Opg-hsp70融合蛋白的制備方法及用途的制作方法

專利名稱：Opg-hsp70融合蛋白的制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及使用大腸桿菌表達制備重組骨保護素-熱休克蛋白70 (OPG-HSP70)融合蛋 白的方法，含有由該方法制備的重組骨保護素-熱休克蛋白70 (OPG-HSP70)的藥物制劑以 及該藥物制劑在制備預防或治療類風濕關節炎中的藥物中的用途。
背景技術：
類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一種T細胞介導的，以滑膜炎癥為主要 特征，同時伴有關節軟骨及骨損傷的自身免疫性疾病。RA在中國的患病率為0.32%~0.38 %，且致殘率高，RA給勞動力、社會經濟造成的損失是巨大的。而RA又是一種難治性疾 病，雖然現有治療手段多種多樣，但都不甚理想。本發明針對RA發病中骨損傷及慢性炎 癥反應這兩個相關聯的RA的關鍵性病理學問題，研制OPG-HSP70融合蛋白，為RA的治 療開辟了一種新的思路。
近幾年，對于破骨細胞(osteoclast, OC)的研究不僅引發了免疫調節、骨代謝疾病中的 理論研究，也為臨床診斷和治療骨代謝性疾病提供了新的依據。對OC從細胞生物學和分 子生物學方面等進行的研究，開辟了各種骨相關疾病的藥物研發的新領域(N Engl J Med. 2005，353(9):872-75)。由于OC是形成侵蝕性關節炎的必要成分，因此其可以作為RA治療 的一個靶點。
OC的分化和/或功能變化所導致的骨再建失衡是多種代謝性骨病，如骨質疏松癥、骨 質硬化癥和畸形性骨炎(Paget骨病)等形成的病理基礎。目前己經證明多種激素和局部細 胞因子如活性維生素D3、糖皮質激素、甲狀旁腺素(PTH)、前列腺素(PGE2)、 IL-6、 IL-ll 、 IL-12等不僅能調節OC生成，還能調節OC的功能。這些因子主要作用于成骨/基質細胞， 通過調節骨保護素(osteoprotegerin， OPG)和NF-kB受體活化因子配體(receptor activator of NF-kB ligand， RANKL)的表達，調控OPG、 RANKL和NF-kB受體活化因子(receptor activator of NF-kB, RANK)之間的比例，介導OC生成并維持其功能。因此OPG、 RANKL 及RANK是OC的最終調節因子。3種分子在OC分化成熟過程中的相互關系及作用機理的 闡明，為多種代謝性骨病的防治提供了理論依據(CurrOpinRheumatol. 2003, 15(3):280-7)。
1997年OPG被發現，它屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員，有單體和由二 硫鍵連接的同源二聚體兩種形式，分子量分別為60kD和120kD。單體存在于成骨細胞內， 而二聚體可分泌入基質中，是一種分泌型糖蛋白。OPG在進化中高度保守，大鼠和小鼠OPG的同源性為94%，小鼠和人OPG的同源性為89%。 OPG最初含401個氨基酸殘基，在合 成過程中因去除21個氨基酸殘基組成的信號肽，最終成為含380個氨基酸的成熟蛋白質。 其N端有4個富含半胱氨酸的功能域(D1 D4)與其配體結合，C端與已知的蛋白沒有同 源性。許多組織器官可以表達OPGmRNA，如肺、心臟、腎臟、肝、胃腸、腦、脊柱、甲 狀腺等，其主要作用是抑制骨吸收(Cell. 1997， 89(2):309-19)。實驗表明，去除OPG的C端 部分(至194aa)并不影響OPG活性，因此包括TNFR樣功能區的OPGN端序列對于抑制 OC分化成熟是必需的也是足夠的。
在發現OPG的一年后，美國的同一個研究小組又發現了 OPG的配體OPGL(Cell. 1998, 93(2):165-76)，即RANKL，屬TNF超家族成員，存在膜結合型和可溶性兩種形式，主要由 成骨細胞和骨髓基質細胞表達，可以促進OC分化、刺激其活化并提高OC存活率。這些作 用出現于RANKL與其受體RANK結合時，并最后表現為對骨的吸收。RANK表達于破骨 細胞的前體細胞表面，與成骨/基質細胞表面的RANKL結合，可啟動OC的分化和成熟。 OPG作為RANK的誘餌受體(decoy receptor),以競爭的方式，高親和性地與RANKL特 異性結合，阻止RANKL與OC上的RANK結合，負向調節OC的分化和活化并促進破骨 細胞凋亡，從而抑制骨吸收，在骨代謝調節中起著關鍵性作用。實驗研究表明，OPG缺陷 型小鼠出現嚴重的骨質疏松，并伴有低骨礦物密度和多發性骨折以及嚴重的動脈硬化，這 是由于RANKL和RANK的結合增加，從而導致OC的形成所致。給正常小鼠重組OPG可 以提高其脛骨和股骨的骨量，并可以補償卵巢切除后由于雌激素喪失而引起的骨丟失。用 PG治療青少年Pegat骨病取得了良好的效果，且沒有明顯的副反應發生(N Engl J Med. 2005, 353(9):918-23)。 2005年舉行的美國內分泌學會(ENDO)年會上，報告了將重組的 OPG應用于40 70歲婦女，可以降低人體對骨的再吸收。這些臨床研究進一步說明了 OPG 在防止骨破壞方面具有良好的應用前景。
RA的關節破壞包括滑膜表面、關節軟骨和軟骨下骨的侵蝕。近期研究發現OC是RA 關節破壞的關鍵成份，在病灶部位有大量的成熟OC及OC前體，另外活性淋巴細胞、巨噬 細胞、成骨細胞和其他細胞表達多種細胞因子，作用于OC生成、分化、活化等各個環節， 使OC過度增殖或異常活躍，打破了骨代謝的平衡，骨的破壞占據優勢。目前認為活化的T 淋巴細胞表達的RANKL是RA中的關鍵調節因子，可為RA中免疫系統與骨代謝提供聯系 (Arthritis Rheum. 2006， 54(6): 1772-7)。 RA關節病變部位出現的大量活化的T淋巴細胞能夠 直接通過膜結合型的RANKL和可溶性RANKL啟動破骨細胞的生成，使關節部位形成更 多的OC前體和成熟OC，并引起骨丟失。多種T細胞來源的細胞因子可能干擾RANK信 號通路，從而影響OC的生成，如IL-12、 IL-18、 IL-4等。其中IL-4作為抗炎性細胞因子通過STAT-6依賴機制抑制OC的分化，最新研究表明IL-4通過抑制NF-kB和(^2+信號通 路直接作用于OC而抑制骨的再吸收(J Immunol. 2005, 175(2):917-25)。在佐劑型關節炎動物 模型中，炎癥活動部位可檢測到RANKL的表達，且與OC的增加、活化相一致，從而導致 嚴重骨與關節破壞。給予OPG可阻抑骨關節的破壞，但對免疫炎癥反應無改善作用(Nature. 1999,402(6759):304-9)。在膠原誘導的關節炎(collagen-induced arthritis , CIA)模型中OPG 亦能減少或阻止骨破壞，但對滑膜炎癥沒有作用(Am J Pathol. 2002， 161(4):1419-27)。由此 表明，OPG并不能解決RA的慢性炎癥問題，炎癥仍是相當棘手的問題。動物試驗發現，T 細胞在RA炎癥的發生發展中起著重要作用，近年來的研究提示，熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)可通過調節T細胞功能抑制RA的炎性反應。
熱休克蛋白屬于分子伴侶蛋白，不僅僅對細胞內一些蛋白質分子構象和穩定性起調節 性作用，還對細胞應激、代謝、增殖以及凋亡等生理過程具有重要的調控作用。根據單體 分子量的大小，熱休克蛋白可分有6個家族HSPIO、 HSP40、 HSP60、 HSP70、 HSP90和 HSPIOO。其中HSP70作為免疫顯性抗原，在進化中高度保守，哺乳動物的HSP與微生物 的HSP有很高的同源性，所以也很容易引起免疫交叉反應。隨著對免疫調節機制特別是調 節性T細胞的深入研究，HSP的免疫調節作用也逐漸被人們所認識。HSP誘導調節性T細 胞的能力是其他細菌保守抗原所不具備的，它可能與參與固有免疫應答細胞的某些HSP受 體有關，而這些受體又是連接固有免疫應答和適應性免疫應答的橋梁。哺乳動物和細菌的 HSP都可以直接活化APC (巨噬細胞和樹突狀細胞)，這種作用可能是通過結合到細胞表面 受體如CD14、 CD40、 TLRs、 CD36、 CD91和LOX1等實現的(Tissue Antigens. 2004, 64(4):442-51)。
HSP70作為免疫顯性抗原，可以被機體識別并產生相應的免疫反應。分析HSP70的表 位發現，只有那些能夠誘導自身HSP交叉反應性T細胞的表位才有保護作用。由于HSP70 進化保守區段在微生物與哺乳動物之間產生交叉反應，這些保守肽段產生的自身抗原交叉 反應性T淋巴細胞又可分泌抑制炎癥的細胞因子，如IL-4、 IL-10和TGF-p，從而激活了免 疫調節機制，直接抑制前炎癥性效應T淋巴細胞，或者調節APC，阻止炎性疾病的進程。 而且，HSP肽段的保護性作用與致病性作用無關。
研究表明用結核桿菌HSP70肽段免疫動物有較好的防治CIA的效果，關節炎指數明顯 下降、病理變化較輕、抑制性細胞因子IL-4水平升高，而炎性細胞因子IFN-"/水平和抗CII 抗體水平降低，與陽性對照組相比有顯著性差異(中國免疫學雜志.2006, 22(12):1092-5)。
鑒于滑膜炎和骨損傷是RA的兩個最顯著的病理學特征，我們將編碼OPG及HSP70功
能性片段的DNA片段連接(去除兩者的與治療RA無關的或對機體有害的肽段，并有利于制劑的制備)，插入原核表達載體pET28a。在此基礎上，對重組蛋白進行原核表達，并通 過分子篩或離子交換層析等方法對重組蛋白進行純化，采用SDS-PAGE、 Western-blot法等 對融合蛋白進行理化鑒定。其次，通過體內外生物活性實驗對融合蛋白做進一步分析。該 體系蛋白表達量高，可控性強，生產成本相對較低，且具有良好的生物學活性，容易實現 大規模生產。

發明內容
本發明的一個目的在于提供用大腸桿菌表達OPG-HSP70融合蛋白并分離純化制備 OPG融合蛋白的生產方法。
本發明還提供一種OPG-HSP70融合蛋白，及其在制備用于預防和治療類風濕關節炎的 藥物中的用途。
本發明的另一個目的是提供含有本發明的OPG-HSP70融合蛋白和藥學上可接受的載 體的藥物制劑。
本發明所述的OPG融合蛋白指OPG或其活性變體、片段與HSP或其變體、片段融合 而成的蛋白。
本發明提供一種編碼OPG與HSP70融合蛋白的核酸序列。但在某些實施方案中，可以 根據實際需要對核酸密碼子進行突變，選用大腸桿菌偏好密碼子，但編碼OPG-HSP70融合 蛋白的氨基酸序列不變。
本發明所述的OPG-HSP70融合蛋白，其為Rl-L-R2形式，其中Rl為OPG蛋白、或 其變體或片段，R2為HSP蛋白、或其變體或片段，L為接頭蛋白。
所述OPG蛋白，或其變體、片段選自
(a) SEQIDNo.l所示的蛋白序列；
(b) 氨基酸序列22-X，其中X為SEQIDNo.l所示的包括位置185—401的任意氨基酸 殘基。
所述的HSP70蛋白、或其變體或片段選自
(a) SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；
(b) 氨基酸序列ITDAVITTPAYFNDA。 所述接頭選自
(a) ala-(ala)n-ala， n可以是1 4間的整數；
(b) gly-(gly)n-gly, n可以是1 4間的整數；
(c) gly-pro-gly;
7(d) gly-gly-pro-gly-gly;
(e) ser- gly-(gly)n-gly， n可以是1 4間的整數；
(f) val;
(g) tyr-val;
(h) 亞部分(a)-(g)的任何組合。
本發明中所指的大腸桿菌包括大腸桿菌BL21 (DE3)等宿主細胞。本發明所使用的表 達載體可以選用各種已知的原核表達載體，將重組表達載體轉化至宿主細胞，利用合適的 條件篩選重組子，誘導表達OPG-HSP70融合蛋白。
在本發明的一個優選的實施例中，在合適的條件下發酵培養工程菌的步驟包括
將酶切鑒定正確的重組克隆質粒轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞，挑選單菌落 接種于5mL2xYT培養基(含25mg/L卡那霉素)，37'C振蕩過夜。次日1: 50轉接后，37°C 培養2h,加入IPTG使之終濃度為0.1mmol/L， 30'C繼續振蕩培養5h后離心收集菌體。
