一種多氯聯苯(PCBs)同系物半抗原及其制備方法

專利名稱：一種多氯聯苯(PCBs)同系物半抗原及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種多氯聯苯及其制備，特別是涉及一種多氯聯苯(PCBs)同系物半抗原及 其制備方法。
背景技術：
多氯聯苯(PCBs)作為一種受到世界各國環境工作者廣泛關注的環境激素類污染物， 其檢測方法的研究成為一個研究熱點。近年來，采用酶聯免疫法測定多氯聯苯的研究成為 其快速監測方法的改進研究方向。中國國內的幾個大學發表的研究文章，其多氯聯苯的半 抗原均來自國外研究機構的饋贈[l， 2]。國內迄今為止還沒有見到多氯聯苯半抗原制備方 法的報道。PCBs同族體的物理、化學、生物和毒物學的性質不同。因此有關前沿研究要求 PCBs的分析必須由測定總量的水平提高到測定同類物和異構體的水平上來，因此單個PCBs 同族體的定性和定量分析是十分必要的。多氯聯苯同系物及其衍生物的制備對其毒理學性 質，遷移轉化，生態效應等研究具有重要意義。多氯聯苯半抗原是采用免疫方法測定多氯 聯苯的基礎，因此，對于多氯聯苯及其半抗原的制備就具有重要的應用價值和理論價值。當前市場上銷售的多氯聯苯單體，都是從工業混合物中通過色譜分離得到。雖然純度 比較高，但標準品的含量一般都低于lmg/ml，而且由于處理程序的復雜價格都很昂貴。這 樣的標準品是不適于用來作為反應原料制備半抗原。因此，國內外關于多氯聯苯免疫分析 的半抗原以及抗原的制備，都是通過一定的不對稱合成方法，制備出多氯聯苯單體，然后 再進一步修飾為半抗原。對于多氯聯苯同系物的制備方法，已有多種方法和原理被報道， 例如利用Sandmeyer reaction[3]用氯化亞銅還原聯苯胺的方法制備多氯聯苯，應用 Ullmarm法的碘苯偶聯反應等。這些方法的局限性在于只能制備對稱的多氯聯苯。在對原 來方法改進的基礎上，Hans-Joachim Lehmhler[4]研究小組多年來采用金屬鈀催化的不對 稱合成方法，制備了一系列的多氯聯苯單體，為多氯聯苯的毒理等研究奠定了良好的基礎。 但此方法使用的催化劑成本較高，而且反應時間長，且后處理程序復雜，產率也不高。本 發明在對傳統的Gomberg-Bachmann法[5]進行機理分析的基礎上，設計出了采用重氮化法 制備對稱和不對稱多氯聯苯同系物的方法，此方法使用的試劑價格低，反應時間短，方法 后處理簡單易操作，同時也能夠得到純度較好的多氯聯苯同系物。在對半抗原的制備方法方面，Yu-WenChiu等[6]采用把聯苯環上的甲氧基還原為羥 基后，采用活化酯法進一步引入含有6個碳的羧基基團，用來作為官能團和蛋白質偶聯。
MilanFrdnek等[7, 8]采用了還原甲氧基的方法和在聯苯環上引入氨基然后進一步重氮化的 方法，引入含有6個碳的羧基官能團。這些文獻上的方法采用多步反應，才得到相應的半 抗原。豈今為止，尚未見國內多氯聯苯及其半抗原的制備。發明內容本發明提供了一種多氯聯苯同系物半抗原及其制備方法，該方法步驟簡單，速度快，產率高。本發明的多氯聯苯同系物半抗原，結構式如下其中，R=C1， Ri二H或Cl， n=l、 2、 3， R3 = COCH2CH2COOH。本發明的一氯取代聯苯，二氯取代，三氯取代，四氯取代聯苯及其半抗原，具有如下 的結構式,COOH三氯聯苯半抗原 四氯聯苯半抗原 其中二氯、三氯、四氯苯胺半抗原的熔點分別為154-156°C、 162-164。C或272-274。C。其結構和純度可以通過元素分析，核磁共振，紅外光譜等檢測手段分析鑒定。本發明的方法的反應式可以描述如下
