一種貫葉連翹總黃酮及其制劑的制備方法和質量檢測方法

專利名稱：：一種貫葉連翹總黃酮及其制劑的制備方法和質量檢測方法
技術領域：
：本發明涉及一種貫葉連翹總黃酮及其制劑的制備方法和質量檢測方法,特別涉及一種抗抑郁貫葉連翹總黃酮及其制劑的制備方法和質量檢測方法。技術背景抑郁癥為情感性精神障礙的主要類型，是一種以顯著而持久的心境低落為主要特征的綜合癥。隨著現代工業化進程加快以及市場經濟所帶來的快節奏和精神、心理等方面的壓力，精神抑郁癥的發病率明顯增加。世界大型流行病學石開究顯示，抑郁癥目前在世界致殘性疾病中排名第四，到2020年將排名第二，僅次于心血管疾病。科學研究證實，心理因素，非心理因素都能誘發憂郁癥，如帕金森氏病等軀體疾病伴發抑郁癥的比例也非常高。精神抑郁癥一旦發病，輕則使患者心理造成很大的痛苦，影響患者正常工作和交往，重則導致自殺，后果十分嚴重。目前抗抑郁藥大致分為三類單胺氧化酶抑制劑、三環類抗抑郁劑及雜環類抗抑郁劑。單胺氧化酶抑制劑是50年代初期最早發現的抗抑郁藥，當時被廣泛應用，有一定的療效。由于有嚴重的毒副反應，很快被三環類抗抑郁藥所取代；三環類抗抑郁劑是當前應用最廣泛的抗抑郁藥。此類藥物可以使心情振奮，有鎮靜作用，對失眠癥狀有一定的治療作用，但奏效較慢，副作用明顯，如口干、便秘、視物模糊、排尿困難、尿儲留，少數可發生震顫或癲癇發作等；雜環類抗抑郁藥對抑郁癥也有一定的治療作用，但存在引起白細胞減少、致眩暈、視力模糊、嗜睡、便秘、體重增加等副作用，另一方面皮疹也較多見，雖然對心臟的毒性較小，但偶爾也有癲癇發作等缺陷。由此可以看出，在治療抑郁癥方面，西藥存在著明顯的副作用等缺陷，而中藥、天然藥物抗抑郁制劑的開發可以避免以上的不足，在未來的市場及應用中將具有廣闊的前景。
發明內容本發明目的在于提供一種貫葉連翹總黃酮；本發明的另一個目的在于提供一種貫葉連翹總黃酮及其制劑的制備方法；本發明的第三個目的在于提供一種貫葉連翹總黃酮制劑的質量檢測方法；本發明的第四個目的在于提供一種貫葉連翹總黃酮及其制劑的用途。本發明目的是通過如下技術方案實現的本發明貫葉連翹總黃酮制劑的質量檢測方法包括如下HPLC指紋圖譜色譜條件漢邦ds色譜柱；Dikma預保護柱;檢測波長240-260nm;柱溫15-35°C;以乙腈為流動相A，以0.1-1.0%磷酸溶液為流動相B,A與B濃度之和為100%,進行梯度洗脫；030min，流動相中A的比例為5-25%;3060min，流動相中A的比例由5-25%線性變化到30-50%;6080min，流動相中A的比例由30_50%線性變化到90-100%;8085min,流動相中A的比例由90-100%線性變化到5-25%;85100min，流動相中A的比例為5_25%;進樣量8-12lU;對照品溶液制備單組分對照品溶液制備精密量取經五氧化二磷干燥36-54小時的對照品適量，用70-95%甲醇溶解，制成濃度分別為蘆丁0.2-0.4呢/ml，金絲桃苷0.2-0.4mg/ml，槲皮素0.2-0.4mg/ml的溶液；混合對照品溶液制備精密量取單組分對照品溶液蘆丁2-4ml，金絲桃苷2-4ml，槲皮素2-4ml混合，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得；供試品溶液的制備取貫葉連翹總黃酮制劑，研細，混勻，精密稱取日用劑量的1/2-3/2，置100ml具塞錐形瓶中，精密加入40-60%乙醇40-60ml，稱定總量，超聲處理10-20分鐘，冷卻至室溫，再稱定總量，用40-60%乙醇補足減失的總量，過濾，精密量取續濾液1-3ml，置10ml量瓶中，加40-60%乙醇至刻度，混勻，用0.35-0.55um微孔濾膜過濾，即得供試品溶液，精密吸取供試品溶液5-15u1，注入高效液相色譜儀，即得HPLC圖譜；同時用對照品溶液進樣，確定蘆丁，金絲桃苷和槲皮素的出峰位置。本發明貫葉連翹總黃酮制劑的質量檢測方法優選如下HPLC指紋圖譜色譜條件漢邦d8色譜柱Kromasil,4.6mmX254mm，5nm;Dikma預保護柱；檢測波長254nm;柱溫25°C;以乙腈為流動相A，以0.5%磷酸溶液為流動相B,A與B濃度之和為100%,進行梯度洗脫；030min，A-B的比例為15:85;3060min，A-B的比例由15:85線性變化到40:60;6080min，A-B的比例由40:60線性變化到100:0;8085min，A-B的比例由100:0線性變化到15:85;85100min，A-B的比例為15:85;進樣量10";對照品溶液制備單組分對照品溶液制備精密量取經五氧化二磷干燥48小時的對照品適量，以85%甲醇溶解，各組分濃度分別為蘆丁0.3mg/ml，金絲桃苷0.3tng/ml，槲皮素0.3rag/ml的溶液；混合對照品溶液制備精密量取單組分對照品溶液戸丁3ml，金絲桃苷3ml，槲皮素3ml混合，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得；供試品溶液的制備取貫葉連翹總黃酮制劑，研細，混勻，精密稱取日用劑量的10/9，置100ml具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50ml，稱定總量，超聲處理15分鐘，冷卻至室溫，再稱定總量，用50%乙醇補足減失的總量，過濾，精密量取續濾液2ml，置10ml量瓶中，加50%乙醇至刻度，混勻，用0.45ixm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液；精密吸取供試品溶液10iU，注入高效液相色譜儀即得HPLC圖譜；同時用對照品溶液進樣，確定盧丁，金絲桃苷和槲皮素的出峰位置。本發明貫葉連翹總黃酮制劑的質量檢測方法優選如下HPLC指紋圖譜色譜條件漢邦ds色譜柱；Dikma預保護柱；檢測波長240nm;柱溫35°C;以乙腈為流動相A，以0.2%磷酸溶液為流動相B，A與B濃度之和為100%，進行梯度洗脫；030min，A-B的比例為10:90;3060min，A-B的比例由10:90線性變化到50:50;6080min，A-B的比例由50:50線性變化到95:5;8085min，A-B的比例由95:5線性變化到10:90;85100min，A-B的比例為10:90;進樣量12nl;對照品溶液制備單組分對照品溶液制備精密量取經五氧化二磷干燥36小時的對照品適量，以70%甲醇溶解，制成濃度分別為蘆丁0.4mg/ml，金絲桃苷0.2mg/ml，槲皮素0.4mg/ml的溶液；混合對照品溶液制備取單組分對照品溶液戶丁2ml，金絲桃苷4ml，槲皮素2ml混合，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得；供試品溶液的制備取貫葉連翹總黃酮制劑，研細，混勻，精密稱取日用劑量的3/2，置100ml具塞錐形瓶中精密加入40%乙醇60ml，稱定總量，超聲處理10分鐘，冷卻至室溫，再稱定總量，用40%乙醇補足減失的總量，過濾，精密量取續濾液lml，置10ml量瓶中，加40%乙醇至刻度，混勻，用0.35nm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液，精密吸取供試品溶液15nl，注入高效液相色譜儀即得HPLC圖譜；同時用對照品溶液進樣，確定蘆丁，金絲桃苷和槲皮素的出峰位置。本發明貫葉連翹總黃酮制劑的質量檢測方法優選如下HPLC指紋圖譜色譜條件漢邦C,8色譜柱；Dikma預保護柱；檢測波長260nm;柱溫15。C;以乙腈為流動相A，以0.8%磷酸溶液為流動相B，A與B濃度之和為100%，進行梯度洗脫；030min，A-B的比例為20:80;3060min，A-B的比例由20:80線性變化到30:70;6080min，A-B的比例由30:70線性變化到90:10;8085min，A-B的比例由90:10線性變化到20:80;85100min，A-B的比例為20:80;進樣量8ul;對照品溶液制備單組分對照品溶液制備精密量取經五氧化二磷干燥36小時的對照品適量，以95%甲醇溶解，制成濃度分別為蘆丁0.2mg/ml，金絲桃苷0.4mg/ml，槲皮素0.2mg/ml的溶液；混合對照品溶液制備取單組分對照品溶液蘆丁2ml，金絲桃苷4ml，槲皮素2ml混合，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得；供試品溶液的制備取貫葉連翹總黃酮制劑，研細，混勻，精密稱取日用劑量的2/3，置100ml具塞錐形瓶中精密加入6(m乙醇40ml，稱定總量，超聲處理20分鐘，冷卻至室溫，再稱定總量，用60%乙醇補足減失的總量，過濾，取續濾液3ml，置10ml量瓶中，加60%乙醇至刻度，混勻，用0.55um微孔濾膜過濾，即得供試品溶液，精密吸取供試品溶液15ul，注入高效液相色譜儀即得HPLC圖譜；同時用對照品溶液進樣，確定蘆丁，金絲桃苷和槲皮素的出峰位置。上述HPLC指紋圖譜檢測的測定結果為共計8個共有峰，其中第3個峰為金絲桃苷內參照峰，第2、3、4、7個峰為特征指紋峰；各個峰的相對保留時間依次分別為0.233、0.900、1.000、1.100、1.650、1.740、2.300、2.690，平均相對峰面積比依次分別為0.0082、0.1299、0.1074、0.089、0.0223、0.0174、0.136、0.0055。本發明貫葉連翹總黃酮制劑的質量檢測方法包括如下鑒別和/或含量測定中的一種或幾種鑒別取貫葉連翹總黃酮制劑，研細，混勻，稱取日用劑量的1/20-1，加甲醇5ml，超聲提取10-20分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液；另取蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對照品，加甲醇制成每lml各含0.5-1.5mg的混合溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法(試驗，吸取上述兩種溶液各lnl，分別點于同一聚酰胺薄層板上，以30-70:l.比例的乙醇一甲酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁溶液，吹干，置365nm紫外燈下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；含量測定A、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的含量測定色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基硅垸鍵合硅膠為填充劑；流動相測定戸丁、金絲桃苷以5-25:60-100比例的乙腈一0.1-1.0%磷酸水溶液為流動相，理論塔板數按蘆丁峰計算應不低于3000:測定槲皮素以25-45:40-80比例的乙腈一O.5%磷酸水溶液為流動相，理論塔板數按槲皮素峰計算應不低于3000，流速l.Oml/分鐘，檢測波長為254nm;對照品溶液的制備、精密稱取6(TC真空干燥3小時的蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對照品適量，加甲醇分別制成每lml含0.15-0.35mg的溶液，即得；供試品溶液的制備取貫葉連翹總黃酮制劑，研細，混勻，精密稱取日用劑量的1/2-3/2，置100ml具塞錐形瓶中，精密加入50X乙醇40-60ml，稱定重量，超聲處理10-20分鐘，冷卻至室溫，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，上清液用Q.45pm微孔濾膜濾過，即得；測定法精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5^1，注入液相色譜儀，測定，即得；本貫葉連翹總黃酮制劑每日用劑量含蘆丁不得低于15-25mg，金絲桃苷不得低于8-15mg，槲皮素不得低于8-15mg，三者總含量不得低于40-60mg;B、黃酮的含量測定對照品溶液的制備精密稱取60'C真空干燥3小時的蘆丁對照品25mg，置40-60ml量瓶中，加乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加乙醇稀釋至刻度，搖勻；吸取上述溶液10-30ml，置40-60ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得，每lml含蘆丁0.10-0.30mg;標準曲線的制備精密量取上述對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分別置25ml量瓶中，各加水至6ml，加3-7%亞硝酸鈉溶液lml,使混勻，放置1-10分鐘，加10X硝酸鋁lml，混勻，放置1-10分鐘，力卩lmol/L氫氧化鈉試液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置10-20分鐘以相應的溶劑為空白；照分光光度法，在500nm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標、濃度為橫坐標，繪制標準曲線；測定法精密量取高效液相色譜法中的供試品溶液lml，置10ml量瓶中，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述溶液lml，置25ml量瓶中，照標準曲線制備項下的方法，自"加水至6ml"起，依法測定吸收度，得吸收度Ai;再精密量取高效液相色譜法中的供試品溶液lml，以lml水代替10X硝酸鋁，按上述方法制備供試品溶液，依法測定吸收度，得吸收度A2;以不加供試品的相應溶液作空白；按下式計算供試品的吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的濃度，計算，即得；供試品的吸收度A-A^A2;本貫葉連翹總黃酮制劑每日用劑量含總黃酮以蘆丁干燥品計不得低于200-300mg。