作為毒蕈堿性受體拮抗劑的1-(烷氨基烷基-吡咯烷-/哌啶基)-2,2-二苯基乙酰胺衍生物的制作方法

專利名稱：作為毒蕈堿性受體拮抗劑的1-(烷氨基烷基-吡咯烷-/哌啶基)-2,2-二苯基乙酰胺衍生物的制作方法
本申請是申請號為200480016600.1、申請日為2004年6月10日、發明創造名稱為“作為毒蕈堿性受體拮抗劑的1-(烷氨基烷基-吡咯烷-/哌啶基)-2，2-二苯基乙酰胺衍生物”的專利申請的分案申請。
背景技術：
發明領域 本發明涉及具有毒蕈堿性受體拮抗劑或抗膽堿能活性的取代的吡咯烷和相關的化合物。本發明還涉及包含這類化合物的藥物組合物；使用這類化合物治療由毒蕈堿性受體介導的醫學狀況的方法；以及適用于制備這類化合物的方法和中間體。
技術現狀 肺障礙，如慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘，折磨著世界范圍內數以百萬的人，并且這樣的障礙是發病和死亡的主要原因。
已知毒蕈堿性受體拮抗劑提供支氣管保護作用，因此，這類化合物適用于治療呼吸障礙，如COPD和哮喘。當用于治療這類障礙時，毒蕈堿性受體拮抗劑通常通過吸入給藥。但是，即使當通過吸入給藥時，大量的毒蕈堿性受體拮抗劑也往往會被吸收到體循環中去，導致全身性副作用，如口干，尿潴留，瞳孔散大和心血管副作用。
另外，許多吸入的毒蕈堿性受體拮抗劑具有相對短的作用持續時間，要求每天將它們給藥若干次。這種每天多次的給藥方案不僅不方便，而且會由于患者不服從所需頻繁的給藥方案而產生治療不充分的重要風險。
因此，存在新的毒蕈堿性受體拮抗劑的需要。特別是，存在當通過吸入給藥時具有高效價且具有降低的全身性副作用的新的毒蕈堿性受體拮抗劑的需要。另外，存在具有長的作用持續時間，從而允許每日一次或甚至每周一次給藥的吸入的毒蕈堿性受體拮抗劑的需要。預計這類化合物對于治療肺障礙，如COPD和哮喘特別有效，同時降低或消除副作用，如口干。
發明概述 本發明提供新型的具有毒蕈堿性受體拮抗劑或抗膽堿能活性的取代的吡咯烷和相關的化合物。已經發現，除了其他的性能以外，本發明的化合物與相關化合物相比，具有令人驚奇和出乎意外的對hM2和hM3毒蕈堿性受體亞型的結合親合性。另外，現發現本發明的化合物，當通過吸入給藥時，具有令人驚奇和出乎意外的肺選擇性，從而導致降低的全身性副作用。此外，還發現本發明的化合物當通過吸入給藥時，具有令人驚奇和出人意料的支氣管保護的持續時間。
因此，在其組成方面的一個方面，本發明提供式I的化合物
其中 每一R1和R2獨立地選自C1-4烷基，C2-4烯基，C2-4炔基，C3-6環烷基，氰基，鹵素，-ORa，-SRa，-S(O)Ra，-S(O)2Ra和-NRbRc；或兩個相鄰的R1基團或兩個相鄰的R2基團相連形成C3-6亞烷基，-(C2-4亞烷基)-O-或-O-(C1-4亞烷基)-O-； 每-R3獨立地選自C1-4烷基和氟； 每一R4獨立地選自氫，C1-6烷基，C2-6烯基，C2-6炔基，C3-6環烷基，C6-10芳基，C2-9雜芳基，C3-6雜環，-CH2-R6和-CH2CH2-R7；或兩個R4基團與它們所連接的氮原子連接在一起形成C3-6雜環； R5選自C1-6烷基，C2-6烯基，C2-6炔基，C3-6環烷基，和-CH2-R8；其中每一烷基、烯基和炔基基團任選被-OH或1-5個氟取代基取代； 每一R6獨立地選自C3-6環烷基，C6-10芳基，C2-9雜芳基和C3-6雜環； 每一R7獨立地選自C3-6環烷基，C6-10芳基，C2-9雜芳基，C3-6雜環，-OH，-O(C1-6烷基)，-O(C3-6環烷基)，-O(C6-10芳基)，-O(C2-9雜芳基)，-S(C1-6烷基)，-S(O)(C1-6烷基)，-S(O)2(C1-6烷基)，-S(C3-6環烷基)，-S(O)(C3-6環烷基)，-S(O)2(C3-6環烷基)，-S(C6-10芳基)，-S(O)(C6-10芳基)，-S(O)2(C6-10芳基)，-S(C2-9雜芳基)，-S(O)(C2-9雜芳基)和-S(O)2(C2-9雜芳基)； 每一R8獨立地選自C3-6環烷基，C6-10芳基，C2-9雜芳基和C3-6雜環； 每一Ra獨立地選自氫，C1-4烷基，C2-4烯基，C2-4炔基和C3-6環烷基； 每一Rb和Rc獨立地選自氫，C1-4烷基，C2-4烯基，C2-4炔基和C3-6環烷基；或Rb和Rc與它們所連接的氮原子連接在一起形成C3-6雜環； a是0-3的整數； b是0-3的整數； c是0-4的整數； d是1或2； e是8或9； 其中在R1、R2、R3、R4、R7、Ra、Rb和Rc中，每一烷基、亞烷基、烯基、炔基和環烷基任選被1-5個氟取代基取代；R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8、Ra、Rb和Rc中，每一芳基、環烷基、雜芳基和雜環基任選被1-3個獨立地選自C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、氰基、鹵素、-O(C1-4烷基)、-S(C1-4烷基)、-S(O)(C1-4烷基)、-S(O)2(C1-4烷基)、-NH2、-NH(C1-4烷基)和-N(C1-4烷基)2的取代基取代，其中每一烷基、亞烷基、烯基和炔基基團任選被1-5個氟取代基取代；和-(CH2)e-中，每一-CH2-基團任選被1或2個獨立地選自C1-2烷基、-OH和氟的取代基取代； 或者其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體。
在其組成方面的另一個方面，本發明提供式II的化合物
其中R5和e如本文中定義；或者其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體。
在獨立的和不同的實施方案中，本發明還涉及其中在吡咯烷環的3-位上，立體化學具有(R)構型的式II化合物；和其中在吡咯烷環的3-位上，立體化學具有(S)構型的式II化合物。
在其組成方面的另一個方面，本發明提供一種藥物組合物，其包含藥學上可接受的載體和治療有效量的式I化合物，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體。這種藥物組合物可以任選包含其他的治療劑。因此，在一個實施方案中，本發明涉及這樣一種藥物組合物，其中該組合物進一步包括治療有效量的甾族抗炎劑，如皮質甾類；β2腎上腺素能受體激動劑；磷酸二酯酶-4抑制劑；或其組合。
本發明的化合物是毒蕈堿性受體拮抗劑。因此，在其方法方面的一個方面，本發明提供一種用于治療哺乳動物的方法，該哺乳動物具有通過用毒蕈堿性受體拮抗劑治療而減輕的醫學狀況，所述方法包括給予哺乳動物治療有效量的式I化合物，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體。
在其方法方面的另一個方面，本發明提供一種用于治療肺障礙的方法，所述方法包括給予需要治療的患者治療有效量的式I化合物，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體。
在其方法方面的還另一個方面，本發明提供一種在患者中產生支氣管擴張的方法，所述方法包括通過吸入法而給予患者產生支氣管擴張的量的式I化合物，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體。
在其方法方面的再另一個方面，本發明提供一種用于治療慢性阻塞性肺病或哮喘的方法，所述方法包括給予需要治療的患者治療有效量的式I化合物，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體。
因為本發明的化合物具有毒蕈堿性受體拮抗劑活性，所以這類化合物還可適作研究具有毒蕈堿性受體的生物系統或樣品或用于研究其他化學化合物的活性的研究工具。因此，在其方法方面的還另一個方面，本發明提供一種使用式I化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體作為研究生物系統或樣品、或用于發現新的具有毒蕈堿性受體拮抗劑活性的化學化合物的研究工具的方法。
本發明還涉及適用于制備式I化合物或其鹽或溶劑化物或立體異構體的方法和新型中間體。因此，在其方法方面的另一個方面，本發明提供制備式I化合物的方法，所述方法包括 (a)使式III化合物與式IV化合物在還原劑的存在下反應； (b)使式V化合物與式VI化合物在還原劑的存在下反應； (c)使式VII化合物與式IV化合物反應；或 (d)使式V化合物與式VIII化合物反應；和然后 (e)除去任何保護基以提供式I化合物或其鹽；其中式I和III-VIII化合物如本文中定義。
在一個實施方案中，上述方法進一步包括另外的形成式I化合物的藥學上可接受的鹽的步驟。
在其方法方面的另一方面，本發明提供用于制備式I化合物的藥學上可接受的鹽的方法，所述方法包括使式IX化合物
其中R1-R5和a-e如本文中定義；Pa是酸不穩定的氨基保護基；與藥學上可接受的酸接觸，形成式I化合物的藥學上可接受的鹽。
在其他的實施方案中，本發明涉及本文中描述的其它方法；并且涉及通過本文中描述的任何方法制備的產物。
在其組成方面的另一個方面，本發明提供式X的化合物
其中R1-R5和a-e如本文中定義；P是氨基保護基；或者其鹽或溶劑化物或立體異構體；用作制備式I化合物的中間體。
在其組成方面的另一個方面，本發明提供式XI的化合物
其中R5和e如本文中定義；P是氨基保護基；G選自-CHO，-CH(ORf)2，-CH2OH和-CH2-L，其中每一Rf獨立地為C1-6烷基或兩個Rf基團相連形成C2-6亞烷基；L是離去基團；或者其鹽或立體異構體；用作制備式I化合物的中間體；條件是當L是氯時，P不是乙氧羰基(即，CH3CH2OC(O)-)。
在另外的獨立和不同的方面，本發明提供 用于治療中的式I的化合物，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體； 用作藥物的式I的化合物，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體； 用于治療肺障礙，包括慢性阻塞性肺病和哮喘的式I的化合物，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體； 包含式I的化合物，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體的藥物； 式I化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體在治療肺障礙，包括慢性阻塞性肺病和哮喘方面的用途； 式I化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體作為用于治療肺障礙，包括慢性阻塞性肺病和哮喘的藥物的用途； 式I化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體用于制備藥物的用途；和 式I化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體在制備用于治療肺障礙，包括慢性阻塞性肺病和哮喘的藥物中的用途。
發明詳述 本發明提供新型的式I的取代吡咯烷和相關化合物，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體。這些化合物可以包含一個或多個手性中心，并且當存在這種手性中心時，本發明涉及外消旋混合物；純立體異構體(即，單個的對映異構體或非對映體)；和這類異構體的立體異構體富集的混合物，除非另外指出。當表現出特定的立體異構體時，本領域技術人員將理解，除非另外指出，在本發明的組合物中可以存在少量其他的立體異構體，條件是作為一個整體的組合物的實用性沒有因為存在這樣的其他異構體而被消除。
本發明的化合物還包含若干堿性基團(如，氨基)，因此，式I化合物可以以游離堿的形式或不同鹽的形式存在。所有這些形式都包括在本發明的范圍內。同樣包括在本發明范圍內的是式I化合物的藥學上可接受的溶劑化物或其鹽。
另外，當可應用時，式I化合物的所有順式-反式或E/Z異構體(幾何異構體)，互變異構形式和拓撲異構形式都包括在本發明的范圍內，除非另作說明。
本文中使用的用于對本發明化合物進行命名的命名法在本文的實施例中舉例說明。通常，使用工業上可獲得的AutoNom軟件(MDL，SanLeandro，Callfornia)得到這一命名法。
代表性的實施方案 以下取代基和值用來提供本發明各個方面有代表性的實施例和實施方案。這些有代表性的值旨在進一步定義這樣的方面和實施方案，并且不想排除其他的實施方案或限定本發明的范圍。在這點上，本文中優選具體值或取代基的代表不想以任何方式從本發明中排除其他的值或取代基，除非另外具體指出。
在特定的實施方案中，R1和R2，當存在時，獨立地選自C1-4烷基，氟，氯和-ORa；其中，每一烷基任選被1-3個氟取代基取代。在另一個特定的實施方案中，每一R1和R2是C1-2烷基或氟。有代表性的R1和R2基團包括，但是不局限于，甲基，乙基，正丙基，異丙基，二氟甲基，三氟甲基，2，2，2-三氟乙基，氟，氯，甲氧基，乙氧基，二氟甲氧基和三氟甲氧基。
在特定的實施方案中，每一R3，當存在時，獨立地選自C1-2烷基和氟；其中，每一烷基任選被1-3個氟取代基取代。當存在兩個R3取代基時，它們可以在相同或不同的碳原子上。有代表性的R3基團包括，但是不局限于，甲基，乙基，二氟甲基，三氟甲基和氟。
在特定的實施方案中，每一R4獨立地為氫或C1-4烷基；或每一R4獨立地為氫或C1-2烷基；或每一R4是氫。有代表性的R4基團包括，但是不局限于，氫，甲基和乙基。
或者，在另一個特定的實施方案中，兩個R4基團和它們所連接的氮原子結合在一起形成C3-5雜環，該雜環任選包含一個另外的選自氮、氧或硫的雜原子。有代表性的雜環包括，但是不局限于，吡咯烷-1-基，哌啶-1-基，哌嗪-1-基，嗎啉-4-基和硫代嗎啉-4-基。
在特定的實施方案中，R5是C1-5烷基；或R5是C1-4烷基；或R5是C1-3烷基；或R5是C1-2烷基；其中，烷基任選被-OH或1-3個氟取代基取代。在該實施方案中，有代表性的R5基團包括，但是不局限于，甲基，乙基，2-羥乙基，2，2，2-三氟乙基，正丙基，異丙基，1-羥基丙-2-基，正丁基和異丁基。在一個實施方案中，R5是甲基。
在其他特定的實施方案中，R5是C3-5環烷基；或R5是C3-4環烷基；其中，環烷基任選被-OH或1-3個氟取代基取代。在該實施方案中，有代表性的R5基團包括，但是不局限于，環丙基，環丁基和環戊基。
在另一個特定的實施方案中，R5是-CH2-R8，其中R8如本文中定義。在該實施方案獨立的方面，R5(即，-CH2-R8)選自 (a)-CH2-(C3-5環烷基)；或-CH2-(C3-4環烷基)；其中，環烷基任選被-OH或1-3個氟取代基取代； (b)-CH2-(苯基)，即，芐基，其中苯基任選被1-3個獨立地選自C1-4烷基、氰基、氟、氯、-O(C1-4烷基)、-S(C1-4烷基)和-S(O)2(C1-4烷基)的取代基取代；其中，每一烷基任選被1-3個氟取代基取代。
在該實施方案中，有代表性的R5基團包括，但是不局限于，環丙基甲基，環丁基甲基和環戊基甲基。和芐基，4-氰芐基，3-甲芐基，4-甲芐基，4-三氟甲氧基芐基，3-氟芐基和4-氟芐基。
在特定的實施方案中，每一R6獨立地是苯基；其中每一個苯基任選被1-3個獨立地選自C1-4烷基、氰基、氟、氯、-O(C1-4烷基)、-S(C1-4烷基)和-S(O)2(C1-4烷基)的取代基取代；其中，每一烷基任選被1-3個氟取代基取代。
在特定的實施方案中，每一R7獨立地選自苯基，-OH和-O(C1-2烷基)；其中，每一烷基任選被1-3個氟取代基取代；和每一苯基任選被1-3個獨立地選自C1-4烷基、氰基、氟、氯、-O(C1-4烷基)、-S(C1-4烷基)和-S(O)2(C1-4烷基)的取代基取代；其中，每一烷基任選被1-3個氟取代基取代。
