專利名稱：：人工合成的豬干擾素基因及制備豬干擾素的方法
技術領域：
：本發明屬于微生物工程領域，具體涉及一種人工合成的豬干擾素基因、含該基因的載體和宿主細胞及制備豬干擾素的方法。
背景技術：
：干擾素是由多種細胞產生的具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤和免疫調節作用的可溶性糖蛋白。目前豬干擾素的批量生產主要有細胞誘導培養法和以大腸桿菌為表達系統的基因重組法。前一種方法以動物細胞為原料，生產工藝復雜、生產成本高，產品有攜帶外源病毒和其他病原微生物的危險。后一種方法雖較前一種先進，生產成本大大降低，但其工藝還是相對較復雜，基因工程陽性大腸桿菌的表達產物是以包涵體的形式存在，需要進行菌體的裂解、包涵體的復性等工藝，且復性率低，因而比活性也較低。另外，其產品純度不高，含有其他雜蛋白，分離純化較復雜，要用價格昂貴的單抗柱。
發明內容本發明的目的是提供一種人工合成的豬干擾素基因；本發明的另一目的是提供一種含上述人工合成的豬干擾素基因的DNA重組載體和宿主細胞；本發明的再一目的是提供一種制備豬干擾素的方法。本發明的技術方案如下本發明提供的人工合成的豬干擾素基因，具有圖1所示的SEQIDNO.l核苷酸序列1atggcccca_3CCteagccttcetcacggcc31ctggtgctaetc鄉tgcgccatetgc61tctctgggctgtg3Cctgcctc恥a_cccac913gCctggetC8Ca_ccagggccctg郷etc7<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>本發明提供的含上述人工合成的豬干擾素基因的DNA重組載體，其為包含圖1所示的SEQIDNO.l核苷酸序列的重組載體。所述的重組載體為甲醇調節型重組載體。所述的重組載體為表達載體pPICz-IFN。本發明提供的宿主細胞，其為包含圖1所示的SEQIDNO.l核苷酸序列基因的宿主細胞，或者為包含圖1所示的SEQIDNO.l核苷酸序列重組載體的宿主細胞。所述的宿主細胞為真核生物細胞或原核生物細胞。所述宿主細胞為甲醇營養型酵母細胞。所述宿主細胞為畢赤酵母細胞。所述宿主細胞為畢赤酵母細胞pichiaPastorisGS115。本發明提供的制備豬干擾素的方法，其特征在于，通過發酵制備豬干擾素，其具體步驟如下(一)豬干擾素工程酵母菌種的構建人工合成的豬a-IFN基因的合成A)根據畢赤酵母菌對氨基酸密碼子的喜好不同和密碼子具有的兼并性，及根據密碼偏愛統計表，將天然豬a干擾素核苷酸序列基因中第67、128、131氨基酸的三聯體密碼子的第三個堿基進行點突變，即將ggg突變為ggt;第127氨基酸的第三個堿基進行點突變，即將gcg變為get;第141氨基酸密碼子進行點突變，即將cgg變為aga;得到不改變天然豬a干擾素蛋白質的氨基酸序列，又為甲醇酵母所喜歡的密碼子，在甲醇酵母中具有高表達效率的人工合成的豬a干擾素基因，即為人工合成的豬a-IFN基因；并將該人工合成的豬a-IFN基因克隆至質粒pUC18-ifn;該人工合成的豬a-IFN基因的氨基酸順序為圖1所示的SEQIDNO.l核苷酸序列SEQIDNO.l核苷酸序列為13tggecCC3accteagecttcetcacggec31Ctggtgetaetcagetgcgecatetgc61tctctgggctgtgacctgcctC3gaccC3C91agectggetagggecctgaggetc121ctggcacaa3tg恥g卿atetctcccttc151tectgcctggac卿郷gacUtgga181teccctcatgaggettttggtggccag211gtccag犯ggetcaagecatggetCtggtg241catgagatgetccagcag3CCttcetc271ttcagea_cagsgggcteggetgetgectgg301a_￡itgag3gCctgctgcagttctacact331ggsctggatcagcagetcagggacctggaa361gectgtgtcatgcaggaggetggtctggaa391ggtcccctgctggsggaggactecate421卿getgtg郷aaatacttccax;卿etc451etctatctgcaagagaagagetacage481ccctgtgectgggagategtc郷gcagaa511gtc卿tecttctcttectec卿犯c541ctgg￡ic卿etc3ggaag犯gtga以該人工合成的豬a-IFN基因為模板，針對巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)委托上海生工公司合成優化設計的序列引物，再進行PCR擴增；所述優化設計的序列引物為上游弓l物5、_atggccccaacctcagcct-3、弓|入EcoRI位點；下游弓i物5、-ctccttcttcctgagtctg-3，弓l入Xbal位點；所述PCR擴增條件為95。C熱變性，5分鐘后，按94。C變性50秒，56。C退火50秒，72'C延伸50秒，進行30個循環，最后1個循環后于72'C保溫20分鐘。用設計合成的特異性引物進行PCR擴增，擴增得到500bp左右的DNA片段；B)表達載體pPICz-ifn的構建將含有人工合成的豬a-IFN基因的克隆質粒pUC18-ifn和pPICz用EcoRI和AvrII雙酶切，并用P/。瓊脂糖膠電泳分別回收含IFN基因的片段和pPICz，然后將IFN基因片段與pPICz連接，得到表達載體pPICz-ifn;C)畢赤酵母的電轉化以來源于TaKaRa公司限制性內切酶將重組質粒pPICz-IFN線性化后，與畢赤酵母GS115感受態混合，用BioRadGenePulser電轉儀電擊轉化，轉化參數為1.8kV、25uF、200Q;電擊后，立即加入lmL冰浴山梨醇，經溫育，將轉化菌液涂布于含抗生素ZeocinTM100ml/L的YPDS平板上，28-30。C孵育2-3天，待平板上的單菌落長出后，將其分別依次點種在含抗生素ZeocinTM500、1000、1500、2000mg/L的YPDS平板上，28-30。C孵育2-3天，然后將ZeocinTM2000mg/L/rYPDS平板上的單菌落再分別依次點種在ZeocinTM2500、3000mg/L的YPDS平板上，28-30'C孵育2-3天，得重組酵母菌株；該重組酵母菌株抵抗ZeocinTM的能力與其整合質粒拷貝數成正比，因此，作ZeocinTM100-3000mg/L范圍的不同質量濃度的瓊脂平板可篩選到多拷貝的重組畢赤酵母電轉化菌株GS115;D)畢赤酵母電轉化菌株的陽性鑒定提取重組畢赤酵母電轉化菌株GS115的基因DNA,同時提取轉化空載體pPICz的GS115的基因組DNA作對照；以人工合成的豬a-IFN基因組為模板，用上述優化設計的上游引物和下游引物進行PCR反應，用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，證明所得畢赤酵母電轉化菌株為陽性；E)重組畢赤酵母電轉化菌株GS115的誘導表達用滅菌牙簽挑取重組畢赤酵母電轉化菌株GS115的單克隆菌株，接種于100mlYPD培養基中培育到OD,值達到6.0，離心收菌；用表達培養基BMGY重懸沉淀，在28-3(TC震蕩培養過夜，離心收集菌體；在超凈工作臺中重新加入少量BMMY，并將離心蓋換成4層無菌紗布；于28-30。C、30%溶氧、300-800rpm震蕩培養24小時后每日補加純甲醇至終濃度為1%(v/v)進行誘導，繼續培養4天；離心收集上清液；用SDS-PAGE電泳法檢測上清液中的干擾素；電泳后將產物轉移到硝酸纖維素膜上，進行WB鑒定一抗為兔抗人a干擾素抗體，二抗為羊抗兔IgG-AP抗體；(二)重組畢赤酵母發酵生產豬干擾素菌種PichiapastorisGS115(pPICz-ifn);發酵罐、電泳儀、分光光度儀；培養基YPD、富營養培養基、貧營養培養基、1%(W/V)甲醇貧營養培養基;培養發酵先將保存菌株(PichiapastorisGS115(pPICz-ifn)劃線接種于YPD平板培養基上，28-3(TC恒溫培養24-32h;再從YPD平板培養基上挑出單菌落，接入250ml三角瓶裝的30mlBMGY培養基中，于2,m00-300rpm，28-30。