專利名稱：：從重組人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其突變體中分離異構(gòu)蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種從基因重組表達(dá)的蛋白中分離出異構(gòu)蛋白的方法，更確切講是從重組的人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或者其突變體中分離異構(gòu)蛋白的方法。
背景技術(shù)：
：在基因重組原核表達(dá)蛋白中，常因蛋白復(fù)性問(wèn)題出現(xiàn)一級(jí)結(jié)構(gòu)完全正確，但不具生物活性的異構(gòu)體。由于異構(gòu)體的存在，使其生物活性受到很大的影響。因此，重組表達(dá)蛋白中異構(gòu)體的分離是生物制藥中需要解決的一個(gè)問(wèn)題。人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)可用于治療普通肥胖癥及糖尿病型肥胖癥?；蛑亟M表達(dá)的人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其突變體可在大腸桿菌中高效表達(dá)，但其中存在的異構(gòu)蛋白沒(méi)有療效，反而會(huì)產(chǎn)生抗體，影響其實(shí)際的藥效。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種從基因重組的人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或者其突變體中分離異構(gòu)蛋白的方法。本發(fā)明的方法是從重組人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其突變體中分離異構(gòu)蛋白的方法是將收集的濕菌體以h51:10(W/V)的比例加入洗滌緩沖液,制成菌體混懸液，超聲破碎至菌體完全破裂、包函體溶出)，再在8000xg12000xg離心，棄去上清，將沉淀用含13mol/L尿素、0.5%TritonX-100的TE緩沖液充分洗滌，得到表達(dá)蛋白包涵體，再用含變性劑6mol/L的鹽酸胍或是8mol/L的尿素的緩沖液將該包涵體充分溶解，溶解至蛋白終濃度為10.5mg/ml，得到包涵體溶解液，將包涵體溶解液用pH8.5含有0.05mol/LTris-HCl、0.5mol/L精氨酸、lmmol/L的EDTA緩沖液進(jìn)行稀釋復(fù)性，直至目的蛋白的終濃度小于100pg/ml,變性劑的終濃度小于lmol/L;4。C放置2448h,成為CNTF復(fù)性蛋白液，超濾濃縮后，經(jīng)凝膠層析G-25柱轉(zhuǎn)換至Tris緩沖液中,收集蛋白峰，再將轉(zhuǎn)換了液體的CNTF復(fù)性蛋白液上QSephrose-FastFlow陰離子交換柱，去除未復(fù)性好的CNTF蛋白及雜蛋白；離子交換層析的上樣緩沖液為Tris.Cl-EDTA、pH7.08.5，解離緩沖液為Tris-HClEDTA、0.10.5mol/LNaCl，再將解離收集的目的蛋白上Octyl-4FastFlow疏水層析柱去除DNA及內(nèi)毒素，疏水層析的條件為A液為Tris-HCl，其pH7.08.5,含lmmol/LEDTA和0.1~0.5mol硫酸銨；B液為Tris.Cl，其pH7.08.5，含lmmol/LEDTA，用A液和B液梯度解離，收集蛋白峰后再上Superdex-75凝膠層析柱，所用緩沖液為pH7.08.0的磷酸緩沖液。本發(fā)明可以有效分離重組人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其突變體中的異構(gòu)蛋白，提高重組人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其突變體的治療效果，降低抗體滴度。圖h兩種CNTF異構(gòu)體SDS-PAGE電泳圖，圖中1、2CNTF為流穿峰；3、4為CNTF解離峰；5為分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖2:不同CNTF異構(gòu)體給藥后小鼠體重的變化結(jié)果。