本發明貫葉連翹總黃酮制劑的質量檢測方法優選如下鑒別和/或含量測定中的一種或幾種鑒別取貫葉連翹總黃酮制劑，研細，混勻，稱取日用劑量的1/9，加甲醇5ml，超聲提取15分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液；另取蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對照品，加甲醇制成每lml各含lmg的混合溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各lpl，分別點于同一聚酰胺薄層板上，以50:1比例的乙醇一甲酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁溶液，吹干，置365nm紫外燈下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；含量測定A、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的含量測定色譜條件與系統適用性試驗用十八垸基硅垸鍵合硅膠為填充劑；流動相測定蘆丁、金絲桃苷以17:83比例的乙腈一0.5%磷酸水溶液為流動相，理論塔板數按蘆丁峰計算應不低于3000:測定槲皮素以36:64比例的乙腈——0.5%磷酸水溶液為流動相，理論塔板數按槲皮素峰計算應不低于3000，流速l.Oml/分鐘，檢測波長為254nm;對照品溶液的制備、精密稱取6(TC真空干燥3小時的蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對照品適量，加甲醇分別制成每lml含O.25mg的溶液，即得；供試品溶液的制備取貫葉連翹總黃酮制劑，研細，混勻，精密稱取日用劑量的1/9，置100ml具塞錐形瓶中，精密加入50X乙醇50ml，稱定重量，超聲處理15分鐘，冷卻至室溫，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，上清液用0.45pm微孔濾膜濾過，即得；測定法精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5^d，注入液相色譜儀，測定，即得；本貫葉連翹總黃酮制劑每日用劑量含蘆丁不得低于18.6mg，金絲桃苷不得低于12.9mg，槲皮素不得低于13.5mg，三者總含量不得低于51mg;,B、總黃酮的含量測定對照品溶液的制備精密稱取6(TC真空干燥3小時的蘆丁對照品25mg，置50ml量瓶中，加乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加乙醇稀釋至刻度，搖勻；吸取上述溶液20ml，置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得，每lml含蘆丁O.20mg;標準曲線的制備精密量取上述對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分別置25ml量瓶中，各加水至6ml，力B5%亞硝酸鈉溶液lml，使混勻，放置6分鐘，加10%硝酸鋁1加1，混勻，放置6分鐘，力nlmol/L比氫氧化鈉試液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘以相應的溶劑為空白；照分光光度法，在500nm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標、濃度為橫坐標，繪制標準曲線；測定法精密量取高效液相色譜法中的供試品溶液lml，置10ml量瓶中，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述溶液lml，置25ml量瓶中，照標準曲線制備項下的方法，自"加水至6ml"起，依法測定吸收度，得吸收度An再精密量取高效液相色譜法中的供試品溶液lml，以lml水代替10X硝酸鋁，按上述方法制備供試品溶液，依法測定吸收度，得吸收度A2;以不加供試品的相應溶液作空白；按下式計算供試品的吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的濃度，計算，即得；供試品的吸收度A-ArA2;本貫葉連翹總黃酮制劑每日用劑量含總黃酮以戸丁干燥品計不得低于240mg。本發明貫葉連翹總黃酮由常規方法制備，也可以由如下方法制成貫葉連翹全草粉碎或切段后，用5-12倍重量份的40_80%的乙醇或甲醇提取，置于提取罐中，在回流狀態下提取1-3次，過濾得提取液將提取液控制溫度50-70'C以下濃縮，至比重1.08_1.15噴霧干燥，得提取物將提取物用3-8倍重量份的石油醚或正已垸脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物將脫脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，將乙酸乙脂萃取液濃縮至比重1.18—1.32，得到主要含金絲桃素、槲皮素類成分的乙酸乙脂部分，即A部分將沉淀部分用水溶解，并同時揮發多余的有機溶劑，得水溶液部分；將水溶液部分充分放冷后，離心或過濾后上聚苯乙烯類弱極性或中極大孔樹脂，流速為柱體積2—5倍純水用量為3—8倍柱體積進行水洗，水洗至顏色較淺，盡無色，用3一8倍柱體積的5—20%乙醇溶劑洗脫，至顏色較淺，即可停止加入；再用30—60%濃度的乙醇洗脫，并收集30—60%部分，將洗脫液濃縮得B部分將A部分和B部分混合，進行真空或噴霧干燥，得貫葉連翹總黃酮。本發明貫葉連翹總黃酮的制備方法優選為貫葉連翹全草粉碎或切段后，用8倍重量份的65%的乙醇提取，置于提取罐中，在回流狀態下提取2次，過濾得提取液將提取液控制溫度60'C以下濃縮，至比重1.12噴霧干燥，得提取物將提取物用6倍重量份的石油醚或正已垸脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物將脫脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，將乙酸乙脂萃取液濃縮至比重1.25，得到主要含金絲桃素、槲皮素類成分的乙酸乙脂部分，即A部分將沉淀部分用水溶解，并同時揮發多余的有機溶劑，得水溶液部分；將水溶液部分充分放冷后，上聚苯乙烯類弱極性或中極大孔樹脂，流速為柱體積4倍用純水5倍柱體積進行洗脫，至顏色較淺，盡無色，用5倍量柱體積的55%乙醇溶劑洗脫，至顏色較淺，即可停止加入；將醇濃度在30—60%之間的部分單獨收集，濃縮得B部分將A部分和B部分混合，進行真空或噴霧干燥，得貫葉連翹總黃酮。本發明貫葉連翹總黃酮的制備方法優選為貫葉連翹全草粉碎或切段后，用5倍重量份的80%的乙醇或甲醇提取，置于提取罐中，在回流狀態下提取l次，過濾得提取液將提取液控制溫度50'C以下濃縮，至比重1.15噴霧干燥，得提取物將提取物用3倍重量份的石油醚或正已垸脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物將脫脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，將乙酸乙脂萃取液濃縮至比重1.32，得到主要12含金絲桃素、槲皮素類成分的乙酸乙脂部分，即A部分將沉淀部分用水溶解，并同時揮發多余的有機溶劑，得水溶液部分；將水溶液部分充分放冷后，離心或過濾后上聚苯乙烯類弱極性或中極大孔樹脂，流速為柱體積2倍純水用量為8倍柱體積進行水洗，水洗至顏色較淺，盡無色，用5倍柱體積的5%乙醇溶劑洗脫，至顏色較淺，即可停止加入；再用30—60%濃度的乙醇洗脫，并收集30—60%部分，將洗脫液濃縮得B部分將A部分和B部分混合，進行真空或噴霧干燥，得貫葉連翹總黃酮。本發明貫葉連翹總黃酮的制備方法優選為貫葉連翹全草粉碎或切段后，用12倍重量份的40%的乙醇或甲醇提取，置于提取罐中，在回流狀態下提取3次，過濾得提取液將提取液控制溫度7(TC以下濃縮，至比重1.08噴霧干燥，得提取物將提取物用8倍重量份的石油醚或正已烷脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物將脫脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，將乙酸乙脂萃取液濃縮至比重1.18，得到主要含金絲桃素、槲皮素類成分的乙酸乙脂部分，即A部分將沉淀部分用水溶解，并同時揮發多余的有機溶劑，得水溶液部分；將水溶液部分充分放冷后，離心或過濾后上聚苯乙烯類弱極性或中極大孔樹脂，流速為柱體積5倍純水用量為3倍柱體積進行水洗，水洗至顏色較淺，盡無色，用8倍柱體積的20%乙醇溶劑洗脫，至顏色較淺，即可停止加入；再用30—60%濃度的乙醇洗脫，并收集30—60%部分，將洗脫液濃縮得B部分將A部分和B部分混合，進行真空或噴霧干燥，得貫葉連翹總黃酮。取上述貫葉連翹總黃酮，加入常規輔料，按照常規工藝，制備成臨床接受的各種劑型，包括但不限于膠囊劑、滴丸劑、顆粒劑、片劑、軟膠囊劑、緩釋劑。上述本發明貫葉連翹總黃酮制劑中片劑由如下方法制備得貫葉連翹總黃酮后，將貫葉連翹總黃酮與微晶纖維素以1-3:1比例混勻，加入40-60%乙醇，制成軟材，制粒，再加入常規輔料，壓片，包薄膜衣，即得。上述本發明貫葉連翹總黃酮制劑中片劑的制備方法優選為得貫葉連翹總黃酮后，將貫葉連翹總黃酮與微晶纖維素以1.6:l比例混勻，加入50%乙醇，制成軟材，制粒，再加入羧甲基淀粉鈉、硬酯酸鎂，滑石粉，壓片，包薄膜衣，即得。本發明藥物組合物不同制劑的日用劑量(每日服用劑量或每日使用劑量)因制劑不同而不同，但不同制劑的日用劑量中含相當生藥材量相同。本發明質量檢測方法以日用劑量為計量單位。本發明所述重量份與體積份的關系為克/毫升。本發明貫葉連翹總黃酮及其制劑用于治療抑郁癥、焦慮或煩躁不安。本發明貫葉連翹總黃酮制劑臨床藥效學實驗證實可明顯對抗小鼠行為絕望及獲得性無助；失望和不動行為時間明顯縮短，表明有抗抑郁的作用；可明顯抑制利血平效應引起的小鼠體溫降低、眼瞼下垂及自主活動減少，顯著增加腦內5—HT、NE的含量；對化學刺激有明顯的保護作用；可輕度減緩心率；同時還可拮抗安鈉咖，起到鎮靜催眠及鎮痛的作用，表明對抑郁癥有明確的治療作用。本發明貫葉連翹總黃酮制劑通過一、二期臨床證實，治療早期抑郁癥有效率93%以上。本發明制備方法主要采用脫脂及乙酸乙脂萃取等步驟，將提取物用石油醚或正已烷脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物；使用石油醚或正己垸脫脂，主要用于除去工藝中極性很小的脂溶性成分以保證乙酸乙脂萃取后，所含有效成分金絲桃素、槲皮素類成分的含量，同時使其所含金絲桃素、槲皮素類成分能充分地溶出，保證進一步純化分離的效果。本發明制備方法較現有技術具有熱敏性成分損失小，有效成分含量穩定，產品收率與質量能得到更好的保證等優勢。采用本發明質量檢測方法對本發明貫葉連翹總黃酮制劑進行檢測，結果顯示出能很好地控制產品的質量，并能保證產品的相關藥效。圖l:混合對照品的HPLC色譜2:本發明貫葉連翹總黃酮片劑樣品的HPLC色譜圖下述實驗例和實施例用于進一步說明本發明但不限于本發明.實驗例lHPLC指紋圖譜實驗(一)儀器和材料DI0NEX高效液相系統(P680HPLCPpmp'ASI-100AixtomatedSampleInjector,ThermostattedColumnCompartmentTCC-100，MVD170M)，電子天平(SartoriusCP225D)、微孔濾膜(0.45nm)、乙腈為色譜純，磷酸為分析純、水為雙蒸水，金絲桃苷(hyperoside)對照品(中國藥品生物制品鑒定所，批號1521-200202)、蘆丁(rUtin)對照品(中國藥品生物制品鑒定所，批號100080-200306)、槲皮素(q^ercetin)對照品(中國藥品生物制品鑒定所，批號0211050702)。本發明貫葉連翹總黃酮片劑樣品由武漢健民中藥工程有限責任公司提供，其批號見表l。