在特定的實施方案中，每一Ra獨立地選自氫和C1-3烷基；或氫和C1-2烷基；其中，每一烷基任選被1-3個氟取代基取代。有代表性的Ra基團包括，但是不局限于甲基，乙基，正-丙基，異丙基，二氟甲基，三氟甲基和2，2，2-三氟乙基。
在特定的實施方案中，每一Rb和Rc獨立地選自氫和C1-3烷基；或氫和C1-2烷基；其中，每一烷基任選被1-3個氟取代基取代。有代表性的Rb和Rc包括，但是不局限于，甲基，乙基，正丙基，異丙基，二氟甲基，三氟甲基和2，2，2-三氟乙基。
或者，在另一個特定的實施方案中，Rb和Rc和它們所連接的氮原子結合一起形成C3-5雜環，該雜環任選包含一個另外的選自氮、氧或硫的雜原子。有代表性的雜環包括，但是不局限于，吡咯烷-1-基，哌啶-1-基，哌嗪-1-基，嗎啉-4-基和硫代嗎啉-4-基。
在特定的實施方案中，a是0、1或2；或a是0或1；或a是0。
在特定的實施方案中，b是0、1或2；或b是0或1；或b是0。
在特定的實施方案中，c是0、1或2；或c是0或1；或c是0。
當d是1，即，當通過d定義的環是吡咯烷環時，那么在一個實施方案中，在吡咯烷環3-位上的立構中心(即，帶有1-氨甲酰基-1，1-二苯甲基基團的碳原子)具有(S)立體化學。在另一個實施方案中，該立構中心具有(R)立體化學。
在一個實施方案中，e是8。在另一個實施方案中，e是9。
本發明特定的實施方案是其中兩個R4基團是氫，a、b和c是0；d是1；e是8或9；R5是C1-3烷基或C1-2烷基的式I的化合物；或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體。
本發明另一個特定的實施方案是其中兩個R4基團是氫，a、b和c是0；d是1；e是8或9；R5是C3-5環烷基或C3-4環烷基的式I的化合物；或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體。
本發明的還另一個特定的實施方案是其中R5是甲基；R1、R2、R3、R4、a、b、c、d、和e如本文中定義的式I化合物；或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體。
本發明其他特定的實施方案是式IIa的化合物
其中R5和e如表I中定義，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
表I *Ph＝苯基 本發明還有其他特定的實施方案是式IIb的化合物
其中R5和e如表II中定義，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
表II *Ph＝苯基 本發明還有其他特定的實施方案是式XII的化合物
其中R5和e如表III中定義，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
表III *Ph＝苯基 在式X和XI的化合物中，P是氨基保護基。在一個實施方案中，P是酸不穩定的氨基保護基(Pa)。在另一個實施方案中，P選自芐基，4-甲氧芐基，2，4-二甲氧基芐基，二苯甲基，三苯甲基，甲氧羰基，乙氧羰基，叔丁氧基羰基，芐基氧代羰基，對-甲氧基芐氧基羰基，9-芴基甲氧基羰基，甲酰基，乙酰基，三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基。在特定的實施方案中，P是叔丁氧基羰基。
在式XI化合物中，L是離去基團。在一個實施方案中，L是氯，溴或碘。在另一個實施方案中，L是甲磺酰氧基(甲磺酸酯)或對甲苯磺酰氧基(甲苯磺酸酯)。在特定的實施方案中，L是對甲苯磺酰氧基。
在一個實施方案中，Rf是甲基或乙基。在另一個實施方案中，兩個Rf基團相連形成-(CH2)2-或-(CH2)3-。
使人感興趣的特定的式X化合物是 2-[(S)-1-(8-N-芐基-N-甲基氨基辛基)吡咯烷-3-基]-2，2-二苯基乙酰胺；和 2-{(S)-1-[8-(N-叔丁氧基羰基-N-甲氨基)辛基]吡咯烷-3-基}-2，2-二苯基乙酰胺。
使人感興趣的特定的式XI化合物是 8-(N-芐基-N-甲氨基)辛-1-醇； 8-(N-叔丁氧基羰基-N-甲氨基)辛-1-醇；和 甲苯-4-磺酸8-(N-叔丁氧基羰基-N-甲氨基)辛基酯。
定義 當描述本發明的化合物、組合物、方法和工藝時，以下術語具有以下含義，除非另外指出。
術語″烷基″意指可以是直鏈或支鏈的一價飽和烴基團。除非另外定義，這類烷基基團通常包含1-10個碳原子。有代表性的烷基包括，例如，甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，仲丁基，異丁基，叔丁基，正戊基，正己基，正庚基，正辛基，正壬基，正癸基等。
術語″亞烷基″意指可以是直鏈或支鏈的二價飽和烴基團。除非另外定義，這類亞烷基基團通常包含1-10個碳原子。有代表性的亞烷基基團包括，例如，亞甲基，乙烷-1，2-二基(″亞乙基″)，丙烷-1，2-二基，丙烷-1，3-二基，丁烷-1，4-二基，戊烷-1，5-二基，等。
術語″烯基″意指一價不飽和烴基團，其可以是直鏈或支鏈的，并具有至少一個，通常是1、2或3個碳-碳雙鍵。除非另外定義，這類烯基基團通常包含2-10個碳原子。有代表性的烯基基團包括，例如，乙烯基，正丙烯基，異丙烯基，正丁-2-烯基，正己-3-烯基等。
術語″炔基″意指一價不飽和烴基團，其可以是直鏈或支鏈的，并具有至少一個，通常是1、2或3個碳-碳三鍵。除非另外定義，這類炔基基團通常包含2-10個碳原子。有代表性的烯基基團包括，例如，乙炔基，正丙炔基，正丁-2-炔基，正己-3-炔基等。
術語″芳基″意指具有單環(即，苯基)或稠環(即，萘)的一價芳烴。除非另外定義，這類芳基基團通常包含6-10個碳原子。有代表性的烯基基團包括，例如，苯基和萘-1-基，萘-2-基，等。
術語″環烷基″意指一價飽和碳環烴基團。除非另外定義，這類環烷基基團通常包含3-10個碳原子。有代表性的環烷基基團包括，例如，環丙基，環丁基，環戊基，環己基等。
術語″鹵素″意指氟，氯，溴和碘。
術語″雜芳基″意指具有單環或兩個稠環且在環中包含至少一個選自氮、氧或硫的雜原子(通常是1-3個雜原子)的一價芳基。除非另外定義，這類雜芳基基團通常總共包含5-10個環原子。有代表性的雜芳基基團包括，例如，以下化合物的一價物種吡咯，咪唑，噻唑，唑，呋喃，噻吩，三唑，吡唑，異唑，異噻唑，吡啶，吡嗪，噠嗪，嘧啶，三嗪，吲哚，苯并呋喃，苯并噻吩，苯并咪唑，苯并噻唑，喹啉，異喹啉，喹唑啉，喹喔啉等，其中連結點在任何適用的碳或氮環原子上。
術語″雜環基″或″雜環″意指具有單環或多個稠環并且在環中包含至少一個選自氮、氧或硫的雜原子(通常是1-3個雜原子)的一價飽和或不飽和(非芳族)基團。除非另外定義，這類雜環基團通常總共包含2-9個環原子。有代表性的雜環基團包括，例如以下化合物的一價物種吡咯烷，咪唑烷，吡唑烷，哌啶，1，4-二烷，嗎啉，硫代嗎啉，哌嗪，3-吡咯啉等，其中連結點在任何適用的碳或氮環原子上。
術語″藥學上可接受的鹽″意指可以接受用于患者，如哺乳動物給藥的鹽(如，對于給定的劑量方案來說具有可接受的哺乳動物安全性的鹽)。這類鹽可以源自于藥學上可接受的無機或有機堿和藥學上可接受的無機或有機酸。源自于藥學上可接受的無機堿的鹽包括銨，鈣，銅，三價鐵，亞鐵，鋰，鎂，錳，二價錳，鉀，鈉，鋅等。使人感興趣的特定的鹽是銨，鈣，鎂，鉀和鈉鹽。源自于藥學上可接受的有機堿的鹽包括以下物種的鹽伯、仲和叔胺，包括取代的胺，環胺，天然存在的胺，等，比如精氨酸、甜菜堿、咖啡因、膽堿、N，N′-二芐基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基嗎啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、葡萄糖胺、組氨酸、海巴明、異丙胺、賴氨酸、甲基葡糖胺、嗎啉、哌嗪、哌啶、多胺樹脂、普魯卡因、嘌呤、可可堿、三乙胺、三甲胺、三丙胺、緩血酸胺、等。源自于藥學上可接受的酸的鹽包括以下酸的鹽乙酸，抗壞血酸，苯磺酸，安息香酸，龍腦磺酸，檸檬酸，乙磺酸，乙二磺酸，反丁烯二酸，葡糖酸，葡萄糖醛酸，谷氨酸，馬尿酸，氫溴酸，鹽酸，羥乙磺酸，乳酸，乳糖酸，馬來酸，蘋果酸，扁桃酸，甲磺酸，粘酸，萘磺酸，萘-1，5-二磺酸，萘-2，6-二磺酸，煙堿酸，硝酸，雙羥萘酸，泛酸，磷酸，琥珀酸，硫酸，酒石酸，對甲苯磺酸，昔萘酸等。使人感興趣的特定的鹽是檸檬酸、氫溴酸、鹽酸、羥乙磺酸，馬來酸、磷酸、硫酸、和酒石酸鹽。
術語″其鹽″意指當酸的氫被陽離子，如金屬陽離子或有機陽離子等替代時形成的化合物。優選，所述鹽是藥學上可接受的鹽，不過對于不計劃對患者給藥的中間體化合物的鹽來說，這是不需要的。
術語″溶劑化物″意指由一個或多個溶質分子，即式I化合物或其藥學上可接受的鹽，和一個或多個溶劑分子形成的絡合物或聚集物。這類溶劑化物通常是具有基本上固定溶質和溶劑摩爾比的結晶固體。該術語也包括包合物，包括含水包合物。有代表性的溶劑包括，例如，水，甲醇，乙醇，異丙醇，乙酸等。當溶劑是水時，形成的溶劑化物是水合物。
術語″支氣管保護″或″支氣管保護性的″意指預防、改善、抑制或減輕呼吸疾病或障礙的癥狀或障礙。為了測定支氣管保護的持續時間，除非另外指出，使用由乙酰膽堿誘發的支氣管縮小的豚鼠模型。
術語″治療有效量″意指當給予需要治療的患者時足以實現治療的量。
這里使用的術語″治療″或″治療″意指治療或治療在患者，如哺乳動物(特別是人或伙伴動物)中疾病或醫學狀況(如COPD或哮喘)，其包括 (a)預防疾病或醫學狀況的發生，即患者的預防性治療； (b)改善疾病或醫學狀況，即，消除或導致患者中疾病或醫學狀況退化； (c)抑制疾病或醫學狀況，即，減緩或抑制患者中疾病或醫學狀況的發展；或 (d)減輕患者中疾病或醫學狀況的癥狀。
術語″離去基團″意指在取代反應，如親核取代反應中可以被另一個官能團或原子替換的官能團或原子。例如，有代表性的離去基團包括氯，溴和碘基團；磺酸酯基團，如甲磺酸酯，甲苯磺酸酯，對溴苯磺酸酯，對硝基苯磺酸酯等；以及酰氧基，如乙酰氧基，三氟乙酰氧基等。
術語″其受保護的衍生物″意指其中用保護或封端基團保護化合物的一個或多個官能團使其免于不希望反應的所述化合物的衍生物。可以受保護的官能團包括，例如，羧酸基團，氨基，羥基，硫醇基，羰基等。有代表性的羧酸保護基包括酯(如對甲氧芐基酯)，酰胺和酰肼；用于氨基的保護基包括氨基甲酸酯(如叔丁氧基羰基)和酰胺；用于羥基的保護基包括醚和酯；用于硫醇基的保護基包括硫醚和硫酯；用于羰基的保護基包括縮醛和縮酮；等。這類保護基是本領域技術人員公知的，并且被描述，例如，在T.W.Greene和G.M.Wuts，″有機合成中的保護基″一書，第三版，Wiley，New York，1999，以及其中引用的參考文獻中。
術語″氨基保護基″意指適合于預防氨基上的不希望的反應的保護基。有代表性的氨基保護基包括，但是不局限于，芐基，叔丁氧基羰基(BOC)，三苯甲基(Tr)，芐氧基羰基(Cbz)，對甲氧基芐氧基羰基(Moz)，9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)，甲酰基，乙酰基，三甲基甲硅烷基(TMS)，叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)，等。術語″酸不穩定的氨基保護基″意指通過用酸，包括例如無機酸或有機酸，如羧酸或磺酸處理而脫除的氨基保護基。有代表性的酸不穩定的氨基保護基包括，但是不局限于，氨基甲酸酯如叔丁氧基羰基(BOC)，對甲氧基芐氧基羰基(Moz)等。
術語″羧基保護基″意指適合于預防羧基上的不希望的反應的保護基。有代表性的羧基保護基包括，但是不局限于，酯，如甲基、乙基、叔丁基、芐基(Bn)、對甲氧芐基(PMB)、9-芴基甲基(Fm)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)、二苯甲基(二苯甲基，DPM)等的酯。
術語″任選取代的″意思指所述的基團或部分，如烷基、苯基等，是未取代的或被所指明的取代基取代。
一般合成方法 本發明的取代的吡咯烷和相關化合物可以用以下的一般方法和步驟，由可容易獲得的原料制備。盡管本發明特定的實施方案可以在以下流程圖中示出或描述，但本領域技術人員將承認，本發明所有的實施方案或方面可以用本文中描述的方法或使用本領域技術人員公知的其他方法、試劑和原料制備。還將理解，當給出典型的或優選的工藝條件(即，反應溫度，時間，反應物的摩爾比，溶劑，壓力，等)時，也可以使用其他的工藝條件，除非另有說明。最佳反應條件可以隨特定的反應物或使用的溶劑而變化，但是這樣的條件可以很容易地由本領域技術人員通過常規優化過程加以確定。
另外，如對本領域技術人員來說顯而易見的，為了防止某些官能團免于經受不希望的反應，可能需要或希望常規的保護基。用于特定官能團的適當保護基的選擇以及適宜的用于這類官能團的保護或脫保護的條件在本領域中是眾所周知的。如果希望的話，可以使用除本文所述方法中舉例說明的那些保護基以外的保護基。例如，許多保護基和它們的引入和脫除被描述在T.W.Greene和G.M.Wuts，″有機合成中的保護基″一書，第三版，Wiley，New York，1999，以及其中引用的參考文獻中。
式(I)化合物或其鹽可以通過包括以下步驟的方法制備 (a)使式III化合物
與式IV化合物
其中P1是氨基保護基，在還原劑的存在下反應； (b)使式V化合物
與式VI化合物
其中P2是氨基保護基，在還原劑的存在下反應； (c)使式VII化合物
其中L1是離去基團，與式IV化合物反應；或 (d)使式V化合物與式VIII化合物反應
其中L2是離去基團，P3是氨基保護基；和然后 (e)除去保護基P1、P2或P3，得到式I化合物或其鹽；其中R1-5和a-e如本文中定義。
任選，可以直接在步驟(e)中，或以獨立的另外的步驟，由步驟(e)的產物制備式I化合物的藥學上可接受的鹽。
在過程(a)中，P1可以是任何適當的氨基保護基，如芐基等。還原劑可以是任何適當的還原劑，包括金屬氫化物還原劑，如三乙酰氧基硼氫化鈉，氰基硼氫鈉等。在反應結束時，可以使用常規方法和試劑除去氨基保護基P1。例如，可以通過在催化劑，如鈀的存在下氫解而除去芐基保護基。
在過程(b)中，P2可以是任何適當的氨基保護基，如芐基，叔丁氧基羰基，芐氧基羰基，9-芴基甲氧基羰基，叔丁基二甲基甲硅烷基等。還原劑可以是任何適當的還原劑，包括金屬氫化物還原劑，如三乙酰氧基硼氫化鈉，氰基硼氫鈉等。在反應結束時，可以使用常規方法和試劑除去氨基保護基P2。例如，可以通過在催化劑，如鈀的存在下氫解而除去芐基保護基；可以通過用酸，如鹽酸、對甲苯磺酸等處理而除去叔丁氧基羰基基團；可以通過用氟化物離子源，如三乙胺三氟化氫處理而除去叔丁基二甲基甲硅烷基基團。
在過程(c)中，L1可以是任何適當的離去基團，其包括但不限于鹵素，如氯、溴或碘，或磺酸酯基，如甲磺酸酯，甲苯磺酸酯等；P1如本文中定義。
在過程(d)中，L2可以是任何適當的離去基團，其包括但不限于鹵素，如氯、溴或碘，或磺酸酯基，如甲磺酸酯，甲苯磺酸酯等；P3可以是任何適當的氨基保護基，如芐基，叔丁氧基羰基，芐基氧基羰基，9-芴基甲氧基羰基，叔丁基二甲基甲硅烷基等。還原劑可以是任何適當的還原劑，包括金屬氫化物還原劑，如三乙酰氧基硼氫化鈉，氰基硼氫鈉等。在反應結束時，可以使用常規方法和試劑除去氨基保護基P2。例如，可以通過在催化劑，如鈀的存在下氫解而除去芐基保護基；可以通過用酸，如鹽酸、對甲苯磺酸等處理而除去叔丁氧基羰基基團；可以通過用氟化物離子源，如三乙胺三氟化氫處理而除去叔丁基二甲基甲硅烷基基團。
在過程(b)和(d)的特定的實施方案中，P2和P3是叔丁氧基羰基基團，其通過用藥學上可接受的酸處理而脫除，并原位生成式I化合物的藥學上可接受的鹽。
作為進一步例子，有代表性的式I化合物的制備示于流程圖A中(其中，在以下流程圖中示出的取代基和變量具有本文中提供的定義，除非另外指出)。
流程圖A
