專利名稱：一種從積雪草總皂苷出發(fā)同時(shí)制備積雪草苷a與積雪草苷b的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從積雪草總皂苷出發(fā)同時(shí)制備積雪草苷A與積雪草苷B的 方法。
背景技術(shù)：
積雪草Ce"^/Za aw'加'ca(L. )UrBan為傘形科植物，植物學(xué)家林奈(Linnaeus, Carolus)于1764年將積雪草歸入天胡荽屬(/fydroa 0^)，并定名為/fycfraco^/e w/加'ca L.。在1879年，德國(guó)人UrBan根據(jù)花瓣的排列以及果實(shí)的棱數(shù)將其從 天胡荽屬中的獨(dú)立出來(lái)并建立積雪草屬(<^^&//")，積雪草歸入該屬并更名為 Cwfe//flay/W/c"(L.)Urb.。積雪草主要分布于南北半球熱帶和亞熱帶地區(qū)，主產(chǎn) 地為南非、印度、斯里蘭卡、馬來(lái)西亞、印度尼西亞、澳大利亞、日本等，我 國(guó)亦產(chǎn)積雪草。積雪草在中國(guó)的藥用歷史已達(dá)二千多年之久，民間常用于治療 感冒、扁桃腺炎、傳染性肝炎、痢疾、跌打損傷、疔瘡腫毒、外傷出血等。積 雪草現(xiàn)代藥理學(xué)研究和應(yīng)用有了很大發(fā)展，表明積雪草可用于治療抑郁癥、皮 膚創(chuàng)傷、胃潰瘍、傳染性肝炎、皮膚病和流行性腦脊髓膜炎等。
積雪草的化學(xué)成分復(fù)雜，主要有三萜類、黃酮類、揮發(fā)油類、多炔烯類等。 其中三萜類化合物是主要的藥效成分，包括積雪草苷、積雪草苷A、波熱模苷、 波熱米苷、參枯尼苷、異參枯尼苷、積雪草酸、羥基積雪草波熱米酸、馬達(dá)積 雪草酸等。積雪草總皂苷是從積雪草中提取得到的皂苷類物質(zhì)的總稱，主要由 三萜苷類物質(zhì)組成，其中代表性成分主要有積雪草苷(Aisaticoside， CASNo.: 16830-15-2)、積雪草苷A (AsaMcoside A; Madecassoside， CAS No.: 34540-22-2) 和積雪草苷B (AsaiticosideB， CAS No.: 125265-68-1)。積雪草苷A也叫羥基 積雪草苷，積雪草苷B和積雪草苷A是一對(duì)同分異構(gòu)體。積雪草苷A和積雪草 苷B與積雪草苷相比多了一個(gè)羥基，極性差異較大，較易實(shí)現(xiàn)分離，但積雪草 苷A和積雪草苷B的差異只在于其中一個(gè)甲基歸屬不同，且兩個(gè)不同的歸屬處 于鄰位關(guān)系，這種差異在R基(Glu-Glu-Rha糖鍵)影響下顯得更加微小，因此 積雪草苷A和積雪草苷B的分離非常困難，目前尚無(wú)有效的方法報(bào)道。
積雪草苷(a)、積雪草苷A(b)與積雪草苷B(c)的結(jié)構(gòu)式分別如下<formula>formula see original document page 5</formula>(a) <formula>formula see original document page 5</formula>(b) <formula>formula see original document page 5</formula>(C)
研究表明，積雪草苷A與積雪草苷B的混合物具有促進(jìn)傷口愈合、抗皺、 抗炎、抗抑郁、促進(jìn)智力等藥理作用。比較積雪草苷促進(jìn)傷口愈合，治療疤痕 的藥理作用可以發(fā)現(xiàn)，積雪草總皂苷的抗炎、抗抑郁、促進(jìn)智力等藥理作用可 能是積雪草苷A與積雪草苷B起了主要作用。同時(shí)還有研究表明，不同濃度以 及不同質(zhì)量組成的積雪草苷A與積雪草苷B混合物的抗炎藥理具有明顯的差異， 所以非常有必要分離得到積雪草苷A與積雪草苷B純品，以進(jìn)一步研究積雪草 苷A與積雪草苷B的藥理作用，為新藥的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從積雪草總皂苷出發(fā)同時(shí)制備積雪草苷A與積雪 草苷B的方法。
方法的步驟如下
1) 積雪草總皂苷用甲醇溶解后加入硅膠混合攪拌均勻，蒸干后得拌樣硅膠， 積雪草總皂苷與硅膠的質(zhì)量比例為0.05 0.2: 1;
2) 層析柱中依序加入硅膠和拌樣硅膠，采用干法裝柱，干法層析柱的高徑 比為3 9，硅膠與拌樣硅膠的高度比為3 8;
3) 以有機(jī)溶劑I一有機(jī)溶劑II一水三元混合溶劑為流動(dòng)相，以0.5-3床層體 積/h的流速洗脫；
4) 洗脫液經(jīng)TLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分l為積雪草苷溶液，餾分2 為積雪草苷、積雪草苷A、積雪草苷B的混合溶液，餾分3為積雪草苷A與積 雪草苷B的混合溶液；
5) 將餾分3真空濃縮、真空干燥后用乙腈一水混合溶劑溶解、過(guò)濾后得濾
液；
6) C18硅膠采用濕法裝柱，柱子的高徑比為4 12，用乙腈一水混合溶劑相 沖洗柱子；
7) 濾液按0.01 0.1 g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/lg C18硅膠的比 例上樣，乙腈一水混合溶劑以0.5 3床層體積/h的流速洗脫；
8) 洗脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分4為積雪草苷B溶液，餾 分5為積雪草苷B與積雪草苷A的混合溶液，餾分6為積雪草苷A溶液，餾分 4與餾分6經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空千燥后分別得積雪草苷B與積雪草苷A產(chǎn)
P
叩 ，
9) C18柱經(jīng)乙腈一水混合溶劑沖洗再生后可再次上樣。
所述歩驟l)中以0.08 0.15 g積雪草總皂苷/lg硅膠的比例加入硅膠攪拌均勻。
步驟3)中有機(jī)溶劑I為氯仿或二氯甲烷或乙酸乙酯。 步驟3)中有機(jī)溶劑II為甲醇或乙醇。
步驟3)有機(jī)溶劑i—有機(jī)溶劑n—水三元混合溶劑中有機(jī)溶劑i的體積濃度
優(yōu)選為60~80%。
步驟3)有機(jī)溶劑I一有機(jī)溶劑II一水三元混合溶劑中有機(jī)溶劑II的體積濃 度優(yōu)選為18~38%。
步驟3)有機(jī)溶劑I一有機(jī)溶劑II一水三元混合溶劑中水的體積濃度優(yōu)選為 2 10%。
步驟5)、步驟6)、步驟7)中乙腈一水混合溶劑中乙腈的體積濃度優(yōu)選為 10~300/0。
步驟7)中濾液按0.02 0.06 g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/lg C18硅
膠的比例上樣。
步驟9)中C18柱再生過(guò)程為依次用體積濃度為80 95%的乙腈一水和 10 3 0%的乙腈 一 水混合溶劑沖洗。
