專利名稱：：具有胰島素樣生長因子-i活性的肽及其用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及具有胰島素樣生長因子-l(IGF-I)活性的肽及其用途。
背景技術：
：由70個氨基酸組成的分子量為7,649Da的胰島素樣生長因子-1(IGF-I)在肝臟中由人生長激素生成然后分泌到血液中。它的氨基酸組成顯示出與胰島素的A鏈約43%的相似性。顯示出與胰島素具有相似作用的IGF-I能夠與胰島素受體及IGF-1受體結合，并且促進細胞增殖。IGF-I因其生長調解活性通常被稱為生長調節素C。已報導，IGF-I受體存在于如脂肪組織、淋巴細胞、骨(bond)和胎盤膜的多種組織以及肝細胞中。IGF-I受體已顯示具有與胰島素受體不同的信號途徑。IGF-I與其受體的結合導致經由第二信使促進體細胞分裂。從肝臟分泌進入血液的IGF-I以與結合蛋白的復合體形式(失活形式)循環。IGF-I響應生理改變或一些營養條件而與其結合蛋白分離然后與體細胞上的受體結合從而刺激細胞。物代謝中胰高血糖素的合成，從而增強細胞對葡萄糖吸收。由于其與胰島素的相似作用，它已成為對Laron侏儒癥和胰島素依賴性或非依賴性糖尿病而言有價值的治療方法的焦點。另外，已研究具有免疫調制活性的IGF-I以提供增強術后患者的免疫應答的療法和調制由膿毒引起的過敏反應的療法。特別是，IGF-I促進軟骨細胞中蛋白聚糖的合成并且用作對由軟骨中蛋白聚糖降解而破壞軟骨引起的變性關節炎的有價值的療法。因此，IGF-I已經成為適用于免疫調制和糖尿病、侏儒癥、變性關節炎及肌萎縮性側索硬化治療的生物分子中最重要的部分。IGF-I在其主鏈中具有三個對其固有活性必要的二硫鍵(氨基酸6-48，18-61和47-52)，其包括B(1-29)、C(30~41)、A(4262)和D(63~70)域。其中，已報導B和A域作為其受體的結合域，并且已提出，C和D域有助于B和A域與IGF-1受體的特異性結合。C和D域的缺失或突變使IGF-I的結合親和性被改變成IGF-I變體優先與胰島素受體而不是IGF-I受體結合。為了IGF-I的大規^^莫生產，許多研究人員已對使用大腸桿菌(五co//)表達系統制備重組蛋白進行了深入的研究。然而，這些制備遭遇到需要消耗時間和成本的重復步驟(refoldingprocess)并且需要復雜的純化方法以除去大腸桿菌產生的污染物。為了避免這些缺點，已通過固相合成法制備IGF-I模擬肽。例如，由Jameson等人提交的美國專利No.5,473,054公開了JB2(相當于IGF-I的第29~38位的氨基酸)和JBI(相當于第61-70位的氨基酸)片段具有細胞增殖潛能并且JBI、JB3的對映異構體具有對IGF-I的抑制活性。Temo等人提交的WO03/048192記載了每個由第33~37位氨基酸組成的IGF-I的肽片段和四肽衍生的物質-P對傷口愈合發揮互補的功效。另夕卜，Kodama等人報導由第50-70位氨基酸組成的IGF-I的肽片段對小鼠糖尿病具有治療作用(Autoimmunity,37:481-487(2004))。貫穿本申請，各種專利和出版物作為參考并且在括號內給出引用出處。為了更加全面地描述本發明以及闡述本發明所屬的
技術領域：
，
發明內容為了開發與天然產生的IGF-I具有相同的作用且與天然產生的IGF-I相比具有更加顯著的特性(例如活性、皮膚滲透和穩定性)的肽，本發明人已進行了深入的研究。結果，本發明人已發現了幾個具有上述極好特性的基于天然產生的IGF-I氨基酸序列的IGF-I模擬肽，最終完成本發明。因此，本發明的一個目的是提供一種具有IGF-I活性的肽。本發明的另一目的是提供一種用于改善皮膚狀態或治療牙周疾病的組合物。本發明的又一目的是提供一種用于改善皮膚狀態或治療牙周疾病的方法。本發明更進一步的目的是提供本發明的肽在制備用于改善皮膚狀態或治療牙周疾病的組合物中的用途。連同所附權利要求書和附圖，從以下詳述的說明中，本發明的其他目的和優點將變得明顯。在本發明的一個技術方案中，提供一種具有胰島素樣生長因子-l(IGF-I)活性并且由IGF-I衍生的肽，該肽包含選自SEQIDNO:2~8的氛基目1^列。在本發明的另一技術方案中，提供一種用于改善皮膚狀態或治療牙周疾病的組合物，該組合物包含本發明的肽作為活性成分。還在本發明的又一技術方案中，提供一種用于改善皮膚狀態或治療牙周疾病的方法，該方法包括向對象施用含有本發明的肽的組合物。在本發明更進一步的技術方案中，提供本發明的肽在制備用于改善皮膚狀態或治療牙周疾病的組合物中的用途。