專利名稱：人血管內皮細胞生長因子受體3結合肽及其篩選方法
技術領域：
本發明屬于醫藥生物技術領域，涉及噬菌體隨機呈現肽庫的篩選、被篩選噬菌體的 親和性檢測和測序、多肽的合成、動物體內分布實驗、融合蛋白的表達、純化和體外活 性檢測等技術，具體涉及人血管內皮細胞生長因子受體3結合肽的篩選方法。
背景技術：
l.多肽導向技術1. 1多肽導向技術的概念和由來生物技術的快速發展大大促進了新藥發現與設計的速度，但體內用藥時，如何使藥 物特異性地到達病灶部位仍然是限制許多藥物由實驗室走向臨床的一大難題。藥物在其 它組織或器官的非特異性分布，不僅增大了體內用藥的劑量，使得藥物成本提高；而且 有可能損傷正常的組織或器官，引發毒副作用，這種毒副作用有時甚至是致死的。為了 克服這一難題，人們提出了導向性的治療策略，該策略的理論基礎是相對于正常的組織， 病灶部位(特別是腫瘤)具有自己獨特的表面分子，這些分子不僅是相對特異的而且常 常是高表達的，所以若給藥物連接上這些分子的配體或抗體，則借助于這些配體或抗體 和它們相應分子的結合，藥物便可特異性的被帶到病灶部位。該策略被認為是提高藥物 特異性的有效方法，目前導向性藥物的開發在藥物開發領域發展處于領先地位，僅以美 國為例，其導向性藥物的開發以13.2%的年增長率位居全美藥物市場的首位。已有文獻證明，最初作為導向性分子的為抗體，如轉鐵蛋白抗體，抗HER2抗體等與 藥物連接后都大大提高了藥物在病灶組織的富集。但是抗體由于分子量大作為導向性分 子有一些缺點，如易引發機體的免疫反應，滲透性差等，由此人們更傾向于利用小分子 肽作為導向性分子。可以作為導向性分子的肽包括兩大類， 一類是天然存在的肽，如生 長激素釋放抑制因子(somatostatin)、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide, VIP) 等，它們分別在神經內分泌腫瘤、消化道癌等的特異性診斷和治療方面發揮了良好的導 向性作用。另一類則是非天然存在的肽，與天然肽相比，該類肽的種類更多，鑒定更方 便，而且有可能比天然肽與其相應受體的親和力更高，故該類肽成為近年來人們關注的 熱點。噬菌體呈現技術則被認為是用于篩選該類肽的快速而有效的方法。1. 2噬菌體呈現隨機肽庫的構建及應用噬菌體呈現技術起源于Smith在1985年報道的辨外源多肽在單鏈噬菌體表面呈現 的結果，其原理是將編碼外源多肽或蛋白的基因片斷插入噬菌體衣殼蛋白的基因中，從 而將外源多肽或蛋白呈現于噬菌體表面。由于構成外源基因片段的脫氧核苷酸可以隨機 地排列組合，所以可以構建呈現不同外源多肽或蛋白的噬菌體表面呈現多肽或蛋白庫， 進而應用于酶底物、抗體和配體的篩選，蛋白間相互作用的研究以及疾病的診斷等方面。 近幾年來，該技術迅速發展，已成為生物學研究和應用領域中重要而有效的工具。可用于噬菌體表面呈現的載體很多，如T4噬菌體、A噬菌體及絲狀噬菌體等。其 中絲狀噬菌體呈現系統是目前最常用，發展最快的呈現系統。絲狀噬菌體是一類具有絲 桿狀形態的噬菌體，在分類中屬于絲桿噬菌體科(Inoviride)，絲狀噬菌體屬(Inovirus)。 用于表面呈現的噬菌體為一類特異性感染大腸桿菌的噬菌體，包括M13、 fd、 fl、 Ifl 和Ike等。它們具有相似的結構。以M13噬菌體為例，它的核心為6000bp的環狀單鏈 DNA,含IO個基因，分別編碼10種不同的蛋白。其中基因VIII編碼主要衣殼蛋白pVm， 基因m。 VI， VII， IX分別編碼次要衣殼蛋白pIII、 pVI、 pVII、 pIX。 M13噬菌體以其 次要衣殼蛋白pIII僅感染具F纖毛的大腸桿菌。絲狀噬菌體自身有許多適于構建多肽庫的特點。如它能夠接受在衣殼蛋白中插入外 源多肽，并將外源蛋白表達后呈現于病毒顆粒表面，便于被相應的受體或抗體識別。即 使外源序列干擾病毒的生活周期，也能通過雙基因或噬菌粒系統將多肽表達于表面，產 生攜帶野生型和重組衣殼蛋白的嵌合噬菌體。易于擴增，重組后的噬菌體能夠通過感染 大腸桿菌得到擴增。對于篩選到的能夠特異性結合某一靶分子的多肽噬菌體也能夠再感 染大腸桿菌，擴增后測序分析其核苷酸序列。噬菌體在各種洗脫條件(如低pH)下仍然 很穩定，可以感染形成很高的滴度(一般達到1012),這樣高的滴度足以代表庫中所有的 克隆。1. 3導向肽的篩選篩選是指用一些方法從噬菌體文庫中挑選出呈現了人們所需要的肽的噬菌體克隆。 一般情況下，第一輪篩選要投入一個庫容較大的庫，通過感染宿主菌，陽性噬菌體得到 擴增，然后進入下一輪篩選，從而使陽性噬菌體得到進一步富集。嚴謹性和產率 (stingency和yield)是兩個評定篩選效率的主要參數。 一般而言增加前者往往會導致 后者的降低。目前常用的篩選方法可分為兩類， 一類是體外篩選， 一類是體內篩選。當純化的耙蛋白易于獲得或高表達靶蛋白的細胞易于獲得時，人們常常選用體外篩選法來對噬菌體文庫進行篩選。該方法的基本流程為首先將篩選配基固定在固相載體 上，然后加入噬菌體文庫。其中呈現了與配基結合肽的噬菌體被捕獲于固相載體上，而 不與配基結合的噬菌體則被洗去。再用洗脫液洗脫結合的噬菌體并感染大腸桿菌得以擴 增，擴增后的噬菌體進入下一輪循環。親和配基的固定可采用許多種固相支持物，如表 面吸附的聚丙乙烯皿或管，硝酸纖維膜和磁性珠，可滲透的珠狀瓊脂糖凝膠等。洗脫的 方法也有多種，常用的有低pH的緩沖液洗脫法和用配基的已知配體與噬菌體競爭的競 爭洗脫法。在有些情況下，某些抗原及標志物不易確定，獲得純化就更加困難。此時體 內篩選是比較合適的選擇。體內篩選的優點是其是在體內進行的，所以肽結合的蛋白完 全保持了它們的活性狀態，但是篩選出的肽究竟是與何種分子結合還有待于進一步確 定。它的基本過程是將噬菌體肽庫經尾靜脈注射入小鼠，待噬菌體在體內循環適宜時 間后，通過心臟對小鼠進行全身灌注，然后收集靶器官中的噬菌體，經體外擴增純化后 再注射給小鼠，進行下一輪淘篩， 一般為3-4輪，直到噬菌體得到富集，挑取單克隆，對噬菌體表面呈現片段進行測序，推導其序列的同源性。利用體內篩選法，人們發現了 許多器官和組織特異性結合的肽。1. 4導向肽的應用由于導向肽可以特異性的識別靶向分子或靶向組織，所以，無論是在疾病的診斷還 是在疾病的治療中都有著廣闊的應用前景。在疾病診斷中方面，由于腫瘤表面分布的標志性分子可以有效的將腫瘤和其它器官 和組織區分開來，而導向多肽具有和這些標志性分子特異性結合，因此，將這些短肽與 造影劑、放射性元素等相連后用于腫瘤診斷，可使得診斷更加的方便、快捷和靈敏。