作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的吡啶和嘧啶衍生物的制作方法

專利名稱：：作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的吡啶和嘧啶衍生物的制作方法作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的吡啶和嘧啶書f生物本發明涉及具有組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制活性的化合物。它還涉及它們的制備方法，含有它們的組合物，以及它們在體外和體內抑制HDAC和作為醫藥的應用，例如作為抑制增生性病癥(如癌癥禾口牛皮癬)的藥物的應用。核組蛋白已知是對于調節基因轉錄和其它DNA^^板過程，例如復制、修復、重組和染色體分離，起主要作用的機構的內在和動態組分。它們是翻譯后修飾，包括乙酰化、磷酸化、曱基化、泛素化和ADP-核糖基化的對象。組蛋白脫乙酰酶，此處稱作"HDAC"，是對于蛋白質的賴氨酸殘基上，包括核心核小體組蛋白H2A、H2B、H3和H4上的乙酰基修飾的去除起催化作用的酶。與本文中稱作"HAT"的組蛋白乙酰基轉移酶一起，HDAC起著調節組蛋白的乙酰化水平的作用。核小體組蛋白的乙酰化平衡在很多基因的轉錄中起重要作用。組蛋白的乙酰化過低伴隨著凝聚的染色質結構，造成基因轉錄的阻抑，而乙酰化的組蛋白伴隨著更開放的染色質結構和轉錄的激活。已經描述過11種結構上相關的HDAC,并將其歸成兩類。I類HDAC由HDAC1、2、3、8和11組成，II類HDAC由HDAC4、5、6、7、9和10組成。第III類HDAC的成員在結構上與第I和n類HDAC不相關。I/II類HDAC通過鋅依賴性機制起作用，而III類HDAC是NAD依賴性的。除組蛋白以外，其它蛋白質也是乙酰化的底物，特別是轉錄因子例如p53、GATA-1和E2F;核內受體，例如糖皮質素受體、甲狀&袈受體、雌激素受體；以及細胞周期調節蛋白，例如pRb。已經將蛋白質乙酰化與蛋白質穩定化，例如p53穩定化，輔因子的募集和DNA結合增強相聯系。p53是一種腫瘤抑制劑，它能夠響應各種應激信號，例如DNA損傷，誘發細胞周期停頓或凋亡。p53誘發的細胞周期停頓的主靶物似乎是p21基因。在被p53激活之后，p21已經根據它與周期蛋白/周期蛋白依賴性激酶絡合物的結合在Gl和G2相造成的細胞周期停頓、它在衰老期間的上調作用，以及它與增生細胞核抗原的相互作用而得到鑒別。HDAC的抑制劑的研究表明它們在細胞周期停頓、細胞分化、凋亡和轉化表型的逆轉中起重要作用。例如，抑制劑制毛褲素A(TSA)造成Gl和G2相的細胞周期停頓，逆轉分化細胞系的轉化表型，并誘發Friend白血病細胞及其它細胞的分化。TSA(和N-辛二酰苯胺異羥肟酸SAHA)已被報道能在小鼠中抑制細胞生長，誘發終末分化，和阻止腫瘤形成(Finnin等，Nature,401:188-193,1999)。還報道說，制毛癬素A可用于治療纖維4b例如肝纖維化和肝硬化(Geerts等，EuropeanPatentApplicationEP0827742,1998年3月11日公布)。HDAC抑制劑的藥效團包括與HDAC的含鋅活性位點相互作用的金屬結合域、連接域和與該活性位點邊緣上的殘基相互作用的表面識別域或加帽域組成。還報道說，HDAC抑制劑會誘發p21基因表達。p21基因被這些抑制劑的轉錄激活是在p21啟動子區域中的組蛋白H3和H4乙酰化之后，由染色質重塑促成的。p21的這種激活是以與p53無關的方式完成的，因此HDAC抑制劑在具有變異的p53基因(許多種胂瘤的標志物)的細胞中有效。此外，HDAC抑制劑能夠具有諸如增強宿主免疫響應和抑制腫瘤血管發生的間接活性，因此能抑制原發性腫瘤的生長和阻止轉移(Mai等，MedicinalResearchReviews,25:261-309,2005)。由于上述原因，HDAC抑制劑在細胞增生性疾病或癥狀(包括具有變異的p53基因的腫瘤)的治療中會有很大的潛力。2003年8月14日公布的專利申請EP1472216公開了作為組蛋白脫乙酰酶的抑制劑的雙環異羥肟酸。2003年9月18日7〉布的專利申請EP1485099、EP1485348、EP1485353、EP1485354、EP1485364、EP1485365、EP1485370、EP1485378,除了別的以外，還^開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的取代的哌嗪基嘧啶基異羥肟酸，此外，EP1485365還公開了R306465。2003年10月9日公布的專利申請EP1492534公開了作為HDAC抑制劑的含一個哌嗪連接基團的氨基曱酸化合物。2003年10月23日/^布的專利申請EP14950027>開了作為組蛋白脫乙酰抑制劑的取代的哌。秦基苯基苯甲酰胺化合物。2003年11月13日公布的專利申請EP15015087^開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的苯甲酰胺化合物。2004年1月29日公布的專利申請WO04/009536公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的在芳基和異羥肟酸基之間包含一個烷基連接基團的書f生物。2004年2月12日公布的專利申請EP1525199公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的(雜)芳基烯基取代的雙環異羥肟酸化合物。2004年6月24日公布的專利申請EP1572626公開了作為藥理試劑的亞芳基羧酸(2-氨基苯基)酰胺衍生物。2004年7月29日公布的專利申請EP1581484公開了具有消炎和抗腫瘤活性的N-羥基苯曱酰胺衍生物。2004年7月29日公布的專利申請EP1585735公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的取代的異羥將酸芳基酯衍生物。2004年8月19日公布的專利申請EP1592667公開了作為藥理試劑的單酰基化鄰苯二胺衍生物。2004年8月19日公布的專利申請EP1590340公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的二氨基亞苯基衍生物。2004年8月26日公布的專利申請EP1592665公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的苯甲酰胺衍生物。2004年8月26日公布的專利申請WO04/072047公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的吲咮類、苯并咪唑類和萘并咪唑類化合物。2004年9月30日公布的專利申請EP1608628公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的與非芳族雜環系連接的異羥肟酸酯。2004年10月14日公布的專利申請EP16136227>開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的將衍生物。2004年10月28日公布的專利申請EP16110887>開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的異羥肝酸酯書f生物。2005年3月31日公布的專利申請WO05/028447公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的苯并咪唑化合物。2005年4月7日公布的專利申請WO05/030704和WO05/030705公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的苯甲酰胺化合物。2005年5月6日乂>布的專利申請WO05/0401017>開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的與酰脲連接的和與磺脲連接的異羥肟酸酯。2005年5月6日7>布的專利申請WO05/040161公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的聯芳基連接的異羥肟酸酯。脫乙酰酶抑制劑的p塞唑基異羥肟酸和噻二唑基異鞋肝酸。2005年9月22日公布的專利申請WO05/086898公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的雜五環異羥肟酸。2005年10月6日公布的專利申請WO05/092899公開了作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑的烯基苯曱酰胺。本發明化合物在結構、藥理活性和/或藥理效力方面與先有技術不同。要解決的問題是提供具有高的酶活性和細胞活性，以及生物利用度和/或體內效力增高的組蛋白脫乙酰酶抑制劑。本發明的新化合物解決了上述問題。本發明化合物顯示出有益的細胞活性。它們在細胞和體內水平都具有高的激活p21基因的能力。它們能具有理想的藥動力學型式，并且對p450酶的親合性低，這降低了不利的藥物-藥物相互作用的危險，還可以有較大的安全限度。本發明化合物的有利特點是代謝穩定性、溶解性和/或p21誘發能力。本發明涉及式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其N-氧化物形式，可藥用的加成鹽和立體化學異構形式，其中X是N或CH;Ri是苯基，萘基或雜環基；其中苯基或萘基均可任選地被一個或二個取代基取代，這些取代基獨立地選自囟素、Cw烷基、d—6烷氧基、多囟代d—6烷基、芳基、羥基、氰基、氨基、d—6烷基羰基氨基、d-6烷基磺酰氨基、羥基羰基、d—6烷氧羰基、羥基Ci—6烷基、d—6烷氧基2005年8月18為組蛋白曱基、氨甲基、d-6烷基氨甲基、d-6烷基羰基氨甲基、C"烷基磺酰基氨曱基、氨磺酰基、Cw烷基氨磺酰基或雜環基；R2是CH2-R10,三氟甲基。