其中，R=C1， n=l， 2， 3， R^二H或C1， R2=H或CI, R3=COCH2CH2COOH。本發明的一種多氯聯苯(PCBS)同系物半抗原衍生物的制備方法，包括下列步驟(1) 將0.05摩爾的1，2-二氯苯胺和5-10ml水溫熱至1，2-二氯苯胺熔化，然后加入10-20ml 濃鹽酸攪拌，用20-40ml的水加熱溶化后，冷之室溫，然后在l-4'C冰浴的條件下用25-33% 的亞硝酸鈉重氮化，得到產物(1)。(2) 在0-5。C的條件下，加入60-80ml芳香烴溶劑(苯，氯苯，二氯苯)，攪拌，同時滴加 濃堿溶液。當溶液呈強堿性時(PH12-14)，停止滴加。室溫繼續攪拌反應1-3小時。(3) 產物的后處理可以采用水蒸氣蒸餾的方法蒸出反應產物，或者通過非極性有機溶劑 萃取的方法，得棕黃色粗產品。粗產物用50-100ml熱無水乙醇溶解,加入l-3g鋅粉和l-3ml 的濃鹽酸，等體系中不再有氣體生成，趁熱過濾，晶體便析出，得到產物(2)。(4) 稱取多氯聯苯同系物，攪拌溶解于裝有20-40mL非質子性有機溶劑(二氯甲烷或硝基 苯等)的容器中，加入琥珀酸酐，攪拌溶解，在冰浴(0-4°C)的條件下，加入無水AlCl3，多氯聯苯，琥珀酸酐和無水AlCl3的摩爾比為1: 1-2: 1-3。無水A1CL在1-2h內分次加入。隔水密封攪拌16-56h,停止反應。反應產物的后處理方法為反應液傾入50-100ml2M的鹽酸溶液中，用50-100ml極性有 機溶劑(乙醚，二氯甲烷)萃取，用50-100ml2M的鹽酸洗滌萃取液，干燥，過濾，蒸去溶劑， 得粗品。粗品用非極性溶劑(正己烷，乙醚，丙酮等洗滌，得純品(3)。本發明采用一步反應，根據原料氯苯胺上的氯原子的位置，和相應的溶劑苯上的氯原子 的個數和位置，在苯環上引入含有4個碳原子的羧基官能團，制得相應的多氯聯苯同系物 半抗原。本發明經過(1)苯胺的重氮化反應，(2)親電加成反應；(3)后處理以及純化，合成出多種多氯聯苯同系物。再用傅克酰基化反應的方法，在苯環上修飾上一個含四個碳的
羧基偶聯臂，制得含有羧基活性基團的半抗原。


圖1二氯聯苯半抗原紅外光譜。 圖2三氯聯苯半抗原紅外光譜。 圖3四氯聯苯半抗原紅外光譜。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而 不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。實施例13,4-二氯聯苯的制備(1) 在100ml燒杯中，將0.05摩爾的1， 2-二氯苯胺(8.101g)和5ml水溫熱至氯苯胺熔 化，然后加入10ml濃鹽酸，劇烈攪拌，加入20ml水，加熱到混合物幾乎完全溶解。然后 加入5ml7j^，攪拌到形成均勻的乳狀懸濁液，此時有3， 4-二氯苯胺鹽酸鹽呈細的晶體析 出。放冷至室溫，加入數塊小冰，外面以冰水浴冷卻，在4"C條件下用30%的亞硝酸鈉重 氮化，用PH試紙控制反應的酸度為2-3。用淀粉碘化鉀試紙監測終點。(2) 將重氮化后的溶液倒入預先用冰水冷卻的60ml苯中，在4'C的條件下，滴加5mol/L 的KOH溶液。加堿時生成黃色沉淀活化物質，與苯作用生成3,4-二氯聯苯。體系反應到 強堿性為止。然后室溫下繼續攪拌反應1小時，停止反應。