發的案例形成專利和研究文獻的是專利登記號為0437500的韓國專利涉及一種食品添加劑，是通過將兩種能夠引起口腔疾病的鏈球菌變體(Streptococcusmutants)和伊氏放線菌(Actinomycesisraelii)作為抗原，將它們分別注射到不同的雞體中，產生能夠抗每個相關致病細菌的IgY。此外，該專利還涉及含有特殊食品添加劑的功能性冰激淋。專利登記號為0415911的韓國專利涉及如何生產能夠預防腸炎的雞蛋，通過將能引起腸炎和胃炎的大腸埃希氏菌和引起腸炎的幽門螺桿菌(7/e/^oZ^"w同時注射到幼雞體內。此外，專利登記號為0406870的韓國專利提出了如何從蛋黃的水溶性成分中分離和純化IgY。專利登記號為0392564的韓國專利介紹了如何生產功能性雞蛋，該功能性雞蛋具有特異性免疫球蛋白，該免疫球蛋白能抗導致痤瘡的痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)。申請號為2001-0046634的韓國專利申請涉及功能性豆奶和含有含抗螺旋桿菌(//e//C06a"e。的IgY的液態蛋黃的酸奶。本領域的大多數研究文獻和論文描述如何從蛋黃制備IgY抗體以及IgY的特性，對于滅菌和抑制生長的研究僅使用幾種特殊的細菌，例如螺旋桿菌(/^//coZ^"w)、大腸埃希氏菌(￡.co//)和沙門氏菌(5Wwo"e〃a)。正如本文所討論的，本發明的動機是基于這樣的事實現在關于IgY的研究、發展和商業化高度集中在功能性原料和食品，而用于肉質加工食品的有效的天然抗菌物質還沒有商業化應用。通過發明一種可商業化應用的對靶向細菌具有選擇性抗生效果的天然抗菌物質，我們能夠發展并完善先進的非熱能滅菌技術，該技術使公司的高品質的產品以各種形式商品化，如在封裝以及烹調后立即將產品裝盤而無需任何額外的熱處理的無菌包裝產品
發明內容本發明的目的是提供抑制肉質食品中致病細菌生長的含有IgY的組合物。本發明的另一個目的是提供一種通過使用前述組合物殺滅肉質加工食品中的致病細菌和抑制肉質加工食品中的致病細菌的生長的方法。本發明包括下述幾個步驟含有IgY的蛋黃的生產步驟；從蛋黃中分離IgY并純化的步驟；含有IgY的液態蛋黃和蛋黃粉末的制備步驟；檢驗前一步驟獲得的IgY的穩定性的步驟；檢測和評價含有IgY的蛋黃粉末和液態蛋黃的抗菌效果的步驟。本發明提供了一種IgY的制備方法，該方法包括下述步驟O通過給雞注射疫苗來生產含有特異性免疫球蛋白的雞蛋，該疫苗能抗使產品變質的致病細菌和其它微生物；ii)對從雞蛋中分離出的蛋黃進行低溫滅菌；和iii)向已滅菌的蛋黃中加入酸性水溶液并將得到的混合物離心分離。在步驟ii)中，低溫滅菌在50-75'C下進行15分鐘至1小時。如果滅菌溫度低于50°C，滅菌不能充分地進行。如果溫度高于75r，蛋黃將會由于熱而變性。如果滅菌時間少于15分鐘，滅菌不能充分地進行，然而也沒必要使滅菌時間長于1小時，因為滅菌時間長于1小時也不會帶來更好的滅菌效果。在步驟iii)中，其特征在于，離心分離是在通過向已滅菌的蛋黃中加入酸性水溶液將最終酸度調節至pH值為5.2-5.5之后進行的。此外，本發明還提供了含有特異性免疫球蛋白的蛋黃，該蛋黃是通過下述兩個步驟特別制備的步驟l，該步驟通過給雞注射能抗使產品變質的致病細菌和其它微生物的疫苗來生產含有特異性免疫球蛋白的雞蛋；和，步驟2，該步驟對從雞蛋中分離出的蛋黃進行低溫滅菌。經過滅菌的蛋黃在低溫下能被凍干或冷凍干燥，以使它變成含有IgY的蛋黃粉末。此外，本發明還提供了對肉質食品具有殺菌或抑制腐爛功能的食品添加劑組合物，該組合物含有下述組中的一種或幾種上述IgY，含有上述IgY的蛋黃，以及含有上述IgY的蛋黃粉末。