表l不同批次樣品來源樣品12345678910號批號200003-01200004-01200005-01200006-01200007-01200007-02200103-01200103-02200104-01200105-01(二)實驗方法色譜條件漢邦ds色譜柱(Kromasi1，4.6mmX254mm，5um);Dikma預保護柱；檢測波長254nm;柱溫25°C;以乙腈為流動相A，以0.5%磷酸溶液為流動相B，(A+B=100%)，梯度洗脫，030min，A-B的比例為15:85，3060min，A_B的比例由15:85線性變化到40:60，6080min，A-B的比例由40:60線性變化到100:0，8085min，A-B的比例由100:0線性變化到15:85，85100min，A-B的比例為15:85;進樣量10ul。(見表2)表2流動相線性梯度時間/minA/%B/%015853015856040608010008515851001585對照品溶液制備單組分對照品溶液制備精密量取經五氧化二磷干燥48小時的對照品適量，用甲醇溶解，各組分濃度分別為蘆丁0.3mg/ml，金絲桃苷0.3mg/ml，槲皮素0.3mg/ml.混合對照品溶液制備精密量取單組分對照品溶液蘆丁3ml，金絲桃苷3ml，槲皮素3ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。供試品溶液的制備取本發明貫葉連翹總黃酮片劑15片，除去薄膜衣，研細，混勻，精密稱取lg，置100ml具塞錐形瓶中，精密加入50y。乙醇50ml，稱定總量，超聲處理15分鐘，冷卻至室溫，密塞，再稱定總量，用50%乙醇補足減失的總量，過濾，精密量取續濾液2ml,置10ml量瓶中，加50%乙醇至刻度，搖勻，用0.45um微孔濾膜過濾，即得。樣品分析將10個不同批次的本發明貫葉連翹總黃酮片劑制成供試品溶液，按以上色譜條件進行分析，得各樣品的HPLC圖譜。同時用對照品溶液進樣，確定蘆丁，金絲桃苷和槲皮素的出峰位置。(三)實驗結果1、相對保留值指紋圖譜的建立根據公式和混合對照品，樣品的HPLC色譜圖(見圖1和圖2)計算各樣品色譜峰的a值(a值為各組分色譜峰的保留時間與內參照峰的保留時間之比)相同(誤差《1%)，即可認為同一化合物，將各個樣品每個峰的RA值(RA值是以峰面積總和最大的樣品的總峰面積為分母，樣品中各色譜峰面積為分子，計算得到各色譜峰的相對面積值。)列于相應的a值項下，得到相對保留值指紋圖譜，見表3。表3不同批次樣品的HPLC相對保留值指紋圖譜<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>根據表3結果可知HPLC指紋圖譜檢測結果共計8個共有峰，其中第3個峰為金絲桃苷內參照峰，第2、3、4、7個峰為特征指紋峰，各個峰的相對保留時間依次分別為0.233、0.900、1.000、1.100、1.650、1.740、2.300、2.690，平均相對峰面積比依次分別為0.0082、0.1299、0.1074、0.089、0.0223、0.0174、0.136、0.0055。共有峰的檢出率》75%。2、樣品之間的相似性將10個批次的本發明貫葉連翹總黃酮片劑樣品計算兩兩之間的峰重疊率并列表，組成反映樣品間相似性的峰重疊率矩陣，該矩陣成為對稱矩陣，見表4。表4不同批次樣品HPLC峰重疊率(％)樣品號123456789101100292.31100385.7176.92100485.7161.5485.71100593.3385.7193.3393.33100693.3385.7193.3393.33100100793.3385.7193.3393.33100100100893.3385.7193.3393.33100100100100992.3183.3392.3176.9285.7185,7185.7185.711001093.3385.7193.3393.33100100100100100100根據表4結果可知10個批次的樣品的HPLC指紋峰重疊率均在75X以上，大多數重疊率在85%以上，表明相似性較好。3、特征指紋峰每個樣品均選出其中峰面積最大的4個峰排列成表，得10個樣品的4強峰表，10批樣品中均出現此4強峰，相對保留值a分別為0.900、1.000、1.100、2.300，故規定這4強峰，即第2，3，4，7個峰為本發明貫葉連翹總黃酮片劑的特征指紋峰(見表5)。將不同批次樣品中蘆丁，金絲桃苷和槲皮素的含量數值列于表6，以規定期間的相關性。_表5不同批次樣品的HPLC4強峰_4強峰順序樣品號1(a=0.900)2(a=1.000)3(a=l.100)4(a=2.300)1.0000.1210.1010.0860.1362.0000.1300.1100.0960.1393.0000.1190.1000.0840.1444.0000.1330.1130.0930,1415.0000.1510.1060.0880.1436.0000.1490.1130.0930.0997.0000.1160.1050.0890.1368.0000.1180.1090.0850.1449.0000.1210,1040.0890.13710.0000.1410.1130,0870,141表6不同批次樣品中蘆丁，金絲桃苷和槲皮素含量(mg/片，片重0.3g)樣品號12345678910戸丁(a=0.900)金絲桃苷(a=1.000)槲皮素(a=2.300)9.9578.0997.48110.15711.3907.1736.9788.8949.0578.1205.2166.8536.2868.6307.9965.4406.3168.2157.7856.5075.2528.6599.05210.76810.7864.7668.18110.85310.2558.12017由表5、表6可以看出特征指紋峰的檢出率為100%，共有峰的檢出率》75%，故含量測定中以蘆丁、金絲桃苷、槲皮素為指標，具有很好的代表性，確實能控制本發明貫葉連翹總黃酮片劑的質量。4、特征指紋峰的相似率和差異率(1)特征指紋峰的相似率不同批次本發明貫葉連翹總黃酮片劑的特征指紋峰的相似率(每批均以相對保留值a由小到大的順序排列)見表7。表7不同批次樣品的特征指紋峰的相似率<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表7表明十批樣品的特征指紋峰相似率的平均值分別為0.93、0.98、0.99、0.97，特征指紋峰的相似度很好。進一步說明特征指紋峰選擇比較合理，能將本發明貫葉連翹總黃酮片劑的特征性表達出來。(2)特征指紋的差異率不同批次本發明貫葉連翹總黃酮片劑的特征指紋峰的差異率(每批均以相對保留值a由小到大的順序排列)見表8。表8不同批次樣品的特征指紋峰的差異率<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>由表8可知特征指紋峰的差異率較少，進一步闡述了特征指紋峰選擇的合理性。(四)結論本次試驗選定金絲桃苷為內參照峰。由以上數據可以看出不同批次本發明貫葉總黃酮片劑的峰重疊率高，特征指紋峰檢出率為100%;不同批次本發明貫葉總黃酮片劑特征指紋峰的相似率均在0.9—1.0之間，說明它們的相似性好；不同批次本發明貫葉總黃酮片劑特征指紋峰的差異率小。綜合上述試驗數據，可以知道本發明貫葉總黃酮片劑HPLC指紋圖譜能有效的實施生產上的在線控制，保證不同批次產品質量的穩定一致。實驗例2本發明貫葉總黃酮制劑的藥效學實驗一、對利血平致小鼠抑郁模型的影響實驗試驗材料1、藥物本發明貫葉連翹總黃酮片劑，每片含貫葉連翹總黃酮150mg，北京大學中醫藥現代研究中心提供，批號20000901;鹽酸氟西汀膠囊(商品名奧麥倫)，20mg/粒，上海中西藥業股份有限公司生產，批號001001;利血平注射液，上海醫科大學紅旗制藥廠生產，批號970505。試驗時以上藥物均配成所需濃度。去甲腎上腺素(NE)、5-羥色胺(5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)、磷酸二氫鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸四鈉(EDTA)、辛垸磺酸鈉均為Sigma產品；乙腈(ACN)為Fisher產品、甲醇、高氯酸、焦亞硫酸鈉及其它試劑均為國產AR級。水為超純水。2、動物ICR種小鼠，72只，雌雄各半，18-22g，由北京維通利華實驗動物技術發展有限公司提供，合格證號SCXK-11-00-0008。3、儀器超速離心機(日本HITACHI55P-72);16通道Co"larray電化學高效液相色譜儀及色譜工作站，580泵，5200A電化學檢測器，542自動進樣器，美國ESA公司產品。Waters,SymmetryC18柱子G.9mmX150mm,3.5um)。4、色譜條件流動相組成磷酸二氫鈉6,21g，檸檬酸2.4g，加入0.25ml100uM的EDTA水溶液，溶解于約300ml超純水中。上述溶液以0.2Pm水系膜過濾。濾過液中加入辛烷基磺酸鈉O.184g及乙腈50ml。超純水定容到500ml。流動相流速0.6ml/min，工作電極1:-150mV，工作電極2:450mV，工作電極3:500mV，工作電極4:550mV。5、標準液的配制以0.lmol/L高氯酸配標準品作為儲備液(100ug/ml)-80。C冰箱中保存。將儲備液稀釋至10ixg/ml作為稀釋液。將稀釋液配成系列濃渡作為標準液。用0.15mol/L的高氯權(含0.04呢焦亞硫酸鈉和0.04y。EDTA)作為工作19表9對小鼠腦內NE及5-HT、5-HIM含量的影響(X土SD)組別劑量NNE(ng/g腦重)5-HT(ng/g腦重)5-HIAA(ng/g腦重)對照組121228.3±218.2978.9±182.3271.9±33.6模型組12353.3±86.3##385.2±79.5##308.2±53.1氟西汀組5mg/kg11421.5±103.2562.3±92.7林264.0±55.7本發明貫葉連翹總黃酮片劑組60mg/kg13551.7±218.1*513.5±101.7**351.8土72.9本發明貫葉連翹總黃酮片劑組30mg/kg11505.9±153.4*455.6±97.1358.8±118.7本發明貫葉連翹總黃酮片劑組15mg/kg9434.6±58.8*396.5±84.3358.6±68.0注與對照組比較:絲PO.001;與模型組比較-*P<0.05,**P<0.01結果表明，在本實驗條件下，標準品的濃度在0-600ng/ml范圍內與峰面積之間有良好的線性關系。與對照組比較，小鼠皮下注射利血平后，中樞單胺類遞質耗竭，NE、5-HT等含量顯著降低(p<0.01)，5-HIAA含量有所升高；與模型組比較，鹽酸氟西汀組5-HT含量顯著增加；本發明貫葉連翹總黃酮片劑三個劑量組NE含量均有明顯增加(p<0.05);其中60mg/kg組5-HT含量亦顯著增加(p<0.01)，30mg/kg、15mg/kg組有增加趨勢；表明本發明貫葉連翹總黃酮片劑可明顯抑制利血平化效應引起的小鼠眼瞼下垂及自主活動減少，顯著增加腦內NE、5-HT的含量，對抑郁癥有治療作用。二、對小鼠失望和不動行為的影響實驗(一)試驗材料藥物本發明貫葉連翹總黃酮片劑，每片含貫葉連翹總黃酮150mg，北京大學中醫藥現代研究中心提供，批號20000901;鹽酸氟西汀膠囊(商品名奧麥倫)，200mg/粒，上海中西藥業股份有限公司生產，批號001001;試驗時以上藥物均配成所需濃度。動物ICR種小鼠，130只，雌雄各半，18-22g，由北京維通利華實驗動物技術發展有限公司提供，合格證號SCXK-11-00-0008。(二)實驗方法1、小鼠游泳絕望實驗動物放入水深10cm、直徑16cm的桶內，水溫保持在25'C。小鼠在游泳一段時間后因"失望"而漂浮不動，篩選出6min內不動時間在70-160s的小鼠，隨機分為5組，每組12只對照組，鹽酸氟西汀5mg/kg組，本發明貫葉連翹總黃酮片劑60mg/kg組，本發明貫葉連翹總黃酮片劑30mg/kg組。按20ml/kg體積灌胃給藥，每日一次，連續21日，未次給藥后60min同上法測定小鼠的不動時間。結果進行統計學處理。2、小鼠懸尾實驗小鼠隨機分為5組，每組14只對照組，鹽酸氟西汀5mg/kg組，本發明貫葉連翹總黃酮片劑60mg/kg組，本發明貫葉連翹總黃酮片劑30mg/kg組。按20ml/kg體積灌胃給藥，每日一次，連續21日，末次給藥后60min將小鼠尾端lcm的部位貼在自制木盒上，頭朝下，使小鼠前后左右均無攀抓的地方，一段時間后小鼠因失望而活動減少，記錄小鼠的不動時間。結果進行統計學處理。(三)實驗結果1、對小鼠游泳絕望的影響小鼠在初放入水桶內時，拼命游泳并試圖爬上桶壁，一段時間后，動物活動減弱，活動之間有較長時間的不動間歇，表現為身體微曲，保持垂直姿勢，鼻孔露出水面，并且間歇時間越來越長。與對照組比較，氟西汀組小鼠6min內不動時間明顯縮短(p0.05)，本發明貫葉連翹總黃酮片劑60mg/kg、30mg/kg小組小鼠6min內不動時間也明顯縮短(p<0.05)，結果見表IO。表明該藥有抗抑郁作用。表10對小鼠游泳絕望的影響(X土SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>注與對照組比較*p<0.052、對小鼠懸尾不動時間的影響與對照組比較，氟西汀組小鼠6min內不動時間明顯縮短(p<0.01),本發明貫葉連翹總黃酮片劑60mg/kg、30mg/kg組小鼠6min內不動時間也明顯縮短(p<0.050.01).