專利名稱：一種c端特異的人btrc多肽及其抗體制備方法
技術領域：
本發明涉及以抗體為特征的體外試驗用的生物制品，具體是一種C 端特異的人BTRC合成多肽、相應抗體及其制備方法，屬于生物醫學技 術領域。
背景技術：
F-Box蛋白家族構成了泛素蛋白連接酶復合物SCFs的四個亞單位中的 一個亞單位，在磷酸化依賴的泛素化中發揮作用。BTRC (beta-transducin repeat containing protein isoform 2)是F-Box蛋白家族成員之一，它與非洲 爪蟾bTrCP1，酵母Met30，脈胞菌Scon2和果蠅的Slimb蛋白具有同源性， 它能與HIV-1 Vpu相互作用并促進CD4分子的蛋白水解作用。同時它還特異 地與磷酸化的IkappaBalpha和beta-catenin基團聯合，可能通過激活 NF-kappaB途徑以及抑制beta-catenin途徑而在多種轉錄事件中發揮作用。 BTRC抗體的制備有利于細胞不同時期對該蛋白的檢測。發明內容本發明是為解決通過免疫實驗特異性檢測人BTRC的表達與天然存 在，并建立相應體外免疫分析所需基本生物制品的問題，而提供的一種 能特異性針對人BTRC的C端的合成多肽、相應抗體及其制備方法。本 發明還可同時解決目前使用的類似抗體價格高，親和力低，抗體結合蛋 白的位置不特異且抗原性較差等問題。本發明所述的抗人BTRC合成多 肽、相應抗體，按照以下歩驟制備抗原表位分析與拮抗位置確定利用多種表位預測軟件，如 DNAsta「， OMIGA， UWGCG等進行綜合分析，主要考量指標包括親水 性結構、抗原指數、表面可及性等，再結合我們已有實際制備抗體的驗 證經驗，最終確定第478到第492位為該抗體的靶標，其氨基酸序列為 FDNKRIVSGAYDGKI。多肽的合成靶標多肽采用全自動多通道多肽合成儀合成，柱層析純化，然后通過HPLC，用每分鐘1。/。的標準乙晴梯度來檢測純度。多肽與載體蛋白交聯由于本合成多肽分子量太小，在動物體內不 能誘導產生免疫反應，因此將多肽與載體蛋白交聯后才能進行免疫，選 擇鑰孔嘁血藍素進行交聯，能顯著增加抗原的大小和免疫原性，從而制 備出人工免疫原。免疫動物所述的制備方法，其抗原肽-交聯載體蛋白做為免疫原， 免疫家兔制備抗體。選取適齡免疫用新西蘭兔，經過適應性伺養后進行 多點注射免疫。反復加強免疫，至取血測抗體效價達到標準時停止免疫。抗體純化達到要求的免疫動物放血，標準方法收集抗血清，依次 使用辛酸-硫酸銨方法和親和層析過柱純化方法，進行抗血清純化，通過SDS-PAGE和HPLC驗證純度，得到目標抗體。本發明制備的高質量多肽抗體效價高、親和力強，可與天然人BTRC 蛋白分子發生特異性結合反應。用多肽制備抗體的成本較常規的重組抗 原制備抗體方法低，抗體特異性好，經親和層析純化后可以用于各種酶 免檢測和WB試驗要求，可用于建立體外免疫分析。該合成肽抗體的制 備，為BTRC蛋白的研究及其相關疾病的研究(如診斷策略的制定，流 行病學調查、預防和控制)提供了一個重要的工具，以及在生物醫學研 究中對相應靶蛋白的特性、含量的測定、分布情況的分析和蛋白的確證 等方面都具有重要作用。
圖1是液相色譜鑒定合成多肽純度結果圖。 圖2是質譜鑒定合成多肽分子量結果圖。圖3是通過間接ELISA方法鑒定純化抗體相對親和常數結果圖。圖1表明經過HPLC對合成的多肽進行純化后，液相色譜鑒定純度 為82.1%。圖2表明多肽分子量理論值為1785，質譜鑒定實測值M+H+為 1786.65。圖3中ELISA檢測制備的多抗和多肽抗原相對親和常數為105-106 L/mol。
具體實施方式
實施例1: BTRC抗原肽的合成。用DNAstar， OMIGA， UWGCG等蛋白分析軟件，對人BTRC氨 基酸序列進行親水性結構(hydrophilicity)、抗原指數(antigenicity)、表面 可及性(surfaceprobability)以及同源性(homology)等分析，再結合我們 已有實際制備抗體的驗證經驗，最終確定第478到第492位為靶標，其 氨基酸序列為FDNKRIVSGAYDGKI。在全自動多肽合成儀上由同定羧 基向氨基端遞減合成后獲得粗品。經30%乙睛溶解后，進行高壓液相色 譜(HPLC)分析，計算主峰面積并收集，經冷凍真空抽干后純化合成肽， 質譜鑒定。實施例2:合成多肽與載體的偶聯。