步驟8)中的真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥過(guò)程如下收集的積雪草苷A與 積雪草苷B洗脫液分別在低于5(TC下真空濃縮至干，以少量甲醇溶解，再加入 8倍量(體積比)的乙酸乙酯結(jié)晶，過(guò)濾后在低于50。C下真空干燥，分別得積 雪草苷A與積雪草苷B產(chǎn)品。
本發(fā)明采用干法和濕法二步層析制備積雪草苷A與積雪草苷B的純品，具 有工藝過(guò)程簡(jiǎn)單、操作費(fèi)用低、積雪草苷A與積雪草苷B產(chǎn)品收率和純度高等 優(yōu)點(diǎn)，制備得到的純度95%以上的積雪草苷A與積雪草苷B純品可用于新藥的 開(kāi)發(fā)。
附圖是一種從積雪草總皂苷出發(fā)同時(shí)制備積雪草苷A與積雪草苷B的工藝 流程簡(jiǎn)圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明中C18硅膠的預(yù)處理過(guò)程C18硅膠在使用前需加甲醇浸泡過(guò)夜使
基質(zhì)上的鍵合相充分展開(kāi)，以充分發(fā)揮其分離能力。
原料積雪草總皂苷的制備過(guò)程:取積雪草干草500g，分別加入6000g， 5000g， 3500g乙醇水溶液浸泡提取三次，其中乙醇水溶液中乙醇的體積百分比為80%, 提取液合并，減壓濃縮去除乙醇，得濃縮液2.9L，濃縮液用水稀釋后過(guò)濾，定 容后得積雪草總皂苷水溶液7.5L，經(jīng)檢測(cè)積雪草總皂苷含量為1.5 g/L;在內(nèi)徑 為4 cm的層析柱中裝入經(jīng)預(yù)處理的大孔吸附樹(shù)脂HPD100，樹(shù)脂柱高為20cm(高 徑比為5)，樹(shù)脂柱的床層體積為251raL;濃縮液以1.5BV/h的流速過(guò)層析柱， 至流出液中雪草總皂苷穿透，共加入濃縮液7000mL;先用4個(gè)床層體積的水洗 滌樹(shù)脂柱，接著用乙醇一水混合流動(dòng)相以2BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙 醇一水混合流動(dòng)相中乙醇的體積百分比為30%，洗脫液經(jīng)TLC分析后合并，再 經(jīng)濃縮、結(jié)晶、真空干燥后得產(chǎn)品積雪草總皂苷12.3 g，樹(shù)脂柱純化過(guò)程回收率 為89.5%，經(jīng)檢測(cè)產(chǎn)品中積雪草總皂苷質(zhì)量含量為80.3%。以上過(guò)程重復(fù)10次， 總共得積雪草總皂苷125.3 g，經(jīng)檢測(cè)產(chǎn)品中積雪草總皂苷質(zhì)量含量為80.7%。
本發(fā)明中所用的分析條件如下
薄層色譜(TLC)條件如下硅膠G254薄板，展開(kāi)劑為正丁醇一乙酸乙酯 —水=4: 1: 5 (取上層溶液使用)，顯色劑為10%的濃硫酸乙醇溶液。
高效液相色譜(HPLC)分析條件AgilentllOO液相色譜分析系統(tǒng)，色譜柱為 Phenomenex C-18 column Synergi Fusion - RP 80A (4jx， 150mmx4.60mm ID)，流 動(dòng)相乙腈一水(20 : 80)，流速0.4 mL/min，柱溫20 °C ，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm， 純度分析使用面積歸 一法。 實(shí)施例1
取3 g積雪草總皂苷加入燒瓶中，加入100 mL甲醇溶解，再加入60 g硅膠 (拌樣比為0.05)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器攪拌均勻、真空蒸干后得拌樣硅膠;在內(nèi)徑為4cm 的層析柱中加入硅膠，裝實(shí)后的硅膠高度為12cm，接著加入拌樣硅膠，裝實(shí)后 的拌樣硅膠高度為4.0cm (高徑比為3，硅膠與拌樣硅膠高度比為3，總床層體 積為201ml);以乙酸乙酯—甲醇一水(體積比為15:8:2)三元混合溶劑為流動(dòng)相， 以1.7mL/min (0.5床層體積/h)的流速洗脫；洗脫液經(jīng)TLC分析后合并成三個(gè) 餾分，餾分l為積雪草苷溶液，餾分2為積雪草苷、積雪草苷A、積雪草苷B
的混合溶液，餾分3為積雪草苷A與積雪草苷B的混合溶液；將餾分3真空濃
縮、真空干燥后得429 mg積雪草苷A與積雪草苷B的混合物；將所得的混合物 用2 mL體積濃度為10%的乙腈一水混合溶劑溶解、過(guò)濾后得濾液；內(nèi)徑為2 cm、 高度為8cm的層析柱(高徑比4，床層體積25mL，裝填C18硅膠量為14 g) 采用濕法裝柱，用體積濃度為10%的乙腈一水混合溶劑沖洗柱子；取0.3mL濾 液上樣(上樣量為0.005 g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/lg C18硅膠)，體 積濃度為10Q/。的乙腈一水混合溶劑以0.2mL/min(0.5床層體積/h)的流速洗脫； 洗脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分4為積雪草苷B溶液，餾分5為 積雪草苷B與積雪草苷A的混合溶液，餾分6為積雪草苷A溶液，餾分4經(jīng)真 空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷B18mg，純度為96.6%，餾分6經(jīng) 真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷A32mg，純度為98.3%; C18再 生后可重復(fù)使用。 實(shí)施例2
取3g積雪草總皂苷加入燒瓶中，加入100mL甲醇溶解，再加入43g硅膠 (拌樣比為0.07)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器攪拌均勻、真空蒸干后得拌樣硅膠;在內(nèi)徑為4cm 的層析柱中加入硅膠，裝實(shí)后的硅膠高度為16cm，接著加入拌樣硅膠，裝實(shí)后 的拌樣硅膠高度為4.0cm (高徑比為4，硅膠與拌樣硅膠高度比為4，總床層體 積為251ml);以乙酸乙酯一乙醇一水(體積比為65:29:6)三元混合溶劑為流動(dòng)相， 以4.2 mL/min (1床層體積/h)的流速洗脫；洗脫液經(jīng)TLC分析后合并成三個(gè) 餾分，餾分l為積雪草苷溶液，餾分2為積雪草苷、積雪草苷A、積雪草苷B 的混合溶液，餾分3為積雪草苷A與積雪草苷B的混合溶液；將餾分3真空濃 縮、真空干燥后得638 mg積雪草苷A與積雪草苷B的混合物；將所得的混合物 用3 mL體積濃度為15%的乙腈一水混合溶劑溶解、過(guò)濾后得濾液；內(nèi)徑為2 cm、 高度為12cm的層析柱(高徑比6，床層體積38mL，裝填C18硅膠量為21 g) 采用濕法裝柱，用體積濃度為15%的乙腈一水混合溶劑沖洗柱子；取1.0mL濾 液上樣(上樣量為0.01 g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/lg C18硅膠)，體積 濃度為15。/。的乙腈一水混合溶劑以0.6mL/min (1床層體積/h)的流速洗脫；洗 脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分4為積雪草苷B溶液，餾分5為積 雪草苷B與積雪草苷A的混合溶液，餾分6為積雪草苷A溶液，餾分4經(jīng)真空 濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷B51mg，純度為93.1%，餾分6經(jīng)真 空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷A88mg，純度為94.7%; C18再生 后可重復(fù)使用。