C振蕩培養24h，作為搖瓶種子；搖瓶種子再以10%(V/V)接入10L發酵罐的BMGY培養基中，200-300rpm，28-30'C進行攪拌培養24h;然后，每日補加甲醇于培養基中至終濃度為1%(v/v)，用10%(v/v)NH4OH和10%(v/v)H3PO4調pH至5.5，DO>30%，連續培養4d;離心，收集含豬C1干擾素的上清液；(三)豬干擾素的純化用HAc調所得豬a干擾素上清液的pH值，先用CM-shepharos層析柱純化，收集目標蛋白洗脫液，用tris-cL緩沖液透析；然后用DEAE-shepharos層析柱純化，收集目標蛋白洗脫液，用PB緩沖液透析，得到純a豬干擾素。本發明提供了豬a干擾素在畢赤酵母菌中高效表達、發酵及純化的新技術方法，從而克服現有技術的不足；甲醇營養型酵母表達系統具有高表達、高穩定、高分泌的特點；該宿主菌畢赤酵母自身蛋白分泌量少，高活性外源蛋白的分泌量大。這就有利于下游的分離純化操作，是一種適宜表達外源基因的真核表達系統，有利于大規模批量生產。圖1為本發明人工合成的豬a干擾素(豬ci-IFN基因)基因序列。具體實施例方式以下結合具體實施例和附圖對本發明作進一步詳細的說明，而并不旨在以任何方式限制本發明。11實施例11、豬干擾素工程酵母菌種的構建1)材料和方法畢赤酵母菌PichiapastorisGS115,pPICz表達質粒，均構自美國Invitrogen公司。TaqDNA聚合酶、限制性內切酶EcoRI、Xhol、XbaII、AvrII、BglII、Smal、T1DNA連接酶，均購自TaKaRa公司。BMGY、BMMY、YPG培養基，見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。質粒抽提試劑盒、PCR產物回收試劑盒購自Promega。一抗為兔抗人a干擾素抗體，二抗為羊抗兔IgG-AP抗體，均為自制；2)人工合成的豬a-IFN基因的合成A)根據畢赤酵母菌對氨基酸密碼子的喜好不同和密碼子具有的兼并性，及根據密碼偏愛統計表，將天然豬a干擾素核苷酸序列基因中第67、128、131氨基酸的三聯體密碼子的第三個堿基進行點突變(即將ggg突變為ggt)，將第127氨基酸的第三個堿基進行點突變(gcg變為gct)，將141氨基酸的密碼子進行突變(cgg變為aga)，得到不改變天然豬a干擾素蛋白質的氨基酸序列，又為甲醇酵母所喜歡的密碼子，在甲醇酵母中具有高表達效率的人工合成的豬a干擾素基因(也稱人工合成的豬a-IFN基因)；并將該人工合成的豬a-IFN基因克隆至質粒pUC18-ifn;該人工合成的豬a-IFN基因的氨基酸順序為圖1所示的SEQIDNO.1的核苷酸序列SEQIDNO.l的核苷酸序列為13tggecCC3accteagecttcetcacggec31Ctggtgetaetcagetgcaatgecatetgc61tctctgggctgtgacctgcctcagaxx91agectggetC3Cagggecctgaggetc121ctggcaca<aatgaggagaatetctcccttc151tectgcctggscca_c卿明ggsctttgga181teccctcatgaggettttggtggcsa_ccag211gtccag卿getc犯gecatggetctggtg241catgagEltgetccagC3ga_ccttccagetc271ttcageg站ggcteggetgetgectgg301aatg站ctgctgC3Ccagttctacact331ggactggatcagcagetcagggacctggaa361gcctgtgtcatgcaggaggetggtctgg￡l￡l391ggtacccccctgctggaggaggactecate421卿getgtgaggaaateicttccac卿etc451etctatctgc犯gagaagagetacage481ccctgtgcctggg明ategtcagggcag朋511gtcatg卿tecttctcttectec卿肌c541ctgc犯gac卿etcagg肌g犯gtga以該人工合成的豬a-IFN基因為模板，針對巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)委托上海生工公司合成優化設計的序列引物，再進行PCR擴增；所述優化設計的序列引物為上游弓l物5'-atggccccaacctcagcct-3'弓|入EcoRI位點；下游弓l物5、-ctccttcttcctgagtctg-3'弓l入XbaI位點；所述PCR擴增條件為95'C熱變性，5分鐘后，按94'C變性50秒，56"C退火50秒，72'C延伸50秒，進行30個循環，最后1個循環后于72。