專利名稱：：血管性腫瘤標志物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種鑒定哺乳動物組織中新血管結構的方法，其中所述新血管結構通過在所述組織中檢測至少一種特異性蛋白進行鑒定。本發明還涉及鑒定與新血管形成相關的疾病或病癥的方法、靶向新血管結構和/或對其成像的方法以及把向與新血管形成相關的疾病或病癥的方法。此外，本發明還涉及新型和/或已知配體(優選抗體，針對新型和/或已知靶蛋白)的用途，用于鑒定哺乳動物組織中的腫瘤細胞，優選哺乳動物腎組織，更優選地哺乳動物血管腎組織。本發明還涉及新型配體，4尤選抗體，包含所述配體或抗體的融合蛋白，包含所述配體、抗體或融合蛋白的藥物和診斷組合物，診斷和治療方法，以及新型蛋白和相應的多核普酸、載體和宿主細胞。現有技術在腫瘤學領域眾所周知，實體腫瘤的生長依賴于其獲取支持性血液供給的能力。在早期階段防止血管形成的抗血管新生已成為一種有希望的抗腫瘤方法。最近的治療概念是靶向破壞已經建立起來的腫瘤血管系統。在動物模型中已證實血管靶向是一種有效的抗胂瘤策略(Neri,D.和Bicknell，R.,Naturereviews.Cancer,vol.5,436-446，June2005》而且大量有希望的化合物已開始臨床試驗。靶向已經建立的腫瘤血管系統代表了一種可選的、有可能成為補充的、而且必定是應用廣泛的療法。很久以前就已知道，腫瘤中的內皮和周圍基質與正常組織中的有所不同，但只是到最近，這些差異才開始在分子水平被表征。在腫瘤的內皮細胞上或者周圍基質中表達的蛋白質已被建議用于治療靶向。(NeriandBicknell,2005,supra)。例如，蓖麻毒素被偶聯到針對實體腫瘤中的小鼠MHCII類抗原的高親合力抗體上。將該偶聯物靜脈內注射進小鼠體內，抗體將蓖麻毒素特異地輸送到腫瘤內皮，在那里其被內在化，引起細胞死亡，隨之而來血管系統崩潰，并根除實體肺瘤(Burrows,F丄和Thorpe,P.E.,PNASUSA90，8996-9000(1993)。在腫瘤血管系統而非正常組織血管系統特異性表達的蛋白質不僅可以被用于抗腫瘤靶向而且可以以特定成像目的用于診斷。為了鑒定腫瘤血管性靶標，大多數研究是基于體外內皮細胞分離物，將其暴露于被認為是模擬正常組織和腫瘤組織的培養條件下，然后使用一系列分子技術鑒定差異表達的基因。盡管基因表達的差異顯而易見，但在分子水平上鑒定差異表達的蛋白被證明是困難的。另一種流行的方法是制備針對不同內皮結構的抗體，這導致鑒定出新的內皮標志物，但沒有鑒定出差異表達的基因，有可能是因為此類蛋白是細胞表面大量組成成分中的微量組分。在另一個最近的方法中，血管系統還用針對血管性抗原的抗體進行體內靶向。在另一個最近的體內靶標方法中，本發明人基于以生物素的反應性酯衍生物對荷瘤小鼠進行尾部灌注，鑒定了正常器官中和腫瘤中的可及抗原(Rybaketal.,Nat.Methods2,291,April2005)。肺瘤特異性的血管性靶標提供了重要的腫瘤診斷信息，并且也使特異性靶向抗腫瘤化合物成為可能。在腫瘤血管系統特異性聚集會積極地減少毒副作用(一般與正常組織中其它部位的抗腫瘤化合物有關)，因此，能夠減少毒性試劑的濃度。此外，腫瘤血管系統特異性的抗腫瘤試劑可以被微注射入動脈血流進入實體腫瘤，附著于其血管系統，并因此提供最少量的毒性外流。簡而言之，一般的肺瘤血管性靶標以及具體而言，特定腫瘤、器官特異性肺瘤等的血管性耙標為腫瘤的診斷和治療提供了一種重要的工具。本發明的目的是鑒定哺乳動物組織中，具體而言是成熟組織中的新血管結構。另一目的是鑒定與哺乳動物中新血管形成相關的疾病或病癥(diseaseorcondition)。進一步的目的是提供用于靶向哺乳動物組織(尤其是成熟組織，更尤其是受疾病影響的組織)中新血管結構和/或對其成像的方法。另外，本發明的目的是提供腫瘤特異性靶標及其用途。本發明的另一目的是提供腎特異性腫瘤靶標，尤其是血管腎腫瘤靶標。本發明提供了新型多肽靶標，用于鑒定新血管結構，尤其是與哺乳動物組織中新血管形成相關的諸如腫瘤、黃斑變性、關節炎和動脈硬化癥的疾病中的新血管結構。如本文中所定義的，新血管系統結構是內皮細胞、胞外基質、周細胞、基質的其它組分和/或緊鄰血管處的患病細胞。此類新血管系統結構可以在肺瘤中，也可以在其它血管新生相關病癥如黃斑變性、動月永硬化癥、類風濕性關節炎等中被發現。此類新血管多肽草巴標選自(1)Periostin[前體],包括其各種亞型(isoforms)以及新的剪接變體A、B、D、E,(2)推定的G-蛋白偶聯受體42,包括其各種亞型，(3)溶質載體家族2(solutecarrierfamily2)，易化葡萄糖轉運體成員1(facilitatedglucosetransportermember1),(4)石危酸軟骨素蛋白多糖(Versican)核心蛋白[前體]，(5)CEACAM3,包括其各種亞型，(6)纖維調節素(Fibromodulin),(7)過氧蛋白(Peroxidasin)同源物[片l殳],(8)可能的G-蛋白偶聯受體37[前體],(9)蛋白sidekick畫l[前體],(10)a1A-電壓依賴型鈣通道，(11)EMILIN2蛋白[片段],(12)唐氏綜合征關鍵區i或蛋白8(Downsyndromecriticalregionprotein8),包4舌其各種亞型，(13)可能的G-蛋白偶聯受體113[前體],(14)ANXA4蛋白[片段],包括其各種亞型，(15)尿調制蛋白-樣l(uromodulin-like1)[前體],包括其各種亞型，(16)清道夫受體F類成員2(scavengerreceptorclassFmember2)[前體],(17)含Sushi結構域的蛋白2(Sushidomain-containingprotein2)[前體],(18)翻譯調控的腫瘤蛋白1(tumorprotein,translationallycontrolled1),(19)推定的G-蛋白偶聯受體(putativeG誦proteincoupledreceptor)Q8TDU0，(20)假定蛋白(hypotheticalprotein)DKFZp686K0275[片段],(21)跨膜蛋白TMEM55A,(22)假定蛋白Q8WYY4,(23)具有序列相似性的家族116,成員A(Familywithsequencesimilarity116,memberA),(24)UPF0240蛋白C6orf66,(25)CDNAFLJ45811fis,克隆NT2RP7014778,(26)假定蛋白DKFZp77901248,(27)卩-脲基丙酸酶(Beta-ureidopropionase),(28)假定蛋白DKFZp434F1919,包括其各種亞型，(29)富含半胱氨酸具有EGF-樣結構域的蛋白2(Cysteine-richwithEGF-likedomainprotein2)[前體],包括其各種亞型，(30)UPF0378家族蛋白KIAA0100[前體],(31)鉀電壓-門控通道亞家族H成員1(potassiumvoltage-gatedchannelsubfamilyHmember1),包4舌其各種亞型。以上血管性靶標中的一些是已知蛋白，而其余的則根據對可能編碼此類蛋白的核苷酸序列進行鑒定而被假定為蛋白。(i)以上三十一種蛋白和(ii)編碼它們的可得到的氨基酸序列和核苦酸序列相應的訪問號下列表1中提供。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>i31j鉀電壓-門控通道亞家族H成員1(電壓-門鉀通道亞基|095259)KvlO.l、Ether-a-go-go鉀通道1、hEAGl.h-eag)(氺以前被il命名為鉀電壓-門控通道亞家族H成員l(KCNHl));(其它亞型)hEAGI095259-2*在現有文獻中以前以此名稱命名**AA,NA=氨基酸序列、核酸序列以上所列蛋白質上下文中的術語"[片段]"和"[前體]"是各蛋白數據庫條目中其實際名稱的一部分，不應認為是以任何方式對本發明范圍的限制。而且，數據庫條目有時包含少量測序錯誤并可能修訂和改動，這是本領域的公知常識。此外，蛋白質可以經翻譯后修飾和差異剪接。因此，優選地，本文中任何提及任何上面三十一種血管性胂瘤標志蛋白之處也指任何序列片段、剪接變體、翻譯后修飾變體和/或其包含進一步延伸的序列以及上面所列蛋白的其它同義詞。本文中更優選地，提及上面的血管性腫瘤標志蛋白包括其變體，該變體可以通過質譜分析加以鑒定，因為該變體含有在實施例末尾的表中用黑體字表示的經鑒定的肽序列。上面的新血管多肽靶標是通過將外科手術取出的腎臟用生物素化試劑進行離體血管灌注而被鑒定的，該生物素化試劑以生物素來標記血管性可及的含伯胺結構。將帶有和不帶有腫瘤的腎臟血管系統中的許多生物素標記的胺結構進行分離、表征及隨后的比較，最終導致鑒定出上面的血管性腫瘤耙標。鑒定程序的細節參見下文實施例1。目前上面的血管性靶標使得血管性靶標特異性配體的制備成為可能。用于本發明用途的配體包括抗體、抗體片段或其功能性衍生物，以及抗體樣結合分子、肽、小的有機分子、適體和如下所述與表1中以上所列的蛋白質之一具有結合親合力的其它結合分子。此類血管靶標特異性配體可用于本發明的方法和用途。在第一方面，本發明涉及鑒定哺乳動物組織中新血管結構的方法，其中所述新血管結構是通過檢測所述組織中至少一種蛋白加以鑒定的，所述至少一種蛋白選自上面表1中所鑒定的蛋白。優選地，哺乳動物組織是成熟的哺乳動物組織，更優選人的成熟組織，最優選腎組織。在本文中所用的術語"成熟組織，，，被理解為表示來自出生哺乳動物的完全分化的組織，優選地成年哺乳動物，且明確地不包括出生前的組織。本發明的另一方面提供了鑒定哺乳動物疾病或病癥的方法，所述疾病或病癥選自肺瘤、黃斑變性、關節炎和/或動脈硬化癥，其中所述疾病或病癥是通過檢測感興趣的哺乳動物組織中和/或緊鄰處的至少一種蛋白加以鑒定的，所述至少一種蛋白選自上面表1中鑒定的蛋白。優選地，所述疾病是肺瘤，更優選人腫瘤，最優選人腎腫瘤。本發明也包括靶向哺乳動物組織中新血管結構和/或對其成像的方法，其中所述新血管結構是通過與所述新血管結構中至少一種蛋白具有特異性結合親合力的配體來耙向和/或成像的，所述至少一種蛋白選自上面表l中鑒定的蛋白。優選地，所述哺乳動物組織是成熟的哺乳動物組織，更優選人的成熟組織，最優選腎組織。本發明的進一步的方面涉及耙向受哺乳動物疾病或病癥影響的組織和/或對其成像的方法，所述哺乳動物疾病或病癥選自腫瘤、黃斑變性、關節炎和/或動脈硬化癥，其中所述疾病或病癥是通過與感興趣的哺乳動物組織中或緊鄰處的至少一種蛋白具有特異性結合親合力的配體來耙行向和/或成像的，所述至少一種蛋白選自上面表1中鑒定的蛋白。優選地，所述疾病是胂瘤，優選人的腫瘤，更優選地人腎腫瘤。盡管單克隆抗體及其衍生物仍是用于藥物生物技術應用的優選結為抗體的替代品被日益廣泛地用于許多應用方面。此類功能性類似物包括適體(BrodyEN,GoldL.,Aptamersastherapeuticanddiagnosticagents.J.Biotechnol.2000Mar.,74(1):5國13.Review)、工程化的小球蛋白(例如，通過莖環的誘變)，用以識別同類抗原(例如anticalins、affibodies、錨蛋白重復(ankydnrepeats)等。[BinzHK,AmstutzP,PluckthunA;Engineeringnovelbindingproteinsfromnonimmunoglobulindomains.NatBiotechnol.2005Oct.,23(10):1257-68.Review.])。具有抗體樣蛋白的球蛋白可以是來源于大型的突變體文庫，例如從大型噬菌體展示文庫中篩選以及可以類似常規抗體的方式分離。同樣地，抗體樣結合蛋白可以通過對球蛋白表面暴露的殘基進行組合誘變而獲得。而且，低分子量的合成有機分子可以被用作血管性腫瘤靶向試劑，條件是它們對于抗原具有足夠的結合親合力和特異性以及適當的藥物動力學特性。因此，在另一方面，本發明涉及對選自表1的蛋白具有特異性結合親合力的至少一種配體，優選地至少一種抗體、其片段或功能性衍生物鑒定哺乳動物組織中的新血管結構，優選鑒定腫瘤的用途。在優選的實施方式中，所述至少一種配體，優選地抗體、其片段或功能性衍生物對選自1A、1B、1D、1E、2、5、7-13、15-17、19-23、25-30的蛋白具有特異性結合親合力。上面表1中的蛋白以及上面剛列出的優選的蛋白是在人腫瘤組織的新血管系統結構中被特異性地鑒定出來。因此，在更優選的實施方式中，本發明涉及在人組織中鑒定腫瘤的本發明用途。表1中的蛋白是在人腎腫瘤組織的新血管系統結構中被鑒定出來的。因此，在進一步更優選的實施方式中，本發明涉及在哺乳動物腎組織、優選人腎組織中鑒定新血管性結構、尤其是鑒定肺瘤的本發明用途。最優選的用于鑒定哺乳動物腎組織、優選人腎組織中的新血管系統結構的蛋白質選自1、2、4—13、15—31。表1中的所有蛋白都是在人腎腫瘤的新血管系統結構中被鑒定的。它們代表腎臟中血流可及的特異性耙標。因此，在最優選的實施方式中，本發明涉及對選自表1的蛋白具有特異性結合親合力的至少一種配體，優選至少一種抗體、其片段或功能性衍生物在哺乳動物血管腎組織、優選地人血管腎組織中鑒定新血管結構、尤其是胂瘤的用途。以上的本發明用途提供了肺瘤的體外和體內診斷方法。例如，與表1的至少一種新血管系統腫瘤靶標具有特異性結合親合力的諸如抗體的配體，可以在允許所述配體、優選抗體與其相應的耙標蛋白結合的條件下與細胞、組織和/或器官接觸。然后配體結合的，優選抗體結合的細胞、組織和/或器官被鑒定為肺瘤或腫瘤相關細胞、組織和/或器官。對結合的配體/抗體的鑒定可以通過技術人員可得的許多常規技術的任一種來完成，所述常規技術已在本領域中成為常規，諸如第二抗體或鑒定偶聯至配體/抗體的標記物如放射性標記和化學標記。所述配體/抗體的接觸步驟和/或對配體/抗體結合的胂瘤細胞、組織和/或器官的鑒定可以在體內，例如通過放射成像的方法來完成。但是，所述接觸步驟也可以在哺乳動物體內完成，隨后分離感興趣的細胞、組織和/或器官，并體外/離體筌定抗體結合的腫瘤細胞。優選地，所述配體/抗體僅被用于體外鑒定腫瘤細胞。術語"體外"施的方法，因此并未違背Art.52(4)EPC。在另一方面，本發明還涉及配體，優選抗體、其片段或功能性衍生物，其與選自上面表1中的蛋白具有特異性結合親合力。優選地，本發明配體，優選抗體、其片段或功能性衍生物與選自下列蛋白的蛋白具有特異性結合親合力(l)Penostin剪接變體A、B、D、E,(5)CEACAM3，包括其各種亞型，(7)過氧蛋白同源物[片段]，(9)蛋白sidekick-l[前體],(12)唐氏綜合征關鍵區域蛋白8，包括其各種亞型，(13)可能的G-蛋白偶聯受體113[前體],(15)尿調制蛋白-樣l[前體],包括其各種亞型，(16)清道夫受體F類成員2[前體],(17)含Sushi結構域的蛋白2[前體],(19)推定的G-蛋白偶聯受體Q8TDU0,(20)假定蛋白DKFZp686K0275[片段],(21)跨膜蛋白TMEM55A,(22)假定蛋白Q8WYY4,(23)具有序列相似性的家族116,成員A,(25)CDNAFLJ45811fis,克隆NT2RP7014778,(28)假定蛋白DKFZp434F1919,包括其各種亞型，(30)UPF0378家族蛋白KIAA0100[前體]。在本文中所使用的術語"特異性結合親合力"應當被理解為表示配體/抗體以顯著的親合力特異性地結合于耙蛋白，而不以顯著的親合力與也位于相同環境中的其它蛋白結合，該環境即試驗體系、體內或體外的診斷或治療裝置、在器官例如腎臟中，并且在相同的條件下，例如pH、溫度、緩沖液等。總而言之，結合特異性是通過與特異性耙分子以及與大量非相關物質進行結合試驗來檢測的。而且，功能檢測、免疫組化和其它方法可以被用于評估特定配體(例如抗體)的結合特異性。對于許多基于能夠特異性結合的配體，例如抗體或球蛋白的生物學試驗(例如ELISA)而言，需要1微摩爾或者更低的解離常數以產生可檢測的結合信號，此信號通常與特異結合模式有關。優選地，用于本發明用途的配體/抗體具有特異性結合親合力，其相對應的解離常數小于大約5,優選地大約1或更小微摩爾(^M),更優選地大約O.lnM或更小，最優選地大約lnM或更小或者甚至lpM或更小。