專利名稱：：一種能抑制結核桿菌生長的化合物及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于醫藥
技術領域：
，具體涉及一種可以抑制結核桿菌(H37Ra、H37Rv和臨床耐藥菌株)生長的化合物。
背景技術：
：結核病是由結核桿菌引起的嚴重危害人類健康的重大傳染病。全球接近32%的人口約21億感染結核桿菌。每年約有280萬人死于結核病。世界衛生組織2007發布的數據顯示，全球新感染肺結核的患者達到每年880萬人的創紀錄水平，而且結核桿菌的抗藥性也在不斷增強。肺結核已經成為全球最為致命、同時也是治療成本最高的傳染病之一。我國是世界第二結核病大國，有5億以上人口受到結核菌感染，傳染性肺結核患者達200萬，每年因結核病死亡人數有25萬之多，國民經濟損失達35億元。衛生部的統計顯示，2006年中國的結核病發病率和死亡率高居傳染病首位。結核病疫情回升的主要原因之一是耐藥結核桿菌的肆虐。因此，開發針對耐藥結核桿菌的新型抗結核藥物迫在眉睫。國內外的研究表明，生物信息學、功能基因組學的發展及其與藥物創新的融合，為創新藥物研究的突破提供了前所未有的機遇。生物信息學、高性能并行計算和基因組技術與藥物設計的緊密結合是快速、高效發現新靶標和獲得藥物先導化合物的有效途徑，如美國LocusDiscovery公司通過靶標結構模擬和先導化合物結構設計，將發現活性化合物的時間由2—3年縮短到幾個月，而篩選化合物所用的經費從幾千萬美元降至幾千美元。所以，以生物信息學和基因組學帶動藥物靶標發現，并以藥靶挖掘促進新型藥物發現的時代已經來臨。而通過生物信息學分析，并結合對結核病、結核分枝桿菌基礎生物學和抗結核藥物作用機制的認識，基于已經建立的結核分枝桿菌基因組數據庫中發現的新候選靶基因，及基因功能的研究；模擬基因編碼蛋白的三維晶體結構，利用計算機從各種化合物數據庫中篩選出可能作用于候選靶蛋白的化合物，將會是一個高通量獲取結核治療藥物的重要手段。色氨酸是細菌生命活動中的重要氨基酸。色氨酸生物合成過程中，噴哚-3-甘油磷酸合成酶(indole-3-glycerolphosphatesynthase,IGPS)[l]催化最后一步的環形閉合反應。IGPS也是與結核分支桿菌細菌細胞壁糖和脂質代謝有關的酶，與結核分枝桿菌中密度脂蛋白代謝和呼吸作用相關，對結核分枝桿菌的存活起著極其重要作用，是結核分枝桿菌生存必需的。基因^T^是編碼IGPS的基因，轉座子突變法證實trpC是結核分枝桿菌和牛型分枝桿菌的必需基因。此外，本課題組通過雙向電泳[2]證實，IGPS在異煙肼耐藥株中的表達顯著高于異煙肼敏感株，抗結核治療后IGPS表達顯著下調。同樣證明了該基因是結核桿菌耐藥的關鍵基因之一。IGPS屬于芳香族氨基酸生物合成過程中的關鍵酶，而哺乳動物和人類中均不存在該酶的編碼基因；同時，用BLAST軟件在NCBI(http:〃w麗.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫中進行搜索，并未發現人類存在與IGPS同源的蛋白質或部分氨基酸序列[3]。因此，IGPS有望作為篩選抗結核藥物的候選靶位，尤其對異煙肼耐藥菌株。針對IGPS開發的新型抗結核藥不僅具有特異性，而且可以避免毒副作用的產生。
發明內容本發明的目的是提供一種對結核桿菌具有抑制劑作用新的化合物。本發明的另一個目的是提供所述化合物在制備治療結核病及其他微生物引起的疾病藥物中的應用。本發明以晶體結構1VC4(PDBID)為模板，同源模建結核桿菌H37Rv來源的吲哚_3-甘油磷酸合成酶(IGPS)的三維結構。借助計算機輔助藥物設計技術，從化合物數據庫中篩選與IGPS結合較好的化合物。通過生物學實驗驗證篩選到對能夠與IGPS很好的結合(平衡解離常數1.2e-7)、能夠有效抑制IGPS酶活性的化合物5-[3-(3，5-二甲基-l-氫-吡唑)_2-羥基-丙氧基]-2-甲基-l-(p-苯甲基)吲哚-3-羧酸(英文名5-[3_[(3,5-dimethyl-lH-pyrazolyl)]_2_hydroxy_propoxy]-2-methyl-l-(p-tolyl)-lH-indole-3-carboxylic,以下簡稱化合物)，其結構式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>該化合物在體外能夠有效抑制結核桿菌H37Ra(最小抑菌濃度0.2Pg/ml)，H37Rv(最小抑菌濃度0.l化/ml)和耐藥結核桿菌(最小抑菌濃度0.Wg/ml)的生長。