-C(=0)-R^-CHb-NRUR13;其中各R"獨立地選自氫、羥基、d—6烷氧基、C^6烷氧基d—6烷氧基、d—6烷基羰氧基、哌嗪基、N-甲基哌嗪基、嗎啉基、硫嗎啉基、咪唑基或三唑基；各R"獨立地選自羥基、d-6烷氧基、氨基或者一或二(d—6烷基)氨基、Cw環烷基氨基、羥基d—6烷基氨基、哌嗪基、一或二(d—6烷基)氨基Cw烷基氨基、N-甲基哌嗪基、嗎啉基或硫嗎啉基；各1112和R"獨立地選自氫、Cw烷基、d-6烷基羰基、d-6烷基磺酰基、或者一或二(d—4烷基)氨基磺酰基；W是氫，羥曱基，氨曱基或是一或二(C"烷基)氨曱基；R"是氳或Cb6烷基；R"是羥基或氨基；R"是氬、噻吩基、呋喃基或苯基，并且各噻吩基、呋喃基或苯基均可任選地被獨立選自以下基團的一或二個取代基取代卣素，氨基，硝基，氰基，羥基，苯基，6烷基，二(d-6烷基)氨基，d-6烷氧基，苯基C^6烷氧基，羥基d—6烷基，d—6烷氧基羰基，羥基羰基，Cw烷基羰基，多囟代d—6烷氧基，多卣代d—6烷基，Cw烷基磺酰基，羥基羰基C"烷基，C"烷基羰基氨基，氨磺酰基，氨磺酰d—6烷基，異^惡唑基，氨基羰基，苯基C2—6烯基，苯基C3-6炔基或吡啶基C3—6炔基；R7、RS和R^各自獨立地代表氫，氨基，硝基，呋喃基，離素，d-6烷基，Cw烷氧基，三氟曱基，噻吩基，苯基，c^烷基羰基氨基，氨基羰基C"烷基，或-C三C-CH2-R";其中R"是氫、C"烷基、羥基、氨基或Cw烷氧基；以上的芳基是苯基或萘基，其中該苯基或萘基可任選地被獨立選自卣素、Cw烷基，d—6烷氧基，三氟甲基，氰基或羥基羰基的一或二個取代基取代；和以上的雜環基是呋喃基，噻吩基，吡咯基，吡咯啉基，吡咯烷基，二氧雜環戊烯基，嗜唑基，噻唑基，咪唑基，咪唑啉基，咪唑烷基，吡唑基，吡唑啉基，吡唑烷基，異嗝唑基，異噻唑基，哺二唑基，三唑基，p塞二唑基，吡喃基，吡啶基，哌啶基，二嗜烷基，嗎啉基，二噻烷基，硫嗎啉基，噠。秦基，嘧啶基，吡。秦基，哌。秦基，三口秦基，三噻烷基，吲。秦基，"引咮基，二氫吲哚基，苯并呋喃基，苯并噻吩基，吲唑基，苯并咪唑基，苯并噻唑基，。票呤基，喹嗪基，喹啉基，噌啉基，酞嗪基，喹唑啉基，喹喔啉基或萘啶基；其中所述各雜環均可任選地被獨立選自鹵素、d—6烷基、d-6烷氧基、氰基、氨基、一或二(d-4烷基)氨基的一或二個取代基取代。術語"組蛋白脫乙酰酶抑制劑"或"組蛋白脫乙酰酶的抑制劑"被用來說明一種能夠與組蛋白脫乙酰酶相互作用并抑制其活性，特別是其酶活性的化合物。抑制組蛋白脫乙酰酶的酶活性意味著降低組蛋白脫乙酰酶從組蛋白中除去乙酰基團的能力。優選這種抑制是特異性的，即，組蛋白脫乙酰酶抑制劑在某個濃度降低組蛋白脫乙酰酶從組蛋白中除去乙酰基團的能力，該濃度低于為產生一些其它不相關的生物效應所需的該抑制劑的濃度。當在前述定義中和以后使用時，鹵素是氟、氯、溴和碘的通稱；d_2烷基定義為有1或2個碳原子的直鏈飽和烴基，例如甲基或乙基；d-6烷基定義為Cw烷基和有3-6個碳原子的直鏈或支鏈飽和烴基，例如丙基、丁基、l-曱基乙基、2-曱基丙基、戊基、2-曱基丁基、己基、2-甲基戊基等；多鹵代C"烷基定義了含3個相同或不同的鹵素取代基的d-6烷基，例如三氟甲基；C2—6烯基定義了含一個雙鍵和2-6個碳原子的直鏈和支鏈烴基，例如，乙烯基、2-丙烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、3-甲基-2-丁烯基等；C3-6炔基定義了含一個三鍵和有3-6個碳原子的直鏈和支鏈烴基，例如，2-丙炔基、3-丁炔基、2-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、3-己炔基等；Cw環烷基包括有3-7個碳的環形烴基，例如環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環庚基等。可藥用的加成鹽包4舌可藥用的酸加成鹽和可藥用的石咸加成鹽。前文所述的可藥用的酸加成鹽打算包括式(I)化合物能形成的有治療活性的無毒的酸加成鹽形式。具有堿性的式(I)化合物能通過用合適的酸處理該堿形式，轉化成其可藥用的酸加成鹽。合適的酸包括，例如，無機酸，如氫卣酸，例如鹽酸或氫溴酸；硫酸，硝酸，磷酸等；或有機酸，例如，乙酸，三氟乙酸，丙酸，羥基乙酸，乳酸，丙酮酸，草酸，丙二酸，琥珀酸(即，丁二酸)，馬來酸，富馬酸，蘋果酸，酒石酸，檸檬酸，曱磺酸，乙磺酸，苯磺酸，對曱苯磺酸，環己烷氨基磺酸，水楊酸，對氨基水楊酸，雙羥萘酸等。形式，轉化成其可藥用的堿加成鹽。合適的堿鹽形式包括，例如，銨鹽，堿金屬和堿土金屬鹽，如鋰、鈉、鉀、鎂鈣鹽等，與有機堿的鹽，例如N,N，-二千基乙二胺鹽、N-甲基-D-葡糖胺鹽、N,N，-二(脫氫松香基)乙二胺基，以及與氨基酸如精氨酸、賴氨酸等形成的鹽。術語"酸或堿加成鹽"還包括式(I)化合物能夠形成的水合物和溶劑加成形狀。這些形式的實例是水合物、醇化物等。在本文中使用的術語"式(I)化合物的立體化學異構形式"，定義為式(I)化合物可能具有的所有可能的化合物，它們由相同的原子經由相同的結合順序構成，但具有不可互換的不同的三維結構。除非另外說明或指出，化合物的化學名稱包括該化合物可能具有的所有可能的立體化學異構形式的混合物。該混合物可以包括所述化合物的基本分子結構的所有非對映體和/或對映體。式(I)化合物的所有立體化學異構形式，無論是純形式或是彼此混合的形式，都打算包括在本發明的范圍之內。式(I)化合物的N-氧化物形式意味著包括其中一個或幾個氮原子一皮氧化成所謂的N-氧化物，特別是其中一個或多個哌啶-、哌。秦-或峻。秦-氮,皮N-氧化的N-氧化物的那些式(I)化合物。式(I)化合物中有一些可能以其互變異構形式存在。這些形式盡管未在上式中明確標出，但也將包括在本發明的范圍之內。在后文中使用時，"式(I)化合物，，還包括可藥用的加成鹽和所有立體異構形式。在本文中使用時，術語"組蛋白脫乙酰酶，，和"HDAC"是指能夠從組蛋白N-末端處賴氨酸殘基的s-氨基中除去乙酰基的酶家族任何成員。除非在上下文中說明，"組蛋白"一詞是指任何物種的任何組蛋白，包括H1、H2A、H2B、H3、H4和H5。人的HDAC蛋白或基因產物包括，但不限于，HDAC-1、HDAC-2、HDAC畫3、HDAC-4、HDAC隱5、HDAC畫6、HDAC-7、HDAC-8、HDAC-9、HDAC-10和HDAC-ll。組蛋白脫乙酰酶也能夠從原生動物或真菌來源衍生形成。第一組令人關注的化合物包括其中W不是氳的式(I)化合物。第二組令人關注的化合物包括其中施加以下一個或多個限制的式(I)化合物a)X是N或CH;b)W是苯基，它可任選地被獨立選自卣素、Cw烷基、C^-6烷氧基、多卣代Cw烷基或芳基的一或二個取代基取代；c)R2是-CH2-RW或-C(=0)-R11;d)各R"獨立地選自氬，羥基，Cw烷氧基，d-6烷氧基Cw烷氧基，d—6烷基羰氧基，N-甲基哌嗪基，嗎啉基，或咪唑基；e)各R"獨立地選自d-6烷基氨基，d-6環烷基氨基，羥基C^6烷基氨基，二(C^-6烷基)氨基C^烷基氨基或嗎啉基；f)113是氫;g)R4是氫或C^烷基；h)R5是氨基；i)W是氫或噻吩基；和j)R7、R8、R9均為氫。第三組令人關注的化合物包括其中施加以下一個或多個限制的那些式(I)化合物a)X是N或CH;b)W是苯基;c)R2是-CH2-R^或-C(=0)-R11;d)各R^獨立地選自氳，羥基，d—6烷氧基，d—6烷氧基d—6烷氧基，C"烷基羰氧基，N-曱基哌嗪基，嗎啉基，或咪唑基；e)各RU獨立地選自d-6烷基氨基，d-6環烷基氨基，羥基d—6烷基氨基，二(d—6烷基)氨基d—6烷基氨基或嗎啉基；f)113是氬;g)114是氫或Ci-6烷基；h)R5是氨基；i)W是氬或噻吩基；和j)R7、R8和R9均為氬。優選的一組令人關注的化合物包括其中施加以下一個或多個限制的那些式(I)化合物a)X是N;b)W是苯基；c)R2是-CH2-R10,其中R"是羥基或Cw烷氧基；d)113是氫；e)R4是氫;f)R5是氨基；g)116是氬或噻吩基；和h)R7、118和119均為氫。另一組優選的令人關注的化合物由其中施加以下一個或多個限制的那些式(I)化合物組成a)X是N;b)W是被卣素取代基取代的苯基；c)!^是-CH2-R1、其中R^是羥基或d-6烷氧基；d)R3是氫;e)R4是氫;f)R5是氨基；g)W是氫或噻吩基；和h)R7、R8和R9均為氬。一種特別優選的式(I)化合物是No.3化合物，即下式化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>式(I)化合物，其可藥用的鹽和N-氧化物及其立體化學異構形式可以用常規方式制備。起始物和一些中間體是已知化合物，它們有市售商品或是可以按照本領域通常已知的或專利申請EP1485099、EP1485348、EP1485353、EP1485354、EP1485364、EP1485365、EP1485370和EP1485378中所述的反應步驟制備。下文將更詳細地說明一些制備方法。其它用來得到最終的式(I)化合物的方法在實施例中說明。式(I)化合物可以通過其中M代表氫或石威金屬(例如鈉或鋰)的式(II)中間體與式(III)化合物在堿(例如三乙胺)和六氟磷酸苯并三唑-l-基氧三吡咯烷基銹(PyBop)存在下反應制備。該反應在合適的溶劑，例如四氫呋喃或二氯甲烷或其混合物中進行。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>或者是，式(I)化合物可以制備如下通過在合適的溶劑如二氯曱烷中用磺酰氯(SOCl2)處理，將式(III)化合物轉化成酰氯，然后使形成的酰氯化合物與式(III)化合物在堿(例如吡啶)存在下于合適的溶劑如二氯曱烷或THF中反應。式(I)化合物也可以根據分子中其它基團的敏感度，通過本領域已知的反應或官能基轉化反應，彼此轉化，例如羧酸酯水解成相應的羧酸或醇；酰胺水解成相應的羧酸或胺；腈水解成相應的酰胺；苯基上的氨基可以利用已知的重氮化反應并隨后用氬置換該重氮基，被氳取代；醇可以轉化成酯和醚；伯胺可以轉化成仲胺或^又胺；雙4建可以氫化成相應的單鍵；苯基上的碘基可以通過在合適的鈀催化劑存在下的一氧化碳插入反應，轉化成酯基。