圖3:不同CNTF異構(gòu)體給藥后小鼠體重變化曲線。具體實(shí)施例方式重組人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)的發(fā)酵培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)本發(fā)明的重組CNTF全基因合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。取所合成的CNTF用發(fā)酵培養(yǎng)，所采用復(fù)合培養(yǎng)基，成份為蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、氯化鈉5g/L。將發(fā)酵種子液(即CNTF)以h101:40(V/V)的比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵培養(yǎng)溫度、pH值、溶氧DO，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每隔一小時(shí)取樣測(cè)OD6Q。的值，當(dāng)OD,在56時(shí)，加入異丙基-l3-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG的終濃度為0.1mmol/L,誘導(dǎo)4小時(shí)后結(jié)束培養(yǎng)，將培養(yǎng)液4000g離心收集菌體。表達(dá)CNTF蛋白包涵體的復(fù)性與異蛋白的分離將收集的濕菌體以l:10(W/V)的比例加入洗滌緩沖液，制成菌體混懸液，超聲破碎；破碎后8000xg1000xg離心，棄去上清，將沉淀用緩沖液充分洗滌，得到表達(dá)蛋白包涵體。將該包含體用含變性劑鹽酸胍或尿素的緩沖液溶解至蛋白含量為10.5mg/ml，得到包涵體溶解液。將包涵含體溶解液用0.05mol/LTris-HCl，含0.5mol/L精氨酸、lmmol/LEDTA，pH8.5的緩沖液進(jìn)行稀釋復(fù)性，直至目的蛋白的終濃度小于100pg/ml，變性劑的終濃度小于lmol/L;4。C放置2448h，超濾濃縮，凝膠層析G-25柱轉(zhuǎn)換至Tris緩沖液中,收集蛋白峰。將轉(zhuǎn)換了液體的CNTF蛋白液上QSephrose-FastFlow陰離子交換柱，在層析時(shí)，選擇合適的上樣條件及解離條件，去除未復(fù)性好的CNTF蛋白及雜蛋白，再將解離收集的的目的蛋白上Octyl-4FastFlow疏水層析柱去除DNA及內(nèi)毒素，收集蛋白峰后再上Superdex-75凝膠層析柱，所用緩沖液為pH7.08.0的磷酸緩沖液。收集蛋白峰即為CNTF原液，SDS-PAGE電泳分析，目的蛋白純度可達(dá)到95%。再將上述所得CNTF原液用0.22)im的濾膜除菌過(guò)濾，加入保護(hù)劑凍干，即為CNTF成品。生物活性檢定采用小鼠減重法來(lái)測(cè)定重組人CNTF突變體的抑制體重增長(zhǎng)藥效。選用體重在1820克的清潔級(jí)健康雄性昆明鼠，精確稱量體重(應(yīng)精確到O.lg)，按體重隨機(jī)分組，每組1020只動(dòng)物。同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品或參考品對(duì)照組及生理鹽水或其他溶媒對(duì)照組。每天將一給定劑量的重組CNTF蛋白腹腔注射小鼠，每天給藥兩次，給藥710天。陰性對(duì)照組每日注射等體積的生理鹽水或其他溶媒兩次。各組試驗(yàn)動(dòng)物于給藥0日起，每天給藥前稱量體重一次，根據(jù)體重計(jì)算給藥劑量。計(jì)算體重增長(zhǎng)抑制率一即減重效率。CNTF異構(gòu)體的鑒別采用上述純化分離工藝時(shí)，在QSephrose-FastFlow陰離子交換柱這一步中，分別收集了流穿峰和解離峰，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)流穿峰主條帶的位置與解離峰的CNTF蛋白條帶位置一致，即兩者蛋白分子量完全相同，同時(shí)它們又來(lái)自同一個(gè)表達(dá)蛋白的包涵體，因此它們可能為同種蛋白的異構(gòu)體，可能是因?yàn)樽冃缘鞍自趶?fù)性過(guò)程中一部分恢復(fù)至有正確構(gòu)象、具有生物活性的CNTF蛋白，一部分為未復(fù)性好的不具活性的異構(gòu)蛋白。