專利名稱：稀有鯽β型雌激素受體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學及環境生物學領域，其中涉及一種(3型雌激素受體及其編碼基因，以及采用該p型雌激素受體作為標記物檢測水生環境
化學毒性的方法和用于診斷水生動植物疾病的試劑盒。
背景技術：
雌激素是一種類固醇激素，其在體內是由芳香化酶催化雄激素轉化而來的。雌激素呈脂溶性，具有眾多靶組織和耙器官，其中包括生殖系統、骨骼、心血管等。目前在人體內發現的雌激素有三種雌二醇、雌酮和雌三醇。通過研究發現，雌激素是通過與細胞內相應的雌激素受體結合從而啟動轉錄、翻譯等下游事件，產生相應的生理學效應，進而調控生長、發育、配對、繁殖等一系列生命事件。
20世紀70年代，Jesen和Jacobsen等利用放射性同位素的方法發現雌激素的信號是由雌激素受體(ER)介導的，雌激素受體是一種與雌激素有高度親和力的蛋白。至1986年，ER蛋白被純化，Greene及其領導的兩個研究小組分別完成了對ER的克隆[Greene， G丄.，Gilna, P.和Water, M.，Sequence and expression of human estrogen receptor complementary DNASciences, 231: 1150-1154 (1986)],并分別在Nature和Science雜志上發表了論文。至此，人們一直認為ER只有一種構型，所有的雌激素效應和抗雌激素效應都是由這種受體來調節。直到1996年，Kuiper在對大鼠前列腺研究時，在大鼠的前列腺中發現了一種新的ER蛋白[Kuiper, G.G.，Enmark, E., Pelto-Huikko, M., Cloning of a novel estrogen receptor expressedin rat prostate and ovary. Proc Nat Acad Sci USA， 93: 5925-5930 (1996)],隨后在人類中也發現了該蛋白的基因，人們把先前發現的稱為ERa,把后來發現的稱為ERJ 。
雌激素受體的結構。ER (包括ERa和ER(3)屬于糖蛋白，其特異性強、親和力高、結合容量低、受熱容易破壞，是甾體激素核受體超家族中的成員，也是一類具有配體激活域的核轉錄因子。ERa和ERp由不同基因編碼，Enmark等研究發現人類ERj3基因定位于人類染色體14q22-24處；ERa基因位于人類染色體6q25. 1處，均含有8個外顯子[Enmark, E.,Pelto國Huikko, M" Gradien, K.， Lagercrantz, S" Lagercrantz,丄,Fried, G.，Nordenskjold, M.， Gustafsson, J. A" Human estrogen receptor卩國gene structure:chromosomal localization, and expression pattern, The Journal of ClinicalEndocrinology & Metabolism 82: 4258-4265( 1997 )〗。ERa基因長約140kb,其蛋白含595個氨基酸；ER(3基因因內含子長度不同而遠小于ERa基因，長約為40kb, ERp蛋白含530個氨基酸。
依據氨基酸N端到C端的序列，從結構上將ER分為5個功能區A/B、 C、 D、 E和F，而從功能上又可分為4個區域(1)N末端為A/B區域，其中存在一個不依賴配體的激活功能區(transcription activationfUnction-1),稱為AF-1區，具有高度變異性。在正常情況下，該區域還含有一個能與轉錄因子交互作用的反式激活區，該功能區可能參與調節配體與ER結合，調節雌激素應答基因的轉錄。比較ERa、 ER卩兩種亞型的AF-1區發現，ERa的AF-1區含有兩個不同的部位，分別調節雌激素激動劑和雌激素部分激動劑，而ER卩的AF-1區則缺少這樣的雙重功能，這可能是造成兩種ER亞型不同功能的一個原因；(2 )中間的區域也稱C區域，為DNA結合區(DNA-binding domain, DBD )。該區含有一個雙鋅指結構，每兩個鋅原子與四個半胱氨酸殘基結合形成1個指狀突起。第1個鋅指結
構與特異識別激素應答元件有關；第2個鋅指結構與受體的二聚體化有
關，二聚體化是受體調節基因轉錄的必要條件。與其它蛋白質的鋅指結構
不同的是，ER的兩個鋅指結構具有協同作用，共同調節與DNA的結合。ER兩種亞型在這一區域具有高度的(96%)同源性；與DNA結合區相鄰的是D區或鉸鏈區，它的特性尚不清楚；(3)C末端E/F區為配體結合區(ligand-bindingdomain, LBD)，該功能區主要是調節配體與ER的結合、受體的二聚化和應答基因表達的激活。此外，該功能區還含有與各種不同