如流程圖A所示，式1化合物首先與醇2反應，其中L3是適當的離去基團，如氯、溴、碘、甲苯磺酰基、甲磺酰基等，得到中間體3。通常，該反應是通過使1與至少一當量，優選約1.0-約1.1當量的醇2在惰性稀釋劑，如乙腈等中接觸進行的。該反應通常在過量的堿的存在下進行；優選，在約2-約4當量的堿，如三烷基胺，優選三乙胺的存在下進行。通常，該反應在約0℃-約80℃，優選約40℃-50℃的溫度范圍內進行約1-24小時，或直到反應基本完全。如果希望的話，所得中間體3容易地通過標準方法，如色譜法、重結晶等純化。
用于該反應的式2的醇或者是市售的，或者可以用公知的方法由市售的原料和試劑制備。有代表性的式2的醇包括，例如，8-氯-1-辛醇，9-氯-1-壬醇，8-溴-1-辛醇，9-溴-1-壬醇，8-碘-1-辛醇，9-碘-1-壬醇等。
然后，將中間體3的羥基氧化為相應的醛，得到中間體4。這一反應通常是通過使3與過量的適當的氧化劑接觸進行的。任何能夠把羥基氧化為醛的氧化劑都可以用于這一反應，其包括鉻(VI)試劑，如聯吡啶氧化鉻(VI)，氯鉻酸吡啶，重鉻酸吡啶等；和活化二甲亞砜試劑，如草酰氯/二甲亞砜，三氧化硫吡啶絡合物/二甲亞砜/三烷基胺等。
優選，這一反應用過量的三氧化硫吡啶絡合物和二甲亞砜，在三烷基胺，如三乙胺、二異丙基乙胺等的存在下進行。通常，這一反應是通過使3與約2.5-約3.5當量的三氧化硫吡啶絡合物和過量的，優選約10當量的二甲亞砜，在過量的，優選約5當量，的二異丙基乙胺的存在下，在惰性稀釋劑，如二氯甲烷中接觸進行的。這一反應通常在約-30℃-約0℃，優選約-10℃-約-20℃的溫度范圍內進行約0.25到約2小時，或直到反應基本完全。任選，然后用標準方法，如色譜法、重結晶等將所得的醛中間體4純化。
或者，醛中間體4可以通過如下方法制備首先使1與下式的化合物反應 L4-(CH2)e-1-CH(ORd)2 或 L5-(CH2)e-1-CH＝CH2 或
其中，L4和L5是適當的離去基團，如氯、溴、碘、甲苯磺酰基、甲磺酰基等，e如本文中定義，每一Rd獨立地為C1-6烷基或者兩個Rd基團相連形成C2-6亞烷基。隨后，將縮醛水解(即，使用酸的水溶液)或將烯烴臭氧分解(即，使用O3，隨后用還原劑，如亞磷酸三甲基酯、甲硫醚等分解臭氧化物)，得到醛4。
然后，使醛中間體4與胺5偶合，得到式6的化合物。通常，該反應是通過使醛4與過量的，如約1.0-約1.2當量的5，在過量的，優選約1.2-約1.5當量的適當還原劑的存在下，在惰性稀釋劑，如二氯甲烷中接觸進行的。適當的還原劑包括，例如，三乙酰氧基硼氫化鈉，氰基硼氫鈉等。優選，還原劑是三乙酰氧基硼氫化鈉。通常，該反應在約0℃-約30℃的溫度范圍內進行約6-約2 4小時，或直到反應基本完全。所得的式6化合物通常用標準方法，如色譜法、重結晶等純化。
使用常規的試劑和反應條件從6上脫除芐基，得到7。例如，使用催化劑，如碳上鈀和/或氫氧化鈀對6進行氫解，容易地除去芐基得到7。通常，該反應是通過使6與氫氣在約40-約60psi的壓力范圍內，在催化劑，如10％的碳上鈀存在下接觸進行的。該反應通常在惰性稀釋劑，如乙醇或異丙醇中，在環境溫度下進行約12-120小時，或直到反應基本完全。
或者，醛中間體5可以與式R5-NH2的胺反應，其中R5如本文中定義，直接得到化合物7。另外，如果希望的話，可以使用其他的氨基保護基替換流程圖A中的芐基。
適合用于本文中所述反應的胺化合物或者是市售的，或者可以由市售的原料和試劑用公知的方法制備。適合使用的有代表性的胺包括，但是不局限于，N-甲基-N-芐胺，N-乙基-N-芐胺，甲胺，乙胺，正丙胺，異丙胺，2-羥基乙胺，DL-2-氨基-1-丙醇，(R)-(-)-2-氨基-1-丙醇，(S)-(+)-2-氨基-1-丙醇，2，2，2--三氟乙基胺，芐胺，環丙胺，環丁胺，環戊胺等。
用于本文中所述反應的式1化合物容易通過流程圖B中舉例說明的方法制備。
流程圖B
如流程圖B中所示，二苯乙腈8與中間體9反應，其中L6是適當的離去基團，如氯、溴、碘、甲苯磺酰基、甲磺酰基等，P4是氨基保護基，如芐基、4-甲氧芐基、4-硝基芐基、乙氧羰基、苯羰基等，得到中間體10。通常，該反應通過如下所述步驟進行首先，通過使8與過量的，優選約1.4-約1.6當量的強堿，如叔丁醇鉀，在惰性稀釋劑，如四氫呋喃中，在約-10℃-約10℃的溫度范圍內接觸約0.5-約2.0小時而形成化合物8的陰離子。然后，使所得陰離子與約0.95-約1.05當量的9在約20℃-約50℃的溫度范圍內原位反應約10-約48小時，或直到反應基本完全。式9的化合物，其中L6是磺酸酯離去基團，很容易通過使用常規方法和試劑由相應的醇制備得到。例如，通過用約1.1當量的對甲苯磺酰氯和約1.2當量的1，4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷(DABCO)處理，容易地將(S)-1-芐基-3-吡咯烷醇轉化為(S)-1-芐基-3-(對甲苯磺酰氧基)吡咯烷。其他的式9化合物可以通過類似的方法，用市售的原料和試劑制備。
然后，使用常規方法和試劑將化合物10脫保護得到化合物11。例如，如果在化合物10中，P4是芐基保護基的話，則通過用氫源，如甲酸銨，和催化劑，如碳上鈀進行轉移氫解容易脫除該芐基。優選，該反應用化合物10的鹽酸鹽或氫溴酸鹽進行或者在酸，如鹽酸、氫溴酸、甲酸、硫酸、磷酸、對甲苯磺酸、乙酸、草酸等的存在下進行。這一氫解反應也可以在酸的存在下用氫氣和催化劑進行。參見，例如，1999年12月21日授權給N.Mori等人的美國專利No.6.005,119。
然后，將化合物11的腈基水解成相應的酰胺(即，-C(O)NH2)，得到式10的化合物。該反應通常是通過使11與硫酸水溶液，優選80％的硫酸，在約70℃-約100℃，優選約90℃的溫度下接觸約12-約36小時，或直到反應基本完全來進行的。如流程圖B所示，腈基到酰胺的水解也可以在脫除保護基之前進行以得到13，然后可以將其脫保護得到化合物12。
如果希望的話，化合物10或11的腈基可以用，例如，含約6-約12％過氧化氫的氫氧化鈉水溶液水解成相應的羧酸(即，-COOH)。然后，可以使用公知的方法和試劑，使所得羧酸與各種胺(即，ReReNH，其中Re如本文中定義)偶合，形成取代的酰胺。
本發明的化合物也可以通過流程圖C中舉例說明的方法制備。
流程圖C
如流程圖C所示，醇2，其中L7是適當的離去基團，如氯、溴、碘、甲苯磺酰基、甲磺酰基等，可以與芐胺5反應得到中間體14。通常，該反應是通過使醇2與至少一當量，優選約1.0-約1.1當量的芐胺5在惰性稀釋劑，如乙腈等中接觸進行的。該反應通常在過量的堿的存在下進行；優選，在約2-約4當量的堿，如三烷基胺，優選三乙胺的存在下進行。通常，該反應在約0℃-約80℃，優選約40℃-60℃的溫度范圍內進行約1-24小時，或直到反應基本完全。如果希望的話，所得中間體14容易地通過標準方法，如色譜法、重結晶等純化。
然后，將中間體14的羥基氧化為相應的醛，得到中間體15。這一反應通常是通過使14與過量的適當的氧化劑接觸進行的。任何能夠把羥基氧化為醛的氧化劑都可以用于這一反應，其包括鉻(VI)試劑，如聯吡啶氧化鉻(VI)，氯鉻酸吡啶，重鉻酸吡啶等；和活化二甲亞砜試劑，如草酰氯/二甲亞砜，三氧化硫吡啶絡合物/二甲亞砜/三烷基胺等。
優選，這一反應用過量的三氧化硫吡啶絡合物和二甲亞砜，在三烷基胺，如三乙胺、二異丙基乙胺等的存在下進行。通常，這一反應是通過使14與約2.5-約3.5當量的三氧化硫吡啶絡合物和過量的，優選約10當量的二甲亞砜，在過量的，優選約5當量的二異丙基乙胺的存在下，在惰性稀釋劑，如二氯甲烷中接觸進行的。這一反應通常在約-30℃-約0℃，優選約-10℃-約-20℃的溫度范圍內進行約0.25到約6小時，或直到反應基本完全。任選，然后用標準方法，如色譜法、重結晶等將所得的醛中間體15純化。
然后，使醛中間體15與1偶合得到式6的化合物。通常，這一反應是通過使醛15與至少約一當量的1在過量的，優選約1.2-約1.5當量的適當還原劑存在下，在惰性稀釋劑，如二氯甲烷中接觸進行的。適當的還原劑包括，例如，三乙酰氧基硼氫化鈉，氰基硼氫鈉等。優選，還原劑是三乙酰氧基硼氫化鈉。通常，該反應在約0℃-約30℃的溫度范圍內進行約2-約24小時，或直到反應基本完全。所得的式6化合物通常用標準方法，如色譜法、重結晶等純化。然后可以如以上所討論的從6上脫除芐基得到7。
另外，本領域技術人員也將理解，流程圖A、B和C中舉例說明的合成步驟可以通過與所示順序不同的順序進行，或通過使用與所述試劑不同的試劑進行，以得到式7的化合物。例如，不是將中間體3或14的羥基氧化成醛，而是，可以使用常規的試劑和反應過程將這些羥基轉化為離去基團，如氯、溴、碘、甲磺酸酯或甲苯磺酸酯。然后，很容易地用胺5或中間體1替換所得離去基團，得到化合物6。
作為另外的實例，有代表性的式I化合物可以如流程圖D中所示的那樣制備 流程D
如流程圖D所示，化合物14的芐基氨基保護基可以用常規方法和試劑脫除和用叔丁氧基羰基氨基保護基置換(即，氫解脫除芐基和二叔丁基重碳酸酯形成叔丁氧基羰基基團)，得到化合物16。
然后，使用常規的試劑和反應方法將化合物16的羥基轉化為離去基團，如氯、溴、碘、甲磺酸酯或甲苯磺酸酯，得到式17的化合物。例如，通過與甲苯磺酰氯(對甲苯磺酰氯)，在適當的堿，包括叔胺，如1，4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷的存在下反應，將羥基轉化為甲苯磺酸酯離去基團。該反應通常在惰性稀釋劑，如甲基叔丁基醚中，在約0℃-約30℃的溫度范圍內進行0.5-6小時，或直到反應基本完全。
然后，用式1化合物替換化合物17的離去基團，得到式18的化合物。該反應通常是通過使17與約0.95-約1.1摩爾當量的1，在叔胺如二異丙基乙胺的存在下接觸進行的。該反應通常在惰性稀釋劑，如乙腈中，在約25℃-約100℃的溫度范圍內進行約2-約12小時，或直到反應基本完全。
然后，用常規試劑和反應條件脫除化合物18的叔丁氧基羰基氨基保護基，得到式7化合物或其鹽。例如，叔丁氧基羰基氨基保護基可以很容易地通過用酸，如鹽酸、三氟乙酸、對甲苯磺酸等處理而脫除。
在一個實施方案中，式18化合物與藥學上可接受的酸接觸，直接形成化合物7的藥學上可接受的鹽，而不分離出游離堿。例如，18可以與萘-1，5-二磺酸接觸形成化合物7的萘-1，5-二磺酸鹽。該反應通常通過使18與約1-約3當量，如2當量的萘-1，5-二磺酸在惰性稀釋劑，如異丙醇中接觸進行。在一個實施方案中，含約2-約10體積％水的異丙醇被用作稀釋劑，以得到晶體萘-1，5-二磺酸鹽。
關于制備本發明有代表性的化合物或其中間體的特定的反應條件及其他方法的更詳細內容被描述在下文列出的實施例中。
藥物組合物 本發明取代的吡咯烷和相關化合物通常以藥物組合物的形式給予患者。這種藥物組合物可以通過任何可接受的給藥途徑給予患者，其包括但不限于，口服、吸入、經鼻、局部(包括透皮)和胃腸外給藥模式。
將理解，適合于特定給藥模式的任何形式的本發明化合物(即，游離堿，藥學上可接受的鹽，或溶劑化物)均可用于本文中討論的藥物組合物中。
因此，在其組合物方面的一個方面，本發明涉及一種藥物組合物，其包括藥學上可接受的載體或賦形劑和治療有效量的式I或II化合物或其藥學上可接受的鹽。任選，如果希望的話，這類藥物組合物可以包含其他的治療劑和/或配制劑。
本發明的藥物組合物通常包含治療有效量的本發明的化合物或其藥學上可接受的鹽。通常，這類藥物組合物將包含約0.01-約95重量％的活性劑；包括，約0.01-約30重量％；如約0.01-約10重量％的活性劑。
任何常規的載體或賦形劑都可以用于本發明的藥物組合物。特定的載體或賦形劑，或載體或賦形劑的組合的選擇將取決于用于治療特定患者的給藥模式或醫學狀況類型或疾病狀態。在這點上，用于特定給藥模式的適當藥物組合物的制備在藥物領域技術人員公知的范圍之內。另外，用于這類組合物的成分是商業上可得到的，例如，從Sigma，P.O.Box 14508，St.Louis，MO 63178。作為進一步的例子，常規的配制方法被描述在Remington的書The Science and Practice ofPharmacy，第20版，Lippincott Williams & White，Baltimore，Maryland(2000)；和H.C.Ansel等人的書Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems，第7版，Lippincott Williams& White，Baltimore，Maryland(1999)中。
可以用作藥學上可接受的載體的物質的有代表性的實例包括，但是不局限于以下所述(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和纖維素醋酸酯；(4)粉末黃蓍膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石粉；(8)賦形劑，如可可脂和栓劑蠟；(9)油，如花生油，棉子油，紅花油，芝麻油，橄欖油，玉米油和豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油，山梨糖醇，甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)藻酸；(16)無熱原水；(17)等滲鹽水；(18)林格氏液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖液；(21)壓縮推進劑氣體，如氯氟烴和氫氟烴；和(22)用于藥物組合物中的其他無毒相容物質。
本發明的藥物組合物通常通過將本發明的化合物與藥學上可接受的載體和一種或多種任選的成分徹底和緊密地混合或摻合制備。必要時或希望的話，之后可以將所得均勻摻合的混合物使用常規方法和設備成型或裝載入片劑，膠囊、丸、罐、筒、分配器等中。
在一個實施方案中，本發明的藥物組合物適合于吸入給藥。適當的用于吸入給藥的藥物組合物將通常呈氣霧劑或粉末形式。這類組合物通常用公知的輸送裝置，如霧化吸入器，定量吸入器(MDI)，干粉吸入器(DPI)或類似的輸送裝置給藥。
在本發明特定的實施方案中，包含活性劑的藥物組合物通過用霧化吸入器吸入給藥。這種霧化器設備通常產生一股高速氣流，這使得包含活性劑的藥物組合物噴霧，形成被攜帶到患者呼吸道中的霧。因此，當配制用于霧化吸入器時，通常將活性劑溶于適當的載體中形成溶液。或者，活性劑可以微粉化并與適當的載體結合形成可呼吸尺寸的微粉化顆粒的懸浮液，其中微粉化通常被定義為，約90％或更多的顆粒的直徑小于約10μm。適當的霧化器設備是商業上可供應的，例如由PARI GmbH(Starnberg，German)提供。其他的霧化器設備，例如，在美國專利6,123,068和WO 97/12687中被公開。
用于霧化吸入器的有代表性的藥物組合物包括等滲的鹽水溶液，其包含約0.05μg/mL-約10mg/mL的式I化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體。在一個實施方案中，該組合物的pH在約4-約6范圍之內。在特定的實施方案中，該組合物任選用檸檬酸鹽緩沖劑緩沖到pH約為5。
在本發明另一個特定的實施方案中，包含活性劑的藥物組合物通過用干粉吸入器吸入給藥。這種干粉吸入器通常在患者吸氣過程中以分散在患者氣流中的自由流動性粉末形式給予活性劑。為了獲得自由流動的粉末，活性劑通常與適當的賦形劑如乳糖或淀粉一起配制。
用于干粉吸入器的有代表性的藥物組合物包含粒徑在約1μm-約100μm之間的干燥乳糖，和式I化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體的微粉化顆粒。
這類干燥粉末制劑可以，例如，通過將乳糖與活性劑混合然后將各組分干混來制備。或者，如果希望的話，可以在沒有賦形劑的情況下配制活性劑。然后，通常將藥物組合物裝到干燥粉末分配器中，或者裝到與干粉輸送裝置一起使用的吸入筒或膠囊中。