見表ll。表明該藥有抗抑郁作用。表ll對小鼠懸尾不動對間的影響(X±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>注與對照組比較*P<0.05,**P<0.01(一)試驗材料藥物本發明貫葉連翹總黃酮片劑，每片含貫葉連翹總黃酮150mg，北京大學中醫藥現代研究中心提供，批號20000901;鹽酸氟西汀膠囊(商品名奧麥倫)，20mg/粒，上海中西藥業股份有限公司生產，批號001001;動物ICR種小鼠，50只，雌雄各半，18—22g，由北京維通利華試驗動物技術發展有限公司提供，合格證號SCXK—11一00""0008。儀器跳臺程序自動控制儀(TT—28型)中國醫學科學院藥物研究所生產。(二)試驗方法動物隨機分為5組，每組10只對照組，本發明貫葉連翹總黃酮片劑60mg/kg組，本發明貫葉連翹總黃酮片劑30mg/kg組，鹽酸氟西汀5mg/kg組。動物按20ml/kg體積灌胃給藥，對照組給予等量蒸餾水，每日一次，連續21日，試驗當日動物放入一底部裝有電流38V網柵的盒中，刺激10s，休息20s，30min內刺激10次，盒中無可逃避的環境，經處理后動物灌胃給予所試藥物，60min后如上法再進行試驗，但盒中放置可供動物逃避的平臺，記錄10s內不會跳上平臺的動物數，結果進行統計學處理。(三)試驗結果對照組經無法逃避的電刺激處理后，在隨后的可逃避條件下有86%小鼠表現為獲得性無助，嘶叫、掙扎、跳躍，但不會跳上平臺；鹽酸氟西汀組有65%表現為獲得性無助，與對照組比較發生率顯著降低(PO.01);本發明貫葉連翹總黃酮片劑60mg/kg、30mg/kg也有減輕獲得性無助的作用，與模型組比較有明顯差異(P<0.05~0.01);見表12。說明給小鼠灌胃本發明貫葉連翹總黃酮片劑后，可反轉獲得性無助的發生，表明該藥對抑郁癥有預防作用。表12對小鼠獲得性無助的影響(X2檢驗)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01四、對安鈉咖興奮作用的影響實驗(一)試驗材料1、藥物本發明貫葉連翹總黃酮片劑，每片含貫葉金絲桃總黃酮150mg，北京大學中醫藥現代研究中心提供，批號20000901;鹽酸氟西汀膠囊(商品名奧麥倫)，20mg/粒，上海中西藥業股份有限公司生產，批號001001;安鈉咖注射液，2ml:無水咖啡因0。248,苯甲酸0.268，上海信誼藥廠生產，批號950501。2、動物ICR種小鼠，72只，雌雄各半，18—22g，由北京維通利華實驗動物技術發展有限公司提供，合格證號SCXK-ll-00-0008。3、儀器小鼠自主活動測定儀型號Qh-l，清華大學生產。(二)實驗方法動物隨機分為6組，每組12只對照組，模型組，氟西汀5mg/kg組，本發明貫葉連翹總黃酮片劑10g生藥/kg組，本發明貫葉連翹總黃酮片劑5g生藥/kg組，本發明貫葉連翹總黃酮片劑2.5g生藥/kg組。動物按20ml/kg體積灌胃給藥，每日一次，連續21日，末次給藥后60min腹腔注射5-THP(10ml/kg)，記錄20min內各組出現震顫的動物數，結果進行統計學處理。(三)實驗結果腹腔注射安鈉咖20min后，模型組小鼠躁動，嘶叫，自主活動次數顯著多于對照組(PO.01);氟西汀組及本發明貫葉連翹總黃酮片劑三個劑量組小鼠自主活動次數與模型組比較也明顯減少(P<0.05~0.01)，見表13。說明本發明貫葉連翹總黃酮片劑可拮抗安鈉咖，顯著減少安鈉咖所致小鼠自主活動增加，表明該藥有抑制大腦皮層興奮的作用。表13對小鼠自主活動的影響(X土SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>注與對照組比較絲PO.01;與模型組比較*P<0.05，**P<0.01五、對小鼠睡眠的影響實驗(一)試驗材料藥物本發明貫葉連翹總黃酮片劑，每片含貫葉金絲桃總黃酮150mg,北京大學中醫藥現代研究中心提供，批號20000901;鹽酸氟西汀膠囊(商品名奧麥倫)，20mg/粒，上海中西藥業股份有限公司生產，批號001001;試驗時以上藥物均配成所需濃度，戊巴比妥鈉，化學純，佛山市化工實驗廠分裝，批號860901。動物ICR種小鼠，60只，雌雄各半，18—22g，由北京維通利華實驗動物技術發展有限公司提供，合格證號SCXK-11-00-0008。(二)實驗方法動物隨機分為5組，每組12只對照組，鹽酸氟西汀5mg/kg組，本發明貫葉連翹總黃酮片劑60mg/kg組，本發明貫葉連翹總黃酮片劑30mg/kg組，本發明貫葉連翹總黃酮片劑15mg/kg組。動物按20ml/kg體積灌胃給藥，每日一次，連續21日，末次給予開郁寧片后60mhi腹腔注射戊巴比妥鈉(60mg/kg)，動物翻正反射消失為入睡時間，從入睡至恢復翻正反射為睡眼時間，記錄結果進行統計學處理。(三)實驗結果與空白對照比較，對照藥氟西汀有明顯延長小鼠睡眠時間的作用(PO.01)，但無延長入睡時間的作用；本發明貫葉連翹總黃酮片劑60mg/kg劑量可明顯延長小鼠的睡眼時間(PO.05).。提示該藥有一定的鎮靜作用。表14對戊巴比妥鈉的協同作用(X士SD)組別劑量n入睡時間(s)睡眠時間(min)對照組12219.8±31.439.3±12.5氟西汀組5mg/kg12.228.6±29.481.7±11.7**本發明貫葉連翹總黃酮片劑組60mg/kg12221.2±17.658.4±23.0*本發明貫葉連翹總黃酮片劑組30mg/kg12223.7±30.550.8±23.8本發明貫葉連翹總黃酮片劑組15mg/kg12207.5±20.245.1±8.6注與對照組比較*P<0.05，**P<0.01六、對小鼠腦內單胺氧化酶的影響實驗(一)試驗材料藥物本發明貫葉連翹總黃酮片劑，每片含貫葉金絲桃總黃酮150mg，北京大學中醫藥現代研究中心提供，批號20000901;嗎氯貝胺片(商品名朗天)，150mg/粒，上海信誼百路達藥業有限公司生產，批號D000401;L-5-羥色胺酸，Sigma公司產品，試24驗當天配成20mg/ml。考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒，單胺氧化酶測定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供。動物ICR種小鼠，115只，雌雄各半，18"^22g，由北京維通利華實驗動物技術發展有限公司提供，合格證號SCXK-11-00-0008。(二)實驗方法1、對L-5羥色胺酸(5-HTP)所致小鼠震顫的影響動物隨機分為5組對照組，鹽酸氟西汀5mg/kg組,本發明貫葉連翹總黃酮片劑60mg/kg組，本發明貫葉連翹總黃酮片劑30mg/kg組，本發明貫葉連翹總黃酮片劑15mg/kg組。動物按20ml/kg體積灌胃給藥，每日一次，連續21日，末次給予藥物后60min腹腔注射5-HTP(200mg^g),記錄20min后小鼠出現震顫的只數，結果進行統計學處理(X2檢驗)。2、對小鼠腦內MAO活性的影響動物隨機分為5組對照組，嗎氯貝胺50mg/kg組，鹽酸氟西汀5mg/kg組，本發明貫葉連翹總黃酮片劑60mg/kg組，本發明貫葉連翹總黃酮片劑30mg/kg組，本發明貫葉連翹總黃酮片劑15mg/kg組。動物按20ml/kg體積灌胃給藥，每日一次，連續21日，末次給藥后60min小鼠斷頭、取腦，立即加入9倍冰冷的生理鹽水，勻漿器勻漿15s(11000轉/min)，離心機離心(4'C，3000rpm),取上清測定蛋白含量(雙縮尿法)及單胺氧化酶活性(比色法)。結果進行統計學處理(t檢驗)。(三)試驗結果l.對L-5羥色胺酸所致小鼠震顫的影響表15對L-5羥色胺酸所致小鼠震顫的影響組別劑量n震顫鼠數(只)對照組100嗎氯貝胺組5mg/kg1010**本發明貫葉連翹總黃酮片劑組60mg/kg139**本發明貫葉連翹總黃酮片劑組30mg/kg13本發明貫葉連翹總黃酮片劑組15mg/kg102注與對照組比較**P<0.01腹腔注射5-THP后20min內，對照組小鼠略顯懶動，肢體未出現震顫；嗎氯貝胺片組小鼠10只均在20tnin內出現晃頭、后肢外展、全身震顫等癥狀；本發明貫葉連翹總黃酮片劑三個劑量組也有部分動物出現了晃頭、震顫等表現，但幅度小于碼氯貝胺片組小鼠，其中60mg/kg組呈陽性反應的動物最多，與對照組比較有顯著性差異(P<0.01).2.對小鼠腦內MAO活性的影響灌胃給藥21天后，與對照組比較，嗎氯貝胺片組小鼠腦內MAO活性顯著降低(PO.01),開郁寧片60mg/kg組亦有相同作用(PO.01)。見表16。表明本發明貫葉連翹總黃酮片劑可引起小鼠刻板行為，經小鼠腦內MAO活性測定顯示開郁寧片可顯著降低小鼠腦內MAO活性，與嗎氯貝胺片有相似的作用。表16對小鼠腦內MAO活性的影響(X土SD)組別劑量nMAO(M/h/mgprot)對照組115.414±0.599嗎氯貝胺組5mg/kg123.837±0.941**本發明貫葉連翹總黃酮片劑組60mg/kg124.177±0.473**本發明貫葉連翹總黃酮片劑組30mg/kg124.949±0.729本發明貫葉連翹總黃酮片劑組15mg/kg125.361±1.113注與對照組比較**P<0.01七、鎮痛作用實驗(一)試驗材料藥物本發明貫葉連翹總黃酮片劑，每片含貫葉金絲桃總黃酮150mg，北京大學中醫藥現代研究中心提供，批號20000901;鹽酸氟西汀膠囊(商品名奧麥倫)，20mg/粒，上海中西藥業股份有限公司生產，批號001001;試驗時以上藥物均配成所需濃度；鹽酸哌替啶，50mg/ml，批號940428，試驗時生理鹽水配成0.5mg/ml;冰乙酸，北京化工廠，批號卯1212。動物ICR種小鼠，120只，雌雄各半，18—22g，由北京維通利華實驗動物技術發展有限公司提供，合格證號SCXK-11-00-0008。(二)實驗方法l.小鼠醋酸刺激法動物隨機分為5組，每組12只對照組，鹽酸氟西汀5mg/kg組，本發明貫葉連翹總黃酮片劑60mg/kg組，本發明貫葉連翹總黃酮片劑30mg/kg組，本發明貫葉連翹總黃酮片劑15mg/kg組。動物灌胃(20ml/kg)給藥21日，末次給藥后60min腹腔注射0.6%醋酸U0ml/kg),26觀察10min內動物扭體次數，以腹部收縮內陷、軀體扭曲、后肢伸展及蠕行等為陽性反應。結果進行統計學處理(t檢驗)1、小鼠尾電刺激法動物隨機分為6組，每組10只對照組，鹽酸哌替啶13mg/kg組，鹽酸氟西汀5mg/kg組，開郁寧片60mg/kg組，開郁寧片30mg/kg組，開郁寧片15mg/kg組。動物灌胃(20ml/kg)給藥每日一次，連續21天，按文獻方法，分別在藥后30、60min進行電刺激。記錄各組不引起嘶叫的動物數，求出各組鎮痛百分率，進行組間比較(X2檢驗)。(三)實驗結果小鼠醋酸剌激法實驗結果證實，與對照組比較，氟西汀組扭體次數顯著減少，疼痛反應顯著減輕(PO.01);本發明貫葉連翹總黃酮片劑60mg/kg、30mg/kg扭體次數也顯著減少(PO.Ol)，有明顯的止痛作用。表17對小鼠醋酸所致疼痛的影響(X土SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實驗例3本發明貫葉總黃酮制劑的制備工藝篩選實驗一、熱敏性成分損失小的對比實驗由于金絲桃素、槲皮素類成分遇熱很不穩定，水溶性很小，工藝中使用大孔樹脂進行純化，一方面以上成分水溶性很小，另一方面將提取物用水加熱溶解，工藝中加熱時溫度很高通常90。C以上，如以金絲桃素為指標，進行濃縮試驗溫度高于6(TC時為0.2%，當溫度低于6(TC以下時為0.35%,如果作為提取物后者是合格的，而前者是不合格的。為了證實工藝中相關有效成分的損失程度，本發明進行了如下對比試驗，1、稱取50克貫葉連翹提取物，直接加熱、水溶解放冷后過大孔吸附脂，2、f爾取50克貫葉連翹提取物、脫脂、乙酸乙脂萃取后，加熱、水溶解放冷后過大孔吸附脂，所得大孔洗脫部分與乙酸乙脂萃取部分混合后干燥、檢測。相關結果見表18。表18熱敏性成分損失小的對比實驗提純方法/有效成分金絲桃素(％)槲皮素(％)總黃酮(％)1、直接水溶純化0.060.4553.62、脫脂萃取后水溶純化0.84.278.2通過以上試驗檢測證實，脫脂、萃取后所含金絲桃素、槲皮素類成分明顯高于直接水溶純化后含量，而直接水溶部分金絲桃素含量很少或不含，總黃酮類成分明顯低于乙酸乙脂進行萃取后純化部分的含量。二、有效成分含量穩定的對比實驗提取物中金絲桃素、槲皮素類成分是不穩定性成分，水溶性很小，而工藝中黃酮類另一成分蘆丁，貫葉金絲桃苷在水中溶解性較好，在工藝中使用大孔樹脂進行純化，能將其進行純化分離，用水加熱溶解時通常較高的溫度對其影響不是很大。通過脫脂、萃取后有利于以上成分的溶出，通常所含金絲桃素、槲皮素受高溫影響而被分解、氧化而破壞，隨著時間的延長，損耗會越來越多，從而影響藥效，而使用乙酸乙脂可以避免以上的不足，并將其充分提取出來，從而保證了產品收率與質量。因此有必要對其進行分開提取，為了證實以上理論的可行性，特進行相關試驗如下1、稱取50克貫葉連翹提取物，直接加熱、水溶解放冷后過大孔吸附脂，2、稱取50克貫葉連翹提取物、脫脂、乙酸乙脂萃取后，加熱、水溶解放冷后過大孔吸附脂，所得大孔洗脫部分與乙酸乙脂萃取部分混合后干燥得成品、分別對以上所得提取物進行檢測，并計算收率。