在本發明的一個優選的實施例中，從發酵產物中純化分離并復性出OPG-HSP70融合蛋 白包括以下要點
陽性克隆菌株于0.1mmol/LIPTG， 30。C誘導培養5h后，4°C， 6000r/min離心15min， 收集菌體，用預冷的20mM Tris-HCL(pI^7.9)緩沖液洗滌菌體，按每克濕菌體加10倍體積 的Buffer A[lMTris-HCl(pH8.0)， 5MNaCl， 0.5M EDTA(pH8.0)， 0.5%Tritonl00， 1MDTT] 重懸，加入溶菌酶至lmg/ml，同時加入PMSF至lmM，冰上放置30min后，間歇超聲破碎 菌體10min，離心收集包涵體沉淀，再分別用2M尿素包涵體洗滌液和Buffer A各洗兩次， 然后用8M尿素變性液溶解包涵體，4°C， 12000r/min離心45min，取上清。上清再經0.22um 的微孔濾膜過濾，即為含有目的重組蛋白的變性液。將大量表達的重組蛋白變性液通過超 濾濃縮的方法濃縮為6mg/mL。按尿素濃度逐步遞減(4M-3M-2M-1M-0.5M-0M)的方法配 好復性液(4M尿素，lmM還原型谷胱甘肽，O.lmM氧化型谷胱甘肽，20%甘油，5%葡萄 糖，PBS，pH7.2)，將濃縮的蛋白變性液5mL置于透析袋內，透析袋置于大體積的復性液中 4'C緩慢攪拌透析。根據透析過程中蛋白是否析出以及析出量的多少確定最佳透析條件，約 四個小時更換一次尿素濃度逐漸降低的透析液，對蛋白變性液進行稀釋復性。復性后的蛋 白最后溶解于pH7.2的PBS溶液中。
已確證，OPG-Fc融合蛋白在臨床應用上是安全有效的，因此，OPG-HSP70融合蛋白 可用于藥物使用。
OPG-HSP70融合蛋白可以用于預防和治療類風濕關節炎等疾病，抑制骨破壞作用并發 揮抑制炎癥作用。


圖1顯示本發明重組質粒的構建示意圖
圖2顯示本發明表達載體的示意圖
圖3 OPG/OPG-HSP70 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜
圖4 OPG-HSP70融合蛋白SDS-PAGE電泳圖譜
圖5 OPG-HSP70包涵體洗滌過程的SDS-PAGE電泳圖譜
圖6 Western-blotting分析OPG-HSP70融合蛋白
圖7復性后OPG-HSP70融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜
圖8 OPG-HSP70融合蛋白對破骨細胞的分化抑制
圖9 OPG-HSP70融合蛋白對炎性細胞因子產生的抑制作用
圖10OPG-HSP70融合蛋白對炎癥模型小鼠的抑炎作用
具體實施例方式
實施例l OPG全長基因的克隆
根據文獻報道的人OPG編碼區cDNA的序列(GenBank號NMJ)02546),設計2條針對 OPG編碼區cDNA的寡核苷酸引物，人骨肉瘤細胞系MG63培養至對數生長早期，加入 rhBMP-2 (在培養基中終濃度達100ug/L)，繼續培養至對數生長期后，細胞計數，離心收 集細胞。按照Trizol Reagent總RNA提取試劑說明書提取細胞總RNA。根據MMLV第一 鏈cDNA合成試劑盒說明書操作步驟，以寡聚(dT)為引物合成cDNA第一鏈。取8uL逆轉 錄產物為模板，在TaqDNA聚合酶作用下，分別用P1， P2引物進行PCR，反應條件為 95t:變性5min后，按下述參數循環35次94。C變性45s， 52。C退火30s， 68'C延伸lmin。 純化后的PCR產物與質粒pGEM-T-Easy在T4DNA連接酶的作用下，4t連接過夜，連接 產物轉化￡.co// DH5a感受態細胞，挑選單菌落接種于5ml LB培養基(含100mg/L氨芐青霉 素)的試管中，37"C振蕩過夜，收集菌體，堿裂解法小量提取質粒，經EcoRI酶切鑒定，構 建重組質粒pGEM-T-Easy-OPG。取酶切鑒定正確的重組克隆進行序列測定。
實施例2 OPG-HSP70融合蛋白原核表達載體的構建
以測序正確的重組質粒pGEMT-Easy-OPG為模板，P3和P4為引物進行第一次PCR擴
增，然后以此次的PCR產物為模板，P3和P5為引物進行第二次PCR擴增，得到OPG-HSP70
融合基因。PCR產物經純化后與原核表達載體pET-28a同時利用Nco I和Xho I限制性內
切酶進行雙酶切反應。酶切后的載體和目的DNA經純化、連接后，轉化￡.(:0//0}15&感受
態細胞中，挑選單菌落接種于5mLLB培養基(含25mg/L卡那霉素)的錐形瓶中，37。C振蕩過夜。收集菌體，小量提取質粒，再經Ncol和Xhol雙酶切鑒定。取酶切鑒定正確的
重組克隆進行序列測定。
實施例3 OPG-HSP70融合蛋白在大腸桿菌中的誘導表達
將酶切鑒定正確的重組克隆質粒轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞，挑選 單菌落接種于5mL 2xYT培養基(含25mg/L卡那霉素)，37'C振蕩過夜。次日1: 50轉接 后，37'C培養2h，加入IPTG使之終濃度為0.1mmol/L， 3(TC繼續振蕩培養5h后離心收集 菌體。
實施例4 OPG-HSP70融合蛋白在大腸桿菌中的純化與復性
陽性克隆菌株于0.1mmol/LIPTG， 30。C誘導培養5h后，4°C， 6000r/min離心15min， 收集菌體，用預冷的20mMTris-HCL(pH-7.9)緩沖液洗滌菌體，按每克濕菌體加IO倍體積 的Buffer A[lMTris-HCl(pH8.0)， 5MNaCl， 0.5M EDTA (pH8.0)， 0.5。/。Tritonl00， 1MDTT] 重懸，加入溶菌酶至lmg/ml，同時加入PMSF至lmM，冰上放置30min后，間歇超聲破碎 菌體10min，離心收集包涵體沉淀，再分別用2M尿素包涵體洗滌液和Buffer A各洗兩次， 然后用8M尿素變性液溶解包涵體，4°C， 12000r/min離心45min，取上清。上清再經0.22um 的微孔濾膜過濾，即為含有目的重組蛋白的變性液。將大量表達的重組蛋白變性液通過超 濾濃縮的方法濃縮為6mg/mL。按尿素濃度逐步遞減(4M-3M-2M-1M-0.5M-0M)的方法配 好復性液(4M尿素，lmM還原型谷胱甘肽，O.lmM氧化型谷胱甘肽，20%甘油，5%葡萄 糖，PBS,pH7.2)，將濃縮的蛋白變性液5mL置于透析袋內，透析袋置于大體積的復性液中 4'C緩慢攪拌透析。根據透析過程中蛋白是否析出以及析出量的多少確定最佳透析條件，約 四個小時更換一次尿素濃度逐漸降低的透析液，對蛋白變性液進行稀釋復性。復性后的蛋 白最后溶解于pH7.2的PBS溶液中。