本發明的化合物體外對IGPS的抑制實驗、化合物與IGPS的結合實驗和化合物體外對結核桿菌的抑制試驗來篩選IGPS抑制劑，具體如下1、5-[3-(3，5-二甲基-1-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-1-(p-苯甲基)吲哚-3-羧酸化合物體外抑制IGPS酶活性的測定(1)底物烯醇式1-(0-羧基苯氨基)-1-脫氧核酮糖-5'-磷酸(CdRP)的化學合成①27.4mg鄰氨基苯甲酸溶解于0.2mL95X乙醇(1M),54.8mg核糖-5-磷酸二鈉融解于0.2mL水(1M);②將上述兩者混合，室溫避光放置5-17h;③用pH4.8-5.1的水稀釋10倍，室溫避光放置lh，以水解殘余的PRA;用5mL飽和的乙酸乙酯萃取3次，除去多余的鄰氨基苯甲酸；⑤產物為30mMCdRP，保存于-2CTC。(2)化合物抑制以CdRP為底物的重組IGPS的活性實驗在反應體系中加入47(M5mMTris，CdRP,2(M50Pg/mLIGPS在280nm處檢測吸光值。并與只有IGPS無CdRP，以及只有CdRP無IGPS在同樣反應條件下進行對照，以排除IGPS和CdRP對吸收值的影響。0.lmMCdRP完全轉化為IGP導致280nm處OD值增加0.448，將37°C條件下每分鐘形成l幽IGP定義為1U。化合物溶于DMSO中配成濃度為10、的溶液。在37匸，pH值為8.0的緩沖體系條件下，檢測化合物對IGPS酶活性的影響。2、5-[3-(3，5-二甲基-1-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-1-(p-苯甲基)H引哚-3-羧酸化合物與IGPS的體外結合能力的測定將IGPS蛋白(72(mg/ml)溶于1%DMS0的PHBS緩沖液。然后在芯片上進行固定。將化合物配置成1X10—5M、1X10—6M、1X10—7M、0.1X10—7M等濃度。在大分子互作儀biacore3000上與蛋白質發生結合，測定平衡解離常數(Kd)。3、5-[3-(3,5-二甲基-1-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-l-(p-苯甲基)吲哚-3-羧酸化合物體外抑制結核桿菌生長測定(1)結核桿菌的接種方法取制備好的lmg/ml結核桿菌菌懸液5W，含菌數量l一5X105，分別接種于每支含500ul7H9的液體培養基(7H9干粉4.7g/L,含2ml/L(v/v)甘油和10%ADC，)中。(2)5-[3-(3，5-二甲基-1-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-l-(p-苯甲基)口引哚-3-羧酸化合物體外最小抑菌濃度(MIC)的測定將N-苯基-6-哌啶基-N'-奎寧-8-并噠嗪-l，3，5-三-2,4-二胺化合物稀釋成不同濃度梯度，并于按上述方法接種完結核桿菌的培養管中添加各濃度梯度的化合物。接種完畢后，置37'C恒溫孵箱內培養，3周觀察結果。將能抑制培養基中細菌生長的最低濃度定為該化合物的最小抑菌濃度(MIC)。有益效果本發明找到了一種可有效抑制結核桿菌生長的5-[3-(3，5-二甲基-l-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-1-(口-苯甲基)吲哚-3-羧酸化合物。該類化合物可用于與含有編碼吲哚-3-甘油磷酸合成酶(IGPS)編碼基因的微生物引起的相關疾病研究和治療，包括結核桿菌、大腸桿菌等病原引起的疾病。即可用于制備治療結核病或其他微生物引起的相關疾病的藥物。圖l、化合物對IGPS酶活性的抑制作用。灰色曲線表示沒有化合物作抑制劑時，隨著反應的進行，反應體系的光吸收值增加。紅色曲線表示化合物(圖中標注為co卿26)加入反應體系后，體系的光吸收值沒有明顯的增加。結果表明，化合物顯著降低了IGPS酶的催化活性。圖2、化合物與IGPS酶的相互作用。反應曲線由下向上，依次代表濃度由低到高變化時，化合物與IGPS的結合反應曲線。結果說明，隨著化合物濃度的升高化合物與IGPS酶的結合能力增加。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發現作進一步闡述，但不限制本發現。