可溶性vegfr雙功能融合受體、其制備方法及用途的制作方法

專利名稱：：可溶性vegfr雙功能融合受體、其制備方法及用途的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物
技術領域：
，更具體地，本發明公開了一類雙功能融合受體、其制備方法及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
：腫瘤尤其是惡性腫瘤是當今世界嚴重危害人類健康的疾病，在各種疾病所致死亡中高居第二位。而且近年來，其發病率呈明顯上升趨勢。惡性腫瘤治療效果差，晚期轉移率高，預后多不佳。目前臨床上所采用的常規治療方法如放、化療和手術治療雖然在很大程度上緩解了病痛，延長了生存時間，但這些方法均存在很大的局限性，其療效難以進一步提高。腫瘤的生長有兩個明顯不同的階段，即從無血管的緩慢生長期轉為有血管的快速增殖期，血管的生成使腫瘤能獲得足夠的營養而完成血管切換期，如果沒有血管的生成，原發腫瘤的生長不超過l2mm，轉移則無法實現。血管內皮生長因子(VEGF)是一類能促進內皮細胞分裂增殖、促進新生血管的形成、提高血管通透性的生長因子，它與細胞表面的血管內皮生長因子受體結合，通過激活酪氨酸激酶信號轉導途徑發揮功能。在腫瘤組織中，腫瘤細胞、腫瘤侵入的巨噬細胞和肥大細胞能分泌高水平的VEGF，以旁分泌的形式刺激腫瘤血管內皮細胞，促進內皮細胞增殖、遷移，誘導血管形成，促進腫瘤持續生長，并提高血管通透性，引起周圍組織纖維蛋白沉著，促進單核細胞、成纖維細胞內皮細胞侵潤，有利于腫瘤基質形成和腫瘤細胞進入新生血管，促進腫瘤轉移。因而抑制腫瘤血管生成被認為是當前最具有前途的腫瘤治療方法之一。Genentech公司的抗癌新藥Avastin(抗VEGF人源化抗體)已于20Q4年2月獲得美國FDA批準上市，用于一線治療轉移性結直腸癌，并有望用于其它腫瘤，包括非小細胞肺癌和腎癌的治療。此外，用可溶性受體阻斷VEGF和VEGFR的傳導途徑也被證明是一種行之有效的方法。VEGF家族包括VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及P工GF(胎盤生長因子)，它們之間的氨基酸序列高度同源，都與同型的酪氨酸激酶受體結合。血管內皮生長因子受體(VEGFR)屬于酪氨酸激酶受體超家族，它們有相似的結構，均由胞外區、跨膜區、胞內區組成。目前發現的VEGFR主要有3種VEGFRl(Flt-1)，VEGFR2(KDR)，VEGFR3。與VEGFR1結合的主要是VEGF、VEGF-B，與VEGFR2結合的主要是VEGF、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E，與VEGFR3結合的主要是VEGF-C、VEGF-D。VEGFR1和VEGFR2主要位于腫瘤血管內皮細胞表面，VEGFR1主要介導細胞骨架重排及引起細胞遷移，VEGF對內皮細胞的增殖、分化由VEGFR2介導。VEGFR3特異表達在淋巴內皮細胞中，在動脈、靜脈、毛細血管內皮中基本沒有表達。VEGF-C和VEGF-D可通過VEGF-C/VEGF-D/VEGFR3信號系統發揮作用，從而導致腫瘤淋巴管的增生和淋巴結的轉移[NeufeldG等，FASEBJ，1999，13:9—22]。Regeneron制藥公司將VEGFRl膜外區與抗體Fc進行融合，制備了VEGFR-Fc融合蛋白，它能與血管內皮細胞表面的VEGFR競爭性結合VEGF和VEGF-B，從而抑制VEGF和VEGF-B的生物活性，阻斷新生血管的形成，實驗結果表明VEGFR1-Fc具有比Avastin更強的抗腫瘤作用[WulffC等，JClinEndocrinolMetab.2001，86(7):3377-86.HolashJ等，PNAS2002，17:11393-11398]。但是，無論是Avastin還是VEGFR1-Fc都是通過阻斷VEGF或/和VEGF-B所誘導的生物學功能，即抑制腫瘤的血管生成來發揮抗腫瘤作用。它們均不能與VEGF-C或VEGF-D相結合，而VEGF-C和VEGF-D可誘導腫瘤內淋巴管生成，進而促進腫瘤淋巴結轉移，所以它們不能抑制腫瘤淋巴結轉移。因此，研究出既能與血管內皮細胞表面的VEGFR競爭性結合VEGF和VEGF-B，還能與VEGF-C或VEGF-D相結合，從而不僅抑制VEGF和VEGF-B的生物活性，阻斷新生血管的形成，還能阻斷VEGF-C和VEGF-D對腫瘤內淋巴管生成的誘導，防止腫瘤淋巴結轉移的高效抗腫瘤藥物一直是本領域的技術人員急待解決的問題。
發明內容本發明公開了1.一種可溶性雙功能VEGFR融合受體，為包含VEGFR1和VEGFR3在內的融合蛋白，既能與VEGF和VEGF-B結合，還能與VEGF-C或VEGF-D相結合。2.—種可溶性雙功能VEGFR融合受體，為VEGFRIg，具有SEQIDN0:8和SEQIDN0:10所示的氨基酸序列。3.一種可溶性雙功能VEGFR融合受體，為VEGFRFc，具有SEQIDN0:12所示的氨基酸序列。4.一種分離的核酸分子，編碼上述1所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體。5.—種分離的核酸分子，編碼上述2所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體VEGFRIg，具有SEQIDN0:7和SEQIDN0:9所示的核苷酸序列。6.—種分離的核酸分子，編碼上述3所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體VEGFRFc，具有SEQIDNO:11所示的核苷酸序列。7.—種載體，含有上述4、5、6任一所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相連的表達調控序列，其中載體可以為pDRl，pCDNA3.1，pcDNA3.1/ZE0(+)，pDHFF之一。8.上述7所述的載體，為pCDNA3.1或pcDNA3.1/ZE0(+)。9.一種宿主細胞，含有上述7所述的載體，為真核細胞。10.上述9所述的宿主細胞，為哺乳動物細胞。11.上述10所述的宿主細胞，為CH0細胞。12.—種制備上述1-3任一所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體的方法，該方法包括a)在表達條件下，培養上述的宿主細胞，從而表達雙功能融合受體，b)分離或純化所述的雙功能融合受體。13.—種組合物，含有上述1-3任一所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體和藥學上可接受的載體。14.上述1-3任一所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體在制備抗腫瘤藥物中的用途。15.上述14所述的組合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。16.上述14、15任一所述的用途，還包括和其它的抗腫瘤藥物聯合使用。任何編碼VEGFR1和VEGFR3的合適的DNA都適合于本發明，這樣的結構包括從RT—PCR激活的淋巴細胞mRNA中分離得到的VEGFR1，從根據embl|AR860556|AR860556中序列全基因合成的VEGFR3，或從其他cDNA文庫中獲得的。本發明中，任何合適的載體都可以使用，可以為pDRl(如圖1)，pCDNA3.1，pcDNA3.1/ZE0(+)，pDHFF之一，表達載體中包括連接有合適的轉錄和翻譯調節序列的融合DNA序列。