結果見表19。表19有效成分含量穩定的對比實驗提純方法/有效成分蘆丁(％)貫葉金絲桃甙(％)槲皮素(％)總黃酮(％)產品收率(％)1、直接水溶純化8.042.30.0748.3122、脫脂萃取后水溶純化9.43.23.9873.218.3通過以上試驗及檢測證實，采用脫脂及乙酸乙脂萃取等步驟的純化方法所得到的金絲桃素、槲皮素類成分明顯高于現有技術，而蘆丁、貫葉金絲桃苷黃酮類成分含量也有所提高，且總黃酮與產品收率明顯提高。三、產品收率高的對比實驗稱取五個批號的提取物分別進行對比試驗，1、每個批號稱取50克貫葉連翹提取物，直接加熱、水溶解放冷后過大孔吸附脂，2、每個批號稱取50克貫葉連翹提取物、脫脂、乙酸乙脂萃取后，加熱、水溶解放冷后過大孔吸附脂，所得大孔洗脫部分與乙酸乙脂萃取部分混合后干燥得成品，并計算收率。結果見表20。表20產品收率高的對比實驗<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>通過比試驗證實，與現有技術相比，采用脫脂及乙酸乙脂萃取等步驟的方法所得到的提取物收率明顯提高，且質量得到有效的保證。四、產品質量好的對比實驗本發明以產品所含總黃酮為檢測指標，稱取五個批號的提取物分別與現有工藝(即未采用脫脂及乙酸乙脂萃取等步驟的方法)進行對比試驗，1、每個批號稱取50克貫葉連翹提取物，直接加熱、水溶解放冷后過大孔吸附脂，2、每個批號稱取50克貫葉連翹提取物、脫脂、乙酸乙脂萃取后，加熱、水溶解放冷后過大孔吸附脂，所得大孔洗脫部分與乙酸乙脂萃取部分混合后干燥得成品，并計算總黃酮含量。結果見表21。表21產品質量好的對比實驗<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>從有效部位新藥研發的角度來看，以總黃酮為指標，可以看出直接水溶后純化即未采用脫脂及乙酸乙脂萃取等步驟的方法，所得到有效部位部分批號是不合格的，因此工藝得不到有效的保證，而采用本發明工藝(脫脂萃取后水溶純化方法)所生產出來的產品，所含的總黃酮均是合格的，因采用本發明工藝所得的產品質量明顯優于現有工藝。下述實施例均可實現上述實驗例的效果具體實施方式實施例1:常規方法制備得貫葉連翹總黃酮顆粒劑，進行HPLC指紋圖譜檢測-色譜條件漢邦C8色譜柱Kromasil,4.6腿X254線5um;Dikma預保護柱；檢測波長254nm;柱溫25。C;以乙腈為流動相A，以0.5%磷酸溶液為流動相B，A與B濃度之和為100%，進行梯度洗脫;030min,A-B的比例為15:85;3060min，A-B的比例由15:85線性變化到40:60;6080min，A-B的比例由40:60線性變化到100:0;8085min，A-B的比例由100:0線性變化到15:85;85100min，A-B的比例為15:85;進樣量lOul;對照品溶液制備單組分對照品溶液制備精密量取經五氧化二磷干燥48小時的對照品，用85%的甲醇溶解，各組分濃度分別為蘆丁0.3mg/ml，金絲桃苷0.3mg/ml，槲皮素0.3mg/ml的溶液；混合對照品溶液制備取單組分對照品溶液蘆丁3ml，金絲桃苷3ml，槲皮素3ml混合，加85%的甲醇稀釋到10ml備用；供試品溶液的制備取貫葉連翹總黃酮顆粒劑，研細，混勻，精密稱取日用劑量的10/9，置100ml具塞錐形瓶中，精密加入50。/。乙醇50ml，稱定總量，超聲處理15分鐘，冷卻至室溫，再稱定總量，用50%乙醇補足減失的總量，過濾，取續濾液2ml用50X乙醇定容至10ml，混勻，用0.45um微孔濾膜過濾，即得供試品溶液；精密吸取供試品溶液10ul，注入高效液相色譜儀即得HPLC圖譜；同時用對照品溶液進樣，確定蘆丁，金絲桃苷和槲皮素的出峰位置；測定結果為共計8個共有峰，其中第3個峰為金絲桃苷內參照峰，第2、3、4、7個峰為特征指紋峰；各個峰的相對保留時間依次分別為0.233、0.900、1.000、1.100、1.650、1.740、2.300、2.690，平均相對峰面積比依次分別為0.0082、0.1299、0.1074、0.089、0.0223、0.0174、0.136、0.0055。實施例2:貫葉連翹全草lkg粉碎后，用5kg的80。/。的乙醇提取，置于提取罐中，在回流狀態下提取1次，過濾得提取液將提取液控制溫度5(TC以下濃縮，至比重1.15噴霧干燥，得提取物將提取物用3kg的正已烷脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物將脫脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，將乙酸乙脂萃取液濃縮至比重1.32，得到主要含金絲桃素、槲皮素類成分的乙酸乙脂部分，即A部分將沉淀部分用水溶解，并同時揮發多余的有機溶劑，得水溶液部分；將水溶液部分充分放冷后，離心后上聚苯乙烯類弱極性大孔樹脂，流速為柱體積2倍純水用量為8倍柱體積進行水洗，水洗至顏色較淺，盡無色，用5倍柱體積的5%乙醇溶劑洗脫，至顏色較淺，即可停止加入；再用30—60%濃度的乙醇洗脫，并收集30—60%部分，將洗脫液濃縮得B部分將A部分和B部分混合，進行真空干燥，得貫葉連翹總黃酮；將貫葉連翹總黃酮加入常規輔料，按照常規工藝，制備成臨床接受的速崩片；HPLC指紋圖譜檢測；色譜條件漢邦Cw色譜柱；Dikma預保護柱；檢測波長240nm;柱溫15。C;以乙腈為流動相A，以0.5%磷酸溶液為流動相B，A與B濃度之和為100%,進行梯度洗脫；030min，A-B的比例為10:90;3060min，A-B的比例由10:90線性變化到50:50;6080min，A-B的比例由50:50線性變化到95:5;8085min，A-B的比例由95:5線性變化到10:90;85100min，A-B的比例為10:90;進樣量12ul;對照品溶液制備單組分對照品溶液制備精密量取經五氧化二磷干燥36小時的對照品，用70%的甲醇溶解，制成濃度分別為蘆丁0.4mg/ml，金絲桃苷0.2mg/ml，槲皮素0.4mg/ml的溶液；混合對照品溶液制備取單組分對照品溶液蘆丁2ral，金絲桃苷4ml，槲皮素2ml30混合，加95%的甲醇稀釋到12ml備用；供試品溶液的制備取貫葉連翹總黃酮速崩片，研細，混勻，精密稱取日用劑量的3/2，置100ml具塞錐形瓶中精密加入40W乙醇60ml，稱定總量，超聲處理10分鐘，冷卻至室溫，再稱定總量，用60%乙醇補足減失的總量，過濾，取續濾液lml用40W乙醇定容至15ml，混勻，用0.4um微孔濾膜過濾，即得供試品溶液，精密吸取供試品溶液15ul,注入高效液相色譜儀即得HPLC圖譜；同時用對照品溶液進樣，確定蘆丁，金絲桃苷和槲皮素的出峰位置；測定結果為共計8個共有峰，其中第3個峰為金絲桃苷內參照峰，第2、3、4、7個峰為特征指紋峰各個峰的相對保留時間依次分別為0.233、0.900、1.000、1.100、1.650、1.740、2.300、2.690，平均相對峰面積比依次分別為0.0082、0.1299、0.1074、0.089、0.0223、0.0174、0.136、0.0055。實施例3:貫葉連翹全草lkg切段后，用8kg的65。/。的乙醇提取，置于提取罐中，在回流狀態下提取2次，過濾得提取液將提取液控制溫度6(TC以下濃縮，至比重1.12噴霧干燥，得提取物將提取物用6kg的石油醚脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物將脫脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，將乙酸乙脂萃取液濃縮至比重1.25，得到主要含金絲桃素、槲皮素類成分的乙酸乙脂部分，即A部分將沉淀部分用水溶解，并同時揮發多余的有機溶劑，得水溶液部分；將水溶液部分充分放冷后，上聚苯乙烯類中極大孔樹脂，流速為柱體積4倍用純水5倍柱體積進行洗脫，至顏色較淺，盡無色，用5倍量柱體積的55%乙醇溶劑洗脫，至顏色較淺，即可停止加入；將醇濃度在30—60%之間的部分單獨收集，濃縮得B部分將A部分和B部分混合，進行噴霧干燥，得貫葉連翹總黃酮；將貫葉連翹總黃酮與微晶纖維素以1.6:l比例混勻，加入50%乙醇,制成軟材,制粒，再加入羧甲基淀粉鈉、硬酯酸鎂，壓片，包薄膜衣，即得薄膜衣片；HPLC指紋圖譜檢測；色譜條件漢邦C,8色譜柱Kromasi1,4.6ramX254mm，5um;Dikma預保護柱；檢測波長254nm;柱溫25°C;以乙腈為流動相A，以0.5%磷酸溶液為流動相B，A與B濃度之和為100%,進行梯度洗脫；030min，A-B的比例為15:85;3060min，A-B的比例由15:85線性變化到40:60;60~80min，A-B的比例由40:60線性變化到100:0;8085min，A-B的比例由100:0線性變化到15:85;85100min，A-B的比例為15:85;進樣量10lU;對照品溶液制備單組分對照品溶液制備精密量取經五氧化二磷干燥48小時的對照品，用85%的甲醇溶解，各組分濃度分別為蘆丁0.3mg/ml，金絲桃苷0.3mg/ml，槲皮素0.3mg/ml的溶液；混合對照品溶液制備取單組分對照品溶液蘆丁3ml，金絲桃苷3ral，槲皮素3ml混合，加85%的甲醇稀釋到10ml備用；供試品溶液的制備取貫葉連翹總黃酮薄膜衣片，研細，混勻，精密稱取日用劑量的10/9，置100ml具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50ml，稱定總量，超聲處理15分鐘，冷卻至室溫，再稱定總量，用50%乙醇補足減失的總量，過濾，取續濾液2ml用50X乙醇定容至10ml，混勻，用0.45um微孔濾膜過濾，即得供試品溶液；精密吸取供試品溶液10y1，注入高效液相色譜儀即得HPLC圖譜；同時用對照品溶液進樣，確定蘆丁，金絲桃苷和槲皮素的出峰位置；測定結果為共計8個共有峰，其中第3個峰為金絲桃苷內參照峰，第2、3、4、7個峰為特征指紋峰；各個峰的相對保留時間依次分別為0.233、0.900、1.000、1.100、1.650、1.740、2.300、2.690，平均相對峰面積比依次分別為0.0082、0.1299、0.1074、0.089、0.0223、0.0174、0.136、0.0055;質量檢測方法鑒別取貫葉連翹總黃酮薄膜衣片日用劑量的5/3，除去薄膜衣，研細，混勻，稱取日用劑量的1/9，加甲醇5ml，超聲提取15分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液；另取蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對照品，加甲醇制成每lml各含lmg的混合溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法(試驗，吸取上述兩種溶液各1^1，分別點于同一聚酰胺薄層板上，以50:1比例的乙醇一甲酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁溶液，吹干，置365nm紫外燈下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；含量測定A、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的含量測定色譜條件與系統適用性試驗用十八垸基硅垸鍵合硅膠為填充劑；流動相測定蘆丁、金絲桃苷以17:83比例的乙腈一0.5%磷酸水溶液為流動相，理論塔板數按蘆丁峰計算應不低于3000:測定槲皮素以36:64比例的乙腈——0.5%磷酸水溶液為流動相，理論塔板數按槲皮素峰計算應不低于3000，流速l.Oml/分鐘，檢測波長為254nm;對照品溶液的制備、精密稱取6(TC真空干燥3小時的蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對照品適量，加甲醇分別制成每lml含O.25mg的溶液，即得；供試品溶液的制備取貫葉連翹總黃酮薄膜衣片，除去薄膜衣，研細，混勻，精密稱取日用劑量的10/9，置100ml具塞錐形瓶中，精密加入50X乙醇50ml，稱定重量，超聲處理15分鐘，冷卻至室溫，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，上清液用0.45pm微孔濾膜濾過，即得；測定法精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5pl，注入液相色譜儀，測定，即得；32本貫葉連翹總黃酮薄膜衣片每日用劑量含蘆丁不得低于18.6mg，金絲桃苷不得低于12.9mg，槲皮素不得低于13.5mg,三者總含量不得低于51mg;B、黃酮的含量測定對照品溶液的制備精密稱取6(TC真空干燥3小時的蘆丁對照品25mg，置50ml量瓶中，加乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加乙醇稀釋至刻度，搖勻；吸取上述溶液20ml，置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得，每lml含戸丁O.20mg;標準曲線的制備精密量取上述對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分別置25ml量瓶中，各加水至6ml，力B5%亞硝酸鈉溶液lml，使混勻，放置6分鐘，加10%硝酸鋁lml，混勻，放置6分鐘，加lmol/L比氫氧化鈉試液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘以相應的溶劑為空白；照分光光度法，在500nm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標、濃度為橫坐標，繪制標準曲線；測定法精密量取高效液相色譜法中的供試品溶液lml，置10ml量瓶中，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述溶液lml，置25ml量瓶中，照標準曲線制備項下的方法，自"加水至6ml"起，依法測定吸收度，得吸收度A!;再精密量取高效液相色譜法中的供試品溶液lml，以lml水代替10X硝酸鋁，按上述方法制備供試品溶液，依法測定吸收度，得吸收度A2;以不加供試品的相應溶液作空白；按下式計算供試品的吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的濃度，計算，即得；供試品的吸收度A-A^A2;本貫葉連翹總黃酮薄膜衣片每日用劑量含總黃酮以戶丁干燥品計不得低于240mg。