干燥粉末吸入器輸送裝置的實例包括Diskhaler(GlaxoSmithKline，Research Triangle Park，NC)(參見，如，美國專利No.5,035,237)；Diskus(GlaxoSmithKline)(參見，如，美國專利No.6,378,519；Turbuhaler(AstraZeneca，Wilmington，DE)(參見，如，美國專利No.4,524,769)；和Rotahaler(GlaxoSmithKline)(參見，如，美國專利No.4,353,365)。適當的DPI設備的另外的實例被描述在美國專利No.5,415,162，5,239,993，和5,715,810及其中引用的參考文獻中。
在本發明還另一個特定的實施方案中，包含活性劑的藥物組合物通過用定量吸入器吸入給藥。這類定量吸入器通常使用壓縮推進劑氣體排放測定量的活性劑或其藥學上可接受的鹽。因此，使用定量吸入器給藥的藥物組合物通常包含活性劑在液化推進劑中的溶液或懸浮液。可以使用任何適當的液化推進劑，包括氯氟烴，如CCl3F，和氫氟烴(HFA)，如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA134a)和1，1，1，2，3，3，3-七氟-正丙烷，(HFA227)。由于擔心氯氟烴會影響臭氧層，通常優選包含HFA的制劑。HFA制劑的另外的任選組分包括共溶劑，如乙醇或戊烷，和表面活性劑，如去水山梨糖醇三油酸酯，油酸，卵磷脂，和甘油。參見，例如，美國專利No.5,225,183，EP 0717987A2，和WO 92/22286。
用于定量吸入器的有代表性的藥物組合物包含約0.01％-約5％重量的式I化合物，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體；約0％-約20％重量的乙醇；和約0％-約5％重量的表面活性劑；其余是HFA推進劑。
這類組合物通常通過把急冷或加壓的氫氟烷烴加入到包含活性劑、乙醇(如果存在的話)和表面活性劑(如果存在的話)的適當的容器中制備。為了制備懸浮液，將活性劑微粉化然后與推進劑結合。之后將制劑裝入形成定量吸入器設備一部分的氣霧劑罐。特別為與HFA推進劑一起使用而開發的定量吸入器設備的實例被提供在美國專利Nos.6,006,745和6,143,277中。或者，可以通過在微粉化的活性劑顆粒上噴霧干燥表面活性劑的涂層來制備懸浮液制劑。參見，例如，WO 99/53901和WO 00/61108。
對于制備可呼吸顆粒的工藝，以及適合于吸入給藥的制劑與設備的另外的實例參見美國專利Nos.6,268,533、5,983,956、5,874,063、和6,221,398，以及WO 99/55319和WO 00/30614。
在另一個實施方案中，本發明的藥物組合物適合于口服。適當的用于口服的藥物組合物可以呈膠囊，片劑，丸，糖淀，扁囊劑，糖衣丸，粉末，顆粒形式；或作為在水性或非水性液體中的溶液或懸浮液；或作為水包油或油包水液體乳劑；或作為酏劑或糖漿；等；每一種都包含預定量的本發明的化合物作為活性成分。
當計劃以固體劑型用于口服(即，作為膠囊、片劑、丸等)時，本發明的藥物組合物將通常包含本發明的化合物作為活性成分和一種或多種藥學上可接受的載體，如檸檬酸鈉或磷酸二鈣。任選或可替代地，這類固體劑型也可以包含(1)填充劑或膨脹劑，如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露糖醇，和/或硅酸；(2)粘合劑，如羧甲基纖維素，藻酸鹽，明膠，聚乙烯基吡咯烷酮，蔗糖和/或阿拉伯膠；(3)濕潤劑，如甘油；(4)崩解劑，如瓊脂，碳酸鈣，馬鈴薯或木薯淀粉，藻酸，某些硅酸鹽，和/或碳酸鈉；(5)溶液阻滯劑，如石蠟；(6)吸收促進劑，如季銨化合物；(7)潤濕劑，如鯨蠟醇和/或單硬脂酸甘油酯；(8)吸收劑，如高嶺土和/或膨潤土；(9)潤滑劑，如滑石粉，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂，固體聚乙二醇，月桂基硫酸鈉，和/或其混合物；(10)著色劑；和(11)緩沖劑。
釋放劑、潤濕劑、包衣劑、甜味劑、調味劑和香味劑、防腐劑和抗氧化劑也可以存在于本發明的藥物組合物中。藥學上可接受的抗氧化劑的實例包括(1)水溶性的抗氧化劑，如抗壞血酸，鹽酸半胱氨酸，硫酸氫鈉，偏亞硫酸鈉，亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如抗壞血酰棕櫚酸酯，丁基化羥基苯甲醚(BHA)，丁基化羥基甲苯(BHT)，卵磷脂，櫚酸丙酯，α-生育酚，等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸，乙二胺四乙酸(EDDA)，山梨糖醇，酒石酸，磷酸，等。用于片劑、膠囊、丸等的包衣劑包括用于腸溶衣的那些，如醋酞纖維素(CAP)，聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸酯(PAP)，羥丙基甲基纖維素酞酸酯，甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物，醋酸偏苯三酸纖維素(CAT)，羧甲基乙基纖維素(CMEC)，醋酸琥珀酸羥丙基甲基纖維素(HPMCAS)，等。
如果希望的話，本發明的藥物組合物也可以通過使用，例如不同比例的羥丙基甲基纖維素或其他的聚合母體、脂質體和/或微球體而被配制以提供活性成分的緩慢或控制釋放。
此外，本發明的藥物組合物可以任選包含遮光劑和可以被配制使得它們在胃腸道的某個部分中只或優選地，任選以延遲的方式釋放活性成分。可以使用的包埋組合物的實例包括聚合物物質和蠟。活性成分也可以呈微囊化的形式，如果適當的話，與一種或多種上述賦形劑一起。
用于口服的適當的液體劑型包括，例如，藥學上可接受的乳劑，微乳劑，溶液，懸浮液，糖漿和酏劑。這類液體劑型通常包含活性成分和惰性稀釋劑，如，水或其他的溶劑，增溶劑和乳化劑，如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(特別是，棉籽、花生、玉米、胚芽、橄欖、蓖麻和芝麻油)，甘油，四氫呋喃基醇，聚乙二醇和脫水山梨糖醇的脂肪酸酯，和其混合物。除了活性成分之外，懸浮液可以包含助懸劑如，乙氧基化的異硬脂酰醇，聚氧乙烯山梨糖醇和脫水山梨糖醇酯，微晶纖維素，偏氫氧化鋁，膨潤土，瓊脂和黃蓍膠，和其混合物。
當計劃用于口服時，本發明的藥物組合物優選包裝在單元劑型中。術語″單元劑型″意指適合于給藥患者的物理上離散的單元，即，每一單元包含單獨或者與一種或多種另外的單元結合產生希望的治療作用所計算的預定量的活性劑。例如，這類單元劑型可以是膠囊，片劑，丸劑，等。
本發明的化合物也可以用已知的透皮輸送系統和賦形劑透皮給藥。例如，本發明的化合物可以與滲透增強劑，如丙二醇、聚乙二醇單月桂酸酯、氮雜環烷-2-酮等混合，并摻入到貼劑或類似的輸送系統中。如果希望的話，包括膠凝劑、乳化劑和緩沖劑的另外的賦形劑可以用于這類透皮組合物中。
本發明的藥物組合物也可以包含與式I化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或立體異構體共同給藥的其他的治療劑。例如，本發明的藥物組合物可以進一步包括一種或多種選自β2腎上腺素能受體激動劑、抗炎藥(如皮質甾類和非甾族抗炎藥(NSAIDs)、其他的毒蕈堿性受體拮抗劑(即，抗膽堿能藥)、抗感染藥(如抗生素或抗病毒劑)和抗組胺劑的治療劑。所述其他的治療劑可以藥學上可接受的鹽或溶劑化物的形式使用。另外，如果適當的話，所述其他的治療劑可以以旋光純的立體異構體使用。
可以與本發明的化合物聯合使用的有代表性的β2腎上腺素能受體激動劑包括，但是不局限于，沙美特羅，柳丁氨醇，福莫特羅，沙甲胺醇，非諾特羅，叔丁喘寧，舒喘寧，新異丙腎上腺素，間羥異丙腎上腺素，比托特羅，吡布特羅，左沙丁胺醇等，或其藥學上可接受的鹽。可以與本發明化合物組合使用的其他的β2腎上腺素能受體激動劑包括，但是不局限于，3-(4-{[6-({(2R)-2-羥基-2-[4-羥基-3-(羥甲基)-苯基]乙基}氨基)己基]氧}丁基)苯磺酰胺和3-(3-{[7-({(2R)-2-羥基-2-[4-羥基-3-(羥甲基)苯基]乙基}氨基)庚基]氧}-丙基)苯磺酰胺及2002年8月29日出版的WO 02/066422中公開的相關化合物；3-[3-(4-{[6-([(2R)-2-羥基-2-[4-羥基-3-(羥甲基)苯基]乙基}氨基)己基]氧}丁基)苯基]咪唑烷-2，4-二酮和2002年9月12日出版的WO 02/070490中公開的相關化合物；3-(4-{[6-({(2R)-2-[3-(甲酰基氨基)-4-羥基苯基]-2-羥基乙基}氨基)己基]氧}丁基)苯磺酰胺，3-(4-{[6-({(2S)-2-[3-(甲酰基氨基)-4-羥基苯基]-2-羥基乙基}氨基)己基]氧}丁基)-苯磺酰胺，3-(4-{[6-({(2R/S)-2-[3-(甲酰基氨基)-4-羥基苯基)-2-羥基乙基}氨基)己基]氧}丁基)苯磺酰胺，N-(叔-丁基)-3-(4-{[6-({(2R)-2-[3-(甲酰基氨基)-4-羥基苯基]-2-羥基乙基}氨基)己基]-氧}丁基)苯磺酰胺，N-(叔-丁基)-3-(4-{[6-({(2S)-2-[3-(甲酰基氨基)-4-羥基苯基]-2-羥基乙基}氨基)己基]氧}丁基)-苯磺酰胺，N-(叔-丁基)-3-(4-{[6-({(2R/S)-2-[3-(甲酰基氨基)-4-羥基苯基]-2-羥基乙基}氨基)己基]-氧}丁基)苯磺酰胺和2002年10月3日出版的WO02/076933中公開的相關的化合物；4-{(1R)-2-[(6-{2-[(2，6-二氯芐基)氧]乙氧基}己基)氨基]-1-羥基乙基}-2-(羥基甲基)苯酚和2003年3月2日出版的WO 03/024439中公開的相關的化合物；N-{2-[4-((R)-2-羥基-2-苯基乙基氨基)苯基]乙基}-(R)-2-羥基-2-(3-甲酰氨基-4-羥基苯基)乙基胺和2003年6月10日授權的美國專利No.6,576,793B1中公開的相關的化合物；N-{2-[4-(3-苯基-4-甲氧基苯基)氨基苯基]乙基}-(R)-2-羥基-2-(8-羥基-2(1H)-喹啉酮-5-基)乙基胺和2003年11月25日授權的美國專利No.6,653,323B2中公開的相關的化合物；和其藥學上可接受的鹽。當使用時，β2-腎上腺素能受體激動劑將以治療有效量存在于藥物組合物中。通常，β2-腎上腺素能受體激動劑的存在量將足以提供約0.05μg到約500μg每劑量。
可以與本發明化合物結合使用的有代表性的皮質甾類包括，但是不局限于，甲基潑尼松龍，潑尼松龍，地塞米松，氟替卡松丙酸酯，6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃基羰基)氧]-11β-羥基-16α-甲基-3-氧代-雄甾烷-1，4-二烯-17β-硫代羥酸S-氟甲基酯，6α，9α-二氟-11β-羥基-16α-甲基-3-氧代-17α-丙酰氧基-雄甾烷-1，4-二烯-17β-硫代羥酸S-(2-氧代-四氫化呋喃-3S-基)酯，倍氯米松酯(如17-丙酸酯或17，21-二丙酸酯)，布地縮松，氟尼縮松，莫米松酯(如糠酸酯)，曲安奈德，羅氟奈德，環索奈德，布替可特丙酸酯，RPR-106541，ST-126等，或其藥學上可接受的鹽。當使用時，皮質甾類將以治療有效量存在于藥物組合物中。通常，甾族抗炎劑的存在量將足以提供約0.05μg到約500μg每一劑量。
其他適當的組合包括，例如，其他的抗炎藥，如，NSAID(如色甘酸二鈉；奈多羅米鈉；磷酸二酯酶(PDE)抑制劑(如茶堿，PDE4抑制劑或混合的PDE3/PDE4抑制劑)；白三烯拮抗劑(如孟魯司特)；白三烯合成抑制劑；iNOS抑制劑；蛋白酶抑制劑，如類胰蛋白酶和彈性蛋白酶抑制劑；β-2整聯蛋白拮抗劑和腺苷受體激動劑或拮抗劑(如腺苷2a激動劑)；細胞因子拮抗劑(如趨化因子拮抗劑，如，白細胞介素抗體(αIL抗體)，具體地說，αIL-4療法，αIL-13療法，或其組合)；或細胞因子合成抑制劑。
例如，可以與本發明化合物組合使用的有代表性的磷酸二酯酶-4(PDE4)抑制劑或混合的PDE3/PDE4抑制劑包括，但是不局限于，順式4-氰基-4-(3-環戊氧基-4-甲氧苯基)環己烷-1-羧酸，2-甲酯基-4-氰基-4-(3-環丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)環己烷-1-酮；順式-[4-氰基-4-(3-環丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)環己烷-1-醇]；順式-4-氰基-4-[3-(環戊氧基)-4-甲氧苯基]環已烷-1-羧酸等，或其藥學上可接受的鹽。其他有代表性的PDE4或混合的PDE4/PDE 3抑制劑包括，AWD-12-281(elbion)；NCS-613(INSERM)；D-4418(Chiroscience andSchering-Plough)；CI-1018或PD-168787(Pfizer)；WO 99/16766中公開的苯并二氧雜環戊烯化合物(Kyowa Hakko)；K-34(KyowaHakko)；V-11294A(Napp)；羅氟司特(Byk-Gulden)；WO 99/47505中公開的酞嗪酮(pthalazinone)化合物(Byk-Gulden)；普馬芬群(Byk-Gulden，現在是Altana)；阿羅茶堿(Ahnirall-Prodesfarma)；VM554/UM565(Vernalis)；T-440(Tanabe Seiyaku)；和T2585(TanabeSeiyaku)。
除本發明化合物以外，可以與本發明化合物組合使用的有代表性的蕈毒堿拮抗劑(即，抗膽堿能藥)包括，但是不局限于，阿托品，硫酸阿托品，阿托品氧化物，甲硝阿托品，氫溴酸后馬托品，氫溴酸莨菪堿(d，1)，氫溴酸東莨菪堿，異丙托溴銨，氧托溴銨，噻托溴銨，乙胺太林，溴化丙胺太林，甲溴辛托品，克利溴銨，copyrrolate(Robinul)，碘異丙米特，溴美噴酯，曲地氯銨(Pathilone)，環苯甲哌甲基硫酸鹽，環噴托酯鹽酸鹽，托吡卡胺，鹽酸苯海索，哌侖西平，替侖西平，AF-DX116和美索曲明等，或其藥學上可接受的鹽；或者，對于以上鹽的形式所列的那些化合物來說，其可替代的藥學上可接受的鹽。
可以與本發明化合物組合使用的有代表性的抗組胺劑(即H1-受體拮抗劑)包括，但是不局限于，乙醇胺類，如馬來酸氯苯吡醇胺，富馬酸氯馬斯汀，鹽酸苯海拉明和茶苯海明；乙二胺類，如馬來酸(amleate)新安替根，吡芐明鹽酸鹽和吡芐明檸檬酸鹽；烷基胺類，如撲爾敏和阿伐斯汀；哌嗪類，如鹽酸羥嗪、雙羥萘酸羥嗪、鹽酸賽克力嗪、乳酸賽克力嗪、鹽酸敏克靜和西替利嗪鹽酸鹽；哌啶類，如阿司咪唑、左卡巴斯汀鹽酸鹽、氯雷他定或其脫碳乙氧基(descarboethoxy)類似物、特非那定和非索非那定鹽酸鹽；氮卓斯汀鹽酸鹽；等，或其藥學上可接受的鹽；或者，對于以上以鹽的形式所列的那些化合物來說，其可替代的藥學上可接受的鹽。
用與本發明化合物結合給藥的其他治療劑的適當劑量在約0.05μg/天-約100毫克/天范圍內。
以下制劑舉例說明了本發明有代表性的藥物組合物 制劑實施例A 如下制備用于口服的硬明膠膠囊 成分 量 本發明化合物 250毫克 乳糖(噴霧干燥的) 200毫克 硬脂酸鎂 10毫克 有代表性的方法將各成分徹底共混，然后裝入硬明膠膠囊中(每一膠囊460毫克組合物)。
制劑實施例B 如下制備用于口服的硬明膠膠囊 成分量 本發明化合物20毫克 淀粉89毫克 微晶纖維素 89毫克 硬脂酸鎂2毫克 有代表性的方法將各成分徹底共混，然后使其通過No.45目美國篩，并裝入硬明膠膠囊中(每一膠囊200毫克組合物)。
制劑實施例C 如下制備用于口服的膠囊 成分量 本發明化合物100毫克 聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯50毫克 淀粉粉末250毫克 有代表性的方法將各成分徹底共混，然后裝入明膠膠囊中(每一膠囊300毫克組合物)。
