專利名稱：蕎麥過敏原及其IgE試劑盒以及它們的制備和使用方法
技術領域：
本發明涉及試劑盒，具體屬于一種蕎麥過敏原IgE試劑盒及其制備和使用方法。 技術背景食物過敏已成為食品衛生工作中的熱點問題之一。全球范圍內約有2%的成年人和4 6。/。 的兒童患有食物過敏癥。 一旦發生，后果相當嚴重，芙國有近500萬人患食物過敏，每年發生 950例，死亡10-20人。據不完全統計，我國每年僅在協和醫院門診就醫的食物過敏患者就達 1.5萬人，發生過因食入一粒花生米而致死的就有數起。在巴黎食物過敏大會上，有關專家指 出，食物過敏會對兒童健康及其今后發展產生不利影響。兒童時期可能出現的過敏形式有皮膚 過敏、食物過敏和哮喘等。發病時間越早，過敏現象可能越重，且歷時越長，甚至持續到成年， 這對兒童的未來發展不利。目前，我國對于食品過敏，還沒有引起足夠的重視，與國外發達國 家(日本，韓國等)相比也有很大的差距，這對于我國全體國民的身體健康構成了很大的威脅。蕎麥屬雙子葉蓼科植物，有2個栽培種，即甜蕎(普通蕎麥)和苦蕎(韃靼蕎麥)。全球蕎麥 種植面積700 800萬公頃，總產量500 600萬噸，主要生產國有俄羅斯、中國、波蘭、法國、 加拿大、日本、韓國等。近年來農業、醫學及食品營養學等方面的研究表明，蕎麥特別是苦蕎 麥，其營養價值居所有糧食作物之首，不僅營養成分豐富、營養價值高，而且含有其它糧食作 物所缺乏和不具有的特種微量元素及藥用成分，這些物質對現代"文明病"及幾乎所有中老年 心腦血管疾病有預防和治療功能，近年還被公認為預防癌癥的保健食品，因而受到各國的重視。 目前蕎麥保健食品已風靡全球，蕎麥生產和保健食品開發呈現新的發展勢頭，蕎麥在世界貿易 中的地位也正在提高，尤其在閂本有很大的消費潛力，因此蕎麥被稱為用途廣泛的21世紀型 作物。近年來關于蕎麥過敏的報道逐年增多，很多人食用養麥后會產生哮喘、休克和皮疹等過敏 癥狀。蕎麥過敏己受到社會各界的普遍關注。這也成為蕎麥利用的一個瓶頸。在日本，己經把 蕎麥列為五大過敏原之一，其病理機制為I型過敏反應，而且是由IgE介導的速發反應。國內 關于蕎麥過敏的研究較少，現階段大部分報道都來自國外。有關蕎麥過敏原，目前美國有用于 臨床檢測的產品，但其屬于一種24kD蕎麥過敏原，它的檢測范圍較窄，對于一些蕎麥過敏的 病例易造成漏檢。發明內容本發明的目的是提供一種蕎麥過敏原，以及含有該蕎麥過敏原的IgE檢測試劑盒，以及該 蕎麥過敏原及其試劑盒的制備和使用方法。該蕎麥過敏原及其試劑盒具有檢測范圍寬，靈敏度
高，可實現大規模檢測的特點。本發明提供的一種蕎麥過敏原，來源于蕎麥，其分子量為56kD，屬于13S貯藏蛋白家族。 所述的蕎麥過敏原通過如下方法制得首先將蕎麥去殼粉碎，脫脂；然后按每克脫脂蕎麥 粉加入10-15mlpH8.0的稀鹽緩沖液，4'C攪拌過夜；離心，除去沉淀，將上清調節pH到5.0, 加入(NH4)2SO4至80。/。飽和度，4'C攪拌30-60分鐘，離心，收集沉淀；將沉淀用少量稀鹽緩沖液重新溶解，并用同樣緩沖液對樣品進行透析，除去(NH4)2S04，得到蕎麥鹽溶蛋白的粗提物; 將粗提物先用陰離子交換柱分離純化，再用凝膠柱分離純化；收集活性峰，蒸餾水透析后，真 空冷凍干燥，得到分子量為56kD的蕎麥過敏原。 所述的蕎麥是苦蕎麥或甜蕎麥；所述的稀鹽緩沖液是Tris-HCl緩沖液(10mmol/LTris和150mmol/LNaCl); 所述的陰離子交換柱可以是Resource Q陰離子交換柱，凝膠柱可以是Sephacryl S-200凝膠柱。本發明提供的一種蕎麥過敏原IgE試劑盒，是一種用間接酶聯免疫吸附試驗檢測蕎麥過敏 的IgE檢測試劑盒，該試劑盒采用了上述得到的分子量為56kD的蕎麥過敏原。其具體包括已預包被蕎麥過敏原的酶標板8X12孑L樣品稀釋液10ral陽性血清0.5ml陰性血清0.5ml酶結合物10ml濃縮洗滌液20ml顯色劑A2mg顯色劑B5ml終止液5ml其中，所述的樣品稀釋液為0.01 mol/L PBST, pH7.4，酶結合物為辣根過氧化物酶標記的 鼠抗人IgE酶結合物，濃縮洗滌液為含0.05。