哺乳動物或昆蟲宿主細胞培養系統可用于本發明的融合蛋白的表達，COS，CH0，NS0，sf9及sf21等均可適用于本發明。可用的宿主細胞為含有上述載體的原核細胞，可以為DH5a，BL21(DE3)，TG1之一。本發明中公開的VEGFR雙功能融合受體的制備方法為在表達條件下，培養上述的宿主細胞，從而表達雙功能融合受體，分離或純化所述的雙功能融合受體。利用上述方法，可以將融合蛋白純化為基本均一的物質，例如在SDS-PAGE電泳上為單一條帶。可以利用親和層析的方法對本發明公開的融合蛋白進行分離純化，根據所利用的親和柱的特性，可以使用常規的方法例如高鹽緩沖液、改變ra等方法洗脫結合在親和柱上的融合蛋白多肽。在本發明的一個實施例中，本發明公開的上述可溶性雙功能VECFR融合受體蛋白VEGFRIg是通過以下方法得到的VEGFR1基因是通過RT—PCR激活的淋巴細胞niRNA中分離得到的，VEGFR3基因根據embl|AR8605561AR860556中序列全基因合成，VEGFR1基因信號肽和Ig2-3區與輕鏈恒定區(kconstantregion)基因連接，并且被克隆到pcDNA3.1/ZE0(+)載體的HinDIll和EcoRI酶切位點之間，VEGFR3基因信號肽和Ig1-2區與重鏈恒定區(IgGlconstantregion)基因連接，同樣被亞克隆到另一pcDNA3.1(+)載體的HinDIll和EcoRI酶切位點之間。上述質粒一起用脂質體法轉染CHO-Kl細胞，并用含600ug/mlG418和250ug/mlZeocin的選擇培養基篩選穩定表達可溶性雙功能VEGFR融合受體VEGFRIg的細胞克隆.利用ProteinA柱通過親和層析從細胞培養物的上清中純化可溶性雙功能VEGFR融合受體蛋白VEGFRIg。在本發明的另一個實施例中，公開了上述可溶性雙功能VECFR融合受體蛋白VEGFRFc的制備方法，為將上述獲得的VEGFR3基因信號肽和Ig1-2區與VEGFR1基因Ig2-3區用overlapPCR的方法連接，再將獲得的融合基因的3'端與人抗體Fc基因(SEQIDN0:5)相連，并且被克隆到pcDNA3.1(+)載體的HindIII和EcoRI酶切位點之間。上述質粒用脂質體法轉染CH0-K1細胞，并用含600ug/mlG418的選擇培養基篩選穩定表達可溶性雙功能VEGFR融合受體VEGFRFc的細胞克隆.利用ProteinA柱通過親和層析從細胞培養物的上清中純化可溶性雙功能VEGFR融合受體蛋白VEGFRFc。發明的申請人對上述的可溶性雙功能VECFR融合受體進親和力檢測、抑制HUVEC細胞增殖、體內抑瘤和抑制腫瘤轉移等實驗，實驗結果表明，本發明公開的可溶性雙功能VEGFR融合受體可以與VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D結合，同時具有可溶性VEGFR1和VEGFR3的功能，可以結合VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D四種血管內皮生長因子，阻斷其信號傳導通路。一方面，它能夠能阻斷血管內皮細胞的活化，增值，分化和遷移，既阻斷腫瘤中新生血管的形成、減少腫瘤的供血和供氧，限制腫瘤的生長，又能降低血管通透性，減少腫瘤通過血管發生轉移的機會。另一方面，它能夠阻斷淋巴內皮細胞的激活，阻斷腫瘤中新生淋巴管的形成，阻止腫瘤細胞順淋巴管轉移的功能。這樣，就幾乎全部阻斷VEGF/VEGFR傳導途徑，阻斷腫瘤中內皮細胞分裂增殖、抑制新生血管的形成、降低血管通透性、減少腫瘤的供血和供氧，同時也可阻斷腫瘤內淋巴管生成，抑制腫瘤的淋巴管轉移，產生更強的抗腫瘤治療療效。此外，這個雙功能融合受體VEGFR1/VEGFR3-Fc將具有比VEGFR1-Fc和VEGFR3-Fc更大的分子量，因而其半衰期將明顯延長，實驗表明，在相等劑量下，雙功能融合受體具有比聯合應用VEGFR1-Fc和VEGFR3-Fc更好的抗腫瘤治療效果。本發明公開上述可溶性雙功能VECFR融合受體蛋白，可以和藥學上可以接受的輔料一起組成藥物制劑組合物從而更穩定地發揮療效，這些制劑可以保證本發明公開的融合受體蛋白氨基酸核心序列的構像完整性，同時還要保護蛋白質的多官能團防止其降解(包括但不限于凝聚、脫氨或氧化)。通常情況下，對于液體制劑，通常可以在2。C-8°C條件下保存至少穩定一年，對于凍干制劑，在30°C至少六個月保持穩定。在這里制劑可為制藥領域常用的混懸、水針、凍干等制劑，優選水針或凍干制劑，對于本發明公開的上述可溶性雙功能VECFR融合受體蛋白的水針或凍干制劑，藥學上可以接受的輔料包括表面活性劑、溶液穩定劑、等滲調節劑和緩沖液之一或其組合，其中表面活性劑包括非離子型表面活性劑如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐溫20或80);poloxamer(如poloxamer188);Triton;十二垸基硫酸鈉(SDS);月桂硫酸鈉；十四烷基、亞油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics;MONAQUATTm等，其加入量應使雙功能VECFR融合受體蛋白的顆粒化趨勢最小，溶液穩定劑可以為糖類，包括還原性糖和非還原性糖，氨基酸類包括谷氨酸單鈉或組氨酸，醇類包括三元醇、高級糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其組合，溶液穩定劑的加入量應該使最后形成的制劑在本領域的技術人員認為達到穩定的時間內保持穩定狀態，等滲調節劑可以為氯化鈉、甘露醇之一，緩沖液口r以為TRIS、組氨酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液之一。上述制劑為包含雙功能VECFR融合受體蛋白的組合物，在對包括人在內的動物給藥后，抗腫瘤效果明顯。具體來講，對腫瘤的預防和/或治療有效，可以作為抗腫瘤藥物使用。本發明所指的腫瘤，包括腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤，腫瘤組織的來源包括但不限于腎上腺、膽囊、骨、骨髓、腦、乳腺、膽管、胃腸道、心臟、腎臟、肝臟、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲狀旁腺、陰莖、前列腺、皮膚、唾液腺、脾臟、睪丸、胸腺、甲狀腺和子宮。除了上述的腫瘤外，還可用于中樞神經系統的腫瘤如膠質細胞多樣性瘤、星細胞瘤等，此外服部的腫瘤包括基底細胞癌、鱗狀細胞癌、黑色素瘤等，還包括內分泌腺腫瘤、神經內分泌系統腫瘤、胃腸道胰腺內分泌系統腫瘤，生殖系統腫瘤及頭頸部腫瘤等。這里不再--列舉。本發明所稱的抗腫瘤藥物，指具有抑制和/或治療腫瘤的藥物，可以包括伴隨腫瘤生長相關癥狀發展的延遲和./或這些癥狀嚴重程度的降低，它進一步還包括已存在的腫瘤生長伴隨癥狀的減輕并防止其他癥狀的出現，還也減少或防止轉移。本發明中雙功能VECFR融合受體蛋白及其組合物在對包括人在內的動物給藥時，給藥劑量因病人的年齡和體重，疾病特性和嚴重性，以及給藥途徑而異，可以參考動物實驗的結果和種種情況，總給藥量不能超過一定范圍。具體講靜脈注射的劑量是11800mg/天。