目 前許多實驗室和公司正在積極的開發這樣的短肽。如Campa等以內皮生長因子受體的變 種III (epidermal growth factor receptor, EGFR)為靶分子從噬菌體呈現肽庫中篩選出與 之結合的肽用于腫瘤的診斷，實驗表明，陽性肽在低劑量GOnmol/l)時仍然可以特異 而高親和力的與EGFR變種III結合，是十分理想的診斷分子。我們利用人轉鐵蛋白受 體對噬菌體呈現12肽庫進行篩選，動物體內分布實驗表明，篩選出的肽在腫瘤組織的富 集率是正常組織的5倍，在腫瘤的診斷中有一定的應用前景。在疾病的治療方面，許多導向性的藥物已進入臨床試驗階段或正在試驗室研究中。1)導向性化療藥物化療藥物如阿霉素、道諾霉素等在腫瘤的治療中一直具有很好的作用，但是，由于 它們對正常的細胞往往也有很強的殺傷力，故在臨床應用中常常受到限制。如果將這些 化學藥物與腫瘤表面特異性分子的結合肽相連構建成導向性的藥物，則可以大大降低已有化療藥物用藥劑量，減少的其毒副作用，并且可以使得一些具有潛在腫瘤治療價值但受其毒副作用限制而未能走向臨床的化療藥物走向應用。如Wadih等將腫瘤血管內皮細 胞特異性結合肽RGD-4C與阿霉素相連構建導向性的藥物RGD-4C-阿霉素，以乳腺癌小 鼠為動物模型，動物實驗顯示與單一的阿霉素相比，RGD-4C-阿霉素的用藥量顯著降低， 用藥量在單一阿霉素用量的1/40時便可以使腫瘤細胞發生壞死，而在這一藥物劑量下， 單一阿霉素對腫瘤是沒有作用的。2)導向性蛋白藥物基因工程的發展使得許多蛋白分子如細胞因子等在腫瘤的治療中發揮著越來越重要 的作用。干擾素、腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor， TNF)等在相關腫瘤的治療中都 顯示出了良好的應用前景，但是有些生物分子在體內可能誘發嚴重的毒副反應，如何降 低它們的毒復作用已成為醫藥工作者共同關心的問題。多肽導向技術是解決這一問題的 有效策略之一。Flavio等將腫瘤血管內皮細胞特異性結合肽NGR與TNF相連構建融合 蛋白NGR-nSfF，在臨床實驗中NGR-TNF相對于天然TNF，對腫瘤的殺傷力顯著提高， 而用藥量僅為天然TNF的1/30。 Meng等利用基因工程的方法構建了導向性干擾素 IFN-a2a-NGR，體內分布實驗表明相對于普通干擾素，導向性干擾素可以特異性的富集 于腫瘤組織。并且導向性干擾素的劑量在普通干擾素劑量的1/3時，即可達到與普通干 擾素同樣的治療效果。此外，急性毒性實驗表明導向性干擾素在動物體內不會引起明顯 的毒副作用；導向性干擾素的藥代動力學行為與普通干擾素一致。目前IFN-a2a-NGR己 授權獲得專利批準號。Tumstatin (膠原IVa3鏈的非膠原區域1)是一種內源性血管生長 抑制因子，Tum-5是由Tumstatin接近N端的54-132位氨基酸組成的，它是Tumstatin 抗血管形成的功能結構域。Ma等用基因工程的方法構建了 Tum5-NGR。在昆明種小鼠 體內接種瘤細胞S180，建立腫瘤模型，結果表明當劑量為lmg/kg時，Tum-5-NGR 的抑瘤效果優于Tum-5，抑瘤率分別為37.78%和26.83%，與對照組相比，均有明顯差 異(尸<0.01)。免疫組化結果顯示，與Tum-5相比，Tum-5-NGR能更好的在腫瘤新生血 管處富集。3)導向性基因治療藥物近年來，基因治療成為繼蛋白類藥物之后又一個治療腫瘤的有效方法。基因治療的 成功依賴于基因傳遞載體的有效性，該載體必須可以特異的將目的基因轉入足量的腫瘤 細胞內以發揮治療作用。但是目前基因治療所常用的大部分病毒載體的特異性都不是十 分讓人滿意，而導向性的基因傳遞系統則是解決之一問題的可能方法。如Stuart等以人 臍靜脈細胞為靶細胞，從噬菌體呈現肽庫種篩選到與之特異性結合的肽SIGYPLP，當該 肽與基因傳遞載體腺病毒相連后，與單一的腺病毒相比，SIGYPLP-腺病毒的基因轉染效 率提高了 15.5倍。White等則從噬菌體肽庫中篩選到與凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體 (thelectinlikeoxidizedLDLreceptor, LOX-l)特異性結合的肽LSIPPKA、 FQTPPQL和 LTPATAI。 LOX-l是一個在高血壓患者的血管內皮細胞上上調的分子，實驗表明當將篩 選獲得的肽與腺病毒相連后可以大大提高腺病毒轉染的效率和特異性，這些肽有可能用 于以LOX-l為靶點的心血管疾病的基因治療中。 2.血管內皮生長因子受體3的研究進展 2. l血管內皮生長因子受體3及其配體血管內皮生長因子受體3 (vascular endothelia growth factor receptor 3， VEGFR-3， 又稱FLT4)是血管內皮生長因子受體家族的新成員，該家族是一類與血管發生密切相 關的蛋白，均屬于m型受體酪氨酸激酶(RTKs)亞家族。目前已發現的血管內皮生長 因子受體(VEGFR)有VEGFR-1(又稱Flt-1) 、VEGFR-2 (又稱Flt-1/ KDR)和VEGFR-3 (又稱Flt-4)。VEGFR-3是迄今為止該家族最新的一個成員，其基因是1992年由Galland 等從人白血病細胞及胎盤cDNA文庫中克隆得到的一種新基因，該基因位于染色體 5q34-q35，共含有31個外顯子，分別編碼三個不同的區域，其中1 1 5號外顯子編碼 胞外區，16號外顯子編碼跨膜區，17 31號外顯子編碼胞內區。除去24氨基酸殘基 的信號肽，成熟的VEGFR-3含有1274個氨基酸殘基,包括膜外域(751aa)，跨膜域(22aa) 和胞內域(482aa)，胞內域是兩個酪氨酸激酶結構區，中間被一長肽隔開。目前己經發現的VEGFR-3的兩個配體為血管內皮生長因子C和D (vascular endothelia growth factor receptor C/D， VEGF-C和VEGF-D)。人類VEGF-C基因位于染色體4q34， 其全長的cDNA序列是從前列腺癌細胞系PC-3細胞cDNA文庫內篩選克隆得到。VEGF-C 的cDNA的開放閱讀框架編碼一種含有419個氨基酸殘基的蛋白，其分子量約46.9kD。 VEGF-C也具有刺激內皮細胞遷移、提高血管的通透性以及刺激內皮細胞增殖的能力， 但是相對于VEGF, VEGF-C需要更高的濃度才能發揮這些作用。