式(II)中間體可以通過式(III)中間體與合適的酸溶液，例如鹽酸，或合適的堿金屬堿，例如氬氧化鈉，在合適的溶劑如乙醇中反應制備，一般是在回流下反應。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>中間體(III)可以制備如下a)其中R2是-CH20H、R4是氫的式(III)中間體(本文稱作式(III-a)中間體)，可以通過本領域已知的反應或官能基轉化反應，轉化成其中112不是-012011的式(III)中間體(本文中稱作式(Ill-b)中間體)。例如，式(Ill-a)的醇可以轉化成胺、酯和醚。該胺可以轉化成相應的酰胺，而伯胺可以轉化成仲胺或7k胺。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>b)式(III-a)中間體可以通過式(IV)中間體與1,4-二喁烷-2,5-二醇和合適的式(V)硼酸(其中W定義如上)在合適的溶劑，例如醇如乙醇中反應，一步制得。c)式(m-b)中間體可以通過式(iv)中間體與合適的式(vi)的酮在合適試劑(例如四乙氧基鈦或硼氬化鈉)存在下于合適的溶劑(如1,2-二氯乙烷)中的反應設備。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>(ni-b)d)其中R"是-COOH的式(III)中間體(本文中稱作式(m-c)化合物)，可以通過式(IV)中間體與2-氧丙酸及合適的式(V)硼酸(其中W定義如上)在合適的溶劑(如l,2-二氯甲烷)中反應，一步制得。e)其中rs是-cooh的式(m-c)中間體，可以通過本領域已知的反應或官能基轉化，轉化成其中W是-C(=0)-R11、Rn不是羥基的式(in)中間體(本文中稱作式(ni-d)化合物，例如轉化成胺和酰胺)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>(V)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>(III-C)(m-d)式(I)化合物和一些中間體的結構中可以有至少一個立體異構源中心。這一立體異構源中心可以以R或S構型存在。上述方法中制備的式(I)化合物一般是對映異構體的外消旋混合物，它們可以按照本領域已知的拆分步驟彼此分離。式(I)的外消旋化合物^對映異構的鹽形式隨后用選擇性結晶或分級結晶法分離，、對映:則利用堿從中釋放出來。分離式(I)化合物的對映異構形式的另一方法涉及使用手性固定相的液體色譜法。所述的純立體化學異構形式也可以由合適起始物的相應的純立體化學異構形式衍生得到，只要該反應是立體專一性地發生。如果要求的是特定的立體異構體，則該化合物優選用立體專一的制備方法合成。這些方法最好是使用對映異構純的起始物。式(I)化合物，其可藥用的酸加成鹽和立體異構形式，因其具有組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制作用而有重要的藥理性質。本發明提供了一種通過給予有效數量的本發明化合物，抑制細胞(包括轉化細胞)異常生長的方法。細胞的異常生長是指不受正常的調節機制制約的細胞生長(例如，失去接觸抑制)。這包括直接地，通過引起癌細胞的生長停頓、終末分化和/或凋亡，和間接地，通過抑制腫瘤的新血管形成，抑制腫瘤生長。本發明還提供了一種通過向需要治療的對象，例如哺乳動物(特別是人)，給予有效量的本發明化合物，抑制腫瘤生長的方法。特別是，本發明提供了一種通過給予有效量的本發明化合物抑制腫瘤生長的方法。可以抑制的腫瘤的實例包括，^旦是不限于，肺癌(例如腺癌，包括非小細胞肺癌)，胰腺癌(例如，胰腺癌，如，外分泌胰腺癌)，結腸癌(例如，結腸直腸癌，如，結腸l^癌和結腸月泉瘤)，前列&，癌(包括「晚期疾病)，淋巴傳系的造血腫瘤(例如，急性淋巴細胞的白血病，B細胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤)，骨髓白血病(例如，急性骨細胞源性的白血病(AML),曱狀腺濾泡癌，骨髓發育不良綜合癥(MDS),源自間充質的腫瘤(例如，纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤)，黑素瘤，畸胎瘤，成神經細胞瘤，膠質瘤，良性皮膚瘤(例如，角化棘皮瘤)，乳房癌(例如晚期乳房癌)，腎癌，卵巢癌，膀胱癌和表皮癌。本發明的化合物可以用于其它治療用途，例如a)在為治療癌癥而對肺瘤放療之前、之中或之后，通過施用本發明化合物，4吏腫瘤對;改療敏化；b)治療關節病和骨病理癥狀，例如類風濕性關節炎，骨關節炎，幼年性關節炎，痛風，多關節炎，牛皮痺關節炎，強直性脊柱炎和全身性紅斑狼瘡；c)抑制平滑肌細胞增生，包括血管增生病、動脈粥樣硬化和再狹窄；d)治療類癥和皮膚病，例如潰瘍性結腸炎、克羅恩病、變應性鼻炎、移植物抗宿主病、結膜炎、嗜喘、急性呼吸窘迫征、貝赫切特綜合癥、移植物排斥、蕁麻滲、變應性皮炎，局限性脫發、硬皮病、疹、濕滲、皮肌炎、痤瘡、糖尿病、全身性紅斑狼癡、川畸病、多發性硬化病、肺氣腫、嚢性纖維化病和慢性支氣管炎；e)治療子宮內膜異位癥、子宮肌瘤、功能不良性子宮出血和子宮內膜增生；f)治療眼血管形成，包括影響^L網膜和脈絡膜血管的血管病；g)治療心功能不良；h)抑制免疫抑制癥狀，例如治療HIV感染；i)治療腎功能不良；j)抑制內分泌失調；k)抑制糖異生功能不良；l)治療神經病，例如帕金森病，或造成認知障礙的神經病，例如阿爾茲海默病，或與多聚谷氨酰胺有關的神經元病；m)治療精神障礙，例如精神分裂癥、雙極性障礙、抑郁癥、焦慮癥和4青^申病；n)抑制神經月幾肉病，例如月幾萎縮側索^&更化；o)治療脊髓性肌萎縮；p)治療易受增強基因表達治療影響的其它病理癥狀；q)增強基因治療；r)抑制脂肪形成；s)治療寄生蟲病，例如瘧疾。因此，本發明公開了作為藥物使用的式(I)化合物及這些式(I)化合物在制造用于治療一種或多種上述病癥的藥物方面的應用。式(I)化合物，其可藥用的酸加成鹽和立體異構形式，能具有重要的診斷性能，即，它們能用來檢測或鑒定生物樣品中的HDAC,包括檢出或測定標記化合物和HDAC之間的絡合物的形成。這些4企測或鑒定方法可以4吏用用標記試劑如放射性同位素、酶、熒光物質、發光物質等標記的化合物。放射性同位素的實例包括1251、1311、SH和"C。酶通常利用合適底物的綴合制成可被檢測的，該底物本身又會催化可^f企測的反應。其實例包括，例如，p-半乳糖苷酶，P-葡糖苷酶，堿性磷酸酶，過氧化物酶和蘋果酸脫氫酶，優選辣根過氧化物酶。發光物質包括，例如，鄰苯二曱酰肼、鄰苯二曱酰肼衍生物、熒光素、水母蛋白和熒光酶。生物才羊品可以定義為體組織或體液。體液的實例是腦脊液、血液、血漿、血清、尿、痰、唾液等。由于其有用的藥理性質，本發明化合物可以配制成各式各樣的藥物形式以便給藥。為制備本發明的藥物組合物，將作為活性組分的有效數量特定化合物，以堿或酸加成鹽的形式，與一種可藥用的載體混合成緊密混合物，該載體可以采用各式各樣的形式，這取決于希望施用的制劑的形式。這些藥物組合物最好是適合優選以口服、直腸、透皮或腸道外注射等方式給藥的單元劑型。例如，在制備口服劑型時，可以使用任何常用的藥物介質，例如，在口服液體制劑例如混懸劑、糖漿劑、酏劑和溶液劑的情形，使用水、二醇、油、醇等；或者，在散劑、丸劑、膠嚢劑和片劑的情形，使用固體載體如淀粉、糖、高嶺土、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等。因為容易給藥，片劑和膠嚢劑是最方便的口服劑型，此時顯然使用固體藥物載體。對于非腸道組合物，載體中通常含有無菌水，至少是大部分，^f旦是也可以包含幫助溶解的其它組分。例如，可以配制可注射的溶液，其中的載體包括鹽溶液、葡萄糖溶液或鹽與葡萄糖溶液混合物。還可以配制可注射的混懸劑，此時可使用合適的液體載體、懸浮劑等。在適合透皮給藥的組合物中，載體可任選地含有滲透增強劑和/或合適的潤濕劑，可4壬選地與合適的4壬何本質的少量添加劑組合，該添加劑應不會對皮膚造成明顯的不利作用。所述添加劑可促進對皮膚的給藥和/或有助于制備所要的組合物。這些組合物可以以各種方式《會藥，例如，以透皮貼劑、點施劑或油膏劑的形式。將上述藥物組合物配制成劑量單元形式特別有利，因其容易給藥和劑量均一。在說明書和權利要求中所說的劑量單元形式是指適合作為單位劑量的物理上分離的單元，每個單元中包含根據計算會產生預期治療效果的預定數量的活性組分，和與其結合的所需要的藥物載體。這些劑量單元形式的實例是片劑(包括刻痕或包衣的片劑)、膠嚢劑、丸劑、包裝散劑、糯米紙嚢劑、可注射的溶液劑或混懸劑、茶匙劑、湯匙劑等，及它們的分離的多劑量形式。本領域技術人員容易根據后文提供的實驗結果確定有效數量。通常考慮治療有效量為每Kg體重0.005-100mg,特別是0.005-10mg。將所需劑量在全天內以適當的間隔分成2、3、4或更多亞劑量給藥可能是恰當的。所述的亞劑量可以配制成單元劑型，例如每個單元劑型含0.5-500mg,特別是10-500mg活性組分。作為本發明的另一方面，設想了HDAC抑制劑與另一種抗癌藥聯:合，尤其是作為藥物使用，特別是用于治療癌癥或相關疾病。為治療以上病癥，本發明化合物可以有利地與一種或多種其它藥物，更具體地說，與其它抗癌藥物，聯合使用。抗癌藥物的實例是-鉑配位化合物，例如，順柏，卡柏或奧沙利鉑;-紫杉烷化合物，例如紫杉醇或多西他賽；-拓樸異構酶I抑制劑，例如喜樹堿化合物，如伊立替康或托泊替康；-拓樸異構酶n抑制劑，例如抗腫瘤鬼臼毒素衍生物，如伊托泊苷或替尼泊苷；-抗肺瘤長春花生物石咸，例如長春石咸、長春新石咸或長春瑞濱；-抗胂瘤核苦衍生物，例如5-氟尿嘧咬、吉西他濱或卡培他濱；-烷基化試劑，例如氮芥或亞硝基脲，例如環磷酰胺、苯丁酸氮芥、卡莫司汀或洛莫司汀；-抗腫瘤蒽環霉素衍生物，例如柔紅霉素、多柔比星、伊達比星或米托蒽醌；-HER2抗體，例如曲妥珠單抗；-雌激素受體拮抗劑或選擇性雌激素受體調節劑，例如，他莫昔芬、托瑞米芬、屈洛昔芬、氟維司群或雷洛昔芬；-芳香酶抑制劑，例如，依西美坦、阿那曲唑、來曲唑和伏氯唑；-分化劑，例如維曱類、維生素D和維曱酸代謝阻滯劑(RAMBA),例如異維A酸；-DNA甲基轉移酶抑制劑，例如5-氮雜胞苷；-激酶抑制劑，例如黃酮吡多、甲磺酸伊馬替尼或吉非替尼；-法尼基轉移酶抑制劑；-其它HDAC抑制劑；-泛素蛋白酶通道抑制劑，例如萬珂(硼替佐米注射粉劑)；或—Yondelis(貝曲替定)。