C保溫20分鐘。用設計合成的特異性引物進行PCR擴增，擴增得到500bp左右的DNA片段；B)表達載體pPICz-ifn的構建將含有人工合成的豬a-IFN基因的克隆質粒pUC18-ifn和pPICz用EcoRI和AvrII雙酶切，并用P/。瓊脂糖膠電泳分別回收含IFN基因的片段和pPICz，然后將IFN基因片段與pPICz連接，得到表達載體pPICz-ifn;C)畢赤酵母的電轉化以來源于TaKaRa公司限制性內切酶Sacl將重組質粒pPICz-IFN線性化后，與畢赤酵母GS115感受態混合，用BioRadGenePulser電轉儀電擊轉化，轉化參數為1.8kV、25uF、200Q;電擊后，立即加入lmL冰浴山梨醇，經溫育，將轉化菌液涂布于含抗生素ZeocinTM100ml/L的YPDS平板上，28-30。C孵育2-3天，待平板上的單菌落長出后，將其分別依次點種在含抗生素ZeocinTM500、1000、1500、2000mg/L的YPDS平板上，28-30。C孵育2-3天，然后將ZeocinTM2000mg/L/rYPDS平板上的單菌落再分別依次點種在ZeocinTM2500、3000mg/L的YPDS平板上，28-30'C孵育2-3天；該重組酵母菌株抵抗ZeocinTM的能力與其整合質粒拷貝數成正比，因此，作ZeocinTM100-3000mg/L范圍的不同質量濃度的瓊脂平板篩選到多拷貝的重組畢赤酵母電轉化菌株GS115;D)畢赤酵母電轉化菌株的陽性鑒定提取重組畢赤酵母電轉化菌株GS115的基因DNA，同時提取轉化空載體pPICz的GS115的基因組DNA作對照；以人工合成的豬a-IFN基因組為模板，用上述優化設計的上游引物和下游引物進行PCR反應，用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，證明所得畢赤酵母電轉化菌株為陽性；E)重組畢赤酵母電轉化菌株GS115的誘導表達用滅菌牙簽挑取重組畢赤酵母電轉化菌株GS115的單克隆菌株，接種于100mlYPD培養基中培育到OD6oo值達到6.0，離心收菌；用表達培養基BMGY重懸沉淀，在28-3(TC震蕩培養過夜，離心收集菌體；在超凈工作臺中重新加入少量BMMY，并將離心蓋換成4層無菌紗布；于28-30。C、30%溶氧、300-800rpm震蕩培養24小時后每日補加純甲醇至終濃度為1%(v/v)進行誘導，繼續培養4天；離心收集上清液；用SDS-PAGE電泳法檢測上清液中的干擾素電泳后將產物轉移到硝酸纖維素膜上，進行WB鑒定一抗為兔抗人a干擾素抗體，二抗為羊抗兔IgG-AP抗體；2、重組畢赤酵母發酵生產豬干擾素菌種PichiapastorisGS115(pPICz-ifn);發酵罐、電泳儀、分光光度儀；培養基YPD、富營養培養基、貧營養培養基、1%甲醇(W/V)貧營養培養基;培養發酵先將保存菌株(PichiapastorisGS115(pPICz-ifn)劃線接種于YPD平板培養基上，28-30。C恒溫培養24-32h;再從YPD平板培養基上挑出單菌落，接入250ml三角瓶裝的30mlBMGY培養基中，于200-3OOrpm，28-30。C振蕩培養24h，作為搖瓶種子；搖瓶種子再以10%(V/V)接入10L發酵罐的BMGY培養基中，200-300rpm，28-3(TC進行攪拌培養24h;然后，每日補加甲醇于培養基中至終濃度為l%(v/v)，用10%(v/v)NaOH和10%H3PO4(v/v)調pH至5.5，DO>30%，連續培養4d;離心，收集含豬a干擾素的上清液；3、豬a干擾素的純化用HAc調所得豬a干擾素上清液的pH值，先用CM-shepharos層析柱純化，收集目標蛋白洗脫液，用tris-cL緩沖液透析；然后用DEAE-shepharos層析柱純化，收集目標蛋白洗脫液，用PB緩沖液透析，得純a豬干擾素。