在胚胎期的小鼠體內可以觀察到VEGF-C出現在新生淋巴管出芽的位置，提示VEGF-C參與了淋巴管的形成；不 僅如此許多研究表明VEGF-C在淋巴管形成前就己存在了，并且在血管的形成中也發揮 著重要作用。此外在活化的巨噬細胞上也可以檢測到VEGF-C的表達。VEGF-D (也被稱為c-fos誘導的生長因子或FIGF)是最新發現的VEGF家族的成 員。VEGF-D基因定位在染色體21Xp22.31上，其基因序列與VEGF-C、 VEGF165、 VEGF167以及PIGF分別有48%、 31°/。、 28%和32%的同源性。人VEGF-D的cDNA序 列含有419bp，其開放閱讀框架編碼含有354個氨基酸的蛋白。VEGF-D與VEGF-C有 61%的同源性，并且同VEGF-C—樣，VEGF-D在人體內既可以和VEGFR-2結合也可以 和VEGFR-3結合。在研究中發現VEGF-D也具有刺激內皮細胞增殖的能力、刺激血管 新生和淋巴管新生的能力。但是目前關于生理條件下VEGF-D的表達還未得到很好的闡 明，僅發現其mRNA存在于發育中的成纖維細胞和黑色素細胞，肺的間質及成年人的血 :管壁。2. 2 VEGFR-3與腫瘤隨著研究的深入，發現VEGFR-3在許多腫瘤中也是高表達的，如Kaposi's肉瘤、 血管皮膚腫瘤、乳腺癌、鼠肝癌和轉移性腺癌、鼻咽癌、結腸癌和卵巢癌等。在腫瘤中 高表達的VEGFR-3對腫瘤的生長有何意義呢？這是一個引起了許多研究者濃厚興趣的 問題，大部分的實驗一致認為VEGFR-3促進了腫瘤的生長和轉移。Yonemum等用RT-PCR和免疫組化的方法對85例胃癌患者體內VEGF-C和 VEGFR-3的表達進行了研究，結果發現VEGF-C和VEGFR-3的表達和淋巴結狀況、淋 巴的浸潤、靜脈的侵襲、腫瘤浸潤之間存在強烈的正相關性。這些結果顯示癌細胞產生 的VEGF-C通過和VEGFR-3的相互作用誘導了淋巴管的增殖和擴張，導致了癌細胞入 侵淋巴管并發生淋巴結的轉移。Huang等利用原位雜交的方法對29例淋巴管瘤患者腫瘤 組織中VEGF和VEGFRmRNA的表達進行了檢測，研究結果表明VEGF-C和它的受體 VEGFR-3， VEGFR-2在淋巴管瘤鄰近相連組織中發現。相反，在血管瘤、血管肉瘤或小 腸/大腸的正常淋巴管的內皮細胞中，很少或沒有VEGF-C， VEGFR-3和VEGFR-2 mRNA 的表達。這些結果提示，VEGF-C和其受體可以經自分泌或旁分泌的調控在淋巴管瘤的 形成中發揮作用。在動物模型中對VEGFR-3及其介導的信號轉導和腫瘤生成以及轉移的關系進行了 更為深入研究。目前，研究方法主要有兩種，其一是將VEGFR-3的配體VEGF-C或VEGF-D轉染腫瘤細胞，然后觀察腫瘤細胞形成的實體瘤組織中和腫瘤鄰近組織中的淋巴管的形 成情況，并評價腫瘤細胞是否侵入了淋巴結。例如，Skobe等人將VEGF-C轉染乳腺癌細 胞，然后將該細胞種入小鼠體內進行研究，他們觀察到腫瘤組織內的淋巴管密度增加了， 同時腫瘤細胞向淋巴結和肺部的轉移率也提高了。在其它類似的動物模型中，不僅同樣 觀察到了腫瘤中新生淋巴管的密度增加，而且觀察到了在這些新生的淋巴管中有腫瘤細 胞的浸潤，并且這些浸潤的腫瘤細胞通過新生淋巴管轉移到了遠處淋巴結。Mandriota等 建立了一種胰腺癌的轉基因小鼠，腫瘤中高表達的VEGF-C導致了腫瘤的淋巴管新生和 遠處轉移。而若用抗VEGF-C/D的抗體阻斷VEGFR-3和配體的結合則可以阻斷腫瘤中淋 巴管的生成和腫瘤的淋巴結轉移。另外一種用于評價VEGFR-3介導的信號轉導通路與腫瘤轉移關系的動物模型也已 經被很好的建立起來了。與第一種方法不同的是，在這種動物模型中不用那些轉染了 VEGF-C/D的腫瘤細胞，而是直接選擇那些具有高度轉移能力的腫瘤細胞來構建荷瘤動 物模型，然后研究對VEGFR-3及其信號轉導通路的阻斷對腫瘤轉移的影響。如人肺癌 細胞NCI-H460-LNM35是一種具有高度轉移能力的腫瘤細胞，將表達可溶性VEGFR-3 的基因轉染入該細胞中，結果發現該轉染細胞的淋巴結浸潤能力和遠端轉移能力遠遠低 于未轉染的對照細胞。而且，即使對于未轉染的NCI-H460-LNM35細胞構建的腫瘤動物 模型，如果給予表達VEGFR-3的腺病毒進行治療的話，其轉移能力也被有效的抑制了。 同樣，Krishnan等將表達可溶性VEGFR-3的基因轉染具有高度轉移能力的乳腺癌細胞 MT-450細胞，然后構建荷瘤大鼠模型進行研究，其結果與He等的結果是一致的。最近， Lin等用RNA干擾技術抑制黑色素瘤細胞中VEGFR-3的配體之一 VEGF-C的表達，結 果發現這種RNA介導的基因沉默技術可以抑制腫瘤淋巴管的形成和腫瘤向肺部的轉移。 Hajime等制備了一種大鼠抗小鼠VEGFR-3的特異性抗體AFL4，然后將大鼠C6膠 質瘤細胞種植于裸鼠皮下構建荷瘤小鼠模型，分別用大鼠抗小鼠VEGFR-2的特異性抗 體Avasl2、 AFL4和PBS對照給予治療，研究結果發現與當Avasl2的劑量在600ng/只 時,腫瘤的體積為1027mn^,而同等劑量AFL4治療的小鼠體內腫瘤的體積僅為296mm3， 甚至當AFL4的治療劑量僅為200ng/只時，小鼠體內腫瘤的體積僅為488mm3，遠遠小 于Avasl2治療組，這表明抗VEGFR-3的單克隆抗體具有更好的抑制腫瘤生長的能力。 在另外一種由人的前列腺癌細胞PC-3構建的荷瘤裸鼠模型中，抗VEGFR-3單克隆抗體 治療的小鼠腫瘤生長完全被抑制。為了進一歩闡明AFL4抑制腫瘤生長的機理，Hajime還在實驗中比較了對照組和AFL4治療組小鼠體內腫瘤的血管密度以及血管內皮的形 態，研究發現AFL4治療組中腫瘤的血管密度小于對照組，并且，相對于對照組，AFL4 治療組中腫瘤新生血管的內皮細胞缺乏很好的連接，從而提示VEGFR-3可能參與了對 腫瘤新生血管完整性的維持，從而在腫瘤的生長中發揮著重要的作用，而AFL4正是通 過破壞這種作用而實現了對腫瘤生長的抑制。Bronislaw等的實驗也得到了相似的結果， 而且他們還在實驗中發現抗VEGFR-3的單克隆抗體并不影響正常的血管和淋巴管。以上實驗強烈提示VEGFR-3及其配體在腫瘤的生長和轉移中發揮了重要的作用， 阻斷VEGFR-3和其配體的結合有可能是腫瘤治療新的有效策略。