為了開發與天然產生的IGF-I具有相同作用且與天然產生的IGF-I相比具有更加顯著特性(例如活性、皮膚滲透和穩定性)的肽，本發明人已進行了深入的研究。結果，本發明人已發現了幾個具有上述極好特性的基于天然產生的IGF-I氨基S臾序列的IGF-I模擬肽。本發明的肽包含選自SEQIDNO:2~8的IGF-I衍生的氨基酸序列。優選地，該肽基本上由選自SEQIDNO:28的氨基酸序列組成。最優選地，該肽由選自SEQIDNO:2~8的氨基酸序列組成。本文所用的術語"肽"指通過肽鍵連接氨基酸殘基形成的線型分子。本發明的肽可通過本領域技術人員已知的常規化學合成方法，尤其是，固相合成技術(Merrifield，」waCTzew.5bc85:2149-54(1963);Stewart,等人，5b/^/尸/z(^eiS^/^Z/es^,2nd,ed.，PierceChem.Co.:Rockford,111(1984))來制備。例如，根據本發明的肽的設計如圖1中所示。SEQIDNO:7相當于天然產生的IGF-I的第22~27位的氨基酸。在SEQIDNO:7中，優選第28~29位的氨基酸由其他氨基酸殘基取代以更強地與其受體結合，這樣產生新序列，SEQIDNO:6。由于計算機程序生成的序列表在專利說明書中的限制，由"Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn畫Lys-Xaa-Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg"表示SEQIDNO:6的氨基酸序列。因此，更確切地說，由"Gly-Phe畫Tyr-Phe-Asn-Lys-(Xaa)n曙Gly-Tyr-Gly畫Ser-Ser-Ser畫Arg誦Arg"表示SEQIDNO:6，其中，Xaa為連接體(肽連接體)，n為1~10的整數(優選1~8、更優選1~5、最優選2)。SEQIDNO:6中含有的連接體包括本領域技術人員可利用的任何連接體。優選地，該連接體包含多個氨基酸。在Huston,等人，MethodsinEnzymology，203:46-88(1991)和Whitlow,等人，ProteinEng.,6:989(1993)中查到了肽連接體的詳細資料，該記載在此通過引用方式并入。本發明中適合的連接體包含具有不帶電側鏈的氨基酸，優選為Gly、Ser、Ala和Cys,最優選為Ala。才艮據最優選的實施方式，SEQIDNO:6中含有的連接體為Ala-Ala二聚體、己酸或氨基丁酸。根據最優選的實施方式，SEQIDNO:6具體的氨基酸序列如SEQIDNO:l中所述。SEQIDNO:2相當于IGF-I的第30~41位的氨基酸。SEQIDNO:8相當于IGF-I的第46~57位的氨基酸。為了提高SEQIDNO:8的肽的活性，Cys殘基優選被Ser殘基取代，這樣產生了新序列，SEQIDNO:3。SEQIDNO:4相當于IGF-I的第52~61位的氨基酸。優選地，在SEQIDNO:4的氨基酸序列中，連接N-和C-末端的Cys殘基以形成二碌i/睫，生成用于增強肽的穩定性的環化肽。即使本發明的肽本身比天然產生的IGF-I具有更高的穩定性，對其的修飾能使其具有高得多的穩定性。優選地，本發明的肽的C-末端被修飾成具有羥基(-OH)或氨基(-NH2)。根據優選的實施方式，本發明的肽的N-末端用選自由乙酰基、藥基曱氧羰基、甲酰基、棕櫚酰基、肉豆蔻基、硬脂酰基或聚乙二醇(PEG)組成的組中的保護基保護。上述的肽的修飾極大地增加了本發明的肽的穩定性。本文所用的術語"穩定性"指體內穩定性和貯藏穩定性(例如，在室溫下的貯藏穩定性)。上述的保護基保護肽免受體內蛋白酶的攻擊。使用本發明的組合物以預防或治療IGF-1有效的(胰島素樣生長因子-1有效的)疾病或狀態。作為活性成分包含在本發明組合物中的本發明的肽具有IGF-I活性并且顯示出與天然產生的IGF-4相同或相似的體內功能和功效。本文所用的術語"IGF-I活性"指本領域技術人員已知的天然產生的IGF-I的任一和全部活性，例如，包括促進細胞增殖分裂。因為制備了本發明的肽以模擬天然產生的IGF-I的作用，所以其能夠發揮天然產生的IGF-I的全部體內活性。因為本發明的肽具有與天然產生的IGF-I相同或相似的功能和作用并且顯示出比天然產生的IGF-I更高的生物活性，所以其能夠有利地用于預防或治療IGF-1有效的疾病或狀態。