制劑實施例D 如下制備用于口服的片劑 成分量 本發明化合物10毫克 淀粉45毫克 微晶纖維素 35毫克 聚乙烯吡咯烷酮(10重量％的水溶液)4毫克 羧甲基淀粉鈉4.5毫克 硬脂酸鎂0.5毫克 滑石粉 1毫克 有代表性的方法使本發明的化合物、淀粉和纖維素通過No.45目美國篩并徹底混合。將聚乙烯吡咯烷酮溶液與所得粉末混合，然后使該混合物通過No.14目美國篩。把這樣產生的顆粒在50-60℃下干燥并通過No.18目美國篩。然后，將羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂和滑石粉(預先通過No.60目美國篩)加入到顆粒中。混合后，將混合物在壓片機上壓縮，形成重100毫克的片劑。
制劑實施例E 如下制備用于口服的片劑 成分量 本發明化合物250毫克 微晶纖維素 400毫克 發煙二氧化硅10毫克 硬脂酸 5毫克 有代表性的方法將各成分徹底共混，然后壓縮成片(每一片劑665毫克組合物)。
制劑實施例F 如下制備用于口服的單刻痕片劑 成分量 本發明化合物400毫克 玉米淀粉50毫克 交聯羧甲纖維素鈉25毫克 乳糖120毫克 硬脂酸鎂5毫克 有代表性的方法將各成分徹底共混，然后壓縮成單刻痕片(每片600毫克組合物)。
制劑實施例G 如下制備用于口服的懸浮液 成分 量 本發明化合物 1.0克 富馬酸0.5克 氯化鈉2.0克 戲羥苯甲酸甲酯0.15克 對羥苯甲酸丙酯0.05克 砂糖 25.5克 山梨糖醇(70％溶液)12.85克 Veegumk(VanderbiltCo.)1.0克 調味劑0.035毫升 著色劑0.5毫克 蒸餾水適量到100毫升 有代表性的方法將各成分混合形成每10毫升懸浮液包含100毫克活性成分的懸浮液。
制劑實施例H 如下制備用于吸入給藥的干燥粉末 成分量 本發明化合物0.2毫克 乳糖25毫克 有代表性的方法將本發明化合物微粉化然后同乳糖混合。之后，把該共混的混合物裝入明膠吸入筒中。筒中內容物使用粉末吸入器給藥。
制劑實施例I 如下制備用于干粉吸入設備的干燥粉末制劑 有代表性的方法制備藥物組合物，其中微粉化的本發明化合物與乳糖的體積(bulk)制劑比為1∶200。將該組合物裝入每劑量能夠輸送約10-約100μg本發明化合物的干粉吸入設備中。
制劑實施例J 如下制備用于通過在定量吸入器中進行吸入給藥的干燥粉末 有代表性的方法通過把10克平均粒徑小于10μm的微粉化顆粒形式的本發明化合物分散在由溶于200毫升軟化水中的0.2克卵磷脂形成的溶液中，而制備包含5重量％本發明化合物和0.1重量％卵磷脂的懸浮液。將懸浮液噴霧干燥，并將所得物質微粉化為平均直徑小于1.5μm的顆粒。把顆粒裝入有加壓的1，1，1，2-四氟乙烷筒中。
制劑實施例K 如下制備用于在定量吸入器中的藥物組合物 有代表性的方法通過把5克平均粒徑小于10μm的微粉化顆粒形式的活性成分分散在溶于100毫升軟化水中的0.5克海藻糖和0.5克卵磷脂形成的膠體溶液中，而制備包含5重量％本發明化合物、0.5％卵磷脂、和0.5％海藻糖的懸浮液。將懸浮液噴霧干燥，并把所得物質微粉化成平均直徑小于1.5μm的顆粒。將該顆粒裝入有加壓的1，1，1，2-四氟乙烷罐中。
制劑實施例L 如下制備用于霧化吸入器中的藥物組合物 有代表性的方法通過把0.1毫克本發明化合物溶于1毫升0.9％的用檸檬酸酸化的氯化鈉溶液中而制備用于霧化器中的水性氣霧劑制劑。將混合物攪拌并超聲處理直到活性成分溶解。通過慢慢加入NaOH而把溶液的pH值調節到約5的值。
制劑實施例M 如下制備可注射的制劑 成分量 本發明化合物0.2克 乙酸鈉緩沖溶液(0.4M)2.0毫升 HCl(0.5N)或NaOH(0.5N) 適量至pH4 水(蒸餾、無菌的)適量到20毫升 有代表性的方法將上述成分共混并用0.5N HCl或0.5N NaOH把pH調節到4±0.5。
實用性 本發明取代的吡咯烷和相關化合物適用作毒蕈堿性受體拮抗劑，因此，這類化合物適用于治療由毒蕈堿性受體介導的醫學狀況，即，通過用毒蕈堿性受體拮抗劑治療而改善的醫學狀況。這種醫學狀況包括，例如，呼吸道障礙，如慢性阻塞性肺病，哮喘，肺纖維化，過敏性鼻炎，鼻液溢；泌尿生殖道障礙，如活動過度的膀胱或逼肌機能亢進和他們的癥狀；胃腸道障礙，如過敏性腸綜合征，憩室疾病，弛緩不能，胃腸運動過強障礙和腹瀉；心臟心律不齊，如竇性心動過緩；帕金森氏病；認知障礙，如阿爾茨海默氏病；dismenorrhea；等。
在一個實施方案中，本發明的化合物適用于治療哺乳動物，包括人和其伙伴動物(如，狗、貓等)中的平滑肌障礙。這類平滑肌障礙包括，例如，活動過度的膀胱，慢性阻塞性肺病和過敏性腸綜合征。
當用于治療平滑肌障礙或其他由毒蕈堿性受體介導的狀況時，本發明的化合物通常將以單一日劑量或以每天多個劑量經口、直腸、胃腸外或通過吸入給藥。每劑量給藥的活性劑的量或每天給藥的總量通常將由患者的醫生確定，并且將取決于諸多因素，如患者狀況的性質和嚴重程度、待治療的狀況、患者的年齡和一般健康情況、患者對活性劑的耐受性、給藥途徑等。
通常，用于治療平滑肌障礙或其他由毒蕈堿性受體介導的障礙的適當的劑量將在約0.14微克/公斤/天到約7毫克/公斤/天活性劑的范圍內變動；包括從約0.15微克/公斤/天到約5毫克/公斤/天。對于平均7 0公斤的人來說，這將共計為約10微克每天-約500毫克每天活性劑。
在特定的實施方案中，本發明的化合物適用于治療哺乳動物，包括人中的呼吸障礙，如COPD或哮喘。當用于治療呼吸障礙時，本發明的化合物通常將以每日多個劑量、每天一個劑量或每周一個劑量通過吸入給藥。通常，用于治療呼吸性障礙的劑量將在約10微克/天到約200微克/天的范圍內變動。
當用于治療呼吸性障礙時，本發明的化合物任選與其他的治療劑，如β2-腎上腺素能受體激動劑；皮質甾類、非甾族抗炎劑、或其組合結合給藥。
在另一個實施方案中，本發明的化合物用來治療活動過度的膀胱。當用于治療活動過度的膀胱時，本發明的化合物通常將以每天一個劑量或每日多個劑量；優選以單一日劑量經口給藥。優選，用于治療活動過度的膀胱的劑量將在約1.0毫克/天到約500毫克/天的范圍內變動。
在還另一實施方案中，本發明的化合物用來治療過敏性腸綜合征。當用于治療過敏性腸綜合征時，本發明的化合物通常將以單一日劑量或每天多個劑量經口或直腸給藥。優選，用于治療過敏性腸綜合征的劑量將在約1.0毫克/天到約500毫克/天的范圍內變動。
因為本發明的化合物是毒蕈堿性受體拮抗劑，所以這類化合物還適用作調查或研究具有毒蕈堿性受體的生物系統或樣品的研究工具。這類生物系統或樣品可以包括M1、M2、M3、M4和/或M5毒蕈堿性受體。任何適當的具有毒蕈堿性受體的生物系統或樣品都可以用于這類研究中，這類研究可以在體外或者體內進行。適合于這類研究的有代表性的生物系統或樣品包括，但是不局限于，細胞，細胞提取物，質膜，組織樣品，哺乳動物(如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、豬、等)，等。
在該實施方案中，包含毒蕈堿性受體的生物系統或樣品與毒蕈堿性受體拮抗量的本發明的化合物接觸。然后，使用常規方法和設備，如放射性配體結合試驗和功能試驗測定拮抗毒蕈堿性受體的作用。這類功能試驗包括，在細胞內環腺苷酸(cAMP)方面的配體介導的變化，在酶腺苷酸環化酶(其合成cAMP)活性方面的配體介導的變化，在把鳥嘌呤核苷5′-O-(r-硫)三磷酸([35S]GTPγS)經由受體催化的[35S]GTPγS與GDP的交換引入到分離的膜方面的配體介導的變化，游離的細胞內鈣離子(例如，用熒光連接成像板閱讀器或來自Molecular Devices，Inc公司的FLIPR測定)方面的配體介導的變化。本發明的化合物將在上列任何功能試驗或類似性質的試驗中，拮抗或降低毒蕈堿性受體的活化。毒蕈堿性受體拮抗量的本發明的化合物通常將在約0.1納摩爾到約100納摩爾范圍內變動。
另外，本發明的化合物可以用作發現新的具有毒蕈堿性受體拮抗劑活性的化合物的研究工具。在該實施方案中，將試驗化合物或一組試驗化合物的毒蕈堿性受體結合數據(例如，如通過體外放射性配體置換試驗測定的)與本發明化合物的毒蕈堿性受體結合數據進行對比，以鑒別出那些具有大致相等或優異毒蕈堿性受體結合的試驗化合物，如果有的話。本發明的這一方面包括，作為獨立的實施方案，形成比較數據(使用適當的試驗)和對試驗數據進行分析以鑒定目的試驗化合物二者。
除了其它性能以外，發現本發明的化合物是M3毒蕈堿性受體活性的強效抑制劑。因此，在特定的實施方案中，本發明涉及式I化合物，其對于M3受體亞型的抑制離解常數小于或等于100nM；或小于或等于50nM；或小于或等于10nM(如通過體外放射性配體置換試驗所測定的)。
此外，還發現當通過吸入給藥時，本發明的化合物具有令人驚奇的和出人意料的支氣管保護的持續時間。因此，在另一個特定的實施方案中，本發明涉及式I的化合物，當通過吸入給藥時，其支氣管保護的持續時間大于約24小時，包括約24小時-約72小時。術語″支氣管保護的持續時間″意思指化合物在乙酰膽堿誘發的支氣管縮小的豚鼠模型中提供支氣管保護作用的時間長度。
此外，發現當通過吸入給藥時，本發明的化合物具有令人驚奇的和出人意料的肺選擇性。因此，在另一個特定的實施方案中，本發明涉及式I的化合物，其在通過吸入給藥后1.5小時或者24小時時，表觀肺選擇性指數大于10。術語″表觀肺選擇性指數″意指或者(a)抗催涎劑ID50(抑制匹魯卡品所誘發的流涎50％所需的劑量)與支氣管保護ID50(抑制乙酰膽堿誘發的支氣管縮小50％所需的劑量)之間的比例；或(b)抗抑制劑ID50(抑制乙酰甲膽堿誘發的平均動脈壓50％所需的劑量)與支氣管保護ID50(抑制乙酰膽堿誘發的支氣管縮小50％所需的劑量)之間的比例。
本發明化合物的這些性能以及實用性，可以用本領域技術人員公知的各種體外和體內試驗來證明。例如，有代表性的試驗在如下實施例中進一步被詳細描述。
實施例 提供以下合成和生物學實施例是為了對本發明進行舉例說明，而不應當視為以任何方式限定本發明的范圍。在以下的實施例中，除非另外指出，以下縮寫具有以下含義。未在以下給以定義的縮寫具有其公認的含義。
AC＝腺苷酸環化酶 ACN＝乙腈 BSA＝牛血清清蛋白 BOC＝叔丁氧基羰基 cAMP＝環腺苷酸 CHO＝中國倉鼠卵巢 cmp＝每分鐘計數 DCM＝二氯甲烷 DIPEA＝二異丙基乙胺 DME＝乙二醇二甲醚 DMF＝N，N-二甲基甲酰胺 DMSO＝二甲亞砜 dPBS＝杜爾貝科的磷酸鹽緩沖鹽水，不含CaCl2和MgCl EDC＝1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(carbodimide)鹽酸鹽 EDDA＝乙二胺四乙酸 EtOAc＝乙酸乙酯 FBS＝胎牛血清 GDP＝鳥嘌呤核苷5′-二磷酸 HEPES＝4-(2-羥乙基)-1-哌嗪-乙磺酸 hM1＝人體毒蕈堿性受體亞型1 hM2＝人體毒蕈堿性受體亞型2 hM3＝人體毒蕈堿性受體亞型3 hM4＝人體毒蕈堿性受體亞型4 hM5＝人體毒蕈堿性受體亞型5 HOAT＝1-羥基-7-氮雜苯并三唑 HPLC＝高效液相色譜法 Ki＝抑制離解常數 MS＝質譜法 MTBE＝四基叔丁基醚 [3H]NMS＝1-[N-甲基-3H]東莨菪堿甲基氯化物 OIS＝氧化震顫素誘發的流涎 PMB＝對甲氧芐基 PyBOP＝苯并三唑-1-基氧三吡咯烷-磷六氟磷酸鹽 THF＝四氫呋喃 TLC＝薄層色譜法 TFA＝三氟乙酸 如下實施例中報道的所有溫度都是攝氏溫度(℃)，除非另外指出。同樣，除非另外指出，試劑、原料和溶劑都購自商品供應商(如Aldrich，Fluka，Sigma等)，并且沒有進行進一步的純化而被使用。
實施例A 2，2-二苯基-2-(S)-吡咯烷-3-基乙酰胺的制備 步驟A-(S)-1-芐基-3-(對-甲苯磺酰基氧)-吡咯烷的制備 在氮氣氣氛中，在0℃下，向攪拌的(S)-1-芐基-3-吡咯烷醇(44.3克，0.25摩爾)和1，4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷(33.7克，0.3摩爾)的250毫升叔丁基甲醚溶液中分步加入對甲苯磺酰氯(52.4克，0.275摩爾)，滴加時間20分鐘。將反應混合物在0℃下攪拌1小時。除去冰浴，并將混合物在環境溫度下攪拌過夜(20±5小時)。加入乙酸乙酯(100毫升)，隨后加入飽和的碳酸氫鈉水溶液(250毫升)。所得混合物在環境溫度下攪拌1小時。分離各層，有機層用飽和的碳酸氫鈉水溶液(250毫升)；飽和的氯化銨水溶液(250毫升)；飽和的氯化鈉水溶液(250毫升)洗滌；然后經硫酸鈉(80克)干燥。濾去硫酸鈉，并用乙酸乙酯(20毫升)洗滌，真空除去溶劑，得到78.2克標題中間體，米色固體(產率94％；通過HPLC檢驗純度為95％)。
步驟B-(S)-1-芐基-3-(1-氰基-1，1-二苯基甲基)-吡咯烷的制備 在0℃下，在5分鐘內向攪拌的二苯乙腈(12.18克，61.8毫摩爾)的無水THF(120毫升)溶液中加入叔丁醇鉀(10.60克，94.6毫摩爾)。反應混合物在0℃下攪拌1小時。在0℃下，向反應混合物中一部分加入(S)-1-芐基-3-(對-甲苯磺酰基氧)-吡咯烷(20.48克，61.3毫摩爾)。除去冷水浴，反應混合物攪拌5-10分鐘，此時，反應混合物變為棕色均勻溶液。然后，將反應混合物在40℃下加熱過夜(20±5小時)。讓反應混合物(亮黃色懸浮液)冷卻到室溫，之后加入水(150毫升)。然后真空除去大部分THF，加入醋酸異丙酯(200毫升)。分離各層，有機層用飽和的氯化銨水溶液(150毫升)；飽和的氯化鈉水溶液(150毫升)洗滌，然后經硫酸鈉(50克)干燥。濾去硫酸鈉，并用醋酸異丙酯(20毫升)洗滌，真空除去溶劑，得到23.88克標題中間體，淺棕色油狀物(產率＞99％，通過HPLC檢驗純度為75％，主要被過量的二苯乙腈污染)。
步驟C-(S)-3-(1-氰基-1，1-二苯甲基)吡咯烷的制備 將(S)-1-芐基-3-(1-氰基-1，1-二苯基甲基)-吡咯烷溶于醋酸異丙酯(約1克/10毫升)，并將溶液與等體積的1N鹽酸水溶液混合。分離所得各層，水層用等體積醋酸異丙酯萃取。合并有機層，經硫酸鈉干燥并過濾。真空除去溶劑，得到(S)-1-芐基-3-(1-氰基-1，1-二苯甲基)吡咯烷鹽酸鹽，淺黃色泡沫狀固體。(注意該鹽酸鹽也可以在步驟B的后處理過程中制備得到)。
向攪拌的(S)-1-芐基-3-(1-氰基-1，1-二苯甲基)吡咯烷鹽酸鹽(8.55克，21.98毫摩爾)的甲醇(44毫升)溶液中加入碳上鈀(1.71克)和甲酸銨(6.93克，109.9毫摩爾)。反應混合物在攪拌下加熱到50℃，加熱3小時。將反應冷卻到環境溫度并加入水(20毫升)。所得混合物通過Celite墊過濾，用甲醇(20毫升)洗滌。收集濾液，真空除去大部分甲醇。殘余物與醋酸異丙酯(100毫升)和10％的碳酸鈉水溶液(50毫升)混合。分離所得各層，水層用醋酸異丙酯(50毫升)萃取。合并有機層，并經硫酸鈉(20克)干燥。濾去硫酸鈉，用醋酸異丙酯(20毫升)洗滌。真空除去溶劑，得到5.75克標題中間體，淺黃油狀物(產率99.7％，通過HPLC檢測純度為71％)。
步驟D-2，2-二苯基-2-(S)-吡咯烷-3-基乙酰胺的制備 將200毫升帶有磁性攪拌棒和氮氣進口的燒瓶裝載(S)-3-(1-氰基-1，1-二苯甲基)吡咯烷(2.51克)和80％的H2SO4(19.2毫升；用16毫升96％的H2SO4和3.2毫升水預先制備)。然后，將反應混合物在90℃加熱24小時或直到HPLC表明原料消耗完。讓反應混合物冷卻到室溫，之后傾入到冰上(按體積計約50毫升)。慢慢地把50％的氫氧化鈉水溶液在攪拌下在冰浴上加入到混合物中，直到pH值大約為12。加入二氯甲烷(200毫升)并與水溶液混合，此時，沉淀析出硫酸鈉并將其濾出。收集濾液，分離各層。水層用二氯甲烷(100毫升)萃取，合并有機層，并經硫酸鈉(5克)干燥。濾去硫酸鈉，用二氯甲烷(10毫升)洗滌。真空除去溶劑，得到克粗產物，淺黃泡沫狀固體(約2.2克，通過HPLC檢測純度為86％)。