這里使用的術語"柏配位化合物"代表以離子形式提供鉑的任何抑制腫瘤細胞生長的賴配位化合物。術語"紫杉烷化合物"代表與某些紫杉(紅豆杉屬)樹物種的提取物有關或由其衍生的，具有紫杉烷環系的一類化合物。術語"拓樸異構酶抑制劑，，被用來表示能改變真核細胞中DNA拓樸結構的酶。它們對于重要的細胞功能和細胞增生起關鍵作用。在真核細胞中有兩類拓樸異構酶，即，I型和II型。I型拓樸異構酶是分子量約為100,000的一種單體酶。該酶與DNA結合并誘發瞬間單鏈斷裂，將雙螺旋解旋(或使其得以解旋)，并隨后重接上鏈裂口，然后從DNA鏈上解離。II型拓樸異構酶具有類似的作用機制，包括誘發DNA鏈斷裂或自由基形成。術語"喜樹堿化合物"用來表示與母體喜樹堿化合物有關或由其衍生的化合物，該母體化合物是從中國的喜樹和印度的臭味假柴龍樹衍生出的一種水不溶性生物堿。術語"鬼臼毒素化合物"用來代表與從曼德拉草提取的母體化合物鬼臼毒素有關的或由其衍生的化合物。術語"抗肺瘤長春花生物石咸"用來表示與長春花才直物(Vincarosea)的提取物有關或由其衍生的化合物。術語"烷基化試劑"包括很大一類化合物，它們的共同特點是，能夠在生理條件下向生物學上活的大分子如DNA提供烷基基團。對于大多數更重要的試劑，例如氮芥和亞硝基脲，活性的烷基化部分是在絡合降解反應(其中一些是酶促反應)之后于體內產生的。烷基化試劑的最重要的藥理作用是干擾與特定的DNA合成及細胞分裂中細胞增生有關的基本機構。烷基化試劑干擾快速增生的組織內的DNA功能和完整性的能力提供了它們的治療用途和很多毒性的基礎。術語"抗胂瘤蒽環霉素衍生物，，包括從真菌波賽鏈霉菌(Str印.Peuticusvar.caesius)得到的抗體及其衍生物，其特4正是具有一個四環素環結構，該結構上帶有一個通過糖苷鍵連接的不常見的糖-柔紅糖胺。人表皮生長因子受體2蛋白(HER2)在原發性乳腺癌中的擴增已經顯示與某些患者的臨床預后差有關。曲妥珠單抗是一種高度純化的、DNA衍生的人源化單克隆IgGlk抗體，它以高親和力和特異性與HER2受體的胞外域結合。很多乳腺癌具有雌激素受體，而且這些肺瘤的生長會受雌激素的激發。術語"雌激素受體拮抗劑"和"選擇性雌激素受體調節劑"用來代表與雌激素受體(ER)結合的雌二醇的竟爭性抑制劑。選擇性雌激素受體調節劑在與ER結合時，誘發該受體的三維形狀改變，調節它與DNA上雌激素效應元件(ERE)的結合。在絕經后婦女中，循環雌激素的主要來源是腎上腺和卵巢雄激素(雄烯二酮和睪酮)通過外周組織中的芳化酶轉化為雌激素(雌酮和雌二醇)。通過芳化酶抑制或滅活去除雌激素，對于某些患有激素依賴性乳腺癌的絕經后婦女是一種有效的和選擇性的治療方法。本文所用的術語"抗雌激素藥物"不僅包括雌激素受體拮抗劑和選擇性雌激素受體調節劑，而且還包括上述的芳化酶抑制劑。術語"分化劑"包括能以各種方式抑制細胞增生和誘發分化的化合物。維生素D和維A酸衍生物已知在調節許多種正常和惡性細胞的生長和分化中起主要使用。維甲酸代謝阻斷劑(RAMBA)通過抑制細胞色素P^介導的維A酸的分解代謝，提高了內源性維A酸的濃度。DNA曱基化變化屬于最常見的人類成瘤異常。選定基因的啟動子中的過度曱基化通常與相關基因的失活有效。術語"DNA甲基轉移酶抑制劑，，被用來表示通過DNA曱基轉移酶的藥理抑制和腫瘤抑制基因表達的再激活起作用的化合物。術語"激酶抑制劑"包括參與細胞周期進程和編程性細胞死亡(凋亡)的激酶的有效抑制劑。術語"法尼基轉移酶抑制劑"用來表示被設計成阻止Ras和其它胞內蛋白法尼基化的化合物。它們已顯示出對惡性細胞增生和存活有作用。術語"其它的HDAC抑制劑"包括但不限于-羧酸酯，例如丁酸酯，肉桂酸，4-苯基丁酸酯或丙戊酸；-異幾肝酸如辛二酰苯胺異羥肝酸(SAHA),含SAHA類似物的哌。秦，聯芳基異羥肟酸A-161906及其。卡唑基醚、四氬吡啶和四氪萘酮類似物，雙環芳基-N-羥基甲酰胺，吡咯沙敏，CG-1521,pXD-101,磺酰胺異羥將酸，LAQ-824,LBH-589,曲古抑霉素A(TSA)，oxamflatin,scriptaid,與scriptaid有關的三環分子，間羧基肉桂酸雙異羥肟酸(CBHA),CBHA樣異羥肟酸，trapoxin-異羥肟酸類似物，CRA-024781,R306465和相關的苯曱酰-及雜芳基-異鞋肟酸，氨基辛二酸酯和丙二酰二酰胺；一環開j四月大，例如trapoxin、apidicin、縮肽、與Spiruchostatin有關的化合物，RedFK-228,含巰基的環四肽(SCOPs),含異羥肟酸的環四肽(CHAPs),TAN-174s和AZumamides;-苯甲酰胺，例如MS-275或CI-994;-或depudecin。術語"泛素-蛋白酶體通道抑制劑"用來表示抑制蛋白酶體中細胞蛋白(包括細胞周期調節蛋白)的定向解體的化合物。為治療癌癥，可以與輻射一起，如上所述地向患者施用本發明化合物。輻射意味著電離輻射，特別是Y射線輻射，尤其直線加速器或現今常用的放射性核素發射的輻射。用放射性核素輻射腫瘤可以是外置或內置輻射。本發明還涉及抗癌藥物和本發明HDAC抑制劑的一種才艮據本發明的聯合藥物。本發明還涉及一種用于藥物治療，例如用于抑制腫瘤細胞生長的根據本發明的聯合藥物。本發明還涉及用于抑制腫瘤細胞生長的一種根據本發明的聯合藥物。本發明還涉及在人類患者中抑制腫瘤細胞生長的方法，包括對患者施用有效數量根據本發明的聯合藥物。本發明進一步提供了一種通過施用有效數量根據本發明的聯合藥物抑制細胞(包括轉化細胞)異常生長的方法。其它藥物和HDAC抑制劑可以同時(例如在分離的或單一的組合物中)或以任何次序先后給藥。在后一情形，兩種化合物應在一段時間內以一定的數量和方式給藥，使其足以保證實現有利的或增效的作用。應該理解，對于聯合藥物的每個組分，最優的給藥方法和次序，以及各自的用藥量和用藥方案，將取決于所施用的具體的其它藥物和HDAC抑制劑，它們的給藥途徑，要治療的特定腫瘤和受治療的具體宿主。最佳方法和給藥次序，以及用藥量和方法，容易由本領域4支術人員利用常^見方法并考慮到這里所述的信息來確定。鉑配位化合物最好是以每平方米身體表面積1-500mg(mg/m"的劑量給藥，例如50-400mg/m2。具體地，對于順鉑，每個療程劑量為約75mg/m2,對于卡賴為約300mg/m2。紫杉烷化合物最好是以每平方米身體表面積50-400mg(mg/m"的劑量給藥，例如75-250mg/m2。具體地，對于紫杉醇，每個療程劑量為約175-250mg/m2，對于多西他賽為約75-150mg/m2。喜樹堿化合物最好是以每平方米身體表面積0.1-400mg(mg/m"的劑量給藥，例如1-300mg/m2。具體地，對于伊立替康，每個療程的劑量為約100-350mg/m2,對于托泊替康為約1-2mg/m2。抗胂瘤的鬼臼毒素書f生物最好以每平方米身體表面30-300mg(mg/m2)的劑量給藥，例如50-250mg/m2。具體地，對于4尹托泊苷，每個療程的劑量為約35-100mg/m2,對于替尼泊苷為約50-250mg/m2。抗腫瘤長春花生物堿最好以每平方米身體表面2-30mg(mg/m"的劑量給藥。具體地，對于長春堿，每個療程的劑量為約3-12mg/m2，對于長春新堿，為約l-2mg/m2,對于長春瑞濱為約10-30mg/m2。抗腫瘤核苷衍生物最好以每平方米身體表面200-2500mg(mg/m"的劑量給藥，例如700-1500mg/m2。具體地，對于5-FU，每個療程的劑量為.200-500mg/m2,對于吉西^f也濱為約800-1200mg/m2，對于卡培〗也濱為約1000-2500mg/m2。烷基化試劑如氮芥或亞硝基脲最好以每平方米身體表面100-500mg(mg/m2)的劑量給藥，例如120-200mg/m2。具體地，對于環磷酰胺，每個療程的劑量為約100-500mg/m2,對于苯丁酸氮芥為約0.1-0.2mg/kg,對于卡莫司汀為約150-200mg/m2,對于洛莫司汀為約100-150mg/m2。抗腫瘤蒽環霉素衍生物最好以每平方米身體表面10-75mg(mg/m2)的劑量給藥，例如15-60mg/m2。具體地，對于多柔比星，每個療程的劑量為約40-75mg/m2,對于柔紅霉素為約25-45mg/m2,對于伊達比星為約10-15mg/m2。曲妥珠單抗最好以每平方米身體表面1-5mg(mg/m"的劑量給藥，特別是每個療程2-4mg/m2。抗雌激素藥最好以每天約1-100mg的劑量給藥，這取決于具體的藥物和要治療的病癥。他莫昔芬適宜以5-50mg的劑量、優選10-20mg,每天2次給藥，繼續該治療足夠的時間以達到和維持治療效果。托瑞米芬適宜以約60mg的劑量每天一次口服給藥，繼續治療足夠的時間以達到和維持治療效果。阿那曲唑適宜以約1mg的劑量每天一次口服給藥。屈洛昔芬適宜以約20-100mg的劑量每天一次口服給藥。雷洛昔芬適宜以約60mg的劑量每天一次口服給藥。伊西美坦適宜以約25mg的劑量每天一次口服給藥。這些劑量可以每個療程力良用例如一次、二次或多次，可以每7、14、21或28天重復一次。由于它們的有用的藥理性質，根據本發明的聯合藥物的各組分，即，其它的藥物和HDAC抑制劑，可以配制成用于給藥的各種藥物形式。各組分可以分別配制在各個藥物組合物中，或是配制在含兩個組分的單一藥物組合物中。因此，本發明還涉及一種藥物組合物，其中含有所述的其它藥物和HDAC抑制劑，以及一種或多種藥物載體。本發明還涉及藥物組合物形式的本發明聯合藥物，其中含有一種抗癌藥和本發明的HDAC抑制劑，以及一種或多種藥物載體。本發明進一步涉及本發明的聯合藥物在制造用于抑制腫瘤細胞生長的藥物組合物中的應用。本發明進一步還涉及一種產品，其中包含作為第一活性成分的根據本發明的一種HDAC抑制劑，和作為第二活性成分的一種抗癌藥物，該產品以聯合制劑的形式用來在癌癥患者的治療中同時、分別或順序使用。