圖1說明本發明的IgY的制備過程；圖2說明本發明的IgY的抗菌活性滴定度的曲線圖；圖3說明本發明的IgY的酸度和溫度穩定性的曲線圖；圖4說明了在2(TC下GrillWinner香腸的每個儲存階段，含有IgY的蛋黃粉末的滅菌和抑制生長的效果的曲線圖；圖5舉例說明沙門氏菌的細胞膜被本發明的IgY破壞的機理；圖6為表明在20"C下GrillWinner香腸的每個儲存階段，含有本發明的IgY的蛋黃粉末的滅菌和抑制生長的效果的照片；其中，A是對照組，B是經IgY處理的實驗組；圖7為本發明的IgY對0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)的滅菌效果的曲線圖；圖8為本發明的IgY對腸炎沙門氏菌(Sa/wo"e〃aew&n力'fifo)的滅菌效果的曲線圖；圖9為本發明的IgY對鼠傷寒沙門氏菌"a/mowe〃a的滅菌效果的曲線圖；圖10為用電子顯微鏡觀察到的本發明的IgY對O157:H7(大腸埃希氏菌(五^/7eWc/2^co//0157:H7))的細胞膜的破壞機理；圖11為用電子顯微鏡觀察到的經本發明的液態IgY處理的GrillWi皿er香腸；將經過IgY處理的香腸在37i:下放置7天后進行觀察；其中，A是對照組，B是經IgY處理的實驗組。具體實施方式根據本發明，術語"IgY"或蛋黃中的免疫球蛋白的意思是從母雞母體通過蛋黃傳遞給胚胎的特異性免疫球蛋白(抗體)。本發明的技術術語IgY包括所有類型的IgY組合物，例如液態或粉末狀物質。大約有20種致病細菌和其它微生物能使肉質加工食品變質。它們包括嗜水氣單胞菌(v4m附o"os/^ra/M(3)、蠟狀芽孢桿菌(萬ac/腸cer潔)、空腸彎曲菌(G3wp//o6ac^7'咖m')、產氣莢膜梭菌(C7o/nW謂/e^/h'"gms)、0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)、乳酸桿菌aacto6fl"7/w)、單核細胞增生李斯特氏菌(丄^er/(3wo"oc_y)、酉良酒酵母(Sacc/2"ramycescerev/w'ae)、腸炎沙門氏菌(5"a/,"e〃ae"&rk逾)、鼠傷寒沙門氏菌(5"a/mo"e〃a(y//z/柳Mr/M附)、金黃色葡萄球菌(5^a//^/ococci^awrews)、表皮葡萄球菌((SVa//2;v7ococcMSe//cferw/(i/s)、肉毒梭菌(C7astr/tZ/MmZo/w//ww/w)、弓瓜菌(F6廠z'ospp)禾口青霉菌(戶em'cz'〃/wm)。在上述20種細菌中，本發明只選擇了12種致病細菌作為最終的靶向細菌，包括革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌以及耐熱型產孢菌類Gpwe/om7W)。這些細菌具有可能導致進行了較高強度的熱處理和較低強度的熱處理的產品以及沒有進行后續滅菌處理的無菌包裝產品發生腐爛，產生氣體，形成痰狀物質，和形成食物毒素的危險。本發明所述的使產品變質的致病細菌和微生物包括0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7，革蘭氏陰性菌)、腸炎沙門氏菌(5Wwo"e〃ae"&W^fo)、鼠1勞寒《少I、，氏菌(Sa/m。"