一旦可獲得耙抗原，則本發明的配體如抗體和片段可通過雜交瘤技術(Kohler,G.andMilstein,C.Nature256,495-497,1975)、抗體噬菌體展示(Winteretal.,A腿.Rev.Immunol.12,433-455,1994)、核糖體展示(Schaffitzeletal.,J.Immunol.Methods,231,119-135,1999)和重復菌落過濾篩選(iterativecolonyfilterscreening)(Giovannonietal.,NucleicAcidsRes.29,E27,2001)常規獲得。用于將抗體片斷化成為功能性產物的一般蛋白酶是眾所周知的。其它片斷化技術同樣可以被使用，只要所產生的片段具有特異性的高親合力，并且優選地解離常數在微摩爾至皮摩爾的范圍內。已表明，scFv形式的抗體片段的血管性肺瘤靶向性能關鍵依賴于(至少對于微摩爾至皮摩爾的解離常數而言)抗體對靶標的親合力。例如，特異于血管形成標志物Fibronectin的EDB結構域的高親合力抗體親合力)更有效地耙向腫瘤新血管系統[VitiF,TarliL,GiovannoniL,ZardiL,NeriD.;Increasedbindingaffinityandvalenceofrecombinantantibodyfragmentsleadtoimprovedtargetingoftumoralangiogenesis.CancerRes.1999Jan15;59(2):347-52.]。在某些情況下，結合親和力(例如與特定同型二價抗體形式相關)可以補償中等的單價結合親合力[NielsenUB,AdamsGP,WeinerLM,MarksJD;Targetingofbivalentanti-ErbB2diabodyantibodyfragmentstotumorcellsisindependentoftheintrinsicantibodyaffinity.CancerRes.2000Nov.15,60(22):6434畫40.]。一種非常方便的用于靶向應用的抗體片段是單鏈Fv片段，其中可變重結構域與可變輕結構域通過多肽接頭被連接在一起。用于血管耙向應用的其它抗體片段包括Fab片段、Fab2片段、迷你抗體(也稱為小免疫蛋白)、串聯scFv-scFv融合物以及scFv與適當結構域的融合物(例如具有免疫球蛋白的Fc部分)。關于特定抗體形式的綜述，請參見HolligerP,HudsonPJ.;Engineeredantibodyfragmentsandtheriseofsingledomains.NatBiotechnol.2005Sep.,23(9):1126-36.Review。用于本發明用途的抗體的術語"功能性衍生物"意欲包括任何抗體或其片段，其在氨基酸序列上已被化學修飾，例如通過添加、置換和/或缺失氨基酸殘基，和/或已在其至少一個原子和/或化學官能團中被化學修飾，例如通過加成、缺失、重排、氧化、還原等，只要該衍生物對表1中相應抗原具有基本上相同的結合親合力，并且優選地具有微摩爾、納摩爾或皮摩爾范圍的解離常數。一種用于本發明用途的最優選的抗體衍生物是抗體融合蛋白，其將在下面更詳細的定義。在一種優選的實施方式中，本發明的抗體、其片段或功能性衍生物選自多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、CDR移植抗體、Fv片段、Fab片段和Fab2片段、以及抗體樣結合蛋白。在所述配體，優選抗體、片段和衍生物之后，本發明的進一步的方面涉及包含本發明配體、優選抗體、其片段和衍生物的融合蛋白。如它在本發明的上下文中所用的，術語"融合蛋白，，意欲包括所有偶聯物，其中本發明的配體/抗體、片段或功能性衍生物以某種方式通過例如共價鍵和/或非共價鍵如離子鍵結合于任何其它組分，例如多肽、信號因子，例如白介素、蛋白質、糖類部分、核普酸、生物學活性小分子、毒素、標記物、放射性標記物等。優選地，本發明的融合蛋白此外還包含具有抗胂瘤活性的組分。這將極大地促進抗肺瘤化合物的選擇性以及特異性，因而使得有可能減少施用給需要該藥物的患者的有效量以及減少與所述化合物相關的毒副作用。完整的單克隆抗體代表一類已成熟的藥物，其對于各種適應癥具有廣泛的治療潛力。抗體的恒定部分通常有助于治療潛力，而糖基化可以影響生物學活性(LiH,SethuramanN,StadheimTA,ZhaD,PrinzB,BallewN,BobrowiczP,ChoiBK,CookWJ,CukanM,Houston畫CummingsNR,DavidsonR,GongB,HamiltonSR,HoopesJP,JiangY,KimN,MansfieldR,NettJH,RiosS,StrawbridgeR,WildtS,GerngrossTU;OptimizationofhumanizedIgGsinglycoengineeredPichiapastoris.NatBiotechnol.January2006)。此外，大量血管粑向抗體衍生物可以被考慮用于藥物介入。它們包括帶有放射性核素、光敏劑、脂質體和藥物的抗體偶聯物，以及帶有促凝血劑、細胞因子、趨化因子、毒素、Fc融合物的基于抗體的融合蛋白和雙特異性抗體。更優選地，本發明的融合蛋白包含具有抗胂瘤活性的組分，其選自完整的抗體、含Fc的抗體片段或其Fc功能性衍生物、放射性核苦酸、光敏劑、脂質體、藥物、促凝血劑、細胞因子、趨化因子、毒素以及雙特異性抗體。已確認的是，諸如抗體衍生物的配體可以有助于疾病的診斷和/或分子成像。對于配體/抗體體內定位的宏觀成像而言，最成熟的方法包括侵_用放射性標記的配體/抗體(例如用于PET或SPECT應用)和使用紅外熒光團標記的配體/抗體(例如用于表面熒光成像，用于內窺成像，用于漫射光學X線斷層攝影等)。而且，也可以使用配體/抗體微泡偶聯物(在基于超聲的成像方法中被用作造影劑；JosephS,OlbrichC,KirschJ,HasbachM,BrielA,SchirnerM.;Areal-timeinvitroassayforstudyingfunctionalcharacteristicsoftarget-specificultrasoundcontrastagents.PharmRes.2004Jun.,21(6):920-6.)和/或用于增強MRI成像的配體/抗體偶聯物(KiesslingF,HeilmannM,LammersT,UlbrichK,SubrV,PeschkeP,WaenglerB,MierW,SchrenkHH,BockM,SchadL,SemmlerW.SynthesisandcharacterizationofHE-24.8:apolymericcontrastagentformagneticresonanceangiography.BioconjugChem.2006Jan-Feb;17(l):42-51.)。在另一更優選的實施方式中，根據本發明的融合蛋白包含具有診斷活性的組分，即使得能夠進行抗體組分的體內和/或離體選擇性鑒定。優選地，具有診斷活性的組分選自放射性標記物、焚光團、生物素、螯合金屬或金屬化合物、和微泡。本發明的具有抗腫瘤組分的融合蛋白對于制備藥物是有用的，所述藥物凈皮有效地粑向腫瘤的血管系統，優選腎腫瘤。因此，本發明的進一步的方面涉及本發明融合蛋白制備治療哺乳動物(優選人)癌癥的藥物的用途。優選地，所述藥物是用于治療腎癌，優選人腎癌。本發明的包含具有診斷活性組分的融合蛋白對于制備藥物是有用的，所述藥物被有效地靶向腫瘤的血管系統，優選腎腫瘤。因此，本發明的進一步的方面涉及本發明的融合蛋白制備鑒定哺乳動物(優選人)肺瘤的診斷組合物的用途。優選地，所述診斷組合物用于鑒定哺乳動物腎腫瘤，優選人腎。本發明的另一方面涉及一種藥物組合物，其包含配體，優選抗體、其片段或衍生物，或本發明的融合蛋白以及藥學上可接受的載體和/或稀釋劑。本發明的另一方面涉及一種診斷組合物，其包含配體，優選抗體、其片段或衍生物，或本發明的融合蛋白。本發明的另一方面涉及鑒定哺乳動物組織、優選人組織腫瘤的方法，包括(i)使與選自以上表1中所列的至少一種蛋白具有特異性結合親合力的配體，優選抗體、其片段或功能性衍生物和/或包含配體，優選抗體、其片段或功能性衍生物的融合蛋白與感興趣的哺乳動物組織、優選地感興趣的人組織在允許所述配體和/或融合蛋白與所述蛋白1至31中至少一種特異結合的條件下進行體內和/或離體接觸，和(ii)鑒定特異性結合的配體和/或融合蛋白。優選地，所述至少一種組織蛋白是選自(所有編號以表1為根據)1A、1B、1D、1E、2、5、7-13、15-17、19-23、25-30。更優選地，所述至少一種組織蛋白是選自1-2、4-13、15-31,且感興趣的哺乳動物組織是腎組織。另外，優選感興趣的哺乳動物組織是血管性腎組織，優選地人血管性腎組織。更優選地，本發明方法的所述步驟(i)和/或(ii)是在離體即體外完成的。最優選地，本發明的方法是對新血管結構成像的方法，具體而言是對癌細胞成像的方法，優選腎腫瘤，更優選體內的血管腎腫瘤。本發明還鑒定了大量新型蛋白，它們可作為新型腫瘤標志物、新型腎特異性腫瘤標志物、新型和特異性的腎腫瘤血管系統標志物，并可以被作為抗原用于提供特異性和高親合力的抗體來作為診斷和治療手段。Periostin的四種新型剪接變體Periostin是90kDa的蛋白，最初命名為成骨細胞特異性因子-2(OSF-2,也稱為PN)，由成骨細胞分泌(Takeshitaetal.,BiochemJ,294(Pt1),271-8,1993)。Tai和同事通過雜交瘤技術制備了單克隆抗periostin抗體，并通過蛋白質免疫印跡檢測人periostin蛋白在腎上腺、肺、甲狀腺、子宮、陰道、卵巢、睪丸、前列腺和在胃腸道中的表達，在胃和結腸直腸中優先表達，同時注意到在小腸和食道中的較低水平(Taietal.,Carcinogenesis,26,908-15,2005)。已有penostin與大量癌癥相關的觀測結果。但是，在現有
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periostin還未被與腎肺瘤相聯系。對于于人periostin,Takeshita和同事(Takeshita,Kikunoetal.,BiochemJ,294(Pt1),271-8,1993)已報道可以產生五種可變剪接轉錄本，且periostin的所有剪接事件都發生在C末端區域。相同小組已在小鼠中發現四種可能的periostin亞型，它們由六種不同的表達盒組合產生(Horiuchi，Amizukaetal.,J.BoneMinerRes"14,1239-49,1999)。這些亞型的功能尚未闡明。Litvin和同事鑒定了小鼠periostin的另一種亞型并將其命名為periostin樣因子(PLF)(Litvinetal.,J.CellBiochem.,92,1044-61,2004)。全長PLFcDNA的序列分析和預測的aa序列表明其與小鼠periostin的Horuichi's亞型3最為相似(Litvin,Selimetal.,JCellBiochem,92,1044-61,2004)。本發明首次證實periostin在是一種在腎癌中過量表達的蛋白。因此，它可以被用作容易通過血流可及的優秀腎胂瘤標志物，這樣，也是基于配體的肺瘤靶向策略的一種有用的靶標。用抗periostin的抗體進行免疫組化分析進一步證明與正常腎組織相比，periostin在腎透明細胞癌的腫瘤間質中高度過量表達。PeriostinC末端區域的PCR擴增顯示了至少八種不同的剪接變體。在公共蛋白質數據庫(Expasy和NCBI)中，只描述了四種不同的人periostin亞型(全長形式和三種剪接亞型Q5VSY8、Q5VSY7和Q5VSY6)。在所有公開的亞型之后，四個新的亞型，稱為亞型A、B、D和E(分別參見SEQIDNO:9、11、13、15)被鑒定出來。相應的分析表明在不同組織中亞型的轉錄本有不同的分布。發現periostin的轉錄本在正常的成年腎cDNA中僅微弱表達(或幾乎不可4全測)，而從透明細胞癌樣本則可以以不同長度的亞型#:擴增出來。此結果與僅在對肺瘤組織的蛋白質組分析中鑒定出periostin是一致的。胎兒腎臟也是periostin陽性，但亞型的分布與那些登記在所有受檢胂瘤組織中的不同。Periostin轉錄本的表達同樣可以在正常的成年腦和肝中看到。但是在腦和肝cDNA文庫中periostin亞型的分布顯示出腫瘤、胎兒和正常成年樣本之間的不同。檢測到的最小的periostin轉錄本主要在腫瘤樣本中表達，在至少四種不同的腎臟和肝臟肺瘤中出現，但在正常樣本中不可檢測，而在正常成年腦和胎兒腎中僅剛剛可檢測到。令人驚訝地，質譜分析顯示了亞型特異性的三種肽EIPVTVYKPIIKK、EIPVTVYRPTLTK和IITGPEIK,因為它們包含了僅存在于特定亞型中的兩外顯子的連接部。期望配體，優選針對僅存在于在腫瘤(甚至特定類型的腫瘤)中特異性表達的新型periostin亞型的"連接肽"的抗體會提供非常強有力的工具來選擇性靶向和破壞這些腫瘤。在一方面，本發明涉及periostin剪接變體蛋白、片段或功能性衍生物，包括含有氨基酸EIPVTVYGPEIK的肽。優選地，本發明此方面涉及periostin剪接變體蛋白A、B、D或E,其分別具有選自SEQIDNOs:9、11、13、15的氨基酸序列，其片l殳或功能性衍生物，其中其片段或功能性衍生物的氨基酸序列包括至少20，優選至少30,更優選至少50個氨基酸，最優選至少75個氨基酸，且a)其中SEQIDNO:9的片段或功能性衍生物具有反映在SEQIDNO:1的位置670-756，或者位置670-756和783-810的缺失的氨基酸序列；b)其中SEQIDNO:11的片段或功能性衍生物具有反映在SEQIDNO:1的位置670-726和784-810,或者位置784-810的缺失的氨基酸序列；優選地，此剪接變體包括含有氨基酸序列EIPVTVYGPEIK的肽。c)其中SEQIDNO:13的片段或功能性衍生物具有反映在SEQIDNO:1的位置670-756的缺失的氨基酸序列；d)其中SEQIDNO:15的片段或功能性衍生物具有包含在SEQIDNO:15的位置421處纈氨酸的氨基酸序列以及反映在SEQIDNO:1的位置671-697的缺失的氨基酸序列。一種優選的實施方式涉及本發明的periostin剪接變體，其與本發明的以上蛋白、片段或功能性衍生物具有至少80,優選85,更優選90,最優選地至少95或98%的氨基酸序列同一性，其中所述氨基酸序列不是SEQIDNO:1、3、5和7中任一個序列。此外，本發明涉及多核苷酸，其編碼4種新型剪接變體任一種的上述本發明蛋白、片段或衍生物。本發明蛋白的功能性衍生物意欲包括任何氨基酸序列和/或化學衍生物，其具有相當充裕的可利用氨基酸殘基以建立與原蛋白具有親合力的抗體相同的結合親合力。優選地，功能性衍生物含有缺失(包括N末端或C末端截短)、添加和/或置換，更優選地保守氨基酸置換。本發明的片段或功能性衍生物含有原全長蛋白的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75或至少100個氨基酸。為確定多肽間的序列同一性，技術人員可以借助本領域技術人員已^口的大量才示準算法。優選地,在http:〃www.expasy.org/tools/blast/禾口oWindows&AUTO—FORMAT=Semiauto&ALIGNMENTS=250&ALIGNMENT—VIEW=Pairwise&CDD—SEARCH=on&CLIENT=web&DATABASE=nr&DESCRIPTIONS=500&ENTREZ—QUERY=%28none%29&EXPECT=10&FILTER=L&FORMAT—OBJECT=Alignment&FORMAT—TYPE=HTML&I—THRESH=0.005&MATRIX—NAME=BLOSUM62&NCBI—GI=on&PAGE=Proteins&PROGRAM=blastp&SERVICE=plain&SETDEFAULTS.x=41&SET—DEFAULTS.y=5&SHOW—OVERVIEW=on&END—OFHTTPGET=Yes&SHOW—LINK〇UT=yes&GET—SEQUENCE:yes的BLAST程序，更優選地用默認設置，被用來鑒定本發明的蛋白、蛋白片段或蛋白^f';亍生物的氨基酸序列同一性。在一些實例中，本發明還提供了編碼本發明蛋白、其片段或功能性衍生物的新型多核普酸，特征在于它們具有與明確引用的核酸序列在嚴謹條件下雜交的能力。除了現有
技術領域：