配體結合的氨基酸序列，與配體結合相關的氨基酸殘基分布于配體結合區的螺旋3-12，還能與調節蛋白相互作用；(4)羧基末端的激素依賴轉錄活沖生功能區(transcription activation fonction-2, AF-2)， ^亥區i或由螺4t3、 4、5和12的氨基酸組成，兩種亞型ER的氨基酸序列在這一區域有較大的差異，只有56%-57%的相同氨基酸序列。因此，兩種受體既有共同的配體，也有各自不同的配體。AF-2的結構和功能因結合的配體類型不同而不同，主要的變化發生在螺旋12的氨基酸位置上。
比較ERa和ER卩發現在DBD區和LBD區的氨基酸殘基順序分別有96-97%和53-56%完全一致，說明a和卩識別并結合相似的17p-雌二醇反應元件(ERE), ^旦是配體i瞽可能并不相同。ERa含有AF-l區，而ER(3缺乏AF-1區。AF-1和AF-2同源性差，而且AF-1轉錄激活的功能是不依賴配體的，而AF-2基因激活的功能卻依賴配體的存在。對于雌激素作用的信號轉導途徑，多年來一直i/v為雌激素是通過與核內受體結合形成復合物，再識別DNA上的特異序列，影響耙基因的轉錄而產生效應，但這個經典模式并不能解釋所有觀察到的現象，隨著ERP的發現，提示雌激素及其受體的信號轉導途徑非常復雜。
雌激素受體的作用途徑
(1 )配體依賴(ligand dependent)途徑。核內ER未與配體結合時，以多蛋白抑制復合物的非活化形式存在。雌激素受體與配體結合后，引起變構形成同源二聚體，同源二聚體再與雌激素反應元件(Estrogen responseelement, ERE)結合后形成復雜復合物。之后，ER直接或間接通過輔激活物與轉錄元件作用，啟動轉錄。輔激活物包括SRC-1、 GRIP1、 ACTR、CBP/p300、TRAP220、PGC隱l和SRA等[Shang， Y.F.， Hu， X.， James, Cofactordynamics and sufficiency in estrogen receptor-regulated transcription, Cell,103: 843-852 (2000)]。 ER與其相互作用可穩定轉錄前起始復合物，使ERE處的染色體變得疏松。轉錄能力與染色體組蛋白N端乙酰化有關，組蛋白乙酰化后可使組蛋白與DNA結合不穩定，從而使染色體結構疏松。因此，ER活性所需的許多輔激活物是組蛋白乙酰轉移酶(HATs)，如pl60輔激活物家族成員SRC-1和ACTR，它們通過重復的LXXIJ氨基酸基序列與有興奮劑的ERs的AF-2區結合，作為平臺結合更多HATs,如p300、CBP和p300/CBP的相關因子pCAF。與此相反，組蛋白去乙酰化酶(HDACs)使組蛋白去乙酰化而抑制轉錄。當給予拮抗劑如他莫昔芬，ERa就與輔抑制物NCoR和SMRT結合[Smith,C.L., Cross-talk betweenpeptide growth factor and estrogen receptor signaling pathways. Biol Report58: 627-632 (1998)]。這些輔抑制物通過結合HDAC復合物如Sin3復合物，而使轉錄受到抑制。
(2)配體非依賴途徑(ligandindependent)。多肽激素，如表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子I (IGF-1 )、胞內信使類似物8-溴-cAMP也能激活ER而促進把基因表達[Ueda, S.， Tsuda, H., Sato, K, Alternativetyrosine phosphorylation of signaling kinases according to hormone receptorstatus in breast cancer overexpressing the insulin-like growth factor receptortype. Cancer Sci 97: 597-604(2006)]。在小鼠的子宮中，同時給予EGF抗體可減弱子宮對E2的反應；相反，給予ER的拮抗劑ICI182、 780可減弱子宮對EGF的反應，可見兩者的部分效應是通過對方介導的。大量研究表明，在該途徑中ER被細胞中的激酶磷酸化可能是關鍵[Ignar誦Trowbridge， D.M., Nelson, K.G., Bidwell， M.C., Coupling of dualsignaling pathways: epidermal growth factor action involves the estrogenreceptor. Proc Natl Acad Sci UAS 89: 4658-4662 (1992); Lannigan D.A.,Estrogen receptor phpsphoiylation. Steroids 68: 1-9 (2003)]。當給予EGF或IGF后，有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)使ERa的AF-1區的第118位絲氨酸磷酸化，從而使受體與ERa特異的輔激活物p68RNA螺旋酶結合，活化耙基因。