下述實施例中，所用的試驗材料及其來源包括H37Ra、H37Rv和臨床耐藥菌株均為上海市肺科醫院樂軍博士惠贈，而且H37Rv和臨床耐藥菌株的抑菌實驗在上海市肺科醫院進行；鄰氨基苯甲酸和核糖-5-磷酸二鈉均購自SIGMA公司；7H9干粉和7H10干粉購自DIFC0公司。實施例15-[3-(3，5-二甲基-1-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-l-(p-苯甲基)吲哚-3-羧酸化合物體外抑制IGPS酶活性實驗(一)試驗方法(1)底物烯醇式1-(0-羧基苯氨基)-1-脫氧核酮糖_5'-磷酸(CdRP)的化學合成①27.4mg鄰氨基苯甲酸溶解于0.2mL95X乙醇(1M)，54.8mg核糖-5-磷酸二鈉融解于O.2mL水(1M);②將上述兩者混合，室溫避光放置5-17h;③用pH4.8-5.1的水稀釋10倍，室溫避光放置lh，以水解殘余的PRA;用5mL飽和的乙酸乙酯萃取3次，除去多余的鄰氨基苯甲酸；⑤產物為30mMCdRP，保存于-2(TC。(2)化合物抑制以CdRP為底物的重組IGPS的活性實驗在反應體系中加入470W5mMTris，10WCdRP，50Pg/mLIGPS。在280nm處檢測吸光值。并與只有IGPS無CdRP，以及只有CdRP無IGPS在同樣反應條件下進行對照，以排除IGPS和CdRP對吸收值的影響。0.lmMCdRP完全轉化為IGP導致280nm處OD值增加0.448，將37°C條件下每分鐘形成l幽IGP定義為1U。化合物溶于DMSO中配成濃度為10—4M的溶液。在37'C，pH值為8.0的緩沖體系條件下，檢測化合物對IGPS酶活性的影響。(二)試驗結果實驗結果(圖1)表明，5-[3-(3，5-二甲基-l-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-l-(p-苯甲基)B引哚-3-羧酸化合物能夠顯著的抑制IGPS酶的催化活性。使IGPS的酶活性降低為不加化合物時的35.89%。這說明，化合物在體外能夠顯著的抑制結核桿菌體內的重要潛在藥物耙標一IGPS酶的活性。實施例25-[3-(3,5-二甲基-1-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-l-(p-苯甲基)吲哚-3-羧酸化合物與IGPS相互作用分析實驗(一)試驗方法將IGPS蛋白(7204g/ml)溶于1%DMS0的fflBS緩沖液。然后在芯片上進行固定。將化合物配置成1X10—5M、1X10—6M、1X1(T7M、0.1X10—7M等濃度。化合物在biacore3000分析儀上與蛋白質發生結合，測定平衡解離常數(Kd)。(二)試驗結果實驗結果證明，N-苯基-6-哌啶基-N'-奎寧-8-并噠嗪-1,3，5-三嗪-2，4-二胺化合物與IGPS酶具有較強的結合能力(圖2)。不同濃度時化合物與IGPS的結合曲線表明，隨著化合物濃度的升高，化合物與IGPS酶的結合能力也在提高，即化合物與IGPS酶的結合能力跟化合物濃度存在一定的正相關性。化合物與IGPS的平衡解離常數(Kd)為1.2e-7。上述實驗結果有力的證明，化合物在體外可以很好的與IGPS酶結合。實施例3:5-[3-(3，5-二甲基-l-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-1-(p-苯甲基)吲哚-3-羧酸化合物體外抑制結核桿菌生長測定(一)試驗方法(1)結核桿菌的接種方法取制備好的lmg/ml結核桿菌(H37Ra、H37Rv和臨床耐藥菌株)株菌懸液5ul，含菌數量1一5X105，分別接種于每支含500ul7H9的液體培養基(7H9干粉4.7g/L，含2ml/L(v/v)甘油和10%ADC，)中。(2)5-[3-(3，5-二甲基-l-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-l-(p-苯甲基)吲哚-3-羧酸化合物體外最小抑菌濃度(MIC)的測定將5_[3-(3，5-二甲基-l-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-1-(p-苯甲基)吲哚-3-羧酸化合物稀釋成不同濃度梯度(200Pg/ml，100Pg/ml，50^g/ml，25Pg/ml，12.5(^g/ml，6.25Pg/ml，0.625Pg/ml，0.5Pg/ml、0.4Pg/ml、0.3Pg/ml、0.2Pg/ml、0.1Pg/ml)，并于按上述方法接種完結核桿菌的培養管中添加各濃度梯度的化合物。