將粗產物在攪拌下溶于乙醇(18毫升)。向該溶液中加入溫的L-酒石酸(1.8克)的乙醇(14毫升)溶液，并將所得混合物攪拌過夜(15±5小時)。所得沉淀通過過濾分離，得到米色固體(約3.2克，通過HPLC檢測其純度＞95％)。把甲醇(15毫升)加入到該固體中，所得漿液在70℃攪拌過夜(15小時)。讓漿液冷卻到環境溫度，過濾后得到白色固體(約2.6克，HPLC表明純度＞99％)。向該固體中加入乙酸乙酯(30毫升)和1 N氫氧化鈉水溶液(25毫升)。將該混合物混合直到形成截然不同的兩層，然后分離各層，水層用乙酸乙酯(20毫升)萃取。合并有機層，并經硫酸鈉(10克)干燥。過濾除去硫酸鈉，真空蒸發溶劑，得到1.55克標題中間體，米色泡沫狀固體(產率58％；HPLC表明純度＞99％)。
實施例1 2-[(S)-1-(8-甲基氨基辛基)吡咯烷-3-基]-2，2-二苯基乙酰胺的合成 步驟A-8-(N-芐基-N-甲氨基)辛烷-1-醇的制備 將處于乙腈(50毫升)中的8-溴-1-辛醇(25克，119.6毫摩爾)在35℃加入到攪拌的N-芐基-N-甲胺(43.49克，358.9毫摩爾)和碳酸鉀(49.52克，358.9毫摩爾)的乙腈(250毫升)溶液中。然后，將反應混合物在35℃攪拌7小時，之后冷卻到環境溫度。過濾碳酸鉀，將濾液減壓濃縮。將粗殘余物溶于MTBE(400毫升)中，有機相用水、鹽水洗滌，經硫酸鎂干燥。加入N-甲基-2-吡咯烷酮，混合物減壓濃縮除去過量的N-芐基-N-甲胺。加入MTBE(400毫升)，有機相用水、鹽水洗滌，經硫酸鎂干燥，過濾并減壓濃縮，得到標題中間體，油狀物(轉化率約100％)。
分析數據MS m/z 250.3(MH+)。
步驟B-8-(N-芐基-N-甲氨基)辛醛的制備 將二甲亞砜(22.71毫升，320毫摩爾)，然后是二異丙基乙胺(55.74毫升，320毫摩爾)在-10℃下加入到攪拌的來自步驟A的中間體(20克，80毫摩爾)的二氯甲烷(200毫升)溶液中。反應混合物在-10℃攪拌30分鐘，然后分步加入三氧化硫吡啶絡合物(38克，240毫摩爾)。反應混合物在-10℃下另外攪拌1小時，然后加入水(200毫升)。分離有機層，用水(200毫升)、鹽水(30毫升)洗滌，經硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。加入甲苯(100毫升)，并將其減壓除去，得到標題中間體，油狀物(轉化率約100％)。
步驟C-2-[(S)-1-(8-N-芐基-N-甲氨基辛基)吡咯烷-3-基]-2，2-二苯基乙酰胺的制備 將來自步驟B的中間體(5.95克，24毫摩爾)和2，2-二苯基-2-(S)-吡咯烷-3-基乙酰胺(7.4克，26.4毫摩爾)的二氯甲烷(250毫升)溶液在0℃冷卻并攪拌10分鐘。在0℃分步加入三乙酰氧基硼氫化鈉(8.4克，36毫摩爾)，并將反應混合物在室溫下攪拌4小時。加入二氯甲烷，有機相用碳酸氫鈉(2x)、鹽水(1x)洗滌，經硫酸鎂干燥，減壓濃縮。粗產物通過急驟色譜法(DCM/MeOH/NH4OH＝90/9/1)純化，得到9克標題中間體，油狀物(產率75％)。
分析數據MS m/z 512.8(MH+)。
步驟D-2-[(S)-1-(8-甲基氨基辛基)吡咯烷-3-基]-2，2-二苯基乙酰胺的制備 在氮氣氛下，向攪拌的來自步驟C的中間體(9克，17.6毫摩爾)的乙酸(170毫升)溶液中加入碳上鈀(10重量％，600毫克)和碳上氫氧化鈀(20重量％，濕，600毫克)。對反應混合物用氮氣沖洗三次，然后在室溫下置于含氫氣球下3天。反應混合物通過Celite過濾，用乙酸洗滌，并在減壓下除去溶劑。所得殘余物通過制備性HPLC純化，得到4.02克標題化合物，為其二(三氟乙酸)鹽的形式，油狀物(產率35％)。
分析數據MS m/z 422.2(MH+)。
或者，如下制備所述標題化合物 步驟A-8-(N-芐基-N-甲氨基)辛烷-1-醇的制備 由8-溴代辛烷-1-醇向250毫升燒瓶中加入N-芐基-N-甲胺(24.3克，200毫摩爾)，碳酸鉀(28克，200毫摩爾)，8-溴代辛烷-1-醇(14克，67毫摩爾)和乙腈(150毫升)。該反應混合物在35-40℃下攪拌5小時。然后過濾固體物質，濾液在高真空下蒸餾形成油狀物以除去過量的N-芐基-N-甲胺。殘余物溶于150毫升MTBE中，并用15％的氯化銨溶液(2x100毫升)、鹽水(100毫升)洗滌，用20克硫酸鈉干燥，過濾和真空蒸餾，得到13.2克標題中間體，油狀物(產率79％)。
由8-氯代辛烷-1-醇在2升燒瓶中裝入芐甲胺(270克，2.23摩爾)，碳酸鈉(157克，1.48摩爾)，碘化鈉(11.1克，0.074摩爾)，8-氯辛醇(122克，0.74摩爾)和乙腈(1000毫升)，所得懸浮液在80℃攪拌20-30小時。然后，將反應混合物濃縮到約500毫升的體積，加入水(600毫升)和叔丁基甲醚(1000毫升)。分離MTBE層并用水(500毫升)洗滌。通過真空蒸餾濃縮MTBE溶液，得到油狀物，然后通過高真空蒸餾將該油狀物進一步濃縮除去過量的芐甲胺。然后，把N-甲基-2-吡咯烷酮(300毫升)加入到剩余的油中，并通過高真空蒸餾濃縮該溶液，得到油狀物。將油狀物溶于MTBE(1000毫升)中，所得溶液用水(2x500毫升)、鹽水(500毫升)洗滌，用硫酸鈉(100克)干燥，過濾，并蒸餾濃縮，得到標題化合物，油狀物(178克，產率96％，純度＞95％)。
步驟B-甲苯磺酸8-(N-芐基-N-甲氨基)辛烷-1-基酯的制備 在250毫升燒瓶中裝入來自步驟A的中間體(10克)，DABCO(6.72克)，和MTBE(100毫升)。將反應混合物冷卻到＜10℃，在＜15℃下加入甲苯磺酰氯(9.2克)在60毫升MTBE中的溶液。該反應混合物在室溫下攪拌2小時，然后加入庚烷(40毫升)，并將混合物過濾。濾液經真空蒸餾，得到16克標題中間體，油狀物(產率99％)。
步驟C-2-[(S)-1-(8-N-芐基-N-甲氨基辛基)吡咯烷-3-基]-2，2-二苯基乙酰胺的制備 在1000毫升帶有氮氣進口的燒瓶中裝入來自步驟B的中間體(16克)，2，2-二苯基-2-(S)-吡咯烷-3-基乙酰胺(10克)，二異丙基乙胺(10.3克)和乙腈(200毫升)。反應混合物在45-50℃下攪拌20小時，然后加入乙酸酐(2克)，混合物在室溫下攪拌2小時。加入叔丁基甲醚(300毫升)和水(400毫升)，分離MTBE層并用水(2x150毫升)洗滌，然后用1N HCl(1x150毫升)洗滌。分離水層，用MTBE(3x100毫升)洗滌，然后用27％的氫氧化銨溶液調節到pH值＞12。之后，用MTBE(2x200毫升)萃取堿性水層，MTBE層用水(200毫升)、鹽水(200毫升)洗滌，經硫酸鈉(20克)干燥，過濾并蒸餾，得到16.5克標題中間體，油狀物(產率90％)。如果希望的話，該反應可以在作為溶劑的N-甲基吡咯烷酮中進行。另外，可以使用碳酸鉀或碳酸鈉替換二異丙基乙胺，和任選可以把碘化鈉加入到反應混合物中。
步驟D-2-[(S)-1-(8-甲氨基辛基)吡咯烷-3-基]-2，2-二苯基乙酰胺的制備 在250毫升燒瓶中裝入來自步驟C的中間體(24克)，碳上鈀(10％的鈀在含50％水的碳上，5.3克))，異丙醇(160毫升)和3M的HCl溶液(30毫升)。反應混合物用氮氣脫氣然后在室溫下氫化(45-50psi)16小時。混合物通過Celite墊過濾，對濾液進行蒸餾，直到剩余約50毫升的體積。將殘余物溶于1N HCl(100毫升)中并用二氯甲烷(2x100毫升)洗滌。水層通過加入氫氧化銨而調節到pH值＞12，然后用MTBE(2x150毫升)萃取。然后用水(100毫升)、鹽水(100毫升)洗滌MTBE溶液，經硫酸鈉干燥(30克)，過濾并蒸餾形成油狀物，其在高真空下干燥，得到16.5克標題化合物(產率91％)。
或者，如下制備所述標題化合物 步驟A-8，8-二甲氧基辛醛的制備 在1升燒瓶中加入環辛烯(50克)，甲醇(250毫升)和二氯甲烷(250毫升)。在-70℃下向溶液中鼓以臭氧8小時。然后加入甲苯磺酸(3克)，反應混合物在-70℃下攪拌6小時。然后加入碳酸氫鈉(20克)并將反應混合物在-60℃另外攪拌2小時。最后，在-60℃下加入亞硫酸二甲酯(56克)，將反應混合物在室溫下攪拌16小時。將形成的固體過濾，濾液蒸發得到油狀物。把油狀物溶于二氯甲烷(300毫升)中，并用1％的碳酸氫鈉溶液(2X150毫升)洗滌。然后使二氯甲烷溶液經硫酸鈉(50克)干燥，過濾并蒸餾，得到60.3克標題中間體，油狀物(產率71％)。
步驟B-2-[(S)-1-(8-氧代辛基)吡咯烷-3-基]-2，2-二苯基乙酰胺的制備 在100毫升燒瓶中裝入2，2-二苯基-2-(S)-吡咯烷-3-基乙酰胺(2.8克)，8，8-二甲氧基辛醛(2.1克)，和二氯甲烷(20毫升)，并將該混合物在室溫下攪拌1小時。加入三乙酰氧基硼氫化鈉(3.18克)，反應混合物在室溫下攪拌14小時。然后加入5％的碳酸氫鈉溶液(350毫升)，該混合物攪拌0.5小時。分離各層，水層用二氯甲烷(20毫升)萃取。將合并的二氯甲烷溶液濃縮，到約20毫升的體積，通過硅膠墊(10克)過濾，用在二氯甲烷中的10％甲醇(100毫升)洗滌。將產物溶液濃縮形成油狀物，并將油狀物溶于50毫升乙腈中，與1％的HCl(30毫升)一起攪拌16小時。通過加入28％的氫氧化銨溶液而將混合物調節到堿性，至pH值＞12，然后用MTBE(2x100毫升)萃取。MTBE層用鹽水(100毫升)洗滌，經硫酸鈉(10克)干燥，過濾并真空濃縮，得到3.8克標題中間體，油狀物(產率93％)。
步驟C-2-[(S)-1-(8-N-芐基-N-甲氨基辛基)吡咯烷-3-基]-2，2-二苯基乙酰胺的制備 在100毫升帶有氮氣進口的燒瓶中裝入來自步驟B的中間體(3克)，N-芐基-N-甲胺(2.1克)和二氯甲烷(20毫升)，該混合物在室溫下攪拌1小時。加入三乙酰氧基硼氫化鈉(3.18克)，將反應混合物在室溫下攪拌14小時。然后通過加入50毫升5％的HCl而猝滅反應，所得混合物攪拌0.5小時。分離各層，水層用二氯甲烷(20毫升)洗滌。水層通過加入50％氫氧化鉀而調節到pH值＞13，然后用MTBE(2x100毫升)萃取。合并的MTBE溶液用鹽水(100毫升)洗滌，經硫酸鈉(10克)干燥，過濾并濃縮，得到2.8克標題中間體，油狀物(產率75％)。使用以上步驟D中所述的方法，將該中間體轉化為標題化合物。
或者，使用以下方法制備呈萘-1，5-二磺酸鹽形式的標題化合物 步驟A-8-(N-叔丁氧基羰基-N-甲氨基)辛-1-醇的制備 在1升燒瓶中裝入8-(芐甲基氨基)辛-1-醇(49克，0.20摩爾)，異丙醇(400毫升)，2N鹽酸水溶液(100毫升)和活性碳(5克，DARCO)，并將所得混合物攪拌30分鐘。然后將混合物過濾除去活性碳，向濾液中加入碳上鈀(5克，10％干重)。所得混合物用氮氣脫氣三次，然后用氫氣脫氣兩次；然后，混合物在Parr振蕩器上，在20-30psi的氫氣下氫化12-24小時。然后，混合物通過20克Celite墊過濾，經蒸餾濃縮到約100毫升的體積。加入異丙醇(200毫升)，并將該溶液再一次通過真空蒸餾濃縮到約100毫升的體積。該方法再重復兩或更多次，得到含8-甲氨基辛-1-醇鹽酸鹽的溶液。
在1升燒瓶中裝入以上得到的8-甲氨基辛醇鹽酸鹽的異丙醇溶液和三乙胺(30.3克，0.30摩爾)，并分步向該混合物中加入重碳酸二叔丁基酯(48克，0.22摩爾)。所得混合物在室溫下攪拌2-5小時，然后將混合物濃縮到約300毫升的體積。加入水(200毫升)和乙酸乙酯(400毫升)，并將該混合物攪拌15分鐘。分離有機層，用水(300毫升)、鹽水(300毫升)洗滌，經硫酸鈉(50克)干燥，過濾并真空脫除溶劑，得到標題化合物，淺黃色油狀物。(40克，產率77％，純度約95％)。
步驟B-甲苯-4-磺酸8-(N-叔丁氧基羰基-N-甲氨基)辛基酯的制備 在250毫升燒瓶中，將來自步驟A的產物(5.2克，20毫摩爾)和DABCO(3.13克，2.8毫摩爾)的MTBE(30毫升)溶液冷卻到約10℃，加入對甲苯磺酰氯(4.2克，22毫摩爾)的MTBE(20毫升)溶液，與此同時保持反應混合物的溫度在20℃或以下。然后，所得溶液在室溫下攪拌2小時。加入水(100毫升)，并將混合物攪拌15分鐘。分離有機層，用水(100毫升)、鹽水(100毫升)洗滌，然后蒸餾濃縮，得到標題化合物，油狀物。
步驟C-2-{(S)-1-[8-(N-叔丁氧基羰基-N-甲氨基)辛基]吡咯烷-3-基}-2，2-二苯基乙酰胺的制備 向500毫升燒瓶中加入來自步驟B的產物(17.68克，43毫摩爾)，來自制備1的產物(12克，43毫摩爾)，二異丙基乙胺(16.55克，128毫摩爾)和乙腈(100毫升)。所得混合物在60℃-65℃下攪拌5-7小時，然后冷卻到室溫。真空減少溶劑，加入醋酸異丙酯(100毫升)以溶解殘余物。所得溶液用水(100毫升)、飽和NaHCO3溶液(100毫升)、鹽水(100毫升)洗滌，經MgSO4(5克)干燥并過濾，得到橙色溶液。
硅膠(115克，280-400目)墊預先用400毫升包含1％三乙胺的醋酸異丙酯處理，隨后用250毫升醋酸異丙酯處理(硅膠墊為大約直徑6.4厘米，高約10.2厘米)。把以上得到的濾液(約150毫升體積)直接負載到預處理的二氧化硅墊上，并用醋酸異丙酯(400毫升)洗脫，然后用在醋酸異丙酯中的20％的異丙醇(1000毫升)洗脫。合并產物級分，濃縮得到標題化合物，油狀物(17.16克，產率77％，純度97％)。
步驟D-2-[(S)-1-(8-甲基氨基辛基)吡咯烷-3-基)-2，2-二苯基乙酰胺的萘-1，5-二磺酸鹽的制備 向1000毫升燒瓶中加入來自步驟C的產物(9.88克，19毫摩爾)，1，5-萘二磺酸四水合物(13.69克，38毫摩爾)和包含3％水的異丙醇(497毫升)。該混合物被加熱到85℃，加熱3-5小時，然后在4小時內慢慢地冷卻到室溫，然后在室溫下攪拌12-24小時。將所得固體過濾，用包含按體積計3％水的異丙醇(400毫升)洗滌，在室溫下真空干燥10-15小時，得到標題化合物，結晶固體(12.59克，產率95％，純度約99％)。
如果希望的話，該鹽可以進一步通過以下方法純化 向1升燒瓶中加入2-[(S)-1-(8-甲基氨基辛基)吡咯烷-3-基)-2，2-二苯基乙酰胺的萘-1，5-二磺酸鹽(21.4克，30.1毫摩爾)和按體積計包含3％水的異丙醇(637毫升)。所得漿液在80℃攪拌2小時，然后慢慢地冷卻到室溫，然后在室溫下攪拌12小時。將所得晶體鹽過濾，用異丙醇(600毫升)洗滌，然后在真空和氮氣中，在室溫下干燥16小時，得到標題化合物，白色結晶固體(20.4克，產率96％)。
實施例2 2-[(S)-1-(8-異丙氨基辛基)吡咯烷-3-基]-2，2-二苯基乙酰胺的合成 步驟A-2-[(S)-1-(8-羥基辛基)吡咯烷-3-基]-2，2-二苯基乙酰胺的制備 將在乙腈(10毫升)中的8-溴-1-辛醇(2.51克，12毫摩爾)在40℃下加入到攪拌的2，2-二苯基-2-(S)-吡咯烷-3-基乙酰胺(2.8克，10毫摩爾)和三乙胺(4.27毫升，30毫摩爾)的乙腈(90毫升)溶液中。反應混合物在55℃加熱16小時，然后冷卻到環境溫度。減壓除去溶劑。粗殘余物乙溶于乙酸乙酯(100毫升)稀釋，有機相用飽和碳酸氫鈉溶液(50毫升)洗滌，經硫酸鎂干燥，過濾并減壓濃縮。粗產物通過急驟色譜法(洗脫劑DCM/MeOH/NH4OH＝90/9/1)純化，得到1.8克標題中間體，油狀物(產率44％)。
步驟B-2-[(S)-1-(8-氧代辛基)吡咯烷-3-基]-2，2-二苯基乙酰胺的制備 將二甲亞砜(1.57毫升，22.1毫摩爾)，隨后是二異丙基乙胺(3.85毫升，22.1毫摩爾)在0℃下加入到攪拌的來自步驟A的中間體(1.8克，4.4毫摩爾)的二氯甲烷(44毫升)溶液中。反應混合物在-10℃攪拌15分鐘，然后加入三氧化硫吡啶絡合物(2.1克，13.2毫摩爾)。反應混合物在-10℃進一步攪拌2小時。加入水(50毫升)和DCM(50毫升)，分離有機層，用飽和的碳酸氫鈉水溶液(2x30毫升)，飽和的硫酸銅(II)水溶液(2x15毫升)和鹽水(30毫升)洗滌。然后，有機層經硫酸鎂干燥，并減壓濃縮，得到1.5克標題中間體，油狀物(產率84％)。
步驟C-2-[(S)-1-(8-異丙氨基辛基)吡咯烷-3-基]-2，2-二苯基乙酰胺的制備 將來自步驟B的中間體(40.6毫克，0.1毫摩爾)和異丙胺(10.2微升，0.12毫摩爾)在1，2-二氯乙烷(1毫升)中在室溫下攪拌1小時，然后加入三乙酰氧基硼氫化鈉(35.1毫克，1.5毫摩爾)。反應混合物攪拌16小時，然后在減壓下除去溶劑。殘余物通過HPLC純化，得到標題化合物，為其二(三氟乙酸)鹽。