中確定與明確引用的核酸序列在嚴謹條件下雜交的能力的普通和/或標準規程外，優選使用比對工具(例如http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgiCMD=Web&LAYOUT=TwoWindows&AUTO—FORMAT=Semiauto&PAGE=Nucleotides&NCBI—GI=yes&FILTER=L&HITLIST—SIZE=100&SHOW—OVERVIEW=yes&AUTO—FORMAT=yes&SHOW—LINKOUT二yes)通過比4交兩種蛋白的核苷酸序列來分析和確定與明確引用的核酸序列在嚴謹條件下雜交的能力，所述核苷酸序列可在基因數據庫中找到(例如http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgidb=nucleotide)。在本發明上下文中所用的術語"編碼蛋白的多核普酸"意欲包括等位基因變異和遺傳密碼冗余。此外，本發明提供了根據權利要求40至93任一權利要求的新型蛋白、其片段和衍生物，以及編碼它們的核苦酸。更明確地，本發明提供了蛋白5(3x)、7、9、12(6x)、13、15(4x)、16、19-23、25、28(2x)、30、31(2x),其具有如對應的SEQIDNO:所示的氨基酸序列(命名參見表l),其片段或功能性衍生物。而且，在優選的實施方式中，本發明涉及與上面的蛋白5(3x)、7、.gov/BLAST/BlastcgiCMD=Web&LAYOUT=Tw9、12(6x)、13、15(4x)、16、19-23、25、28(2x)、30、31(2x)，其片段或功能性衍生物具有至少70,優選80,更優選90,最優選至少95%氨基酸序列同一性的蛋白、其片段或功能性衍生物。此外，本發明涉及編碼根據本發明以上提及的上述任一種蛋白5(3x)、7、9、12(6x)、13、15(4x)、16、19-23、25、28(2x)、30、31(2x)，其片段或功能性衍生物的多核苦酸，其具有與編碼完整蛋白的相應核酸序列(命名參見表l)在嚴謹條件下雜交的能力本發明還包括載體，其包含編碼本發明的蛋白、片段和功能性衍生物的多核普酸，以及宿主細胞，其包括本發明所述的蛋白、片段和功能性衍生物和/或載體。最后但并非最不重要，本發明進一步的方面涉及應用本發明的多核苷酸、載體和/或宿主細胞重組生產本發明的蛋白、片段和功能性衍生物的方法。以下將簡要討論已證實了它們作為腫瘤靶標用途的靶蛋白，尤其是作為血管性腎腫瘤靶標用途的靶蛋白。蛋白#2該經鑒定的肽可以是分別來源于兩種蛋白亞型(表l:2):游離脂肪酸受體3(014843)和/或推定的G蛋白偶聯受體42(015529)中的一種或兩者。在所述G蛋白偶聯受體基因超家族的家族A(也被分類為家族1)中，有著系統發生學上相關的一組90個受體，其對異常廣泛的各種配體類型產生反應，鑒于它們初級序列相對密切的相似性(BockaertandPin,EmboJ,18，1723-9,1999)。游離脂肪酸受體3在全部三篇公開的關于此受體的研究中都是在動物脂肪中被檢測到(Brownetal.,J.Biol.Chem.,278,11312-9,2003;LePouletal.,J.Biol.Chem.,278,25481-9,2003;Xiongetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,101,1045-50,2004)。目前，還未知區分GPR41和GPR42的抗體。任一種此類蛋白在肺瘤中的表達或者甚至過量表達尚未被報道過。蛋白#3溶質載體家族2,易化葡萄糖轉運體成員1(SLC2A1)(=葡萄糖載體類型1,紅細胞/腦(GLUTl))(P11166)葡萄糖攝取的增加是惡性組織中發現的主要代謝變化之一。此攝取是由葡萄糖轉運(Glut)蛋白介導的，其為負責葡萄糖跨細胞膜轉運的膜蛋白。此類人葡萄糖轉運蛋白具有獨特的組織分布，有助于在各種調節下對葡萄糖的處理(PessinandBell,AnnuRevPhysiol,54,911-30,1992)。一個七種葡萄糖轉運蛋白的家族已被克隆。其中，Glutl(其也被稱為溶質載體家族2，易化葡萄糖轉運體成員1(SLC2A1))在紅細胞、血腦屏障、外周神經的神經束膜和胎盤中表達(Froehneretal.,J.Neurocytol.,17,173-8,1988;Pardridgeetal.,JBiolChem,265,18035-40,1990;PessinandBell,Annu.Rev.Physiol.,54,911-30,1992;Takataetal.,CellTissueRes,267,407-12,1992)。在現有技術中，Glutl已與大量胂瘤相聯系。通過免疫組織化學，Glutl也被顯示出在腎癌中有所表達(Nagaseetal.,JUrol,153,798-801,1995;Northetal.,ClinNeuropathol,19,131-7,2000)。本發明首次說明了Glutl是一種容易由血流可及的蛋白，表明此腫瘤標志物對于基于配體的腫瘤靶向策略是一種有用的靶標。蛋白#4硫酸軟骨素蛋白多糖核心蛋白[前體](13611)是一種大型胞外基質蛋白多糖，其存在于各種組織中并且在細胞黏附和生存、細胞增殖、細胞遷移和胞外基質組裝的調控過程中發揮作用(Wight,CurrOpinCellBiol,14,617-23,2002)。此外，有證據表明硫酸軟骨素蛋白多糖在血管新生和腫瘤中過量表達。本發明令人驚訝地證明了硫酸軟骨素蛋白多糖在腎癌中的表達，表明此胂瘤標志物對基于配體的腫瘤耙向策略是一種有用的耙標。蛋白#5令人驚訝地，肽SDPLKLTVK僅在腫瘤中被鑒定出來，而在正常腎樣本中則沒有。此肽是SwissProt數據庫中三個不同序列條目的一部分，所述三個不同序列條目為具有292個氨基酸殘基的CEACAM3(Q6UY47)、具有293個氨基酸殘基的癌胚抗原相關細胞黏附分子(基因名稱CEACAM21)(Q3KPI0)和具有235個氨基酸殘基的R29124(075296)。此類蛋白的存在是根據DNA序列分析假定的，但未經實驗證實。所述三個序列共享98%以上同一性，含有最多3個錯配。這些數據表明這三個序列要么屬于相同的蛋白，而差異是來自于測序錯誤，要么這些序列對應于同一蛋白的不同亞型。這些序列表現出與CEACAM家族，人癌胚Ag(CEA)蛋白家族亞族的其它蛋白顯著的相似性(Beaucheminetal.,ExpCellRes,252,243-9,1999)。盡管大量CEACAM已在蛋白水平被加以研究，但對于本發明中鑒定的蛋白而言，似乎事實并非如此。已在蛋白水平真正研究過的對于CEACAM的最高相似性是針對膽汁糖蛋白前體(CEACAM1)的，并且僅為最多44%。此外，CEACAM1序列并不包含所鑒定的肽。本發明令人驚訝地鑒定了肽SDPLKLTVK,因此證實了具有數據庫條目Q6UY47、Q3KPI0和075296中所預測序列的蛋白的存在。目前，還沒有可獲得的特異性地識別此蛋白的抗體。此外，本發明在腫瘤中鑒定了上述肽，而在正常腎中則沒有，因此，表明所述蛋白作為一種新型標志物在人腫瘤中過量表達，更優選地作為人腎腫瘤標志物，最優選地作為容易通過血流可及的人腎肺瘤標志物，這樣，可用作基于配體的腫瘤靶向策略的靶標。蛋白#6在本發明中，肽YLPFVPSR作為蛋白纖維調節素(Q8IV47)的一部分被加以鑒定。纖維調節素最初被描述為一種59-kDa蛋白(Heinegardetal.,JBiolChem,261,13866-72,1986),其與膠原蛋白I型和II型相互作用(HedbomandHeinegard,JBiolChem,264,6898-905,1989),并出現在專欠骨的膠原纖維上(Hedlundetal,MatrixBiol.,14,227-32,1994)。纖維調節素被認為在膠原纖維的形成過程中發揮了重要的作用，如通過對無FM鼠在腱中形成異常膠原原纖維的觀察所顯示的(Svenssonetal.,J.Biol.Chem.,274,9636-47,1999)。此蛋白已被與大量腫瘤相聯系。令人驚訝地，本發明揭示了纖維調節素蛋白在腎癌中的過量表達，因此表明所述蛋白作為一種新型的人腎肺瘤標志物，更優選地作為容易通過血流可及的人腎肺瘤標志物，這樣，可用作基于配體的胂瘤耙向應用的耙標。蛋白#7過氧蛋白同源物[片段](也被命名為黑素瘤相關抗原MG50)(Q92626)最初是通過cDNA消減方法加以鑒定的，其中cDNA克隆是在通過原位空斑雜交篩選了黑素瘤表達文庫之后，用消減的黑素瘤cDNA探針(黑素瘤細胞系減去肺癌細胞系)加以分離的(Hutchinsetal.,CancerRes,51,1418-25,1991)。令人驚訝地，本發明證明過氧蛋白同源物[片段]僅在腫瘤樣本中#皮鑒定出，而在正常腎組織中則沒有，因此表明此蛋白作為腫瘤標志物的用途，更優選作為腎腫瘤標志物，更優選作為容易通過血流可及的腫瘤標志物。值得注意的是，過氧蛋白同源物[片段]目前僅是由特定的mRNA序列證明來假定的，而此蛋白的存在尚未在自然界被證實。蛋白#8肽MRAPGALLAR,令人驚訝地僅在腎腫瘤中^皮鑒定出，其與可能的G蛋白偶聯受體37[前體](015354)的蛋白序列相匹配。孤兒G蛋白偶聯受體GPR37和相關基因編碼推定的G蛋白偶耳關受體亞家族，其在哺乳動物中樞神經系統中高度表達。Toyota和同事發現GPR37是急性骨髓白血病(AML)中啟動子相關富含CpG區(被稱為CpG島)表現出高甲基化的基因之一(Toyotaetal.,Blood,97,2823-9,2001)。此類高甲基化可以導致基因沉默，其通過DNA曱基轉移酶的作用經有絲分裂而被克隆繁殖。此類甲基化相關沉默作用在瘤形成的肺瘤抑制基因沉默過程中起到了病理作用。令人驚訝地，本發明在腫瘤中鑒定了GPR37,而在正常腎中則沒有，并證明此蛋白在腫瘤中過量表達，因此表明此蛋白作為新型標志物在人腫瘤中過量表達，更優選地作為人腎肺瘤標志物，最優選地作為容易通過血流可及的人腎肺瘤標志物，這樣，可用作基于配體的腫瘤耙向應用的革巴標。蛋白#9蛋白sidekick-1[前體](Q8TEN9)的存在是根據對全長cDNAs的測序而假定的(Nagase,Tetal.,KazusaDNAResearchInstitute,directsubmissiontotheNCBIdatabase),4旦未經實驗證實。令人驚訝地，已證明此蛋白存在(通過對肽AELTDLK的鑒定，其對此蛋白是特異性的)，并且該蛋白在腫瘤新血管系統結構中和/或周圍過量表達，因此開辟了血管性靶向生物醫藥應用。蛋白#10蛋白alA-電壓依賴型鈣通道被證實在稱為脊髓小腦共濟失調類型6(SCA6)的疾病中是突變的，所述疾病是一種常染色體顯性神經退化性疾病(Toru,Setal.,J.Biol.Chem.275,10893-8,2000)。至今，沒有得到關于其在正常組織或腫瘤組織中表達的數據。令人驚訝地，通過對胰蛋白酶酶解肽RGALVGAPR的鑒定，本發明證明其在胂瘤新血管系統結構中和/或周圍過量表達，因此表明血管性革巴向生物醫藥應用。蛋白#11EMILIN2蛋白[片段](彈性蛋白微纖維界面定位蛋白(elastinmicrofibrilinterfaselocatedProtein2),Q8N5L1)是一種彈性纖維相關并唐蛋白。EMILIN2蛋白mRNA的表達已被Colombatti的研究小組證實(Doliana,Retal.,JBiolChem.276,12003-11,2001)。該蛋白具有局限在脊髓、外周白細胞、肺、胎盤和胎兒心臟的表達模式。此外，該研究小組展示了人平滑肌肉瘤細胞的免疫組織化學，表明EMILIN1和EMILIN2的部分共定位。Forrest的研究小組(Amma,LLetal.,MolCellNeurosci.23,460-72,2003)用northern印跡分析證實了EMILIN2蛋白局限于心臟、肺和耳蝸的表達模式。通過鑒定該蛋白特異性的胰蛋白酶酶解肽RGALVGAPR,其在腫瘤新血管系統結構中和/或周圍的過量表達被令人驚訝地證明了，因此表明血管性靶向生物醫藥應用。蛋白#12唐氏綜合征關鍵區域蛋白8(也被命名為惡性黑素瘤相關蛋白1)(Q96T75)具有6種不同的剪接亞型。胰蛋白酶酶解肽LFMPRPK對于這6種剪接亞型中的5種是特異性的(參見表1)。令人驚訝地，所述唐氏綜合征關鍵區域蛋白8(其中總共6種亞型被公開)的5種剪接亞型Q96T75、Q6EXA9、Q684H4、Q96T75-2和Q96T75-3中的一種或多種在胂瘤新血管結構中和/或周圍的過量表達被證明了，因此表明血管性耙向生物醫藥應用。蛋白#13所述蛋白可能的G蛋白偶聯受體113[前體](Q8IZF5)在關注新型人G蛋白偶聯受體的大規模BLAST研究過程中被鑒定出來(Fredriksson,Retal.,FEBSLett531,407-14,2002)。令人驚訝地，本發明在腫瘤中鑒定了可能的G蛋白偶聯受體113[前體]。通過鑒定該蛋白特異性的胰蛋白酶酶解肽NKISYFR,其在腫瘤新血管系統結構中和/或周圍的過量表達被證明，因此表明血管性靶向生物醫藥應用。蛋白#14蛋白數據庫條目膜聯蛋白A4(P09525)和蛋白ANXA4[片段](Q6LES2)具有除Q6LES2的最初2個氨基酸以外相同的氨基酸序列。因此，這兩條數據庫條目的差異可能要么是測序錯誤的結果，要么是此蛋白有兩種亞型存在。Zimmermann等(Zimmermarm,Uetal.,CancerLett.209,111-8,2004)在其關于透明細胞腎細胞癌的論文中表示，在正常細胞中annexinA4集中在細胞核周圍，而在肺瘤細胞中該蛋白則定位于基側膜。這表明膜聯蛋白IV的亞細胞分布是與該細胞和其鄰居之間附著的性質相聯系的。此結果表明一種可能性，即膜聯蛋白IV在透明細胞腎細胞癌的形態變化過程和擴散過程中發揮了重要的作用。令人驚訝地，本發明通過鑒定所述蛋白特異性的胰蛋白酶酶解肽ISQTYQQQYGR證明了其在腫瘤新血管系統結構中和/或周圍的過量表達，因此表明血管性靶向生物醫藥應用。蛋白#15(4x)尿調制蛋白-樣l[前體](也^皮命名為嗅素)(Q5DID0、Q5DID0-2、Q5DID0-3和Q5DID0-3)被鑒定為一種新型膜結合蛋白，其由嗅覺和犁鼻感覺神經元特異性表達(DiSchiavi,E.etal.,Eur.J.Neurosci.21,3291-300,2005)。該研究小組用融合于flag標簽的嗅素轉染HEK細胞，并用抗flag的抗體鑒定了此融合蛋白。令人驚訝地，本發明通過鑒定所述蛋白特異性的胰蛋白酶酶解肽IVNHNLTEKLLNR證明了其在肺瘤新血管系統結構中和/或周圍的過量表達，因此表明血管性靶向生物醫藥應用。在現有技術中，所述蛋白嗅素也被稱為尿調制蛋白-樣，同樣具有四種不同的剪接亞型(參見表l)。蛋白#16所述蛋白清道夫受體F類成員2[前體](Q96GP6)已被證明在胚胎發生期間在小鼠的毛嚢、皮膚和鼻上皮，以及在舌和口腔上皮、經歷骨化作用的肋骨和胸腺的髓質區域中均有所表達(Hwang,Metal.,GeneExprPatterns.5,801-8,2005)。令人驚訝地，通過鑒定所述蛋白特異性的胰蛋白酶酶解肽GAGPARRR證明了其在肺瘤新血管系統結構中和/或周圍的過量表達，因此表明血管性耙向生物醫藥應用。蛋白#17所述含sushi結構域的蛋白2[前體](Q9UGT4)被Lubec研究小組通過2D畫PAGE和MALDI質譜(Lubec,G.etal.,J.Chem.Neuroanat.26,171-8,2003)在人的皮質神經元細胞系HCN-2中明確地鑒定。令人驚訝地，通過鑒定所述蛋白特異性的胰蛋白酶酶解肽VAHQLHQR證明了其在腫瘤新血管系統結構中和/或周圍的過量表達，因此表明血管性耙向生物醫藥應用。蛋白#18所述翻譯調控的腫瘤蛋白1(TCTP)已被了解20多年。在Bommer和Thiele的綜述(Int.J.Biochem.CellBiol.36,379-85,2004)中,突出了TCTP對于細胞生長的重要性及其抗凋亡活性。令人驚訝地，通過鑒定所述蛋白特異性的胰蛋白酶酶解肽KWVKINNVK證明了其在肺瘤新血管系統結構中和/或周圍的過量表達，因此表明血管性靶向生物醫藥應用。蛋白#19所述推定的G蛋白偶聯受體(Q8TDU0)的存在是根據人基因組的序列同源性研究而假定的(Takeda,Setal.,FEBSLett.520,97-101,2002),但未經實驗證實。本發明令人驚訝地證明此蛋白事實上是存在的(通過鑒定肽LSVVEAPCR,其對于此蛋白是特異性的)，并且還證明其在肺瘤新血管系統結構中和/或周圍被過量表達，因此表明血管性耙向生物醫藥應用。