實(shí)施例3
取3 g積雪草總皂苷加入燒瓶中，加入100 mL甲醇溶解，再加入43 g硅膠 (拌樣比為0.07)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器攪拌均勻、真空蒸干后得拌樣硅膠;在內(nèi)徑為4cm 的層析柱中加入硅膠，裝實(shí)后的硅膠高度為20cm，接著加入拌樣硅膠，裝實(shí)后 的拌樣硅膠高度為4.0cm (高徑比為5，硅膠與拌樣硅膠高度比為5，總床層體 積為301ml);以氯仿一甲醇一水(體積比為35:13:2)三元混合溶劑為流動(dòng)相，以 7.5mL/min (1.5床層體積/h)的流速洗脫；洗脫液經(jīng)TLC分析后合并成三個(gè)餾 分，餾分l為積雪草苷溶液，餾分2為積雪草苷、積雪草苷A、積雪草苷B的 混合溶液，餾分3為積雪草苷A與積雪草苷B的混合溶液；將餾分3真空濃縮、 真空干燥后得675 mg積雪草苷A與積雪草苷B的混合物；將所得的混合物用3 mL體積濃度為20%的乙腈一水混合溶劑溶解、過(guò)濾后得濾液；內(nèi)徑為2cm、 高度為16cm的層析柱(高徑比8，床層體積50mL，裝填C18硅膠量為28 g) 采用濕法裝柱，用體積濃度為20%的乙腈一水混合溶劑沖洗柱子；取2.5mL濾 液上樣(上樣量為0.02 g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/lg C18硅膠)，體積 濃度為20%的乙腈一水混合溶劑以1.3mL/min (1.5床層體積/h)的流速洗脫； 洗脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分4為積雪草苷B溶液，餾分5為 積雪草苷B與積雪草苷A的混合溶液，餾分6為積雪草苷A溶液，餾分4經(jīng)真 空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷B 143 mg，純度為95.1%，餾分6 經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷A245mg，純度為96.8%; C18 再生后可重復(fù)使用。 實(shí)施例4
取5g積雪草總皂苷加入燒瓶中，加入100mL甲醇溶解，再加入56g硅膠 (拌樣比為0.09)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器攪拌均勻、真空蒸干后得拌樣硅膠;在內(nèi)徑為4cm 的層析柱中加入硅膠，裝實(shí)后的硅膠高度為20cm，接著加入拌樣硅膠，裝實(shí)后 的拌樣硅膠高度為4.0cm (高徑比為5，硅膠與拌樣硅膠高度比為5，總床層體 積為301ml);以氯仿一乙醇一水(體積比為35:13:2)三元混合溶劑為流動(dòng)相，以 10.0mL/min (2床層體積/h)的流速洗脫；洗脫液經(jīng)TLC分析后合并成三個(gè)餾 分，餾分l為積雪草苷溶液，餾分2為積雪草苷、積雪草苷A、積雪草苷B的 混合溶液，餾分3為積雪草苷A與積雪草苷B的混合溶液；將餾分3真空濃縮、 真空干燥后得916 mg積雪草苷A與積雪草苷B的混合物；將所得的混合物用4 mL體積濃度為25%的乙腈一水混合溶劑溶解、過(guò)濾后得濾液；內(nèi)徑為2cm、 高度為20cm的層析柱(高徑比10，床層體積63mL，裝填C18硅膠量為35 g)
采用濕法裝柱，用體積濃度為25%的乙腈一水混合溶劑沖洗柱子；取0.2mL濾 液上樣(上樣量為0.001 g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/lg C18硅膠)，體 積濃度為25。/。的乙腈一水混合溶劑以2.1mL/min (2床層體積/h)的流速洗脫； 洗脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分4為積雪草苷B溶液，餾分5為 積雪草苷B與積雪草苷A的混合溶液，餾分6為積雪草苷A溶液，餾分4經(jīng)真 空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷B 8 mg，純度為91.6%，餾分6經(jīng) 真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷A14mg，純度為93.2%; C18再 生后可重復(fù)使用。 實(shí)施例5
取5g積雪草總皂苷加入燒瓶中，加入100mL甲醇溶解，再加入56g硅膠 (拌樣比為0.09)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器攪拌均勻、真空蒸干后得拌樣硅膠;在內(nèi)徑為4cm 的層析柱中加入硅膠，裝實(shí)后的硅膠高度為24cm，接著加入拌樣硅膠，裝實(shí)后 的拌樣硅膠高度為4.0cm (高徑比為6，硅膠與拌樣硅膠高度比為6，總床層體 積為352ml);以二氯甲烷一甲醇一水(體積比為75:21:4)三元混合溶劑為流動(dòng)相， 以14.7mL/min (2.5床層體積/h)的流速洗脫；洗脫液經(jīng)TLC分析后合并成三 個(gè)餾分，餾分1為積雪草苷溶液，餾分2為積雪草苷、積雪草苷A、積雪草苷 B的混合溶液，餾分3為積雪草苷A與積雪草苷B的混合溶液；將餾分3真空 濃縮、真空干燥后得868 mg積雪草苷A與積雪草苷B的混合物；將所得的混合 物用4 mL體積濃度為30%的乙腈一水混合溶劑溶解、過(guò)濾后得濾液；內(nèi)徑為2 cm、高度為24cm的層析柱(高徑比12，床層體積75 mL，裝填C18硅膠量為 42 g)采用濕法裝柱，用體積濃度為30%的乙腈一水混合溶劑沖洗柱子；取2.9 mL 濾液上樣(上樣量為0.015 g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/lg C18硅膠)， 體積濃度為30%的乙腈—水混合溶劑以3.1mL/min (2.5床層體積/h)的流速洗 脫；洗脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分4為積雪草苷B溶液，餾分 5為積雪草苷B與積雪草苷A的混合溶液，餾分6為積雪草苷A溶液，餾分4 經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分得積雪草苷B 140 mg，純度為88.9%，餾 分6經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷A241mg，純度為90.5%; C18再生后可重復(fù)使用。 實(shí)施例6