(3) 把反應物轉移至250ml三口燒瓶中，蒸去苯，然后通入水蒸氣，進行水蒸氣蒸餾。 多氯聯苯與水蒸氣一同蒸出。得黃棕色油狀粗品。粗品用正已垸萃取，蒸去多余溶劑，溶 于100ml無水熱乙醇，加入鋅粉lg和濃鹽酸2ml,等容器中氣體不再生成，過濾除去不溶 物，產品即析出，為白色的針狀晶體。產物經紅外光譜儀和核磁共振等分析來鑒定其化學 結構。測熔點為48-50°C。表征數據如下IR(cm"): 1583， 1485, 1470， 1067， 848， 810, !HNMRb (CDC13， 400MHz) 5 7.40 (1H),7.48 (7' = 8 Hz, 3H),7.56 (7' = 8 Hz, 3H), and 7.68(S， 1H).元素分析:實測值(計算值)%: C12H8C12C 62.3 (64.5) ，H 3.684(3.587)N〈0. 030(0)。(4) 3，4-二氯聯苯半抗原制備稱取3， 4-二氯聯苯5mmo1,溶解于裝有20mL CH2C12的燒瓶中，加入5mmo1的琥珀酸酐， 攪拌溶解，在冰浴的條件下，加入12. 5 mmol的無水A1C13。在1.5h內分次加入。密封攪 拌16h后，停止反應，把反應液傾入60ml2M的鹽酸中，然后用30mlX3的(:仏(:12萃取，用 50ml2M的鹽酸洗滌萃取液，干燥，過濾，蒸除溶劑，得粗品。粗品用正己垸洗滌，可得純 品，為棕黃色晶體，熔點154-156'C。產物經紅外，核磁和元素分析進行鑒定，認為是所 合成產物。IR(cm") 3059， 2928， 1675， 1468， 1413， 1186， 990， 809， 778， 648; 'HNMR15 (CDC13 ， 400MHz) 5 2.50 (d，" = 8.4 , =2.0 Hz,2H， -CH2), 3.2(乂 = 8.2,3H),7.760 (d, 乂 = 8. 4 Hz, 2H ph-H), 7.9 (d, 乂 = 8.44Hz, 2H)， 8.0(d,, = 12 Hz, 3H)， 12.1 (S， 1 H);元素分析 實測值(計算值)% Ci6H12Cl203 C 59. 58 (55.44) ，H 3. 732(3. 715). N 〈0.030(0)實施例2半抗原的應用本發明制備的多氯聯苯半抗原，主要應用在環境中多氯聯苯的免疫檢測中。它的主要 用途之一，就是可以用來直接和蛋白質大分子偶聯，制備出用來免疫動物的免疫原，進而 制備出相應的單克隆或多克隆抗體。下面就3， 4-二氯聯苯半抗原的使用做以應用舉例稱取0.4mmol半抗原4- (3， 4-二氯聯苯基)-4-氧-丁酸,置于潔凈干燥的小錐形瓶中， 加入400PL DMF使之溶解。稱取64.8 mg DCC與38. 8mg NHS溶于300叱DMF，在磁力攪拌下逐 滴加到小錐形瓶中，室溫攪拌反應8h， 4t:過夜。將反應后產物置于低溫高速離心機9 000 r/min，經15 min分離出上清液。稱取160mg BSA溶于10mL 0. 02mol / L pH 7. 4磷酸鹽緩 沖溶液中，逐滴加入600叱上述清液，于冰浴條件下反應4h。反應畢，將溶液裝入透析袋， 自來水沖洗48h， ， 0. 9%生理鹽水透析3 d，離心分出上清液，即得PCB-BSA偶聯物。偶聯 物經紫外可見分光光度計掃描鑒定后，從偶聯物PCB-BSA的紫外吸收光譜圖可以看到，3, 4-二氯聯苯在300nm波長處有最大吸收峰，BSA在波長280咖處有最大吸收峰，PCB-BSA最高 吸收峰出現前移，符合PCB和BSA吸收峰疊加特征。