專利名稱：疏水蛋白的分離提純方法
技術領域：
本發明涉及蛋白的分離提純方法，特別是涉及疏水蛋白的分離提純方法。
背景技術：
真菌疏水蛋白(hydrophobin)是廣泛存在于絲狀真菌中的一簇具有不同尋常生理生化性質的小型蛋白質(約含100個氨基酸殘基)，在其它有機體中尚未發現。根據疏水性圖譜和其組裝薄膜的溶解性特征，可將疏水蛋白分為兩類I型和II型。為了更具體的了解疏水蛋白，科學家對它們的結構及生物物理和生物化學等方面的特性進行了大量研究。研究發現，疏水蛋白對真菌類的生長和繁殖起到非常重要的作用，包括真菌對表面的吸附、穩定性，果肉和空中菌絲的形成，以及對真菌結構的覆蓋保護等。由水中的菌絲所分泌的疏水蛋白可以在水中擴散且在與其它介質或空氣的界面上發生自組裝，使水的表面張力大幅下降，從而使得菌絲能夠沖破水環境向空氣中生長。其中，疏水蛋白SC3可以使50μg/mL水溶液的表面張力從最大72mj/m2降低至24mj/m2，說明疏水蛋白也是很好的表面活性劑。這種蛋白質之所以擁有如此強大的功能，是因為它們具有在親水-疏水界面上(例如水-空氣界面、水-油界面或水與類似特氟龍的疏水性固體界面)通過自組裝形成兩親性薄膜的特性。
疏水蛋白大約包含有100個氨基酸殘基，通過自組裝在界面形成兩親性薄膜從而改變表面的自然特性。疏水蛋白薄膜十分穩固，可以在100℃下抵抗住2％的SDS。疏水蛋白既無細胞毒性也無強免疫原性，因此，它們不僅在生物領域具有很高的科研價值，在醫藥和工業領域同樣具有非常好的應用前景。疏水蛋白可以在固體上面將其它蛋白質固定，或將溶化的蛋白質凈化。例如，在醫學移植物的表面使疏水蛋白自組裝，能顯著提高這些移植物的生物相容性或能防止致病的細菌粘附到如導管的表面，并且促進人類纖維原細胞的生長。這種疏水蛋白還可以作為一種媒介，或者稱為“粘附劑”，將細胞、蛋白質以及其它種類的分子固定在疏水的固體表面，比如生物傳感器。利用組裝后疏水蛋白的化學惰性，可以預測在穩定固定酶的活性方面會有優勢，同時成型的薄膜具有的多孔性有利于一些小分子進入傳感器。在納米技術領域，經過某些處理的疏水蛋白可以攜帶不同的功能基團，在表面可以形成納米精度的不同分子圖形，因為組裝后的I型疏水蛋白的棒狀結構大約只有10nm寬，但化學性質非常穩定。另外，疏水蛋白有非常高的表面活性能(SC3大約是30mj/m2)，與傳統的生物表面活性劑十分相似，例如糖脂類、脂肽酶/脂蛋白、磷脂、中性油脂和脂多糖。這樣，就可以將疏水蛋白應用于制藥業，以替代傳統的表面活性劑。
疏水蛋白的這些特性已經引起了科學界的廣泛關注，目前的研究主要集中在如何實現其工業化生產及其在各領域中的具體應用方面。但疏水蛋白的生產能力還十分有限，在分離提純方面也有很大的困難，因而大大阻礙了其發展速度。因此很多國際科技工作者一直致力于此方面的研究，比如de Vocht等人提出的《Method of purifyinga hydrophobin present in a hydrophobin-containing solution》，已于2001年申請了世界范圍的知識產權專利保護，公開號為WO/2001/057076。利用疏水蛋白對固體基板的吸附對溶液進行提純，將固體基板浸入提純溶液長時間后取出，使用強表面活性劑再將吸附在固體表面的疏水蛋白溶解，最后通過層析法及離心分離法再將疏水蛋白與表面活性劑分離提純。
我國南開大學在國內雜志《生物活性物質分離與提純》2005年第31卷第7期上發表的文章《瑞氏木霉疏水蛋白HFBI的分離純化》，報道了疏水蛋白HFBI的抽提純化方法，是依次用1％ SDS抽提，KCl沉淀后，經過Berol 532雙水相萃取可得到疏水蛋白粗提品，然后再通過Sephadex G-25和Q-Sepharose進一步純化。