e〃a/);//H'附wrz.w附)、空腸彎曲菌(Gawp_y/o6ac&ry'ey'ww/)、金黃色葡萄球菌(&ap/^/ococcwm/Mus，革蘭氏陽性菌)、表皮葡萄球菌(Stop/^/ococcwe//fl^/mW^)、單核細胞增生李斯特氏菌(ZiWeWawowoc^ogms)、蠟狀芽孢桿菌(5a"7/wc^ews，革蘭氏陽性菌和耐熱型產抱菌類G;or^/br附ers))、產氣英膜梭菌(C7ofr/^'w附per^777ge"s)、以及酉良、酒酵母(Sacc/zara，cescerev&z'ae)，酉良酒酵母(iSacc/zaram_yc&scerev/w'ae)是能導致食品變質的典型的細菌之一。本發明還提供了關于IgY或含有IgY的蛋黃的信息，所述IgY或含有IgY的蛋黃對上述被認為是引起食品變質的致病細菌和其它微生物的靶向細菌具有優異的抗菌活性。根據本發明，將篩選后的靶向細菌注射到母雞體內，首先從母雞產的蛋的蛋黃中獲得IgY(特異性抗體，能夠阻止被注射的12種細菌)。產品中含有大量的蛋白質，其次是脂質、灰分和水。能抵御12種致病微生物的抗體IgY的總含量為15.5毫克/克(圖1)。為了直接驗證IgY對12種細菌的滅殺和抑制效果，用ELISA(酶聯免疫吸附試驗，一種間接的酶免疫響應的方法)來觀察抗原抗體響應過程中光密度(OD，OpticalDensity)值的變化。光密度值的增加表明IgY對特異的病原體的選擇性響應較高。因此，這可以被用作表明具有強的殺滅和抑制生長效果的間接的指標。實驗結果表明，除了腸炎沙門氏菌(5""/附o"e〃ae"&n'"tfo)禾卩鼠傷寒沙門氏菌(/S<3/mowe〃a(y//z/mwn'wm)以外，本發明的IgY對12種病原體中的大多數顯示出高的光密度值，這說明IgY能夠抑制特異的病原體生長。IgY的滅活機理可以被理解為對抗體與細胞膜結合的響應。詳細地說，IgY不是單克隆抗體而是多克隆抗體，在與細菌一起培養6個小時的期間內，它的數量增加，且顯示出限制細菌生長的特異的殺菌功能。在一段時間內抑制細菌繁殖的作用是通過下述機理產生的IgY的Fab片段的兩個位點與細菌的膜外蛋白質(菌毛)或脂多糖結合產生粘著作用并因此破壞細胞膜的功能。為了生產含有IgY的液態蛋黃，將含有IgY的雞蛋搗碎分離出蛋黃，雞蛋的抗菌效果通過ELISA被間接證明。然后，在50-75'C下以低速將蛋黃攪拌15-60分鐘，同時殺菌。通過這種方法，使用低溫滅菌得到無菌條件下的含有IgY的液態蛋黃。此外，如果使在低溫下攪拌的含有IgY的蛋黃在l-l(TC的冷卻室內冷卻過夜，并在無菌條件下噴霧干燥，然后就能夠獲得含有IgY的蛋黃粉末。更進一步說，IgY水溶液也可以通過下述方法制備得到將分離出的蛋黃在低溫下攪拌，然后用pH值為2-5的酸性水溶液將蛋黃稀釋6-9倍，得到最終的酸度為pH值為5.2-5.5。然后，將蛋黃溶液在1-10。C的冷卻條件下放置至少6小時(優選6-24小時)，并在3000-6000rpm下離心分離15-60分鐘。用這種方法，IgY在上層清液中，顆粒狀的蛋清蛋白被分離，得到IgY水溶液。此外，通過將IgY水溶液凍干(冷凍干燥)，也可以得到粉末狀的IgY。由于便于儲存和運輸，在很多用途中粉末狀物質比液態物質更有用。上述說明的分離IgY的方法是有效的，采用簡單的只使用離心分離機(離心機)和冷凍干燥機作為必要設備的方法，獲得的大于90%的抗體活性滴定度是安全的。將IgY應用于實際的肉質加工食品后，觀察由該方法制備的IgY的殺菌和抑制生長的效果。每一種具有抗12種病原體效果的混合有IgY的粉末和液體被分別應用于作為食物樣本的GrillWinner香腸(商標名稱，韓國CJ株式會社)。在生產香腸的過程中，IgY的加入量為香腸重量的0.5重量％。觀察香腸在10°C、15"C和35'C下放置8天直到56天的狀況，分析總細菌數、感官測試和表明腐爛的氣體的產生。