實施例5活性實驗OPG-HSP70融合蛋白對破骨細胞的分化抑制
將凍存的原代小鼠骨髓細胞復蘇后，37°C、 5%C02飽和濕度條件下培養。然后加入巨
噬細胞集落刺激因子M-CSF至終濃度為25ng/mL，于37匸、5%C02飽和濕度條件下培養
24h。次日收集細胞懸液，即為M-CSF依賴性非附著性骨髓單核細胞。1000r/min，常溫離
心5min，棄上清，PBS洗兩遍。用1640培養基(含25 ng/mL的M-CSF和40 ng/mL的
RANKL)重懸細胞，計數，并調整細胞濃度為lxl06/mL。 24孔板中每個孔分別放置一張
玻片，各孔分別加入培養液1640 200pL， 37'C溫育2h后吸出培養液。按照加入OPG-HSP70
融合蛋白或PBS的不同分為實驗組和對照組，每組10個復孔。實驗組加入OPG-HSP70融
合蛋白至終濃度為10ng/mL，對照組加入同樣的PBS液。然后每個孔中分別各加入M-CSF和RANKL重懸的骨髓細胞懸液lmL， 37°C、 5%C02飽和濕度條件下培養。三天后第一 次換液，此后每兩天換液一次，每次換液50%，培養至第七天時，棄去培養基，PBS洗細 胞兩次，4% (體積分數)甲醛溶液固定15min，然后再用PBS洗細胞兩次，空氣中自然干 燥。按照Sigma說明書行TRAP染色，于光學顯微鏡下計數多個核TRAP陽性破骨細胞。2 個以上細胞核、染為紅色的為破骨細胞。
實施例6活性實驗OPG-HSP70融合蛋白對炎癥模型小鼠的抑炎作用
小鼠腹部皮膚脫毛，范圍約3cmx3cm，用ly。二硝基氟苯(DNFB)溶液40pL均勻涂抹 致敏。固定小鼠5sec，使皮膚表面溶劑揮發。同時給予實驗組小鼠腹腔注射OPG-HSP70融 合蛋白，0.2mg/只/次；對照組同時腹腔注射生理鹽水。隔日注射，共注射三次。次日再涂 抹DNFB致敏強化一次。致敏后第5天，用1%DNFB溶液10pL均勻涂抹于小鼠右耳(兩面) 進行攻擊。24h后，斷頸處死小鼠，用游標卡尺測量左右耳厚度之差為腫脹度。采用單因 素方差分析比較各實驗組與對照組的差異。左右耳厚度之差表示DTH的程度。
于小鼠發病高峰，即攻擊后24h，斷頸處死小鼠，在裝滿酒精的大燒杯里浸泡2min左 右，然后將小鼠轉移到超凈工作臺內。取一無菌培養皿，在其內加入8mL的1640細胞培 養液，將200目細胞篩浸入其中，將分離的脾臟放于細胞篩上，用注射器芯均勻研磨脾臟 到沒有肉眼可見的組織碎塊。用尖吸管吸取細胞篩下的8mL脾細胞懸液到無菌15mL離心 管內，輕輕吹打混勻。用尖吸管吸取脾細胞懸液滴加到己盛有4mL淋巴細胞分離液的15mL 離心管內，使脾細胞懸液重疊于分離液面。水平離心機2000rpm離心20min。離心后絕大 多數單個核細胞懸浮于血漿與分離液界面，呈白膜狀。將尖吸管輕插至白膜層，沿試管壁
邊緣吸出單個核細胞，移入另一無菌15mL離心管中。加入5mL 1640細胞培養液，充分 混勻，1500rpm離心15min后棄上清，將沉淀細胞再次重懸于5mL 1640細胞培養液中， 1500rpm離心15min后棄上清，吸凈殘液，然后于管中加入不含細胞刺激劑的完全培養基 50tiL，吹打混勻后將其轉移到1.5mL離心管中。取出上述原液4pL到已盛有400pL生理鹽 水的離心管中(即將細胞原液稀釋100倍)，充分混勻后取10pL，從側面加入已蓋好蓋玻 片的計數板上，取四個角4個大格進行計數。計數完畢后，計算細胞原液的濃度，公式為 細胞原液濃度=4個大格的細胞總數/4><10、稀釋倍數(100)，用含有細胞刺激劑的完全培養 基稀釋，使細胞的終濃度為3xlO"mL。
取PVDF膜包被的96孔板(MAIPAN4510板)，用來檢測IFN-y。待檢物共分實驗組和 對照組2個組別。雙孔檢測，最后取平均值。每孔加10(^170Q/。乙醇預濕PVDF膜，蓋上板 蓋，室溫孵育5min。然后吸出或彈出孔內乙醇，立即用PBS溶液洗兩遍，在吸水紙上拍干。每孔加入50pL用5mLPBS稀釋的包被抗體，添加無菌PBS至100|aL，蓋上板蓋，4'C包被 過夜。棄去孔中液體，用洗滌緩沖液PBST洗滌，靜置15 30s后甩出液體，重復洗滌5次， 在無菌吸水紙上拍干板子。然后每孔加入200pL的lx封閉液R (用PBS溶液稀釋10倍)， 蓋上板蓋，37'C孵育lh (或室溫孵育2h)。棄去孔中封閉液，每孔加100pL細胞懸液(細 胞濃度為3xlO"mL，并且含有細胞刺激劑)，蓋上板蓋，在37。C、 5%C02、 100%濕度的環 境下孵育20 24h。甩出反應孔中的細胞，迅速在每孔加入室溫下的PBS溶液250pL，然后 用力甩出，重復3次后，用PBST洗滌5次。然后每孔加入100pL生物素化檢測抗體稀釋 液，用封板膜封好反應板，于37'C孵育lh。棄去孔中液體，用PBST沖洗膜的兩側5次。 然后每孔加入10(VL鏈霉素-HRP親和素稀釋液，用封板膜封好反應板，于37'C孵育lh。 棄去孔中液體，用PBST沖洗膜的兩側5次。然后每孔立即加入100pL解凍的AEC底物液， 蓋上板蓋，室溫避光反應15 30min;當清晰的斑點形成后，棄去孔中液體并用DDW充分 沖洗膜的兩側以終止反應。室溫下干燥PVDF板，用免疫斑點圖像分析儀計數。統計學處 理Eli-spot結果采用SPSS統計軟件12.0中的單因素方差分析法進行各組之間的數據分 析。序列表
<110〉王煒趙文明馬靜李慎濤
〈120〉 0PG-HSP70融合蛋白的制備方法及用途
<腸9
<170〉 Patentln version 3. 3
<210〉 1
<211> 401
<212> PRT
〈213> Artificial
<220>
〈223> OPG蛋白 〈220>