實驗部分下文中術語"EtOAc"指乙酸乙酯，"MgS(V，指硫酸鎂，"K2CCV，指碳酸鉀，"Et3N"指三乙胺，"CH2Cl2"指二氯曱烷，"PyBOP"指六氟磷酸苯并三唑-l-基氧三吡咯烷基磷鎩，"THF，指四氬呋喃，"DIPE，，指二異丙基醚，"NH40H，，指氫氧化銨，"iPrOH"指2-丙醇。A.中間體的制備實施例Ala)中間體l的制備向[2-(4-氟苯基)乙烯基]硼酸(0.0093mol)在乙醇UOOml)中的溶液加入1,4-二^惡烷-2,5-二醇(0.0093mol)。再加入6-(l-哌嗪基)-3-吡啶羧酸乙酯(0.0085mol)。將該混合物在室溫下攪4半15分鐘后過濾。蒸發濾液，殘余物置于EtOAc中。有機層用飽和氯化鈉溶液洗，干燥(MgS〇4)，過濾后蒸發溶劑。將得到的級分(3.3g)溶在乙醚中，于5。C下逐滴加入HC1(5-6N,2ml)。濾出沉淀，用乙醚洗后干燥。將此級分(3g)置于水中，加入K2C03。該混合物用CH2Cl2萃取，分離出有機層，干燥(MgS04),過濾并蒸發溶劑，得到2.7g(79。/。)中間體1(E構型)。b)中間體2的制備在5。C下向中間體1(0.0042mol)在THF(20ml)中的溶液逐滴加入60%氫化鈉溶液(0.0068mol)。將混合物在5。C攪拌30分鐘。逐滴加入碘曱烷(0.0063mol)。將混合物在5。C攪拌30分鐘，然后在室溫下攪拌7小時，倒在水上，用EtOAc萃取。有機層用飽和氯化鈉溶'液洗，干燥(MgSOj,過濾并蒸發溶劑。將該級分(1.2g)在硅膠上用柱色"i普法純化(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH/NH4OH99/1/0.4至94/6/0.6;5pm)。收集純級分，蒸發溶劑，得到0.86g(50o/())油狀的中間體2(E構型)。c)中間體3的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>將中間體2(0.002mol)和氬氧化鋰(0.0041mol)在THF(40ml)和水(20ml)中的混合物在室溫下攪拌48小時。蒸發THF。將混合物用EtOAc萃取。水層用3NHC1中和，用CH2Cl2萃取3次。分離出有斗幾層，干燥(MgS04),過濾并蒸發溶劑，得到0.74g(96。/。)中間體3(E構型)。實施例A2a)中間體4的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>將2-(l-哌。秦基)-5-嘧啶羧酸乙酯(0.0055mol)、[2-(3-氟苯基)乙晞基〗硼酸(0.006mol)和1，4-二"惡烷-2,5-二醇(0.72g)在乙醇(70ml)中的混合物于室溫下攪拌15小時，然后蒸發至干。殘余物置于水中，用CH2Cl2萃取。分離出有機層，干燥(MgS04),過濾，蒸發溶劑。將該級分(2.6g)在硅膠上用柱色譜法純化(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH/NH4OH97/3/0.1;15-40|Lim)。收集純級分，蒸發溶劑，得到1.4g(64。/。)油狀中間體4(E構型)。b)中間體5的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>將中間體4(0.0012mol)和氫氧化鋰(0.0025mol)在THF(25ml)和FbO(12ml)中的混合物于室溫下攪拌15小時，然后冷卻至室溫并蒸發，加入3NHCl至pH為4-5。蒸發THF,用水洗，然后用乙醚洗，干燥，得到0.44g(95%)中間體5的鹽酸(HC1)鹽(E構型)。實施例A3a)中間體6的制備向[(lE)-2陽苯基乙烯基]硼酸(0.0021mol)中加入1,4隱二嚅烷國2,5畫二醇(0.0021mol)在乙醇(300ml)中的溶液，然后加入2-(l-哌。秦基)-5-嘧啶羧酸乙酯(0.0021mol)。將混合物在室溫下攪拌24小時。濾出沉淀，將濾液蒸發。此級分(9.6g)在硅膠上用柱色譜法純化(洗脫劑.'CH2Cl2/CH3OH/NH4OH,97/3/0.1;15-40,)。收集純級分，蒸發溶劑，得到3.2g(39。/。)中間體6(E構型)。b)中間體7的制備將中間體6(0.007mol)和氳氧化4里(水溶液，0.0141mol)在THF(80ml)和水(40ml)中的混合物于室溫下攪拌3天。加入1N鹽酸，蒸發THF。濾出沉淀，用最少量的水洗，然后用乙醚洗并且干燥，得到2.3g中間體7(E構型)。實施例A4a)中間體8的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>向[2-(4-氟苯基)乙烯基]硼酸(0.0186mol)在乙醇(400ml)中的溶液加入1,4-二哺烷-2,5-二醇(0.0186mol)。加入2-(l-哌。秦基)-5-嘧口定象酸乙酯(0.0169mol)。將該混合物在室溫下攪拌15小時后過濾，將濾液蒸發，殘余物置于EtOAc中。有機層用水和飽和NaCl溶液洗，干燥(MgS04),過濾和蒸發溶劑。該級分(6.8g)在硅膠上用柱色"i普法純化(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH/NH4OH,98/2/0.1;15-40jum)。收集純級分，蒸發溶劑。將該級分(4.6g)溶于乙醚(200ml),加入5-6NHC1/異丙醇(3ml)。濾出沉淀物，用乙醚洗，干燥。將此級分(4.1g)置于水中，力。K2C03。用CH2C12萃取此混合物。分離出有斗幾層，干;t喿(MgSOj,過濾，蒸發溶劑，得到4.1g油狀中間體8(E構型)。b)中間體9的制備O在5。C和N2氣流下，向中間體8(0.0005mol)在THF(35ml)中的溶液逐滴加入60%氪化鈉溶液(0.008mol)。將混合物在5。C攪拌30分鐘。逐滴加入碘甲烷(0.0074mol)。在5。C攪拌混合物30分鐘，然后在室溫下攪拌15小時，倒在冰上，用EtOAc萃取2次。有機層用飽和NaCl溶液洗，用MgS04干燥，過濾后蒸發溶劑至干。此級分(1.45g)在硅膠上用柱色譜法純化(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH/NH4OH，99/1/0.1至96/4/0.4;5pm)。收集純級分，將溶劑蒸發，得到lg(48%)中間體9(E構型)。c)中間體10的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>將中間體9(0.0023mol)和氬氧化鋰(0.0047mol)在THF(50mL)和水(25ml)中的混合物在室溫下攪拌15小時，蒸發THF。將該混合物用3NHC1酸化，用CH2Cl2萃取。分離出有機層，用MgS04干燥，過濾后蒸發溶劑，得到0.9g(90。/0)中間體10的鹽酸鹽(E構型)。d)中間體11的制備向中間體IO(0.0007mol)在l,2-二氯乙烷(12ml)中的溶液逐滴加入亞硫酰二氯(0.0083mol)。在50。C攪拌該混合物15小時，然后蒸發至干，得到鹽酸鹽形式的0.16g中間體11(E構型)。實施例A5a)中間體12的制備向氨基曱酸[2-氨基-4-(2-噻吩基)苯基]-l,l-二甲基乙基酯(0.0006mol)在吡啶(7ml)中的溶液逐滴加入中間體11(0.0003mol)在CH2C12(3ml)中的溶液。將混合物在室溫下攪拌15小時，然后蒸發至干。殘余物置于CH2Cl2中。有才幾層用水洗幾次，干燥(MgS04),過濾并蒸發溶劑。該級分(0.35g)在硅膠上用柱色語法純化(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH/NH4OH,99/1/0至97/3/0.1;15-40pm)。收集純級分，蒸發溶劑，得到0.2g(80。/。)中間體12(構型E)。B.化合物的制備實施例Bl化合物1的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>向中間體3(0.0011mol)、1,2-苯二胺-鹽酸鹽(0.0026mol)和Et3N(0.005mol)在THF/CH2C12(50/50)(45ml)中的混合物加入PyBOP(0.0016mol)。將該混合物在室溫下攪拌5小時，倒入水中，用CH2C12萃取。分離出有機層，干燥(MgS04),過濾，蒸發溶劑。殘余物在石圭膠上用柱色譜法純化(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH/NH4OH,96/4/0.2;15-40|um)。收集純級分，蒸發溶劑。該級分(0.41g)自DIPE/乙醚中結晶。濾出沉淀并干燥，得以0.28g(32%)化合物I(E構型，熔點214。C)。實施例B2化合物2的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>向中間體5(0.0006mol)和1,2-苯二胺-鹽酸鹽(0.0015mol)在THF/CH2C12(25ml)中的溶液依次加入PyBOP(0.0009mol)和Et3N(0.0028mol)。室溫下攪拌該混合物5小時，然后倒入水中，用CH2C12萃取。分離有機層，用MgS04干燥，過濾并蒸發溶劑。該級分(0.75g)在石圭膠上用柱色i普法純化(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH/NH4OH,98/2/0.2至92/8/0.8;5|um)。收集純級分，蒸發溶劑。該級分(0.18g)自DIPE中結晶。濾出沉淀并且干燥，得到0.14g(45%)化合物2(E構型，熔點230°C)。實施例B3化合物3的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>向中間體7(0.0011mol)在THF/CH2C12(50/50)(40ml)中的溶液依次加入PyBOP(0.0015mol)和Et3N(0.0048mol)。