/。Tween-20的生理鹽水，顯色劑A為鄰苯二胺， 顯色劑B為H202，終止液為lmol/LH2S04溶液。本發明蕎麥過敏原IgE試劑盒的制備方法，是采用蕎麥過敏蛋白包被酶標板(聚苯乙烯微 孔板)，以鼠抗人IgE標記辣根過氧化物酶(簡稱HRP)制備而成，包括如下歩驟A:蕎麥過敏原酶標板的制備將蕎麥過敏原用pH9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液包被 用濃度為1%的明膠封閉；用濃度為20%的蔗糖室溫保護3小時，干燥后，裝入含干燥劑的 包裝中保存；B:樣品稀釋液的制備將8gNaCl， 0.2gKH2PO4,2.9gNa2HPO4.12H2O,0.5mlTween-20加蒸餾水至1000ml配制而成；C:鼠抗人IgE酶結合物的制備用市售的鼠抗人IgE酶結合物，用樣品稀釋液稀釋1000倍；D:陽性血清和陰性血清的制備陽性血清取自蕎麥過敏病人，陰性血清血清取自健康人 血清；E:濃縮洗滌液的制備將170gNaCl用1000ml蒸餾水配成濃縮洗滌液；F:顯色劑A的制備取試劑鄰苯二胺；G:顯色劑B的制備取610ml 0.1 mol/L檸檬酸，640ml 0.2 mol/L Na2HP04.12 H20,加入 1250ml蒸餾水和4 ml H202;H:終止液的制備lmol/LH2S04溶液。本發明提供的蕎麥過敏原IgE試劑盒的使用方法，包括如下步驟A:取出酶標板，在室溫下平衡10分鐘，每孔各加95^il樣品稀釋液，再加5pl待檢標本 血清，同時設空白對照(只加10(V1樣品稀釋液)，陰性對照(加100pl，不加樣品稀釋液)， 陽性對照(加lOOpl，不加樣品稀釋液)，37。C水浴作用0. 5-1. 5小時；B:將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋為20倍的稀釋洗滌液；C:用稀釋洗滌液洗滌酶標板3次，最后一次倒扣于吸水紙上，使里面的液體充分流盡； D:每孔加lOOpl酶結合物，37'C水浴作用0.5-1.5小時；E:用稀釋洗滌液洗滌3次，最后一次倒扣于吸水紙上，使里面的液體充分流盡； F:將顯色劑A和顯色劑B混合，每孔加入lOOpl混合物，暗處反應10-30分鐘； H:每孔加入一滴終止液； G:在492nm處測定其光吸收值。與現有技術相比本發明的優點和效果1、制備獲得蕎麥中的一個56kDa過敏原，較目前 臨床檢測中使用的過敏原有較寬的檢測范圍；2、該過敏原與蕎麥過敏病人血清中的IgE具有 特異性的結合活性，可用于臨床檢測及蕎麥過敏癥的早期診斷，也適合作流行病學調査；3、 以明膠作為惰性蛋白，提高了靈敏度，同時本底沒有明顯增加；4、檢測時間短， 一般2個小 時內即可檢出結果；5、樣品無需無菌化處理，操作簡單易行；6、檢測成本低廉，可以進行大 批量檢測，適于推廣使用。
圖1:蕎麥過敏原制備流程2: SDS-PAGE檢測蕎麥過敏原純度，泳道1為分子量Marker;泳道2為純化的蕎麥 過敏原。
具體實施方案實施例/:蕎麥過敏原的制備制備流程見圖1，首先將苦蕎麥(Tartary buckwheat)去殼 粉碎，按每克蛋白加入3ml丙酮，4'C攪拌3小時，真空抽慮除去丙酮，然后加入等體積的無 水乙醚，真空抽慮除去乙醚，風干得到脫脂的蕎麥粉；然后按每克蛋白加入10ml Tris-HCl緩 沖液(10mmol/LTris和150mmol/LNaCl pH8.0)， 4。C攪拌過夜；3000r/m離心10分鐘，除去沉淀， 將上清調節pH到5.0，加入(NH4)2SO4至80。/。飽和度，13000r/m離心30分鐘，除去上清，用 盡量少的Tris-HCl緩沖液將沉淀重新溶解。用Tris-HCl緩沖液對樣品進行透析，以除去 (NH4)2S04,得到蕎麥鹽溶蛋白的粗提物。