分析數據MS m/z 450.3(MH+)。
使用本文中描述的方法和適當的原料，制備了表IV所示的化合物 表IV 1質譜法m/z(MH+)。
2不可得到的 另外，使用本文中描述的方法和適當的原料，可以制備表V中所示的化合物 表V 對比實施例A 2-[(S)-1-(8-二甲氨基辛基)吡咯烷-3-基]-2，2-二苯基乙酰胺的合成 在50毫升干燥的圓底燒瓶中裝入2，2-二苯基-2-(S)-吡咯烷-3-基乙酰胺(200毫克，0.714毫摩爾)和氯仿(20毫升)，然后用氮氣吹掃。加入二甲胺(535微升，1.071毫摩爾)，隨后滴加1，8-二溴辛烷(131微升，0.714毫摩爾)。反應混合物加熱至50℃并攪拌約60小時。將黃色均混合物冷卻到室溫，用1.0M氯化氫水溶液萃取，然后用新鮮的氯仿洗滌。向酸性水層中加入乙酸乙酯，用10.0M的氫氧化鈉水溶液將混合物調節為堿性至pH值13。然后，堿性的水層用另外的乙酸乙酯(2x15毫升)萃取。然后合并的有機層用飽和的氯化鈉水溶液洗滌，經硫酸鈉干燥，過濾并蒸發，得到粗產物。粗產物(223.0毫克)通過制備性HPLC純化，經冷凍干燥，得到標題化合物，為其二(三氟醋酸)鹽，白色吸濕性固體。
分析數據MS m/z 436.4(C28H41N3O+H)+；計算值436.3。
對比實施例B 2-[(S)-1-(9-二甲氨基壬基)吡咯烷-3-基]-2，2-二苯基乙酰胺的合成 使用本文中描述的方法和適當的原料，制備標題化合物，為其二(三氟醋酸)鹽，白色吸濕性固體。
分析數據MS m/z 450.4(C29H43N3O+H)+計算值450.3。
對比實施例C 2-{(S)-1-[8-N-(2-羥乙基)-N-甲氨基壬基]吡咯烷-3-基}-2，2-二苯基乙酰胺的合成 使用本文中描述的方法和適當的原料，制備標題化合物，為其二(三氟醋酸)鹽，白色吸濕性固體。
分析數據MS m/z 480.2；計算值480.4。
對比實施例D 2-[(S)-1-(8-氨基辛基)吡咯烷-3-基]-2，2-二苯基乙酰胺的合成 步驟A-2-[(S)-1-(8-溴辛基)吡咯烷-3-基]-2，2-二苯基乙酰胺的制備 向2，2-二苯基-2-(S)-吡咯烷-3-基乙酰胺(1.2克，0.004摩爾)和二異丙基乙胺(0.74毫升，0.004摩爾)在1∶1(v/v)的丙酮和DMF混合物(20毫升)的溶液中加入1，8-二溴辛烷(0.99毫升，0.005摩爾)。將混合物加熱到40℃，加熱5小時，然后濃縮到干燥，用二氯甲烷(20毫升)稀釋。所得混合物用飽和的碳酸氫鈉(2x20毫升)、鹽水(1x20毫升)洗滌，經硫酸鎂干燥，過濾和濃縮。殘余物通過硅膠色譜法純化，用5％的甲醇/二氯甲烷洗脫，得到315毫克標題中間體，白色固體(產率15％)。
分析數據MS m/z 472.5(MH+)；計算值472.2。
步驟B-2-[(S)-1-(8-二叔-BOC-氨基辛基)吡咯烷-3-基]-2，2-二苯基乙酰胺的制備 在-10℃下，向二叔丁基亞氨基羧酸酯(61毫克，0.28毫摩爾)的5毫升DMF溶液中加入氫化鈉(11毫克，0.28毫摩爾；60％，在礦物油中)。讓溶液慢慢地升溫至室溫，攪拌2小時后，加入在二甲基甲酰胺(5毫升)中的來自步驟A的中間體(0.095毫克，0.20摩爾)。然后，讓反應混合物在室溫下攪拌過夜，之后真空濃縮，用10毫升二氯甲烷稀釋，該混合物用飽和的碳酸氫鈉(2x10毫升)、鹽水(1x110毫升)洗滌，經硫酸鎂干燥，過濾和濃縮，得到120毫克標題中間體，白色固體。(產率99％)。
分析數據MS m/z 608.8(MH+)；計算值608.5。
步驟C-2-[(S)-1-(8-氨基辛基)吡咯烷-3-基]-2，2-二苯基乙酰胺的制備 向來自步驟B的中間體(120毫克，0.16毫摩爾)中加入三氟乙酸(0.08毫升)在二氯甲烷(0.720毫升)中的混合物，反應混合物在室溫下攪拌4小時。然后將反應混合物真空濃縮至干燥，用二氯甲烷(10毫升)稀釋，并慢慢地加入1N氫氧化鈉直到pH值達到14。分離有機層，用飽和的碳酸氫鈉(2x10毫升)、鹽水(1x110毫升)洗滌，經硫酸鎂干燥，過濾，濃縮。殘余物通過制備性HPLC純化，得到27毫克標題化合物，為其二-三氟乙酸鹽，白色固體。
分析數據MS m/z 408.6(MH+)；計算值408.3。
試驗1 放射性配體結合試驗 A.由表達hM1、hM2、hM3和hM4毒蕈堿性受體亞型的細胞制備膜 在由補充有10％FBS(胎牛血清)和250微克/毫升遺傳霉素的HAMF-12組成的的培養基中，使穩定表達克隆的人體hM1、hM2、hM3和hM4毒蕈堿性受體亞型的CHO(中國倉鼠卵巢)細胞系分別生長至接近匯合。細胞在5％的CO2、37℃的培養箱中生長，并用在dPBS中的2mm EDTA提起。通過在650xg下進行5分鐘離心而收集細胞，細胞沉淀或者在-80℃下冷凍儲存，或者立即制備膜。對于膜的制備來說，將細胞沉淀再懸浮在溶胞緩沖劑中并用Polytron PT-2100組織碎裂機(Kinematica AG；20秒x2裂解)均化。粗膜在4℃下在40,000xg下離心15分鐘。然后，將膜沉淀用再懸浮緩沖劑再懸浮，并再一次用Polytron組織碎裂機均化。通過在Lowry，O.等人1951，Journal ofBiochemistry193，265中描述的方法，測定該膜懸浮液中的蛋白質濃度。將所有的膜以等分樣冷凍儲存在-80℃下或立即使用。制備的hM5受體膜的等分樣直接從Perkin Elmer購買，并在-80℃下儲存直到使用。
B.對毒蕈堿性受體亞型hM1、hM2、hM3、hM4和hM5的放射性配體結合試驗 在總試驗體積為100微升的96孔微量滴定板中進行放射性配體結合試驗。把穩定表達hM1、hM2、hM3、hM4或hM5蕈毒堿亞型的CHO細胞膜稀釋在試驗緩沖劑中，至以下特定的目標蛋白質濃度(微克/孔)對于hM1來說，10微克，對于hM2來說，10-15微克，對于hM3來說，10-20微克，對于hM4來說，10-20微克，對于hM5來說，10-12微克。在加入到試驗板中之前，用Polytron組織碎裂機對膜進行簡短均化(10秒)。使用濃度范圍為0.001nM至20nM的L-[N-甲基-3H]東莨菪堿甲基氯化物([3H]-NMS)(TRK666，84.0Ci/mmol，Amersham PharmaciaBiotech，Buckinghamshire，England)進行飽和結合研究，用于測定放射性配體的KD值。用1nM的[3N}-NMS和11個不同試驗化合物濃度進行置換試驗，以測定試驗化合物的Ki值。將試驗化合物最初溶解在稀釋緩沖劑中到濃度為400μM，然后用稀釋緩沖劑連續稀釋5x，到最后濃度為10pM-100μM。加入到試驗板中的加料順序和體積如下25微升放射性配體，25微升稀釋的試驗化合物，和50微升膜。試驗板在37℃下培養60分鐘。通過在預先在1％的BSA中進行處理的GF/B玻璃纖維過濾器板(PerkinElmer Inc.，Wellesley，MA)上快速過濾而終止結合反應。濾板用洗滌緩沖劑(10mm的HEPES)沖冼三次，以除去未結合的放射性。然后將板風干，向每一孔中添加50微升Microscint-20液體閃爍流體(PerkinElmer Inc.，Wellesley，MA)。然后在PerkinElmer Topcount液體閃爍計數器(PerkinElmer Inc.，Wellesley，MA)中對各板進行計數。使用一位點競爭模型，用GraphPadPrism軟件包(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)通過非線性回歸分析對結合數據進行分析。由觀察到IC50值和放射性配體的KD值，用Cheng Prusoff方程式計算試驗化合物的Ki值(Cheng Y；PrusoffWH.(1973)Biochemical Pharma cology，22(23)3099-108)。將Ki值轉化為pKi值，以確定幾何平均數和95％的置信區間。然后把這些概括性統計值轉化回用于數據報告的Ki值。
在該試驗中，較低的Ki值表明試驗化合物對試驗受體具有較高的結合親和性。在該試驗中，發現式I的化合物，對于M3毒蕈堿性受體亞型來說具有約0.96nM的Ki值。
在該試驗中具有較低Ki值的試驗化合物對毒蕈堿性受體具有較高的結合親和性。在該試驗中試驗的本發明的化合物，其對于hM2的Ki值為約200nM-低于1nM；通常是約100nM-低于1nM；對于hM3的Ki值為約100nM-低于1nM；通常是約50nM-低于1nM。例如，實施例1-11，14，26，27，和39的化合物，其對于hM3的Ki值低于50nM。因此，在該試驗中，發現本發明的化合物與hM2和hM3受體亞型強力地結合。
另外，對于下式化合物的結合親和性
顯示于表V中(其中R5，Rx和e如表V中定義) 表V *相對于本發明化合物來說，在結合親和性方面的變化。
表V中的數據證明，用另外的烷基，如甲基取代末端氨基時，能顯著降低在hM2和hM3受體亞型上的結合親和性。另外，表V中的數據證明，從末端氨基上脫除烷基，如甲基時，能顯著降低在hM2和hM3受體亞型上的結合親和性。
試驗2 毒蕈堿性受體功能效價試驗 A.激動劑介導的cAMP累積的抑制的阻抑 在該試驗中，通過在表達hM2受體的CHO-K1細胞中測定試驗化合物阻抑毛喉素介導的cAMP累積的氧化震顫素抑制的能力而測定試驗化合物的功能效價。
cAMP試驗以放射免疫測定格式進行，使用具有125I-cAMP的閃光板腺苷酸環化酸活化試驗系統(NEN SMP004B，Perkin Elmer LifeSciences Inc.，Boston，MA)，并按照生產商的說明進行試驗。
用dPBS將細胞沖冼一次，并如以上細胞培養和膜制備部分中所述，用胰蛋白酶-EDDA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.53mmEDDA)提起。分離的細胞通過在50mL dPBS中，在650xg下離心5分鐘而洗滌兩次。然后將細胞沉淀再懸浮在10毫升dPBS中，用Coulter Z1二元粒子計數器(Beckman Coulter，Fullerton，CA)對細胞進行計數。細胞再一次在650xg下離心5分鐘，并再懸浮在刺激緩沖劑中，達到1.6x106-2.8x106細胞/毫升的試驗濃度。
試驗化合物最初溶解在稀釋緩沖劑(補充有1毫克/毫升BSA(0.1％)的dPBS)中達到400μM的濃度，然后用稀釋緩沖劑連續稀釋到最終克分子濃度為100μM-0.1nM。按類似方式稀釋氧化震顫素。
為了測定氧化震顫素對腺苷酸環化酶(AC)活性的抑制，將25微升毛喉素(在dPBS中稀釋，最后濃度為25μM)、25微升稀釋的氧化震顫素、和50微升細胞加入到激動劑試驗孔中。為了測定試驗化合物阻抑氧化震顫素抑制的AC活性的能力，將25微升毛喉素和氧化震顫素(在dPBS中稀釋，終濃度分別為25μM和5μM)、25微升稀釋的試驗化合物、和50微升細胞加入到其余的試驗孔中。
反應在37℃培養10分鐘，通過加入100微升冰冷的檢測緩沖劑而終止。將板密封，在室溫下培養過夜，次日早晨在PerkinElmerTopCount液體閃爍計數器(PerkinElmer Inc.，Wellesley，MA)上計數。如生產商的用戶指南所述，根據對樣品和cAMP標準品所觀察到的計數計算產生的cAMP的量(Pmol/孔)。使用非線性回歸，一位點競爭方程式，用GraphPad Prism軟件包(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)通過非線性回歸分析對數據進行分析。使用氧化震顫素濃度響應曲線的EC50和氧化震顫素試驗濃度分別作為KD和[L]，使用Cheng-Prusoff方程式來計算Ki值。將Ki值轉化為pKi值以確定幾何平均數和95％的置信區間。然后把這些概括性統計值轉化回用于數據報告的Ki值。
在該試驗中，較低的Ki值表明試驗化合物在試驗的受體上具有較高的功能活性。實施例1的化合物被發現，在表達hM2受體的CHO-K1細胞中，對于毛喉素介導的cAMP累積的氧化震顫素抑制的阻抑來說，具有低于5nM的Ki值。
B.激動劑介導的GTPγ[35S]結合的阻抑 在第二個功能試驗中，通過測定在表達hM2受體的CHO-K1細胞中化合物阻抑氧化震顫素刺激的[35S]GTPγS結合的能力來確定試驗化合物的功能效價。在使用時，將冷凍的膜解凍，然后稀釋在試驗緩沖劑中，使最終的靶組織濃度為每孔5-10μg蛋白質。用Polytron PT-2100組織碎裂機將膜簡短均化，然后加入到試驗板中。
在每一實驗中，測定由激動劑氧化震顫素刺激[35S]GTPγS結合的EC90值(90％最大應答的有效濃度)。
為了測定試驗化合物抑制氧化震顫素刺激的[35S]GTPγS結合的能力，把以下物質加入到96孔板的每一孔中含有[35S]GTPγS(0.4nM)的25微升試驗緩沖劑，25微升氧化震顫素(EC90)和GDP(3μM)，25微升稀釋的試驗化合物和25微升表達hM2受體的CHO細胞膜。然后，將試驗板在37℃培養60分鐘。試驗板在用1％的BSA-預處理GF/B過濾器上過濾，使用PerkinElmer 96-孔采集機。對板用冰冷的洗滌緩沖劑沖洗3x3秒，然后空氣干燥或真空干燥。把Microscint-20閃爍液(50微升)加入到每一孔中，對每個板都密封并在TopCounter(PerkinElmer)上進行放射性計數。使用非線性回歸，一位點競爭方程式，用GraphPad Prism軟件包(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)通過非線性回歸分析對數據進行分析。使用Cheng-Prusoff方程式來計算Ki值，分別用試驗中試驗化合物濃度響應曲線的IC50值和氧化震顫素濃度作為KD和[L]，配體濃度。
在該試驗中，較低的Ki值表明試驗化合物在試驗的受體上具有較高的功能活性。發現實施例1的化合物在表達hM2受體的CHO-K1細胞中，對于氧化震顫素刺激的[35S]GTPγS結合的阻抑來說，具有低于5nM的Ki值。
C.經由FLIPR試驗的激動劑介導的鈣釋放的阻抑 與Gq蛋白質偶合的毒蕈堿性受體亞型(M1，M3和M5受體)，在激動劑結合到受體上時，活化磷脂酶C(PLC)途徑。結果，活化的PLC把磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)水解為二酰甘油(DAG)和磷脂酰基-1，4，5-三磷酸(IP3)，其依次從細胞內貯藏所，即，內質網和肌質網產生鈣釋放。FLIPR(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)試驗通過使用當游離鈣結合時會發熒光的對鈣敏感的染料(Fluo-4AM，Molecular Probes，Eugene，OR)，估算這種細胞內鈣的增加。通過FLIPR實時測量這種熒光事件，FLIPR檢測來自用人體M1和M3、以及黑猩猩M5受體克隆的細胞單層中的熒光的變化。通過拮抗劑抑制由激動劑介導的細胞內鈣增加的能力，測定拮抗劑效價。
對于FLIPR鈣刺激試驗，在進行試驗前的晚上，將穩定表達hM1、hM3和hM5受體的CHO細胞種在96孔FLIPR板中。種下的細胞通過含有FLIPR緩沖劑(在不含鈣和鎂的Hank緩沖鹽溶液(HBSS)中的10mmHEPES，pH7.4，2mm氯化鈣，2.5mm丙磺舒)的細胞洗滌液(Cellwash)(MTX Labsystems，Inc.)洗滌兩次，除去生長培養基，留下50微升/孔的FLIPR緩沖劑。然后，將細胞用50微升/孔的4μMFLUO-4AM(制備2X溶液)在37℃，5％的二氧化碳中培養40分鐘。染料培養期之后，將細胞用FLIPR緩沖劑洗滌兩次，留下最終體積為50微升/孔。