目前已有許多公司正 在這方面進行積極的嘗試，如Pytowski等制備了抗人VEGFR-3的抗體并觀察到該抗體 具有阻斷成人淋巴管再生的功能。除了抗體之外，針對VEGFR-3信號轉導通路設計的 小分子激酶抑制劑的研究也在進行之中，比如BAY43-卯06 ， CEP-7055 ， PTK787/ZK222584等正在進行臨床實驗，這些藥物的成功研制有望為腫瘤的治療帶來新 的希望。發明內容本發明的目的在于，利用已商品化的VEGFR-3為靶分子從噬菌體呈現環7肽庫中篩 選出與VEGFR-3結合的肽，化學合成該肽，通過體內體外試驗對肽的性質進行研究。從 而為以VEGFR-3為靶點的抗腫瘤導向性藥物的開發和設計提供新的策略。為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是人血管內皮細胞生長因子受體3結合肽，以商品化的hVEGFR-3為靶分子，在噬菌 體呈現環7肽庫中篩選得到與其高親和力的三種環7肽，其特征在于，包括下列三種環 7肽之一，其氨基酸序列分別如下Cys Ser Asp His Trp His Tyr Trp Cys;Cys Ser Asp Tyr Asn His His Trp Cys;Cys Ser Asp Trp Gin His Pro Trp Cys<>上述的三種多肽與hVEGFR-3的天然配體VEGF-C和VEGF-D的蛋白序列及基因序 列無任何同源性，與hVEGFR-3具有特異的親和性。實現上述多肽的篩選方法，其特征在于，按以下步驟完成 a)噬菌體呈現環7肽庫的篩選以O.lmol/L的NaHC03， pH8.6， 100pg/mL配制的VEGFR-3和IgGlFc溶液包被 ELISA板孔置于濕盒中輕輕搖動，4。C孵育。過夜后，將96孔板倒扣在潔凈的紙巾上，輕扣除盡殘余液體；然后用1。/。牛血清白蛋白的TBS， 50mMTris—HCl， pH7.5， 4。C孵 育，封閉2h,再采用0."/。Tween20的TBST洗滌6次，每次均要將96孔板倒扣在潔凈的 紙巾上，輕扣除盡殘余液體。將200 nl用TBST稀釋的含2xlO"pfo噬菌體溶液加入IgGlFc 包被孔，室溫孵育lh。輕輕吸出未與IgGlFc包被孔結合的噬菌體，加入到已封閉好的 VEGFR-3包被孔，室溫孵育lh。傾去液體，去除未結合的噬菌體，再用TBS+0.1%Tween 20洗滌10次，每次均要將96孔板倒扣在潔凈的紙巾上，輕扣除盡殘余液體；用10(HiL 洗脫液洗脫結合的噬菌體，其洗脫液配方為0.2mol/LGlycine-HCl， pH2.2, 10g/LBSA， 并迅速加入配方為lmol/LTris-HCI， pH9.1的中和液中和；取lpL測滴度，剩余液體加 入20 mL處于對數生長早期的ER2738培養物(大腸桿菌ER2738; 20mg/L四環素的5mL LB培養基胰蛋白胨10g/L酵母提取物5g/L NaCl 10g/L)中，于37'C劇烈振蕩培 養4,5h，得到擴增的噬菌體；將擴增好的噬菌體和大腸桿菌的混合液倒入離心管，于4'C， 10000rpm離心10min; 上清轉入新的離心管，再離心，取80%的離心上清轉入新的離心管，加入l/6體積的 PEG8000/NaCl，其配方為PEG-8000200mg/mL， NaC12.5M， 4。C靜置過夜；次日， 4°C， 10000rpm離心15min，傾去離心上清；再同法快速離心一 下，吸盡殘留上清；1 mLTBS 重懸沉淀，于4°C 10000rpm離心5min，將殘留的細胞沉淀下來；上清加入l/6體積的 PEG/NaCl，冰浴lh， 4°C， 10000rpm離心15min，傾去上清，用200 pL含0.01 %NaN3 的TBS重懸沉淀，10000rpm離心lmin;上清即為擴增好的洗脫液，lpL用于測滴度， 余下的液體于4。C存放；200nLVEGFR-3和IgGlFc溶液各新包被一孔，用于下一輪篩選，為了提高篩選肽 的嚴謹性，第二輪和第三輪篩選中，VEGFR-3的濃度分別降至50mg/L和20mg/L;重 復以上篩選步驟，第二輪和第三輪的篩選中，加入的第一輪和第二輪篩出的噬菌體應根 據滴度計算相當于2xl()UpfU噬菌體的液體體積；將TBST中Tween的濃度提高至0.5%; 第三輪的洗脫產物不需進行擴增，取lpL進行滴度測定，剩余存放于4。C;從滴度測定中，菌斑數〈100的平板上隨機挑取60個分隔良好噬菌斑進行擴增和純 化，既用無菌牙簽蘸取的50個分隔良好的藍色噬菌斑分別放入對數中期培養的ER2738 中，37'C劇烈振蕩培養4.5h后，瞬間離心30s。新的離心管，同法再離心一次，取80% 的上清，即得擴增的噬菌體液體；b)特異性噬菌體篩選以100mg/L的NaHC03 (pH8.6)稀釋的VEGFR-3包被96孔酶聯板，同時對每個 孔設立1% BSA對照孔，同型的IgGl對照孔，4'C孵育過夜;傾去包被液,加入5mg/L BSA，0.1mol/LNaHCO3， pH8.6的封閉液，4'C封閉2h，以步驟l)中的TBST洗6次，每次 均要除盡殘余液體；將60個純化的lX10"孔噬菌體分別加入NaHCO3 (pH8.6)稀釋的 VEGFR-3、 IgGlFc和BSA包被孔中室溫孵育2h。 TBST洗6次，每孔加入HRP標記的 小鼠抗M13噬菌體mAblOOixL，其比例1:5000，室溫孵育lh; TBST洗6次，鄰苯二 胺顯色并用2mol/L硫酸終止反應后測定A490nm處的吸光值； c)噬菌體呈現肽的序列測定根據ELISA結果，篩選出29個與VEGFR-3有較高親和力而與其他對照親和力低的 克隆進行序列測定；噬菌體克隆的擴增同前，取噬菌體培養上清；常規提取噬菌體單鏈 DNA，以單鏈DNA為模板，采用噬菌體隨機肽庫試劑盒中所提供的測序引物，引物序 列為5'—CCCTCATAGTTAGCGTAACG"3'，在ABI310 DNA自動測序儀上進行自動測 序，根據DNA測序結果，推導出噬菌體所呈現隨機肽的氨基酸序列，比較不同克隆之 間氨基酸序列的同源性，即可得到篩選的三種多肽。選擇其中表現最好的噬菌體及其呈現的肽(CSDSWHYWC)為代表進行進一步的研 究，研究表明本發明的肽可以在特異性的與VEGFR-3分子、VEGFR-3陽性的細胞結合， 并且動物試驗表明該肽可以特異性的富集于VEGFR-3陽性的腫瘤組織中。本發明制備的肽可以特性的與VEGFR-3結合，將其他藥物與該肽連接后，可以提 高藥物在VEGFR-3藥物在病灶組織中的匯集度，從而降低藥物的用量，減輕其毒副作用， 提高藥物的療效。