說明半抗原已和蛋白質發生反應，生成 新的偶聯物。實施例33， 4， 4，-三氯聯苯及其半抗原的制備(1)在100ml燒杯中，將0.05摩爾的1， 2-二氯苯胺(8.101g)和10ml水溫熱至熔化，然 后加入15ml濃鹽酸，攪拌，加入30ml水，加熱攪拌到形成均勻的乳狀懸濁液。放冷至室 溫，加入數塊小冰，外面以冰水浴冷卻，在5'C條件下用25%的亞硝酸鈉重氮化，用PH 試紙控制反應的酸度為2-3。用淀粉碘化鉀試紙監測終點。 (2) 將重氮化后的溶液倒入預先用冰水冷卻的80ml氯苯中，在5°C的條件下，滴加5mol/L 的NaOH溶液。加堿時生成黃色沉淀活化物質，與氯苯作用生成3，4, 4，-三氯聯苯。反應 到強堿性為止。然后室溫下繼續攪拌反應2小時，停止反應。(3) 把反應物轉移至250ml三口燒瓶中，通入水蒸氣蒸去氯苯，三氯聯苯與水蒸氣一同 蒸出。得黃棕色固體。粗品用石油醚萃取，蒸去多余溶劑，溶于50ml無水熱乙醇，加入 鋅粉1.5g和濃鹽酸2ml,等容器中氣體不再生成，過濾除去不溶物，產品即析出，為白色的 針狀晶體。測熔點為54-56°C，產物經紅外光譜儀和核磁共振等分析來鑒定其化學結構。 表征數據如下IR(cm") 1545， 1463， 1134， 878， 828， 765， 1HNMRb (CDC13 ， 400MHz) 5 7.26(d,= 8.4 Hz,lH， H-6)， 7.30 (dd， J, = 8.4Hz， j, = 2. OHz, 1H, H-5)，7.33 (AA' XX' system, 2H， H-3' ， 5' ), 7.49 (AA' XX' system,2H， H-2' ,6' ), 7.54(d， 乂 = 2. OHz， 1H， H-3).Elemental analysis實測值(計算值)% Ci2H7Cl3C 55.69 (55.92) ,H 2.701(2.718)， N 〈0.030(0)o(4) 稱取3， 4,4'-三氯聯苯5咖o1,溶解于裝有30mL 0^12的燒瓶中，加入5咖o1的琥 珀酸酐，攪拌溶解，在冰浴的條件下，加入lOmmol的無水AlCl3。在2h內分次加入。密 封攪拌28h后，停止反應，把反應液傾入100ml2M的鹽酸中，然后用40mlX3的0^12萃 取，用80ral 2M的鹽酸洗滌萃取液，干燥，過濾，蒸除溶劑，得粗品。粗品用石油醚洗滌， 可得純品，為紅棕色晶體，熔點162-164°C。產物經紅外，核磁和元素分析進行鑒定，認 為是所合成產物。數據如下IR&m-1) 3090, 2933, 1721， 1694， 1590， 1463， 1310， 1186， 1032， 881， 820， ！HNMRb (CDC13 ， 400MHz) 5 2.58 (dd, J, = 8.4 J, =2.0 Hz,2H， -CH2), 7.50 (d, " = 8.4 Hz, 1H, H-6), 7.77 (d， J' = 2. 0 Hz， 2H, H-2,2' O),8.0(d，" = 2. 0 Hz, 2H, H-3)， 12.1 (S，1H) ， Elemental analysis實測值(計算值)%Ci6HiiCl303 C 51.9 (53.7) ，H 3.071(3.076)， N 〈0.030 (0)。