取5g積雪草總皂苷加入燒瓶中，加入100mL甲醇溶解，再加入45g硅膠 (拌樣比為0.11)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器攪拌均勻、真空蒸干后得拌樣硅膠;在內(nèi)徑為4cm 的層析柱中加入硅膠，裝實(shí)后的硅膠高度為24cm，接著加入拌樣硅膠，裝實(shí)后
的拌樣硅膠高度為4.0cm (高徑比為6，硅膠與拌樣硅膠高度比為6，總床層體 積為352ml);以二氯甲烷一乙醇一水(體積比為40:9:1)三元混合溶劑為流動(dòng)相， 以17.6mL/min (3床層體積/h)的流速洗脫；洗脫液經(jīng)TLC分析后合并成三個(gè) 餾分，餾分為積雪草苷溶液，餾分2為積雪草苷、積雪草苷A、積雪草苷B 的混合溶液，餾分3為積雪草苷A與積雪草苷B的混合溶液；將餾分3真空濃 縮、真空干燥后得943 mg積雪草苷A與積雪草苷B的混合物；將所得的混合物 用4 mL體積濃度為15%的乙腈一水混合溶劑溶解、過(guò)濾后得濾液；內(nèi)徑為2 cm、 高度為12cm的層析柱(高徑比6，床層體積38mL，裝填C18硅膠量為21 g) 采用濕法裝柱，用體積濃度為15%的乙腈一水混合溶劑沖洗柱子；取2.2mL濾 液上樣(上樣量為0.025 g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/lg C18硅膠)，體 積濃度為15%的乙腈一水混合溶劑以1.9mL/min (3床層體積/h)的流速洗脫； 洗脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分4為積雪草苷B溶液，餾分5為 積雪草苷B與積雪草苷A的混合溶液，餾分6為積雪草苷A溶液，餾分4經(jīng)真 空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷B 123 mg，純度為91.0%，餾分6 經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷A210mg，純度為92.6%; C18 再生后可重復(fù)使用。 實(shí)施例7
取5g積雪草總皂苷加入燒瓶中，加入100mL甲醇溶解，再加入45g硅膠 (拌樣比為0.11)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器攪拌均勻、真空蒸干后得拌樣硅膠;在內(nèi)徑為4cm 的層析柱中加入硅膠，裝實(shí)后的硅膠高度為24cm，接著加入拌樣硅膠，裝實(shí)后 的拌樣硅膠高度為4.0cm (高徑比為6，硅膠與拌樣硅膠高度比為6，總床層體 積為352ml);以乙酸乙酯一甲醇一水(體積比為15:8:2)三元混合溶劑為流動(dòng)相， 以2.9mL/min (0.5床層體積/h)的流速洗脫；洗脫液經(jīng)TLC分析后合并成三個(gè) 餾分，餾分1為積雪草苷溶液，餾分2為積雪草苷、積雪草苷A、積雪草苷B 的混合溶液，餾分3為積雪草苷A與積雪草苷B的混合溶液；將餾分3真空濃 縮、真空千燥后得931 mg積雪草苷A與積雪草苷B的混合物；將所得的混合物 用5 mL體積濃度為20%的乙腈一水混合溶劑溶解、過(guò)濾后得濾液；內(nèi)徑為2 cm、 高度為16cm的層析柱(高徑比8，床層體積50mL，裝填C18硅膠量為28 g) 采用濕法裝柱，用體積濃度為20%的乙腈—水混合溶劑沖洗柱子；取4.5mL濾 液上樣(上樣量為0.03 g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/lg C18硅膠)，體積 濃度為20。/o的乙腈一水混合溶劑以0.4mL/min (0.5床層體積/h)的流速洗脫； 洗脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分4為積雪草苷B溶液，餾分5為
積雪草苷B與積雪草苷A的混合溶液，餾分6為積雪草苷A溶液，餾分4經(jīng)真 空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷B 225 mg，純度為97.6%，餾分6 經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷A386mg，純度為99.3%; C18
再生后可重復(fù)使用。 實(shí)施例8
取6g積雪草總皂苷加入燒瓶中，加入100mL甲醇溶解，再加入46g硅膠 (拌樣比為0.13)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器攪拌均勻、真空蒸干后得拌樣硅膠;在內(nèi)徑為4cm 的層析柱中加入硅膠，裝實(shí)后的硅膠高度為28cm，接著加入拌樣硅膠，裝實(shí)后 的拌樣硅膠高度為4.0cm (高徑比為7，硅膠與拌樣硅膠高度比為7，總床層體 積為402ml);以乙酸乙酯一乙醇一水(體積比為65:29:6)三元混合溶劑為流動(dòng)相， 以6.7 mL/min (1床層體積/h)的流速洗脫；洗脫液經(jīng)TLC分析后合并成三個(gè) 餾分，餾分l為積雪草苷溶液，餾分2為積雪草苷、積雪草苷A、積雪草苷B 的混合溶液，餾分3為積雪草苷A與積雪草苷B的混合溶液；將餾分3真空濃 縮、真空干燥后得1254 mg積雪草苷A與積雪草苷B的混合物；將所得的混合 物用5mL體積濃度為25。/。的乙腈一水混合溶劑溶解、過(guò)濾后得濾液；內(nèi)徑為2 cm、高度為20cm的層析柱(高徑比10，床層體積63 mL，裝填C18硅膠量為 35 g)采用濕法裝柱，用體積濃度為25%的乙腈—水混合溶劑沖洗柱子;取4.2 mL 濾液上樣(上樣量為0.03 g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/lg C18硅膠)，體 積濃度為25%的乙腈一水混合溶劑以1.0mL/min (1床層體積/h)的流速洗脫； 洗脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分4為積雪草苷B溶液，餾分5為 積雪草苷B與積雪草苷A的混合溶液，餾分6為積雪草苷A溶液，餾分4經(jīng)真 空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷B 254 mg，純度為92.6%，餾分6 經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷A435 mg，純度為94.2%; C18 再生后可重復(fù)使用。 實(shí)施例9