載體蛋白選擇KLH ( Keyhole limpet hemocyanin)，用雙功能試劑 順丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)連接法將KLH與合成肽進行偶 聯取KLH5mg (0.11|jmo!，含賴氨酸2.2fjmol)，溶于0.75ml偶聯 緩沖液1 (50mmol/L硼酸鹽緩沖液，pH8.5) ; 3mg MBS (11|jmo)溶 于75jjl二甲酰胺(DMF)。將MBS溶液分3次加入KLH溶液，旋轉。迅速離心后，將反應混合物(約0.8ml)加 入預先用偶聯緩沖液2 (0.1mol/L磷酸鹽，0.15mol/LNaCL， 0.01mol/LNa2EDTA， PH7.0)平衡的PD-10柱。用偶聯緩沖液2洗脫， 收集洗脫液(即MBS-KLH溶液)。溶解1.5mg合成多肽于0.15ml偶 聯緩沖液2，加入MBS-KLH緩沖液0.56，室溫下旋轉混合，作用2小 時后置4。C過夜，將反應混合物(約0.7ml)加入預先用磷酸緩沖液平 衡的PD-10柱，磷酸緩沖液洗脫，收集流出液。將KLH、 MBS-KLH禾口 偶聯物進行SDS-KLH和偶聯物進行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳) 鑒定偶聯效率。實施例3:抗多肽抗體的制備。取偶聯的KLH-多肽500ijg，溶于500jjl磷酸緩沖液，加等體積的完 全福氏佐劑。免疫選取適齡免疫用新西蘭兔(體重標準為2-2.5公斤)， 經過適應性飼養后，背部皮內不少于15點注射。2周后抗原量減半(250|jg)，加等體積的不完全福氏佐劑，第一次加強免疫。2周后進行 第二次加強免疫，方法同前。再2周后幵始耳緣靜脈少量采血，用合成 多肽(1|jg/ml)包被酶標板，間接ELISA法檢測免疫血清效價。反復加 強免疫，至取血測抗體效價達到1: 16萬時停止免疫，采用頸動脈放血 收集抗體。實施例4:親和層析純化抗多肽抗體。①BTRC合成多肽親和層析柱的制備稱取1.5g CNBr活化 Sepharose4B，用1mmol/L鹽酸充分浸洗膨脹凝膠后，再用偶聯緩沖液 洗2次，迅速與溶于5ml偶聯緩沖液的合成多肽500Mg混合，室溫下旋轉混合2小時。加入0.2mol/L甘氨酸4ml終止反應，室溫旋轉混合1小 時。用偶聯緩沖液和甘氨酸緩沖液交替洗凝膠各2次，再用50ml磷酸 鹽緩沖液洗凝膠，按終止濃度0.02%加疊氮鈉(NaN3)，置4。C保存。②親和層析純化抗多肽抗體將20ml兔抗多肽血清與1.6ml多肽偶 聯的S印harose 4B共同加入50ml離心管，4°C旋轉混合6小時。將凝 膠加入層析柱，棄去流出液，用15ml磷酸鹽緩沖液沖洗凝膠。每次加 0.8mlpH2.9， 0.1mol/L甘氨酸緩沖液洗脫，共8次，洗脫液分別加入8 支預先加入80卩l 2mol/L Tris-HCL緩沖液(pH7.5) ， 20ml磷酸鹽緩沖 液洗凝膠。上述全部操作過程在4。c下完成。毎管取洗脫液2mI，稀釋 50倍后測280nm的OD值，計算蛋白質含量并繪制洗脫曲線。實施例5:抗體鑒定，使用間接ELISA方法檢測抗體相對親和常數。用合成肽交聯BSA，分別以5 "g/mL和10 ug/mL的濃度，在4 度下包被ELISA檢測板過夜，10%的山羊血清室溫封閉2小時后加入倍 比稀釋的已知蛋白濃度的純化后的抗體，再加入HRP標記的羊抗兔IgG 二抗0.1mL， TMB顯色測定A450。以抗體濃度的對數為橫坐標，以曲線 達到水平時的A450值為100%，以其他相對于該濃度的百分數為縱坐標 作圖，求出A50即50% A值對應的抗體濃度。按照Kaff=(n-1)/2(n[Ab'] t-2[Ab]t)算出抗體相對親和常數，其中[Ab' ]t 、 [Ab]t指的是A50時 即包被抗原分別為5ti g/mL和10 u g/mL時抗體半飽和時抗體的摩爾濃 度，[Ag]t、 [Ag， ]t指的是包被的抗原濃度本實驗中即指10u g和5u g， n=[Ag]t/[Ag， ] t，本實驗中n=2。試驗效果1. BTRC合成多肽HPLC純化后，使用液相色譜鑒定純度為82.1 %。 多肽分子量理論值為1785，質譜鑒定實測值M+H+為1786.65。2. 多肽與載體的偶聯效率SDS-PAGE電泳鑒定偶聯效率與樣品回 收率大致相符，大于80%。3. 抗體效價多只家兔得到的抗血清效價均在1:10萬以上。4. 抗體親和力相對親和常數為105-106L/mol。5. 