同樣，ER(3的N末端的活化區也可被MAPK磷酸化，以不依賴配體的形式結合pl60輔激活物SRC-1,繼而再與ERE作用，減弱ERa配體激活的轉錄活性。因此，同時表達兩種受體亞型的細胞，總的雌激素效應可能取決于ERa/ER卩的比值[Kato, S.， Estrogenreceptor-mediated cross-talk with growth factor signaling pathways. BreastCancer 8: 3-9 (2001); Tremblay， A., Giguere, V" Contribution of steroidreceptor coactivator畫l and CREB binding protein in ligand畫independentactivity of estrogen receptor beta. J Steroid Biochem Mol Biol 77: 19-27(2001)]。
(3 )不依賴ERE的轉錄途徑(ERE-independent)
ER除了與ERE結合產生效應外，也能與Fos和Jun作用而與DNA上的AP-1位點結合影響轉錄，同時Era-Spl復合物也可結合富含GC的啟動子序歹寸[Paech， K., Webb, P" Kuiper, GG" Differential ligand activation ofestrogen receptor ERa and ERp at API sites. Science 277: 1508-1510(1997) ]。 ERa和ERp在AP-1位點處與雌激素結合后，表現為相反的作用；與ERa結合時，雌激素活化轉錄；而與ER卩結合時，雌激素抑制轉錄。另外，拮抗劑他莫昔芬、雷洛昔芬在AP-1位點處與ER(3結合，則成為強有力的轉錄興奮劑。
雌激素受體的分布。ERa和ERP的序列在不同的區域都有一定的同源性。在分布和功能上，ERa和ER卩也有著相當大的差別。在不同的器官中，使用原位雜交的方法發現，ERa的mRNA主要在子宮、睪丸、腦，下垂體、腎、附睪和腎上腺中高度表達，ERp的mRNA主要在前列腺、卵巢、肺、膀胱、腦、子宮和睪丸中高度表達[Marino, M., Acconcia, R，Ascenzi, P., Estrogen receptor signaling: bases for drug actions. Curr DrugTargets Immune Endocr Metabol Disord 5: 305-314 (2005)]。在心血管系統和骨骼中，血管平滑肌主要表達ERJ3， ERa的表達很少或者沒有。在成骨細胞中，ERa和ER(3均有表達，但是以ER(3為主。在腫瘤組織中，ER的表達可能與相應的正常組織不同，例如正常卵巢以表達ER卩為主，而卵巢癌中ERP表達明顯降低甚至失去。即使在同一個器官中，ERa和ERp的分布也有很大的差別。在大鼠的子宮中，子宮內膜腔的上皮細胞和間質細胞中，均有ERa和ER|3的表達，但是在腺上皮細胞中主要表達ERa;在大鼠卵巢中，ERa與ER卩的mRNA均有表達，但ER(3的表達占優勢[Gustafsson, J., Estrogen receptor (32, a new dimension in estrogen mechanismof action. J Endocrinol 163: 379-383 (1999) ]。 ER|3在卵泡生長及排卵前在成熟卵泡的小顆粒細胞中高表達，但在退化黃體細胞中弱表達。而ERa在胚胎上皮細胞、間質細胞、鞘膜細胞中均有表達，唯獨在顆粒細胞中無表達，說明在卵泡生長和成熟的調節過程中主要是ERP介導了雌激素的活性。在乳腺中，ERa在人類乳腺小葉和導管的上皮細胞有表達，而ER卩不僅在乳腺小葉和導管的上皮細胞有表達，還在乳腺肌上皮細胞有高表達，偶爾也可在周圍基質細胞和內皮細胞及淋巴管等有表達。在男性生殖系統中，ERa在不同生殖道的上皮細胞、睪丸細胞均有較高表達，但在前列腺中表達較低。ER卩在男性生殖系統如輸精管上皮細胞、附睪、前列腺的上皮細胞和睪丸的支持細胞均有表達[Pare, G., Krust， A., Karas， R.H.，Estrogen receptor-alpha mediates the protective effects of estrogen againstvascular injury. Circ Res 90: 1087-1092 (2002)]。
不同的ER對雌激素類物質的親和力以及對ERE的結合能力各不相同。對于雌二醇，ERa和ER卩與之的親和力相似，但對于植物性雌激素和一些雌激素拮抗劑來說，其對ERa和ERp的親和力卻不盡相同。 一般來說，植物性雌激素對ERj3的親和力更高，而不同的雌激素拮抗劑，它們對ERa和ER卩的結合能力各不相同。大多數情況下，在人類的細胞中，ERa的轉錄活性要高于ERp,在雌激素刺激下，ERa的mRNA的基礎轉錄活性也要高于ER卩的mRNA。