<221> MISC—FEATURE
<222> (1)..(401)
〈400〉 1
Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp lie Ser lie
15 10 15
Lys Trp Thr Thr Gin Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp
20 25 30
Glu Glu Thr Ser His Gin Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr 35 40 45Lys Gin His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro 55
Thr Asp Ser Trp
Tyr Leu 50
Cys Pro Asp His Tyr 65
Leu Tyr Cys Ser
Tyr 70
Val Cys Lys Glu
Thr 60
Thr Ser Asp Glu
Pro 85
Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val 100
Glu Phe Cys Leu
His Thr Ser Asp Glu Cys 75 80
Leu Gin Tyr Val Lys Gin Glu 90 95
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr
Leu Glu lie 115
Gly Val Val Gin Ala Gly 130
Cys Pro Asp Gly Phe 145
Arg Lys His Thr
Cys 105
His Arg Ser Cys
Lys 120
Thr Pro Glu Arg Asn 135
Ser Asn Glu Thr
Phe 150
Cys Ser Val Phe
Gly 110
Pro Pro Gly Phe 125
Thr Val Cys Lys Arg 140
Ser Lys Ala Pro
Asn 165
Gly Asn Ala Thr His Asp Asn lie 180
Gly lie Asp Val
Ser Ser Lys Ala Pro Cys
155 160
Gly Leu Leu Leu Thr Gin Lys
170 175
Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr
Gin Lys Cys 195
Phe Ala Val Pro Thr Lys 210
Asp Asn Leu Pro Gly 225
Lys Arg Gin His
Cys 185
Leu Cys Glu Glu
Thr 200
Phe Thr Pro Asn Trp 215
Lys Val Asn Ala
Thr 230
Ser Gin Glu Gin
Glu 190
Ala Phe Phe Arg 205
Leu Ser Val Leu Val 220
Ser Val Glu Arg
Ser 245
Trp Lys His Gin Asn Lys Ala Gin 260
Leu Cys Glu Asn
Glu Ser Val Glu Arg lie
235 240
Thr Phe Gin Leu Leu Lys Leu
250 255
lie Val Lys Lys lie lie Gin
Asp lie Asp 275
Ser 280
Asp 265
Val Gin Arg His
lie 285
lie 270
Gly His Ala
14Asn
Lys 305 Pro
Gly
Lys
lie
Phe 385 Leu
Leu Thr Phe 290
Lys Val Gly
Glu Gin Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly
300
lie Lys Ala Cys
Leu 295
Asp lie Glu Lys
Ala Glu 310
Ser Asp Gin lie Leu Lys Leu Leu 325
Thr Leu Lys Gly
Asp Gin Asp 340
Thr Tyr His Phe Pro Lys 355
Arg Phe Leu His Ser 370
Leu Glu Met
Thr lie Lys Ala Cys Lys 315 320 Ser Leu Trp Arg lie Lys Asn 330 335 Met His Ala Leu Lys His Ser
lie Gly 390
Leu 345
Thr Val Thr Gin Ser 360
Thr Met Tyr Lys
Phe 375
Asn Gin Val Gin
Lys 350
Leu Lys Lys Thr 365
Tyr Gin Lys Leu
Ser 395
Leu 380
Val Lys lie Ser
Cys 400
<210> 2
<211〉 625
〈212> PRT
<213〉 Artificial
〈220>
<223〉 HSP蛋白
<220>
〈221〉 MISC_FEATURE <222> (1)..(625)
<400> 2Met Ala Arg Ala Val Gly lie Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Val Val 1
Ser Val
Val 5
Gly
Leu Glu Gly Gly Asp Pro
Val 25 Ala
Gly 10
Val Val Ala Asn
Ser 30 Gly
Val 15 Glu
Gly
Glu 20
Ser Arg Thr Thr Pro Ser lie Val Ala Phe Ala Arg Asn Gly Glu Val
Thr Thr Pro Ser lie Val Ala Phe Ala Arg Asn 35 40 45
Leu Val Gly Gin Pro Ala Lys Asn Gin Ala Val Thr Asn Val Asp Arg