用以上方法法生產的三批次純a豬干擾素，經檢測結果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>純度用SDS-PAGE電泳法檢測純a豬干擾素純度，結果均大于96%;活性用常規的細胞病變抑制法WISH/VSV測定該純a豬干擾素活性大于1.03X109IU/mg;比活性生物學活性與蛋白質含量之比；活性蛋白用Lowry法，經測定其蛋白含量大于976mg/L。序列表〈110〉成都乾盛昌生物科技有限公司〈120〉人工合成的豬干擾素基因及制備豬干擾素的方法〈160〉1〈210〉1〈211〉570〈212〉DNA〈213〉豬〈400〉1atggccccaatctctgggctctggcacaaatcccctcatgC3tg3g￡ltgCaatgagagccgcctgtgtca卿gctgtgaccctgtgcctctgcaagacacctcagccttgtgacctgcctgaggag犯t鄉cttttggtccagcagactgctgcaccatgcagg郷cggaaatacttggg卿tcgtgax;tcaggaacctcacggcctcagacccacctctcccttctggcaaccagcttccagctcgttctacacttggtctggaaccacagactcg犯gg觀tgactggtgctacagcctggctctcctgcctggttcagcacagggactggatcggtaccccccaccctctatcgtcatgagattcagctgcaaacaccagggc3cc3cagaagctcaagccatagggctcggcagcagctcagtgctggaggatgcaagsg犯ccttctcttctgccatctgccctgaggctcggactttggaggctctggtgtgctgcctggggacctgg3aggactccatcgagctacagcctcca^aac60120180240300360420480540570權利要求1、一種人工合成的豬干擾素基因，其特征在于，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列1atggccccaacctcagccttcctcacggcc31ctggtgctactcagctgcaatgccatctgc61tctctgggctgtgacctgcctcagacccac91agcctggctcacaccagggccctgaggctc121ctggcacaaatgaggagaatctctcccttc151tcctgcctggaccacagaagggactttgga181tcccctcatgaggcttttggtggcaaccag211gtccagaaggctcaagccatggctctggtg241catgagatgctccagcagaccttccagctc271ttcagcacagagggctcggctgctgcctgg301aatgagagcctgctgcaccagttctacact331ggactggatcagcagctcagggacctggaa361gcctgtgtcatgcaggaggctggtctggaa391ggtacccccctgctggaggaggactccatc421agagctgtgaggaaatacttccacagactc451accctctatctgcaagagaagagctacagc481ccctgtgcctgggagatcgtcagggcagaa511gtcatgagatccttctcttcctccagaaac541ctgcaagacagactcaggaagaaggagtga。2、一種重組載體，其特征在于，為包含權利要求1所述SEQIDNO.l所示的核苷酸序列的重組載體。3、如權利要求2所述的重組載體，其特征在于，所述的重組載體為甲醇調節型重組載體。4、如權利要求2所述的重組載體，其特征在于，所述的重組載體為表達載體pPICz-IFN。