將混合物在室溫下攪拌4小時，然后倒入水中，用CH2C12萃取。有機層用飽和NaHC03洗，干燥(MgSOj,過濾后蒸發溶劑。將該級分(0.59g)在硅膠上用柱色譜法純化(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH/NH4OH,99/1/0.05至95/5/0.25;5|um)。收集純級分，蒸發溶劑。將該級分(0.36g)自乙醚中結晶。濾出沉淀并將其干燥，得到0.32g(51o/。)化合物3(E構型，熔點150°C)。實施例B4化合物4的制備在5。C下向1,2-苯二胺-鹽酸鹽(0.0012mol)在吡啶(7ml)中的溶液逐滴加入中間體ll(0.0003mol)在CH2Cl2(3ml)中的溶液。室溫下攪拌該混合物15小時，然后蒸發至干。殘余物置于CH2Cl2中。有機會用水洗幾次，干燥(MgS04),過濾，蒸發溶液。該級分(0.2g)在石圭膠上用柱色譜法純4匕(洗脫劑CH2C12/CH30H,97/3;10)um)。收集純級分，蒸發溶劑。將該級分(0.09g)自DIPE中結晶。濾出沉淀，將其干燥，得到0.05g化合物4(E構型)。實施例B5化合物5的制備在5。C下向中間體12(0.0003mol)在CH2C12(5ml)中的溶液逐滴加入三氟乙酸(0.7ml)。室溫下攪拌該混合物4小時。加入冰和水，加固體NaHC03。將混合物用CH2C12萃取2次。分離有才幾層，干燥(MgS04),過濾并蒸發溶劑。該級分(0.2g)在硅膠上用柱色譜法純化(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH/NH4OH，97/3/0.1;10|am)。收集純級分，蒸發溶劑。將該級分(0.13g)置于乙醚中，濾出沉淀并將其干燥，得到O.lg(59%)化合物5(E構型，熔點19rC)。表F-1列出了按照以上實施例之一制備的化合物。表F-l<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>c.藥理實施例抑制組蛋白脫乙酰酶的體外試驗(見實施例C.l)測量了用式(I)化合物得到的對HDAC酶活性的抑制作用。式(I)化合物的細胞活性利用對細胞毒性或存活的比色測定法(MosmamiTim,JournalofImmunologicalMethods65:55-63,1983)對A2780腫瘤細胞進行測定(見實施例C.2)。化合物的溶解度量度了化合物停留在溶液中的能力。在第一種方法中，測量了化合物在稀釋時停留在水溶液中的能力(見實施例C.3a)。將DMSO儲備液用單一的水基緩沖溶劑按不同的連貫步驟稀釋。在此方法(C.3.a)中，隨后將混合物在BDGentest溶解度掃描4義中掃描以確定沉淀的發生。在第二種方法中，化合物在不同pH下的溶解度可以使用化學發光氮檢測儀測定(見實施例C.3.b)。-藥物的滲透性表示藥物從一種介質移入或穿過另一介質的能力。特別是它穿過腸膜進入血流和/或從血流進入目標的能力。滲透性(見實施例C.4)可以通過濾膜固定的人工膜磷脂雙層的形成測定。在濾膜固定的人工膜試馬全中，用一只96孔微量滴定板和一只96孔濾4反形成一個"夾層"結構，使得每個復合孔都被分成兩個室，供體溶液位于底部，受體溶液在頂部，二者一皮一個涂敷著二油酰》壽脂酰膽堿的2%(w/v)十二烷溶液的125nm微濾盤(0.45|um孔)分開，其條件使得該系統在與緩沖劑水溶液接觸時，在過濾通道內部形成多層的脂雙層。化合物穿過這一人工膜的滲透性用cm/S量度。目的是查看藥物在2個不同的pH(4.0和7.4)下通過平行的人工膜的滲透情況。化合物的檢測用UV光度計在250-500nm的最佳波長下進4亍。藥物的代謝是指脂溶性的生物異源或生物內源化合物被酶促轉化成極性、水溶性和可排泄的代謝物。藥物代謝的主要器官是肝。代謝產物的活性常常低于母體藥物或者無活性。但是，一些代謝物可以活性或毒性作用增強。因此藥物代謝可以包括"解毒"和"中毒"兩類過程。決定器官應付藥物和化學品的能力的主要酶體系之一由細胞色素P450單加氧酶代表，它們是NADPH依賴性酶。化合物的代謝穩定性可以使用亞細胞人組織在體外測定(見實施例C.5)。本文中化合物的代i謝穩定性用其與微粒體溫育15分鐘后代謝的藥物％表示。化合物的定量用LS-MS分析來測定。已經證明，4艮多種抗腫瘤藥物會激活p21蛋白，包括DNA損傷劑和組蛋白脫酰基酶抑制劑。DNA損傷劑通過肺瘤抑制基因p53激活p21,而組蛋白脫乙酰酶抑制劑通過轉錄因子Spl轉錄激活p21基因。因此，DNA損傷劑通過p53效應元件激活p21啟動子，而組蛋白脫乙酰酶抑制劑通過Spl位點(位于相對于TATA框的-60bp至+40bp區域)激活p21啟動子，二者均導致p21蛋白的表達增加。當細胞內的p21啟動子由不包含p53效應元件的p211300bp的啟動子片,殳組成時，它因此對DNA損傷劑沒有響應。化合物誘發p21的能力可以通過試驗化合物由于在細胞水平上對HDAC的抑制作用而誘發p21的能力來評價。細l包可以用含有一個不含p53效應元件的p211300bp啟動子片段的表達載體穩定地轉染，其中報道基因表達相對于對照水平的增高，表明該化合物具有誘發p21的能力。該報道基因是一種熒光蛋白，報道基因的表達則以發射的熒光的數量來量度(見實施例C6)。特異性HDAC抑制劑不應該抑制其它酶，例如高豐度CYPP450蛋白。CYPP450(大腸肝菌表達的)蛋白3A4,2D6en2C9將其特異底物轉化成熒光分子。CYP3A4蛋白將7-卡氧基三氟甲基香豆素(BFC)轉化成7-羥基三氟甲基香豆素。CYP2D6蛋白將3-[2-(N,N-二乙基-N-甲基氨基)乙基]-7-曱氧基-4-曱基香豆素(AMMC)轉化成3-[2-(N,N-二乙基氨基)乙基]-7-羥基-4-甲基香豆素鹽酸鹽，CYP2C9蛋白將7-曱氧基-4-三氟曱基香豆素(MFC)轉化成7-羥基三氟曱基香豆素。抑制該酶促反應的化合物將會使熒光信號減弱(見實施例C.7)。實施例C.l:用熒光標記的底物體外測定對組蛋白脫乙酰酶的抑制作用<吏用Biomol乂/^司的HDACFluorescentActivityAssay/DrugDiscovery試劑盒(產品編號AK-500-0001)。HDAC熒光活性測定是以FluordeLys(發生熒光的組蛋白脫乙酰酶賴氨酰)底物和顯影劑組合為基礎。FluordeLys底物含有一個乙酰化的賴氨酸側《連。該底物的脫乙酰化敏化了底物，于是在第二步中用FluordeLys顯影劑處理，產生一個熒光團。HeLa核提取物(供應商Biomol)以60|ug/ml與75iuM底物一起溫育。FluordeLys底物是加在含有25mMTris、137mMNaCl、2.7mMKC1和1mMMgCl2.6H20的pH7.4緩沖液中。30分鐘后，加入1體積的顯色劑。用355nm的光激發該熒光團，在熒光板讀取器上檢測發射的光(450nm)。對每次實驗，均平行地試驗對照樣(含HeLa核提取物和緩沖劑)、空白溫育樣(含緩沖劑但不含HeLa核提取物)及樣品(含有溶在DMSO中并進一步在緩沖劑和HeLa核提取物中稀釋的化合物)。在第一種情形，化合物在10—5M濃度下進行試驗。當化合物在10—SM下顯示活性時，作出濃度-響應曲線，其中化合物在10^M和10^M之間的濃度下進行試驗。所有樣品均試驗4次。每次試驗均從對照樣和樣品的測定值中減去空白值。對照樣代表100%底物脫酰基化。對于每個樣品，熒光均表示成對照樣平均值的百分數。適當時利用對分級數據的正態等效偏差分析計算出IC5。值(為將代謝物數量降至對照樣的50%所需的藥物濃度)。本文將試驗化合物的作用表示成pIC5o(IC5。值的負對數值)(見表F-2)。實施例C.2:對A2780細胞的抗增生活性的測定試驗的所有化合物均溶在DMSO中并在培養基中進一步稀釋。在細胞增生試^r中，最終的DMSO濃度從不超過0.1%(v/v)。對照樣中含A2780細胞和DMSO,但不含化合物。空白樣中含DMSO但不含細胞。將MTT按5mg/ml溶于PBS中。配制含0.1M甘氨酸和0.1MNaCl并用NaOH(1N)緩沖至pH10.5的甘氨酸緩沖液(所有試劑均得自Merck)。人A2780卯巢癌細胞(T.C.Hamilton博士[FoxChaseCancerCentre,Pennsylvania,USA]贈送)在補充了2mML-谷氨酸、50iug/ml慶大霉素和10%胎牛血清的PRMI1640培養基中培養。在加濕的5。/oC02氣氛下將細胞在37T:下常身見地保持成單層培養物。利用胰蛋白酶/EDTA溶液以l:40的分傳比將細胞每周傳代一次。所有的培養基和補充物均得自LifeTech加logy。使用Gen-ProbeMycoplasmaTissueCulture試劑盒(供應商BioMerieux)確定細胞中不含支原體污染物。將細胞接種在NUNC96孔培養板(供應商LifeTechnologies)上，令其粘附在塑料上過夜。接種所用的密度為每孔在總體積200)ul的培養基中1500個細胞。在細胞粘附于板上之后，更換培養基并加入藥物和/或溶劑至終體積200|ul。溫育4天后，用200|ul新鮮的培養基替換原培養基，利用基于MTT的試驗測定細胞密度和生存力。向每個孔中加入25JulMTT溶液并將細胞在37。C下再培養2小時。然后小心地吸出培養基，藍色的MTT-甲臘產物通過依次加入25)nl甘氨酸緩沖液和100filDMSO來溶解。在微板搖蕩器上搖蕩微板10分鐘，使用一臺Emax96孔分光光度計(供應商Sopachem)測定在540nm處的吸光度。實驗中每個實驗條件的結果均是3個重復的孔的平均值。為進行初始篩選，將化合物在單一的固定濃度10^M進行試驗。對于活性化合物，重復進行試驗以確立完整的濃度-響應曲線。每次試驗均平行地進行對照樣(不含藥物)和空白樣(不含細胞或藥物)溫育試驗。從所有的對照和樣品值中減去空白值。對于每個樣品，將細胞生長的平均值(吸光度單位)表示成相對于對照樣細胞生長平均值的百分數。