本文所用術語"IGF-1有效的疾病或狀態"指通過天然產生的IGF-I能夠預防或治療的疾病或狀態。根據優選的實施方式，可將本組合物的作用表述成對皮膚狀態的改善或對牙周疾病的治療。當將本組合物應用于牙周疾病時，可將其配制成牙膏或者用于牙齒和口腔清潔或護理的組合物。本文的術語"用于治療牙周疾病的組合物"可與其它術語"用于牙齒和口腔護理的組合物"和"用于牙齒和口腔清潔的組合物"交替使用。本發明的肽促進齒齦組織中存在的表皮細胞的生物活性并且愈合齒齦傷口以使受損的齒齦組織再生，從而治療或預防牙周疾病。根據更優選的實施方式，本組合物具有改善皮膚狀態的功效或活性。尤其是，由于其低分子量，本組合物中用作活性成分的肽顯示出極好的皮膚滲透。因此，當將本組合物局部應用于皮膚時，很明顯地，相當大地改善了皮膚狀態。還更優選地，本組合物對皮膚狀態的改善包括改善皺紋或皮膚彈性、預防皮膚老化、預防脫發、促進毛發生長、改善皮膚濕度、去除暗斑、治療痤瘡、傷口愈合和皮膚再生，最優選地，包括改善皺紋或皮膚彈性和預防皮膚老化、傷口愈合以及皮膚再生。例如，在本組合物中用作活性成分的肽促進角質細胞的增殖，誘導原膠原、層粘連蛋白和纖連蛋白的生物合成以使角質細胞層、表皮和真皮再生，從而致使改善皺紋、皮膚彈性和皮膚濕度，預防皮膚老化，傷口愈合，皮膚再生和齒齦組織再生。可將本組合物制備成藥物或化妝品組合物。根據優選的實施方式，所述組合物為包含(a)藥用有效量的本發明的肽；和(b)可藥用載體的藥物組合物。本文所用的術語"藥用有效量"指足夠顯示和實現本發明的肽的功效和活性的量。在本發明的藥物組合物中包含的通常在藥物制劑中使用的可藥用載體包括但不限于，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡膠(rubberarable)、磷酸鉀、精氨酸鹽(arginate)、明膠、硅酸鉀、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、曱基纖維素、羥基苯曱酸曱酯、羥基苯曱酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。根據本發明的藥物組合物可進一步包含潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、調味劑、乳化劑、混懸劑和防腐劑。適合的可藥用載體和配方的詳細資料可在雷明頓氏制藥科學(iew/"gtow's尸/^nwacew"ca/5Wewces(19thed.，1995))中找到，將其通過引用方式并入本申請。根據本發明的藥物組合物可經口或腸胃外給藥，并且優選經腸胃外給藥，例如，通過靜脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、經皮或局部給藥。本發明的藥物組合物的適合的劑量可根據藥物配制方法、給藥方法、患者的年齡、體重、性別、發病狀態、飲食、給藥時間、給藥途徑、排泄率及對所用藥物組合物的敏感性而變化。優選地，本發明的藥物組合物可以每日0.0001100嗎的劑量給藥。根據本領域技術人員已知的常規技術，可用如上所述的可藥用載體和/或溶媒(vehicle)配制根據本發明的藥物組合物，最終提供幾種形式的單劑量型和多劑量型。所述制劑的非限定性實例包括但不限于，在油或水介質中的溶液劑、混懸劑或乳劑、浸膏劑、酏劑、粉劑、顆粒劑、片劑和膠嚢劑，并且可進一步包含分散劑或穩定劑。根據優選的實施方式，所述組合物為包含(a)美容有效量的本發明的肽；和(b)化妝品可用載體的化妝品組合物。本文所用的術語"美容有效量"指足夠實現如上所述的改善皮膚狀態的功效的量。可將本發明的化妝品組合物配制成很多種形式，例如，包括溶液、混懸劑、乳劑、糊劑、軟膏、凝膠、霜劑(cream)、洗劑、粉劑、皂劑、包含表面活性劑的清潔劑、油、粉狀底霜、乳狀底霜、蠟狀底霜和噴霧劑。具體地，可將本發明的化妝品組合物配制成柔膚劑、滋養液、滋養霜、按摩霜、精華素、眼霜、清潔霜、清潔泡沫、清潔水、美容涂敷劑(pack)、噴霧劑或粉劑的形式。當化妝品組合物為糊劑、霜劑或凝膠的形式時，其可包含動物和植物脂肪、蠟、石蠟、淀粉、西黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、聚硅氧烷、皂土、硅石、滑石、氧化鋅或這些物質的混合物。在粉劑或噴霧劑的配方中，其可包含乳糖、滑石、硅石、氬氧化鋁、硅酸鈣、聚酰胺粉末和這些物質的混合物。噴霧劑可另外包含常規推進劑，例如，含氯氟經、丙烷/丁烷或二甲醚。