分析結果顯示出殺菌和抑制生長的效果，該效果包括沒有由1(^個微生物的殺滅和抑制生長引起的細菌生成氣體。在具有良好的抗菌效果的基礎上，IgY不會影響加工得到的食物的味道，IgY的最大優勢是有望克服現有商購天然抗菌物質的使用范圍有限的問題。另一方面，本發明涉及殺滅和抑制使肉質食品變質的病原體和其它微生物生長的方法，該方法通過采用上述組合物對肉質食品進行處理。針對這一點，所述組合物應該在有效量的范圍內使用。而對處理方法沒有特別要求，可以在加工食物的過程中將組合物加入到肉質食品中。下面，將結合實施例對本發明進行詳細描述。還應該清楚地理解的是，前面只是通過舉例來描述，因此，本發明并不限于該具體的實施方式。實施例1:通過分離和純化制備含有IgY的蛋黃及其組合物通過下述方法(圖1)制得含有IgY的粉末狀和液態的蛋黃。關于整個制備過程，挑選出12種在肉質食品的衛生和質量方面會造成問題的病原體，每種細菌疫苗被注射到隨機抽樣的母雞體內，以獲得對細菌具有特異性的IgY物質。將IgY分離和純化以檢測它的活性。通過低溫滅菌和干燥方法制得含有IgY的液態蛋黃或蛋黃粉末，間接地證明其有效的抗菌功能。通過下述方法對本發明進行詳細說明步驟l:含有IgY的雞蛋的生產為了理想地完成本發明，將能夠抗包括桿菌(&"7//^)、梭菌(C/o^7W"m)、沙門氏菌(Sa/附o"e〃a)和大腸埃希氏菌(Eco//)在內的12種靶向細菌的疫苗注射到單個的12周到21周大的白冠來亨雞體內，分別獲得含有能抗12種細菌的IgY的12種雞蛋。注射的細菌疫苗是通過熱處理或化學處理使細胞膜變性而被滅活的細菌，將該細菌與免疫刺激物質混合，并通過胸腔肌肉注入雞的體內。為了產生最大量的抗體，至少注射兩次疫苗。在本發明中，在初次注射疫苗后，記憶細胞B被激活，然后進行第二次注射使細胞以幾何級數進行分裂而產生大量的特異性抗體。步驟2:IgY的分離和純化在本發明中，將IgY從雞蛋的蛋黃中分離，并通過ELISA(—種免疫酶響應的方法)間接檢測它的抗菌功能，以確定該含有IgY的蛋黃是否適用。有效地分離IgY是非常重要的，它是來自蛋黃液態成分中的一種水溶性成分。因此，在本發明中，將蛋黃與9倍的酸性的鹽溶液(pH值為5.0-5.5)混合，6小時后，低密度脂蛋白從混合物中沉淀出來，只有水溶性物質(IgY)能夠通過離心而分離。將分離出的IgY凍干。通過ELISA(OD值為450nm)(抗菌效果的一個間接參數)用OD值分析得到抗特異的病原體的IgY的特征活性。高的OD值間接說明它具有高的抗病原體的抗菌效果。結果如圖2所示。結果顯示，IgY對病原體和其它使產品變質的細菌具有有效的抗菌效果。特別值得注意的是，對于7種病原體的抗菌效果特別優異，例如，0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)和腸炎沙門氏菌(&/mo"e//ae"^7'"(&，革蘭氏陰性菌)、金黃色葡萄球菌(Sto;^;;/o"ccwa"^w，革蘭氏陽性菌)、單核細胞增生李斯牛寺氏菌(丄/Wer/a附o"ocj^oge"s)、蠟狀芽f包桿菌(5flc/〃wscerews'革蘭氏陽性菌和耐熱產孢菌類)、產氣莢膜梭菌(C7o/nW/wmpe/yh'"gem)、禾卩釀酒酵母(Sacc/2aramycescereWWae)，它們是典型的使產品變質的微生物。根據實施例的結果，除了腸炎沙門氏菌和鼠疫沙門氏菌，IgY組合物顯示出抗12種病原體中的大部分病原體的有效的OD值，這說明它對特異的病原體具有優異的抑制生長的性能(參見表l)。