將粗提物上樣到Resource Q陰離子交換柱，在 AKTATMPurifer上進行分離純化，所用的平衡緩沖液為20mmol/LTris-HCl緩沖液(pH7.3)，洗 脫液為20mmol/L Tris-HCl緩沖液(0.5mol/LNaCl， pH7.3)，收集有活性的洗脫峰然后上樣到 Sephacryl S-200凝膠柱進行進一步純化，所用緩沖液為20mmol/L Tris-HCl (150mmol/L NaCl， pH7.3)。收集活性峰，蒸餾水透析后，真空冷凍干燥，得到蕎麥過敏原產品。用非還原SDS-PAGE 檢測過敏原的純度，結果見圖2。實施例2、實驗材料取甜蕎麥(Commonbuckwheat)，實驗步驟和條件同實施例1，同樣 得到分子量為56kD的蕎麥過敏原。實施例j、蕎麥過敏原IgE試劑盒制備1、 抗原預包被酶標板的制備a. 包被將實施例1得到的分子量為56kD的蕎麥過敏原，用抗原包被液(0.05moI/L碳 酸鹽緩沖液，pH9.6 )稀釋成lOOpg/ml,包被酶標板，每孔lOOpl， 4 'C過夜，倒掉包被液， 甩干；b. 封閉每孔加含1%的明膠的封閉液4 'C過夜，倒掉封閉液，甩干；c. 干燥加入20%的蔗糖室溫保護3小時，至干燥室干燥后，裝入含干燥劑的包裝中保存'-2、 酶結合物的制備采用商品化的酶結合物，用樣品稀釋液稀釋IOOO倍使用。3、 其他試劑的制備樣品稀釋液的制備將NaC18g， KH2P04 0.2g, Na2HP04 .12H20 2.9 g, Tween-20 0.5 ml 加蒸餾水至1000ml配制而成。濃縮洗滌液的制備將NaCl 170g, 10ml,蒸餾水1000ml配成20*生理鹽水濃縮洗滌液。 顯色劑A的制備取鄰苯二胺試劑。顯色劑B的制備取610ml， O.lmol/L檸檬酸(2.1gA00ml)， 640ml 0.2mol/LNa2HPO4.12 H20 (7.163g/100ml),加入1250ml蒸餾水,加入4 ml H202 。終止液的制備所述終止液為用蒸餾水稀釋后的硫酸，濃度為lmol/LH2S04。 4、試劑盒的組裝按每盒一包96孔/包的抗原預包被酶標板， 一瓶洗滌液(20ml), —瓶 樣品稀釋液(10ml)， 一瓶酶結合物工作液(10ml)， 一瓶顯色劑A(2mg)， 一瓶顯色劑B(5ml)， 一 瓶陽性對照(0.5ml)， 一瓶陰性對照(0.5ml)和一份使用說明書組裝。將試劑盒置于4'C條件下 保存備用。實施例么蕎麥過敏原IgE試劑盒的使用取待檢標本l、 2、 3檢測其是否對蕎麥過敏，按如下方法檢測A:取出酶標板，在室溫下平衡10分鐘，每孔各加95pl樣品稀釋液，再加5pl待檢標本 血清，同時設空白對照(只加100pl樣品稀釋液)，陰性對照(加100nl，不加樣品稀釋液)， 陽性對照(加100pl，不加樣品稀釋液)，37'C水浴作用1小時；B:將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋為20倍的稀釋洗滌液；C:用稀釋洗漆液洗漆酶標板3次，最后一次倒扣于吸水紙上，使里面的液體充分流盡；D:每孔加10(^1酶結合物，37'C水浴作用40分鐘；E:用稀釋洗滌液洗滌3次，最后一次倒扣于吸水紙上，使里面的液體充分流盡； F:將顯色劑A和顯色劑B混合，每孔加入10(^1混合物，暗處反應20分鐘； H:每孔加入一滴終止液；G:在492nm處測定其光吸收值，檢測結果及分析血清號空白對照陰性對照陽性對照待檢標本1待檢標本2待檢標本3OD值0.0370.0490.7500.0511.0790.669P/N--59.41.1586.852.7結果判定P/N=(標本OD值-空白對照OD值)/ (陰性對照OD值-空白對照OD值)，以 P/N》2. 1為陽性，P/N<1. 5為陰性。經計算標本1的P/N值小于1. 5,而標本2和標本3 P/N 值
權利要求
1.一種蕎麥過敏原，特征在于它是分子量為56kD的蕎麥過敏原。