蛋白#20所述假定蛋白DKFZp686K0275(Q7Z3A1)的存在是根據對全長cDNA的測序而，i定的(Wiemann,Setal.,MolecularGenomeAnalysis,GermanCancerResearchCenter(DKFZ),directsubmissiontotheNCBIhomepage),^f旦未經實騶r證實。本發明令人驚訝地證明此蛋白事實上是存在的(通過鑒定肽AGQGFGLR,其對于此蛋白是特異性的)，并且還證明其在腫瘤新血管系統結構中和/或周圍被過量表達，因此表明血管性耙向生物醫藥應用。蛋白#21所述跨膜蛋白TMEM55A(Q8N4L2)的存在是根據對全長cDNA的測序而假定的(Strausberg,RL.etal.,Proc.Natl.Acad.Sd.USA.99,16899-903,2002),但未經實-瞼證實。本發明令人驚訝地證明此蛋白事實上是存在的(通過鑒定肽KISSVGSALPR,其對于此蛋白是特異性的)，并且還證明其在腫瘤新血管系統結構中和/或周圍被過量表達，因此表明血管性靶向生物醫藥應用。蛋白#22所述假定蛋白(Q8WYY4)的存在是根據對全長cDNA的測序而假定的(Gu,JR.etal.,NationalLaboratoryForOncogenes&RelatedGenes,ShanghaiCancerInstitute,directsubmissiontotheNCBIhomepage),但未經實驗證實。本發明令人驚訝地證明此蛋白事實上是存在的(通過鑒定肽VLTAMVGK，其對于此蛋白是特異性的)，還證明其在腫瘤新血管系統結構中和/或周圍被過量表達，因此表明血管性靶標生物醫藥應用。蛋白#23所述具有序列相似性的家族116成員A(Q8IWF6)的存在是根據對全長cDNA的測序而假定的(Strausberg,RL.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.99,16899-903,2002),但未經實驗證實。本發明令人驚訝地證明此蛋白事實上是存在的(通過鑒定肽GPAGLGPGSR，其對于此蛋白是特異性的)，并且還證明其在胂瘤新血管系統結構中和/或周圍被過量表達，因此表明血管性靶向生物醫藥應用。蛋白#24所述蛋白UPF0260蛋白C6orf66(Q9P032),其也被稱作HRPAP20(激素調節的增殖相關蛋白20kDa),已被證明在穩定轉染的MCF-7(人的乳腺癌)細胞中在缺乏激素刺激的情況下具有增強增殖的作用，而在缺少血清的情況下具有增加存活的作用。Karp等(Karp,CMetal.,CancerRes.64:1016-25,2004)推斷HRPAP20是一種磷蛋白質，它是激素依賴型肺瘤細胞的增殖和存活所必需的。本發明首次證明此蛋白在人腫瘤中的過量表達(通過鑒定此蛋白特異性的胰蛋白酶酶解肽MGALVIR),且更優選地在人腫瘤新血管系統結構中過量表達，因此表明血管性靶向生物醫藥應用。蛋白#25所述蛋白CDNAFLJ45811fis,克隆NT2RP7014778(Q6ZS59)的存在是根據對全長cDNA的測序而假定的(Isogai,Tetal.,NEDOhumancDNAsequencingproject,directsubmissiontotheNCBIhomepage),但未經實驗證實。本發明令人驚訝地證明此蛋白事實上是存在的(通過鑒定肽QFWLGGVAR,其對于此蛋白是特異性的)，并且還證明其在腫瘤新血管系統結構中和/或周圍被過量表達，因此表明血管性靶向生物醫藥應用。蛋白#26&27所述經鑒定的肽(EAFEAASR)無法對所述的兩種蛋白假定蛋白DKFZp77901248(Q6AHZ8)和卩-脲基丙酸酶(Q9UBRl)加以區分。RZPD主頁(http:〃www.rzpd.de)將假定蛋白DKFZp77901248鏈接于卩-脲基丙酸酶。P-脲基丙酸酶是一種蛋白質，此蛋白的缺陷會導致嘧啶降解通路的先天性障礙(vanKuilenburg,ABetal.,HumMolGenet.13,2793-801,2004)。還沒有公開的數據將p-脲基丙酸酶與癌癥相聯系。令人驚訝地，本發明證明其在肺瘤新血管系統結構中和/或周圍被過量表達，因此表明血管性耙向生物醫藥應用。蛋白#28所述假定蛋白DKFZp434F1919(Q9GZU6)及其亞型MDS011(Q9GZT6)(所述兩種蛋白具有99.6%的氨基酸序列同一性)的存在是根據對全長cDNA的測序而假定的(Ota,Tetal.,NatureGenetics36,40-45,2004),但未經實-驗證實。本發明令人驚訝地證明此蛋白事實上是存在的(通過鑒定肽IDAEIASLK,其對于此蛋白是特異性的)，并且還證明其在腫瘤新血管系統結構中和/或周圍被過量表達，因此表明血管性靶向生物醫藥應用。蛋白#29所述蛋白富含半胱氨酸具有EGF-樣結構域的蛋白2[前體](6個亞型，參見表l)的表達已針對不同正常組織(northernblot)和腦(免疫組織化學)被加以研究(Ortiz,JAetal.,JNeurochem.95,1585-96,2005),但還沒有關于腫瘤組織的數據可得到。令人驚訝地，本發明證明在腫瘤新血管系統結構中和/或周圍的過量表達，因此表明血管性靶向生物醫藥應用。蛋白#30所述UPF0378家族蛋白KIAA0100[前體](Q5H9T4)的存在是根據對cDNA的測序而假定的(Ottenwaelder,B.etal.,TheGermancDNAConsortium,directsubmissiontotheNCBIdatabase),4旦未經實馬全證實。本發明令人驚訝地證明此蛋白事實上是存在的(通過鑒定肽KLQAELK，其對于此蛋白是特異性的)，并且還證明其在腫瘤新血管系統結構中和/或周圍被過量表達，因此表明血管性耙向生物醫藥應用。蛋白#31在本發明中，所述肽SPILAEVK被鑒定為蛋白鉀電壓-門控通道亞家族H成員1(095259)的部分。此蛋白存在兩種亞型(isoforms),兩者都含有此肽(095259&095259-2(hEAG))。Pardo和同事(Pardoetal.,EMBO丄，18,5540-5547,1999)證實對此蛋白表達的抑制會引起細胞增殖的顯著減少。他們證實KCNH1在乳房及腦腫瘤細胞中表達。此外，通過免疫組織化學，在宮頸癌中檢測到表達(Fariasetal.,CancerRes.,64,6996-7001,2004)。令人驚訝地，本發明揭示了所述蛋白鉀電壓-門控通道亞家族H成員l在腎癌中的過量表達，因此，表明所述蛋白作為新型人腎腫瘤標志物，更優選作為容易通過血流可及的人腎肺瘤標志物，這樣，可用作基于配體的腫瘤耙向應用的耙標。圖l.(A)是離體腎臟灌流程序的示意圖，該程序被用來鑒定腎臟血管系統中的腫瘤標志物。在腎切除術后兩分鐘之內，將荷瘤腎臟用生物素的反應性酯衍生物進行灌注，從而洗去血液成分并將可及的蛋白生物素化。生物素化的組織樣本可以被切下，分別處理以純化生物素化的蛋白，產生胰蛋白酶酶解肽，其通過nano-HPLC加以分離并通過基質輔助激光解吸附電離串聯飛行時間(MALDI-TOF/TOF)質譜進行分析。(B)荷瘤腎臟，在離體灌注后被切成兩半。使用基于親合素-辣根過氧化物酶的染色流程，對組織切片中生物素化的結構在腫瘤部分(C)和正常腎臟部分(D)進行檢測。在腫瘤塊中，血管結構被優先生物素化。圖2顯示通過cDNA文庫的半定量PCR分析確認靶標[透明細胞癌，泳道l;顆粒細胞癌，泳道2;移行細胞癌，泳道3;正常胎兒腎，泳道4;正常成人腎，泳道5]。(*)與其它蛋白不同，CEACAM3用MASCOT軟件分配的置信度對于最佳肽離子是在95%以下，并且即使在肉眼檢查MS-MS鐠圖后也明確的。圖3是用對periostin(A)和硫酸軟骨素蛋白多糖(B)特異性的抗體對正常腎和腫瘤切片的免疫組織化學分析結果。用抗periostin的抗體染色，在正常腎樣品中顯示出低背景著色，而在受調查的8個肺瘤中的8個都表現出強烈的過量表達。硫酸軟骨素蛋白多糖在8個腫瘤中的6個強烈地過量表達，但并未使正常腎和其它正常組織著色。染色反應并未出現在省略了第一抗體的陰性對照實驗中。標尺-XXX。圖4(A)顯示periostin各種亞型的蛋白序列比對情況，限于該蛋白的羧基末端區域，在那里發生了可選剪接。圖4(B)是不同的外顯子組合的圖解表示，該外顯子對應于插圖A中所示的區域。在本研究中所鑒定的亞型被命名為《A》至《E》。藍灰色圖5periostin亞型特異性肽的鑒定。(A)HPLC組份的MALDI-TOF譜圖，該組份中含有質荷比1527.98的肽。(B)此肽(EIPVTVYKPIIKK)的序列是通過MALDI-TOF/TOF確定的。在理論肽片段離子(C)和內部片斷離子(D)的表中，鑒定出的離子用黑體標示。所述肽EIPVTVYKPIIKK(圖Sl插圖B中的藍灰色矩形)包括兩個外顯子之間的連接部分，其僅出現在亞型Q15063-2和《B》中。圖6(A)periostin的純化重組片段(47kDa)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，該重組片段被用作抗體噬菌體展示選擇過程中的抗原。(B)ELISA結果的圖解表示，經挑選的scFv克隆經過兩輪針對FAS2-FAS4或FAS4的淘選。陽性ELISA信號表示特定抗體克隆針對該抗原的結合親合力。最佳的克隆被挑選用于進一步表征。(C)ELISA篩選結果的圖解表示，此結果是在經過首輪針對FAS2-FAS4的克隆C2的親合力成熟之后。圖7人腎腫瘤組織切片的免疫組織化學染色。(A)用經選擇的針對periostin結構域FAS2-FAS4的人單克隆scFv抗體(克隆C2)染色，顯示出胞外結構的強陽性著色主要在肺瘤血管周圍(白色箭頭指出了腫瘤血管周圍的陽性著色)。(B)陰性對照使用了相同的染色流程但省略了scFv，導致沒有特異性染色。圖8幾位患有腎透明細胞癌的患者中periostin的免疫組織化學檢測。免疫組織化學染色顯示了在受調查的8/8肺瘤中periostin的強烈過量表達。黑色箭頭指出了所挑選的帶有陽性著色的區域。標尺，100nm。圖9幾位患有腎透明細胞癌的患者中硫酸軟骨素蛋白多糖的免疫組織化學檢測。免疫組織化學染色顯示了在受調查的6/8腫瘤中硫酸軟骨素蛋白多糖的強烈過量表達。黑色箭頭指出了所挑選的帶有陽性著色的區域。標尺，25pm。圖10CEACAM3的純化重組片段(26kDa)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。圖11纖維調節素的純化重組片段(27kDa)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。圖12(A)黑素瘤相關抗原MG50的純化重組片段(12kDa)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，該重組片段被用作抗體p藍菌體展示選擇過程中的抗原。(B)ELISA結果的圖解表示，挑選的scFv克隆經過3輪針對黑素瘤相關抗原MG50片段的淘選。陽性ELISA信號表示特定抗體克隆針對該抗原的結合親合力。最佳的克隆被挑選用于進一步表征。圖13人腎腫瘤組織切片的免疫組織化學染色。(A)用經選擇的針對黑素瘤相關抗原MG50結構域片段的人單克隆scFv抗體(克隆F6)染色，顯示強陽性著色主要在腫瘤血管周圍(黑色箭頭指出了腫瘤血管周圍的一些陽性著色斑點)。(B)陰性對照使用了相同的染色流程但省略了scFv,導致沒有特異性染色。圖14(A)蛋白sidekick-l的純化重組片段(24kDa)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，該重組片段被用作抗體噬菌體展示選擇過程中的抗原。(B)ELISA結果的圖解表示，挑選的scFv克隆經過2輪針對蛋白sidekick-l片段的淘選。陽性ELISA信號表示特定抗體克隆針對該抗原的結合親合力。最佳的克隆被挑選用于進一步表征。圖15(A)ANXA4蛋白的純化重組片段(37kDa)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，該重組片段被用作抗體噬菌體展示選擇過程中的抗原。(B)ELISA結果的圖解表示，挑選的scFv克隆經過2輪針對重組ANXA4蛋白的淘選。陽性ELISA信號表示特定抗體克隆針對該抗原的結合親合力。最佳的克隆被挑選用于進一步表征。圖16人腎腫瘤組織切片的免疫組織化學染色。(A)用經選擇的針對重組ANXA4蛋白的人單克隆scFv抗體(克隆Ell)染色，顯示出腫瘤細胞的強陽性著色，包括那些在腫瘤血管周圍的(白色箭頭指出了一些帶有陽性著色的斑點；事實上，該組織的大部分都是陽性的)。(B)陰性對照使用了相同的染色流程但省略了scFv,導致僅幾個區域帶有微弱的著色。標尺，100^m。圖17UPF0378家族蛋白KIAA0100的純化重組片段(27kDa)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。圖18(A)鉀電壓-門控通道亞家族H成員l的示意圖。在噬菌體展示選擇中用作抗原的該肽對應于此膜蛋白第二胞外環(參見紅色箭頭)。(B)ELISA篩選結果的圖解表示，該結果是在經過首輪針對鉀電壓-門控通道亞家族H成員1肽的克隆H9的親合力成熟之后。陽性ELISA信號表示特定抗體克隆針對該抗原的結合親合力。圖19人胂瘤組織切片的免疫組織化學染色。(A)用經選擇的針對鉀電壓-門控通道亞家族H成員1的人單克隆scFv抗體(克隆H9)染色，在人腎腫瘤(A)和人肺腫瘤(C)組織切片中表現出腫瘤細胞膜的強陽性著色(黑色箭頭指出了細胞膜的陽性著色)。陰性對照使用了相同的染色流程但省略了scFv,導致在腎腫瘤組織(B)和肺肺瘤組織(D)中都沒有特異性著色。圖20用Hela細胞進行的FACS實驗。用經挑選的針對鉀電壓-門控通道亞家族H成員1的scFv(H9)作為第一抗體，小鼠抗myc(克隆9E10)作為第二抗體以及FITC標記的抗小鼠Ig作為第三抗體對所述細胞進行處理，與用相同方法但省略了scFv之后處理的細胞相比(右側插圖)顯示了FACS中的位移(左側插圖)，表明scFv(H9)成功結合于Hela細胞。圖21用Hela細胞進行的免疫組織化學實驗。用經選擇的針對鉀電壓-門控通道亞家族H成員1的人單克隆scFv抗體(克隆H9)將培養的Hela細胞染色，顯示了腫瘤細胞膜(A)的強陽性著色(白色箭頭指出了細胞膜的陽性著色)。陰性對照使用了相同的染色流程但省略了scFv，導致沒有特異性著色(B)。提供下列實施例用來以更具體的細節更好地說明本發明。它們不應當被解釋為是以任何方式對本權利要求范圍的限制。除在操作實例或另作說明之處以外，在本說明書和所附權利要求中，所有表達成分數量、反應條件、百分比同一性、氨基酸數、核苷酸數等的數字都應當被理解為在所有情況下被術語"大約"加以修飾。此外，本文中引用的所有數字范圍都應當被理解為明確包括了其所有可能的子范圍。以下實施例1舉例說明了根據本發明所鑒定的標記蛋白在新血管結構中的過量表達，特別是它們在肺瘤中的過量表達，尤其是在腎腫瘤中的過量表達。此外，以下實施例2至10舉例說明了本發明所選擇的血管標志物蛋白的制備以及它們作為抗原用以生產針對此類血管標志物蛋白的抗體的用途。此類抗體(或者帶有相同選擇性親合力的其它配體)對于此類標志物蛋白的進一步表征和生物醫藥應用是有用的。此外，一些實施例證實了本發明所選擇的標志物蛋白用于鑒定新血管結構的用途，尤其是鑒定肺瘤中的新血管結構。實施例實施例1引言一種化學的蛋白組方法，基于對外科手術切除的帶有腫瘤的人腎臟進行離體灌注和對其中可及結構的生物素化，；波用于獲取有關可及和在人癌癥中過量表達的豐富抗原的信息。生物素化的蛋白經鏈霉親合素樹脂純化并用質i普方法加以鑒定，揭示了637種蛋白，其中184種僅在肺瘤樣本中被發現，而223種僅在正常腎部分被發現。用此方法鑒定的三十種可及的肺瘤相關抗原是基于抗體的抗癌療法的合適靶標。用于鑒定正常器官中和腫瘤中的可及抗原的特異性方法是基于用生物素的反應性酯衍生物對荷瘤小鼠進行尾部灌注，這已被本發明人新近公開(Rybaketal.2005supra)。此方法使得有可能對上皮細胞膜上和其它容易通過血流可及的結構上(例如胞外基質組分)的可及蛋白進行有效的生物素化。將來自器官裂解液的生物素化的蛋白在鏈親合素樹脂上進行純化，隨后進行基于質譜的比較蛋白組分析，使得有可能對成百上千的可及蛋白進行鑒定，它們中的一些被發現在器官中和腫瘤中是差異表達的。上面的生物素化方法被應用于對三個外科手術切除的腎臟進行離體灌注，該腎臟來自患有腎細胞癌的患者(圖l和表2)。