物質中常見的疏水基團有烷基、芳香基等，物質中含疏水性基團越多，其疏水性就會越大，比如聚乙烯，聚苯乙烯，聚丙烯等都屬于疏水性物質。特氟龍(Teflon)化學名稱叫做聚四氟乙烯，是把乙烯(C2H4)中的四個氫(H)都置換成氟(F)，變成四氟乙烯(C2F4)，再經聚合作用形成。由于特氟龍是由碳原子和氟原子制成，不含氫，所以疏水性能特別強。特氟龍還具有耐熱、耐低溫、耐蝕性、優異的非粘著性及自潤性、低磨擦系數等特性。
發明內容
本發明的目的是提供一種利用疏水性物質的粒子對疏水蛋白的吸附及異相成核生長效應對其進行分離提純的方法。
為解決上述技術問題，本發明采取以下技術方案疏水蛋白的一種分離提純方法，是先將表面分布有疏水性物質粒子的固體基板置于待提純的疏水蛋白溶液中浸泡，然后將基板從疏水蛋白溶液中取出，用水漂洗，再放入盛有水的容器中進行超聲振蕩，使在疏水性粒子表面吸附且成核生長的疏水蛋白脫落后溶于水中，最后將基板從溶液中取出，得到經純化的疏水蛋白溶液。
在上述疏水蛋白的分離提純方法中，由于疏水蛋白能夠在所有的疏水性物質表面吸附，因而所述疏水性物質的選擇是多種多樣的，如特氟龍(Teflon)等。
所述固體基板表面分布的疏水性物質的粒子的多少會影響疏水蛋白成核生長的大小，一般粒子越多，疏水蛋白生長的尺寸越大，粒子越少，疏水蛋白生長的尺寸越小，對疏水蛋白的提純效率不高，但是密度太高則會形成疏水性物質薄膜，不利于疏水蛋白的成核生長，因此，所述固體基板上分布的疏水性物質粒子的密度一般為1×E2-3×E15個/cm2。
所述用于分離提純疏水蛋白的表面分布有疏水性物質粒子的固體基板的制備方法有很多，如物理化學刻蝕，物理化學沉積，化學腐蝕，粒子轟擊，物理吸附，粘附，涂覆等。考慮到粒子在基板表面附著力的大小及粗糙度等問題，使用離子束濺射鍍膜機是比較好的方法，具體操作為使用離子束濺射鍍膜機在真空條件下向光滑潔凈的固體基板表面轟擊疏水性物質靶，使疏水性物質的粒子附著于潔凈固體基板表面，并通過對濺射時間的控制，對固體基板分布的疏水性物質的粒子密度進行調控，以制成表面分布有所需密度疏水性物質粒子的固體基板。通常，濺射時間太長，容易形成疏水性薄膜，不利于疏水蛋白的成核生長，而濺射時間太短，則疏水性粒子密度太小，對疏水蛋白的提純效率不高。所述濺射時間一般為1-600s，優選為5s。所述固體基板的材質是多種多樣的，如石英、硅片或玻璃板等均可。
此外，表面分布有疏水性物質粒子的固體基板在待提純的疏水蛋白溶液中的浸泡時間的長短也會影響疏水蛋白成核生長的大小，一般浸泡時間越長，疏水蛋白生長的尺寸越大，浸泡時間越短，疏水蛋白生長的尺寸越小，可根據疏水蛋白溶液的濃度及疏水性物質的粒子密度對浸泡時間進行調整，一般為0.01-72小時。
通過對疏水蛋白樣品進行不同功率的超聲振蕩處理，發現并不是功率越大分離提純效果越好，功率過大，反而會促進已溶于水中的疏水蛋白向疏水性物質粒子上聚集，因此，超聲振蕩的功率密度一般為0.01-500W/mL(優選為1.35-1.45W/mL)，振蕩頻率為1-300KHz，振蕩時間為0.01-300min。
用上述方法分離純化的疏水蛋白也屬于本發明的保護范圍。
本發明提供了一種疏水蛋白的分離純化方法。該方法是利用疏水蛋白能夠在疏水性物質的表面吸附且疏水性物質的粒子對疏水蛋白有很強的異相成核生長作用，從而達到對疏水蛋白進行分離提純的目的。用本發明的方法能夠便捷地得到純度較高的疏水蛋白溶液，并且該方法具有操作簡單，條件要求低，成本低廉，分布有疏水性物質粒子的基板可以重復使用，易于進行工業化應用的優點。本發明將在疏水蛋白的分離純化中發揮重要作用，應用前景廣闊。
下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