溶液和乳劑的配方可包含溶劑、增溶劑和乳化劑，例如水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯曱醇、苯曱酸節酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇、油、甘油脂肪酯、聚乙二醇和失水山梨糖醇的脂肪酸酯。混懸劑的配方可包含例如水、乙醇或丙二醇的液體稀釋劑；混懸劑，例如乙氧化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯失水山梨糖醇酯、孩t晶纖維素、氫氧化鋁(aluminummetahydroxide)、皂土、瓊脂及西黃蓍膠或這些物質的混合物。具有表面活性劑的清潔組合物的配方可包含脂族醇硫酸酯、脂族醇醚硫酸酯、磺基琥珀酸單酯(sulfosucinnatemonoester)、異硫代硫酸酯(isothinate)、咪唑鐵鹽衍生物、牛磺酸曱酯、肌氨酸酯(sarcocinate)、月旨肪酸酰胺醚硫酸酯、烷基氨基甜菜堿、脂族醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物、乙氧化甘油脂肪酸酯或這些成分的混合物。此外，本發明的化妝品組合物可包含助劑與作為活性成分的肽及載體。助劑的非限定性實例包括防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、增溶劑、維生素、著色劑、氣味改進劑或這些物質的混合物。將本發明的特征和優點總結如下(i)本發明的IGF-1模擬肽具有與天然產生的IGF-I相同的功能或活性；(ii)本發明的肽具有比天然產生的IGF-I更高的穩定性和皮膚滲透能力；(iii)因此，含有該肽的組合物對需要IGF-I活性的疾病或狀態顯示出極好的治療和預防功效；以及(iv)可將本發明的肽有利地應用于藥物組合物、準藥(quasi-drug)和化妝品中。圖1表示天然產生的胰島素樣生長因子-l(IGF-I)的氨基酸序列和選出的用于制備本發明肽的區域。圖2示意性表示了本發明的肽的制備方法。圖3表示實施例中制備的SEQIDNO:l的肽的高效液相色譜分析結果。圖4表示實施例中制備的SEQIDNO:2的肽的高效液相色譜分析結果。圖5表示實施例中制備的SEQIDNO:3的肽的高效液相色譜分析結果。圖6表示實施例中制備的SEQIDNO:4的肽的高效液相色鐠分析結果。圖7表示實施例中制備的SEQIDNO:5的肽的高效液相色譜分析結果。圖8顯示本發明的肽對角質細胞生長的影響。x軸中標識的數字為肽的類型和量。例如，"1—10"和"1—1000"分別表示用10ng和1000ngSEQIDNO:l的肽的處理結果。圖9a表示證實本發明的肽對角質細胞生長的影響的顯微鏡圖像。肽1~5分別表示SEQIDNO:l~5的肽。圖9b表示證實本發明的肽對成纖維細胞生長的影響的顯微鏡圖像。肽1~5分別表示SEQIDNO:l~5的肽。圖10表示對用本發明的肽溫育的細胞培養物中升高的原膠原水平的分析結果。肽1~5分別表示SEQIDNO:l~5的肽。圖1la和1lb表示對用本發明的肽溫育的細胞培養物中升高的層粘連蛋白(圖lla)和纖連蛋白(圖llb)水平的分析結果。肽15分別表示SEQIDNO:l~5的肽。圖12表示證實本發明的肽與細胞上的受體結合的圖像。圖13為顯示施用含有本發明的肽的化妝品的BalbC小鼠的皮膚厚度變化的顯微鏡圖像。肽1~5分別表示SEQIDNO:l~5的肽。圖14為顯示本發明的熒光肽的皮膚滲透的顯微鏡圖像。現將通過實施例進一步詳細描述本發明。對本領域技術人員顯而易見的是，這些實施例是用來更具體地闡述本發明的并且如所附權利要求書提出的本發明的范圍不限于實施例或受實施例的限制。實施例制備實施例1:Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn-Lys-Ala-Ala-Gly-Tyr-Gly-Ser畫Ser匿Ser-Arg-Arg(SEOIDNO:l)的合成向加入到反映其中的700mg氯三苯曱基氯樹脂(CTL樹脂，NovaBiochem，目錄號01-64-0021)中加入10mL二氯曱坑(MC)并且振蕩3分鐘。除去溶液后，向生產物中加入10mL二曱基曱酰胺(DMF)，然后進行振蕩3分鐘，之后除去溶劑。向該反應器中加入10mL二氯曱烷溶液然后向反應器中加入200mmolFmoc-Arg(pbf)-OH和400mmol二異丙基乙胺(DIEA)，之后通過振蕩溶解該混合物，然后振蕩的同時進行反應1小時。