取6g枳雪草總皂苷加入燒瓶中，加入100mL甲醇溶解，再加入40g硅膠 (拌樣比為0.15)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器攪拌均勻、真空蒸干后得拌樣硅膠;在內(nèi)徑為4 cm 的層析柱中加入硅膠，裝實(shí)后的硅膠高度為28cm，接著加入拌樣硅膠，裝實(shí)后 的拌樣硅膠高度為4.0cm (高徑比為7，硅膠與拌樣硅膠高度比為7，總床層體 積為402ml);以氯仿一甲醇一水(體積比為35:13:2)三元混合溶劑為流動(dòng)相，以 10.0 mL/min (1.5床層體積/h)的流速洗脫；洗脫液經(jīng)TLC分析后合并成三個(gè) 餾分，餾分l為積雪草苷溶液，餾分2為積雪草苷、積雪草苷A、積雪草苷B
的混合溶液，餾分3為積雪草苷A與積雪草苷B的混合溶液；將餾分3真空濃
縮、真空干燥后得1608 mg積雪草苷A與積雪草苷B的混合物；將所得的混合 物用8mL體積濃度為15%的乙腈_水混合溶劑溶解、過(guò)濾后得濾液；內(nèi)徑為2 cm、高度為12 cm的層析柱(高徑比6，床層體積38 mL，裝填C18硅膠量為 21 g)采用濕法裝柱，用體積濃度為15。/。的乙腈一水混合溶劑沖洗柱子；取3.6mL 濾液上樣(上樣量為0.035 g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/lg C18硅膠)， 體積濃度為15。/。的乙腈一水混合溶劑以0.9mL/min (1.5床層體積/h)的流速洗 脫；洗脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分4為積雪草苷B溶液，餾分 5為積雪草苷B與積雪草苷A的混合溶液，餾分6為積雪草苷A溶液，餾分4 經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷B 170 mg，純度為90.5%,餾 分6經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷A291mg，純度為92.1%; C18再生后可重復(fù)使用。 實(shí)施例10
取8 g積雪草總皂苷加入燒瓶中，加入100 mL甲醇溶解，再加入53 g硅膠 (拌樣比為0.15)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器攪拌均勻、真空蒸干后得拌樣硅膠;在內(nèi)徑為4cm 的層析柱中加入硅膠，裝實(shí)后的硅膠高度為32cm，接著加入拌樣硅膠，裝實(shí)后 的拌樣硅膠高度為4.6cm (高徑比為8，硅膠與拌樣硅膠高度比為7，總床層體 積為459ml);以氯仿一乙醇一水(體積比為35:13:2)三元混合溶劑為流動(dòng)相，以 15.3mL/min (2床層體積/h)的流速洗脫；洗脫液經(jīng)TLC分析后合并成三個(gè)餾 分，餾分1為積雪草苷溶液，餾分2為積雪草苷、積雪草苷A、積雪草苷B的 混合溶液，餾分3為積雪草苷A與積雪草苷B的混合溶液；將餾分3真空濃縮、 真空干燥后得1745 mg積雪草苷A與積雪草苷B的混合物；將所得的混合物用 8tnL體積濃度為20。/。的乙腈一水混合溶劑溶解、過(guò)濾后得濾液；內(nèi)徑為2cm、 高度為16cm的層析柱(高徑比8，床層體積50mL，裝填C18硅膠量為28 g) 采用濕法裝柱，用體積濃度為20%的乙腈一水混合溶劑沖洗柱子；取5.8mL濾 液上樣(上樣量為0.045 g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/lg C18硅膠)，體 積濃度為20%的乙腈一水混合溶劑以1.7mL/min (2床層體積/h)的流速洗脫； 洗脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分4為積雪草苷B溶液，餾分5為 積雪草苷B與積雪草苷A的混合溶液，餾分6為積雪草苷A溶液，餾分4經(jīng)真 空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷B 274 mg，純度為87.8%，餾分6 經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷A470mg，純度為89.4%; C18 再生后可重復(fù)使用。
實(shí)施例11
取8g積雪草總皂苷加入燒瓶中，加入100mL甲醇溶解，再加入47g硅膠 (拌樣比為0.17)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器攪拌均勻、真空蒸干后得拌樣硅膠;在內(nèi)徑為4cm 的層析柱中加入硅膠，裝實(shí)后的硅膠高度為32cm，接著加入拌樣硅膠，裝實(shí)后 的拌樣硅膠高度為4.6 cm (高徑比為8，硅膠與拌樣硅膠高度比為7,總床層體 積為459ml);以二氯甲烷一甲醇一水(體積比為75:21:4)三元混合溶劑為流動(dòng)相， 以19.1mL/min (2.5床層體積/h)的流速洗脫；洗脫液經(jīng)TLC分析后合并成三 個(gè)餾分，餾分1為積雪草苷溶液，餾分2為積雪草苷、積雪草苷A、積雪草苷 B的混合溶液，餾分3為積雪草苷A與積雪草苷B的混合溶液；將餾分3真空 濃縮、真空干燥后得1770 mg積雪草苷A與積雪草苷B的混合物；將所得的混 合物用8mL體積濃度為25。/。的乙腈一水混合溶劑溶解、過(guò)濾后得濾液；內(nèi)徑為 2 cm、高度為20 cm的層析柱(高徑比10，床層體積63 mL，裝填C18硅膠量 為35 g)采用濕法裝柱，用體積濃度為25%的乙腈一水混合溶劑沖洗柱子；取 6.3 mL濾液上樣(上樣量為0.04 g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/lg C18硅 膠)，體積濃度為25。/。的乙腈一水混合溶劑以2.6mL/min(2.5床層體積/h)的流 速洗脫；洗脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分4為積雪草苷B溶液， 餾分5為積雪草苷B與積雪草苷A的混合溶液，餾分6為積雪草苷A溶液，餾 分4經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷B316mg，純度為89.5%， 餾分6經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷A541 mg，純度為91.0%; C18再生后可重復(fù)使用。 實(shí)施例12