環境激素雌性化的作用機制。環境激素分子作為配體(ligand)與雌激素受體結合，引起一系列的雌激素刺激或抑制雌激素的生理效應。ERa主要是作為基因轉錄的激動劑，而ERP主要是作為基因轉錄的抑制劑。環境激素結合這兩個不同作用點，從而導致了兩種不同的作用雌性化作用和抑制雌性化作用。
環境激素分子干擾動物和人類內分泌系統的過程主要為環境激素分子與雌激素受體結合，導致原結合于受體上的熱休克蛋白90 (hsp90)從受體上解離下來；結合了配體的雌激素受體發生構象改變并同型二聚體化，這種同型二聚體復合物和DNA上雌激素反應元件具有高度親和能力(雌激素反應元件為位于5'端雌激素誘導基因調節區域的特異DNA序列)。ERP也可與ERa形成異源二聚體，它也可以與ERE結合。當這種親和發生時，同型或者異型二聚體復合物將使轉錄子聚集到草巴基因啟動子上，并M基因轉錄的增強，轉錄出mRNA并翻譯成蛋白質，從而表現出各種生理效應，最終導致了諸多的生物現象雌激素與受體結合、基因的轉錄和細胞的增殖、以及短期內的子宮增重。己烯雌酚、DDT等都是靠這種機制來干擾生物體的生殖和發育[Danzo, B丄，Environmentalxenobiotics may disrupt normal endocrine fimction by interfering with bindingof physiological ligands to steroid receptors and binding proteins. EnvironHealth Perspect 105: 294-301 (1997)]。
雌激素分子也可以與ERp結合，并以與ERa相反的介導模式，通過DNA上的AP-1反應元件影響ER介導的基因轉錄活性。如17|3-雌二醇和ERa結合后通過DNA上的AP-1反應元件激活并提高報告基因的轉錄，然而與ER卩結合則抑制轉錄。選擇性雌激素受體調節劑(selective estrogenreceptor modulator, SERMs)是環境激素中的一類，三苯氧胺、植物雌激素中各種異黃酮就是其代表物。它們在不同靶組織可以表現為雌激素激動劑和/或拮抗劑的作用，并與體內激素水平有關。某些SERMs在雌激素受體反應(ERE)路徑上轉錄調節作用與雌激素不同，不能通過ERE路徑激活轉錄，而是完全阻斷雌激素在ERE路徑上的作用。SERMs與ERa和ER卩具有高度的親和性，且SERMs也可致伴侶蛋白的游離、ERs二聚體的形成以及ERs與ERE的結合。SERMs的拮抗作用是在雌激素受體與啟動子區域結合的最后一步發生，阻斷配體結合區域的移動和功能性AF-2表面的出現，從而抑制轉錄。研究ERa和ER^的配體結合區域結晶化發 現其拮抗作用的分子機制是由于SERMs包含一個estradiol缺乏的大側 鏈，不能使ERs形成功能性AF-2表面，阻止了 ER與輔調節蛋白的結合， 因而激活途徑突然被終止，從而達到抑制的效果[Mitlak, B.H., Cohen, F丄, Selective estrogen receptor modulation look ahead. Drug 57: 653-663 (1999)]。 稀有鮑鯽(Go6/oc_y;7n;s rams)屬擔尼亞科，鮑鯽屬，是中國特有的 稀有魚類，分布于四川省漢源縣、石棉縣、雙流縣、都江堰市和彭縣等地。 其具有繁殖力強，溫度適應范圍廣，二氧化碳和溶氧耐受力高，性成熟周 期短等作為實驗魚類的優良特征，而且在水生化學品毒性測試上有極高的 敏感性[Ma, T. W., Wang， Z. J.和Liu, J. K. Endocrine disrupting effects on Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) fed with field collected Limnodrilus sp. J Environ Sci 16: 784-787 (2004); Zhong, X.， Xu, Y., Liang, Y., Liao, T.和 Wang, J. The Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) as an in vivo model for endocrine disruption in freshwater teleosts: a fUll life-cycle test with diethylstilbestrol. Aquat Toxicol 71: 85-95 (2005)]。因此，檢測、分離和鑒 定稀有鮑鯽的13型雌激素受體，并將其作為基因轉錄抑制因子應用于對環 境內分泌干擾物作用機制的研究中，具有分子生物學和毒理學水平上的深 遠意義。
發明內容