5、一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為包含權利要求1所述SEQIDNO.l所示的核苷酸序列基因的宿主細胞，或者為包含權利要求2所述的包含所述SEQIDNO.l所示的核苷酸序列的重組載體的宿主細胞。6、如權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞為真核生物細胞。7、如權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為甲醇營養型酵母細胞。8、如權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為畢赤酵母細胞PichiaPastorisGS115。9、一種制備豬干擾素的方法，其特征在于，通過發酵制備豬干擾素，其具體步驟如下(一)豬干擾素工程酵母菌種的構建人工合成的豬a-IFN基因的合成A)根據畢赤酵母菌對氨基酸密碼子的喜好不同和密碼子具有的兼并性，及根據密碼偏愛統計表，將天然豬a干擾素核苷酸序列基因中第67、128、131氨基酸的三聯體密碼子的第三個堿基進行點突變，即將ggg突變為ggt;將第127氨基酸的第三個堿基進行點突變，即將gcg變為gct;將141氨基酸的密碼子進行突變，即將cgg變為aga;得到不改變天然豬a干擾素蛋白質的氨基酸序列，又為甲醇酵母所喜歡的密碼子，在甲醇酵母中具有高表達效率的人工合成的豬a干擾素基因，即為人工合成的豬a-IFN基因；并將該人工合成的豬a-IFN基因克隆至質粒pUC18-ifo;該人工合成的豬a-IFN基因的氨基酸順序為圖1所示的SEQIDNO.l的核苷酸序列SEQIDNO.l的核苷酸序列為1atggecCC3￡LCCteagecttcetc3Cggec31ctggtgetaetcagetgcsatgecatetgc61tctctgggctgtgacctgcctC￡lgacccac91鄉ctggetC3Cacc鄉gecCtg恥getc121ctggcaatg郷卿atetctcccttc151tectgcctggacC3C卿鄉gactttgga181teccctcatgaggettttggtggc犯ccag3211gtccag鄉getgccatggetctggtg241catgagatgetccagC3ga_ccttcetc271ttcageaca_gagggcteggetgetgcctgg301aatgagagectgctgttctacact331ggactggatcagcagetcagggacctggaa361gcctgtgtcatgC3ggaggetggtctggaa391ggtcccctgctggagg觀gactecate421卿getgtgaggaaatacttccacagaetc451etctatctgc犯gagaagagetac481ccctgtgcctgggagategtc恥ggcagaa511gtcatg卿tecUctcttectec卿a_ac541ctg卿etc兆g鄉aagg昭tga以該人工合成的豬a-IFN基因為模板，針對巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)委托上海生工公司合成優化設計的序列引物，再進行PCR擴增；所述優化設計的序列引物為上游弓l物5、-atggccccaacctcagcct_3、弓|入EcoRI位點；下游引物5'-ctccttcttcctgagtctg-3，弓l入XbaI位點；所述PCR擴增條件為95X:熱變性，5分鐘后，按94。C變性50秒，56'C退火50秒，72'C延伸50秒，進行30個循環，最后1個循環后于72'C保溫20分鐘。