反應后，將該生成物洗滌并在溶于DCM中的曱醇和D正A(2:1)中反應IO分鐘，然后用過量的DCM/DMF(1:1)洗滌該生成物。除去溶劑后，向反應器中加入10mLDMF并振蕩3分鐘，隨后除去溶劑。向反應器中加入10mL脫保護溶液(20。/c)哌咬/DMF)且在室溫下振蕩IO分鐘并進行溶液的去除。加入相同體積的脫保護溶液后，進行反應IO分鐘并且除去溶液，隨后依次用DMF、MC和DMF洗滌以制得Arg-(pbf)-CTL樹脂。向新的反應器中加入10mLDMF溶液，然后力口入200mmolFmoc畫Arg(pbf)-OH、200mmolHoBt和200mmolBop，隨后振蕩溶解。向該反應器中加入400mmolDIEA并且進行振蕩以溶解全部固體含有物。將溶解的氨基酸溶液？1入容納脫保護樹脂的反應器中并且在室溫下在振蕩的同時進行反應1小時。在除去反應溶液后，用DMF溶液振蕩生成物3次以除去未反應的殘余物。取少量反應后的樹脂通過(水合)茚三酮試驗評價反應進度。使用脫保護溶液，以與上述相同的方式進行2次脫保護以制得Arg-(pbf)-Arg-(pbf)-CTL樹脂。用DMF和MC洗滌后，進行(水合)茚三酮試驗然后如上所述進行氨基酸的連接。基于圖1中描述的氨基酸序列，將Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc曙Gly、Fmoc畫了yr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Lys(BoG)、Fmoc-Asn(trt)、Fmoc—Phe、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Phe和Fmoc-Gly依次連接到樹脂上。通過與脫保護溶液溫育兩次每次10分鐘除去Fmoc-保護基。依次用DMF、MC和甲醇洗滌該制備的肽基樹脂3次，在氮氣氣流下干燥，在P205下通過真空干燥完全干燥，然后在室溫下間歇振蕩下使其與30mL離去溶液[包含81.5。/oTFA、5%蒸餾水、50/。苯硫基曱烷、5%苯酚、2.5%EDT和1%TIS]反應2小時。過濾并用少量TFA溶液洗滌該樹脂，之后將濾出液與母液合并。在減壓下蒸餾以減小至總體積的一半后，使用50mL冷醚誘導沉淀并且通過離心法收集形成的沉淀，隨后用冷醚洗滌2次。除去母液后，在氮氣氣氛下干燥該生成物以提供1.18g未純化的GFYFNKAAGYGSSSRR(收率69.6%)。使用質量分析器測定終產物的分子量為1770.6(理論MW1769.9)。制備實施例2:其他肽的合成用如制備實施例1中所述的方法合成SEQIDNO:2-5的肽。SEQIDNO:2(Gly-Tyr-Gly畫Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln畫Thr:GYGSSSRRAPQT)相當于IGF誦I第30~41位的氨基酸；SEQIDNO:3(Glu-Ser-Ser畫Phe畫Arg-Ser-Ser-Asp-Leu曙Arg-Arg畫Leu:ESSFRSSDLRRL)相當于IGF-I第46-57位的氨基酸；SEQIDNO:4(Cys-Asp-Leu-Arg-Arg誦Leu-Glu-Met-Tyr-Cys:CDLRRLEMYC)相當于IGF-I第52-61位的氨基酸；以及SEQIDN0:5(Arg畫Arg一Leu-Glu-Met—Tyr-Cys—Ala—Pro-Leu畫Lys陽Pro:RRLEMYCAPLKP)相當于IGF-I第55~66位的的氨基酸。將肽的測定的分子量總結于表1中。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>制備實施例3:Cvs曙Asp-Leu-Arg-Arg畫Leu-Glu曙Met-Tvr-Cys(l,lO環化CDLRRLEMYC)的合成為了增加制備實施例2中制備的SEQIDNO:4的肽的穩定性，在C-和N-末端使用Cys殘基進行環化。在1L10%DMSO/脫保護蒸餾水中溶解100mgSEQIDNO:4(Cys-Asp-Leu畫Arg畫Arg-Leu-Glu-Met-Tyr-Cys-OH)的肽。固定pH值為8.0后，在空氣下振蕩該肽溶液8小時以引起氧化。通過制備色語法，獲得40mg環化的Cys-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Glu-Met-Tyr-Cys-OH(1,10環化的)。