圖1為表面分布有Teflon粒子的石英基板的原子力顯微圖像圖2為表面分布有Teflon粒子的石英基板在疏水蛋白HFBII溶液中浸泡12小時取出后的原子力顯微圖像及圖像分析結果圖3為將吸附有疏水蛋白的基板經不同功率的超聲振蕩處理后的原子力顯微圖像具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
實施例1、疏水蛋白的分離提純及檢測不同功率的超聲振蕩處理對純化效果的影響一、用于分離提純疏水蛋白的表面分布有Teflon粒子的固體基板的制備將潔凈的拋光石英基板放入離子束濺射鍍膜機，安裝上Teflon靶，真空抽至1.3E-3pa，濺射5s后取出，得到表面分布有Teflon粒子的固體基板，原子力顯微鏡觀測結果如圖1所示(圖A的尺寸為5微米，圖B的尺寸為1微米)，潔凈拋光石英基板表面的粗糙度很低，由經濺射鍍膜后的原子力圖像中可以看到基板表面分布了許多顆粒，通過對表面進行水接觸角的測試發現接觸角變大，由此證明這些在基板表面分布的點就是Teflon粒子，Teflon粒子的密度約為8×E11個/cm2。
二、疏水蛋白的分離提純及檢測不同功率的超聲振蕩處理對純化效果的影響將步驟一制備的表面分布有Teflon粒子的固體基板置于待提純的疏水蛋白HFBII溶液中浸泡12小時，然后將基板從疏水蛋白溶液中取出，在原子力顯微鏡下觀測并對圖像進行分析，觀測及圖像分析結果如圖2所示(圖A為原子力顯微圖像，尺寸為5微米；圖B為圖像分析結果)，可以看到基板表面生長出了很大的形狀不規則的疏水蛋白聚集體，這是由于疏水蛋白在Teflon粒子表面吸附并成核生長所致。由原子力顯微鏡配套的分析軟件可得聚集體的高度可達約130nm，直徑能達到約550nm，說明疏水蛋白的生長速率很高。用水對吸附有疏水蛋白的基板漂洗后，將其再放入盛有水的容器中進行超聲振蕩，使Teflon粒子吸附且成核生長的疏水蛋白脫落后溶于水中，超聲振蕩功率密度分別設為0.85W/mL、1.42W/mL、1.90W/mL，其它條件一樣，頻率為20-25KHz，振蕩時間為15min，超聲結束后將基板從溶液中取出，在原子力顯微鏡下觀測，觀測結果如圖3所示(圖A為在0.85W/mL下振蕩后基板的原子力顯微圖像，圖B為在1.42W/mL下振蕩后基板的原子力顯微圖像，圖C為在1.90W/mL下振蕩后基板的原子力顯微圖像，尺寸均為5微米，Z軸高度為15nm)，由圖3可以看出對樣品采用不同功率進行超聲處理后所得的效果并不一樣，在1.42W/mL下超聲振蕩的基板上剩余的疏水蛋白最少，大的聚集顆粒明顯消失，達到了分離提純的效果，由此說明并不是超聲功率越大效果越好，這是因為疏水蛋白具有很高的活性，功率過大反而又會促進溶液中的疏水蛋白向Teflon粒子上聚集，1.35-1.45W/mL為最佳的振蕩功率密度。上述檢測結果表明，用本發明的方法可得到純度較高的疏水蛋白。
實施例2、疏水蛋白的分離提純一、用于分離提純疏水蛋白的表面分布有Teflon粒子的固體基板的制備將潔凈的玻璃基板放入離子束濺射鍍膜機，安裝上Teflon靶，真空抽至1.3E-3pa，濺射300s后取出，得到表面分布有Teflon粒子的固體基板。
二、疏水蛋白的分離提純將步驟一制備的表面分布有Teflon粒子的固體基板置于待提純的疏水蛋白HFBII溶液中浸泡72小時，然后將基板從疏水蛋白溶液中取出，在原子力顯微鏡下觀測并對圖像進行分析，可以看到基板表面生長出了很大的形狀不規則的疏水蛋白聚集體，這是由于疏水蛋白在Teflon粒子表面吸附并成核生長所致。由原子力顯微鏡配套的分析軟件可得聚集體的高度可達約130nm，直徑能達到約550nm，說明疏水蛋白的生長速率很高。然后用水對吸附有疏水蛋白的基板漂洗后，將其再放入盛有水的容器中進行超聲振蕩，超聲振蕩功率密度分別設為0.01W/mL，振蕩頻率為200KHz，振蕩時間為300min，超聲結束后將基板從溶液中取出，在原子力顯微鏡下觀測，觀測結果表明玻璃基板上剩余的疏水蛋白較少，大的聚集顆粒明顯消失，得到了純度較高的疏水蛋白。