本發明的目的是基于P型雌激素受體是基因轉錄抑制因子的發現，將 其作為環境內分泌干擾物的預警分子標記物，從而提供一種用于檢測水生 環境化學毒性的方法或用于診斷水生動植物疾病的試劑盒。 為實現上述發明目的，本發明提供了下列技術方案 一種稀有齣鯽P型雌激素受體(以下簡稱為GrER|3 ),所述受體具有 SEDIDNo,2所示的氨基酸序列。 一種編碼上述雌激素受體的基因，所述 基因具有SEDIDNo.l所示的核苷^列，以及一種包含上述基因的表達 載體。
本發明還提供了一種檢測水生環境化學毒性的方法，所述方法包括檢 測水生環境中上述受體的表達水平。其中，所述化學毒性是雌激素效應或 基因轉錄抑制。
本發明還提供了一種用于診斷水生動植物疾病的試劑盒，所述試劑盒包含檢測水生環境中上述受體的表達水平的工具。其中，所述水生動才直物 具體為魚類。所述疾病可以為生殖系統疾病，具體為性腺發育不完全、雌 雄同體和/或性別逆轉。
本發明以實驗室祠養并馴化的稀有鉤鯽為來源，從雌、雄魚肝臟中擴
增GrER卩基因并進行克隆和測序，其cDNA序列長901bp,編碼297個 氨基酸。GrER(3基因的cDNA序列具體為SEDIDNo.l所示的DNA序列， GrER(3基因編碼的雌激素受體氨基酸序列具體為SED ID No.2所示的氨基
酸序列。
本發明通過運用RT-PCR技術，檢測了 GrER(3基因在各組織中和各 幼魚時期的表達，結果表明GrER卩基因在雌、雄魚的大腦、性腺、肌肉 和肝臟中均有表達，但是在肝臟和性腺中表達水平較高。而未成熟的幼魚 體內從孵出后就可以檢測到該基因的轉錄產物， 一直持續到成魚中，表明 該基因在雌、雄魚的生長，發育和繁殖調控中具有重要的功能。
本發明通過設計特異性引物，建立了稀有鉤鯽GrERp基因的實時定 量PCR-SYBR Green熒光染料方法，以p-actin基因作為內參基因和卵黃 蛋白原基因作為對照基因。運用熒光定量PCR方法檢測了暴露在環境雌 激素作用下的幼魚和成年魚的表達變化，發現在雌激素作用下幼魚和成年 雄魚在誘導GrERp基因表達譜上具有不同的效應。
本發明不僅檢測到(3型雌激素受體在稀有齣鯽的各組織中均有表達， 而且證明其表達水平是可以被檢測的。在內分泌干擾物暴露下，GrERJ3基 因表達水平會發生顯著的變化，而且與常規檢測指標卵黃蛋白原(VTG) 基因表達水平的變化相一致。在對幼魚的檢測中，p型雌激素受體也具有 高水平的表達，其表達早于VTG基因的表達，更容易被檢測，而且比VTG 基因更敏感。由于VTG基因的表達及卵黃蛋白原的生成需要經過一個長 的反饋途徑，檢測P型雌激素受體更有利于進行早期環境內分泌干擾物的 預警指示。
本發明適用于檢測水生環境化學毒性，以及診斷水生動植物疾病，尤 其是診斷魚類的生殖系統疾病，從而實現調控魚類生殖能力的目的。本發 明試驗結果表明，GrER卩基因的表達與雌激素效應具有劑量-效應關系， 使得本發明的方法具有操作簡便、快捷、準確的優點。
下面結合附圖對本發明作進一步的說明，其中 圖1顯示了經RT-PCR檢測到的GrER(3基因在稀有齣鯽雌、雄魚的 不同器官中的表達。其中p-actin基因作為對照基因。
圖2顯示了經RT-PCR檢測到的GrER(3基因在稀有齣鯽幼魚中的表達。
圖3顯示了稀有鮑鯽GrERp基因的重組質粒的篩選結果。
圖4顯示了稀有齣鯽GrER卩和(3-actin基因的熒光定量PCR的擴增效應。
圖5顯示了熒光定量PCR檢測稀有鉤鯽幼魚暴露在100ng/L的E2 (17-|3雌二醇)中GrER卩基因表達的改變。
圖6顯示了熒光定量PCR檢測到的稀有鉤鯽在環境內分泌干擾物2， 4-二氯酚暴露后的GrER卩基因的表達譜變化。*號表示有顯著差異的組， 尸<0.5。
具體實施例方式
下面結合具體實施方式
進一步闡述本發明，下述實施例僅用于說明本 發明，而不對本發明的范圍進行限制。下列實施例中的實驗方法中未注明 的具體實驗條件即按照常規條件或按照廠商所建議的條件實施。
1. 化學試劑
雌二醇(17卩-estradiol，E2)、 2，4-二氯酚(2,4-dichlorophenol)和二曱基 亞砜(Dimethyl Sulfoxide, DMSO )購于Sigma公司(St. Louis, MO，美國)。 所述雌二醇(17卩-estradio1, E2)和2,4-二氯酚分別配制成DMSO溶液，然后 按照DMSO溶液水為0.005% (體積比)配制實驗暴露用水。
2. 實^^動物馴化
實驗中采用的稀有鮑鯽已經馴化4年以上，其養殖和暴露條件控制 為水溫25-28。C, K硬度8.0 mg/L, pH值7.5-7.8，溶氧8.0-9.0 mg/L。 光周期控制為晝夜=16: 8。飼料為新孵化的活體卣蟲和顆粒狀飼料。
3. 實-驗方法
(1)不同組織樣品的采集從孵化后9月齡的成熟個體(n = 6-9) 中得到魚肝、腦、性腺、肌肉組織，采集后的樣品立即用液氮凍存，直至 提取總RNA時。(2) 不同內分泌干擾物質的暴露實驗將酵化后9月齡的雌、雄成 魚分別暴露于不同濃度的化合物中。每組20L水中30尾，采用流水暴露 系統，水流速度為4 1/h,藥流速度為lml/min, 0.005% (v/v) DMSO作為 對照組。暴露3周后采集性腺樣品，采集后的樣品立即用液氮凍存，直至 提取總RNA時。