使用質量分析器測定的最終環化肽的分子量為1302.8。制備實施例4:FITC-b-Ala-Cys-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu匿Glu-Met-Tyr-Cys(2，11環化的FITC-b-Ala-CDLRRLEMYC)的合成向加入反應器中的700mg氯三苯曱基氯樹脂(CTL樹脂，NovaBiochem，目錄號01-64-0021)中加入10mL二氯曱烷(MC)并且振蕩3分鐘。除去溶液后，向生產物中加入IOmL二曱基曱酰胺(DMF)，然后進行振蕩3分鐘，之后除去溶劑。向該反應器中加入IOmL二氯曱烷溶液并且向反應器中加入200mmolFmoc-Cys(trt)-OH和400mmol二異丙基乙胺(DIEA)，之后通過振蕩溶解該混合物，然后在振蕩同時進行反應1小時。反應后，將該生成物洗滌并在溶于DCM中的曱醇和DIEA(2:1)中進行反應IO分鐘，然后用過量的DCM/DMF(1:1)洗滌該生成物。除去溶劑后，向反應器中加入10mLDMF并振蕩3分鐘，隨后除去溶劑。向反應器中加入10mL脫保護溶液(20。/。哌咬/DMF)且在室溫下振蕩IO分鐘并進行溶液去除。加入相同體積的脫保護溶液后，進行反應IO分鐘并且除去溶液，隨后依次用DMF、MC和DMF洗滌以制得Cys-(trt)-CTL樹脂。向新的反應器中加入10mLDMF溶液，然后加入200mmolFmoc隱Tyr(tBu)-OH、200mmolHoBt和200mmolBop，隨后振蕩溶解。向該反應器中加入400mmolDIEA并且進行振蕩以溶解全部固體含有物。將溶解的氨基酸溶液引入容納脫保護樹脂的反應器中并且在室溫下振蕩的同時進行反應1小時。在除去反應溶液之后，用DMF溶液振蕩生成物3次以除去未反應的殘余物。取少量反應過的樹脂通過(水合)茚三酮試驗評價反應進度。使用脫保護溶液，以與上述相同的方式進行2次脫保護以制得Tyr-(tBu)-Cys-(trt)-CTL樹脂。用DMF和MC洗滌后，進行(水合)茚三酮試驗然后如上所述進行氨基酸的連接。基于圖1中描述的氨基酸序列，將M、E、L、R、R、L、D、C和Fmoc-b-Ala-OH依次連接到樹脂上。通過與脫保護溶液溫育兩次每次10分鐘除去Fmoc-保護基。將100mmol溶于DMF中的FITC與200mmolDIEA混合，加入到樹脂中并且保持反應1小時，隨后洗滌。依次用DMF、MC和曱醇洗滌該制備的肽基樹脂3次，在氮氣氣流下干燥，在P205下通過真空干燥完全干燥，然后在室溫下間歇振蕩的同時使其與30mL離去溶液[包含81.5%TFA、5%蒸餾水、5。/。苯碌u基甲烷、5%苯酚、2.5%EDT和1%TIS]反應2小時。過濾并用少量TFA溶液洗滌該樹脂，之后將濾出液與母液合并。在減壓下蒸餾以減小至總體積的一半后，使用50mL冷醚誘導沉淀并且通過離心法收集形成的沉淀，隨后用冷醚洗滌2次。除去母液后，在氮氣氣氛下干燥該生成物以提供0,78g未純化的FITC-b-Ala-CDLRRLEMYC(收率52.6%)。其后，使用在肽的C-末端和距離N-末端一個氨基酸處的Cys殘基進行環化。在1L10%DMSO/脫保護蒸餾水中溶解100mgFITC-b-Ala-CDLRRLEMYC的肽。固定pH值為8.0后，在空氣下振蕩該肽溶液8小時以引起氧化。通過制備色譜法，獲得45mg環化的FITC-b漏Ala畫Cys-Asp-Leu-Arg-Arg匿Leu-Glu-Met-Tyr-Cys-OH(2,11環化的)。試驗實施例1:肽對HaCaT角質細胞和NIH3T3成纖維細胞生長的影響為了評價在制備實施例1~2中制備的5種肽是否具有胰島素樣生長因子-l相似的活性，根據Rizzino等人的方法(Rizzino，等人Omcer48:4266(1988))，使用HaCaT角質細胞和NIH3T3成纖維細胞進行SRB(磺酰羅丹明B(SulforhodamineB))比色分析。在含有添加了100%FBS(胎牛血清)的EMEM(Eagle'sminimalessentialmedia,Gibco，美國)的250mL燒瓶中培養HaCaT角質細胞(TheKoreanCellLineBank)和NIH3T3成纖維細月包(TheKoreanCellLineBank)。用0.25%胰蛋白酶溶液處理培養的細胞以從培養并瓦底部分離細胞并且離心分離收集細胞粒。