實施例3、疏水蛋白的分離提純一、用于分離提純疏水蛋白的表面分布有Teflon粒子的固體基板的制備將潔凈的玻璃基板放入離子束濺射鍍膜機，安裝上Teflon靶，真空抽至1.3E-3pa，濺射600s后取出，得到表面分布有Teflon粒子的固體基板。
二、疏水蛋白的分離提純將步驟一制備的表面分布有Teflon粒子的固體基板置于待提純的疏水蛋白HFBII溶液中浸泡24小時，然后將基板從疏水蛋白溶液中取出，在原子力顯微鏡下觀測并對圖像進行分析，可以看到基板表面生長出了很大的形狀不規則的疏水蛋白聚集體，這是由于疏水蛋白在Teflon粒子表面吸附并成核生長所致。由原子力顯微鏡配套的分析軟件可得聚集體的高度可達約130nm，直徑能達到約550nm，說明疏水蛋白的生長速率很高。然后用水對吸附有疏水蛋白的基板漂洗后，將其再放入盛有水的容器中進行超聲振蕩，超聲振蕩功率密度分別設為300W/mL，振蕩頻率為100KHz，振蕩時間為60min，超聲結束后將基板從溶液中取出，在原子力顯微鏡下觀測，觀測結果表明玻璃基板上剩余的疏水蛋白較少，大的聚集顆粒明顯消失，得到了純度較高的疏水蛋白。
實施例4、疏水蛋白的分離提純一、用于分離提純疏水蛋白的表面分布有Teflon粒子的固體基板的制備將潔凈的硅片基板放入離子束濺射鍍膜機，安裝上Teflon靶，真空抽至1.3E-3pa，濺射1s后取出，得到表面分布有Teflon粒子的固體基板。
二、疏水蛋白的分離提純將步驟一制備的表面分布有Teflon粒子的固體基板置于待提純的疏水蛋白HFBII溶液中浸泡1小時，然后將基板從疏水蛋白溶液中取出，在原子力顯微鏡下觀測并對圖像進行分析，可以看到基板表面生長出了很大的形狀不規則的疏水蛋白聚集體，這是由于疏水蛋白在Teflon粒子表面吸附并成核生長所致。由原子力顯微鏡配套的分析軟件可得聚集體的高度可達約130nm，直徑能達到約550nm，說明疏水蛋白的生長速率很高。然后用水對吸附有疏水蛋白的基板漂洗后，將其再放入盛有水的容器中進行超聲振蕩，超聲振蕩功率密度分別設為500W/mL，振蕩頻率為300KHz，振蕩時間為200min，超聲結束后將基板從溶液中取出，在原子力顯微鏡下觀測，觀測結果表明硅片基板上剩余的疏水蛋白較少，大的聚集顆粒明顯消失，得到了純度較高的疏水蛋白。
實施例5、疏水蛋白的分離提純一、用于分離提純疏水蛋白的表面分布有Teflon粒子的固體基板的制備將潔凈的石英基板放入離子束濺射鍍膜機，安裝上Teflon靶，真空抽至1.3E-3pa，濺射50s后取出，得到表面分布有Teflon粒子的固體基板。
二、疏水蛋白的分離提純將步驟一制備的表面分布有Teflon粒子的固體基板置于待提純的疏水蛋白HFBII溶液中浸泡36小時，然后將基板從疏水蛋白溶液中取出，在原子力顯微鏡下觀測并對圖像進行分析，可以看到基板表面生長出了很大的形狀不規則的疏水蛋白聚集體，這是由于疏水蛋白在Teflon粒子表面吸附并成核生長所致。由原子力顯微鏡配套的分析軟件可得聚集體的高度可達約130nm，直徑能達到約550nm，說明疏水蛋白的生長速率很高。然后用水對吸附有疏水蛋白的基板漂洗后，將其再放入盛有水的容器中進行超聲振蕩，超聲振蕩功率密度分別設為1.45W/mL，振蕩頻率為150KHz，振蕩時間為150min，超聲結束后將基板從溶液中取出，在原子力顯微鏡下觀測，觀測結果表明石英基板上剩余的疏水蛋白較少，大的聚集顆粒明顯消失，得到了純度較高的疏水蛋白。