(3) 合成cDNA第一條鏈采用Trizol試劑(Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, MA,美國)才是取組織總RNA,然后對l是取 的總RNA進行DNAaseI (大連寶生物公司)處理和純化。在液氮中研磨 的肝臟中加入1 ml Trizol試劑和DNA酶，加0.2ml氯仿，蓋好管蓋，劇 烈振蕩15s,室溫放置3min。 4。C下12,000 rpm離心10min，轉移7JC相至 新管，緩慢加入1倍體積的70%乙醇，混勻。離心，去廢液，干燥，用 TE (Tris EDTA緩沖液)溶解總RNA。所得總RNA的紫外光吸收 A260/A280大于1.8, 0.8%曱醛變性凝膠電泳證實無降解。采用MMLV反 轉錄酶(Invitrogen， Paisley, UK)合成cDNA第一條鏈。
4. GrER卩基因序列克隆
根據NCBI GenBank (http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/)發布的有關ER 基因序列，利用Primer Premier 5設計兼并引物，PCR反應擴增目標基因。 先進行第一鏈的合成，分別取稀有鮑鯽雌、雄個體RNAlOiil,加入2pl 隨機引物，70。C反應5min,在冰上冷卻。加入M-MLV ( Promega, 美國)反轉錄酶，ljxlRNA酶抑制劑，5pl反應緩沖液，5jildNTP(脫氧 核苦三磷酸)，加水至25^1，輕輕混合，37。C下保持lh;在70。C下保持 10min,冰浴冷卻。PCR擴增反應體系為25 其中含模板100 ngDNA， 每個引物取0.5 pmol/L, 1.5mmol/LMg2+， 0.2 jimol/L dNTP, 1UTaqDNA 聚合酶，加水補至25 pl。純化PCR產物連接到pUC 19-T質粒(大連寶 生物公司)上，轉入感受態大腸桿菌擴培。
5. GrERp基因片段的篩選和測序分析
轉化菌涂布于涂有X-gal( 5-溴-4-氯-3-吲哚-P-D-吡喃半乳糖)和IPTG (異丙基-P - D -硫代半乳糖苷)的含氨芐青霉素(Amp)的LB平板上 培養，37 。C下培養過夜。隨機挑取24個白色菌落，接種于2ml含Amp 的液體培養基中。用PCR方法檢測質粒的插入片段，引物為通用引物SP6 和T7, PCR反應條件為94 。C預變性6min , 94 。C 40 s， 55 。C 50 s, 72 。C80s, 35個循環，72。C延伸8min， 4 。C保存。篩選出有差異的陽性克隆委托北京諾賽基因公司進行測序。通過M13引物測序獲得901 bp的序 列。采用Clustal X軟件將推算的GrERp氨基酸序列和Genbank公布的氨 基酸序列進行了比對，采用MEGA3軟件Identity Matrix計算相同序列的 比例。基于氨基酸序列比對文件，采用鄰接法(Neighbor joining method, NJ)分析系統發生關系，構建NJ樹。
圖3顯示了稀有鉤鯽GrER卩基因的重組質粒的篩選結果。從平板上 隨機挑選白斑進行菌落PCR,再挑選條帶與GrER(3 —致的菌落(15和18 號泳道)進行過夜培養，進行測序鑒定。
6. RT-PCR對GrER(3基因的檢測
用p-actin作為內參基因，取總RNA進行反轉錄，然后進行擴增，PCR 反應條件為94°C， 10min; 94°C， 30s; 55°C, 30s; 72°C， 45s; 35個循 環。
圖1顯示了 RT-PCR檢測到的GrERp基因在稀有鉤鯽雌雄魚不同器 官中的表達，其中以(3-actin基因作為對照基因，在雌雄魚精巢、卵巢、 大腦、肝臟和肌肉中都有表達，其中性腺和肝臟的表達較其它組織更豐富。
圖2顯示了 RT-PCR檢測到的GrER(3基因在稀有齣鯽幼魚中的表達， 其中從孵出后1天到15天，GrER(3基因都有明顯的表達。
7. 實時定量PCR方法分析基因表達差異
定量PCR 1物采用軟件Primer Express 2.0設計，每對引物至少跨越 一個內含子以減少基因組DNA的影響。cDNA標準品為純化的普通PCR 產物。從大腸桿菌中提取含有GrER(3基因片段的重組質粒，在分光光度 計上測定其DNA濃度和純度。以IO倍稀釋的質粒作為模版，進行PCR, 做出標準曲線，確定模板的最佳濃度。