但還需通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證哪一部分為所需要的具活性的CNTF蛋白。為此，采用小鼠體重增值抑制試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)分組對(duì)照組IO只小鼠，每天注射生理鹽水；流穿峰組IO只小鼠，每天注射CNTF流穿峰蛋白60ug/kg。解離峰組IO只小鼠，每天注射CNTF解離峰蛋白60ug/kg。CNTF復(fù)性液組IO只小鼠，每天注射CNTF復(fù)性蛋白60ug/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果給藥十天后，稱量小鼠體重變化值。對(duì)照組平均體重增長(zhǎng)8.56g;流穿峰組平均體重增長(zhǎng)8.84g;解離峰組平均體重增長(zhǎng)2.82g;CNTF復(fù)性液組平均體重增長(zhǎng)6.61g;受試小鼠體重變化曲線見圖2。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知解離峰為有正確構(gòu)象具活性的CNTF蛋白，該蛋白具有與天然人CNTF相似的生物活性，即抑制小鼠體重增長(zhǎng)的活性，而從流穿峰收集的CNTF異構(gòu)體在給藥期間同等給藥劑量，不能明顯抑制小鼠體重增長(zhǎng)，CNTF復(fù)性液組為包涵體復(fù)性液，未將復(fù)性蛋白與異構(gòu)體分離，是這兩種CNTF異構(gòu)體的混合物。因此，該組小鼠在試驗(yàn)期間體重增長(zhǎng)值有所降低，但體重增長(zhǎng)明顯高于CNTF解離峰組。試驗(yàn)結(jié)果表明，用QSephrose-FastFlow陰離子交換柱，選擇合適的純化條件，可以將復(fù)性好的、具有天然構(gòu)象的CNTF蛋白(CNTF-G)與非天然構(gòu)象的CNTF蛋白(CNTF-B)分開。為進(jìn)一步對(duì)以上的結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證，本發(fā)明對(duì)CNTF-G與CNTF-B的免疫原性進(jìn)行了比較，采用ELISA法檢測(cè)免疫小鼠血清，結(jié)果如下CNTF-G效價(jià)在1:64001:25600之間；CNTF-B效價(jià)在1:1001:1600之間；由ELISA檢測(cè)可知CNTF-B蛋白給藥后，產(chǎn)生的抗體滴度是CNTF-G蛋白的1664倍，說(shuō)明CNTF-B蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性。這也是藥效降低的主要原因。本發(fā)明還對(duì)CNTF-G與CNTF-B免疫小鼠后，產(chǎn)生抗體的情況進(jìn)行了比較；采用常規(guī)免疫法，選用Balb/C雌性小鼠，每組10只，免疫程序如下。0周用弗氏完全佐劑，分別配制CNTF-G與CNTF-B，皮內(nèi)注射，100嗎/只。2周弗氏不完全佐劑，分別配制CNTF-G與CNTF-B，皮內(nèi)注射，100jug/411周水劑CNTF-G，僅免疫CNTF-G組，每周加強(qiáng)一次，皮內(nèi)注射，200嗎/只。4周、12周鼠尾靜脈采血，檢測(cè)抗體滴度。在第四周測(cè)定時(shí)，CNTF-B已產(chǎn)生抗體，所以停止免疫，CNTF-G繼續(xù)免疫，檢測(cè)結(jié)果見表l。表1CNTF-G與CNTF-B免疫后小鼠產(chǎn)生抗體結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由小鼠免疫試驗(yàn)可知，CNTF-B蛋白產(chǎn)生抗體時(shí)間早，且抗體滴度很高(1:64001:12800);而CNTF-G蛋白不易產(chǎn)生抗體，在連續(xù)免疫3個(gè)月后，才有40%小鼠產(chǎn)生了抗體，且抗體效價(jià)較低(1:1001:1600)。