本發明公開的雙功能VECFR融合受體蛋白及其組合物還可以和其他的抗腫瘤藥聯合給藥，用于腫瘤的治療，這些抗腫瘤藥包括1、細胞毒類藥物(1)作用于DNA化學結構的藥物烷化劑如氮芥類、亞硝尿類、甲基磺酸酯類；鉑類化合物如順鉑、卡鉑和草酸鉑等；絲裂霉素(MMC);(2)影響核酸合成的藥物二氫葉酸還原酶抑制劑如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制劑如氟尿嘧啶類(5FU、FT—207、卡培他濱)等；嘌呤核苷合成酶抑制劑如6—巰基嘌呤(6—MP)和6—TG等；核苷酸還原酶抑制劑如羥基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制劑如阿糖胞苷(Ara-C)和健擇(Gemz)等；(3)作用于核酸轉錄的藥物選擇性作用于DNA模板，抑制DNA依賴RNA聚合酶，從而抑制RNA合成的藥物如放線菌素D、柔紅霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光輝霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的藥物紫杉醇、泰索帝、長春花堿、長春瑞濱、鬼臼鹼類、高三尖杉酯堿；(5)其他細胞毒藥門冬酰胺酶主要抑制蛋白質的合成；2、激素類抗雌激素三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制劑氨魯米特、蘭特隆、來曲唑、瑞寧德等；抗雄激素氟它氨RH-LH激動劑/拮抗劑諾雷德、依那通等；3、生物反應調節劑主要通過機體免疫功能抑制腫瘤干擾素；白細胞介素一2;胸腺肽類；4、單克隆抗體美羅華(MabThera);Cetuximab(C225);赫賽汀(Trastuzumab)Bevacizumab(Avastin);5、其他括一些目前機制不明和有待進一步研究的藥物；細胞分化誘導劑如維甲類；細胞凋亡誘導劑。本發明公開的雙功能VECFR融合受體蛋白及其組合物可以和上述的抗腫瘤藥物之一或其組合聯合用藥。圖1pDRl表達載體結構示意圖，hCMVpro表示人巨細胞病毒MajorImmediate早期啟動子；BGHpA表示Bovinegrowthhormone多腺苷化信號；SV40ori表示SV40病毒早期復制起點；DHFR表示二氫葉酸還原酶基因；pUCorigin為質粒復制起點；AMP為氨芐青霉素抗性基因；圖2.VEGFRIg-L基因結構示意圖3.VEGFRIg-H基因結構示意圖4.VEGFRIg雙功能融合受體結構示意圖5.VEGFRFc基因結構示意圖6.VEGFRFc雙功能融合受體結構示意圖7.雙功能融合受體與VEGF結合力實驗；圖8.雙功能融合受體與VEGF-C結合力實驗；圖9.雙功能融合受體與VEGF的競爭抑制曲線；圖IO.雙功能融合受體與VEGF-C的競爭抑制曲線；圖ll.雙功能融合受體抑制HUVEC細胞增殖活性實驗具體實施方式以下實施例、實驗例對本發明進行進一步的說明，不應理解為對本發明的限制。實施例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些用于構建載體和質拉的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質拉的方法或將質粒引入宿主細胞的方法.這樣的方法對于本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，并且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.,Fritsch,E.F.andManiais，T.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndedition,ColdspringHarborLaboratoryPress,實施例l.人抗體輕、重鏈恒定區和Fc區基因的克隆用淋巴細胞分離液分離健康人淋巴細胞，用Trizol試劑(Invitrogen公司產品)提取總RNA，根據文獻(Cell,1980，22:197-207)和文獻(NucleicAcidsResearch,1982，10:4071-4079)報道的序列分別設計引物擴增抗體重鏈和輕鏈恒定區基因，并用引物FC有義GAAGCTTAATAATGGCCCGGGCGAGCCCAAATCTTGTGAC和FC反義CGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGG擴增抗體Fc區。PCR反應均采用熱啟動，反應條件94"C分鐘；94°C45秒，60°C45秒，72T1分10秒，30個循環；72。C10分鐘。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化回收并克隆到pGEM-T載體中，測序驗證后確認獲得了正確的克隆。SEQIDN0:1和SEQIDN0:2分別顯示了重鏈恒定區(CH)的核苷酸和氨基酸序列。SEQIDN0:3和SEQIDN0:4分別顯示了輕鏈恒定區(CD的核苷酸和氨基酸序列。SEQIDNO:5和SEQIDNO:6分別顯示了Fc區的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正確克隆記作pGEM-T/CH、pGEM-T/CL和pGEM-T/Fc。實施例2:可溶性雙功能VEGFR融合受體的構建用淋巴細胞分離液分離健康人淋巴細胞，用Trizol試劑(Invitrogen公司產品)提取總認A，以引物VEGFRll有義TAAGCTTGCCGCCACCATGGTCAGCTACTGGGAC，(Invitrogen公司合成)，做RT—PCR獲得VEGFR1基因Ig1-3區，裝入PGEM-T載體(PGEM-T/VEGFR1)，VEGFR3基因根據embl|AR860556|AR860556中序列(請上海生物工程技術服務有限公司全基因合成)，VEGFR1基因信號肽(以引物VEGFR11有義TAAGCTTGCCGCCACCATGGTCAGCTACTGGGAC;VEGFRll反義ACGAAAGGTCTACCTCCGGAACTAGATCCTGTGAGAAG以PGEM-T/VEGFR1為模板擴增)和Ig2-3區(以引物VEGFR12有義TCCGGAGGTAGACCTTTCG;VEGFR12反義CAGATGGTGCAGCCACAGTGCCCGGGCCTGCTTTATCATATATATGCACTGAGG，以PGEM-T/VEGFR1為模板擴增)與人抗體輕鏈恒定區(kconstantregion)基因(以引物LC有義ACTGTGGCTGCACCATCTGT;LC反義GAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTG以pGEM-T/CL為模板)以overlapPCR連接(序列見SEQIDNO:1)，并且被克隆到pGEM-T載體(Promega公司產品)中，挑選陽性克隆，測序正確，以HinDIll和EcoRI酶切(Promega公司產品)，經瓊脂糖凝膠電泳純化回收獲得lkb的酶切片斷與同酶切的質粒pcDNA3.1/ZE0(+)(Invitrogen公司產品)用T4DNA連接酶(Invitrogen公司產品)進行連接，構建成真核表達載體pcDNA3.1/ZEO(+)(VEGFRIg-L)。圖2為VEGFRIg-L的基因結構圖。SEQIDN0:7和SEQIDN0:8分別顯示了VEGFRIg-L的核苷酸和氨基酸序列。VEGFR3基因信號肽和Ig1-2區(以引物VEGFR31有義TAAGCTTGCCGCCACCATGCAGCGGGGCGCCGCGCT;VEGFR31反義AGCTAGCGCCTGTGATGTGCACCAGGAAG,以PGEM-T/VEGFR1為模板擴增)，經瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產物并克隆到pGEM-T載體(Promega公司產品)中，篩選陽性克隆測序。