取8g積雪草總皂苷加入燒瓶中，加入100mL甲醇溶解，再加入40g硅膠 (拌樣比為0.2)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器攪拌均勻、真空蒸干后得拌樣硅膠；在內(nèi)徑為4 cm 的層析柱中加入硅膠，裝實(shí)后的硅膠高度為36 cm，接著加入拌樣硅膠，裝實(shí)后 的拌樣硅膠高度為4.5cm (高徑比為9，硅膠與拌樣硅膠高度比為8，總床層體 積為509ml);以二氯甲烷一乙醇一水(體積比為40:9:1)三元混合溶劑為流動(dòng)相， 以25.4mL/min (3床層體積/h)的流速洗脫；洗脫液經(jīng)TLC分析后合并成三個(gè) 餾分，餾分1為積雪草苷溶液，鎦分2為積雪草苷、積雪草苷A、積雪草苷B 的混合溶液，餾分3為積雪草苷A與積雪草苷B的混合溶液；將餾分3真空濃 縮、真空干燥后得2170 mg積雪草苷A與積雪草苷B的混合物；將所得的混合 物用8 mL體積濃度為20%的乙腈一水混合溶劑溶解、過(guò)濾后得濾液；內(nèi)徑為2 cm、高度為20cm的層析柱(高徑比10，床層體積63 mL，裝填C18硅膠量為
35 g)采用濕法裝柱，用體積濃度為20%的乙腈一水混合溶劑沖洗柱子；取6.4 mL 濾液上樣(上樣量為0.05 g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/lg C18硅膠)，體 積濃度為20。/。的乙腈一水混合溶劑以3.1mL/min (3床層體積/h)的流速洗脫； 洗脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)熘分，餾分4為積雪草苷B溶液，餾分5為 積雪草苷B與積雪草苷A的混合溶液，餾分6為積雪草苷A溶液，餾分4經(jīng)真 空濃縮、結(jié)晶、真空-T燥后分別得積雪草苷B 395 mg，純度為89.5%，餾分6 經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷A676mg，純度為91.0%; C18 再生后可重復(fù)使用。 實(shí)施例13
取6g積雪草總皂苷加入燒瓶中，加入100mL甲醇溶解，再加入75g硅膠 (拌樣比為0.08)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器攪拌均勻、真空蒸干后得拌樣硅膠；在內(nèi)徑為5.5 cm的層析柱中加入硅膠，裝實(shí)后的硅膠高度為27.5 cm，接著加入拌樣硅膠， 裝實(shí)后的拌樣硅膠高度為3.9 cm (高徑比為5，硅膠與拌樣硅膠高度比為7，總 床層體積為746ml);以氯仿一甲醇一水(體積比為35:13:2)三元混合溶劑為流動(dòng) 相，以24.9mL/min (2床層體積/h)的流速洗脫；洗脫液經(jīng)TLC分析后合并成 三個(gè)餾分，餾分1為積雪草苷溶液，餾分2為積雪草苷、積雪草苷A、積雪草 苷B的混合溶液，餾分3為積雪草苷A與積雪草苷B的混合溶液；將餾分3真 空濃縮、真空干燥后得1528 mg積雪草苷A與積雪草苷B的混合物；將所得的 混合物用3mL體積濃度為20。/。的乙腈一水混合溶劑溶解、過(guò)濾后得濾液；內(nèi)徑 為2 cm、高度為12 cm的層析柱(高徑比6，床層體積38 mL，裝填C18硅膠 量為21 g)采用濕法裝柱，用體積濃度為20%的乙腈一水混合溶劑沖洗柱子； 取2.5 mL濾液上樣(上樣量為0.06 g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/lg C18 硅膠)，體積濃度為20%的乙腈一水混合溶劑以1.3 mL/min (2床層體積/h)的 流速洗脫；洗脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分4為積雪草苷B溶液， 餾分5為積雪草苷B與積雪草苷A的混合溶液，餾分6為積雪草苷A溶液，餾 分4經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷B318mg，純度為94.6%， 餾分6經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷A545 mg，純度為96.3%; C18再生后可重復(fù)使用。 實(shí)施例14
取8g積雪草總皂苷加入燒瓶中，加入100mL甲醇溶解，再加入80g硅膠 (拌樣比為O.l)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器攪拌均勻、真空蒸干后得拌樣硅膠；在內(nèi)徑為5.5 cm的層析柱中加入硅膠，裝實(shí)后的硅膠高度為27.5cm，接著加入拌樣硅膠，
裝實(shí)后的拌樣硅膠高度為3.9cm (高徑比為5，硅膠與拌樣硅膠高度比為7，總 床層體積為746ml);以乙酸乙酯一乙醇一水(體積比為65:29:6)三元混合溶劑為 流動(dòng)相，以18.7mL/min (1.5床層體積/h)的流速洗脫；洗脫液經(jīng)TLC分析后 合并成三個(gè)餾分，餾分1為積雪草苷溶液，餾分2為積雪草苷、積雪草苷A、 積雪草苷B的混合溶液，餾分3為積雪草苷A與積雪草苷B的混合溶液；將餾 分3真空濃縮、真空干燥后得1871mg積雪草苷A與積雪草苷B的混合物；將 所得的混合物用4mL體積濃度為20。/。的乙腈一水混合溶劑溶解、過(guò)濾后得濾液； 內(nèi)徑為2 cm、高度為12 cm的層析柱(高徑比6，床層體積38 mL，裝填C18 硅膠量為21 g)采用濕法裝柱，用體積濃度為20%的乙腈一水混合溶劑沖洗柱 子；取3.1 mL濾液上樣(上樣量為0.07 g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/lg C18硅膠)，體積濃度為20%的乙腈一水混合溶劑以0.9mL/min(1.5床層體積/h) 的流速洗脫；洗脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分4為積雪草苷B溶 液，餾分5為積雪草苷B與積雪草苷A的混合溶液，餾分6為積雪草苷A溶液， 餾分4經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷B 347 mg，純度為91.6%， 餾分6經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷A595 mg，純度為93.2%; C18再生后可重復(fù)使用。 實(shí)施例15