圖1是篩選出29個與VEGFR-3有較高親和力而與其他對照(同型IgGl對照，BSA 對照)親和力低的噬菌體克隆的ELISA結果黑色框為陽性噬菌體與VEGFR-3的結合結 果；灰色框為與同型IgGl的結合結果；白色框為與封閉液牛血清白蛋白BSA的結合結 果。圖2是選擇表現最好的噬菌體Phagel進行研究的結果。ELISA結果表明Phagel可 以特異性地與VEGFR-3結合，而不與VEGFR-2或VEGFR-1結合。黑色框代表Phagel與 不同受體的結合，白色框代表對照噬菌體與不同受體的結合。圖3是Phagel在荷瘤小鼠體內的分布試驗。實驗結果顯示歸巢于腫瘤組織(VEGFR-3 高表達)中的Phagel是對照噬菌體的2. 38倍，這一比值高于歸巢于其它組織的Phagel 與對照噬菌體的比值，說明Phagel在VEGFR-3高表達的腫瘤組織。圖4是對表現最好的噬菌體Phagel呈現的多肽PI (CSDSWHYWC)化學合成后進 行研究的結果。ELISA結果表明PI可以特異性地與VEGFR-3結合，而不與VEGFR-2或VEGFR-1結合。黑色框代表P1與不同受體的結合，白色框代表對照多肽與不同受體的結合。圖5是化學合成FTIC-P1與VEGFR-3高表達細胞的結合結果。實驗表明FTIC-P1可 以特異性的與VEGFR-3高表達細胞HT29結合，并且結合與細胞的細胞膜上；而不與 VEGFR-3陰性的細胞結合。A-C，對照多肽P5不與對照細胞EVC304反應；D-F，陽性 多肽Pl不與對照細胞EVC304反應；G-I，對照多肽P5不與陽性細胞HT29細胞反應； J-K，陽性多肽P1特異性識別陽性細胞HT29細胞。左列，單獨FTIC熒光成像，中列， 單獨PI成像，右列，二者重疊。圖6是FTIC-P1在荷瘤小鼠體內的分布試驗圖片。實驗結果顯示與對照多肽相比 FTIC-Pl可以特異性的匯聚于腫瘤組織(VEGFR-3高表達)中，而在其他組織中，FTIC-P1 與對照多肽的分布行為沒有明顯差別。左列，單獨FTIC熒光成像，中列，單獨PI成像， 右歹!j， 二者merge 0以下結合附圖和實施例對本發明作進一步的詳細描述。
具體實施方式
依照本發明的技術方案制備的人VEGFR-3結合肽，應用親和篩選的方法利用 VEGFR-3為耙分子，在噬菌體隨機呈現環7肽庫(BioLabs , New England)中篩選得 到高親和力的7肽Cys Ser Asp His Trp His Tyr Trp Cys (半胱氨酸-絲氨酸-天冬氨酸-絲氨酸-色氨酸-組氨酸-酪氨酸-色氨酸-半胱氨酸)。實現本發明的肽庫篩選和檢定工作，按以下步驟完成 3. 1.噬菌體隨機呈現環7肽庫的篩選噬菌體隨機環7肽庫(Ph. D. —7 Phage display p印tide library):購自美國New England Biolabs公司，其滴度為1. 5X 1013噬斑形成單位(pfu) /mL;多樣性2.7X109 transformants。宿主菌為大腸桿菌E. coli ER2738,攜帶有可被噬菌體感染的F'因子， 具有四環素抗性，可與呈現了 12肽的噬菌體形成a互補。測序引物(-96glIIsequencirig primer)序歹U為ccctcatagttagcgtaacg。 3. 1. l噬菌體滴度的測定(1) E,coliER2738的培養以無菌操作技術從ER2738大腸桿菌的甘油凍存物中 挑取一接種環，接種于四環素抗性的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L， 瓊脂15g/L， NaCl: 10g/L)上，37'C培養24h,待平板上可見白色透亮的菌落形成后， 將基本培養平板置于4°C保存。(2) 平板上挑取E. coli ER2738單菌落接種于含20mg/L四環素的5mL LB (胰蛋白 胨10 g/L酵母提取物5 g/L NaCllO g/L)培養液中，37'C振蕩培養至對數生長中期(0D600 約為0.5)。(3) 將噬菌體用LB進行10倍連續梯度稀釋。對于擴增后的噬菌體培養上清，稀 釋108-10"倍；對于未擴增的篩選洗脫液，稀釋10'-104倍。(4) 每份稀釋的噬菌體樣品各取1(^1，分別加入步驟(2)培養好的細菌中(20(^1)， 快速混勻，室溫孵育lmin 5min。(5) 各感染的細菌分別移入45'C預溫、含有頂層瓊脂3—5ml (胰蛋白胨10g/L， 酵母提取物5 g/L， NaCllO g/L， MgCl2 6H201 g/L,瓊脂糖7 g/L)的培養管中，加 入40 pi 20 mg/mL的X-gal和16 pi 50mg/mL的IPTG,充分混勻，然后迅速倒入預溫 的LB平板，傾斜使頂層瓊脂均勻分布。(6) 將平板放置5min，使溫度降低，然后反轉平板，37'C孵育過夜。 觀察平板，計數藍色噬斑并乘以該平板中噬菌體樣品的稀釋倍數，得到每10nl噬菌體的滴度，以藍色噬斑形成單位表示(plaque forming units, pfu)。 3. 1. 2.生物淘洗(1) 在96孔板中加入200|li1用O.lmol/1的NaHC03(pH8.6)稀釋的VEGFR-3和 IgGlFc溶液(100ng/ml)。置于濕盒中輕輕搖動，4'C孵育過夜。(2) 預先接種ER2738于10 ml (測滴度用)和含四環素的20 ml (擴增噬菌體用) 的LB中，37。C培養。(3) 將2.1中的96孔板取出，傾去液體，將96孔板倒扣在潔凈的紙巾上，輕扣 除盡殘余液體。(4) 加入200|xl封閉液(含1%BSA的TBS)， 4°C孵育2h。(5) TBST (TBS+0.1%Tween)洗滌6次，每次均要將96孔板倒扣在潔凈的紙 巾上，輕扣除盡殘余液體。(6) 將200 nl用TBST稀釋的含2xl()Upfix噬菌體溶液加入IgGlFc才包被孔，室 溫孵育lh。(7) 輕輕吸出未與IgGlFc包被孔結合的噬菌體，加入到已封閉好的VEGFR-3 包被孔，室溫孵育lh。(8) 傾去液體去除未結合的噬菌體，TBST洗滌10次，每次均要將96孔板倒扣 在潔凈的紙巾上，輕扣除盡殘余液體。