此方法持續7-9分鐘，使得有可能對肺瘤部分的血管結構進行有效的和選擇性的標記(圖1C)，同時正常腎部分中的血管和管狀結構也都被標記(圖1D)。在生物素化并用含伯胺的溶液(Tris)將過量的生物素化試劑淬滅后，將樣本切下，在有SDS存在的條件下均質化并裝載至鏈親合素樹脂上，由此使生物素化的蛋白富集。隨后的蛋白水解消化，隨之進行nanoHPLC分離，并通過MALDI-TOF/TOF進行質譜分析，使得有可能對全部樣本中總共637種蛋白進行鑒定。如所期望地，在正常樣本和肺瘤樣本中都觀察到的豐富蛋白包括胞外基質的組分，諸如膠原蛋白、層粘連蛋白、串珠素(perlecan)、人基膜聚糖(lumican)、玻璃粘連蛋白(vitronectin)、纖維粘連蛋白(fibronectin)和細胞粘合素(tenascin)。僅在正常腎部分發現的蛋白包括腎臟特異性4丐粘蛋白16、幾種載體、載脂蛋白E和尿調蛋白。大量蛋白僅在肺瘤樣本中被發現。它們中的一些以前已被報道在特定腫瘤結構中過量表達[例如碳酸肝酶IX、TEM4、過氧蛋白同源物[片段]、唐氏綜合征關鍵區域蛋白8、整合素a-l、外核普酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3(ectonucleotidepyrophosphatase/-phosphodiesterase3)]。僅一小部分在此分析中鑒定的月中瘤抗原(例如軸突生長誘向因子受體DCC(netrinreceptorDCC)、溶質載體家族2,易化葡萄糖轉運體成員1、神經細胞黏附分子1)目前已在"HumanProteinAtlas":agenome-wideinitiativeforthecharacterizationofproteinexpressionpatternsinnormaltissuesandcancer中—皮才艮道。由于對腫瘤樣本中蛋白的檢測可能在原則上不僅反映了一種優先的表達模式，而且也反映了對于生物素化試劑的差異可及性，因此所選擇的蛋白候選者通過免疫組織化學以及通過cDNA文庫的PCR分析進行表征。Periostin是在此分析中最豐富的腫瘤相關抗原，代表了一種特別令人感興趣標志物，其已被發現在卵巢上皮肺瘤、乳腺癌中、在肺癌的外周以及在結腸直腸癌和它們的肝臟轉移中被上調。人periostin的五種不同剪接亞型的存在已被報道，但是僅三種亞型的序列被公開(Swiss-Prot/TrEMBL和NCBIProtein)。但是，六種亞型序列在對cDNA文庫的PCR分析中被鑒定出來，其在正常腎、胎兒腎和腫瘤腎中具有不同的相對豐度(圖2和圖4)。對正常腎和透明細胞癌樣本的免疫組織化學分析揭示了periostin在腫瘤中顯著的過量表達，其具有突出的血管和基質染色模式(圖3)。同樣地，通過PCR(圖2)以及通過免疫組織化學分析(圖3),硫酸軟骨素蛋白多糖都被發現在胎兒和腫瘤樣本中更加豐富。一些推定的腫瘤相關抗原被發現同樣存在于正常腎的cDNA文庫中(圖2),包4舌fibulins、月中瘤抑制候選物3(tumorsuppressorcandidate3(N33蛋白))和假定蛋白DKFZp686K0275[片段](圖2)。與之相對，大量令人感興趣的標志物在胎兒和腫瘤樣本中產生了實際上比較強的PCR條帶，這些標志物包括碳酸酐酶IX、TEM-4、過氧蛋白同源物[片段]、整合素a-l、血小板反應素2(thrombospondin2)、推定的G蛋白偶聯受體42、軟骨聚集蛋白多糖(aggrecan)、可能的G蛋白偶聯受體37[前體]、纖維調節素、溶質載體家族2,易化葡萄糖轉運體成員1和蛋白sidekick-1[前體](圖2)。在本分析中所鑒定的637種蛋白中，大約20%對應于細胞內蛋白。盡管一些更加豐富的細胞內蛋白(例如肌動蛋白、微管蛋白、角蛋白、組蛋白)可以要么通過對鏈親合素的粘性，要么作為離體生物素化壞死結構的結果而獲得，但是一些細胞內蛋白已被報道在增殖的內皮細胞表面變成可及的。材料與方法患者本研究是在獲得列支大學醫院倫理委員會(theethicalcommitteeoftheUniversityHospitalofL"ge(比利時))批準后啟動的。患者選擇所采用的標準如下1)與腎透明細胞癌高度一致的胂瘤診斷，如通過常規的超聲和腹部CT掃描所評定的；2)整體腎切除術的治療適應癥；3)胂瘤的大小和位置使得能夠清晰地辨別將被用作正常對照的腎臟健康部分。在沒有生物素干擾的情況下，與對特異性蛋白的檢測相容的免疫組織化學方法被采用用于診斷組織病理學分析。獲得了患者的知情同意并完成了對HIV和肝炎A、B和C的血清學否定。有關患者的詳細信息參見表SI.離體血管灌注手術是按照標準程序進行的，其包括腎動脈、靜脈和輸尿管的結扎和切開，以及隨后的腎切除術。腎動脈留有一個較長的縫合處，用于在灌注步驟中進行即時的鑒定。在腎切除術后的2分鐘內，腎動脈被插入導管，打開腎靜脈(通過去除縫合線)以使得灌注液能夠流出，并經腎動脈開始灌注。腎臟首次用500ml1mg/ml硫-NHS-LC-生物素的PBS溶液灌注7-9分鐘，洗去血液成分并用生物素標記可及的含伯胺結構。然后馬上用450ml含50mM伯胺的三-(羥甲基)-氨基曱烷(Tris)的PBS溶液進行第二個灌注步驟8-9分鐘以淬滅未反應的生物素化試劑。所有灌注溶液都含有10Q/()dextran-40作為血漿擴充劑，并被預熱至40。C。兩個灌注步驟均以100-150mmHg的壓力進行。成功的灌注是通過在灌注的開始幾分鐘內洗出血液，而隨后流出腎靜脈的是清澈的灌注液來表示的。在灌注后，將器官用50mMTris的PBS清洗，晾干，用黑墨水4察拭以使得能夠對手術邊緣進行隨后的病理研究，并沿徑向軸(開始于外表中央邊緣)用刀片切成兩半。成功的灌注導致組織發白的顏色。來自肺瘤和來自正常腎組織(未受腫瘤影響)的樣本被切下(從良好灌注的發白部分)并立即速凍用于蛋白組和組織化學分析，或者被多聚曱醛固定并經石蠟包埋用于組織化學分析。作為陰性對照，未灌注的器官在腎切除術后被切成兩半，如上所述從腫瘤以及從正常腎組織獲取樣本。有關受檢器官的詳細信息參見表2。用親合素-生物素化過氧化物酶復合物將組織切片組織化學染色根據標準方法，將來自經多聚曱醛固定、石蠟包埋的組織樣本的切片用親合素-生物素-過氧化物酶復合物(VectastainEliteABCkit(VectorLaboratories,Burlingame,CA,USA))染色。用于蛋白組分析的蛋白抽提物的制備將來自健康腎和人癌患者的透明細胞癌組織的樣本按每mg組織40[il含2。/oSDS、50mMTris、10mMEDTA、CompleteE蛋白酶抑制劑混合物(RocheDiagnostics,Mannheim,Germany)的PBS裂解緩沖液，pH7.4重懸，并使用Ultra-TurraxT8分散器(IKA-Werke,Staufen,Germany)以2分鐘全功率和2分鐘待機的六次間隔在中度冷卻條件下進行勻漿。使用Vibra-cell(Sonics,NewTown,CT,USA)將勻漿物超聲處理(在中度冷卻條件下30秒超聲，l分鐘待機，6次間隔)，隨后在99。C下溫育15分鐘，并以15000xg離心20分鐘。上清被用作總蛋白抽提物。使用BCAProteinAssayReagentKit(Pierce)確定蛋白濃度。生物素化蛋白的純化在緩沖液A(含NP401%，SDS0,1%的PBS)中將SA國sepharose漿液(64nl/mg總蛋白)清洗三遍，沉淀并移去上清。將來自不同樣本的十五毫克總蛋白抽提物與SA-Sepharose沉淀混合。讓生物素化蛋白的捕獲在室溫下在旋轉混合器上進行2小時。移去上清并用緩沖液A將樹脂清洗三遍，用緩沖液B(含NP400.1%,NaCl1M的PBS)清洗兩遍，并用50mM碳酸氳銨清洗一遍。最后，將樹脂重懸于400(il50mM碳酸氫銨溶液中，并加入20pl測序級改性豬胰蛋白酶(儲液40ng/|til的50mM碳酸氫銨)(Promega,Madison,WI,USA)。在37。C持續攪拌條件下，蛋白酶消化過夜。收集上清并加入三氟乙酸至0.1%的終濃度。用C18;微量柱(ZipTipC18,Millipore,Billerica,MA,USA)將肽脫鹽，純化并濃縮。在凍干之后，將肽儲存于-20。C。配備自動在線分配的Nano毛細管-HPLC點樣于MALDI靶板上使用UltiMate納米級LC系統和由Chromdeon軟件(Dionex,Sunnyvale,CA,USA)控制的FAMOS微量自動上樣器(LCPackings,Amsterdam,TheNetherlands),通過反相高效液相色鐠(RP-HPLC)將胰蛋白酶酶解肽分離。流動相A由2%乙腈和0.1。/o三氟乙酸(TFA)的水溶液組成，流動相B由80%乙腈和0.1%TFA水溶液組成。流速為300nl/分鐘，導致~170bar的流動相A壓力。將來源于由1.5mg總蛋白親合純化的消化生物素化蛋白凍干肽溶解于5(il緩沖液A中，并裝載上柱(內徑75pm,長度15cm,用C18PepMap100填充，3pm,IOOA柱子；LC填料)。將肽用0-30%B的梯度洗脫7分鐘，30-80%B梯度洗脫67分鐘，80-100。/。B梯度洗脫3分鐘，并用100%B洗脫5分鐘；然后在分析下一個樣品前將柱子用100。/。A平衡20分鐘。將洗脫的組份與3mg/mla-氰基-4-羥基肉桂酸、277pmol/ml神經加壓素(neurotensin)(內標)、0.1%TFA和70%乙腈的水溶液混合，并使用在線Probot系統(Dionex)放置于一192孔MALDI耙板上。MALDI基質溶液的流速被設置為1.083|nl/min。因此，在20秒期間收集的每一組份均含有361nlMALDI基質溶液和100nl樣品。神經加壓素的終濃度為每樣品孔100fmol。MALDI-TOF/TOF質譜基質輔助激光解吸附電離串聯飛行時間(MALDI-TOF/TOF)質譜分析用4700ProteomicsAnalyzer(AppliedBiosystems,Framingham,MA)進行。所有譜圖均使用工作在200Hz的激光頻率下的Nd:YAG激光器獲得。為了前體離子的選"^，所有組份在進行MS/MS前，以MS方式測量。每個樣品點最多挑選15個前體用于隨后通過碰撞誘導分裂的片段化。前體選擇的標準是最小S/N60且點對點(shot-to-shot)的前體質量限度為120ppm。譜圖通過全球蛋白質服務器工作站(GlobalProteinServerWorkstation(AppliedBiosystems))進行加工和分析，其使用內部的MASCOT(MatrixScience,UK)軟件將MS和MS/MS數據與經計算才幾(insilico)處理的蛋白數據庫匹配。將獲得的數據針對從NCBI主頁(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載的人類數據庫進行篩選。錯切數(missedcleavage)被設置為2。依靠MASCOT軟件完成的蛋白質的鑒定被認為在對最佳肽離子的95%置信度區間內的正確調用。在90%與95%之間的置信度區間內選擇的中靶對象(hits)是通過對譜圖的手工檢查核實的。免疫組織化學染色根據標準方法，將來自多聚曱醛固定、石蠟包埋的組織樣本切片通過免疫過氧化物酶4支術(VectastainEliteABCkit(VectorLaboratories,Burlingame,CA,USA))進行染色。免疫親合純化的兔多克隆抗periostin抗體(Biovendor,Heidelberg,Germany)和單克隆抗疏酸軟骨素蛋白多糖抗體(克隆12C5;DevelopmentalStudiesHybridomaBank,UniversityofIowa,Ames,IA,USA)按1:500稀釋使用。PCR分析包含來自透明細胞癌、顆粒細胞癌、移行細胞癌、正常成人腎和胎兒腎的cDNAs的人腎腫瘤cDNA板(panel)是購自BioChain(Hayward,CA,USA)。聚合酶鏈式反應(PCR)是使用HotStartTaqPolymerasekit(Qiagen,Hilden,Germany)完成的。PCR條件如下:95°C變性15分鐘,隨后是94°C變性1分鐘，54°C退火1分鐘和72°C延伸1分鐘的35個循環。72°CIO分鐘完成最后的延伸步驟。引物序列可根據要求獲得。PCR反應產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳加以分析，通過溴化乙錠染色，并使用BioDoc-It成像系統(UVP,Upland,CA,USA)成像。為了分析periostin剪接亞型，將條帶從瓊脂糖凝膠中切下并測序(BigDyeTerminatorvl.lCycleSequencingkit;ABIPRISM310GeneticAnalyzer;AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)。periostin新剪接變體的鑒定對于人periostin,Takeshita和同事已報道可產生五種可變剪接4爭錄本，并且periostin的所有剪接事件都發生在C末端區域。一些特定亞型可能在腫瘤中被選擇性表達而在正常組織中則不表達(類似于已被良好表征的纖維粘連蛋白的含ED-B亞型以及含C結構域的大型細胞粘合素C亞型的表達模式)，這種可能性導致了用于在人cDNA文庫通過PCR擴增可變剪接結構域的引物的設計。PeriostinC末端區域的PCR擴增顯示了至少五種不同的剪接變體。這可能與Takeshita和coworkers(supra)的發現相一致，但是他們還沒有公開他們已發現的亞型的序列。對現有數據庫的分析表明存在三種亞型(SwissProt號Q15063、Q15063-2和Q15063-3)以及一個EST克隆(OTTHUMP0018271),對應于第四種不同的periostin亞型。然而，圖2中所示擴增條帶的切割及其測序產生了六種不同的亞型，其中四種并未對應于任何已知的序列。全長periostin和與亞型Q15063-3相對應的亞型也通過在分析中測序而纟皮加以鑒定。periostin亞型特異性肽的鑒定重要的是注意到以上的蛋白組分析能夠鑒定出亞型特異性的肽，所述亞型僅特異性地出現在腫瘤樣品中，這表示這些肽包括外顯子的連4妻部(或者外顯子部分)，其僅存在于特定亞型中而在其它亞型中則沒有。(參見圖5(A)含1527.5797m/z肽的HPLC組份的MALDI-TOF譜圖(B和C))。在MALDI-TOF/TOF實驗中，所述序列(EIPVTVYKPIIKK)通過碰撞誘導分裂而被確定。肽EIPVTVYKPIIKK(圖4插圖B中的藍灰色矩形)包括兩個外顯子之間的連接部，其僅出現在亞型Q15063-2和《B>>中。亞型特異性肽的另一實例是由序列AELTDLK的肽所表示，其包括僅出現在假定蛋白FLJ00154(—種僅在人腎臟的腫瘤部分被特異性地檢測到的蛋白)的結構域連接部，并且其代表了Sidekick-like蛋白1的人類同源物的次要轉錄本(未提供數據)。對另外出現在其它正常組織的蛋白的腫瘤特異性亞型的鑒定使得能夠制備亞型特異性抗體，該抗體是有選擇性的，因為它們能夠在相同蛋白的各種亞型之間進行區分，而此類抗體將提供用于腫瘤治療的潛在靶標。結果表2.本研究所涉及病例的說明。對不同年齡和性別受特定大小和階段腫瘤影響的五位患者的腎臟進行分析。三個器官^f皮如上所述進4亍離體生物素化，而其它兩個未灌注的腎臟樣本作為陰性對照被收集和分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>表3.正常腎、肺瘤部分和兩者中被鑒定的推定膜蛋白和胞外基質蛋白的選擇。編號表示三位腎臟被離體生物素化的患者中，有多少種蛋白#皮鑒定。#患者(總數=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>實施例2引言為評估periostin作為腫瘤標志物的用途，此蛋白的重組片賴::故克隆并表達。針對重組片段的人單克隆抗體被制備并在ELISA和免疫組織化學實驗中力口以檢測。材料與方法對應于periostin(SEQIDNO:l)的氨基酸序列位置232-632(FAS2-FAS4)和496-632(FAS4)的重組蛋白片段^皮克隆用作生物淘選實52驗的抗原。該片段使用pQE12載體(Qiagen,Hilden,Germany)在大腸桿菌E.coli菌株TG1中表達。使用Ni-NTA柱(Qiagen)從E.coli裂解液中純化蛋白。