將測序正確的克隆用HindIII和NheI雙酶消化，回收700bp酶切片斷與與同酶切的質粒pGEM-T/CH連接，挑選正確克隆后以HinDI11和EcoRI酶切，經瓊脂糖凝膠電泳純化回收2.3kb片段，與同酶切的質粒pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司產品)用T4DNA連接酶(Invitrogen公司產品)進行連接，構建成真核表達載體pcDNA3.1(+)(VEGFRIg-H)。圖3為VEGFRIg-H的基因結構圖。SEQIDN0:9和SEQIDNO:IO分別顯示了VEGFRIg-H的核苷酸和氨基酸序列。于3.5cm組織培養皿中接種3X105CH0-Kl細胞，細胞培養至90%-95%融合時進行轉染取質粒10ug(質粒pcDNA3.1(+)(VEGFRIg-H)4yg，質粒pcDNA3.1/ZE0(+)(VEGFRIg—L)6ug)禾tl20u1Lipofectamine2000Reagent[Invitrogen公司產品]分別溶于500u1無血清固EM培養基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混合，室溫孵育20分鐘以使DNA-脂質體復合物形成，其間用3ml無血清的固EM培養基替換培養皿中的含血清培養基，然后將形成的DNA-脂質體復合物加入到板中，C02孵箱培養4小時后補加2ml含10%血清的DMEM完全培養基，置于C02孵箱中繼續培養。轉染進行24h后細胞換含600ug/mlG418和250ug/mlZeocin的選擇培養基篩選抗性克隆。取細胞培養上清用ELISA檢測篩選高表達克隆小鼠抗人IgG(CH2)包被于ELISA板，4°C過夜，用2%BSA-PBS于37°C封閉2小時，加入待測的培養上清和標準品(HumanmyelomaIgGl，K)，37°C孵育2小時，加入服P-小鼠抗人IgG(CH3)進行結合反應，37。C孵育1小時，加入TMB于37。C作用5分鐘，最后用H2SCX終止反應，測OD頓,值。將篩選得到的高表達克隆用無血清培養基擴大培養，用ProteinA親和柱(GE公司產品)分離純化VEGFRIg融合受體。將純化融合受體用PBS進行透析，最后以紫外吸收法定量。圖4為VEGFRIg融合受體結構圖。上述獲得的VEGFR3基因信號肽和Ig1-2區與VEGFR1基因Ig2-3區用overlapPCR的方法連接，經瓊脂糖凝膠電泳純化回收獲得1.3kb并且被克隆到pGEM-T載體體(Promega公司產品)中，挑選陽性克隆，測序正確，以HinDIll和Smal雙酶切(Promega公司產品)，經瓊脂糖凝膠電泳純化回收獲得1.3kb的酶切片斷N端連接PGEM-T/Fc(IgGlFc)(Sequence9)，挑選陽性克隆，，以HinDIll和EcoRI雙酶切(Promega公司產品)，經瓊脂糖凝膠電泳純化回收獲得2kb的酶切片段與同酶切的質粒pcDNA3.1(+)用T4DNA連接酶(Invitrogen公司產品)進行連接，構建成真核表達載體pcDNA3.1(+)(VEGFRFc)。圖5為VEGFRFc的基因結構圖。SEQIDNO:11和SEQIDNO:12分別顯示了VEGFRFc的核苷酸和氨基酸序列。于3.5cm組織培養皿中接種3X105CHO-Kl細胞，細胞培養至90%-95%融合時進行轉染取pcDNA3.1(+)(VEGFRFc)質粒10和20y1Lipofectamine2000Reagent[Irwitrogen公司產品]分別溶于500ul無血清匿EM培養基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混合，室溫孵育20分鐘以使DNA-脂質體復合物形成，其間用3ml無血清的函EM培養基替換培養皿中的含血清培養基，然后將形成的DNA-脂質體復合物加入到板中，C02孵箱培養4小時后補加2ml含10%血清的DMEM完全培養基，置于0)2孵箱中繼續培養。轉染進行24h后細胞換含600yg/mlG418的選擇培養基篩選抗性克隆。取細胞培養上清用ELISA檢測篩選高表達克隆小鼠抗人IgG(CH2)包被于ELISA板，4。C過夜，用2%BSA-PBS于37°C封閉2小時，加入待測的培養上清和標準品(HumanmyelomaIgGl，K)，37。C孵育2小時，加入服P-小鼠抗人IgG(CH3)進行結合反應，37。C孵育1小時，加入TMB于37。C作用5分鐘，最后用H2S0J冬止反應，測OD咖值。將篩選得到的高表達克隆用無血清培養基擴大培養，用ProteinA親和柱(GE公司產品)分離純化VEGFRFc融合受體。將純化融合受體用PBS進行透析，最后以紫外吸收法定量。圖6為VEGFRFc融合受體結構圖。實驗例實驗例1:可溶性雙功能VEGFR融合受體親和力檢測實驗-ELISA法實驗步驟分別將VEGF、VEGF-C(腿D公司產品)用O.05mmol/L碳酸鈉.碳酸氫鈉緩沖液(pH9.6)稀釋成2ug/ml，100ul/孔，4。C包被過夜。3%脫脂奶室溫封閉2h后，加入不同濃度的可溶性VEGFR融合受體VEGFRFc、VEGFRIg，100u1/孔，每個濃度取3個平行孔，室溫孵育2h。棄上清液，PBS洗滌3次，加入按效價稀釋好的HRP標記的小鼠抗人IgG單抗(DAK0公司產品)，50u1/孑L，室溫孵育45min。PBS充分洗滌后，0PD避光顯色，加入2mol/L仏304終止反應后，置酶標儀(Elx型自動酶標比色儀，美國BIO-TEK公司)中測定492nm吸光度(A492)值。實驗結果如圖7，圖8所示。實驗結果表明可溶性VEGFR融合受體VEGFRFc、VEGFRIg可同時結合VEGF、VEGF-C，且結合力與VEGFR1Fc和VEGFR3Fc相似。實驗例2:可溶性雙功能VEGFR融合受體親和力檢測實驗不同量的可溶性雙功能VEGFR融合受體與50ng的VEGFRlFc(分別為AP標記的VEGFR1Fc(見文章Suppressionoftumorangiogenesisandgrowthbygenetransferofasolubleformofvascularendothelialgrowthfactorreceptorintoaremoteorgan.Takayama，-K，Cancer-Res.2000Apr15;60(8):2169-77)、VEGFR3Fc(見文章.InhibitionoflymphangiogenesiswithresultinglymphedemaintransgenicmiceexpressingsolubleVEGFrec印tor-3TAIJAM紐INENNATUREMEDICINE200147199-205)混合并在室溫濕育l個小時。將混合物轉移到用VEGF(200ng/孔)或VEGF-C(200ng/孔)(R&D公司產品)包被的96孔微量滴定權并在室溫繼續溫育2小時，然后將滴定板洗5次，加入AP的底物以對結合的VEGFRFc—AP分子定量.然后計算IC50，即，50%抑制VEGFR融合受體與VEGF結合所需要的VEGFR融合受體濃度。如圖9，圖10所示，可溶性VEGFR融合受體VEGFRFc、VEGFRIg可同時競爭性抑制VEGF、VEGF-C與VEGFRlFc和VEGFR3Fc的結合。實驗例3:可溶性雙功能VEGFR融合受體抑制HUVEC細胞增殖實驗取生長狀態良好的HUVEC細胞，調整細胞濃度為2.5X10Vml，接種于96孔細胞培養板，200ul/孔，于37。