(9)用100^1洗脫液(0.2mol/LGlycine-HCl， pH2.2， 10g/LBSA)洗脫結合的 噬菌體，并迅速加入中和液(lmol/lTris-HClpH9.1)中和；取liul測滴度，剩余液體加 入20ml處于對數生長早期的R2738培養物中，于37'C劇烈振蕩培養4.5h，進行擴增。(10) 將擴增好的噬菌體和大腸桿菌的混合液倒入離心管，于4'C， lOOOOrpm離 心lOmin。將離心上清轉入新的離心管，同法再離心一次，取80%的離心上清入新的離 心管。(11) 在離心管中加入1/6體積的PEG8000/NaCl，于4。C靜置過夜。(12) 次日取出PEG8000/NaCl沉淀好的液體，于4。C， 10000rpm離心15min，小 心的傾去離心上清；再同法快速離心一下，用微量移液器吸盡殘留上清。(13) 用lml TBS重懸離心沉淀，將重懸液轉入小離心管中，于4'C10000rpm離 心5min以將殘留的細胞沉淀下來。(14) 將離心上清移入新的小離心管中，加入l/6體積的PEG/NaCl冰浴lh。 4'C， 10000rpm離心15min，小心的傾去離心上清；再同法快速離心一下，用微量移液器吸盡 殘留上清。(15) 用200nl含0.01。/。NaN3的TBS重懸沉淀，10000rpm離心lmin以沉淀 那些不能溶解的物質。將上清移入新的離心管，即為擴增好的洗脫液，lpl用于測滴度， 余下的液體于4'C存放。(16) 用200pl目的蛋白溶液新包被96孔板一孔，用于下一輪篩選，為了提高篩 選肽的嚴謹性，第二輪和第三輪篩選中，目的蛋白的濃度分別降至50mg/l和20mgA。(17) 觀察步驟2.15中測滴度的結果，計數藍斑的數量以確定噬菌體的滴度。根 據該滴度計算相當于2xl0Upfii噬菌體的液體體積。(18) 進行第二輪篩選，重復步驟2.16，并將TBST中Tween的濃度提高至0.5%。(19) 用200pl VEGFR-3和IgGl Fc溶液新包被96孔板一孔，用于第三輪篩選。 重復步驟2.9， TBST中Tween20的濃度為0.5%,第三輪的洗脫產物不需進行擴增，取 lpl進行滴度測定，剩余存放于4。C。從滴度測定中，菌斑數小于IOO的平板上隨機挑 取50個分隔良好噬菌斑按下列方法進行擴增和純化，此時應注意挑取的噬菌斑培養的 時間不能超過18h。經過三輪篩選，特異性噬菌體進一步被富集，得到的噬菌體滴度逐步升高。第一輪The average: 1.0x106 pfu第二輪The average: l.lxio8 pfu第三輪The average:6.0x108 pfu3. 1. 3.噬菌體特異性篩選(噬菌體ELISA)在這挑選出的50個克隆中利用噬菌體ELISA進一步挑選與VEGFR-3高親和力的克隆。(1) 以lOOmg/L VEGFR-3 (Na線PH8.6)包被96孔酶聯板，每孔200叱，同時 對每個VEGFR-3孔設立1% BSA的包被孔對照，并對每個孔再包被一個同型的IgGl為陰 性對照，4t孵育過夜。(2) 傾去包被液，加入封閉液(5mg/L BSA， 0. lmol/L NaHC03， pH 8.6)， 4。C封 閉2h。(3) 傾去封閉液，TBST洗6次，每次均要將96孔板倒扣在潔凈的紙巾上，輕扣除 盡殘余液體。(4) 將50個純化的噬菌體(1X107孔)分別加入Rituximab， BSA和IgGl包被孔 中室溫孵育2h。(5) TBST洗6次，每孔加入服P標記的小鼠抗M13噬菌體raAb (1:5000) 100uL， 室溫孵育lh.(6) TBST洗6次，OPD (鄰苯二胺)顯色并用2mol/L硫酸終止反應后測定A4卯nm 處的吸光值顯色后測定A410nm處的吸光值。3. 1. 4.噬菌體呈現肽的序列測定根據50個克隆的ELISA結果，篩選出29個與VEGFR-3有較高親和力而與其他對照 親和力低的克隆(結果見圖1)進行序列測定。(1) 噬菌體單鏈DNA的提取噬菌體克隆的擴增同前，取噬菌體培養上清。用華舜公司生產的單鏈DNA提取試劑 盒進行噬菌體單鏈DNA的提取，按操作說明書進行操作在含有單個噬菌體克隆的LB 培養液中加入沉淀液,高速離心后得到噬菌體顆粒沉淀，加入裂解液裂解噬菌體外殼蛋 白，經過樹脂純化，洗脫得到噬菌體單鏈DNA，紫外定量其濃度大于100ng/uL。(2) Sanger雙脫氧鏈終止法測定DNA序列以單鏈DNA為模板，采用噬菌體隨機肽庫試劑盒中所提供的測序引物，引物序列為 5'—CCCTCATAGTTAGCGTAACG—3'，在ABI 310 DNA自動測序儀上進行自動測序。(3) 呈現隨機肽氨基酸序列的推導及氨基酸同源性分析根據DNA測序結果，推導出噬菌體所呈現隨機肽的氨基酸序列，得出三種序列(P1， P2， P3)如下。比較不同克隆之間氨基酸序列的同源性。Pl:Cys Ser Asp His Trp His Tyr Trp Cys;P2'. Cys Ser Asp Tyr Asn His His Trp Cys;P3: Cys Ser Asp Trp Gin His Pro Trp Cys。 3. 2.噬菌體Phagel的鑒定 3. 2. 1. Phagel與VEGFR-3的特異性結合(1) 以VEGFR-1 、 VEGFR-2和VEGFR-3分別包被ELISA孔(100ug/孔)，封閉、 洗滌的過程同上。(2) 將純化的噬菌體Phagel (噬菌體Phagel為ELISA中表現最好的陽性噬菌體， 下同)和對照噬菌體(第一輪淘洗中未結合的噬菌體，下同)，分別加入VEGFR-l、 VEGFR-2和VEGFR-3包被孔中，100^1/孔(其滴度為1.9x108pfii/l00^1)，室溫孵育2h。(3) 洗滌過程同上，每孔加入HRP標記的小鼠抗M13噬菌體單克隆抗體(1:5000) IOOW，室溫孵育lh。(4) TBST洗6次，OPD顯色后測定A490nm處的吸光值(結果見圖2)。 3. 2. 2. Phagel在荷瘤小鼠體內的分布試驗(1) 構建荷瘤裸鼠模型在裸鼠右腹股溝皮下接種5xl()S個/只的HT-29細胞，兩 周后觀察，腫瘤成長約lxO.lcm，可用于實驗。(2) 將含10"pfo噬菌體Phagel及無關噬菌體的10(^1 TBS，尾靜脈注入小鼠體內。(3) 噬菌體在小鼠體內循環2-5min后，戊巴比妥鈉150mg/kg腹腔注射麻醉。然 后橫隔水平切開皮膚，暴露全部胸壁，剪斷胸骨，注意避免損傷心臟和大血管。(4) 充分暴露心臟后，通過左心室用靜脈針穿刺入主動脈，針管內有回吸的血液 后緩慢推入已預溫37°C的50 ml生理鹽水，同時在右心耳處剪開一小口，可見血液流出， 直至流出的血液變成淡紅色為止。