抗體的應用以上技術指標的實現保證該抗體完全可以應用于蛋 白印跡和各種酶免實驗，以及建立相應體外免疫分析試劑。序列表<110>北京意宏安生物科技有限公司<120> —種C端特異的人BTRC多肽及其抗體制備方法 <160>2<210> 1 <211>569 <212> PRT <213>人<400> 1MDPAEAVLQEKALKFMNSSEREDCNNGEPPRFDNKRIVSGAYDGKI CARLCLNQETVCLASTAMKTENCVAKTKLANGTSSMIVPKQRKLSASYEK EKELCVKYFEQWSESDQVEFVEHLISQMCHYQHGHINSYLKPMLQRDFI TALPARGLDHIAENILSYLDAKSLCAAELVCKEW丫RVTSDGMLWKKLIERM VRTDSLWRGLAERRGWGQYLFKNKPPDGNAPPNSFYRALYP國DIETI ES隨RCGRHSLQRIHCRSETSKGVYCLQYDDQKIVSGLRDNTIKIWDKN TLECKRILTGHTGSVLCLQYDERVIITGSSDSTVRVWDVNTGEMLNTLIHH CEAVLHLRFNNGMMVTCSKDRSIAVWDMASPTDITLRRVLVGHRAAVNV VDFDDKYIVSASGDRTIKVWNTSTCEFVRTLNGHKRGIACLQYRDRLWS GSSDNTIRLWDIECGACLRVLEGHEELVRCIRCDNKRIVSGAYDGKIKVW DLVAALDPRAPAGTLCLRTLVEHSGRVFRLQFDEFQIVSSSHDDTILIWDFLNDPAAQAEPPRSPSRTYT丫ISR<210>2 <211> 15 <212> PRT <213>人<400> 2FDNKRIVSGA丫DGKI
權利要求
1.一種C端特異的人BTRC多肽，其特征在于多肽的氨基酸序列為FDNKRIVSGAYDGKI。
2. —種特異的抗BTRCC端合成多肽抗體，其特征在于該抗體效價在l: 100000以上，特異 性強，親和力高達105 — 1.06L/mol。
3. —種特異的抗人BTRCC端合成多肽抗體的制備方法，其特征在于以人BTRC氨基酸序列中第478到第492位的FDNKRIVSGAYDGKI肽段序列作為抗原肽合成人BTRC抗原肽； 純化的抗原肽與蛋白載體偶聯，經柱層析純化后；制備出人工免疫原，免疫動物，制備多 肽抗體，并經親和層析純化而成。
4. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于載體蛋白為鑰孔嘁血藍素。
5. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于偶聯的KLH—多肽加福氏佐劑免疫后收集抗體c
6. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于抗原肽與載體蛋白偶聯作為免疫原，免疫家 兔制備兔抗人BTRC合成多肽抗體。
7. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于合成多肽偶聯Sepharose4B，制備親和層析 柱，用于純化抗多肽抗體。
全文摘要
本發明公開了一種C端特異的人BTRC多肽及其抗體的制備方法，屬于以抗體為特征的體外試驗用的生物制品。C端特異的人BTRC多肽的氨基酸序列為FDNKRIVSGAYDGKI。抗人BTRC多肽抗體按以下方法制備(1)人BTRC抗原表位的分析；(2)人BTRC C端多肽的合成；(3)合成多肽與載體蛋白交聯；(4)制備兔抗人BTRC多肽抗體；(5)收集、分離得到含有抗體的血清，純化抗體，即得到抗人BTRC多肽抗體。本發明制備的C端特異的抗人BTRC合成多肽抗體效價高、親和力強、特異性好，可與天然人BTRC發生特異性結合反應；制備成本低；純化后的抗體可完全用于免疫印跡和酶聯免疫吸附實驗，以及建立體外免疫分析方法。該抗體為BTRC蛋白的研究及其相關疾病的研究(如診斷策略的制定，流行病學調查、預防和控制)提供了一個重要的工具，以及在生物醫學研究中對相應靶蛋白的特性、含量的測定、分布情況的分析和蛋白的確證等方面都具有重要作用。
文檔編號C07K7/08GK101318996SQ20071010017
公開日2008年12月10日 申請日期2007年6月6日 優先權日2007年6月6日
發明者呂玉娥, 杜宏武, 陳光宇 申請人:北京意宏安生物科技有限公司