以反轉錄的DNA作為模板，在PCR反應體系中，加入過量SYBR Green熒光染料，在Bio-Rad iCycler iQTM5 Multicolor實時定量PCR檢測 系統進行PCR擴增，每次反應液包含11.25pL的Quant 2X iQTM SYBR Green PCR master mix (Bio-Rad, USA), 100 nM上游和下游引物和1 pi cDNA模板。反應^f牛為95°C, 4min; 60°C， 30s; 72°C, 30s，循環次 數為35-40。隨后進行溶解曲線分析和表達分析。每次擴增重復3次以 上。20jiL體系PCR反應液包括SYBR⑧Green PCR Master Mix (Applied Biosystems,美國)10 pL, 25 |umol/L正義和反義引物各0.4 |iL，及cDNA 和雙蒸餾水。PCR反應程序為50°C， 2min; 95°C， lOmin; 40個循環 95°C, 15 s， 60°C， 60s。在最后一個循環結束后做熔解曲線，確定PCR 反應質量。96孔光學PCR板和光學透明塑料蓋膜購自Applied Biosystems 公司。儀器采用ABI 7000型熒光定量PCR儀(ABI Prism 7000 Sequence Detection System, Applied Biosystems, 美國)。
圖4顯示了稀有鮑鯽GrER(3, VTG和p-actin基因的熒光定量PCR的 擴增效應(三個基因的擴增效率相差在5%的范圍內說明其擴增是有效擴 增)。
圖5顯示了熒光定量PCIU全測稀有鮑鯽幼魚暴露在100ng/L的E2( 17-|3雌二醇)中GrER (3基因表達水平的改變。由于內分泌干擾物的重要特 征之一是影響生殖腺的發育和生長，幼魚的發育在孵化后1到15天是性 別分化的關鍵時期，在24h暴露后，ERbeta基因的影響沒有顯著性差異 (a)。 72h暴露后，從第四天開始就可以檢測到E2對GrERl3基因表達具 有顯著影響(B)，表明GrERP基因具有很高的敏感性，而且其影響一直 持續到第十五天，是可以用來進行環境內分泌干擾物的早期預警指示。
圖6顯示了熒光定量PCR檢測到的稀有鮑鯽在環境內分泌干擾物2, 4-二氯酚暴露后的GrER卩基因的表達譜變化。以VTG基因作為陽性對照 基因，2, 4-二氯酚暴露后VTG基因在雌魚中被顯著誘導，而雄魚中沒有 被誘導。在GrERp基因表達變化中，雌魚被顯著抑制，雄魚被顯著誘導。 由于GrERp基因作為基因轉錄抑制劑，其表達的下調，導致VTG基因的 上調，而在雄魚中由于GrER卩基因的上調，VTG基因不能被誘導。
8.統計分析
采用SPSS軟件(Ver 11.5; Chicago, IL, USA )的單向方差分析( one-way ANOVA)和Tukey多重比較來檢驗相關數據的差異。當p < 0.05時認為差 異顯著。所有數據和圖表均以平均值土標準偏差表示。表l:所用的引物
For5'-TGCCGTCTTAGGAAGTGTTACG-3'
ER
Rev5'-CCAGCAGCAGGTCGTACAG誦3'
(3-actinFor5'-CAGGGCGTGATGGTGGGGAT-3'
DQ539421Rev5'-GGTTGGCTTTGGGGTTGAG-3'
GrER卩For5'-AACAGACCGCCACATTAG-3'
EF190319Rev5'畫GAGCCACCTGAGATTTACC-3'
VTGF25'-AAATTCATGGTGCTGCTGAAG-3'
EF095728R25'畫CCTTTCATCCAGTCTGCAAC-3'
15序列表
SEDID No.l
〈110〉 中國科學院生態環境中心 〈120〉稀有鮑鯽(3型雌激素受體及其應用 〈130〉 D薩110129 <160〉 2
〈170〉 Patentln version 3. 3
〈210〉 1 〈211> 901 〈212> DNA
〈213> 稀有鮑鯽(Gobiocypris rarus ) 〈400> 1
tgccgtctta ggaagtgtta cgaagttgga atgatgaaat gtgggttacg gcgagatcg1
60
ggcagctacc aacaaagagg agcacagcag aagagactgg cacgattatc tggcaggatg 120
agaaccagtg gcccgatatc tcaagagatg aaaagtgccc cacgtcccat aagtggaaac 180
gaggtggtta acatggggtt gagccctgag gaactaatcg ctcgcctcat ggatgcagag 240
ccacctgaga tttacctcat gaaagatgtg aagaagccat ttactgaagc caacgtcatg 300
atgccactga ccaacctggc tgacaaagag ctcgttcaca tgatcggctg ggccaagaag 360
atccccggtt ttgtggagct cagtcttttt gaccaggtcc atttgctaga gtgctgctgg 420<formula>formula see original document page 17</formula>Leu Ala Arg Leu Ser Gly Arg Met Arg Thr Ser Gly Pro lie Ser Gin 35 40 45
Glu Met Lys Ser Ala Pro Arg Pro lie Ser Gly Asn Glu Val Val Asn 50 55 60