(5) 取出鼠皮下的瘤塊及對照組織，稱重，加入存放于4"C的1 mlPBS-PMSF， 用組織勻漿器小心研磨。(6) 把勻漿移入50ml離心管，加入5 ml在0。C預冷的PBS-PMSF (含1XBSA)洗 3次渦旋10s以充分混合組織和洗滌液，3000-4000 rpm離心4-5 min,小心吸出上清，注意每次加洗滌液前要振蕩，以充分洗滌勻漿沉淀。操作時使樣品保存于冰塊上。(7) 把組織和宿主菌(OD6oo約為0.5) 1 ml混合，室溫下靜止60 min， LB培養 液預溫至37'C。(8) 加入預溫的LB培養液10ml，室溫孵育30min。(9) 分別取2 pl， 20 pl， 200 nl組織/宿主菌LB混合物加至45'C的3 ml頂層瓊 脂中，充分混勻后將其鋪于含IPTG/X-Gal的LB平板上。余混合物200 )nl/份鋪于LB平 板上。待頂層瓊脂凝固后將LB平板置于37'C孵箱中培養12h。 12h后平板上長出藍色 噬斑，對藍色噬斑進行計數，然后推算噬菌體的數量(結果見圖3)。3. 3.化學合成多肽的鑒定3. 3. l合成Phagel呈現的多肽Pl及對照多肽P5并進行FITC標記采用固相合成法合成Phagel呈現的多肽Pl及對照多肽P5，并進行FITC標記，合 成工作和標記均由西安華辰生物科技公司完成，純度為98%以上。 3. 3. 2 Pl與VEGFR-3分子的特異性結合(1) 以2mg/lPl或P5包被96孔酶聯板，每孔100nl， 4。C孵育過夜。(2) 傾去包被液，于每孔中加入封閉液(5mg/lBSA， 0.1mol/l NaHC03， pH8.6)， 4'C封閉2h。(3) 傾去封閉液，TBST洗6次。每次均要將96孔板倒扣在潔凈的紙巾上，輕扣 除盡殘余液體。(4 )將VEGFR-3 、 VEGFR-2和VEGFR-1蛋白分別加入對應的孔中 (100ng/,l/well),室溫反應lh。(5) TBST洗6次，每孔加入小鼠抗人IgG抗體(1:1000)，室溫反應lh。(6) TBST洗6次，每孔加入HRP標記的山羊抗小鼠抗體(1: 5000)，溫孵育lh。(7) TBST洗6次，OPD顯色后測A490nm處的吸光值(結果見圖4)。 3. 3. 3 Pl與VEGFR-3陽性細胞HT29的特異性結合(1) 用胰酶和EDTA消化貼壁的VEGFR-3陰性的細胞EVC304和VEGFR-3陽性 的細胞HT29，鏡下觀察待細胞呈懸浮圓形時，完全培養基終止反應。(2) 將細胞懸液滴于潔凈的載玻片上，孵箱(37°C, 5%C02)中培養4h，使之貼 壁。然后在盛放載玻片的培養皿中加入完全培養基，繼續培養。(3) 鏡下觀察當細胞伸展了 50-70%時，取出細胞爬片，PBS洗滌2次。(4) 于冷的丙酮中固定10min，自然風干。(5) PBST洗滌3次，5%正常山羊血清封閉，室溫30min。(6) 在相應樣品上滴加PBS稀釋的FITC-P1或FTIC-P5 (80ng/份)。室溫避光孵育 30min。(7) PBST洗滌3次后用PI (20pg/ml)染色5min。(8) PBST洗滌3次，中性甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像(結 果見圖5)。3. 3. 4 Pl在荷瘤小鼠體內分部試驗(1) 構建荷瘤裸鼠模型在裸鼠右腹股溝皮下接種2"06個/只的腫瘤細胞，兩周 后觀察，腫瘤成長約lxO.lcm,可用于實驗。(2) 將含FITC-P1和FITC-P5分別尾靜脈注入小鼠體內100|^1/只(lmg/ml)。(3) 待5min后，戊巴比妥鈉150mg/kg腹腔注射麻醉。然后橫隔水平切開皮膚， 暴露全部胸壁，剪斷胸骨，注意避免損傷心臟和大血管。(4) 充分暴露心臟后，通過左心室用靜脈針穿刺入主動脈，針管內有回吸的血液后 緩慢推入已預溫37。C的20ml生理鹽水，同時在右心耳處剪開一小口，可見血液流出， 直至流出的血液變成淡紅色為止。(5) 換用50rnllOc/。甲醛灌注小鼠，取小鼠皮下的瘤塊及對照組織，在10%甲醛溶 液中后固定4h。(6) 在25%蔗糖溶液中置換出各組織的水分。(7) OTC包埋后制備冰凍切片(lO)am)。(8) 用PI (20ng/ml)染色5min， PBS洗滌3次。(9) 中性甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像(結果見圖6)。 3. 4實驗證實效果經實驗證實本發明的效果如下1) 利用商品化的VEGFR-3為配體在噬菌體隨機呈現環7肽庫成功篩選了出了特異 性與VEGFR-3結合的多肽Cys Ser Asp His Trp His Tyr Trp Cys; Cys Ser Asp Tyr Asn His His Trp Cys; Cys Ser Asp Trp Gin His Pro Trp Cys (見圖1)。經序列比對，與任何已知蛋 白分子不具有同源性。2) 選擇表現最好的噬菌體Phagel進行研究。ELISA結果表明Phagel可以特異性地 與VEGFR-3結合，而不與VEGFR-2或VEGFR-1結合。黑色框代表Phagel與不同受體的結合，白色框代表對照噬菌體與不同受體的結合(見圖2)。并且Phagel在荷瘤小鼠體 內的分布試驗結果顯示歸巢于腫瘤組織(VEGFR-3高表達)中的Phagel是對照噬菌體的 2.38倍，這一比值高于歸巢于其它組織的Phagel與對照噬菌體的比值，說明Phagel 在VEGFR-3高表達的腫瘤組織(見圖3)。3)對Phagel呈現的多肽P1 (CSDSWHYWC)化學合成后進行研究，ELISA結果表 明PI可以特異性地與VEGFR-3結合，而不與VEGFR-2或VEGFR-1結合(見圖4)。細胞 學是驗結果表明PI可以特異性與VEGFR-3高表達細胞的結合結果(見圖5)。進一步的 動物實驗表明可以特異性的匯聚于腫瘤組織(VEGFR-3高表達)中(見圖6)。綜上所述，該多肽的得到能夠應用于以VEGFR-3為靶點的導向性藥物的設計和開發 中，從而為提高藥物在VEGFR-3高表達組織的匯聚，提高藥物的療效，降低藥物用量和 毒副作用奠定基礎。人血管內皮細胞生長因子受體3結合肽的氨基酸序列 PI:Cys Ser Asp His Trp His Tyr Trp Cys; P2: Cys Ser Asp Tyr Asn His His Trp Cys; P3.. Cys Ser Asp Trp Gin His Pro Trp Cys。