在不包含FBS的EMEM中重懸該細胞，將其等分試樣(4x103個細胞)力。入到96孔板的每個孔中，并且在37。C、7%C02下培養24小時。培養24小時后，用不含血清的新鮮培養基更換該培養基并且在如上所述的相同條件下與人胰島素樣生長因子-l(NIBSC，英國)或溶于10%DMSO的5種合成肽(IOng/mL或1,000ng/mL)溫育72小時。除去上層清液后，使用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)洗滌細胞1次并且與SRB溶液(Sigma-Aldrich)溫育。用PBS洗滌細胞并且在顯微鏡下觀察到細胞活性。另外，測量590nm的吸光度以分析細胞增殖。圖8表示角質細胞生長的分析數據。用肽處理72小時后，在顯微鏡下觀察角質細胞的生長狀態(圖9a:角質細胞，圖9b:成纖維細胞)。如圖8中所示，本發明的5種肽明顯地促進了角質細胞的生長，其功效比天然產生的IGF-I好得多。另外，如圖9a和9b中所示，可以觀察到本發明的肽促進成纖維細胞和角質細胞的生長。此外，用本發明的肽處理角質細胞并且測量作為顯示皮膚皺紋改善指標的原膠原、層粘連蛋白和纖連蛋白的水平。培養48小時的角質細胞與5iamol本發明的肽溫育72小時。使用原膠原ELISA試劑盒(Takara,日本)、層粘連蛋白ELISA試劑盒(CHEMICON,美國)和纖連蛋白試劑盒(Takara，日本)進行定量。如圖10和lla~lib中所示，顯示了本發明的肽提高了細胞中原膠原、層粘連蛋白和纖連蛋白的水平。作用。試驗實施例2:對熒光標記的肽與成纖維細胞上受體的結合的測量在含有添加了100%FBS(胎牛血清)的EMEM(Eagle'sminimalessentialmedia,Gibco，美國)的250mL燒瓶中培養3T3成纖維細胞。培養48小時后，除去培養基的上清液并且使用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)洗滌剩余物1次。將制備實施例4中制備的FITC-b-Ala-CDLRRLEMYC溶于DMSO和PBS至濃度為1mg/mL并且與培養細胞溫育1小時。除去培養基后，徹底洗滌細胞并且在熒光和光學顯微鏡下觀察其表面。圖12表示FITC-標記的肽與細胞上受體結合的測量結果。本發明的肽與成纖維細胞表面上的受體結合。配方實施例1:納米肽的制備在500mL蒸餾水中溶解50mg在制備實施例3中合成的肽。將該肽溶液與5g卵磷脂、0,3mL油酸鈉、50mL乙醇和少量的油混合并用蒸餾水將其體積調節至1L。該生成的溶液在高壓下經微流化床裝置以進行乳化，從而提供具有100nm大小的納米體(nanosome)。該納米體被制成具有約50ppm的最終濃度并且用作化妝品的成分。配方實施例2:使用納米肽的柔膚劑的制備按照下列成分配制包含配方實施例1中制備的肽納米體的柔膚劑表2<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>配方實施例3:使用納米肽的滋養霜的制備按照下列成分配制包含配方實施例1中制備的肽納米體的滋養霜:表3<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>配方實施例4:使用納米肽的精華素的制備按照下列成分配制包含配方實施例1中制備的肽納米體的精華素:表4<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>配方實施例5:漱口水的制備按照下列成分配制包含制備的肽的漱口水:表5<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>試驗實施例3:肽對BalbC小鼠皮膚厚度的影響分析為了評價本發明的肽對化妝品的適用性和體內功效，將在配方實施例3中配制的滋養霜應用到小鼠皮膚上。6周齡BalbC雄性小鼠(CentralLab.Animal,Inc.,韓國)進行1周的適應性飼養并用含巰基乙酸的霜劑部分去除其背部的毛發。將小鼠分成2組；對其中一組局部施用包含含有肽的納米體的霜劑而對另一組局部施用不含納米體的霜劑。每天早上(A.M.8:30)及晚上(P.M.6:30)進行施用達5天劑量為100mg。施用后，頸部脫位處死小鼠并將其皮膚組織包蠟。用切片機將包蠟的組織切片至厚度為8jxm并用蘇木精/曙紅著色，然后在光學顯微鏡下觀察。如圖13中所示，包含本發明的肽的納米體化妝品可促進角化細胞層和表皮層的形成和生長。