50 55 60
Thr Val Arg Ser Val Lys Arg His Met Gly Ser Asp Trp Ser lie Glu 65 70 75 80
lie Asp Gly Lys乙ys Tyr Thr Ala Pro Glu lie Ser Ala Arg lie Leu
85 90 95
Met Lys Leu Lys Arg Asp Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Glu Asp lie Thr
100 105 110
Asp Ala Val lie Thr Thr Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Gin Arg Gin 115 120 125
Lys Asp Ala Gly Gin lie Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg lie
Ala Thr Lys Asp Ala Gly Gin lie Ala Gly Leu Asn 130 135 140
Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys 145
Glu Lys Glu Gin
Ala 150
lie Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly
Tyr 155 Leu
Arg lie Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr 165 170 175
Asp Val Ser Leu Leu Glu lie Gly Glu Gly Val Val Glu Val Arg
Gly 160 Phe
Ala
Leu Leu Glu lie Gly Glu Gly Val Val Glu Val 180 185 190
Thr Ser Gly Asp Asn His Leu Gly Gly Asp Asp Trp Asp Gin Arg Val
195 200 205
Val Asp T卬Leu Val Asp Lys Phe Lys Gly Thr Ser Gly lie Asp Leu
210 215 220
Thr Lys Asp Lys Met Ala Met Gin Arg Leu Arg Glu Ala Ala Glu Lys 225 230 235 240Ala Lys lie Glu Leu Ser Ser Ser Gin Ser Thr Ser lie Asn Leu Pro
250 255 Pro Leu Phe Leu Asp Glu Gin
Leu 245
Asp Ala Asp Lys
Tyr lie Thr Val 260
Leu Thr Arg Ala Glu Phe Gin 275
Lys Pro Phe Gin
Thr Arg 290
Ser Glu lie Asp His 305
Ala Val Thr Asp
Asn 265
Arg lie Thr Gin Asp 280
Val lie Ala Asp
Ser 295
Val Val Leu Val Gly 310
Val Lys Glu Leu
Leu 325
Lys Gly Val Asn Pro Asp Glu Val 340
Leu Lys Gly Glu
Thr 300
Gly Ser Thr Arg 315
Gly Gly Lys Glu
Asp 270
Leu Leu Asp Arg 285
Gly lie Ser Val
Ala Gly Val 355
Thr Pro Leu Ser Leu Gly 370
Leu lie Glu Arg Asn 385
Thr Thr Ala A印
Thr 330
Val Ala Val Gly Ala 345
Lys Asp Val Leu
Val 360
lie Glu Thr Lys Gly 375
Thr lie Pro Thr
Met Pro 320 Pro Asn 335 Ala Leu Gin 350
Leu Leu Asp Val 365
Val Met Thr Arg
Thr 390
Asn Gin Pro Ser
Gly 380
Arg Ser Glu
Asp 405
Gly Glu Arg Glu lie Ala Ala His 420
lie Pro Pro Ala
Leu Thr Gly 435
Thr Phe Asp lie Asp Ala 450
Lys Gly Thr Gly Lys Glu 465 470
Lys 395
Val Gin lie Gin Val 410
Asn Lys Leu Leu Gly 425
Arg Gly lie Pro
Pro 440
Gly lie Val His
Asn 455
Asn Thr lie
Thr Phe 400 Tyr Gin 415 Ser Phe Glu 430
Gin lie Glu Val 445
Thr Ala Lys Asp
Arg lie 475
Val 460
Gin Glu Gly
Ser Gly 480Leu Ser Lys Glu Asp lie Asp Arg 485
Arg Lys Arg Arg
Ala Glu Glu Asp 500
Als Glu Thr Leu 515
Glu Gly
Glu
Ala 530
Asp Ala Ala Val 545
Ser Ala lie Lys
Leu Gly Gin Ala 580
Gly Ala Ala His 595
Asp Val
Ala
Lys 625
Asp 610
Val Tyr Gin Thr 520
Gly Ser Lys Val 535
Ala Glu Ala Lys 550
Ser Ala Met Glu 565
lie Tyr Glu Ala
Pro Gly Gly Glu 600
Val Asp Ala Glu 615
Met lie Lys Asp Ala Glu Ala His