Met Gly Leu Ser Pro Glu Glu Leu lie Ala Arg Leu Met Asp Ala Glu 65 70 75 80
Pro Pro Glu lie Tyr Leu Met Lys Asp Val Lys Lys Pro Phe Thr Glu 85 90 95
Ala Asn Val Met Met Pro Leu Thr Asn Leu Ala Asp Lys Glu Leu Val 100 105 110
His Met lie Gly Trp Ala Lys Lys lie Pro Gly Phe Val Glu Leu Ser 115 120 125
Leu Phe Asp Gin Val His Leu Leu Glu Cys Cys Trp Leu Glu Val Leu 130 135 140
Met Leu Gly Leu Met Trp Arg Ser Val Asn His Pro Gly Lys Leu lie 145 150 155 160
Phe Ser Pro Asp Leu Ser Leu Ser Arg Asp Glu Gly Ser Cys Val Gin 165 170 175
Gly Phe Val Glu lie Phe Asp Met Leu Leu Ala Ala Thr Ser Arg Phe 180 185 190
Arg Glu Leu Lys Uu Gin Arg Glu Glu Tyr Val Cys Leu Lys Ala Met195 200 205
lie Leu Leu Asn Ser Asn Met Cys Leu Ser Ser Ser Glu Gly Gly Glu 210 215 220
Asp Leu Gin Arg Arg Ser Lys Leu Leu Ser Leu Leu Asp Ser Val Thr 225 230 235 240
Asp Ala Leu Val Trp Ala lie Ser Lys Thr Gly Pro Glu Leu Ser Ala 245 250 255
Ala Leu His Gin Thr Ser Pro Ser Ala His Ala Ala Leu Pro His Lys 260 265 270
Ala Pro Gin Arg His Gly Pro Pro Ala Leu His Glu Asp Glu Arg Trp 275 280 285
Phe Leu Cys Thr Thr Cys Cys Ser Leu 290 29權利要求
1. 一種稀有鮈鯽β型雌激素受體，其特征在于，所述受體具有SED IDNo.2所示的氨基酸序列。
2. —種編碼權利要求1所述的雌激素受體的基因，其特征在于，所述 基因具有SEDIDNo.l所示的核苷^列。
3. —種包含權利要求2所述基因的表達載體。
4. 一種檢測水生環境化學毒性的方法，其特征在于，所述方法包括 檢測水生環境中如權利要求1所述受體的表達水平。
5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述化學毒性是雌激 素效應。
6. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述化學毒性為基因轉 錄抑制。
7. —種用于診斷水生動植物疾病的試劑盒，其特征在于，所述試劑 盒包含檢測水生環境中如權利要求1所述的受體的表達水平的工具。
8. 根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述水生動植物為魚類。
9. 根據權利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，所述疾病為生殖 系統疾病。
10. 根據權利要求7至9中任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述 生殖系統疾病為性腺發育不完全、雌雄同體和/或性別逆轉。
全文摘要
本發明提供一種稀有鯽β型雌激素受體和編碼所述的雌激素受體的基因。本發明還提供了一種檢測水生環境化學毒性的方法和用于診斷水生動植物疾病的試劑盒，上述方法或試劑盒均涉及檢測水生環境中上述受體的表達水平。本發明適用于檢測水生環境化學毒性，以及診斷水生動植物疾病，尤其是診斷魚類的生殖系統疾病，從而實現調控魚類生殖能力的目的。本發明試驗結果表明，GrERβ基因的表達與雌激素效應具有劑量-效應關系，使得本發明的方法具有操作簡便、快捷、準確的優點。
文檔編號C07K14/72GK101469020SQ200710308510
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月29日 優先權日2007年12月29日
發明者張小艷, 查金苗, 王子健, 饒凱鋒 申請人:中國科學院生態環境研究中心