表1含有本發明的IgY的蛋黃的生化特性<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>步驟3:制備含有IgY的液態蛋黃和蛋黃粉末由于本發明的含有IgY的蛋黃的抗菌效果表現出了有效的值，下一步是制備含有IgY的液態蛋黃和蛋黃粉末。將含有IgY的雞蛋搗碎分離蛋黃，通過上述ELISA法間接證明了IgY的抗菌效果。然后將蛋黃以低速攪拌，同時在62'C的低溫下滅菌30分鐘。下一步，將液態蛋黃在(C的冷卻室中冷卻過夜，然后在無菌條件下噴霧干燥制備得到蛋黃粉末。制備粉末過程的產率為83%，蛋黃粉末中的IgY的活性為90.7。/。，這說明了在該過程后相當高OD值的IgY被保留下來。按照實施例制得的組合物的實驗結果如下。實驗實施例l:IgY穩定性的測試為了將本發明的IgY作為商購天然抗菌物質而商業化，有必要確保IgY在各種條件下的穩定性。因此，在上述實施例中設定的pH值和溫度條件下對穩定性的研究結果表明，在pH值為3或更低的情況下，由于變性而喪失功能，而且在pH值為9或更高的情況下，抗體功能下降。由于加工食品的酸度一般在pH值為4-7，測得在這個范圍內IgY能夠保持很好的活性。總的來說，為了在食物中使用雞蛋衍生材料，在65"下實施5分鐘巴斯德殺菌。在這種情況下，IgY顯示出99n/。的抗菌活性。但是，當在75'C或更高溫度下加熱l小時，它的抗菌活性會減少60%以上。因此，能夠總結出，這種物質適用于非熱能滅菌產品(如圖3)。實驗實施例2:含有12種IgY的蛋黃粉末的抗菌活性測試在本實驗實施例中，分析了將含有對12種病原體具有抗菌效果的IgY的蛋黃粉末應用于實際的肉質加工食品中的滅菌和抑制生長的效果。實驗結果表明，當生產的GrillWinner香腸含有0.5重量％的含有IgY的蛋黃粉末時，在2(TC的儲存溫度下儲存21天后，觀察到的滅菌效果為10'(如圖4所示)。這樣的抗菌效果是由于特異性免疫球蛋白(IgY)與細菌的細胞膜結合而使細胞膜結構發生形變，從而使細菌的細胞膜的功能被削弱或者喪失(如圖5所示)。因為IgY具有基于使細菌的功能退化的抗菌機制，它在抑制生長方面的作用更為有用，而不是通過殺菌滅活。對于制得的肉質食品(例如火腿或香腸)不能完全被滅菌，微生物安全性是為了抑制病原體的生長并且將細菌控制在10M02以下。由于IgY對特異的病原體具有選擇性抑制生長的作用，可以注意到，IgY在微生物安全性方面是有效的。因此，當加入含有具有選擇性抗菌功能的IgY的蛋黃粉末時，可以有效地殺滅和控制靶向細菌的生長，并且不會影響(產品的)味道。實驗實施例3:含有2種IgY的液態蛋黃的抗菌效果的測試在本實驗實施例中，通過應用于實際的肉質加工食品，分析含有對特別的兩種病原體具有抗菌活性的IgY的蛋黃粉末的滅菌和抑制生長的作用。兩個靶向病原體包括近來經常出現在肉質加工食品中的李斯特菌a^en'fl)和沙門氏菌(5Wmo"e^)。在本實驗中，將在預先的測試中表現對這些病原體有作用的兩種IgY混合，并進行測試。實驗結果表明，當加工的GrillWinner香腸含有0.5重量％的含有IgY的液態蛋黃時，在15"的儲存溫度下儲存14天后，沒有發現細菌總數有明顯的變化。但是，在沒有添加IgY的對照組中，生成了粘液質，間接地說明香腸處于腐爛狀態，并且由于產生氣體，包裝袋膨脹，然而，在實驗組中沒有觀察到這種狀態改變，這說明產品質量良好。實驗實施例3再次證實了實驗實施例2的關于IgY具有優異的抑制微生物生長的作用的結果。實驗實施例4:本發明的IgY的抗菌效果測試將0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)、腸炎沙門氏菌(Sa/mo"e〃ae"fen'^fc)和鼠傷寒沙門氏菌(Sa/mowe〃a0^/2/wMn'ww)的每種疫苗注射，以獲得對每種微生物具有抗菌效果(殺滅和抑制生長)的液態IgY。