用設計合成的特異性引物進行PCR擴增，擴增得到500bp左右的DNA片段；B)表達載體pPICz-ifn的構建將含有人工合成的豬a-IFN基因的克隆質粒pUC18-ifn和pPICz用EcoRI和AvrII雙酶切，并用1%(v/v)瓊脂糖膠電泳分別回收含IFN基因的片段和pPICz，然后將IFN基因片段與pPICz連接，得到表達載體pPICz-ifn;C)畢赤酵母的電轉化以來源于TaKaRa公司限制性內切酶Sacl將重組質粒pPICz-IFN線性化后，與畢赤酵母GS115感受態混合，用BioRadGenePulser電轉儀電擊轉化，轉化參數為1.8kV、25uF、200Q;電擊后，立即加入lmL冰浴山梨醇，經溫育，將轉化菌液涂布于含抗生素ZeocinTM100ml/L的YPDS平板上，28-3(TC孵育2-3天，待平4板上的單菌落長出后，將其分別依次點種在含抗生素ZeocinTM500、1000、1500、2000mg/L的YPDS平板上，28-30。C孵育2-3天，然后將ZeocinTM2000mg/L/rYPDS平板上的單菌落再分別依次點種在ZeocinTM2500、3000mg/L的YPDS平板上，28-3(TC孵育2-3天，得重組酵母菌株；該重組酵母菌株抵抗ZeocinTM的能力與其整合質粒拷貝數成正比，因此，作ZeocinTM100-3000mg/L范圍內的不同質量濃度的瓊脂平板篩選到多拷貝的重組畢赤酵母電轉化菌株GS115;D)畢赤酵母電轉化菌株的陽性鑒定提取重組畢赤酵母電轉化菌株GS115的基因DNA，同時提取轉化空載體pPICz的GS115的基因組DNA作對照；以人工合成的豬a-IFN基因組為模板，用上述優化設計的上游引物和下游引物進行PCR反應，用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，證明所得畢赤酵母電轉化菌株為陽性；E)重組畢赤酵母電轉化菌株GS115的誘導表達用滅菌牙簽挑取重組畢赤酵母電轉化菌株GS115的單克隆菌株，接種于100mlYPD培養基中培育到OD6oo值達到6.0，離心收菌；用表達培養基BMGY重懸沉淀，在28-3(TC震蕩培養過夜，離心收集菌體；在超凈工作臺中重新加入少量BMMY，并將離心蓋換成4層無菌紗布；于28-30。C、30%溶氧、300-800rpm震蕩培養24小時后每日補加純甲醇至終濃度為1%(v/v)進行誘導，繼續培養4天；離心收集上清液；用SDS-PAGE電泳法檢測上清液中的干擾素；電泳后將產物轉移到硝酸纖維素膜上，進行WB鑒定一抗為兔抗人ct干擾素抗體，二抗為羊抗兔IgG-AP抗體；(二)重組畢赤酵母發酵生產豬干擾素菌種PichiapastorisGS115(pPICz-ifn);發酵罐、電泳儀、分光光度儀；培養基YPD、富營養培養基、貧營養培養基、1%(W/V)甲醇貧營養培養基;培養發酵先將保存菌株(PichiapastorisGS115(pPICz-ifn)劃線接種于YPD平板培養基上，28-30。C恒溫培養24-32h;再從YPD平板培養基上挑出單菌落，接入250ml三角瓶裝的30mlBMGY培養基中，于200-300rpm，28-30。C振蕩培養24h，作為搖瓶種子；搖瓶種子再以10%(V/V)接入10L發酵罐的BMGY培養基中，200-300rpm，28-3(TC進行攪拌培養24h;然后，每日補加甲醇于培養基中至終濃度為l%(v/v)，用10%(v/v)NaOH和10%(v/v)H3P04調pH至5.5，DO〉30%，連續培養4d;清液；(三)豬a干擾素的純化用HAc調所得豬a干擾素上清液的pH值，先用CM-shepharos層析柱純化，收集目標蛋白洗脫液，用tris-cL緩沖液透析；然后用DEAE-shepharos層析柱純化，收集目標蛋白洗脫液，用PB緩沖液透析，得到純a豬干擾素。全文摘要本發明涉及人工合成的豬干擾素基因、含該基因的載體和宿主細胞及制備豬干擾素的方法；人工合成的豬干擾素基因具有圖1所示SEQIDNO.1核苷酸序列；其制備為先合成人工合成的豬α-IFN基因、含該基因的載體和宿主細胞；之后重組畢赤酵母發酵生產豬干擾素；再純化所得豬α干擾素；表達系統具有高表達、高穩定、高分泌的特點；該宿主菌畢赤酵母自身蛋白分泌量少，高活性外源蛋白的分泌量大，有利于下游的分離純化操作，是一種適宜表達外源基因的真核表達系統，并且有利于大規模批量生產。文檔編號C07H21/04GK101450961SQ200710195419公開日2009年6月10日申請日期2007年11月28日優先權日2007年11月28日發明者劉宗秀,房春林,李猶平,楊海涵,王萬平申請人:成都乾盛昌生物科技有限公司