實施例4:貫葉連翹全草lkg粉碎后，用12kg的40。/。的甲醇提取，置于提取罐中，在回流狀態下提取3次，過濾得提取液將提取液控制溫度70'C以下濃縮，至比重1.08噴霧干燥，得提取物將提取物用3kg的石油醚脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物將脫脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，將乙酸乙脂萃取液濃縮至比重1.18，得到主要含金絲桃素、槲皮素類成分的乙酸乙脂部分，即A部分將沉淀部分用水溶解，并同時揮發多余的有機溶劑，得水溶液部分；將水溶液部分充分放冷后，過濾后上聚苯乙烯類弱極性大孔樹脂，流速為柱體積5倍純水用量為3倍柱體積進行水洗，水洗至顏色較淺，盡無色，用8倍柱體積的20%乙醇溶劑洗脫，至顏色較淺，即可停止加入；再用30—60%濃度的乙醇洗脫，并收集30—60%部分，將洗脫液濃縮得B部分將A部分和B部分混合，進行真空干燥，得貫葉連翹總黃酮；將貫葉連翹總黃酮加入常規輔料，按照常規工藝，制備成臨床接受的膠囊劑；33HPLC指紋圖譜檢測；色譜條件漢邦Cw色譜柱Kromasil,4.6mraX254mm，5um;Dikma預保護柱；檢測波長254nm;柱溫35。C;以乙腈為流動相A，以0.2%磷酸溶液為流動相B，A與B濃度之和為100%，進行梯度洗脫；030min，A-B的比例為10:90;3060min，A-B的比例由10:90線性變化到50:50;6080min，A-B的比例由50:50線性變化到95:5;8085min，A-B的比例由95:5線性變化到10:90;85100min，A-B的比例為10:90;進樣量12lil;對照品溶液制備單組分對照品溶液制備精密量取經五氧化二磷干燥48小時的對照品，用85%的甲醇溶解，各組分濃度分別為蘆丁0.3mg/ml，金絲桃苷0.3mg/ml，槲皮素0.3mg/ml的溶液；混合對照品溶液制備取單組分對照品溶液蘆丁3ml，金絲桃苷3ml，槲皮素3ml混合，加85%的甲醇稀釋到10ml備用；供試品溶液的制備取貫葉連翹總黃酮膠囊劑，研細，混勻，精密稱取日用劑量的10/9，置100ml具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50ml，稱定總量，超聲處理15分鐘，冷卻至室溫，再稱定總量，用50%乙醇補足減失的總量，過濾，取續濾液2ml用50X乙醇定容至10ml，混勻，用0.45ixm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液；精密吸取供試品溶液10ul，注入高效液相色譜儀即得HPLC圖譜；同時用對照品溶液進樣，確定蘆丁，金絲桃苷和槲皮素的出峰位置；測定結果為共計8個共有峰，其中第3個峰為金絲桃苷內參照峰，第2、3、4、7個峰為特征指紋峰；各個峰的相對保留時間依次分別為0.233、0.900、1.000、1.100、1.650、1.740、2.300、2.690，平均相對峰面積比依次分別為0.0082、0.1299、0.1074、0.089、0.0223、0.0174、0.136、0.0055;質量檢測方法含量測定A、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的含量測定色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基硅垸鍵合硅膠為填充劑；流動相測定蘆丁、金絲桃苷以17:83比例的乙腈一0.5%磷酸水溶液為流動相，理論塔板數按蘆丁峰計算應不低于3000:測定槲皮素以36:64比例的乙腈——0.5%磷酸水溶液為流動相，理論塔板數按槲皮素峰計算應不低于3000，流速l.Oml/分鐘，檢測波長為254nm;對照品溶液的制備'精密稱取60'C真空干燥3小時的蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對照品適量，加甲醇分別制成每lml含O.25mg的溶液，即得；供試品溶液的制備取貫葉連翹總黃酮膠囊劑，研細，混勻，精密稱取日用劑量的10/9，置100ml具塞錐形瓶中，精密加入50X乙醇50ml，稱定重量，超聲處理15分鐘，冷卻至室溫，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，上清液用0.45pm微孔濾膜濾過，即得；測定法精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5nl，注入液相色譜儀，測定，即得；本貫葉連翹總黃酮膠囊劑每日用劑量含蘆丁不得低于18.6mg，金絲桃苷不得低于12.9mg，槲皮素不得低于13.5mg，三者總含量不得低于51mg;B、黃酮的含量測定對照品溶液的制備精密稱取60'C真空干燥3小時的蘆丁對照品25mg，置50ml量瓶中，加乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加乙醇稀釋至刻度，搖勻；吸取上述溶液20ml，置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得，每lml含盧丁O.20tng;標準曲線的制備精密量取上述對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分別置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5%亞硝酸鈉溶液lml，使混勻，放置6分鐘，加10%硝酸鋁lml，混勻，放置6分鐘，力Blmol/L比氫氧化鈉試液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘以相應的溶劑為空白；照分光光度法，在500nm的被長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標、濃度為橫坐標，繪制標準曲線；測定法精密量取高效液相色譜法中的供試品溶液lml，置10ml量瓶中，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述溶液lml，置25ml量瓶中，照標準曲線制備項下的方法，自"加水至6ml"起，依法測定吸收度，得吸收度A!;再精密量取高效液相色譜法中的供試品溶液lml，以lml水代替10X硝酸鋁，按上述方法制備供試品溶液，依法測定吸收度，得吸收度A2;以不加供試品的相應溶液作空白；按下式計算供試品的吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的濃度，計算，即得；供試品的吸收度A=A1-A2;本貫葉連翹總黃酮膠囊劑每日用劑量含總黃酮以蘆丁干燥品計不得低于240mg。實施例5:貫葉連翹全草lkg切段后，用5kg的80。/。的乙醇提取，置于提取罐中，在回流狀態下提取1次，過濾得提取液將提取液控制溫度50'C以下濃縮，至比重1.15噴霧干燥，得提取物將提取物用3kg的正已烷脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物將脫脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，將乙酸乙脂萃取液濃縮至比重1.32，得到主要含金絲桃素、槲皮素類成分的乙酸乙脂部分，即A部分將沉淀部分用水溶解，并同時揮發多余的有機溶劑，得水溶液部分；將水溶液部分充分放冷后，過濾后上聚苯乙烯類中極大孔樹脂，流速為柱體積2倍純水用量為8倍柱體積進行水洗，水洗至顏色較淺，盡無色，用5倍柱體積的5%乙醇溶劑洗脫，至顏色較淺，即可停止加入；再用30—60%濃度的乙醇洗脫，并收集30—60%部分，將洗脫液濃縮得B部分將A部分和B部分混合，進行噴霧干燥，得貫葉連翹總黃酮；將貫葉連翹總黃酮與微晶纖維素以2:l比例混勻，加入45%乙醇，制成軟材，制粒，再加入羧甲基淀粉鈉、微粉硅膠，壓片，包薄膜衣，即得分散片；HPLC指紋圖譜檢測；色譜條件:漢邦ds色譜柱;Dikma預保護柱;檢測波長260nm;柱溫15'C;以乙腈為流動相A，以0.8%磷酸溶液為流動相B，A與B濃度之和為100%,進行梯度洗脫；030min，A-B的比例為20:80;3060min，A-B的比例由20:80線性變化到30:70;6080min，A-B的比例由30:70線性變化到90:10;8085min，A-B的比例由90:10線性變化到20:80;85100min，A-B的比例為20:80;進樣量8ul;對照品溶液制備單組分對照品溶液制備精密量取經五氧化二磷干燥36小時的對照品，用95%的甲醇溶解，制成濃度分別為蘆丁0.4mg/ml，金絲桃苷0.2mg/ml，槲皮素0.4mg/ml的溶液；混合對照品溶液制備取單組分對照品溶液蘆丁2ml，金絲桃苷4ml，槲皮素2ml混合，加70%的甲醇稀釋到12ml備用；供試品溶液的制備取貫葉連翹總黃酮分散片，研細，混勻，精密稱取日用劑量的1/2，置100ml具塞錐形瓶中精密加入6(^乙醇40ml，稱定總量，超聲處理20分鐘，冷卻至室溫，再稱定總量，用40%乙醇補足減失的總量，過濾，取續濾液3ml用40X乙醇定容至15ml，混勻，用0.4um微孔濾膜過濾，即得供試品溶液，精密吸取供試品溶液15ul，注入高效液相色譜儀即得HPLC圖譜；同時用對照品溶液進樣，確定蘆丁，金絲桃苷和槲皮素的出峰位置；測定結果為共計8個共有峰，其中第3個峰為金絲桃苷內參照峰，第2、3、4、7個峰為特征指紋峰；各個峰的相對保留時間依次分別為0.233、0.900、1.000、1.100、1.650、1.740、2.300、2.690，平均相對峰面積比依次分別為0.0082、0.1299、0.1074、0.089、0-0223、0.0174、0.136、0.0055;質量檢測方法鑒別取貫葉連翹總黃酮分散片日用劑量的5/3，除去薄膜衣，研細，混勻，稱取日用劑量的1/9，加甲醇5ml，超聲提取15分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液；另取蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對照品，加甲醇制成每lml各含lmg的混合溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法(試驗，吸取上述兩種溶液各1^1，分別點于同一聚酰胺薄層板上，以50:1比例的乙醇一甲酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁溶液，吹干，置365nm紫外燈下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。實施例6:貫葉連翹全草lkg粉碎后，用8kg的65。/。