C、5%C02孵箱中培養24h后換無血清培養基，繼續培養72h，加入不同濃度梯度的VEGFR融合受體，分別以VEGFRlFc，VEGFR3Fc,無關抗體G10為對照，每個濃度取3個平行孔，37t:孵育lh，加入終濃度為25ng/ml的VEGF繼續培養24h后，加入10ul[3H].TdR(18.5kBq/孔)，37。C孵箱中孵育7h，細胞收集器收集細胞于玻璃纖維濾膜上，采用H液閃計數儀進行測定。如圖11所示，可溶性VEGFR融合受體VEGFRFc、VEGFRIg比VEGFRlFc和VEGFR3Fc有更強的抑制HUVEC細胞增殖的活性。實驗例4可溶性雙功能VEGFR融合受體體內抑制腫瘤生長實驗實驗步驟為檢測可溶性雙功能VEGFR融合受體體內抑瘤活性，首先用PC-3-mlg2細胞(人前列腺癌細胞PC-3(ATCC:CRL-1435)選自體內淋巴結轉移的亞系，轉染表達熒光素酶報告基因)，接種于到雌性重癥免疫缺陷小鼠(第二軍醫大學實驗動物中心)右腹側皮下，接種腫瘤當天給予可溶性雙功能VEGFR融合受體25mg/kg(VEGFRFc、VEGFRIg)及對照VEGFRlFc,VEGFR3Fc和空載體，然后隔天皮下注射持續一周.兩周后，小鼠用定影劑灌注，腫瘤取出固定，測量腫瘤的長寬，計算腫瘤體積，結果如表1所示。表1可溶性雙功能融合受體抑制腫瘤生長活性實驗結果(x士s，n二10)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注a，VEGFR1FC+VEGFR3Fc組與VEGFRlFc組，P=0.004;b，VEGFRlFc組與VEGFRlFc組，P=0.004;c，VEGFRIg組與VEGFRlFc組，P二0.002;d，VEGFRlFc組與VEGFRlFc+VEGFR3Fc組，P=0.008;e，VEGFRIg與VEGFRlFc+VEGFR3Fc組，P=0.007。(非配對t檢驗)結果表明可溶性雙功能VEGFRIg融合受體可以顯著抑制腫瘤的生長.實驗例5:可溶性雙功能VEGFR融合受體體內抑制腫瘤轉移實驗實驗步驟PC-3-mlg2細胞是人前列腺癌細胞PC-3(ATCC:CRL-1435)選自體內淋巴結轉移的亞系，轉染表達熒光素酶報告基因的慢病毒載體后，接種于雌性重癥免疫缺陷小鼠右腹側皮下。接種腫瘤當天給予可溶性雙功能VEGFR融合受體25mg/kg(VEGFRFc、VEGFRIg)及對照VEGFRlFc，VEGFR3Fc和空載體，然后隔天皮下注射持續3周.6周后腹腔注射熒光素底物15mg/g，15min后，處死小鼠，檢測淋巴結轉移數目及轉移淋巴結的大小和熒光強度。實驗結果見表2表2可溶性雙功能融合受體抑制腫瘤淋巴轉移活性(x士s，n=10)<table>complextableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>注a，VEGFR1FC+VEGFR3Fc組與VEGFRlFc組，P二O.007;b，VEGFRlFc組與VEGFRlFc組，P=0.007;c，VEGFRIg組與VEGFRlFc組，P=0.008;d，VEGFRlFc組與VEGFRlFc+VEGFR3Fc組，P=0.008;e，VEGFRIg與VEGFRlFc+VEGFR3Fc組，P=0.009;f，與陰性對照組，p〉0.3。(非配對t檢驗)上述結果表明，可溶性雙功能VEGFR融合受體可明顯抑制腫瘤的淋巴結轉移。從以上實驗結果可以看出，本發明公開的上述可溶性雙功能VEGFR融合受體達到了本發明的目的。SEQUENCELISTINGSEQIDNO:l<110>上海中信國健藥業有限公司上海國健生物技術研究院〈120〉可溶性VEGFR雙功能融合受體、其制備方法及用途〈130〉WulffC等，JClinEndocrinolMetab.2001,86(7):3377-86〈150>CN200610147288.0<151>2006-12-14<160〉12〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1<211>990〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉1gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctcc犯gagcacctctggg60ggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg120tgg犯ctcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca180ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccsgacc240tacatctgcacaagcccagca^caccaagga>gttga_gccc300aaatcttgtgcacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggs360ccgtcagtcttcctcttcccccc3aa3ccc犯ggacsccctcatgatctcCCgg3CCCCt420gaggtcacatgcgtggtggt卿cgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactgg480tacgtggscggcgtgg鄉tgcat犯tgccCgCggg3gg3540agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg^tggc^g600gagtacaagtgcaaggtctcc33caB3gccctcccagcccCC已tCg3g肌aaccatctcc6603aagcc3^gggcagccccgag犯ccacaggtgtacaccctgcccccatcccggg郷ag720accaggtcagcctgacctgcCtggtC犯3ggcttctatccC3gCg3C3tC780gccgtggaigtggg卿gc肌tgggcagccgga_g3acaactgcctcccgtg840ctggactccgscggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaag郎c鄉tgg900cagc鄉ggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacg960tctccctgtcCCCgggt333990SEQIDNO:2<210〉<211>318〈212>腿<213〉人工序列〈400〉2actgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctgga60actgcctctgttgtgtgcctgctgaat犯cttctatcccag卿ggccaa8gt3C3gtgg120已aggtggataacgccctccsatcgggt犯ctcccaggagagtgtcacagagC3gg3C8gC180aaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagca^agC8g3240cacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtC3C33ag3gc300ttcaacagggg卿gtgt318SEQIDNO:3〈210>3〈211>693