490 495 Glu Glu Ala Asp Val Arg Asn Gin 505 510 Glu Lys Phe Val Lys Glu Gin Arg 525
Pro Glu Asp Thr Leu Asn Lys Val 540
Ala Ala Leu Gly Gly Ser Asp lie 555 560 Lys Leu Gly Gin Glu Ser Gin Ala
570 575 Ala Gin Ala Ala Ser Gin Ala Thr 585 590 Pro Gly Gly Ala His Pro Gly Ser 605
Gly Arg Glu Ala
Val Val Asp Asp 620
〈210> 3
<211> 薦
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial
<220〉
〈223〉 OPG蛋白的編碼序列
〈220>
18<221〉 misc—feature 〈222〉 (l)..(謹)
〈400〉 3
atgaacaagttgctgtgctgcgcgctcgtgtttctggacatctccattaagtggaccacc60
cagg犯acgtttcctccaaagtaccttcatt3tg3Cg犯g犯acctctcatcagctgttg120
tgtgac犯atgtcctcctggtacctacctaaaacaacac tgtgg8卿CC180
gtgtgcgccccttgccctgaccactactac3cagacagctggcacaccagtgacgagtgt240
ctatactgcagccccgtgtgCgagctgagc鄉agtgcaatcgcacc300
cacaaccgcgtgtgcg犯tgc卿g卿ggcgctaccttga_g3ta_g8gttctgcttga犯360
cataggagctgccctcctggatttggagtggtgc肌gctgg犯ccccagagcgaaataca420
gtttgcaaaagatgtccagatgggttcttctcaaatgagacgtcatctaaagcaccctgt480
caaattgcagtgtctttggtctcctgctaactcagaaagg540
tatgttccggtcaac tcaaaaatgtgg犯tagatgttacc600
ctgtgtg鄉aggcattcttcaggtttgctgttcctacaa8gttt8CgCCtaactggctt660
agtgtcttggtageic犯tttgcctggcacccag卿gtgt720
a犯cggcaacacagctcacattccagctgctgaagttatg780
犯gatatagtc犯g犯gatcttgacctctg840
gtgC6LgCggCtgCtEL8LCCtCaccttcgagcagcttcgteigCttgEltgg犯900
agcttaccgggaaag犯sgtgggagc卿3gacattgaaaaaacaataaaggc3tgca肌960
cccagtgaccagatcctg肌gctgctcagtttgtggcgaacgaccaagac1020
3ccttgaagggcctaatgcaCgC3Ct肌Elgcactcaaagacgtaccactttcccaaaact1080
gtcactcagagtCt犯3g^Lgaccatcsggttccttcacagcttcacaat1140
t8tC8g犯gttatttttagaaaccaggtccaat犯gctgc1200
ttataa1206
<210〉 4
<211> 1878
<212> DNA
〈213〉 Artificial<220>
<223> HSP蛋白的編碼序列 〈220>
<221> misc一feature
〈222〉 (l)..(腦)
<400〉 4
atggctcgtgcggtcgggatcgacctcgggccgtcgtctcggttctggaa60
ggtggcgacccggtcgtcgtcgccaactccgagggctccaggaccaccccgtcaattgtc120
gcgttcgcccgc犯cggtgaggtgctggtcggccagcccgggcsgtgacc180
犯CgtCg3tCgcaccgtgcgctcggtcaagcgacacatgggC鄉g3CtggtCC3t3g3g240
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tacttc犯tgacgcccagcgtcaggccacc卿gacgccggccagatcgccggcctc肪c420
gtgctgcggatcgtcaacgagccgaccgcggccgcgctggcctacggcctCgElC卿ggC480
g卿鄉鄉agcgaatcctggtcttcgacttgggtggtggcactttcgacgtttccctg540
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atcgccgcgcacaacaagttgctcgggtccttcgagctgaccggcatcccgccggcgccg1320cgggggattc cgcagatcga ggtcsctttc accgccaagg ac肌gggcac cggc犯ggag ctgtccaagg aagacattga ccgcatgatc cgc犯gcgtc gcg鄉鄉c cgatgttcgt gag犯gttcg tcaa3g肌ca gcgtg￡iggcc ctg犯ca鄉ttga^tgccgc ggtggcgg犯 tcggccatca agtcggcgat ggagaagctg atctacgaag cagctcaggc tgcgtcacag ccgggcggtg cccaccccgg CtCggCtg6Lt ggccgggagg cc卿tga
gacatcgacg ccaacggcat tgtgcacgtc 1380
犯cacgatcc g犯tccfigg3 3ggctcgggc 1440