對(duì)于治療用生物制品，抗體的產(chǎn)生可以和藥物發(fā)生中和反應(yīng)，降低藥物的療效，所以治療用生物藥物的免疫原性是這類藥物能否研發(fā)成功的關(guān)鍵因素，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)生產(chǎn)工藝的控制，使復(fù)性好的具有與天然CNTF相同活性的CNTF-G蛋白與未復(fù)性好的CNTF-B蛋白分離。通過(guò)小鼠生物活性實(shí)驗(yàn)、抗原性實(shí)驗(yàn)、免疫原性實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，說(shuō)明在重組表達(dá)的CNTF蛋白中，未復(fù)性好的異構(gòu)體蛋白CNTF-B是產(chǎn)生抗原性及免疫原性的主要因素。而且也證明了本發(fā)明的方法可以有效分離重組人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中的異構(gòu)蛋白。權(quán)利要求1、從重組人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其突變體中分離異構(gòu)蛋白的方法，其特征是將收集的濕菌體以1∶5～1∶10(W/V)的比例加入洗滌緩沖液，制成菌體混懸液，超聲破碎至菌體完全破裂、包涵體溶出，再在8000×g～12000×g離心，棄去上清，將沉淀用含1～3mol/L尿素、0.5％TritonX-100的TE緩沖液充分洗滌，得到表達(dá)蛋白包涵體，再用含變性劑6mol/L的鹽酸胍或是8mol/L的尿素的緩沖液將該包涵體充分溶解至蛋白含量為1～0.5mg/ml，得到包涵體溶解液，將包涵體溶解液用pH8.5，0.05mol/LTris-HCl，0.5mol/L精氨酸、1mmol/LEDTA的緩沖液進(jìn)行稀釋復(fù)性，直至目的蛋白的終濃度小于100μg/ml，變性劑的終濃度小于1mol/L；4℃放置24～48h，成為CNTF復(fù)性蛋白液，超濾濃縮后，經(jīng)凝膠層析G-25柱轉(zhuǎn)換至Tris.Cl緩沖液中，收集蛋白峰，上QSephrose-FastFlow陰離子交換柱，去除未復(fù)性好的CNTF蛋白及雜蛋白；離子交換層析的上樣緩沖液為pH7.0～8.5，Tris-HCl，1mmol/LEDTA，解離緩沖液為pH7.0～8.5，Tris-HCl，1mmol/LEDTA、含0.1～0.5mol/LNaCl，再將解離收集的目的蛋白上Octyl-4FastFlow疏水層析柱去除DNA及內(nèi)毒素，疏水層析的條件為A液為Tris-HCl，其pH7.0～8.5，含1mmol/LEDTA和0.1～0.5mol硫酸銨；B液為Tris-HCl，其pH7.0～8.5，含1mmol/LEDTA，用A液和B液梯度解離，收集蛋白峰后再上Superdex-75凝膠層析柱，所用緩沖液為pH7.0～8.0的磷酸緩沖液，收集目的蛋白峰，即為CNTF原液。全文摘要本發(fā)明涉及一種從基因重組表達(dá)的蛋白中分離出異構(gòu)蛋白的方法。本發(fā)明的方法是將收集的濕菌體在洗滌緩沖液制成菌體混懸液，經(jīng)超聲破碎離心，棄去上清，沉淀用含尿素、TritonX-100的TE緩沖液洗滌得到表達(dá)蛋白包涵體，再用含鹽酸胍或是尿素的緩沖液將該包涵體充分溶解，將包涵體溶解液用含有Tris-HCl、精氨酸和EDTA緩沖液進(jìn)行稀釋復(fù)性，再放置24～48h，成為CNTF復(fù)性蛋白液，超濾濃縮后，經(jīng)凝膠層析G-25柱轉(zhuǎn)換至Tris緩沖液中，收集蛋白峰，再將轉(zhuǎn)換了液體的CNTF復(fù)性蛋白液上QSephrose-FastFlow陰離子交換柱，去除未復(fù)性好的CNTF蛋白及雜蛋白。文檔編號(hào)C07K1/36GK101113174SQ20071012613公開日2008年1月30日申請(qǐng)日期2007年6月12日優(yōu)先權(quán)日2007年6月12日發(fā)明者卜曉萍,應(yīng)蓮芳,萍李,梁凌宇,琳蔣,溱謝,馬亞茹,高雪峰申請(qǐng)人:蘭州生物制品研究所