根據Silacci等報道的方法，Prot函ics.2005Jun;5(9):2340國50,將單鏈Fv形式(scFv)的針對所述periostin片段的抗體從ETH-2-Gold噬菌體展示文庫中挑選出來。ELISA篩選表達結合所述抗原的scFv抗體的克隆，并使用單鏈Fv制備物在新鮮冷凍的組織樣品切片上進行免疫組織化學染色，如之前在Silacci等，Proteomics.2005June;5(9):2340-50andBracketal.,Clin.CancerRes.2006May15;12(10):3200-8中所述。所選抗體的親合成熟按Brack等，Clin.CancerRes.2006May15;12(10):3200-8中所述進行。用商品化免疫親合純化兔多克隆抗periostin抗體(BiovendorHeidelberg,Germany)進行免疫組織化學染色，如實施例1中所述。結果所述結構域FAS2-FAS4或結構域FAS4被克隆和表達。圖6A表示該純化重組蛋白FAS2-FAS4(47kDa條帶)的SDS-PAGE分析。針對此蛋白的噬菌體展示選擇產生了大量表達scFv抗體的克隆，該抗體對FAS2-4以及對FAS4是特異性的，如通過在包被的重組蛋白上進行的ELISA所示(參見圖6B)。針對FAS2-4的最佳克隆C2被進一步親合成熟以獲得具有更高親合力的抗體(參見圖6C的ELISA結果)。所選的抗periostin抗體C2被用于免疫組織化學分析，其在人腎腫瘤組織切片的血管和胞外基質結構上表現出陽性著色(參見圖7A)。陰性對照，來自相同組織的切片經過相同的染色流程，僅省略了scFv,未表現陽性著色(參見圖7B)。此外，針對periostin的商品化抗體(還參見實施例1)被用于評價不同患者的腎腫瘤中periostin的表達情況(參見圖8)。受試的八名患者中的八名在腎腫瘤中表現出陽性抗periostin著色。此類結果證明針對periostin的人單克隆抗體可以被制備并用于檢測人癌組織新血管結構中的此類抗原。免疫組織化學結果表明periostin若不是在所有患者也是在大多數患者的人腎肺瘤中被高水平表達。實施例3引言為進一步研究硫酸軟骨素蛋白多糖抗原，我們完成了對不同患者的腎腫瘤切片的免疫組織化學分析。材料與方法如實施例1所述，用單克隆抗硫酸軟骨素蛋白多糖抗體(克隆12C5)對多聚曱醛固定、石蠟包埋的人腎肺瘤切片進行免疫組織化學染色結果此外，針對硫酸軟骨素蛋白多糖的商品化抗體(還參見實施例l)被用于評價不同患者的腎腫瘤中periostin的表達情況(參見圖9)。受試的八名患者中的六名在腎腫瘤中表現出陽性抗硫酸軟骨素蛋白多糖著色，要么更多地擴散到胞外基質，要么更多地局限在腫瘤血管的周圍區域。此類結果表明硫酸軟骨素蛋白多糖在大多數患者的人腎腫瘤中以高水平表達，并有可能是通過血管系統可及的。實施例4引言為評估CEACAM3抗原，此蛋白的重組片段被克隆并表達，用來作為通過噬菌體展示挑選抗體的抗原。材料與方法如實施例2所述，對應于CEACAM3(SEQIDNO:25)的氨基酸序列位置36-236的重組蛋白片段被克隆并表達，用來作為生物淘選實驗的抗原。結果對應于氨基酸序列位置36-236的CEACAM3結構域被克隆并表達。圖10表示該純化重組蛋白(26kDa條帶)的SDS-PAGE分析。此結果表明為使用其作為抗體選擇過程中的抗原，CEACAM3片段可以被制備。與實施例2相似，此類抗體可以作為血管性肺瘤標志物;故用于CEACAM3的進一步確認。實施例5引言為評估纖維調節素作為抗原的用途，此蛋白的重組片段被克隆并表達，用來通過噬菌體展示挑選抗體。材料與方法如實施例2所述，對應于CEACAM3(SEQIDNO:25)的氨基酸序列位置94-315的重組蛋白片段被克隆并表達，用來作為生物淘選實驗的抗原。結果對應于氨基酸序列位置94-315的纖維調節素片段被克隆并表達。圖11表示該純化重組蛋白(27kDa條帶)的SDS-PAGE分析。此結果表明為使用其作為抗體選擇過程中的抗原，纖維調節素片段可以被制備。與實施例2相似，此類抗體可以作為血管性腫瘤標志物被用于纖維調節素的進一步確認。實施例6引言為評估過氧蛋白同源物[片段]作為腫瘤標志物的用途，此蛋白的重組片段被克隆并表達。針對此重組片段的人單克隆抗體被制備并在ELISA和免疫組織化學實驗中加以檢測。材料與方法如實施例2所述，對應于過氧蛋白同源物[片段](SEQIDNO:33)的氨基酸序列位置539-632的重組蛋白片段被克隆并表達，并進行抗體的噬菌體展示選擇、ELISA篩選和免疫組織化學。結果過氧蛋白同源物片段被克隆并表達。圖12A表示該純化重組蛋白片段(12kDa條帶)的SDS-PAGE分析。針對此蛋白的噬菌體展示選擇產生了大量表達scFv抗體的克隆，該抗體對重組的過氧蛋白同源物片段是特異性的，如通過在包被的重組蛋白上進行的ELISA所示(參見圖12B)。所挑選的抗過氧蛋白同源物[片段]的抗體被用于免疫組織化學分析，其主要在人腎腫瘤組織切片的肺瘤血管周圍表現出陽性著色(參見圖13A)。陰性對照，省略了scFv,未表現陽性著色(參見圖13B)。此結果證明針對過氧蛋白同源物[片段]的人單克隆抗體可以被制備并用于檢測人癌組織的新血管結構中的此類抗原。免疫組織化學結果表明過氧蛋白同源物[片段]在人胂瘤的新血管系統中是被高水平表達的。實施例7引言為評估蛋白sidekick-l作為腫瘤標志物的可能性，此蛋白的重組片段被克隆并表達。針對該重組片段的人單克隆抗體被制備并在ELISA中加以;險測。材料與方法如實施例2所述，對應于蛋白sidekick-l(SEQIDNO:37)氨基酸序列位置851-1052的重組蛋白片段被克隆和表達，并進行抗體的噬菌體展示選擇和ELISA篩選。結果蛋白sidekick-l片段被克隆并表達。圖14A表示該純化重組蛋白片段(24kDa條帶)的SDS-PAGE分析。針對此蛋白的噬菌體展示選擇產生了幾個表達scFv抗體的克隆，該抗體對重組的蛋白sidekick-l片段是特異性的，如通過在包被的重組蛋白上進行的ELISA所示(參見圖14B)。此結果證明針對蛋白sidekick-l的人單克隆抗體可以針對重組抗原片段被制備。此類抗體可以作為腫瘤標志物用于蛋白sidekick-l的進一步確認，與實施例2所述方法相似。實施例8引言為評估ANXA4蛋白作為胂瘤標志物的用途，此蛋白的重組片段被克隆并表達。針對該重組片段的人單克隆抗體被制備并在ELISA和免疫組織化學實-驗中加以檢測。材料與方法如實施例2所述，對應于ANXA4蛋白(SEQIDNO:52)氨基酸序列位置3-321的重組蛋白片段被克隆并表達，并進行抗體的噬菌體展示選擇、ELISA篩選和免疫組織化學。結果幾乎完整的ANXA4蛋白被克隆和表達。圖15A表示該純化重組的ANXA4蛋白(37kDa條帶)的SDS-PAGE分析。針對此蛋白的噬菌體展示選擇產生了大量表達scFv抗體的克隆，該抗體對ANXA4蛋白是特異性的，如通過在包被的重組蛋白上進行的ELISA所示(參見圖15B)。針對ANXA4蛋白的最佳克隆E11被用于免疫組織化學分析，其在人腎腫瘤的組織切片上表現為肺瘤細胞(還有位于腫瘤血管周圍的那些細胞)的陽性著色(參見圖16A)。陰性對照，來自相同組織的切片經過相同的染色流程，僅省略了scFv,未表現陽性著色(參見圖16B)。此結果證明針對ANXA4蛋白的人單克隆抗體可以被制備并用于檢測人癌組織中的此類抗原。免疫組織化學結果表明此抗原在人肺瘤中(還有新血管系統周圍)是被高水平表達的。實施例9引言為進一步研究抗原UPF0378家族蛋白KIAA0100,我們克隆并表達了此蛋白的重組片段，以便將其作為通過噬菌體展示來選擇抗體的抗原。材料與方法如實施例2所述，對應于UPF0378家族蛋白KIAA0100(SEQIDNO:96)的氨基酸序列位置755-968的重組蛋白片段被克隆并表達，用作生物淘選實^r的抗原。結果與討論對應于氨基酸序列755-968的UPF0378家族蛋白KIAA0100片段被克隆并表達。圖17表示該純化重組蛋白(32kDa條帶)的SDS-PAGE分析。此結果表明UPF0378家族蛋白KIAA0100片段可以被制備，從而使用它們作為抗體選擇過程中的抗原。與實施例2相似，此類抗體可以作為血管性肺瘤標志物被用于此抗原的進一步確認。實施例10引言為評價鉀電壓-門控通道亞家族H成員1作為腫瘤標志物的有效性，制備了針對合成肽的人單克隆抗體，所述合成肽對應于此膜蛋白胞外環的氨基酸序列。此類抗體在ELISA、免疫組織化學、FACS和免疫細胞化學實驗中加以檢測。材料與方法對應于鉀電壓-門控通道亞家族H成員1(SEQIDNO:98)的第二胞外環(氨基酸序列位置316-349;圖解表示參見圖18A)的合成肽被用作生物淘選實驗的抗原。根據Silacd等所述的方法，Proteomics.2005Jun;5(9):2340-50,將針對生物素化肽的單鏈Fv形式(scFv)的抗體從ETH-2-Gold噬菌體展示文庫中挑選出來。如實施例2所述，對所選抗體進行ELISA篩選、免疫組織化學染色和親合成熟。根據標準方法，對培養細胞進行FACS和免疫細胞化學染色，使用所選的scFv作為第一抗體，小鼠抗-c-myc(克隆9E10)作為第二抗體以及FITC-標記的抗-小鼠Ig作為第三抗體。結果針對生物素化的鉀電壓-門控通道亞家族H成員1肽(參見上面和圖18A)的噬菌體展示選擇產生了大量表達結合scFv抗體的克隆，如通過在該包被肽上的進行ELISA所檢測的(未提供數據)。針對的最佳克隆H9被進一步親合成熟以獲得具有更高親合力的抗體(參見圖18B中的ELISA結果)。所選的抗鉀電壓-門控通道亞家族H成員1的抗體H9被用于免疫組織化學分析，其表現出對人腎胂瘤(參見圖19A)和人肺腫瘤(參見圖19C)組織切片上肺瘤細胞膜的陽性著色。陰性對照，來自相同組織的切片經過相同的染色流程，僅省略了scFv,未表現陽性著色(參見圖19B和圖19D)。在HeLa細胞(一種人宮頸癌細胞系)上的進一步研究表明所述scFv抗體H9可以在FACS中識別此類細胞(參見圖20)并在免疫細胞化學中引起此細胞膜的陽性著色(參見圖21)。此結果證明針對鉀電壓-門控通道亞家族H成員1的人單克隆抗體可以被制備，而且此抗原在人癌組織(也包括那些位于新血管系統緊鄰處的肺瘤細胞)的肺瘤細胞膜上以及人腫瘤細胞系的膜上被表達。因此，此抗原有可能是用于血管性腫瘤靶標方法的合適靶標。下表是根據本發明鑒定的血管性腫瘤標志物的氨基酸序列列表。實施例1中鑒定的部分氨基酸序列以黑體字顯示。其中的SEQIDNOs與所附的序列列表相對應，該序列列表是本發明公開內容的一部分。<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>NGMIIPSMYNNLGLF腿YPNGVVTVNCARIIHGNQIATNGVV歴DRVLTQIGTSIQDFIEAEDDLSSFRAAAITSDILEALGRDGHFTLFAPTNEAFEKLPRGVLERFMGDKVASEALMKYHILNTLQCSESIMGGAVFETLEGNTIEIGCDGDSITVNGIKMVNKKDIVTNNGVIHLIDQVLIPDSAKQV正LAGKQQTTFTDLVAQLGLASALRPDGEYTLLAPVNNAFSDDTLSMRNGAIHIFREIIKPAEKSLHEKLKQDKRFSTFLSLLEAADLKELLTQPGDWTLFVPTNDAFKGMTSEEKEILIRDKNALGNIILYHLTPGVFIGKGFEPGVTNILKTTQGSKIFLKEVNDTLLVNELKSKESDIMTTNGVIHWDKLLYPADTPVGND(JLLEILNKLIKYIQIKFVRGSTFKEIPVTVYTTKIITKWEPKIKVIEGSL(3PnKTEGPTLTKVKIEGEPEFRLIKEGETITEVIHGEPIIKKYTKnDGVPVEITEKETREERIITGPEIKYTRISTGGGETEETLKKLLQEEVTKVTKFIEGGDGHLFEDEEIKRLLQGDTPVRKLQANKKVQGSRRRLREGRSQSEQIDNO:3MIPFLPMFSLLLLLIVNPINANNHYDKILAHSRIRGRDQGPNVCALQQILGTKKKYFSTCKLREEIEGKGSFTYFAPSNEAWDNLDSDIRRGLESNVNVELLNALHS畫INKRMLTKDLKNGMIIPSMYNNLGLF腿YPNGWTVNCARIIHGNQIATNGW固DRVLTQIGTSIQDFIEAEDDLSSFRAAAITSDILEALGRDGHFTLFAPTNEAFEKLPRGVLERFMGDKVASEALMKYHILNTLQCSESIMGGAVFETLEGNTIEIGCDGDSITVNGIKMVNKKDIVTNNGVIHLRNGAIHIFREIIKPAEKSLHEKLKQDKRFSTFLSLLEAADLKELLTQPGDWTLFVPTNDAFKGMTSEEKEILIRDKNALQNIILYHLTPGVFIGKGFEPGVTNILKTTQGSKIFLKEVNDTLLVNELKSKESDMTTNGVIHWDKLLYPADTPVGNDQLLEILNKLIKYIQIKFVRGSTFKEIPVTVYKPnKKYTKIIDGVPVEITEKETREERIITGPEIKYTRISTGGGETEETLKKLLQEEVTKVTKFIEGGDGHLFEDEEIKRLLQGDTPVRKLQANKKVQGSRRRLREGRSQSEQIDNO:5MIPFLPMFSLLLLLIVNPINA麗HYDKILAHSRIRGRDQGPNVCALQQILGTKKKYFSTCKLREE正GKGSFTYFAPSNEAWDNLDSDIRRGLESNVNVELLNALHS腹INK腹LTKDLKIEAEDDLSSFRAAAITSDILEALGRDGHFTLFAPTNEAFEKLPRGVLERFMGDKVASEALMKYHILNTLQCSESIMGGAWETLEGNTIEIGCDGDSITVNGIKMVNKKDIVTNNGVIHL<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>LQGDTPVRKLQANKKVQGSRRRLREGRSQSEQIDNO:15MIPFLPMFSLLLLL雨PINA麗HYDKILAHSRIRGRD(5GPNVCAL柳LGTKKKYFSTCKLREEIEGKGSFTYFAPSNEAWDNLDSDIRRGLESNVNVELLNALHSHMINKRMLTKDLKNGMIIPSMYNNLGLF腿YPNGWTVNCARIfflGN(5IATNGVVHVIDRVLT(5IGTSIQDFMKYHILNTLQCSESIMGGAVFETLEGNT正IGCDGDSITVNGIKMVNKKDIVTNNGVIHLVQRLLKLILQNHILKVKVGLNELYNGQILETIGGKQLRVFVYRTAVCIENSCMEKGSKQGRNGAIHIFREIIKPAEKSLHEKLKQDKRFSTFLSLLEAADLKELLTQPGDWTLFVPTNDAFKGMTSEEKEILIRDKNALQNIILYHLTPGWIGKGFEPGVTNILKTT()GSKIFLKEVNDFKEIPVTVYRPTLTKVKIEGEPEFRLIKEGETITEVIHGEPIIKKYTKIIDGVPVEITEKETREERIITGPEIKYTRISTGGGETEETLKKLL卿VTKVTKFIEGGDGHLFEDEEIKRLLQGDTPVRKLQANKKVQGSRRRLREGRSQ2推定的G-蛋白偶聯受體42(+亞,型)015529SEQIDNO:17DLLLLLFLPF脂VEAANGMHWPLPFILCPLSGFIFFTTIYLTALFLAAVSIERFLSVAHPYNVSHWGYICGESPVWRIYVTLLSTLNSCVDPFVYYFSSSGFQADFHELLRRLCGLWGQWQQESSMELKEQKGGEEQRADRPAERKTSEHSQGCGTGGQVACAEN_SEQIDNO:19DLLLLLFLPFRMVEAANGMHWPLPFILCPLSGFIFFTTIYLTALFLAAVSIERFLSVAHPWQQESSMELKEQKGGEEQRADRPAERKTSEHSQGCGTGGQVACAES溶質栽體家族2，易化葡萄糖轉運體成員1P11166SEQIDNO:21MLILGRFIIGVYCGLTTGFVPMYVGEVSPTAFRGALGTLHQLGIWGILIAQWGLDSIMGNKDLWPLLLSIIFIPALLQCIVLPFCPESPRFLLINRNEENRAKSVLKKLRGTADVTHDLQEMKEESRQMMREKKVTILELFRSPAYRQPILIAWLQLSQQLSGINAVFYYSTSIFEKCFQYVEQLCGPYVFIIFTVLLVLFFIFTYFKVPETKGRTFDEIASGFRQGGASQSDKTPEELFHPLGADSQV4硫酸軟骨素蛋白多糖核心蛋白[前體]P13611SEQIDNO:23MFINIKSILWMCSTLIVTHALHKVKVGKSPPVRGSLSGKVSLPCHFSTMPTLPPSYNTSEDASVRHPVTVARAQCGGGLLGVRTLYRFENQTGFPPPDSRFDAYCFKPKEATT1DLSILAETASPSLSKEPQMVSDRTTPIIPLVDELPVIPTEFPPVGNIVSFEQKATVQPQAITDSLATKLPTPTGSTKKPWDMDDYSPSASGPLGKLDISEIKEEVLQSTTGVSHYATDSWDGWEDKQTQESVTQIEQIEVGPLVTSMEILKHIPSKEFPVTETPLVTARMILESKTEKKMVSTVSELVTTGHYGFTLGEEDDEDRTLTVGSDESTLIFDQIPEVITVSKTSEDTIHTHLEDLESVSASTTVSPLIMPD麗GSSMDDWEERQTSGRITEEFLGKYLSTTPFPSQHRTEIELFPYSGDKILVEGISTVIYPSLQTEMTHRRERTETLIPEMRTDTYTDEIQEEITKSPFMGKTEEEVFSGMKLSTSLSEPIHVTESSVEMTKSFDFPTLITKLSAEPTEVRDMEEDFTATPGTTKYDKDIPSFTEDGADEFTLIPDSTQKQLEEVTDEDIAAHGKFTIRFQPTTSTGIAEKSTLRDSQEPTTYVDSSHTIPLSVIPKTDWGVLVPSVPSEDEVLGEPS,LVIDQTRLEATISPETLTGSERVPVLETTPVGKIDHSVSYPPGAVTEHKVKTDEWTLTPRIGPKVSLSPGPEQKYETEGSSTTGFTSSLSPFSTHITQLMEETTTEKTSLEDIDLGSGLFEKPKATEL正FSTIKVTVPSDITTAFSSVDRLHTTSAFKPSSAITKKPPLIDREPGEETTSDMVIIGESTSHVPPTTLEDIVAKETETDIDREYFTTSSPPATQPTRPPTVEDKEAFGPQALSTPQPPASTKFHPDINVYIIEVRENKTGRMSDLSVIGHPIDSESKEDEPCSEETDPVHDLMAEILPEFPDIIEIDLYHSEENEEEEEECANATDVTTTPSVQYINGKHLVTTVPKDPEAAEARRGQFESVAPSQNFSDSSESDTHPFVIAKTELSTAVQPNESTETTESLEVTWKPETYPETSEHFSGGEPDVFPTVPFHEEFESGTAKKGAESVTERDTEVGHQAHEHTEPVSLFPEESSGEIAIDQESQKIEATPRQWELSGSSSIPITEGSGEAEEDEDTMFTMVTDLSQRNTTDTXITLDTSRIITESFFEWATTIYPVSEQPSAKWPTKFVSETDTSEWISSTTVEEKKRKEEEGTTGTASTFEVYSSTQRSDQLILPFELESPNVATSSDSGTRKSFMSLTTPTQSEREMTDSTPWTETNTLENLGAQTTEHSSIHQPGVQEGLTTLPRSPASVFMEQGSGEAAADPETTTVSSFSLNVEYAIQAEKEVAGTLSPHVETTFSTEPTGLVLSTVMDRWAENITQTSREIVISERLGEPNYGAEIRGFSTGFPLEEDFSGDFREYSTVSHPIAKEETVMMEGSGDAAFRDTQTSPSTVPTSVHISHISDSEGPSSTMVSTSAFPWEEFTSSAEGSGEQLVTVSSSWPVLPSAVQKFSGTASSIIDEGLGEVGTVNEIDRRSTILPTAEVEGTKAPVEKEEVKVSGTVSTNFPQTIEPAKLWSRQEVNPVRQEIESETTSEEQIQEEKSFESPQNSPATEQTIFDSQTFTETELKTTDYSVLTTKKTYSDDKEMKEEDTSLVNMSTPDPDANGLESYTTLPEAT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KQLSEILRILTSRRSSQSPQELFEISRPQSPESERDIFGASSEqIDNO:100MQKSSTCSFMYGELTDKDTIEKVRQTFENYE應SFEILMYKKNRTPVWFFVKIAPIRNEQDKWLFLCTFSDITAFKQPIEDDSCKGWGKFARLTRALTSSRGVLQQLAPSVQKGENVHKHSRLAEVLQLGSDILPQYKQEAPKTPPHIILHYCWKTTWDWnLILTFYTAILWYNVSSVYISSLYFTMTSLTSVGFGNIAPSTDIEKIFAVAIMMIGSLLYATIFGNVTTIFQQMYASHSFSRNLILTYNLRKRIVFRKISDVKREEEERMKRKNEAPLILPPDHPVRRLFQRFRQQKEARLAAERGGRDLDDLDVEKGNVLTEHASANHSLVKASWTVRESPATPVSFQAASTSGASGEATLKKTDSCDSGITKSDLRLDNVGEARSPQDRSPILAEVKHSFYPIPEQTLQATVLEVRHELKEDIKALNAKMTNIEKQLSEILRILTSRRSSQSPQELFEISRPQSPESERDIFGAS權利要求1.一種鑒定哺乳動物組織中新血管結構的方法，其中所述新血管結構通過檢測所述組織中至少一種蛋白進行鑒定，所述至少一種蛋白是選自(1)Periostin[前體]，包括其各種亞型以及新的剪接變體A、B、D、E，(2)推定的G-蛋白偶聯受體42，包括其各種亞型，(3)溶質載體家族2，易化葡萄糖轉運體成員1，(4)硫酸軟骨素蛋白多糖核心蛋白[前體]，(5)CEACAM3，包括其各種亞型，(6)纖維調節素，(7)過氧蛋白同源物[片段]，(8)可能的G-蛋白偶聯受體37[前體]，(9)蛋白sidekick-1[前體]，(10)α1A-電壓依賴型鈣通道，(11)EMILIN2蛋白[片段]，(12)唐氏綜合征關鍵區域蛋白8，包括其各種亞型，(13)可能的G-蛋白偶聯受體113[前體]，(14)ANXA4蛋白[片段]，包括其各種亞型，(15)尿調制蛋白-樣1[前體]，包括其各種亞型，(16)清道夫受體F類成員2[前體]，(17)含Sushi結構域的蛋白2[前體]，(18)翻譯調控的腫瘤蛋白1，(19)推定的G-蛋白偶聯受體Q8TDU0，(20)假定蛋白DKFZp686K0275[片段]，(21)跨膜蛋白TMEM55A，(22)假定蛋白Q8WYY4，(23)具有序列相似性的家族116，成員A，(24)UPF0240蛋白C6orf66，(25)CDNAFLJ45811fis，克隆NT2RP7014778，(26)假定蛋白DKFZp779O1248，(27)β-脲基丙酸酶，(28)假定蛋白DKFZp434F1919，包括其各種亞型，(29)富含半胱氨酸具有EGF-樣結構域的蛋白2[前體]，包括其各種亞型，(30)UPF0378家族蛋白KIAA0100[前體]，(31)鉀電壓-門控通道亞家族H成員1，包括其各種亞型。2.根據權利要求1所述的方法，其中所述哺乳動物組織是成熟的哺乳動物組織，更優選人成熟組織，最優選腎組織。3.—種鑒定哺乳動物選自肺瘤、黃斑變性、關節炎和/或動脈硬化癥的疾病或病癥的方法，其中所述疾病或病癥通過在感興趣的哺乳動物組織中和/或緊鄰部位檢測至少一種蛋白進行鑒定，所述的至少一種蛋白選自(l)Periostin[前體],包括其各種亞型以及新的剪接變體A、B、D、E，(2)推定的G-蛋白偶聯受體42,包括其各種亞型，(3)溶質載體家族2,易化葡萄糖轉運體成員1，(4)硫酸軟骨素蛋白多糖核心蛋白[前體],(》CEACAM3，包括其各種亞型，(6)纖維調節素，(7)過氧蛋白同源物[片段],(8)可能的G-蛋白偶聯受體37[前體]，(9)蛋白sidekick-l[前體],(10)alA-電壓依賴型4丐通道，(11)EMILIN2蛋白[片段],(12)唐氏綜合征關鍵區域蛋白8,包括其各種亞型，(13)可能的G-蛋白偶聯受體113[前體],(14)ANXA4蛋白[片段]，包括其各種亞型，(15)尿調制蛋白-樣l[前體],包括其各種亞型，(16)清道夫受體F類成員2[前體],(17)含Sushi結構域的蛋白2[前體],(18)翻譯調控的肺瘤蛋白1,(19)推定的G-蛋白偶聯受體Q8TDU0，(20)假定蛋白DKFZp686K0275[片段]，(21)跨膜蛋白TMEM55A,(22)假定蛋白Q8WYY4,(23)具有序列相似性的家族116,成員A，(24)UPF0240蛋白C6orf66,(25)CDNAFLJ45811fis,克隆NT2RP7014778，(26)<叚定蛋白DKFZp77901248,(27)卩-脲基丙酸酶，(28)假定蛋白DKFZp434Fl9l9,包括其各種亞型，(29)富含半胱氨酸具有EGF-樣結構域的蛋白2[前體],包括其各種亞型，(30)UPF0378家族蛋白KIAA0100[前體],(31)鉀電壓-門控通道亞家族H成員1,包括其各種亞型。4.根據權利要求3所述的方法，其中所述疾病是腫瘤，優選人腫瘤，更優選人腎肺瘤。5.—種粑向哺乳動物組織中新血管結構和/或對其成像的方法，其中所述新血管結構通過配體進行把向和/或成像，所述配體與所述新血管結構中至少一種蛋白具有特異性結合親合力，所述至少一種蛋白選自(l)Periostin[前體]，包括其各種亞型以及新的剪接變體A、B、D、E,(2)推定的G-蛋白偶聯受體42，包括其各種亞型，(3)溶質載體家族2,易化葡萄糖轉運體成員1,(4)硫酸軟骨素蛋白多糖核心蛋白[前體]，(》CEACAM3,包括其各種亞型，(6)纖維調節素，(7)過氧蛋白同源物[片段],(8)可能的G-蛋白偶聯受體37[前體],(9)蛋白sidekick-1[前體],(10)alA-電壓依賴型釣通道,(11)EMILIN2蛋白[片段],(12)唐氏綜合征關鍵區域蛋白8,包括其各種亞型，(13)可能的G-蛋白偶聯受體113[前體],(14)ANXA4蛋白[片段],包括其各種亞型，(15)尿調制蛋白-樣l[前體],包括其各種亞型，(16)清道夫受體F類成員2[前體],(17)含Sushi結構域的蛋白2[前體],(18)翻譯調控的腫瘤蛋白1,(19)推定的G-蛋白偶聯受體Q8TDU0,(20)假定蛋白DKFZp686K0275[片段]，(21)跨膜蛋白TMEM55A,(22)假定蛋白Q8WYY4，(23)具有序列相似性的家族116,成員A,(24)UPF0240蛋白C6orf66,(25)CDNAFLJ45811fis,克隆NT2RP7014778,(26)假定蛋白DKFZp77901248,(27)卩-脲基丙酸酶，(28)假定蛋白DKFZp434F1919,包括其各種亞型，(29)富含半胱氨酸具有EGF-樣結構域的蛋白2[前體],包括其各種亞型，(30)UPF0378家族蛋白KIAA0100[前體],(31)鉀電壓-門控通道亞家族H成員1,包括其各種亞型。6.根據權利要求5所述的方法，其中所述哺乳動物組織是成熟的哺乳動物組織，更優選人成熟組織，最優選腎組織。7.—種耙向受選自腫瘤、黃斑變性、關節炎和/或動脈硬化癥的疾病或病癥影響的哺乳動物組織和/或對其成像的方法，其中所述疾病或病癥通過配體進行把向和/或成像，所述配體與在感興趣的哺乳動物組織中和/或緊鄰部位的至少一種蛋白具有特異性結合親合力，所述至少一種蛋白選自(l)Periostin[前體],包括其各種亞型以及新的剪接變體A、B、D、E，(2)推定的G-蛋白偶聯受體42,包括其各種亞型，(3)溶質載體家族2，易化葡萄糖轉運體成員1，(4)硫酸軟骨素蛋白多糖核心蛋白[前體],(5)CEACAM3，包括其各種亞型，(6)纖維調節素，(7)過氧蛋白同源物[片段],(8)可能的G-蛋白偶聯受體37[前體]，(9)蛋白sidekick-1[前體],(10)alA-電壓依賴型釣通道，(11)EMILIN2蛋白[片段],(12)唐氏綜合征關鍵區域蛋白8,包括其各種亞型，(13)可能的G-蛋白偶聯受體113[前體],(14)ANXA4蛋白[片段],包括其各種亞型，(15)尿調制蛋白-樣1[前體],包括其各種亞型，(16)清道夫受體F類成員2[前體],(17)含Sushi結構域的蛋白2[前體]，(18)翻譯調控的肺瘤蛋白1,(19)推定的G-蛋白偶聯受體Q8TDU0，(20)假定蛋白DKFZp686K0275[片段],(21)跨膜蛋白TMEM55A,(22)假定蛋白Q8WYY4,(")具有序列相似性的家族II6,成員A,(M)UPF0M0蛋白C6orf66，(25)CDNAFLJ45811fis,克隆NT2RP7014778,(26)假定蛋白DKFZp77901248,(27)卩-脲基丙酸酶，(28)假定蛋白DKFZp434F1919，包括其各種亞型，(29)富含半胱氨酸具有EGF-樣結構域的蛋白2[前體],包括其各種亞型，(30)UPF0378家族蛋白KIAA0100[前體]，(31)鉀電壓-門控通道亞家族H成員1,包括其各種亞型。8.根據權利要求7所述的方法，其中所述疾病是腫瘤，優選腎腫瘤，更優選人腎腫瘤。9.至少一種配體，優選抗體、其片段或功能性衍生物在鑒定哺乳動物組織中的腫瘤中的用途，所述配體對下述蛋白具有特異性結合親合力，所述蛋白選自(l)Periostin[前體],包括其各種亞型以及新的剪接變體A、B、D、E，(2)推定的G-蛋白偶聯受體42,包括其各種亞型，(3)溶質載體家族2,易化葡萄糖轉運體成員1,(4)硫酸軟骨素蛋白多糖核心蛋白[前體],(》CEACAM3，包括其各種亞型，(6)纖維調節素，(7)過氧蛋白同源物[片段],(8)可能的G-蛋白偶聯受體37[前體],(9)蛋白sidekick隱l[前體],(10)alA-電壓依賴型鈣通道,(11)EMILIN2蛋白[片段],(12)唐氏綜合征關鍵區域蛋白8,包括其各種亞型，(13)可能的G-蛋白偶聯受體113[前體],(14)ANXA4蛋白[片段],包括其各種亞型，(15)類尿調制蛋白l[前體],包括其各種亞型，(16)清道夫受體F類成員2[前體],(17)含Sushi結構域的蛋白2[前體]，(18)翻譯調控的腫瘤蛋白1，(19)推定的G-蛋白偶聯受體Q8TDU0,(20)假定蛋白DKFZp686K0275[片段],(21)跨膜蛋白TMEM55A,(22)假定蛋白Q8WYY4,(23)具有序列相似性的家族116，成員A,(24)UPF0240蛋白C6orf66,(25)CDNAFLJ45811fis,克隆NT2RP7014778,(26)假定蛋白DKFZp77901248,(27)卩-脲基丙酸酶，(28)假定蛋白DKFZp434F1919,包括其各種亞型，(29)富含半胱氨酸具有EGF-樣結構域的蛋白2[前體],包括其各種亞型，(30)UPF0378家族蛋白KIAA0100[前體],(31)鉀電壓-門控通道亞家族H成員1,包括其各種亞型。10.根據權利要求9所述的用途，用于鑒定人組織中的腫瘤。11.根據權利要求9或10所述的用途，其中所述至少一種配體，優選抗體、其片段或功能性衍生物對權利要求9所述的選自蛋白1A、1B、1D、1E、2、5、7-13、15-17、19-23、25-30的蛋白具有特異性結合親合力。12.根據權利要求9至11中任一項所述的用途，用于鑒定哺乳動物腎組織中的腫瘤，優選地人腎組織。13.根據權利要求12所述的用途，其中所述的至少一種配體，優選地抗體、其片段或功能性衍生物對權利要求9所述的選自蛋白1、2、4-13、15-31的蛋白具有特異性結合親合力。14.根據權利要求9至13中任一項所述的用途，用于鑒定哺乳動物腎腫瘤組織中的新血管結構，優選地人血管腎組織。15.根據權利要求9至14中任一項所述的用途，用于體外或體內鑒定腫瘤，優選體外。16.