實施例43， 3',4,4'-四氯聯苯及其半抗原的制備(1)在100ml燒杯中，將0.05摩爾的1， 2-二氯苯胺(8.101g)和10ml水溫熱至熔化，然 后加入20ml濃鹽酸，攪拌，加入25ml水，加熱攪拌到形成均勻的乳狀懸濁液。放冷至室 溫，加入數塊小冰，外面以冰水浴冷卻，在O'C條件下用33%的亞硝酸鈉重氮化，用PH 試紙控制反應的酸度為2-3。用淀粉碘化鉀試紙監測終點。 (2)將重氮化后的溶液倒入預先用冰水冷卻的80ml 二氯苯中，在O'C的條件下，滴加 3mol/L的NaOH溶液。加堿時生成黃色沉淀活化物質，與二氯苯作用生成3，3，,4, 4，-四氯 聯苯。用PH試紙檢測PH為12。停止加堿。然后室溫下繼續攪拌反應3小時，停止反應。 (3)把反應物轉移至250ml三口燒瓶中，通入水蒸氣蒸去二氯苯，四氯聯苯與水蒸氣一同 蒸出。得黃棕色固體。粗品用苯萃取，蒸去多余溶劑，溶于70ml無水熱乙醇，加入鋅粉2g 和濃鹽酸3ml,等容器中氣體不再生成，過濾除去不溶物，產品即析出，為白色的針狀晶體。 測熔點為174-176°C，產物經紅外光譜儀和核磁共振等分析來鑒定其化學結構。表征數據 如下IR(cm-1) 1546， 1475， 1445， 1135， 828， 671;'HNMRb (CDC13 ， 400MHz) :57.34 (dd， 乂 = 8.4 乂 =2.0 Hz, 2H, H隱6,6' ), 7.50 (d, 乂 = 8. 4 Hz, 2H, H陽5,5' )， 7.60 (d， 乂 = 2.0 Hz,2H,H-2,2' ); Elemental analysis實測值(計算值)%C12H6C14:C 47.59 (49.3) ，H 2.122(2.0548)， N 0(<0. 030)。 (4) 3, 3',4，4'-四氯聯苯半抗原制備稱取四氯聯苯5鵬ol，溶解于裝有30mL CH2Cl2的燒瓶中，加入5mmol的琥珀酸酐，攪拌 溶解，在冰浴的條件下，加入15 mmol的無水AlCl3。在2h內分次加入。密封攪拌56h后， 停止反應，把反應液傾入100ml2M的鹽酸中，然后用40mlX3的CH2Cl2萃取，用60ml2M的鹽 酸洗滌萃取液，干燥，過濾，蒸除溶劑，得粗品。粗品用正己烷洗滌，可得純品，為棕褐 色晶體，熔點272-274°C。產物經紅外，核磁和元素分析進行鑒定，認為是所合成產物。 IR(cm-1) : 3065， 2929， 1711， 1545， 1363， 1134， 1030， 878， 818; ^NMRb (CDC13 ， 400MHz): 5 2.58 (dd, 乂 = 8.4 乂 =2.0 Hz,2H, -CH2), 7.43(d， = 8. 4 Hz, 1H, H-6), 7.72 (d, =2.0Hz,2H,H-2,2' 0).8.0(d,乂 = 2. 0 Hz, 1H, H-5)， 12.1 (s, 1 H);Elemental analysis實測值(計算值)%: C16H10Cl4O3 C 48.73 ( 48.97 ) ， H 2.431(2.551)， N 0.312(0)。
權利要求
1.一種多氯聯苯半抗原，結構式如下其中，R＝Cl，R1＝H或Cl，n＝1、2、3，R3＝COCH2CH2COOH。
2.根據權利要求l所述的多氯聯苯半抗原，其特征是在于結構式如下:<formula>formula see original document page 2</formula>其中二氯、三氯、四氯聯苯半抗原的熔點分別為154-156°C、 162-164。C和272-274。C。