取12g積雪草總皂苷加入燒瓶中，加入100mL甲醇溶解，再加入100g硅 膠(拌樣比為0.12)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器攪拌均勻、真空蒸干后得拌樣硅膠；在內(nèi)徑為 5.5cm的層析柱中加入硅膠，裝實(shí)后的硅膠高度為33cm，接著加入拌樣硅膠， 裝實(shí)后的拌樣硅膠高度為5.5cm (高徑比為6，硅膠與拌樣硅膠高度比為6，總 床層體積為914ml);以乙酸乙酯一乙醇一水(體積比為65:29:6)三元混合溶劑為 流動(dòng)相，以22.9mL/min (1.5床層體積/h)的流速洗脫；洗脫液經(jīng)TLC分析后 合并成三個(gè)餾分，餾分1為積雪草苷溶液，餾分2為積雪草苷、積雪草苷A、 積雪草苷B的混合溶液，餾分3為積雪草苷A與積雪草苷B的混合溶液；將餾 分3真空濃縮、真空干燥后得3243 mg積雪草苷A與積雪草苷B的混合物；將 所得的混合物用4 mL體積濃度為25%的乙腈一水混合溶劑溶解、過(guò)濾后得濾液； 內(nèi)徑為2 cm、高度為12 cm的層析柱(高徑比6，床層體積38 mL，裝填C18 硅膠量為21 g)采用濕法裝柱，用體積濃度為25%的乙腈一水混合溶劑沖洗柱 子；取2.1 mL濾液上樣(上樣量為0.08 g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/lg C18硅膠)，體積濃度為25%的乙腈一水混合溶劑以1.3mL/min (2床層體積/h) 的流速洗脫；洗脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分4為積雪草苷B溶
液，餾分5為積雪草苷B與積雪草苷A的混合溶液，餾分6為積雪草苷A溶液， 餾分4經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷B 365 mg，純度為87.8%， 餾分6經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷A626 mg，純度為89.4%; C18再生后可重復(fù)使用。 實(shí)施例16
取12g積雪草總皂苷加入燒瓶中，加入100mL甲醇溶解，再加入100g硅 膠(拌樣比為0.12)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器攪拌均勻、真空蒸干后得拌樣硅膠；在內(nèi)徑為 5.5cm的層析柱中加入硅膠，裝實(shí)后的硅膠高度為33cm，接著加入拌樣硅膠， 裝實(shí)后的拌樣硅膠高度為5.5cm (高徑比為6，硅膠與拌樣硅膠高度比為6，總 床層體積為914ml);以氯仿一甲醇一水(體積比為35:13:2)三元混合溶劑為流動(dòng) 相，以30.5mL/min (2床層體積/h)的流速洗脫；洗脫液經(jīng)TLC分析后合并成 三個(gè)餾分，餾分1為積雪草苷溶液，餾分2為積雪草苷、積雪草苷A、積雪草 苷B的混合溶液，餾分3為積雪草苷A與積雪草苷B的混合溶液；將餾分3真 空濃縮、真空干燥后得3109 mg積雪草苷A與積雪草苷B的混合物；將所得的 混合物用4mL體積濃度為25。/。的乙腈一水混合溶劑溶解、過(guò)濾后得濾液；內(nèi)徑 為2 cm、高度為16 cm的層析柱(高徑比8，床層體積50 mL，裝填C18硅膠 量為28 g)采用濕法裝柱，用體積濃度為25%的乙腈一水混合溶劑沖洗柱子； 取3.2 mL濾液上樣(上樣量為0.09 g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/lg C18 硅膠)，體積濃度為25%的乙腈一水混合溶劑以L3mL/min (1.5床層體積/h)的 流速洗脫；洗脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分4為積雪草苷B溶液， 餾分5為積雪草苷B與積雪草苷A的混合溶液，餾分6為積雪草苷A溶液，餾 分4經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷B521mg，純度為85.6%， 餾分6經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷A893 mg，純度為87.1%; C18再生后可重復(fù)使用。 實(shí)施例17
取10 g積雪草總皂苷加入燒瓶中，加入100 mL甲醇溶解，再加入77 g硅 膠(拌樣比為0.13)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器攪拌均勻、真空蒸干后得拌樣硅膠；在內(nèi)徑為 4.5 cm的層析柱中加入硅膠，裝實(shí)后的硅膠高度為31.5 cm,接著加入拌樣硅膠， 裝實(shí)后的拌樣硅膠高度為6.3cm (高徑比為7，硅膠與拌樣硅膠高度比為5，總 床層體積為601ml);以氯仿-甲醇一水(體積比為35:13:2)三元混合溶劑為流動(dòng) 相，以20.0mL/min (2床層體積/h)的流速洗脫；洗脫液經(jīng)TLC分析后合并成 三個(gè)餾分，餾分l為積雪草苷溶液，餾分2為積雪草苷、積雪草苷A、積雪草
苷B的混合溶液，餾分3為積雪草苷A與積雪草苷B的混合溶液；將餾分3真
空濃縮、真空干燥后得2722mg積雪草苷A與積雪草苷B的混合物；將所得的 混合物用6mL體積濃度為20。/。的乙腈一水混合溶劑溶解、過(guò)濾后得濾液；內(nèi)徑 為2 cm、高度為12 cm的層析柱(高徑比6，床層體積38 mL，裝填C18硅膠 量為21 g)采用濕法裝柱，用體積濃度為20%的乙腈一水混合溶劑沖洗柱子； 取4.6 mL濾液上樣(上樣量為0.1 g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/lg C18 硅膠)，體積濃度為20%的乙腈一水混合溶劑以1.3 mL/min (2床層體積/h)的 流速洗脫；洗脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分4為積雪草苷B溶液， 餾分5為積雪草苷B與積雪草苷A的混合溶液，餾分6為積雪草苷A溶液，餾 分4經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷B417mg，純度為84.0%， 餾分6經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷A 715 mg，純度為85.4%; C18再生后可重復(fù)使用。 實(shí)施例18
取8 g積雪草總皂苷加入燒瓶中，加入100 mL甲醇溶解，再加入53 g硅膠 (拌樣比為0.15)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器攪拌均勻、真空蒸干后得拌樣硅膠;在內(nèi)徑為4 cm 的層析柱中加入硅膠，裝實(shí)后的硅膠高度為28cm，接著加入拌樣硅膠，裝實(shí)后 的拌樣硅膠高度為5.6cm (高徑比為7，硅膠與拌樣硅膠高度比為5，總床層體 積為422ml);以乙酸乙酯一甲醇一水(體積比為15:8:2)三元混合溶劑為流動(dòng)相， 以10.6mL/min (1.5床層體積/h)的流速洗脫；洗脫液經(jīng)TLC分析后合并成三 個(gè)餾分，餾分1為積雪草苷溶液，餾分2為積雪草苷、積雪草苷A、積雪草苷 B的混合溶液，餾分3為積雪草苷A與積雪草苷B的混合溶液；將餾分3真空 濃縮、真空干燥后得2071 mg積雪草苷A與積雪草苷B的混合物；將所得的混 合物用8 mL體積濃度為25%的乙腈一水混合溶劑溶解、過(guò)濾后得濾液；內(nèi)徑為 2cm、高度為16cm的層析柱(高徑比8，床層體積50 mL，裝填C18硅膠量為 28 g)采用濕法裝柱，用體積濃度為25%的乙腈一水混合溶劑沖洗柱子;取6.5 mL 濾液上樣(上樣量為0.06 g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/lg C18硅膠)，體 積濃度為25%的乙腈一水混合溶劑以1.7mL/min (2床層體積/h)的流速洗脫； 洗脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分4為積雪草苷B溶液，餾分5為 積雪草苷B與積雪草苷A的混合溶液，餾分6為積雪草苷A溶液，餾分4經(jīng)真 空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷B 410 mg，純度為93.1%，餾分6 經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷A703 mg，純度為94.7%; C18 再生后可重復(fù)使用。