接種完畢后，置37'C恒溫孵箱內培養，3周觀察結果。將能抑制培養基中細菌生長的最低濃度定為該化合物的最小抑菌濃度(MIC)。(二)試驗結果結果發現，5-[3-(3，5-二甲基-l-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-1-(p-苯甲基)吲哚-3-羧酸化合物能夠在較低濃度下顯著抑制結核桿菌的生長。其中，化合物對結核桿菌H37Ra的最小抑菌濃度(MIC)為0.2^g/ml;化合物對標準有毒株的最小抑菌濃度(MIC)為O.化g/ml;化合物對結核桿菌臨床耐藥菌株(8株)的平均最小抑菌濃度(MIC)為O.1Pg/ral。實驗結果重復3次(表l)。上述3個實施例的結果都有力的說明，5-[3-(3，5-二甲基-l-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-1-(p-苯甲基)吲哚-3-羧酸化合物通過與結核桿菌來源的吲哚-3-甘油磷酸合成酶(IGPS)結合抑制IGPS酶的催化活性，從而有效的抑制了結核桿菌的生長。化合物對H37Ra的MIC為0.2化/ml;化合物對有毒株和臨床耐藥菌株的MIC為0.Wg/ml。化合物具有開發成新型抗結核藥物的潛力。表1列出了化合物的部分抑菌實驗結果，化合物對H37Ra的最小抑菌濃度(MIC)為0.21^g/ml;化合物對H37Rv和臨床耐藥菌株的最小抑菌濃度(MIC)為0.Wg/ml。實驗結果重復了3次。表1化合物抑制結核桿菌生長的部分實驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>參考文獻HZalkin，幾Paluh,MvanCleemput，WSMoyeandCYanofsky,NucleotidesequenceofSaccharomycescerevisiaegenesTRP2andTRP3encodingbifunctionalanthranilatesynthase:indole-3-glycerolphosphatesynthase,J.Biol.Chem.,1984,259，3985-3992.樂軍，劉麗蓉，謝建平，劉蓓，梁莉，王洪海，異煙肼耐藥和敏感結核分枝桿菌的比較蛋白質組學研究，中華微生物學和免疫學雜志，2004，24:258-262.YangYP,ZhangM，ZhangHM，LeiJQ,JinRL，XuSF,Bao幾，ZhangL，WangH，Purification,characterizationandstructuralstudyofMycobacteriumtuberculosisindole-3-glycerolphosphatesynthase.Biochemistry(Moscow)200671:s38-s43.權利要求1、一種能抑制結核桿菌生長的化合物，其化學名稱為5-[3-(3，5-二甲基-1-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-1-(p-苯甲基)吲哚-3-羧酸，結構通式為id="icf0001"file="S2007101721820C00011.gif"wi="91"he="82"top="5"left="5"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>2、一種如權利要求l所述化合物在制備治療結核病藥物中的應用。全文摘要本發明屬醫藥
技術領域：
，具體為一種能抵制結核桿菌生長的化合物及其應用。該化合物為5-[3-(3，5-二甲基-1-氫-吡唑)-2-羥基-丙氧基]-2-甲基-1-(p-苯甲基)吲哚-3-羧酸，在對結核桿菌生長的體外抑制試驗中，能夠顯著的抑制結核桿菌的生長。其中，化合物對結核桿菌H37Ra的最小抑菌濃度(MIC)為0.2μg/ml；對標準有毒株H37Rv的最小抑菌濃度(MIC)為0.1μg/ml；化合物對結核桿菌臨床耐藥菌株的最小抑菌濃度(MIC)為0.1μg/ml。該化合物可用于制備治療結核病及其他微生物引起的疾病的藥物。文檔編號C07D403/12GK101182320SQ20071017218公開日2008年5月21日申請日期2007年12月13日優先權日2007年12月13日發明者徐勝鳳,沈洪波,王洪海,王菲菲,王虹軍,胡海榮,強黃申請人:復旦大學