適當時，利用對于分級數據的正態等效偏差分析(Fmney,D.J.,ProbitAnalyses,2ndEd.Chapter10,GradedResponses,CambridgeUniversityPress,Cambridge1962)計算出IC50值(將細胞生長降至對照樣的50%所需的藥物濃度)。本文中試驗化合物的作用用PI5q(15。值的負對數值)表示(見表F-2)。實施例C.3:溶解度/穩定性CI—3—.—a——在—水介—質—_中—的—動—態多—解—度在一只96孔儲備液板(每孔200nl)中配制在DMSO中的5000-9.8ILiM(1/2稀釋)的DMSO儲備液。每次稀釋后將樣品混合。然后將這些DMSO溶液的等分試樣(2^1)轉移到另外兩個每孔中含200iul緩沖水溶液的96孔緩沖液板中。所述緩沖液板各含pH7.4或pH4.0的緩沖水溶液。在最后一次稀釋后，將緩沖液板混合，使樣品在室溫下穩定半小時。對于每種化合物，為排除偶然誤差，稀釋均以雙份進行。然后將混合物在BDGentest溶解度掃描儀中掃描沉淀的存在。根據混合物中存在/不存在沉淀，利用內插法計算動態溶解度。將其分成3級。溶解度高的化合物的分數為3，其溶解度高于或等于50fiM。中等溶解度的得分為2,其溶解度高于10inVH旦4氐于50]uM。4氐溶解度的化合物得分為1,這些化合物的溶解度低于或等于10iliM。試驗了四種化合物三種在試驗的兩個pH值下的得到為1,一種在pH7.4下得分為l，在pH4.0下得分為2。0:—3—I—在-P—H3——的—溶—解底化合物在pH2.3下的溶解度也能夠用化學發光氮檢測儀測定(見表F-2)。實施例C.4:平行的人工膜滲透性分析將儲備樣(10jal在100%DMSO中的5mM儲備液的等分液樣)在含2mlpH4或pH7.4的緩溶水溶液體系(PSR4體系溶液濃縮物(pION))的深孔或預混板中稀釋。在將樣品加到參比板中之前，先向孔中加入150)Lll緩沖液，進行空白的UV測定。然后將緩沖液倒走，將該板作為參比板使用。所有測量均在耐UV的板(供應商Costar或Greiner)中進行。在完成參比板的空白測定之后，向參比板中加入150)Lil稀釋的樣品和向供體板1中加入200)il稀釋的樣品。將一只受體濾板l(供應商Millipore,型號MAIPN45)用4pl人工成膜液(1，2-二油酰-sn-甘油-3國磷酸膽堿在含0.1%2,6-二叔丁基-4-曱基苯酚的十二烷中)涂覆并置于供體板1的頂上，形成一個"夾層結構"。將緩沖液(200)iil)分加到頂上的受體板孔中。該夾層結構加蓋蓋住，在室溫下于暗處存放18小時。受體板2的空白測定進行如下在孔中加入150iul緩沖液，然后進行UV測定。在完成受體板2的空白測定后，倒走緩沖液，將150iul受體溶液從受體濾板1轉移到受體板2，然后從夾層結構中取下受體濾板1。在完成供體板2的空白測量后(見上)，將150pl供體溶液從供體板1轉移至供體板2。掃描(用一臺SpectraMAX190)供體板2、受體板2和參比板各孔的UV光譜。用PSR4p指令軟件時對所有光譜進行加工以計算滲透性。所有化合物均用三份重復樣測量。在各次實驗中使用卡馬西比、灰黃霉素、無環鳥苷、阿替洛爾、呋塞米和氯噻嗪作為標準。化合物:故分級成三類低滲透性(平均作用〈0.5xl(T6cm/s;評分1),中等滲透性(lxlO-6cm/s〉平均作用20.5xl0-6cm/s;評分2)，或高滲透性($1x10-6cm/s;評分3)。實施例C.5:代謝穩定性實—逸——a—按照Gorrd等的方法(Xenobiotica5:453-462,1975),通過在將組織機械均化后離心分離，制得亞細胞組織制品。將肝組織在水冷的0.1MTris-HCl(pH7.4)緩沖液中沖洗，以洗去多余的血液。然后將組織吸干，稱重并用手術剪粗略地剪碎。將該組織碎片在3倍體積冰冷的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中用裝有四氟乙烯杵的Potter-S(Braun,Italy)或SorvallOmni-Mix均化器均化7xlO秒。在這兩種情形，容器在均化過程中均保持在水中或水上。用Sorvall離心機或Beckman超離心機將組織均化物在9000xg和4。C下離心20分鐘。得到清液在-80。C下儲存，稱為"S9"。該S9級分可以用Beckman超離心機在100000xg下再離心60分(4°C)。小心地吸出形成的清液，將其等分并稱為"細胞溶膠"。將沉淀物重新懸浮在O.IM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，最終體積為每0.5g原始組織1ml,稱其為"微粒體"。將所有的亞細胞級分成等份，立即冷凍在液氮中，在-80。C下存放，直至使用。對于要試驗的樣品，溫育混合物中含有PBS(0.1M)、化合物(5|uM)、微粒體(1mg/ml)和NADPH產生體系(0.8mM葡萄糖-6-磷酸，0.8mM氯化鎂和0.8單位的葡萄糖-6-磷酸脫氬酶)。對照樣品含有同樣的物質，但是微粒體用熱滅活的(95。C下10分鐘)微粒體代替。對照樣中化合物的回收率總是100%。將該混合物在37。C下預溫育5分鐘。在0時刻(t=0)通過加入0.3mMNADP開始反應，將樣品溫育15分鐘(tl5)。通過加入2倍體積的DMSO終止反應。然后將樣品在900xg下離心IO分鐘，清液在分才斤前于室溫下存放的時間不要超過24小時。所有的溫育均以雙份樣品進行。清液的分析采用LC-MS分析法。樣品的洗脫在一只XterraMSC18(50x46mm,5pM,Waters,US)上進行。使用Alliance2790(供應商Waters,US)HPLC系統。用緩沖液A(乙酸銨在水/乙腈中的25mM溶液(pH5.2))，溶劑B(乙腈)和溶劑C(甲醇)在2.4ml/mm的流速下洗脫。采用的梯度是以線性方式使有機相濃度增加，在5分鐘內從0%至50%B和50%C,在1分鐘內至100%B，另1.5分鐘保持有機相濃度固定。樣品的總注入體積為25|Lil。使用一臺裝有ESI源的Quattro(供應商MicromassManchester,UK)三重四才及質i普儀作為^r測器。源溫和脫溶劑溫度分別設定在120和350°C,使用氮氣作為霧化器和干燥氣體。數據以正掃描方式(單離子反應)得到。錐壓設定為10V，采樣時間為1秒。代謝穩定性用化合物在活性微粒體(E(act))存在下溫育15分鐘后代-浙％表示代謝％=100%-("飾(a")的總、,闊x腦)代謝百分數小于20%的化合物被定義為高度代謝穩定的，評分為3。代謝20-70%的化合物是中等穩定的，評分為2。代謝百分數高于70%的化合物是代謝不穩定的，評分為1。當進行代謝穩定性篩選時，總是包括3種參比化合物。維拉帕米是作為具有低代謝穩定性(代謝％=73%)的化合物，西沙為利作為中等代謝穩定性(代謝％=45%),丙醇作為中等至高度代謝穩定性(25%代謝)的化合物被包括在內。使用這些參比化合物以確認此代謝穩定性試驗有效。試驗了3種化合物，一種得分為3,兩種為2。實施例C6:P21誘發能力A2780細胞(ATCC)在補充了10%FCS、2mML-谷氨酰胺和慶大酶素的RPMI1640培養基中于含5%C02的加濕培養箱中在37。C培養。所有的細胞培養溶液均由Gibco-BRL(Gaithersburg,MD)提供。其它的材料Nunc提供。基因組DNA由增生的A2780細胞提取，代作模板用于p21啟動子的嵌套式聚合酶鏈式反應分離。第一次擴增以基因組DNA作為模板，使用寡核香酸對GAGGGCGCGGTGCTTGG和TGCCGCCGCTCTCTCACC，在55。C的退火溫度下進行20次循環。形成的4.5kb片段含有相對于TATA框-4551至+88片l殳，將其用寡核苷酸TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG和的片斷，卩話用寡核苷酸對TCGGGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC和段，含有相對于TATA框的-1300至+88片段。寡核苷酸中存在的限制位點Xhol和Kpnl(未劃線的序列)被用于亞克隆。在KpnI和XbaI限制位點上從pGL3-basic中除去焚光素酶報道基因，用ZsGreen報道基因(得自pZsGreen1-N1質粒)代替。pGL3-basic-ZsGreen-1300是通過將上述的人p21啟動子區域的1.3kb片l殳插入到XhoI和KpnI位點處的pGL3-basic-ZsGreen中構成的。所有的限制酶均由BoehringerManheim(Germany)提供。將A2780細胞植入6孔板中，密度為2xl05細胞，溫育24小時，利用Lipofectamine2000(Invitrogen,Burssels,Belgium)按照廠商的說明用2pgpGL3-basic-ZsGreen-1300和0.2|ugpSV2neo載體轉染。轉染過的細胞用G418(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)選擇10天，生長單細胞懸浮液。3周后，得到單克隆。將A2780選擇的克隆擴展并以每孔10000細胞接種在96孔板上。接種24小時后，用化合物再處理細胞24小時(影響近側p21啟動子區域中的spl位點)。隨后，將細胞用4%RFA固定30分鐘，用Hoechst染料對染。p21啟動子的活化導致ZsGreen產生，從而產生熒光，用AscentFluoroskan(ThermoLabsystems,Brussels,Belgium)對其監觀'J。對每次試驗，均平行地進行對照(不含藥物)和空白溫育(不含細胞或藥物)。從所有的對照值和樣品值中減去空白值。對每個樣品，p21誘發作用均用對照樣中存在的p21值的百分數表示。誘發百分數高于130%定義為顯著誘發。試驗了三種化合物，它們在10—6M下顯示出顯著的p21誘發作用。實施例C.7:P450抑制能力試一險的所有化合物均溶于DMSO中(5mM),并在乙腈中進一步詳希釋至5xl0"M。再在試驗緩沖液(O.lMMaK磷酸鹽緩沖液，pH7.4)中稀釋，最終的溶劑濃度不要超過2%。