2. 如權利要求1所述的蕎麥過敏原的制備方法，其特征在于包括如下步驟首先將蕎麥 去殼粉碎，脫脂；然后按每克脫脂蕎麥粉加入10-15mlpH8.0的稀鹽緩沖液，4'C攪拌過夜； 離心，除去沉淀，將上清調節pH到5.0，加入(NH4)2SO4至80。/。飽和度，4'C攪拌30-60分鐘， 離心，收集沉淀；將沉淀用少量稀鹽緩沖液重新溶解，并用同樣緩沖液對樣品進行透析，除 去(NH4)2S04，得到蕎麥鹽溶蛋白的粗提物；將粗提物先用陰離子交換柱分離純化，再用凝膠 柱分離純化；收集活性峰，蒸餾水透析后，真空冷凍干燥，得到分子量為56kD的蕎麥過敏 原。
3. —種蕎麥過敏原IgE試劑盒，其特征在于包括己預包被蕎麥過敏原的酶標板 8X12孔樣品稀釋液 10ml陽性血清 0.5ml陰性血清 0.5ml酶結合物 10ml濃縮洗滌液 20ml顯色劑A 2mg顯色劑B 5ml終止液 5ml其中，所述的樣品稀釋液為0.01mol/LPBST, pH7.4，酶結合物為辣根過氧化物酶標記的 鼠抗人IgE酶結合物，濃縮洗滌液為含0.05% Tween-20的生理鹽水，顯色劑A為鄰苯二胺， 顯色劑B為H202，終止液為lmol/LH2S04溶液。
4.如權利要求3所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 A:蕎麥過敏原酶標板的制備將蕎麥過敏原用pH9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液包被； 用濃度為1%的明膠封閉；用濃度為20%的蔗糖室溫保護3小時，干燥后，裝入含干燥劑的 包裝中保存；B:樣品稀釋液的制備用8 g NaCl， 0.2 g K H2P04 ， 2.9 g Na2HP04 .12H20, 0.5 ml Tween-20 加蒸餾水至1000 ml配制而成；C:鼠抗人IgE酶結合物的制備用市售的鼠抗人IgE酶結合物，用樣品稀釋液稀釋IOOO倍；D:陽性血清和陰性血清的制備陽性血清取自蕎麥過敏病人，陰性血清血清取自健康人 血清；E:濃縮洗滌液的制備將170gNaC110mlTween-20，用1000ml蒸餾水配成濃縮洗滌液；F:顯色劑A的制備取試劑鄰苯二胺；G:顯色劑B的制備取610ml O.lmol/L擰檬酸，640ml 0.2 mol/LNa2HP04. 12 H20,加入 1250ml蒸餾水和4 ml H202;H:終止液的制備lmol/LH2S04溶液。 5.如權利要求3所述的蕎麥過敏原IgE試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下步驟 A:取出酶標板，在室溫下平衡10分鐘，每孔各加95pl樣品稀釋液，再加5^1待檢標 本血清，同時設空白對照，陰性對照，陽性對照，37匸水浴作用0.5-1.5小時；B:將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋為20倍的稀釋洗滌液；C:用稀釋洗滌液洗滌酶標板3次，最后一次倒扣于吸水紙上，使里面的液體充分流盡；D:每孔加,1酶結合物，37'C水浴作用0. 5-1. 5小時；E:用稀釋洗滌液洗滌3次，最后一次倒扣于吸水紙上，使里面的液體充分流盡；F:將顯色劑A和顯色劑B混合，每孔加入lOO^il混合物，暗處反應10-30分鐘；H:每孔加入一滴終止液；G:在492nm處測定其光吸收值。
全文摘要
本發明提供了一種蕎麥過敏原，通過將蕎麥去殼，粉碎，脫脂，溶解，分離純化等步驟制得，其分子量為56kD。本發明提供了一種蕎麥過敏原試劑盒，是一種用間接酶聯免疫吸附試驗檢測蕎麥過敏的IgE檢測試劑盒。本發明的蕎麥過敏原與蕎麥過敏病人血清中的IgE具有特異性的結合活性，較目前臨床檢測中使用的過敏原有較寬的檢測范圍，可用于臨床檢測及蕎麥過敏癥的早期診斷，也適合作流行病學調查。所制備的試劑盒靈敏度高，檢測時間短，操作簡單易行，檢測成本低廉，可以實現大批量檢測，適于推廣使用。
文檔編號C07K14/415GK101148471SQ200710139639
公開日2008年3月26日 申請日期2007年10月26日 優先權日2007年10月26日
發明者崔曉東, 昕 張, 王轉花 申請人:山西大學