犯ggacgccg aagcgcacgc cgaggaggat 1500
aatc犯gccg agacattggt ctaccagacg 1560
gagggtggtt cg犯ggtacc tg犯gac3Cg 1620
gcgaaggcgg cacttggcgg atcggatatt 1680
ggcc鄉3gt cgc兆gctct ggggcaagcg 1740
gccactggcg ctgcccaccc cggcggcgag 1800
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1878
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〈211〉 23
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial
〈220〉
〈223〉 引物
<220〉
〈221〉 misc一feature 〈222〉 (l).. (23)
<400> 5
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〈210〉 6 <211> 23 <212> DNA<213> Artificial <220〉
<223〉 引物 <220>
<221〉 misc—feature
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〈400〉 6
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<210> 7
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<223〉 引物 <220>
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<212> DNA
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<221> misc—feature
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<210> 9
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〈213〉 Artificial
<220>
〈223> 引物 〈220〉
<221> misc—feature
〈222> (1)..(51)
<400> 9
ccgctcgagt caggcgtcat tgaagtaggc gggcgtcgtg ataaccgcgt c 51
2權利要求
1. 一種產生OPG-HSP70融合蛋白的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼OPG、其變體或片段的核苷酸序列和編碼HSP蛋白、其變體或片段的核苷酸序列可操作地連接于表達載體，得到OPG-HSP70融合蛋白重組表達載體；(b)將步驟(a)中的重組表達載體轉化入大腸桿菌，篩選獲得表達OPG-HSP70融合蛋白的工程菌；(c)在合適的條件下發酵培養誘導表達融合蛋白；(d)從步驟(c)中的培養產物中純化分離所述融合蛋白；其中所述融合蛋白的形式為R1-L-R2形式，其中R1為OPG蛋白、或其變體或片段，R2為HSP蛋白、或其變體或片段，L為接頭蛋白。所述OPG蛋白，或其變體、片段選自(1)SEQID No1所示的蛋白序列；(2)氨基酸序列22-X，其中X為SEQIDNo1所示的包括位置185—401的任意氨基酸殘基。所述的HSP70蛋白、或其變體或片段選自(1)SEQIDNo2所示的氨基酸序列；(2)氨基酸序列ITDAVITTPAYFNDA。所述L接頭選自(1)ala-(ala)n-ala，n可以是1～4間的整數；(2)gly-(gly)n-gly，n可以是1～4間的整數；(3)gly-pro-gly；(4)gly-gly-pro-gly-gly；(5)ser-gly-(gly)n-gly，n可以是1～4間的整數；(6)val；(7)tyr-val；(8)亞部分(1)-(7)的任何組合。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(c)包括重組克隆質粒轉化大腸桿菌 BL21 (DE3)感受態細胞，挑選單菌落接種于5mL2xYT培養基(含25mg/L卡那霉素)，37°C 振蕩過夜。次日1: 50轉接后，37。C培養2h，加入IPTG使之終濃度為0.1mmol/L， 30。C繼 續振蕩培養5h后離心收集菌體。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(d)包括采用包涵體的溶解，稀釋復性及分子篩層析獲得目的蛋白。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸序列22_X是第22_194為氨基酸。
5. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白潛在用于類風濕關節炎的治療。
全文摘要
本發明為“OPG-HSP70融合蛋白的制備方法及用途”，屬生物醫藥新技術領域。本發明提供了一種骨保護素-熱休克蛋白70(OPG-HSP70)融合蛋白藥物。該藥物針對類風濕性關節炎(RA)最重要的病理學特征關節滑膜炎伴有軟骨和骨的破壞，通過骨保護素(OPG)作為誘餌受體，可與成骨細胞等細胞表達的核因子κB受體活化因子配體(RANKL)結合，阻斷RANKL與破骨細胞表達的RANK結合，從而抑制破骨細胞參與的骨吸收；利用熱休克蛋白(HSP)的保護性多肽片段抑制關節炎癥。發明包括編碼該融合蛋白的DNA序列；經重組技術產生這種融合蛋白的方法；以及該融合蛋白的生物學活性等。
文檔編號C07K19/00GK101434656SQ20071018793
公開日2009年5月20日 申請日期2007年11月16日 優先權日2007年11月16日
發明者李慎濤, 煒 王, 趙文明, 靜 馬 申請人:王 煒;趙文明;馬 靜