將液態IgY凍干以制成粉末狀物質，然后采用基于免疫酶響應方法的ELISA證明對包括0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)、腸炎沙門氏菌(Sa/mo"e〃ae"teW^fc)和鼠傷寒沙門氏菌(5"a/mo"e〃a/^7/n'mwn'ww)在內的每種特異的病原體的抗菌效果。然后，分別制備含有106-107CFU/mlO157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)、腸炎沙門氏菌"a/wo"e〃a和鼠傷寒沙門氏菌(5^/mo"e//aO^/n'mMn'Mm)的三種鹽溶液，然后分別向三種鹽溶液中加入相應的抗0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)的IgY粉末2.34毫克/毫升、抗腸炎沙門氏菌(5^/mo"e//aewfen'^fo)的IgY粉末0.9毫克/毫升和抗鼠傷寒沙門氏菌(&/mo"e〃a^//z/附wWMm)的IgY粉末0.63毫克/毫升。通過檢測細菌數量的減少來研究對三種類型的微生物的滅菌和抑制生長的作用隨著時間的變化。除了靶向細菌的選擇，IgY粉末的制備與實施例l相同。結果表明，抗0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)的IgY粉末的滅菌效果為102(CFU/ml)(99%的0157:H7被殺滅)。(如圖7所示)。對于腸炎沙門氏菌"a/wo"e〃ae"&nW^y),滅菌效果表現為101(CFU/ml)(90%的腸炎沙門氏菌(Sa/wo"e〃ae"/en力'cfc)被殺滅)(如圖8所示)。抗鼠傷寒沙門氏菌(Sa/wo"e〃a0^/2^mn'iw7)的IgY粉末的滅菌效果為101(CFU/ml)(90%的鼠傷寒沙門氏菌(5"a/mo"e〃aO^/2/wwn'wm)被殺滅)(如圖9所示)。為了指出IgY對0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)的滅菌或抑制生長的作用機理，用電子顯微鏡觀察用IgY處理過的0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)。如圖10所示，IgY免疫金標記粒子被吸附在0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)的細胞膜上。在大約4個小時后，該病原體的細胞膜被破壞以致該病原體死亡或抑制生長。將根據實施例1步驟2分離出的IgY水溶液凍干得到的IgY粉末加入到GrillWinner香腸中。制得的香腸含有0.05重量％的上述IgY粉末，并將其放置在35'C的培養器中。7天后，觀察并分析由微生物(病原體和其它使產品變質的微生物)生長引起的香腸表面發生的變化。結果表明，沒有經過IgY處理的對照組(A)，由于微生物的生長，結構被完全破壞，如圖11所示。但是，在添加了本發明的IgY的實驗組中，微生物被殺滅或被抑制生長，因此，產品的結構完好。這證實了本發明的IgY具有優異的抗菌效果。含有本發明的對12種病原體具有抗菌作用的IgY的組合物，被設計用來殺滅和抑制病原體細菌的生長，對導致食物中毒和肉質食品腐爛的細菌具有突出的抗菌效果。本發明的組合物還在低溫、非熱能處理條件下對病原體細菌顯示出優異的殺滅和抑制生長的效果。因此，在食品滅菌工業中這是一個杰出的發明，因為它能將天然殺菌劑以各種方式商業化應用。