權利要求
1.人血管內皮細胞生長因子受體3結合肽，其特征在于，包括下列三種環7肽之一，其氨基酸序列分別如下Cys Ser Asp His Trp His Tyr Trp Cys；Cys Ser Asp Tyr Asn His His Trp Cys；Cys Ser Asp Trp Gln His Pro Trp Cys。
2. 權利要求1所述的人血管內皮細胞生長因子受體3結合肽篩選方法，其特征在 于，按以下步驟完成1)噬菌體隨機呈現環7肽庫的篩選以200W用0.1mol/l的NaHC03稀釋的VEGFR-3和IgGlFc溶液包被ELISA板孔， 過夜后，將96孔板倒扣在潔凈的紙巾上，輕扣除盡殘余液體；然后用1%牛血清白蛋白 的TBS， 50mMTris—HCl， pH7.5， 4'C孵育，封閉2h,再采用0.1%Tween20的TBST 洗滌6次，每次均要將96孔板倒扣在潔凈的紙巾上，輕扣除盡殘余液體；將200 ^用TBST稀釋的含2xl0"pfu噬菌體溶液加入IgGlFc才包被孔，室溫孵 育；輕輕吸出未與IgGlFe包被孔結合的噬菌體，加入到已封閉好的VEGFR-3包被孔， 室溫孵育lh;傾去液體，去除未結合的噬菌體，再用TBS40.1。/。Tween20洗漆10次，每 次均要將96孔板倒扣在潔凈的紙巾上，輕扣除盡殘余液體；用100nL洗脫液洗脫結合 的噬菌體，其洗脫液配方為0.2mol/LGlycine-HCl， pH2.2， 10g/LBSA,并迅速加入配 方為lmol/LTris-HCl， pH9.1的中和液中和；取lpL測滴度，剩余液體加入20mL處于 對數生長早期的R2738培養物中，于37°C劇烈振蕩培養4.5h,得到擴增的噬菌體，所 述的R2738培養物為大腸桿菌ER2738; 20mg/L四環素的5mL LB培養基胰蛋白胨 10 g/L酵母提取物5 g/L NaCllO g/L;將擴增好的噬菌體和大腸桿菌的混合液倒入離心管，于4'C， 10000rpm離心10min; 上清轉入新的離心管，再離心，取80%的離心上清轉入新的離心管，加入l/6體積的 PEG8000/NaCl，其配方為PEG-8000200mg/mL， NaC12.5M， 4。C靜置過夜；次日，4 'C10000rpm離心15min，傾去離心上清；再同法快速離心一下，吸盡殘留上清；1 mLTBS 重懸沉淀，于4'C10000rpm離心5min，將殘留的細胞沉淀下來；上清加入1/6體積的 PEG/NaCl，冰浴1 h, 4°C, 10000rpm離心15min，傾去上清，用200 pL含0.01%NaN3 的TBS重懸沉淀，10000rpm離心lmin;上清即為擴增好的洗脫液，lpL用于測滴度， 余下的液體于4'C存放；200pl用0.1mol/l的NaHC03稀釋的VEGFR-3和IgGlFc分別包被新孔，用于下一 輪篩選，在第二輪和第三輪篩選中，VEGFR-3濃度分別降至50mg/L和20mg/L;重復 以上篩選步驟，第二輪和第三輪的篩選中，加入的第一輪和第二輪篩出的噬菌體根據滴 度計算相當于2xl0"pfii噬菌體的液體體積；將TBST中Tween20的濃度提高至0.5%; 第三輪的洗脫產物不需進行擴增，取lpL進行滴度測定，剩余存放于4'C;從滴度測定中，菌斑數〈100的平板上隨機挑取50個分隔良好噬菌斑進行擴增和純 化，既用無菌牙簽蘸取的50個分隔良好的藍色噬菌斑分別放入對數中期培養的ER2738 中，37'C劇烈振蕩培養4.5h后，瞬間離心30s。新的離心管，同法再離心一次，取80% 的上清，即得擴增的噬菌體液體；2)特異性噬菌體篩選以100mg/L的NaHC03(pH8.6)稀釋的VEGFR-3包被96孔酶聯板，同時對每個孔設 立1。/。BSA對照孔，同型的IgGl對照孔，4X:孵育過夜；傾去包被液，加入5mg/LBSA， 0.1mol/LNaHCO3， pH8.6的封閉液，4'C封閉2h，以步驟l)中的TBST洗6次，每次 均要除盡殘余液體；將50個純化的1 X 109/孔噬菌體分別加入NaHC03 pH8.6中，BSA 和同型抗體IgGl包被孔中室溫孵育2h; TBST洗6次，每孔加入HRP標記的小鼠抗 M13噬菌體mAbl00uL，其比例1:5000,室溫孵育lh; TBST洗6次，鄰苯二胺顯色并 用2mol/L硫酸終止反應后測定A490nm處的吸光值顯色后測定A410nm處的吸光值； 3)噬菌體呈現肽的序列測定根據ELISA結果，篩選出29個與VEGFR-3有較高親和力而與其他對照親和力低的 克隆進行序列測定；噬菌體克隆的擴增同前，取噬菌體培養上清；常規提取噬菌體單鏈 DNA，以單鏈DNA為模板，采用噬菌體隨機肽庫試劑盒中所提供的測序引物，引物序 列為5'~CCCTCATAGTTAGCGTAACG~3'，在ABI310 DNA自動測序儀上進行自動測 序，根據DNA測序結果，推導出噬菌體所呈現隨機肽的氨基酸序列，比較不同克隆之 間氨基酸序列的同源性，即可得到篩選的三種模擬表位，其氨基酸序列分別為Cys Ser Asp His Trp His Tyr Trp Cys;Cys Ser Asp Tyr Asn His His Trp Cys;Cys Ser Asp Trp Gin His Pro Trp Cys。
全文摘要
本發明公開了一種人血管內皮細胞生長因子受體3結合肽及其篩選方法，包括下列三種環7肽之一，其氨基酸序列分別如下Cys Ser Asp His Trp His Tyr Trp Cys；Cys Ser Asp Tyr Asn His His Trp Cys；Cys Ser AspTrp Gln His Pro Trp Cys。上述環7肽能夠特異性的與VEGFR-3分子以及VEGFR-3陽性的細胞結合，并且在荷瘤小鼠體內可以特異性的匯聚于VEGFR-3陽性的腫瘤組織中。
文檔編號C07K7/64GK101225108SQ20071030774
公開日2008年7月23日 申請日期2007年12月21日 優先權日2007年12月21日
發明者包春杰, 張英起, 萌 李, 鑫 秦, 薛曉暢, 葦 韓 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學