的乙醇提取，置于提取罐中，在回流狀態下提取2次，過濾得提取液將提取液控制溫度60'C以下濃縮，至比重1.12噴霧干燥，得提取物將提取物用6kg的石油醚脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物將脫脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，將乙酸乙脂萃取液濃縮至比重1.25，得到主要含金絲桃素、槲皮素類成分的乙酸乙脂部分，即A部分將沉淀部分用水溶解，并同時揮發多余的有機溶劑，得水溶液部分；將水溶液部分充分放冷后，上中極大孔樹脂，流速為柱體積4倍用純水5倍柱體積進行洗脫，至顏色較淺，盡無色，用5倍量柱體積的55%乙醇溶劑洗脫，至顏色較淺，即可停止加入；將醇濃度在30—60%之間的部分單獨收集，濃縮得B部分將A部分和B部分混合，進行噴霧干燥，得貫葉連翹總黃酮；將貫葉連翹總黃酮與植物油以l:2比例混勻，以明膠加入適量甘油、著色劑為軟膠囊殼、用軟膠囊機壓制成軟膠囊；含量測定-A、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的含量測定色譜條件與系統適用性試驗用十八垸基硅垸鍵合硅膠為填充劑；流動相測定蘆丁、金絲桃苷以17:83比例的乙腈一0.5%磷酸水溶液為流動相，理論塔板數按蘆丁峰計算應不低于3000:測定槲皮素以36:64比例的乙腈——0.5%磷酸水溶液為流動相，理論塔板數按槲皮素峰計算應不低于3000，流速l.Oml/分鐘，檢測波長為254nm;對照品溶液的制備'精密稱取6(TC真空干燥3小時的蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對照品適量，加甲醇分別制成每lml含O.25mg的溶液，即得；供試品溶液的制備取貫葉連翹總黃酮軟膠囊，除去囊殼，混勻，精密稱取日用劑量的10/6,置100ml具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50ml，稱定重量，超聲處理15分鐘，冷卻至室溫，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，上清液用0.45pm微孔濾膜濾過，即得；測定法精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5pl，注入液相色譜儀，測定，即得；本貫葉連翹總黃酮軟膠囊每日用劑量含蘆丁不得低于18.6mg，金絲桃苷不得低于12.9mg，槲皮素不得低于13.5mg，三者總含量不得低于51mg;B、黃酮的含量測定對照品溶液的制備精密稱取60。C真空干燥3小時的蘆丁對照品25mg，置50ml量瓶中，加乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加乙醇稀釋至刻度，搖勻；吸取上述溶液20ml，置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得，每lml含蘆丁O.20mg;標準曲線的制備精密量取上述對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分別置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5%亞硝酸鈉溶液lml，使混勻，放置6分鐘，力口10。/a肖酸鋁lml，混勻，放置6分鐘，加lmol/L比氫氧化鈉試液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘以相應的溶劑為空白；照分光光度法，在500nm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標、濃度為橫坐標，繪制標準曲線；測定法:精密量取高效液相色譜法中的供試品溶液lml，置10ml量瓶中，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述溶液lml，置25ml量瓶中，照標準曲線制備項下的方法，自"加水至6ml"起，依法測定吸收度，得吸收度Au再精密量取高效液相色譜法中的供試品溶液lml，以lml水代替10X硝酸鋁，按上述方法制備供試品溶液，依法測定吸收度，得吸收度A2;以不加供試品的相應溶液作空白；按下式計算供試品的吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的濃度，計算，即得；供試品的吸收度A=ArA2;本貫葉連翹總黃酮軟膠囊每日用劑量含總黃酮以戸丁干燥品計不得低于240mg。實施例7:貫葉連翹總黃酮由以下方法制成緩釋膠囊劑后，進行如下質量檢測貫葉連翹全草lkg切段后，用10kg的70。/。的乙醇提取，置于提取罐中，在回流狀態下提取1次，過濾得提取液將提取液控制溫度50'C以下濃縮，至比重1.15噴霧干燥，得提取物將提取物用3kg的正已烷脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物將脫脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，將乙酸乙脂萃取液濃縮至比重1.32，得到主要含金絲桃素、槲皮素類成分的乙酸乙脂部分，即A部分將沉淀部分用水溶解，并同時揮發多余的有機溶劑，得水溶液部分；將水溶液部分充分放冷后，過濾后上聚苯乙烯類中極大孔樹脂，流速為柱體積2倍純水用量為8倍柱體積進行水洗，水洗至顏色較淺，盡無色，用5倍柱體積的5%乙醇溶劑洗脫，至顏色較淺，即可停止加入；再用30_60%濃度的乙醇洗脫，并收集30—60%部分，將洗脫液濃縮得B部分將A部分和B部分混合，進行噴霧干燥，得貫葉連翹總黃酮；將貫葉連翹總黃酮與微晶纖維素以2:l比例混勻，加入45%乙醇，制成軟材，制粒，所得顆粒包緩釋蒗薄膜衣后，加入適量硬脂酸鎂填充膠囊，即得緩釋膠囊；鑒別取貫葉連翹總黃酮緩釋膠囊劑日用劑量的5/3，研細，混勻，稱取日用劑量的1/9，加甲醇5ml，超聲提取15分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液；另取蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對照品，加甲醇制成每lml各含lmg的混合溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法(試驗，吸取上述兩種溶液各1^1，分別點于同一聚酰胺薄層板上，以50:1比例的乙醇一甲酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁溶液，吹干，置365nm紫外燈下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；含量測定為蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的含量測定38色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相測定蘆丁、金絲桃苷以17:83比例的乙腈一0.5%磷酸水溶液為流動相，理論塔板數按蘆丁峰計算應不低于3000:測定槲皮素以36:64比例的乙腈——0.5%磷酸水溶液為流動相，理論塔板數按槲皮素峰計算應不低于3000，流速l.Oml/分鐘，檢測波長為254nm;對照品溶液的制備、精密稱取60。C真空干燥3小時的蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對照品適量，加甲醇分別制成每lml含O.25mg的溶液，即得；供試品溶液的制備取貫葉連翹總黃酮緩釋膠囊劑，研細，混勻，精密稱取日用劑量的10/9，置100ml具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50ml，稱定重量，超聲處理15分鐘，冷卻至室溫，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，上清液用0.45Mm微孔濾膜濾過，即得；測定法精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5pl，注入液相色譜儀，測定，即得；本貫葉連翹總黃酮膠囊劑每日用劑量含蘆丁不得低于18.6mg，金絲桃苷不得低于12.9mg，槲皮素不得低于13.5mg，三者總含量不得低于51mg。實施例8:貫葉連翹全草lkg切段后，用5kg的80%的乙醇提取，置于提取罐中，在回流狀態下提取1次，過濾得提取液將提取液控制溫度5(TC以下濃縮，至比重1.15噴霧干燥，得提取物將提取物用3kg的石油醚脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物將脫脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，將乙酸乙脂萃取液濃縮至比重1.32，得到主要含金絲桃素、槲皮素類成分的乙酸乙脂部分，即A部分將沉淀部分用水溶解，并同時揮發多余的有機溶劑，得水溶液部分；將水溶液部分充分放冷后，過濾后上聚苯乙烯類弱極性大孔樹脂，流速為柱體積2倍純水用量為8倍柱體積進行水洗，水洗至顏色較淺，盡無色，用5倍柱體積的5%乙醇溶劑洗脫，至顏色較淺，即可停止加入；再用30—60%濃度的乙醇洗脫，并收集30—60%部分，將洗脫液濃縮得B部分將A部分和B部分混合，進行真空干燥，得貫葉連翹總黃酮；將貫葉連翹總黃酮加入常規輔料，按照常規工藝，制備成臨床接受的顆粒劑。實施例9:貫葉連翹全草lkg粉碎后，用12kg的40。/。的乙醇提取，置于提取罐中，在回流狀態下提取3次，過濾得提取液將提取液控制溫度7(TC以下濃縮，至比重1.08噴霧干燥，得提取物將提取物用8kg的正已垸脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物將脫脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，將乙酸乙脂萃取液濃縮至比重1.18，得到主要含金絲桃素、槲皮素類成分的乙酸乙脂部分，即A部分將沉淀部分用水溶解，并同時揮發多余的有機溶劑，得水溶液部分；將水溶液部分充分放冷后，過濾后上聚苯乙烯類中極大孔樹脂，流速為柱體積5倍純水用量為3倍柱體積進行水洗，水洗至顏色較淺，盡無色，用8倍柱體積的20%乙醇溶劑洗脫，至顏色較淺，即可停止加入；再用30—60%濃度的乙醇洗脫，并收集30—60%部分，將洗脫液濃縮得B部分將A部分和B部分混合，進行真空干燥，得貫葉連翹總黃酮；將貫葉連翹總黃酮與微晶纖維素以2.5:l比例混勻，加入55%乙醇，制成軟材，制粒，再加入常規輔料，壓片，包薄膜衣，即得片劑。實施例10:貫葉連翹全草lkg切段后，用8kg的65。/。的乙醇提取，置于提取罐中，在回流狀態下提取2次，過濾得提取液將提取液控制溫度6(TC以下濃縮，至比重1.12噴霧干燥，得提取物將提取物用6kg的石油醚脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物將脫脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，將乙酸乙脂萃取液濃縮至比重1.25，得到主要含金絲桃素、槲皮素類成分的乙酸乙脂部分，即A部分將沉淀部分用水溶解，并同時揮發多余的有機溶劑，得水溶液部分；將水溶液部分充分放冷后，上中極大孔樹脂，流速為柱體積4倍用純水5倍柱體積進行洗脫，至顏色較淺，盡無色，用5倍量柱體積的55%乙醇溶劑洗脫，至顏色較淺，即可停止加入；將醇濃度在30—60%之間的部分單獨收集，濃縮得B部分將A部分和B部分混合，進行真空干燥，得貫葉連翹總黃酮；將貫葉連翹總黃酮與微晶纖維素以1.6:1比例混勻，加入50%乙醇，制成軟材，制粒，再加入羧甲基淀粉鈉、硬酯酸鎂，滑石粉，壓片，包薄膜衣，即得片劑。實施例ll:貫葉連翹全草lkg切段后，用5kg的80。/。的乙醇提取，置于提取罐中，在回流狀態下提取1次，過濾得提取液將提取液控制溫度50'C以下濃縮，至比重1.15噴霧干燥，得提取物將提取物用3kg的石油醚脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物將脫脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，將乙酸乙脂萃取液濃縮至比重1.32，得到主要含金絲桃素、槲皮素類成分的乙酸乙脂部分，即A部分將沉淀部分用水溶解，并同時揮發多余的有機溶劑，得水溶液部分；將水溶液部分充分放冷后，過濾后上聚苯乙烯類弱極性大孔樹脂，流速為柱體積2倍純水用量為8倍柱體積進行水洗，水洗至顏色較淺，盡無色，用5倍柱體積的5%乙醇溶劑洗脫，至顏色較淺，即可停止加入；再用30—60%濃度的乙醇洗脫，并收集30—60%部分，將洗脫液濃縮得B部分將A部分和B部分混合，進行真空干燥，得貫葉連翹總黃酮。實施例12:貫葉連翹全草lkg粉碎后，用12kg的40。/。的乙醇提取，置于提取罐中，在回流狀態下提取3次，過濾得提取液將提取液控制溫度7(TC以下濃縮，至比重1.08噴霧干燥，得提取物將提取物用8kg的正已烷脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物將脫脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，將乙酸乙脂萃取液濃縮至比重1.18，得到主要含金絲桃素、槲皮素類成分的乙酸乙脂部分，即A部分將沉淀部分用水溶解，并同時揮發多余的有機溶劑，得水溶液部分；將水溶液部分充分放冷后，過濾后上聚苯乙烯類中極大孔樹脂，流速為柱體積5倍純水用量為3倍柱體積進行水洗，水洗至顏色較淺，盡無色，用8倍柱體積的20%乙醇溶劑洗脫，至顏色較淺，即可停止加入；再用30—60%濃度的乙醇洗脫，并收集30—60%部分，將洗脫液濃縮得B部分-將A部分和B部分混合，進行真空干燥，得貫葉連翹總黃酮。