對于CYP3A4蛋白質的試驗，每孔在100iul的總試驗體積中含15pmolp450/mg蛋白質(在0.01MNaK磷酸鹽緩沖液+1.15%KC1中)，產生NADPH體系(3.3mM葡萄糖-6-磷酸，0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，1.3mMNADP和3.3mMMgCl2.6H20,在試馬全緩沖液中)和化合物。在37。C預溫育5分鐘后，加入在試驗緩沖液中的150nM熒光探針底物BFC以開始反應。室溫下溫育30分鐘后，加入2體積的乙腈終止反應。在激發波長405nm和發射波長535nm下進行熒光測定。酮康唑(IC5(^Ji=3xlO—8M)被包括在此實驗中作為參比化合物。對于CYP2D6蛋白質的試驗，在每孔100|ul的總試-驗體積中含有6pmolP450/mg蛋白質(在0.01MNaK磷酸鹽緩沖液+1.15%KCl),NADPH產生體系(0.41mM葡萄糖-6-磷酸，0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脫氬酶，0.0082mMNADP和0.41mMMgCl2.6H20,在試驗緩沖液中)和化合物。在37。C預溫育5分鐘后，加入熒光探針底物AMMC在試驗緩沖液中的3pM溶液以開始酶促反應。在室溫下溫育45分鐘后，加入2體積的乙腈使反應終止。在激發波長405nm和發射波長460nm下進行熒光測定。實驗中包括奎尼丁(IC5(^i<5xlO-8M)作為參比化合物。對于CYP2C9蛋白質的試-瞼，每孔在100|ul的總試-驗體積中含有15pmolP450/mg蛋白(在0.01MNaK磷酸鹽緩沖液+1.15。/。KCl中)、NaDPH產生體系(3.3mM葡萄糖-6-磷酸，0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脫氬酶，1.3mMNADP和3.3mMMgClr6H20,在試-驗緩沖液中)和化合物。在37。C下預溫育5分鐘后，加入熒光探針底物MFC在試^驗緩沖液中的200|uM溶液開始反應。室溫下溫育30分鐘后，加入2體積的乙腈終止反應，在激發波長405nm和發射波長535nm下進行焚光測定。在此實驗中包括磺胺苯吡唑(IC5(WA=6.8xlO-7M)作為參比化合物。為進行初始篩選，在lxl(T5M的單一固定濃度下試—瞼各化合物。對于活性化合物，重復進行試驗以建立完整的濃度-響應曲線。每次實驗均平行地進行對照(不含藥物)和空白溫育(不含酶或藥物)實驗。所有化合物均用四分重復試驗。從所有的對照和樣品值中減去空白值。對于各樣品，樣品的P450活性平均值(按相對熒光單位)被表示成對照樣的P450活性值的百分數。抑制百分數用100。/。減去樣品的P450活性平均值表示。在適當時，計算出IC50值(為將P450活性降至對照樣的50%所需的藥物濃度)。表F-2:按照實施例C.l、C.2和C.3.b試驗的化合物的結果(空白表示相關化合物無數據值)<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>D.組合物實施例包膜片劑片—刑—核」^的—制_備將100g式(I)化合物、570g乳糖和200g淀粉混合均勻，然后用5g十二烷基硫酸鈉和10g聚乙烯吡咯烷酮在200ml水中的溶液濕化。將濕粉混合物過篩，干燥，再過篩。然后加入100g微晶纖維素和15g氬化植物油。將其混合均勻，壓制成片，得到10000片，每片含10mg式(I)化合物。包—騰向10g甲基纖維素在75ml變性乙醇中的溶液加入5g乙基纖維素在150g二氯甲烷中的溶液。然后加入75ml二氯甲烷和2.5ml甘油。將10g聚乙二醇熔化并溶在75ml二氯曱烷中。將后一溶液加入前一溶液中，然后加入2.5g十八烷酸鎂、5g聚乙烯吡咯烷酮和30ml濃縮的色素懸浮液，將其全部均化。在包膜裝置中用這樣得到的包膜混合物將片劑核心包膜。權利要求1.一種式(I)化合物其N-氧化物形式，可藥用的加成鹽和立體化學異構形式，其中X是N或CH；R1是苯基，萘基或雜環基；其中苯基或萘基均可任選地被一個或二個取代基取代，這些取代基獨立地選自鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、多鹵代C1-6烷基、芳基、羥基、氰基、氨基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷基磺酰氨基、羥基羰基、C1-6烷氧羰基、羥基C1-6烷基、C1-6烷氧基甲基、氨甲基、C1-6烷基氨甲基、C1-6烷基羰基氨甲基、C1-6烷基磺酰基氨甲基、氨磺酰基、C1-6烷基氨磺酰基或雜環基；R2是CH2-R10，三氟甲基，-C(＝O)-R11或-CH2-NR12R13；其中各R10獨立地選自氫、羥基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6烷氧基、C1-6烷基羰氧基、哌嗪基、N-甲基哌嗪基、嗎啉基、硫嗎啉基、咪唑基或三唑基；各R11獨立地選自羥基、C1-6烷氧基、氨基或者一或二(C1-6烷基)氨基、C1-6環烷基氨基、羥基C1-6烷基氨基、哌嗪基、一或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基氨基、N-甲基哌嗪基、嗎啉基或硫嗎啉基；各R12和R13獨立地選自氫、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、C1-6烷基磺酰基、或者一或二(C1-4烷基)氨基磺酰基；R3是氫，羥甲基，氨甲基或是一或二(C1-6烷基)氨甲基；R4是氫或C1-6烷基；R5是羥基或氨基；R6是氫、噻吩基、呋喃基或苯基，并且各噻吩基、呋喃基或苯基均可任選地被獨立選自以下基團的一或二個取代基取代鹵素，氨基，硝基，氰基，羥基，苯基，C1-6烷基，二(C1-6烷基)氨基，C1-6烷氧基，苯基C1-6烷氧基，羥基C1-6烷基，C1-6烷氧基羰基，羥基羰基，C1-6烷基羰基，多鹵代C1-6烷氧基，多鹵代C1-6烷基，C1-6烷基磺酰基，羥基羰基C1-6烷基，C1-6烷基羰基氨基，氨磺酰基，氨磺酰C1-6烷基，異噁唑基，氨基羰基，苯基C2-6烯基，苯基C3-6炔基或吡啶基C3-6炔基；R7、R8和R9各自獨立地代表氫，氨基，硝基，呋喃基，鹵素，C1-6烷基，C1-6烷氧基，三氟甲基，噻吩基，苯基，C1-6烷基羰基氨基，氨基羰基C1-6烷基，或-C≡C-CH2-R14；其中R4是氫、C1-6烷基、羥基、氨基或C1-6烷氧基；以上的芳基是苯基或萘基，其中該苯基或萘基可任選地被獨立選自鹵素、C1-6烷基，C1-6烷氧基，三氟甲基，氰基或羥基羰基的一或二個取代基取代；和以上的雜環基是呋喃基，噻吩基，吡咯基，吡咯啉基，吡咯烷基，二氧雜環戊烯基，噁唑基，噻唑基，咪唑基，咪唑啉基，咪唑烷基，吡唑基，吡唑啉基，吡唑烷基，異噁唑基，異噻唑基，噁二唑基，三唑基，噻二唑基，吡喃基，吡啶基，哌啶基，二噁烷基，嗎啉基，二噻烷基，硫嗎啉基，噠嗪基，嘧啶基，吡嗪基，哌嗪基，三嗪基，三噻烷基，吲嗪基，吲哚基，二氫吲哚基，苯并呋喃基，苯并噻吩基，吲唑基，苯并咪唑基，苯并噻唑基，嘌呤基，喹嗪基，喹啉基，噌啉基，酞嗪基，喹唑啉基，喹喔啉基或萘啶基；其中所述各雜環均可任選地被獨立選自鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氰基、氨基、一或二(C1-4烷基)氨基的一或二個取代基取代。2.根據權利要求l的化合物，其中a)X是N或CH;b)W是苯基，它可任選地被獨立選自卣素、d—6烷基、d-6烷氧基、多面代d—6烷基或芳基的一或二個取代基取代；c)R2是-CH2-R"或-C(=0)-R11;d)各R"獨立地選自氫，鞋基，d—6烷氧基，C^烷氧基Cw烷氧基，d-6烷基羰氧基，N-曱基哌。秦基，嗎啉基，或咪唑基；e)各Rn獨立地選自d—6烷基氨基，d-6環烷基氨基，羥基d—6烷基氨基，二(Q—6烷基)氨基d—6烷基氨基或嗎啉基；f)R3是氫;g)R4是氬或d—6烷基；h)R5是氨基；i)W是氫或噻吩基；和j)R7、R8、R9均為氫。第三組令人關注的化合物包括其中施加以下一個或多個限制的那些式(I)化合物a)X是N或CH;b)R是苯基；c)R2是-CH2-R^或-C(=0)-R11;d)各R"獨立地選自氬，羥基，d—6烷氧基，Cw烷氧基d-6烷氧基，C"烷基羰氧基，N-甲基哌嗪基，嗎啉基，或咪唑基；e)各R"獨立地選自d-6烷基氨基，d—6環烷基氨基，羥基d.e烷基氨基，二(Cw烷基)氨基d-6烷基氨基或嗎啉基；f)R3是氫；g)R4是氫或d-6烷基；h)R5是氨基；i)R"是氫或噻吩基；和j)R7、118和119均為氫。3.根據權利要求l的化合物，其中a)X是N;b)W是苯基；c)R2是-CH2-R10,其中R^是羥基或d-6烷氧基；d)W是氫；e)W是氳；f)R5是氨基；g)RS是氳或噻吩基；和h)R7、118和119均為氳。4.根據權利要求l的化合物，其中該化合物是本文的化合物No.3,即，下式化合物5.—種藥物組合物，其中含有可藥用的載體和作為活性組分的治療有效量的權利要求1至4中任一項的化合物。6.—種制備權利要求5的藥物組合物的方法，其中將可藥用的載體與權利要求1至4中任一項的化合物緊密混合。7.作為藥物使用的權利要求1至4中任一項的化合物。8.權利要求1至4中任一項的化合物在制造用于治療增生性疾病的藥物方面的應用。9.抗癌藥物與權利要求1至4中任一項的HDAC抑制劑的聯合。10.—種制備權利要求1的化合物的方法，其特征在于，將其中M代表氫或堿金屬的式(II)化合物與式(III)化合物在堿存在下反應全文摘要本發明包括具有組蛋白脫乙酰酶抑制活性的式(I)新化合物，其中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹和X具有所定義的含義；它們的制備，含有它們的組合物及它們作為藥物的應用。文檔編號C07D239/42GK101370789SQ200780002306公開日2009年2月18日申請日期2007年1月16日優先權日2006年1月19日發明者J·阿茨,L·F·B·馬康內特-德克拉恩,P·R·安吉鮑德申請人:詹森藥業有限公司