另外，發現本發明的FUC-標記的肽(SEQIDNO:3)均勻地局限在細胞內。因此，能夠驗證本發明的肽加速了角質細胞和表皮層的生長，從而改善皮膚狀態。綜上所述，本發明的IGF-I模擬肽具有與天然產生的IGF-I相同的功能或作用且比天然產生的IGF-I具有更高的穩定性和皮膚滲透。因此，含有本發明的肽的組合物對需要IGF-I活性的疾病或狀態的治療、預防和改善能夠顯示極好的功效。另外，本發明的肽能夠有利地應用于藥物組合物、準藥和化妝品中。已經描述了本發明的優選實施方案，應該理解的是，落入本發明實質內的變化和改變對于本領域技術人員是顯而易見的，并且本發明的范圍由所附權利要求及其等效技術方案所確定。權利要求1、一種肽，該肽具有胰島素樣生長因子-1(IGF-I)活性并且由IGF-I衍生，該肽包含選自SEQIDNO:2～8中的氨基酸序列。2、根據權利要求l所述的肽，其中，SEQIDNO:6的氨基酸序列中的連接體為Ala-Ala二聚體、氨基己酸或氨基丁酸。3、根據權利要求l所述的肽，其中，SEQIDNO:6的氨基酸序列為SEQIDNO:l的氨基酸序列。4、根據權利要求1所述的肽，其中，存在于SEQIDNO:4的氨基酸序列的N-末端和C-末端的Cys殘基被連接形成二硫鍵。5、根據權利要求1所述的肽，其中，所述肽的C-末端被修飾成具有羥基(-OH)或氨基(-NH。。6、根據權利要求1所述的肽，其中，所述肽的N-末端用選自由乙酰基、芴基曱氧羰基、曱酰基、棕櫚酰基、肉豆蔻基、硬脂酰基或聚乙二醇(PEG)組成的組中的保護基保護。7、一種用于改善皮膚狀態或治療牙周疾病的組合物，該組合物包含根據權利要求1~6中任一項所述的肽作為活性成分。8、根據權利要求7所述的組合物，其中，該組合物包含(a)藥用有效量的根據權利要求1~6中任一項所述的肽；和(b)可藥用載體。9、根據權利要求7所述的組合物，其中，該組合物包含(a)美容有效量的根據權利要求1~6中任一項所述的肽；和(b)化妝品可用載體。10、根據權利要求7所述的組合物，其中，所述改善皮膚狀態為改善皺紋或皮膚彈性、預防皮膚老化、預防脫發、促進毛發生長、改善皮膚濕度、去除暗斑或治療痤齊。11、根據權利要求7所述的組合物，其中，該組合物對牙周疾病具有治療功效，并且為牙膏或者用于口腔清潔或口腔護理的組合物。12、一種用于改善皮膚狀態或治療牙周疾病的方法，該方法包括向對象施用包含根據權利要求1~6中任一項所述的肽作為活性成分的組合物。13、根據權利要求12所述的方法，其中，所述組合物包含(a)藥用有效量的根據權利要求1~6中任一項所述的肽；和(b)可藥用載體。14、根據權利要求12所述的方法，其中，所述組合物包含(a)美容有效量的根據權利要求16中任一項所述的肽；和(b)化妝品可用載體。15、根據權利要求12所述的方法，其中，所述改善皮膚狀態為改善皺紋或皮膚彈性、預防皮膚老化、預防脫發、促進毛發生長、改善皮膚濕度、去除暗斑或治療痤瘙。16、根據權利要求12所述的方法，其中，所述組合物對牙周疾病具有治療功效，并且為牙膏或者用于口腔清潔或口腔護理的組合物。17、權利要求1~6中任一項所述的肽在制備用于改善皮膚狀態或治療牙周疾病的組合物中的用途。18、根據權利要求17所述的用途，其中，所述組合物包含(a)藥用有效量的根據權利要求16中任一項所述的肽；和(b)可藥用載體。19、根據權利要求17所述的用途，其中，所述組合物包含(a)美容有效量的根據權利要求16中任一項所述的肽；和(b)化妝品可用載體。20、根據權利要求17所述的用途，其中，所述改善皮膚狀態為改善皺紋或皮膚彈性、預防皮膚老化、預防脫發、促進毛發生長、改善皮膚濕度、去除暗斑或治療痤瘡。21、根據權利要求17所述的用途，其中，所述組合物對牙周疾病具有治療功效，并且為牙膏或者用于口腔清潔或口腔護理的組合物。全文摘要本發明涉及一種具有胰島素樣生長因子-1(IGF-I)活性并且由IGF-I衍生的肽以及包含該肽的用于改善皮膚狀態或治療牙周疾病的組合物。本發明的IGF-I模擬肽具有與天然產生的IGF-I相同的功能或作用且比天然產生的IGF-I具有更高的穩定性和皮膚滲透。因此，含有本發明的肽的組合物對需要IGF-I活性的疾病或狀態的治療、預防和改善能夠顯示出極好的功效。另外，本發明的肽能夠有利地應用于藥物組合物、準藥和化妝品中。文檔編號C07K14/65GK101395179SQ200780007937公開日2009年3月25日申請日期2007年3月6日優先權日2006年3月6日發明者鄭镕池,金榮德,金銀美申請人:凱爾杰有限公司