為了測定拮抗劑效價，首先測定對于氧化震顫素的細胞內Ca2+釋放的劑量依賴性刺激，以便能夠在后來以在EC90濃度下測量抗氧化震顫素刺激的拮抗劑效價。首先用化合物稀釋緩沖劑將細胞培養20分鐘，隨后加入激動劑，這通過FLIPR進行。對于氧化震顫素的EC90值是按照FLIPR測量以及以下數據還原部分中詳細描述的方法產生的，結合使用公式ECF＝((F/100-F)^1/H)*EC50。在刺激板中制備3xECF的氧化震顫素濃度，從而使得在拮抗劑抑制試驗板的每一孔中都加入EC90濃度的氧化震顫素。
用于FLIPR的參數是暴露長度0.4秒，激光強度0.5瓦，激發波長488納米，發射波長550納米。通過在加入激動劑之前，對熒光的變化進行10秒的測定而確定基線。激動劑刺激后，FLIPR連續不斷地測定每0.5到1秒的熒光的變化，持續測定1.5分鐘，以捕捉最大的熒光變化。
對于每一孔，熒光的變化用最大熒光減去基線熒光來表示。對照藥物濃度的對數，采用用于S形曲線劑量-反應的嵌入模型，用GraphPad Prism(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)通過非線性回歸對原始數據進行分析。根據Cheng-Prusoff方程式(Cheng &Prusoff，1973)，使用氧化震顫素EC50值作為KD值，氧化震顫素EC90值為配體濃度，通過Prism測定拮抗劑的Ki值。
在該試驗中，較低的Ki值表明試驗化合物在試驗的受體上具有較高的功能活性。發現式I的化合物，在穩定表達hM3受體的CHO細胞中，阻抑激動劑介導的鈣釋放的Ki值低于5nM。
試驗3 在乙酰膽堿誘發的支氣管縮小的豚鼠模型中， 測定支氣管保護的持續時間 該體內試驗用來評價顯示毒蕈堿性受體拮抗劑活性的試驗化合物的支氣管保護作用。
通過籠子卡片單獨地鑒別6只重量在250-350克之間的雄性豚鼠(Duncan-Hartley(HsdPocDH Harlan，Madison，WI))的各組。在整個研究中，允許動物隨意進食和飲水。
試驗化合物通過在10分鐘內在整個身體暴露給藥室(R&S Molds，San Carlos，CA)中經吸入給藥。布置給藥室使得氣霧劑同時從中心管輸送到6個單獨的室中。豚鼠暴露于試驗化合物或賦形劑(WFI)的氣霧劑下。用由壓力為22psi的氣體混合物(CO2＝5％，O2＝21％，N2＝74％)驅動的LC Star霧化器裝置(Model 22F51，PARI Respiratory Equipment，Inc.，Midlothian，VA)，由水溶液產生這些氣霧劑。在此操作壓力下，通過霧化器的氣流大約為3L/分鐘。產生的氣霧劑被通過正壓驅動到各室中。在遞送與霧化溶液的過程中沒有使用稀釋空氣。在10分鐘的霧化過程中，大約有1.8毫升溶液被霧化。這是通過比較充滿的霧化器在霧化前和霧化后的重量，由重量分析法法測定的。
在給藥后1.5、24、48和72小時使用全身體積描記法，評價通過吸入給藥的試驗化合物的支氣管保護作用。
在開始肺評價之前的45分鐘，通過肌內注射氯胺酮(43.75毫克/公斤)、賽拉嗪(3.50毫克/公斤)和乙酰丙嗪(1.05毫克/公斤)而將每一只豚鼠麻醉。剃出外科手術位置并用70％的灑精洗凈后，造成頸部腹面的一個2-3厘米中線切口。然后，分離頸靜脈，并用填充了鹽水的聚乙烯導管(PE-50，Becton Dickinson，Sparks，MD)插管，以允許靜脈內輸入在鹽水中的乙酰膽堿(Ach)(Sigma，St.Louis，MO)。然后，解剖游離出氣管，并用14G聚四氟乙烯管(#NE-014，Small Parts，Miami Lakes，FL)插管。如果需要的話，通過另外再肌肉內注射上述麻醉劑混合物保持麻醉。如果動物對抓撓其爪有反應或者呼吸率大于100呼吸/分鐘的話，監測并調節麻醉深度。
一旦完成上述套管插入，就把動物投入體積描記器(#PLY 3114，Buxco Electronics，Inc.，Sharon，CT)中，插入食道壓力套管(PE-160，Becton Dickinson，Sparks，MD)以測定肺驅動壓力(壓力)。把特氟隆氣管套管連接到體積描記器的開口處，以允許豚鼠呼吸到來自室外的房間空氣。然后，將室密封。用加熱燈來保持體溫，并通過使用10毫升標準注射器(#5520 Series，Hans Rudolph，Kansas City，MO)使豚鼠的肺被4毫升空氣膨脹3次，以保證下氣道不會萎陷，并且保證動物不遭受通氣過度。
一旦測定到，對于順應性來說基線值在0.3-0.9毫升/厘米水范圍之內，對于阻力來說在0.1-0.199厘米水/毫升每秒范圍內，就開始進行肺評價。Buxco肺測量計算機程序使能夠收集并推導肺值。
開始這一程序啟動試驗方案和數據收集。通過Buxco壓力傳感器測定每一次呼吸時體積描記器中發生的隨著時間的體積變化。通過將這一信號對時間求積分，計算對于每一次呼吸的流量的度量。這一信號，和采用Sensym壓力傳感器(#TRD 4100)收集的肺驅動壓力變化一起，通過Buxco(MAX2270)前置放大器與數據收集界面(#′s SFT3400和SFT3813)聯起來。所有其他的肺參數都從這兩個輸入值得到。
收集基線值5分鐘，隨后，用Ach攻擊豚鼠。把Ach(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)(0.1毫克/毫升)由注射器泵(sp210iw，World Precision Instruments，Inc.，Sarasota，FL)靜脈內輸入1分鐘，劑量及從實驗開始起規定的時間如下5分鐘時1.9微克/分鐘；10分鐘時3.8微克/分鐘；15分鐘時7.5微克/分鐘；20分鐘時15.0微克/分鐘；25分鐘時30微克/分鐘和30分鐘時60微克/分鐘。如果阻力或順應性在每一Ach劑量后3分鐘時還沒有返回到基線值，就由10毫升標準注射器用4毫升空氣將豚鼠的肺膨脹3次。記錄的肺參數包括呼吸頻率(呼吸/分鐘)，順應性(毫升/厘米水)和肺阻力(厘米水/毫升每秒)。一旦在該方案的第35分鐘時完成肺機能測量，就將豚鼠從體積描記器中移走并通過二氧化碳窒息法處死。
用以下方式中的一種或兩種對數據進行評價 (a)由″壓力的變化″與″流量的變化″之間的比計算肺阻力(RL，厘米水/毫升每秒)。
對于賦形劑和試驗化合物組，計算對ACh(60微克/分鐘，IH)的RL應答。計算在每一預處理時間上用賦形劑處理的動物中的平均ACh應答，并用來計算在相應的預處理時間上在每一試驗化合物劑量下的ACh應答的抑制百分比。用于″RL″的抑制劑量反應曲線用四個參數邏輯斯諦方程式，使用GraphPad Prism，用于Windows的3.00版本(GraphPad Software，San Diego，California)進行擬合，用來估算支氣管保護的ID50值(抑制ACh(60微克/分鐘)支氣管縮小藥應答50％所需的劑量)。使用的方程式如下 Y＝Min+(Max-Min)/(1+10((logID50-X)*希爾斜率)) 其中X是劑量的對數，Y是響應值(Ach誘發的RL增加的百分比抑制)。Y從Min開始，并且逐漸接近于Max，具有S形狀。
(b)量PD2，其被定義為導致基線肺阻力雙倍所需要的Ach或組胺的量，是使用由一系列Ach或組胺攻擊期間的流量和壓力得到的肺阻力值來計算的，計算使用以下方程式(由以下文獻中所述的用于計算PC20值的方程式推導得出，即，American Thoracic Society，Guidelines for methacholine and exercise challengetesting-1999.Am J Respir Crit Care Med.，2000；161309-329) 其中 C1＝C2之前Ach或組胺的濃度 C2＝導致肺阻力(RL)至少2倍增加的Ach或組胺的濃度 R0＝基線RL值 R1＝C1后的RL值 R2＝C2后的RL值 有效的劑量被定義為，把對50微克/毫升劑量Ach的支氣管縮小(bronchorestriction)響應值限定到基線肺阻力(PD2(50))的雙倍時的劑量。
使用雙尾學生T檢驗進行數據的統計分析。P-值＜0.05被認為是顯著的。
通常，在該試驗中在劑量后1.5小時對于ACh誘發的支氣管縮小，PD2(50)低于約200微克/毫升的試驗化合物是優選的。發現式I的化合物在劑量后1.5小時對于ACh誘發的支氣管縮小，其PD2(50)低于約200微克/毫升。
試驗4 吸入豚鼠流涎試驗 使重量為200-350克的豚鼠(Charles River，Wilmington，MA)在到達后適應室內豚鼠群體至少3天。通過在餡餅狀給藥室(R+S Molds，San Carlos，CA)中，在10分鐘內吸入(IH)而給予試驗化合物或賦形劑。將試驗溶液溶于無菌水，用充滿5.0毫升給藥溶液的霧化器進行輸送。把豚鼠限制在吸入室中30分鐘。在此期間，將豚鼠限制在大約110平方厘米的區域中。該空間對于動物自由轉身、它們自己復位來說是足夠的，并允許喂養。適應20分鐘后，將豚鼠暴露給由LS Star霧化器裝置(Model 22F51，PARI Respiratory Equipment，Inc.，Midlothian，VA)產生的氣霧劑，所述霧化器裝置由壓力為22psi的室空氣驅動。霧化結束后，在處理后1.5、6、12、24、48、或72小時對豚鼠進行評價。
在試驗之前1小時，用肌內(IM)注射氯胺酮43.75毫克/公斤，賽拉嗪3.5毫克/公斤和乙酰丙嗪1.05毫克/公斤的混合物將豚鼠麻醉，注射體積為0.88毫升/公斤。將動物腹面向上以20角傾斜置于加熱的(37℃)毛毯上，頭位于向下的斜坡。把4-ply 2x2英寸的紗布墊(Nu-Gauze一般用途的海綿球，Johnson and Johnson，Arlington，TX)插入到豚鼠嘴中。5分鐘后，給以毒蕈堿激動劑毛果蕓香堿(3.0毫克/公斤，s.c.)，并且立即把紗布墊丟棄并代之以新的預先稱重的紗布墊。將唾液收集10分鐘，此時，稱重紗布墊并記錄重量差，以測定所累積的唾液的量(毫克)。對接收賦形劑和每一劑量試驗化合物的動物，都計算所收集的唾液的平均量。賦形劑組的平均值被認為是100％流涎。使用結果平均值(n＝3或更大)計算結果。使用雙因素方差 分析計算在每一時間點上對于每一劑量的置信區間(95％)。該模型是Rechter在以下文獻中描述的方法的改良形式″Estimation ofanticholinergic drug effects in mice by antagonism againstpilocarpine-induced salivation″，Ata Pharmacol Toxicol，1996，24243-254。
計算在每一預處理時間上在用賦形劑處理的動物中的平均唾液重量，并用來計算在相應的預處理時間上，在每一劑量下的流涎的百分比抑制。抑制劑量-反應數據用四個參數邏輯斯諦方程式，使用GraphPad Prism，用于Windows的3.00版本(GraphPad Software，San Diego，California)進行擬合，用于估算抗催涎劑ID50(抑制50％毛果蕓香堿引起的流涎所需的劑量)。使用的方程式如下 Y＝Min+(Max-Min)/(1+10((ID50-X)*希爾斜率)) 其中X是劑量的對數，Y是響應值(流涎的百分比抑制)。Y從Min開始，并且逐漸接近于Max，具有S形狀。
抗催涎劑ID50與支氣管保護劑ID50的比用來計算試驗化合物的表觀肺選擇性指數。通常，表觀肺選擇性指數大于約5的化合物是優選的。在該試驗中，式I的化合物的表觀肺選擇性指數大于約5。
試驗5 神志清醒的豚鼠中乙酰甲膽堿誘發的抑制劑應答 在這些研究中使用健康、成年、雄性Sprague-Dawley豚鼠(Harlan，Indianapolis，IN)，其重量在200-300克之間。在異氟烷麻醉(實現)時，在動物身上裝上頸總動脈和頸靜脈導管(PE-50導管)。這些導管利用皮下通道外置到肩胛下區域。用4-0 Ethicon絲把所有的外科手術切割口縫合，導管用肝素(1000單位/毫升)固定。在手術結束時，對每一動物都給以鹽水(3毫升，SC)以及丁丙諾啡(0.05mg/kg，IM)。在把動物回送回它們的容納室之前，允許他們在加熱墊上恢復。
手術后大約18-20小時，將動物稱重，把每一動物身上的頸動脈導管連接到用于記錄動脈壓的轉換器上。使用Biopac MP-100獲取系統記錄動脈壓和心率。讓動物適應并穩定20分鐘。
每一動物用甲基膽堿(MCh)(0.3毫克/公斤，iv)攻擊，通過頸靜脈線給藥，監測其心血管反應10分鐘。然后，將動物置入連接到包含有試驗化合物或賦形劑溶液的霧化器的全身給藥室中。用可呼吸的空氣和5％二氧化碳的氣體混合物，以3升/分鐘的流速將溶液霧化10分鐘。然后，從全身室中將動物移出并將其送回到各自的籠中。在給藥后1.5和24小時，再次用MCh(0.3毫克/公斤，iv)對動物進行攻擊并測量血液動力反應。此后，用戊巴比妥鈉(150毫克/公斤，IV)將動物實施安樂死。
MCh產生平均動脈壓(MAP)降低，心率降低(心動過緩)。測量每一次MCh攻擊(IH給藥前和后)MAP(抑制劑應答)的從基線的峰降低。心動過緩作用不用于進行分析，因為這些應答不強并且不可再現。處理對MCh應答的作用，用對照抑制劑應答的百分比抑制(平均值+/-SEM)來表示。用具有適當post-hoc檢驗的雙因素方差分析來檢測處理和預處理時間的效果。在用賦形劑吸入給藥后1.5和24小時時，對MCh的抑制劑應答相對不變。
抗抑制劑ID90與支氣管保護劑ID50的比用來計算試驗化合物的表觀肺選擇性。通常，表觀肺選擇性指數大于約5的化合物是優選的。在該試驗中，實施例1的化合物具有大于5的表觀肺選擇性指數。
雖然已經參考特定的方面或實施方案對本發明進行了描述，但本領域技術人員應當理解，在不背離本發明真實的精神和范圍的情況下，對其可以進行各種各樣的變化或者可以替代形成各種各樣的等價方案。另外，在可適用專利法和法規所允許的程度上，本發明中引用的所有出版物、專利和專利申請都全文在此引入作為參考，其引用程度就好像每一文件已經獨立地引入到本發明中作為參考那樣。
權利要求
1.式XI的化合物，或其鹽或立體異構體
其中
P是氨基保護基；
G選自-CHO，-CH(ORf)2，-CH2OH和-CH2-L，其中每個Rf獨立地為C1-6烷基或兩個Rf基團相連形成C2-6亞烷基；并且L是離去基團；
R5選自C1-6烷基、C3-6環烷基和-CH2-R8；其中每個烷基基團任選被-OH或1至5個氟取代基取代；
R8為C6-10芳基；
e是8或9；
條件是當L是氯時，P不是乙氧羰基。
2.權利要求1的化合物，其中R5是C1-5烷基，其中烷基基團任選被-OH或1至3個氟取代基取代。
3.權利要求2的化合物，其中R5是C1-3烷基，其中烷基基團任選被-OH或1至3個氟取代基取代。
4.權利要求2的化合物，其中R5選自甲基、乙基、2-羥乙基、2，2，2-三氟乙基、正丙基、異丙基、1-羥基丙-2-基、正丁基和異丁基。
5.權利要求4的化合物，其中R5是甲基。
6.權利要求1的化合物，其中R5是C3-5環烷基。
7.權利要求6的化合物，其中R5選自環丙基、環丁基和環戊基。
8.權利要求1的化合物，其中R5為-CH2-(苯基)。
9.權利要求1的化合物，其中e是8。
10.權利要求1的化合物，其中e是9。
11.8-(N-芐基-N-甲基氨基)辛-1-醇或其鹽。
12.8-(N-叔-丁氧羰基-N-甲基氨基)辛-1-醇。
13.甲苯-4-磺酸8-(N-叔-丁氧羰基-N-甲基氨基)辛基酯。
14.權利要求1的化合物，其中P選自芐基，叔丁氧基羰基、三苯甲基、芐氧基羰基、對甲氧基芐氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基、甲酰基、乙酰基、三甲代甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基。
全文摘要
本發明涉及式XI的化合物，或其藥學上可接受的鹽或立體異構體，其中P、G、R5和e如說明書中所定義。
文檔編號C07D211/34GK101108809SQ20071013997
公開日2008年1月23日 申請日期2004年6月10日 優先權日2003年6月13日
發明者M·瑪門, A·休斯, 季玉華, 莉 李, 張緯江 申請人:施萬制藥