〈212〉■〈213〉人工序列〈400〉3ggcccgggcgagccca^tcactcacacatgcccaccgtgcccagcacct60gaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaagg己caccctcatg120atctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggscgtgagccacgaagaccctgag180gtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgatgccaagaca卿ccgcgg240gaggagcagtgtaxxgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgC￡LCCaggaC300tggctgaatgcaagtgc犯ggtctccaacaaagccctcccagcccccatc360gagaaaaccatctccaaagcca卿ggceigccccgagaaccacaggtgtacaccctgccc420ccatctcggg鄉聊tgacc^ga^ccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttc480tatcccagcgacatcgccgtggsgtgggsgagc組gggcc犯ctac犯g540accacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttccgctcaccgtg600gaca3gagc3ggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctg660cac犯ccactgagcctctccctg693SEQIDNO:4〈210〉4〈211>330〈212>PRT〈213〉人工序列<400>4AlaSerThr1SerThrPheProGlyVal50L>euSer65TyrlieSerGlu35HisLysGly20ProGly5GlyProSerValPheProLeuAlaProSer10ThrAlaAlaLeuGlyValThrValThrPheProSerValValCysAsnArgValGluProAlaLysPro130ValVal145TyrValGluGinHisGinLysAla210GinPro225MetThrPro115LysPro100GluVal85LysThr70AsnSerAla55ValSer40ValLeu25TrpCysI>euValAsnSerGlyLeuGinSerProSerSerHisLysProCysAspAspValAspValGlyLeuLeuThrLeuAspTyrAsp195LeuArgLysAsn180TrpVal165SerSer150GluGlyMet135HisGly120lieLys105ProSer90ThrSer75AsnSer60LeuHisThrSerValPheSerArgThrGluAspProValHisAsnThrTyrArgLeuAsnProAlaProGluProAsnGin245Gin230ValGlylie215ValLys200GluVal185GluAla170ValGlu155LysPro140ValTyrLysCysLysThrlieTyrThrLeuSerLeuThrCys250Pro235LeuSer220ProAla45GlyLeu125GluSerValLeuLys205LysLys30LeuSer15AspLysTyrThrSerLeuTyrSerGlyThrLysValCysThrGinPro110PheAsp95ProThr80LysCysProProValThrCysLysThrLysProPheAsnThr190ValArg175ValTrp160GluLeuSerAsnAlaLysGlySerArgGluValLysGlyPhe255Glu240TyrProSerAsplieAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGinProGluAsn260265270AsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePhe275280285LeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGinGinGlyAsn290295300ValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThr305310315320GinLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys325330SEQIDNO:5〈210〉5〈211〉106〈212>PRT<213〉人工序列〈400〉5ArgValAlaAlaProSerValPheliePheProProSerAspGluGin151015LeuLysSerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyr202530ProArgGlu'AlaLysValGinTrpLysValAspAsnAlaLeuGinSer354045GlyAsnSerGinGluSerValThrGluGinAspSerLysAspSerThr505560TyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLys65707580HisLysValTyrAlaCysGluValThrHisGinGlyLeuSerSerPro859095ValThrLysSerPheAsnArgGlyGluCys100105SEQIDNO:6〈210〉6〈211〉231<212>PRT<213>人工序列〈400〉6GlyProGly1GluLeuAspThrAspVai50GlyVal65AsnSerLeuLeu35SerCysGly20MetAsp5GlyLysThrHisThrCysProProCysPro10LeuProSerVallieSerArgHisGluAspGluValHisThrTyrTrpLeuAsnProAlaGluPro130AsnGin145lieAlaPro115GinGly100lieArg85LysValGluThrThrProLysLeuCysSer210LeuSerThr195ValPro180ValTrp165ValAsn70ValPro55AlaThr40GluValTyrThrValSerLeuThr150GluLeu135CysMetHisGluPhe25ProValPheProProLysThrValSerValGluTyrLysGluLysThrlie120ProCys105SerLeuAspSerAspLysSerLeuSerProGlyAla215LysArg200LeuGluValThrLysLysLeu90LysPhePro75ThrAsn60ArgCys45TrpValSerAsnLysAlaLysProSerArgLeuValLysSerAsnGlyAsp185TrpGin170GlyGly155ProGlu140PheGly125GluGinGinGlyHisAsnHisTyr220Asn205Thr30ValValLeuHisLys110GinSerPhePheLeu190ValAla15ProProLysValValTyrValAspGluGluGinGin95AlaProMetThrTyrProSerGluAsnAsnTyr175TyrTyr80AspLeuArgLysAsp160LysSerPheSerGinLysSer225230SEQIDNO:7〈210〉7<211>1008<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉7atggtcagct3Ctggg3C3Ccggggtcctgctgtgcgcgctgctcagctgtctgcttctc603ceigg3tct3gttccgg鄉tagacctttcgt昭卿tgtccccgaaatt120atacacatgactg鄉g犯gggagctcgtcattccctgccgggttacgtcacctaacatc180actgttactttccacttgacactttgatccCtg3tgg3犯acgcataatc240tggg織gtag咖gggcttwtcatatcaaatgcaacgtagggcttctg300acctgtgaagcaacagtc犯tgggcatttgactatctcacacatcgacaa360accaatacaatcatagatgtccaaataagc3C3CC3CgCCcagtcaaattacttagaggc420catactcttgtcctcaattgtactgctaccactcccttgaacacgagag"ttcaaatgacc480tggagttaccctgatgaaaagcttccgtaaggcgacg組tgaccaaagc540aattcccatgccaacat已ttctacagtgttcttactattgga^caaagac600aaaggactttatacttgtcgtgt肌ggagtggaccatcattcaaatctgttaacacctca660gtgcatatatatgataaagcaggcccgggcactgtggctgcaccatctgtcttcatcttc720ccgccatctgatgagcsgttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgCtg￡L￡lt33C780ttctatcccag卿ggcca3agtacagtggaaggtggat已acgccctcca3tCgggt3已C840tcccaggeigagtgtC3C3g333ggaiC￡LgC3cctacagcctcagcagcacc900ctgacgctgagcaaagcagactacgagaaaacgcctgcgaagtcacccat960C3gggCCtgBgctcgcccgtC3Ca犯g3gCttcaaragggg卿gtgt1008SEQIDNO:8〈210〉8<211〉336〈212〉PRT<213〉人工序列〈400〉8MetValSerTyrTrpAspThrGlyValLeuLeuCysAlaLeuLeuSer151015CysLeuLeuLeuThrGlySerSerSerGlyGlyArgProPheValGlu20GlulieProGluMetTyrSer35LeuVallieProCysArgSer25lieHisMetThrVal50LysPheProLeulie40ThrSerProAsnPhe30GlyArgGluLys65TrplieGlyLeuVal55ThrLeulieProAspSerArgGlyAsp70GlyPhelielielie60GlyGlu45ThrValThrLeuLys85ThrCysGluAlaAsp75AsnAlaThrLysArglieLeu100LeuThrHisArgSer90ValAsnGlyHisArgTyrThrAsnTyr115ThrProArgProThr105ThrAsnThrlieLys95Tyrlie80GluLyslieLeu145TrpSer130AsnGin120LysLeuLeuArgLeu110AspValGinCysTyrVal135ThrProLeuAsnlie125HisThrLeuValSerTyrProThrAlaThr150GluLysAsnLysGly140ArgValGinMetlieAspGinlieArgAsp225ProAspAspSer210LysAsp165AsnSerHisAlaSer180MetGinAsnLysArg170lieThr155AlaSerValArgLys195GlyProSerPheAsn185LysGlyLeuPheTyrSerAsp200SerValAsnThrTyrTyrArg175LeuThr160/\rgThrVal190CysArgValAlaGlyProGlyProSerAspGly230GinLys215ThrValAlaAlaThr205ValHislieTyrSer220SerValPhelieLeuLeuAsnAsn260Glu245PheTyrProLeuLysSerLysArgPro235ThrAlaSerValGlu265Gly250AlaLysValGinTrp270Val255LysPhe240CysValAspAsnAlaLeuGinSerGlyAsnSerGinGluSerValThrGluGin275280285AspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSer290295300LysAlaAspTyrGluLysHisLysValTyrAlaCysGluValThrHis305310315320GinGlyLeuSerSerProValThrLysSerPheAsnArgGlyGluCys325330335SEQIDNO:9<210〉9〈211〉1668<212〉DNA〈213〉人工序列<400〉9atgcagcggggcgccgcgctgtgcctgcgactgtggctctgcctgggactcctggacggc60Ctggtg3gtgactactccatgacccccccgaccttg^catcacggaggagtcacacgtc120atcgacaccggtgacagcctgtccatctcctgcaggggacagcaccccctcgagtgggct180tggcc已ggagctcagg鄉cgccagccaccgg卿c卿gacEigcgaggscacgggggtg240gtgcg卿ctgcg鄉gcac卿cgccaggccctactgcaaggtgttgctgctgcacgag300gtacatgcc已acgacacaggcagctacgtctgctactacaagtac3tc3aggcacgcatc360g郷gC織Elcggccgccagctcctacgtgttcgtg卿gactttgagcagccattcatc420aacaagcctgacacgctcttggtcaacaggaaggacgccatgtgggtgccctgtctggtg480tccatccccggcctcaatgtcacgctgcgctcgcaaagctcggtgctgtggcc卿cggg540caggaggtggtgtgggatgaccggcggggcatgctcgtgtccacgccactgctgcacgat600gccctgtacctgcagtgcgagaccacctgggg卿ccaggacttcctttccaaccccttc660ctggtgcacatcacaggcgcggcccatcggtcttccccctggcaccctcc720tccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtC卿g3ctacttcccc780gaaccggtgacggtgtcgtgg已actcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccg840gctgtcctac3gtcctcaggactctactccctcagcsgcgtggtgaccgtgccctccagc900agcttgggcacccagacctacatctgcaacagccceigc犯caccaaggtg960g3③g卿gstcttgtgaccatgcccaccgtgcccagca1020cctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttcccccggacaccctc1080atgatctcccggacccctgaggtcacstgcgtggtggtgg3Cgtg3gCC3Cg33g3CCCt1140gaggtc鄉ttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcata^tgccaagacaaagccg1200cgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctxaccgtcctgcaccag1260gactggctgaatggc鄉g3gtacaagtgc犯ggtCtCC3ac犯agccctcccagccccc1320atcgagaa^ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctg1380CCCCC3tXCCcaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggc1440ttctatcccagcgacatcgccgtggagtggg卿gc犯tgggcagccggagaacaactac1500aagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcacc1560gtggacaagagc郷tggcagc站g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LeuGlu500ThrAsnHis485ValHisAsnAlaGlu475LysPheAsnVal490ThrLysProArgCysTrpTyrGlyArgLysValGlu535Lys505SerValLeuThrValVal480TyrVal495GluGinVal520TyrLysCysLysGlu510LeuHisGinVal540Val525SerAsnLysAlaLeuProAlaProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGinPro545550555560ArgGluProGinValTyrThrLeuProProSerArgGluGluMetThr565570575LysAsnGinValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSer580585590AsplieAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGinProGluAsnAsnTyr595600605LysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyr610615620SerLysLeu■ThrValAspLysSerArgTrpGinGinGlyAsnValPhe625630635640SerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGinLys645650655SerLeuSerLeuSerProGlyLys660權利要求1.一種可溶性雙功能VEGFR融合受體，為包含VEGFR1和VEGFR3在內的融合蛋白，既能與VEGF和VEGF-B結合，還能與VEGF-C或VEGF-D相結合。2.權利要求1所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體，為VEGFRIg，具有SEQIDN0:8和SEQIDN0:10所示的氨基酸序列。3.權利要求1所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體，為VEGFRFc，具有SEQIDN0:12所示的氨基酸序列。4.一種分離的核酸分子，編碼權利要求1所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體。5.—種分離的核酸分子，編碼權利要求2所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體VEGFRIg，具有SEQIDN0:7和SEQIDN0:9所示的核苷酸序列。6.—種分離的核酸分子，編碼權利要求3所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體VEGFRFc，具有SEQIDNO:11所示的核苷酸序列。7.—種載體，含有權利要求4、5、6任一所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相連的表達調控序列，其中載體可以為pDRl，pcDNA3.1(+)，pcDNA3.1/ZE0(+)，pDHFR之一。8.權利要求7所述的載體，為pcDNA3.1(+)或pcDNA3.1/ZE0(+)。9.一種宿主細胞，含有權利要求7所述的載體，為真核細胞。10.權利要求9所述的宿主細胞，為哺乳動物細胞。11.權利要求IO所述的宿主細胞，為CH0細胞。12.—種制備權利要求1-3任一所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體的方法，該方法包括a)在表達條件下，培養權利要求9-ll任一所述的宿主細胞，表達雙功能融合受體，b)分離或純化所述的雙功能融合受體。13.—種組合物，含有權利要求1-3任一所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體和藥學上可接受的載體。14.權利要求1-3任一所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體在制備抗腫瘤藥物中的用途。15.權利要求13所述的組合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。16.權利要求14、15任一所述的用途，還包括和其它的抗腫瘤藥物聯合使用。全文摘要本發明公開了一種可溶性VEGFR雙功能融合受體、其制備方法及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。更具體地，本發明公開了可溶性VEGFR雙功能融合受體VEGFRFc和VEGFRIg。文檔編號C07K14/435GK101205252SQ20071019386公開日2008年6月25日申請日期2007年12月3日優先權日2006年12月14日發明者盛侯,庚寇,張大鵬,李博華,皓王,郭亞軍,錢衛珠申請人:上海中信國健藥業有限公司;上海國健生物技術研究院