3. —種多氯聯苯(PCBs)同系物半抗原的制備方法，包括下列步驟(1) 將0.05摩爾的1，2-二氯苯胺和5-10ml水溫熱至1，2-二氯苯胺熔化，然后加入10-20ml 濃鹽酸攪拌，用20-40ml的水加熱溶化后，冷之室溫，在0-4"冰水浴的條件下，用25-33% 的亞硝酸鈉重氮化；(2) 在0-5°0的條件下，加入60-80ml芳香烴溶劑，攪拌，同時滴加濃堿溶液，當溶液PH 達到12-14時，停止滴加，室溫繼續攪拌反應1-3小時；(3) 水蒸氣蒸出反應產物，或者通過非極性有機溶劑萃取的方法，得棕黃色粗產品，粗 產物用50-100ml熱無水乙醇溶解，加入l-3g鋅粉和l-3ml的濃鹽酸，體系中不再有氣體 生成，趁熱過濾，多氯聯苯晶體析出；(4) 稱取多氯聯苯同系物，攪拌溶解于裝有20-40mL非質子性有機溶劑的容器中，加入琥 珀酸酐，攪拌溶解，在0-4'C冰浴的條件下，加入無水AlCl3,在l-2h內分次加入，在無 水條件下攪拌16-56h,停止反應；反應產物的后處理方法為反應液傾入50-100ml2M的冰鹽酸溶液中，用50-100ml極性 有機溶劑萃取，用50-100ml2M的鹽酸洗滌萃取液，干燥，過濾，蒸去溶劑，得粗品，非極性溶劑洗滌或過柱分離，得純品。
4. 根據權利要求l所述的多氯聯苯(PCBs)同系物半抗原的制備方法，其特征在于步驟2 所述的芳香烴溶劑是苯、氯苯或二氯苯。
5. 根據權利要求l所述的多氯聯苯(PCBs)同系物半抗原的制備方法，其特征在于步驟3所述的非極性有機溶劑是石油醚、丙酮或正己垸。
6. 根據權利要求l所述的多氯聯苯(PCBs)同系物半抗原的制備方法，其特征在于步驟4 所述的非質子性有機溶劑是二氯甲烷或硝基苯。
7. 根據權利要求l所述的多氯聯苯(PCBs)同系物半抗原的制備方法，其特征在于步驟4 所述的極性有機溶劑為二氯甲烷或乙醚。
8. 根據權利要求l所述的多氯聯苯(PCBs)同系物半抗原的制備方法，其特征在于步驟4 所述的非極性溶劑是正己烷或石油醚。
9. 根據權利要求l所述的多氯聯苯(PCBs)同系物半抗原的制備方法，其特征在于步驟4 所述的多氯聯苯、琥珀酸酐和無水A1C13的摩爾比為1: 1-2: 1-3。
全文摘要
本發明涉及一種多氯聯苯(PCBs)同系物半抗原及其制備方法，多氯聯苯半抗原，結構式如下右式，其中，R＝Cl，R¹＝H或Cl，n＝1、2、3，R³＝COCH₂CH₂COOH，制備包括(1)二氯苯胺熔化，加入濃鹽酸攪拌，用20-40ml的水加熱熔化后，用25-33％的亞硝酸鈉重氮化；(2)在0-5℃的條件下，加入60-80ml芳香烴溶劑攪拌，滴加濃堿，攪拌反應1-3小時；(3)水蒸氣蒸出反應產物，或者通過非極性有機溶劑萃取的方法，得棕黃色粗產品。加入1-3g鋅粉和1-3ml的濃鹽酸，體系中不再有氣體生成，趁熱過濾，晶體析出；(4)多氯聯苯，琥珀酸酐和無水AlCl₃的摩爾比為1∶1-2∶1-3。冰水浴條件下無水AlCl₃在1-2h內分次加入。密封攪拌16-56h，停止反應。本發明步驟簡單，速度快，產率高。
文檔編號C07C59/84GK101157611SQ20071017051
公開日2008年4月9日 申請日期2007年11月16日 優先權日2007年11月16日
發明者莊惠生, 陳寒玉 申請人:東華大學