實施例6、疏水蛋白的分離提純一、用于分離提純疏水蛋白的表面分布有Teflon粒子的固體基板的制備將潔凈的石英基板放入離子束濺射鍍膜機，安裝上Teflon靶，真空抽至1.3E-3pa，濺射100s后取出，得到表面分布有Teflon粒子的固體基板。
二、疏水蛋白的分離提純將步驟一制備的表面分布有Teflon粒子的固體基板置于待提純的疏水蛋白HFBII溶液中浸泡48小時，然后將基板從疏水蛋白溶液中取出，在原子力顯微鏡下觀測并對圖像進行分析，可以看到基板表面生長出了很大的形狀不規則的疏水蛋白聚集體，這是由于疏水蛋白在Teflon粒子表面吸附并成核生長所致。由原子力顯微鏡配套的分析軟件可得聚集體的高度可達約130nm，直徑能達到約550nm，說明疏水蛋白的生長速率很高。然后用水對吸附有疏水蛋白的基板漂洗后，將其再放入盛有水的容器中進行超聲振蕩，超聲振蕩功率密度分別設為1.35W/mL，振蕩頻率為250KHz，振蕩時間為30min，超聲結束后將基板從溶液中取出，在原子力顯微鏡下觀測，觀測結果表明石英基板上剩余的疏水蛋白較少，大的聚集顆粒明顯消失，得到了純度較高的疏水蛋白。
權利要求
1.疏水蛋白的分離提純方法，是先將表面分布有疏水性物質粒子的固體基板置于待提純的疏水蛋白溶液中浸泡，然后將基板從疏水蛋白溶液中取出，用水漂洗，再放入盛有水的容器中進行超聲振蕩，最后將基板從溶液中取出，得到經純化的疏水蛋白溶液。
2.根據權利要求1所述的分離提純方法，其特征在于所述疏水性物質為特氟龍。
3.根據權利要求1所述的分離提純方法，其特征在于所述固體基板上分布的疏水性物質的粒子的密度為1×E2-3×E15個/cm2。
4.根據權利要求1所述的分離提純方法，其特征在于所述用于分離提純疏水蛋白的表面分布有疏水性物質粒子的固體基板的制備方法為使用離子束濺射鍍膜機在真空條件下向光滑潔凈的固體基板表面轟擊疏水性物質靶，得到表面分布有疏水性物質粒子的固體基板。
5.根據權利要求4所述的分離提純方法，其特征在于所述濺射時間為1-600s。
6.根據權利要求1所述的分離提純方法，其特征在于所述表面分布有疏水性物質粒子的固體基板在待提純的疏水蛋白溶液中的浸泡時間為0.01-72小時。
7.根據權利要求1-6任一項所述的分離提純方法，其特征在于所述超聲振蕩的功率密度為0.01-500W/mL，振蕩頻率為1-300KHz，振蕩時間為0.01-300min。
8.根據權利要求7所述的分離提純方法，其特征在于所述超聲振蕩的功率密度為1.35-1.45W/mL。
9.用權利要求1-8任一項所述方法得到的經分離純化的疏水蛋白。
全文摘要
本發明公開了疏水蛋白的分離提純方法。該方法是先將表面分布有疏水性物質粒子的固體基板置于待提純的疏水蛋白溶液中浸泡，然后將基板從疏水蛋白溶液中取出，用水漂洗，再放入盛有水的容器中進行超聲振蕩，最后將基板從溶液中取出，得到經純化的疏水蛋白溶液。該方法是利用疏水蛋白能夠在疏水性物質表面吸附且疏水性物質的粒子對疏水蛋白有很強的異相成核生長作用，從而達到對疏水蛋白進行分離提純的目的。用本發明的方法能夠便捷地得到純度較高的疏水蛋白溶液，并且該方法具有操作簡單，條件要求低，成本低廉，疏水性物質表面可重復使用，易于進行工業化應用的優點。本發明將在疏水蛋白的分離純化中發揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號C07K1/14GK101054407SQ20071009964
公開日2007年10月17日 申請日期2007年5月25日 優先權日2007年5月25日
發明者胡振彥, 李良彬, 田揚超 申請人:中國科學技術大學