權利要求1、一種特異性蛋黃免疫球蛋白的制備方法，該方法包括下述步驟i)通過給雞注射疫苗來生產含有特異性免疫球蛋白的雞蛋，該疫苗能抗使產品變質的致病細菌和其它微生物；ii)對從所述雞蛋中分離出的蛋黃進行低溫滅菌；和iii)向已滅菌的蛋黃中加入酸性水溶液并將得到的混合物離心分離。2、根據權利要求1所述的特異性蛋黃免疫球蛋白的制備方法，其中，步驟ii)中，所述低溫滅菌在50-75X:下進行15分鐘至l小時。3、根據權利要求1所述的特異性蛋黃免疫球蛋白的制備方法，其中，在實施步驟iii)的離心分離之前，通過向已滅菌的蛋黃中加入酸性水溶液將最終酸度調節至pH值為5.2-5.5。4、根據權利要求1所述的特異性蛋黃免疫球蛋白的制備方法，其中，所述使產品變質的致病細菌和其它微生物為嗜水氣單胞菌(Arawoww/z_y<ira/7Ma)、蠟狀芽孢桿菌(B腦.〃mcerews)、空腸彎曲菌(C謹p/2/0Z)ac&rm')、產氣莢膜梭菌(C7o/r/<i/ww;eryHwgera)、大腸埃希氏菌0157:H7(￡^/7^&/7&0//0157:117)、乳酸桿菌(丄actoZ)ac/〃w)、單核細胞增生李斯特氏菌(丄/他r/awo"oqytogera)酉良酒酵母(Sacc/w!ra，cescerev/57'ae)、腸炎t少l、，ft"^^^1"/^^"^//"er"/(^/s)、鼠i^寒》少n氏菌(5^/附0"6//"^p/z/mwr/MW)、金黃色葡萄球菌(S鄉/^/ococcz^awmM1)禾口表皮葡萄球菌(S鄉/2y/0c0ccws5、一種特異性蛋黃免疫球蛋白，該特異性蛋黃免疫球蛋白是由權利要求1-4中任意一項所述的特異性蛋黃免疫球蛋白的制備方法制備得到的。6、含有特異性蛋黃免疫球蛋白的蛋黃，該蛋黃是由包括下述步驟的方法制備得到的i)通過給雞注射疫苗來生產含有特異性免疫球蛋白的雞蛋，該疫苗能抗使產品變質的致病細菌和其它微生物；和ii)對從所述雞蛋中分離出的蛋黃進行低溫滅菌。7、含有特異性蛋黃免疫球蛋白的蛋黃粉末，該蛋黃粉末是通過將權利要求6所述的蛋黃冷凍干燥而制備得到的。8、對肉質加工食品具有滅菌或抑制腐爛功能的食品添加劑組合物，該組合物含有選自由權利要求5所述的特異性蛋黃免疫球蛋白、權利要求6所述的含有特異性蛋黃免疫球蛋白的蛋黃以及權利要求7所述的含有特異性蛋黃免疫球蛋白的蛋黃粉末所組成的組中的一種或幾種物質。全文摘要本發明涉及一種抑制肉質食品中的致病細菌生長的含有IgY的組合物，IgY是一種從蛋黃中得到的特異性免疫球蛋白。本發明的IgY靶向的使肉質加工產品變質的12種具有代表性的細菌和其它微生物包括嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、空腸彎曲菌(Camphlobacterjejuni)、產氣莢膜梭菌(Clotridiumperfringens)、0157:H7(Escherichiacoli，大腸埃希氏菌0157:H7)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogens)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。12種細菌以抗原的形式被分別注射到雞體內，以獲得本發明的抗12種病原體的IgY。文檔編號C07K16/00GK101400701SQ200780008575公開日2009年4月1日申請日期2007年3月12日優先權日2006年3月10日發明者孫京鉉,宋珉錫,尹熙南,李惠珍,趙元一申請人:Cj第一制糖株式會社;Igy公司