—種配體，優選抗體、其片段或功能性衍生物，對下述蛋白具有特異性結合親合力，所述蛋白選自(l)Periostin剪接變體A、B、D、E，(5)CEACAM3，包括其各種亞型，(7)過氧蛋白同源物[片段],(9)蛋白sidekick-l[前體],(12)唐氏綜合征關鍵區域蛋白8,包括其各種亞型，(13)可能的G-蛋白偶聯受體113[前體],(1》尿調制蛋白-樣1[前體],包括其各種亞型，(16)清道夫受體F類成員2[前體],(17)含Sushi結構域的蛋白2[前體],(19)推定的G-蛋白偶聯受體Q8TDU0,(20)假定蛋白DKFZp686K0275[片段],(21)跨膜蛋白TMEM55A,(22)假定蛋白Q8WYY4,(23)具有序列相似性的家族116,成員A,(25)CDNAFLJ45811fis,克隆NT2RP7014778,(28)假定蛋白DKFZp434F1919，包括其各種亞型，(30)UPF0378家族蛋白KIAA0100[前體]。17.根據權利要求16所述的抗體、其片段或功能性衍生物，其中所述的抗體、其片段或功能性衍生物選自多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合型抗體、人源化抗體、CDR移植抗體、Fv片段、Fab片段、Fab2片段和抗體樣結合蛋白。18.—種融合蛋白，包含配體，優選根據權利要求16或17所述的抗體、其片段或功能性衍生物。19.根據權利要求18所述的融合蛋白，包含具有抗腫瘤活性的組分。20.根據權利要求19所述的融合蛋白，其中所述的具有抗腫瘤活性的組分選自完整抗體、其含有Fc的抗體片段或Fc功能性衍生物、放射性核苷酸、光敏劑、脂質體、藥物、促凝劑、細胞因子、趨化因子、毒素以及雙特異性抗體。21.根據權利要求18所述的融合蛋白，包含具有診斷活性的組分，即能夠用于體內和/或離體的選擇性鑒定。22.根據權利要求21所述的融合蛋白，其中具有診斷活性的組分選自放射性標記物、熒光團、生物素、螯合金屬或金屬化合物、以及微泡。23.權利要求18至20中任一項所述的融合蛋白在制備治療哺乳動物、優選人癌癥的藥物中的用途。24.根據權利要求23所述的用途，用于治療腎癌，優選人腎癌。25.根據權利要求18、21或22中任一項所述的融合蛋白在制備鑒定哺乳動物、優選人腫瘤的診斷組合物中的用途。26.根據權利要求25所述的用途，用于鑒定哺乳動物腎，優選人腎中的腫瘤。27.—種藥物組合物，包含根據權利要求16或17中任一項所述的配體，優選抗體、其片段或衍生物和/或根據權利要求18至20中任一項所述的融合蛋白和藥學上可接受的載體或稀釋劑。28.—種診斷組合物，包含根據權利要求16或17中任一項所迷的配體，優選地抗體、其片段或衍生物和/或根據權利要求18、21或22中任一項所述的融合蛋白。29.—種鑒定哺乳動物組織、優選人組織中^l中瘤的方法，包4舌(i)使與選自(l)Periostin[前體],包括其各種亞型以及新的剪接變體A、B、D、E,(2)推定的G-蛋白偶聯受體42,包括其各種亞型，(3)溶質載體家族2,易化葡萄糖轉運體成員1,(4)硫酸軟骨素蛋白多糖核心蛋白[前體],("CEACAM3,包括其各種亞型，(6)纖維調節素，(7)過氧蛋白同源物[片段],(8)可能的G-蛋白偶聯受體37[前體],(9)蛋白sidekick-l[前體],(10)alA-電壓依賴型鉀通道，(11)EMILIN2蛋白[片段],(12)唐氏綜合征關鍵區域蛋白8,包括其各種亞型，(13)可能的G-蛋白偶聯受體113[前體],(14)ANXA4蛋白[片段]，包括其各種亞型，(15)尿調制蛋白-樣l[前體],包括其各種亞型，(16)清道夫受體F類成員2[前體]，(17)含Sushi結構域的蛋白2[前體],(18)翻譯調控的腫瘤蛋白1,(19)推定的G-蛋白偶聯受體Q8TDU0,(20)假定蛋白DKFZp686K0275[片段],(21)跨膜蛋白TMEM55A,(22)，￡定蛋白Q8WYY4,(23)具有序列相似性的家族116,成員A,(24)UPF0240蛋白C6orf66,(25)CDNAFLJ45811fis,克隆NT2RP7014778,(26)假定蛋白DKFZp77901248,(27)卩-脲基丙酸酶，(28)假定蛋白DKFZp434F1919，包括其各種亞型，(29)富含半胱氨酸具有EGF-才羊結構域的蛋白2[前體]，包括其各種亞型，(30)UPF0378家族蛋白KIAA0100[前體]，(31)鉀電壓-門控通道亞家族H成員1,包括其各種亞型，的至少一種蛋白具有特異結合親和力的配體，優選抗體、其片^殳或功能性衍生物和/或包含配體，優選抗體、其片段或功能性衍生物的融合蛋白在允許所述配體和/或融合蛋白與所述蛋白1至36中至少一種特異性結合的條件下與感興趣的哺乳動物組織、優選感興趣的人組織進4亍體內和/或離體4妻觸，和(ii)鑒定特異性結合的配體和/或融合蛋白。30.權利要求29所述的方法，其中根據權利要求29所述的至少一種蛋白選自1A、1B、1D、1E、2、5、7-13、15-17、19-23、25-30。31.權利要求29或30所述的方法，其中根據權利要求29所述的至少一種蛋白選自1、2、4-13、15-31,且所述感興趣的哺乳動物^L織是腎組織。32.根據權利要求29至31中任一項所述的方法，其中所述感興趣的哺乳動物組織是血管腎組織，優選人血管腎組織。33.根據權利要求29至32中任一項所述的方法，其中所述步驟(i)和(ii)是離體進行的。34.根據權利要求29至32中任一項所述的方法，其中所述方法是對腫瘤、優選腎腫瘤、更優選血管腎腫瘤體內成像的方法。35.—種periostin剪接變體蛋白、片段或功能性衍生物，包含具有氨基酸EIPVTVYGPEIK的肽。36.分別具有選自SEQIDNOs:9、11、13、15的氨基酸序列的Periostin剪接變體蛋白A、B、D或E,其片段或功能性衍生物，其中其片段或功能性衍生物的氨基酸序列包括至少10,優選至少15，更優選至少30個氨基酸，并且最優選至少50或至少75個氨基酸，且a)其中SEQIDNO:9的片段或功能性衍生物具有反映SEQIDNO:1的位置670-756、或者位置670-756和783-810的缺失的氨基酸序列；b)其中SEQIDNO:11的片段或功能性衍生物具有反映SEQIDNO:1的位置670-726和784-810、或者位置784-810的缺失的氨基酸序列；c)其中SEQIDNO:13的片段或功能性衍生物具有反映SEQIDNO:1的位置670-756的缺失的氨基酸序列；d)其中SEQIDNO:15的片段或功能性衍生物具有包含SEQIDNO:15的位置421處的氨基酸纈氨酸的氨基酸序列，和反映SEQIDNO:1的位置671-697的缺失的氨基酸序列。37.根據權利要求36所述的periostin剪接變體蛋白、片段或功能性衍生物，包含具有氨基酸EIPVTVYGPEIK的肽。38.根據權利要求35至37所述的蛋白、片段或功能性衍生物，與權利要求37所述的蛋白、片段或功能性衍生物具有至少80%、優選85%、更優選90%、最優選至少95%或98%的氨基酸序列同一性，其中所述序列不是SEQIDNO:1、3、5和7中的任一序列。39.—種多核苷酸，其編碼權利要求35至38所述的蛋白、片段或功能性衍生物。40.—種蛋白(5),具有如SEQIDNOs:25、27和29中任一項所示的氨基酸序列，其片段或功能性衍生物。41.根據權利要求40所述的蛋白、片段或功能性衍生物，與SEQIDNOs:25、27或29的蛋白具有至少70%、優選80%、更優選90%、最優選至少95%的氨基酸序列同一性。42.—種多核香酸，其編碼SEQIDNOs:25、27或29的蛋白、其片段或功能性衍生物，具有分別與SEQIDNOs:26、28或30的核酸序列在嚴謹條件下雜交的能力。43.—種蛋白(7),具有如SEQIDNO:33中所示的氨基酸序列，其片段或功能性衍生物。44.根據權利要求43所述的蛋白、片段或功能性衍生物，與SEQIDNO:33的蛋白具有至少70%、優選80%、更優選90%、最優選至少95%的氨基酸序列同一性。45.—種多核普酸，其編碼SEQIDNO:33的蛋白、其片段或功能性衍生物，具有與SEQIDNO:34的核酸序列在嚴謹條件下雜交的能力。46.—種蛋白(9),具有如SEQIDNO:37中所示的氨基酸序列，其片段或功能性衍生物。47.根據權利要求46所述的蛋白、片段或功能性衍生物，與SEQIDNO:37的蛋白具有至少70%、優選80%、更優選90%、最優選至少95%的氨基酸序列同一性。48.—種多核苷酸，編碼SEQIDNO:37的蛋白、其片段或功能性衍生物，具有與SEQIDNO:38的核酸序列在嚴謹條件下雜交的能力。49.一種蛋白(12)或其亞型，其具有選自SEQIDNOs:43、45至49的氨基酸序列，其片段或功能性衍生物。50.根據權利要求49所述的蛋白、片段或功能性衍生物，其與選自SEQIDNOs:43、45至49中的任一種蛋白具有至少70%、優選80%、更優選90%、最優選至少95%的氨基酸序列同一性。51.—種多核普酸，編碼選自SEQIDNOs:43、45至49中的任一個蛋白、其片段或功能性衍生物，優選具有如SEQIDNO:44所示的核酸序列。52.—種蛋白(13)，具有如SEQIDNO:50中所示的氨基酸序列，其片段或功能性衍生物。53.根據權利要求52所述的蛋白、片段或功能性衍生物，與SEQIDNO:50的蛋白具有至少70%、優選80%、更優選90%、最優選至少95%的氨基酸序列同一性。54.—種多核苷酸，其編碼SEQIDNO:50的蛋白、其片段或功能性衍生物，具有與SEQIDNO:51的核酸序列在嚴謹條件下雜交的能力。55.—種蛋白(15),具有如SEQIDNOs:56、58-60任一項中所示的氨基酸序列，其片段或功能性衍生物。56.根據權利要求55所述的蛋白、片段或功能性衍生物，與SEQIDNOs:56、58-60任一項的蛋白具有至少70%、優選80%、更優選90%、最優選至少95%的氨基酸序列同一性。57.—種多核苷酸，編碼SEQIDNOs:56、58-60中任一項的蛋白、其片段或功能性衍生物，優選具有與SEQIDNO:57的核酸序列在嚴謹條件下雜交的能力。58.—種蛋白(15),具有如SEQIDNO:56中所示的氨基酸序列，其片段或功能性衍生物。59.根據權利要求58所述的蛋白、片段或功能性衍生物，與SEQIDNO:56的蛋白具有至少70%、優選80%、更優選90%、最優選i也至少95%的氨基酸序列同一性。60.—種多核苷酸，編碼SEQIDNO:56的蛋白、其片段或功能性衍生物，優選具有與SEQIDNO:57的核酸序列在嚴謹條件下雜交的能力。61.—種蛋白(16),具有如SEQIDNO:61中所示的氨基酸序列，其片段或功能性衍生物。62.根據權利要求61所述的蛋白、片段或功能性衍生物，與SEQIDNO:61的蛋白具有至少70%、優選80%、更優選90%、最優選至少95%的氨基酸序列同一性。63.—種多核香酸，其編碼SEQIDNO:61的蛋白、其片段或功能性衍生物，具有與SEQIDNO:62的核酸序列在嚴謹條件下雜交的能力。64.—種蛋白(19),具有如SEQIDNO:67中所示的氨基酸序列，其片段或功能性衍生物。65.根據權利要求64所述的蛋白、片段或功能性衍生物，與SEQIDNO:67的蛋白具有至少70%、優選80%、更優選90%、最優選至少95%的氨基酸序列同一性。66.—種多核苷酸，其編碼SEQIDNO:67的蛋白、其片段或功能性衍生物，具有與SEQIDNO:68的核酸序列在嚴謹條件下雜交的能力。67.—種蛋白(20),具有如SEQIDNO:69中所示的氨基酸序列，其片段或功能性衍生物。68.根據權利要求67所述的蛋白、片段或功能性衍生物，與SEQIDNO:69的蛋白具有至少70%、優選80%、更優選90%、最優選至少95%的氨基酸序列同一性。69.—種多核苷酸，其編碼SEQIDNO:69的蛋白、其片段或功能性衍生物，具有與SEQIDNO:70的核酸序列在嚴謹條件下雜交的能力。70.—種蛋白(21),具有如SEQIDNO:71中所示的氨基酸序列，其片段或功能性衍生物。71.根據權利要求70所述的蛋白、片段或功能性衍生物，與SEQIDNO:71的蛋白具有至少70%、優選80%、更優選90%、最優選至少95%的氨基酸序列同一性。72.—種多核苷酸，其編碼SEQIDNO:71的蛋白、其片段或功能性衍生物，具有與SEQIDNO:72的核酸序列在嚴謹條件下雜交的能力。73.—種蛋白(22),具有如SEQIDNO:73中所示的氨基酸序列，其片段或功能性衍生物。74.根據權利要求73所述的蛋白、片段或功能性衍生物，與SEQIDNO:73的蛋白具有至少70%、優選80%、更優選90%、最優選至少95%的氨基酸序列同一性。75.—種多核苦酸，其編碼SEQIDNO:73的蛋白、其片段或功能性衍生物，具有與SEQIDNO:74的核酸序列在嚴謹條件下雜交的能力。76.—種蛋白(23),具有如SEQIDNO:75中所示的氨基酸序列，其片段或功能性衍生物。77.根據權利要求76所述的蛋白、片段或功能性衍生物，與SEQIDNO:75的蛋白具有至少70%、優選80%、更優選90%、最優選至少95%的氨基酸序列同一性。78.—種多核苷酸，其編碼SEQIDNO:75的蛋白、其片段或功能性衍生物，具有與SEQIDNO:76的核酸序列在嚴謹條件下雜交的能力。79.—種蛋白(25),具有如SEQIDNO:79中所示的氨基酸序列，其片段或功能性衍生物。80.根據權利要求79所述的蛋白、片段或功能性衍生物，與SEQIDNO:79的蛋白具有至少70%、優選80%、更優選90%、最優選至少95%的氨基酸序列同一性。81.—種多核苷酸，其編碼SEQIDNO:79的蛋白、其片段或功能性衍生物，具有與SEQIDNO:80的核酸序列在嚴謹條件下雜交的能力。82.—種蛋白(28),具有如SEQIDNO:85中所示的氨基酸序列，其片段或功能性衍生物。83.根據權利要求82所述的蛋白、片段或功能性衍生物，與SEQIDNO:85的蛋白具有至少70%、優選80%、更優選90%、最優選至少95%的氨基酸序列同一性。84.—種多核普酸，其編碼SEQIDNO:85的蛋白、其片段或功能性衍生物，具有與SEQIDNO:86的核酸序列在嚴謹條件下雜交的能力。85.—種蛋白(28)亞型，具有如SEQIDNO:87中所示的氨基酸序列，其片段或功能性衍生物。86.根據權利要求85所述的蛋白、片段或功能性衍生物，與SEQIDNO:87的蛋白具有至少70%、優選80%、更優選90%、最優選至少95%的氨基酸序列同一性。87.—種多核苦酸，其編碼SEQIDNO:87的蛋白、其片段或功能性衍生物，具有與SEQIDNO:88的核酸序列在嚴謹條件下雜交的能力。88.—種蛋白(30),具有如SEQIDNO:96中所示的氨基酸序列，其片段或功能性衍生物。89.根據權利要求88所述的蛋白、片段或功能性衍生物，與SEQIDNO:96的蛋白具有至少70%、優選80%、更優選90%、最優選至少95%的氨基酸序列同一性。90.—種多核苷酸，其編碼SEQIDNO:96的蛋白、其片段或功能性衍生物，具有與SEQIDNO:97的核酸序列在嚴謹條件下雜交的能力。91.一種蛋白(31)，具有如SEQIDNO:98或SEQIDNO:100中所示的氨基酸序列，其片段或功能性衍生物。92.根據權利要求91所述的蛋白、片段或功能性衍生物，與SEQIDNO:98或SEQIDNO:100的蛋白具有至少70%、優選80%、更優選90%、最優選至少95%的氨基酸序列同一性。93.—種多核苷酸，其編碼SEQIDNO:98或SEQIDNO:100的蛋白、其片段或功能性衍生物，優選具有與SEQIDNO:99的核酸序列在嚴謹條件下雜交的能力。94.一種載體，包含編碼根據前面權利要求中任一項所述的蛋白、其片段或功能性衍生物的多核苦酸。95.—種宿主細胞，包含根據前面權利要求任一項所述的重組蛋白、核酸和/或載體。1全文摘要本發明涉及一種鑒定哺乳動物組織中新血管結構的方法，其中所述新血管結構通過在所述組織中檢測至少一種特異性蛋白進行鑒定。本發明還涉及鑒定與新血管形成相關的疾病或病癥的方法、靶向新血管結構和/或對其成像的方法以及靶向與新血管形成相關的疾病或病癥的方法。此外，本發明還涉及新型和/或已知配體(優選抗體，針對新型和/或已知靶蛋白)的用途，用于鑒定哺乳動物組織中的腫瘤細胞，優選哺乳動物腎組織，更優選地哺乳動物血管腎組織。本發明還涉及新型配體，優選抗體，包含所述配體或抗體的融合蛋白，包含所述配體、抗體或融合蛋白的藥物和診斷組合物，診斷和治療方法，以及新型蛋白和相應的多核苷酸、載體和宿主細胞。文檔編號C07K16/00GK101389963SQ200780006337公開日2009年3月18日申請日期2007年2月21日優先權日2006年2月22日發明者C·羅斯利,D·尼里,J·-N·雷巴克申請人:菲洛根有限公司