權(quán)利要求
1.一種從積雪草總皂苷出發(fā)同時(shí)制備積雪草苷A與積雪草苷B的方法，方法的步驟如下1)積雪草總皂苷用甲醇溶解后加入硅膠混合攪拌均勻，蒸干后得拌樣硅膠，積雪草總皂苷與硅膠的質(zhì)量比例為0.05～0.2∶1；2)層析柱中依序加入硅膠和拌樣硅膠，采用干法裝柱，干法層析柱的高徑比為3～9，硅膠與拌樣硅膠的高度比為3～8；3)以有機(jī)溶劑I-有機(jī)溶劑II-水三元混合溶劑為流動(dòng)相，以0.5～3床層體積/h的流速洗脫；4)洗脫液經(jīng)TLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分1為積雪草苷溶液，餾分2為積雪草苷、積雪草苷A、積雪草苷B的混合溶液，餾分3為積雪草苷A與積雪草苷B的混合溶液；5)將餾分3真空濃縮、真空干燥后用乙腈-水混合溶劑溶解、過(guò)濾后得濾液；6)C18硅膠采用濕法裝柱，柱子的高徑比為4～12，用乙腈-水混合溶劑相沖洗柱子；7)濾液按0.01～0.1g積雪草苷A與積雪草苷B的混合物/1g C18硅膠的比例上樣，乙腈-水混合溶劑以0.5～3床層體積/h的流速洗脫；8)洗脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)餾分，餾分4為積雪草苷B溶液，餾分5為積雪草苷B與積雪草苷A的混合溶液，餾分6為積雪草苷A溶液，餾分4與餾分6經(jīng)真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥后分別得積雪草苷B與積雪草苷A產(chǎn)品；9)C18柱經(jīng)乙腈-水混合溶劑沖洗再生后可再次上樣。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從積雪草總皂苷出發(fā)同時(shí)制備積雪草苷A與 積雪草苷B的方法，其特征在于所述步驟1)中以0.08 0.15 g積雪草總皂苷/lg 硅膠的比例加入硅膠攪拌均勻。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從積雪草總皂苷出發(fā)同時(shí)制備積雪草苷A與 積雪草苷B的方法，其特征在于所述步驟3)中有機(jī)溶劑I為氯仿或二氯甲烷或 乙酸乙酯。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從積雪草總皂苷出發(fā)同時(shí)制備積雪草苷A與 積雪草苷B的方法，其特征在于所述步驟3)中有機(jī)溶劑II為甲醇或乙醇。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從積雪草總皂苷出發(fā)同時(shí)制備積雪草苷A與積雪草苷b的方法，其特征在于所述步驟3)有機(jī)溶劑i一有機(jī)溶劑n—水三元混合溶劑中有機(jī)溶劑I的體積濃度為60~80%。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從積雪草總皂苷出發(fā)同時(shí)制備積雪草苷A與 積雪草苷B的方法，其特征在于所述步驟3)有機(jī)溶劑I一有機(jī)溶劑II一水三元 混合溶劑中有機(jī)溶劑II的體積濃度為18 38%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從積雪草總皂苷出發(fā)同時(shí)制備積雪草苷A與 積雪草苷B的方法，其特征在于所述步驟3)有機(jī)溶劑I—有機(jī)溶劑II一水三元混 合溶劑中水的體積濃度為2~10%。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從積雪草總皂苷出發(fā)同時(shí)制備積雪草苷A與 積雪草苷B的方法，其特征在于所述步驟5)、步驟6)、步驟7)中乙腈一水混合 溶劑中乙腈的體積濃度為10~30%。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從積雪草總皂苷出發(fā)同時(shí)制備積雪草苷A與 積雪草苷B的方法，其特征在于所述步驟7)中濾液按0.02 0.06 g積雪草苷A 與積雪草苷B的混合物/lg C18硅膠的比例上樣。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從積雪草總皂苷出發(fā)同時(shí)制備積雪草苷A 與積雪草苷B的方法，其特征在于所述步驟9)中C18柱再生過(guò)程為依次用體積 濃度為80 95%的乙腈_水和10 30%的乙腈_水混合溶劑沖洗。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從積雪草總皂苷出發(fā)同時(shí)制備積雪草苷A與積雪草苷B的方法，方法為積雪草總皂苷用甲醇溶解，加硅膠攪拌，蒸干得拌樣硅膠；層析柱中依序加入硅膠和拌樣硅膠，干法裝柱；以有機(jī)溶劑I-有機(jī)溶劑II-水三元混合溶劑為流動(dòng)相洗脫；洗脫液經(jīng)TLC分析后合并成三個(gè)餾分，取其中富含積雪草苷A與積雪草苷B的餾分，真空濃縮、真空干燥后溶解、過(guò)濾得濾液；C18硅膠采用濕法裝柱，濾液上樣，用乙腈-水混合溶劑洗脫；洗脫液經(jīng)HPLC分析后合并成三個(gè)餾分，分別取其中富含積雪草苷B、積雪草苷A的餾分真空濃縮、結(jié)晶、真空干燥。該方法具有工藝過(guò)程簡(jiǎn)單、操作費(fèi)用低、積雪草苷A與積雪草苷B純度高等優(yōu)點(diǎn)，可用于新藥的開(kāi)發(fā)。
文檔編號(hào)C07J63/00GK101182346SQ20071016447
公開(kāi)日2008年5月21日 申請(qǐng)日期2007年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月5日
發(fā)明者呂秀陽(yáng), 賈廣韜, 鄭興芳 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)