實施例13:貫葉連翹全草lkg切段后，用8kg的65。/。的乙醇提取，置于提取罐中，在回流狀態下提取2次，過濾得提取液將提取液控制溫度6(TC以下濃縮，至比重1.12噴霧干燥，得提取物將提取物用6kg的石油醚脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物將脫脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，將乙酸乙脂萃取液濃縮至比重1.25，得到主要含金絲桃素、槲皮素類成分的乙酸乙脂部分，即A部分將沉淀部分用水溶解，并同時揮發多余的有機溶劑，得水溶液部分；將水溶液部分充分放冷后，上中極大孔樹脂，流速為柱體積4倍用純水5倍柱體積進行洗脫，至顏色較淺，盡無色，用5倍量柱體積的55%乙醇溶劑洗脫，至顏色較淺，即可停止加入；將醇濃度在30—60%之間的部分單獨收集，濃縮得B部分將A部分和B部分混合，進行真空干燥，得貫葉連翹總黃酮。權利要求1、一種貫葉連翹總黃酮，其特征在于該貫葉連翹總黃酮是由如下方法制備的貫葉連翹全草粉碎或切段后，用5-12倍重量份的40-80％的乙醇或甲醇提取，置于提取罐中，在回流狀態下提取1-3次，過濾得提取液將提取液控制溫度50-70℃以下濃縮，至比重1.08-1.15噴霧干燥，得提取物將提取物用3-8倍重量份的石油醚或正己烷脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物將脫脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，將乙酸乙脂萃取液濃縮至比重1.18-1.32，得到主要含金絲桃素、槲皮素類成分的乙酸乙脂部分，即A部分將沉淀部分用水溶解，并同時揮發多余的有機溶劑，得水溶液部分；將水溶液部分充分放冷后，離心或過濾后上聚苯乙烯類弱極性或中極大孔樹脂，流速為柱體積2-5倍純水用量為3-8倍柱體積進行水洗，水洗至顏色較淺，盡無色，用3-8倍柱體積的5-20％乙醇溶劑洗脫，至顏色較淺，即可停止加入；再用30-60％濃度的乙醇洗脫，并收集30-60％部分，將洗脫液濃縮得B部分將A部分和B部分混合，進行真空或噴霧干燥，得貫葉連翹總黃酮。2、如權利要求1所述的貫葉連翹總黃酮，其特征在于該貫葉連翹總黃酮是由如下方法制備的貫葉連翹全草粉碎或切段后，用8倍重量份的65%的乙醇提取，置于提取罐中，在回流狀態下提取2次，過濾得提取液將提取液控制溫度6(TC以下濃縮，至比重1.12噴霧干燥，得提取物將提取物用6倍重量份的石油醚或正已烷脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物將脫脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，將乙酸乙脂萃取液濃縮至比重1.25，得到主要含金絲桃素、槲皮素類成分的乙酸乙脂部分，即A部分將沉淀部分用水溶解，并同時揮發多余的有機溶劑，得水溶液部分；將水溶液部分充分放冷后，上聚苯乙烯類弱極性或中極大孔樹脂，流速為柱體積4倍用純水5倍柱體積進行洗脫，至顏色較淺，盡無色，用5倍量柱體積的55%乙醇溶劑洗脫，至顏色較淺，即可停止加入；將醇濃度在30—60%之間的部分單獨收集，濃縮得B部分將A部分和B部分混合，進行真空或噴霧干燥，得貫葉連翹總黃酮。3、如權利要求1-2任一所述的貫葉連翹總黃酮制成的制劑，其特征在于取貫葉連翹總黃酮，加入常規輔料，按照常規工藝，制備成臨床接受的膠囊劑、滴丸劑、顆粒劑、片劑、軟膠囊劑或緩釋劑。4、如權利要求3所述的貫葉連翹總黃酮制成的制劑的質量檢測方法，其特征在于包括如下HPLC指紋圖譜色譜條件漢邦U色譜柱；Dikma預保護柱;檢測波長240-260nm;柱溫15-35。C;以乙腈為流動相A，以0.1-1.0%磷酸溶液為流動相B，A與B濃度之和為100%，進行梯度洗脫；030min，流動相中A的比例為5-25%;3060min，流動相中A的比例由5-25%線性變化到30-50%;6080min，流動相中A的比例由30-50%線性變化到90-100%;8085min，流動相中A的比例由90-100%線性變化到5-25%;85100min，流動相中A的比例為5-25%;進樣量8-12iU;對照品溶液制備單組分對照品溶液制備精密量取經五氧化二磷干燥36-54小時的對照品適量，用70-95%甲醇溶解，制成濃度分別為蘆丁0.2-0.4mg/ml，金絲桃苷0.2-0.4mg/ml，槲皮素0.2-0.4mg/ml的溶液；混合對照品溶液制備精密量取單組分對照品溶液蘆丁2-4ml，金絲桃苷2-4ml，槲皮素2-4ml混合，置10ral量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得；供試品溶液的制備取貫葉連翹總黃酮制劑，研細，混勻，精密稱取日用劑量的1/2-3/2，置100ml具塞錐形瓶中，精密加入40-60%乙醇40-60ml,稱定總量，超聲處理10-20分鐘，冷卻至室溫，再稱定總量，用40-60%乙醇補足減失的總量，過濾，精密量取續濾液1-3ml，置10ml量瓶中，加40-60%乙醇至刻度，混勻，用0.35-0.55um微孔濾膜過濾，即得供試品溶液，精密吸取供試品溶液5-15nl，注入高效液相色譜儀，即得HPLC圖譜；同時用對照品溶液進樣，確定蘆丁，金絲桃苷和槲皮素的出峰位置；測定結果為共計8個共有峰，其中第3個峰為金絲桃苷內參照峰，第2、3、4、7個峰為特征指紋峰；各個峰的相對保留時間依次分別為0.233、0.900、1.000、1.100、1.650、1.740、2.300、2.690，平均相對峰面積比依次分別為0.0082、0.1299、0.1074、0.089、0.0223、0.0174、0.136、0.0055。5、如權利要求4所述的貫葉連翹總黃酮制成的制劑的質量檢測方法，其特征在于包括如下HPLC指紋圖譜色譜條件漢邦d8色譜柱Kromasil，4.6咖X254咖，5"m;Dikma預保護柱；檢測波長254nm;柱溫25°C;以乙腈為流動相A，以0.5%磷酸溶液為流動相B，A與B濃度之和為100%，進行梯度洗脫;030min,A-B的比例為15:85;3060min，A-B的比例由15:85線性變化到40:60;6080min，A-B的比例由40:60線性變化到100:0;8085min，A-B的比例由100:0線性變化到15:85;85100min，A-B的比例為15:85;進樣量10Ul;對照品溶液制備單組分對照品溶液制備精密量取經五氧化二磷干燥48小時的對照品適量，以85%甲醇溶解，各組分濃度分別為蘆丁0.3mg/ml，金絲桃苷0.3mg/ml，槲皮素0.3mg/ml的溶液；混合對照品溶液制備精密量取單組分對照品溶液戸丁3ml，金絲桃苷3ml，槲皮素3ml混合，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得；供試品溶液的制備取貫葉連翹總黃酮制劑，研細，混勻，精密稱取日用劑量的10/9，置100ml具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50ml，稱定總量，超聲處理15分鐘，冷卻至室溫，再稱定總量，用50%乙醇補足減失的總量，過濾，精密量取續濾液2ml，置10ml量瓶中，加50%乙醇至刻度，混勻，用0.45"m微孔濾膜過濾，即得供試品溶液；精密吸取供試品溶液10iU，注入高效液相色譜儀即得HPLC圖譜；同時用對照品溶液進樣，確定蘆丁，金絲桃苷和槲皮素的出峰位置；測定結果為共計8個共有峰，其中第3個峰為金絲桃苷內參照峰，第2、3、4、7個峰為特征指紋峰；各個峰的相對保留時間依次分別為0.233、0.900、1.000、1.100、1.650、1.740、2.300、2.690，平均相對峰面積比依次分別為0.0082、0.1299、0.1074、0.089、0.0223、0.0174、0.136、0.0055。6、如權利要求4所述的貫葉連翹總黃酮制成的制劑的質量檢測方法，其特征在于包括如下HPLC指紋圖譜色譜條件漢邦Cw色譜柱；Diktna預保護柱；檢測波長240nm;柱溫35°C;以乙腈為流動相A，以0.2%磷酸溶液為流動相B，A與B濃度之和為100%，進行梯度洗脫；030min，A-B的比例為10:90;3060min，A-B的比例由10:90線性變化到50:50;6080min，A-B的比例由50:50線性變化到95:5;8085min，A-B的比例由95:5線性變化到10:90;85100min，A-B的比例為10:90;進樣量12y1;對照品溶液制備單組分對照品溶液制備精密量取經五氧化二磷干燥36小時的對照品適量，以70%甲醇溶解，制成濃度分別為蘆丁0.4mg/ml，金絲桃苷0.2mg/ral，槲皮素0.4mg/ml的溶液；混合對照品溶液制備取單組分對照品溶液蘆丁2ml，金絲桃苷4ml，槲皮素2ml混合，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得；供試品溶液的制備取貫葉連翹總黃酮制劑，研細，混勻，精密稱取日用劑量的3/2，置100ml具塞錐形瓶中精密加入40%乙醇60ml，稱定總量，超聲處理10分鐘，冷卻至室溫，再稱定總量，用40%乙醇補足減失的總量，過濾，精密量取續濾液lml，置10ral量瓶中，加40%乙醇至刻度，混勻，用0.35nm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液，精密吸取供試品溶液15yl，注入高效液相色譜儀即得HPLC圖譜；同時用對照品溶液進樣，確定蘆丁，金絲桃苷和槲皮素的出峰位置；測定結果為共計8個共有峰，其中第3個峰為金絲桃苷內參照峰，第2、3、4、7個峰為特征指紋峰；各個峰的相對保留時間依次分別為0.233、0.900、1.000、1.100、1.650、1.740、2.300、2.690，平均相對峰面積比依次分別為0.0082、0.1299、0,1074、0.089、0.0223、0.0174、0.136、0.0055。7、如權利要求1-2任一所述的貫葉連翹總黃酮在制備治療抑郁癥的藥物中的應用。8、一種貫葉連翹總黃酮的制備方法，其特征在于該方法為貫葉連翹全草粉碎或切段后，用5-12倍重量份的40—80%的乙醇或甲醇提取，置于提取罐中，在回流狀態下提取l-3次，過濾得提取液將提取液控制溫度50-70。C以下濃縮，至比重1.08—1.15噴霧干燥，得提取物將提取物用3-8倍重量份的石油醚或正已烷脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物將脫脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，將乙酸乙脂萃取液濃縮至比重U8—1.32，得到主要含金絲桃素、槲皮素類成分的乙酸乙脂部分，即A部分將沉淀部分用水溶解，并同時揮發多余的有機溶劑，得水溶液部分；將水溶液部分充分放冷后，離心或過濾后上聚苯乙烯類弱極性或中極大孔樹脂，流速為柱體積2一5倍純水用量為3—8倍柱體積進行水洗，水洗至顏色較淺，盡無色，用3—8倍柱體積的5—20%乙醇溶劑洗脫，至顏色較淺，即可停止加入；再用30—60%濃度的乙醇洗脫，并收集30—60%部分，將洗脫液濃縮得B部分將A部分和B部分混合，進行真空或噴霧干燥，得貫葉連翹總黃酮。9、如權利要求8所述的貫葉連翹總黃酮的制備方法，其特征在于該方法為貫葉連翹全草粉碎或切段后，用8倍重量份的65%的乙醇提取，置于提取罐中，在回流狀態下提取2次，過濾得提取液將提取液控制溫度6(TC以下濃縮，至比重1.12噴霧干燥，得提取物將提取物用6倍重量份的石油醚或正已垸脫脂，除去脂溶性成份，得脫脂后提取物將脫脂后提取物用乙酸乙脂萃取，得沉淀和乙酸乙脂萃取液，將乙酸乙脂萃取液濃縮至比重1.25，得到主要含金絲桃素、槲皮素類成分的乙酸乙脂部分，即A部分將沉淀部分用水溶解，并同時揮發多余的有機溶劑，得水溶液部分；將水溶液部分充分放冷后，上聚苯乙烯類弱極性或中極大孔樹脂，流速為柱體積4倍用純水5倍柱體積進行洗脫，至顏色較淺，盡無色，用5倍量柱體積的55%乙醇溶劑洗脫，至顏色較淺，即可停止加入；將醇濃度在30—60%之間的部分單獨收集，濃縮得B部分將A部分和B部分混合，進行真空或噴霧干燥，得貫葉連翹總黃酮。全文摘要本發明公開了一種貫葉連翹總黃酮及其制劑的制備方法和質量檢測方法。本發明制備方法主要采用脫脂及乙酸乙酯萃取等步驟，較現有技術具有熱敏性成分損失小，有效成分含量穩定，產品收率與質量能得到更好的保證等優勢。本發明質量檢測方法能很好地控制產品的質量，并能保證產品的相關藥效。本發明貫葉連翹總黃酮及其制劑用于治療抑郁癥具有很好的功效。文檔編號C07D311/30GK101322748SQ20071011897公開日2008年12月17日申請日期2007年6月15日優先權日2007年6月15日發明者曾慶恢,朱立彬,李崇明,銘袁,黃志軍申請人:武漢健民中藥工程有限責任公司