專利名稱::幽門螺桿菌重組VacA單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及重組單克隆抗體,特別涉及一種幽門螺桿菌重組VacA單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
:自1983年Warren和Marshall從胃粘膜組織中發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)以來,大量研究已經(jīng)表明該菌是引起慢性胃炎和胃潰瘍的最常見原因,在胃潰瘍的復(fù)發(fā)及胃癌的發(fā)生中起到重要作用。Hp的感染非常普遍,發(fā)展中國家高于發(fā)達(dá)國家,發(fā)展中國家流行特征為兒童期易感型,嬰幼兒甚至出生幾個月的新生兒都可能受到感染,并以每年3-10%的速度上升,因各種體檢未將Hp感染的檢查作為常規(guī)指標(biāo),多為引起臨床癥狀就診時才發(fā)現(xiàn),一旦感染,將終身受累,自愈率幾乎為零。感染者中慢性胃炎的發(fā)病率為45-85%、消化性潰瘍?yōu)?0-20%、胃癌和淋巴瘤為40.61/10萬。在我國普通人群中的感染率為50-80%,并以每年1-2%的速度增加。預(yù)防Hp感染,對保護(hù)人群健康具有重要的現(xiàn)實意義。目前,已發(fā)現(xiàn)Hp的毒力因子有多種,如鞭毛、黏附因子、尿素酶、蛋白水解酶、毒素相關(guān)蛋白、細(xì)胞空泡毒素(vacuolatingcytotoxinA,VacA)等,其中VacA是一種重要的致病物質(zhì)。1988年,Leunk首先發(fā)現(xiàn)Hp具有使真核細(xì)胞空泡變性的毒素,并命名為細(xì)胞空泡毒素(VacA)。1992年,Cover和Blaster提純了該毒素。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為VacA屬于A-B型結(jié)構(gòu)的細(xì)菌毒素,即37000Da片段是毒性亞單位,58000Da片段是結(jié)合亞單位。其致病機(jī)理尚未完全明了,多認(rèn)為VacA可通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),引起內(nèi)吞作用障礙,最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)空泡樣變性;同時能夠在胞漿膜上形成通道與增強(qiáng)極化上皮單層細(xì)胞的滲透性,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。流行資料表明雖然50%-60%人群感染Hp,但臨床上僅有15%的感染者出現(xiàn)癥狀。Hp的其他毒力因子幾乎存在所有的菌株,因此不能解釋Hp感染后的不同臨床表現(xiàn)。而編碼VacA的基因存在所有菌株中,但只有50%-60%菌株表達(dá),感染者是否出現(xiàn)臨床癥狀與感染菌株的毒力有關(guān)。因此診斷VacA產(chǎn)毒株感染在臨床上具有重要意義,針對VacA的防治措施也具有重要價值。編碼vacA基因的DNA大約3.8kb。Atherton等發(fā)現(xiàn)Hp的vacA基因內(nèi)存在三種不同的信號區(qū)序列(sla,slb,s2)和兩種不同的中間區(qū)序列(ml,m2),據(jù)此可將Hp分為不同的vacA基因亞型。vacA基因型有很強(qiáng)的地區(qū)差異性,研究表明我國基因型大多為slm2型。紀(jì)徐準(zhǔn)等對五株有代表性的中國Hp菌株進(jìn)行vacA基因測序,然后用比較基因序列差異距離的方法分析,發(fā)現(xiàn)四株中國m2型vacA基因彼此相似,其基因差異距離明顯不同于同型西方菌株。編碼毒性亞單位及輸出段的基因在中國菌株間彼此相似,而與西方菌株相比則形成獨(dú)立的一組。由于vacA基因呈多態(tài)性,導(dǎo)致表達(dá)蛋白結(jié)構(gòu)的差異。因此針對中國株的vacA基因產(chǎn)物用于診斷和防治更適合國內(nèi)臨床?,F(xiàn)有技術(shù)已成功地表達(dá)了VacA重組蛋白,并鑒定其具有良好的抗原性與免疫原性,由于制備方法的煩瑣及各種影響因素的存在,目前尚未制備出重組VacA單克隆抗體。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是(1):提供一種能持續(xù)穩(wěn)定分泌幽門螺桿菌重組VacA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系ZYA2、ZYB5、ZYC8、ZYD4及一種利用該雜交瘤細(xì)胞用同系小鼠體內(nèi)誘生法獲得的抗幽門螺桿菌重組VacA蛋白的單克隆抗體(針對中國株的重組VacA單克隆抗體)。(2)、提供該單克隆抗體在制備診斷VacA陽性株感染的ELISA試劑盒中的應(yīng)用以及幽門螺桿菌重組VacA單克隆抗體在制備相應(yīng)疫苗和治療VacA陽性株感染的試劑中的應(yīng)用。采用的具體技術(shù)方案如下-一種能持續(xù)穩(wěn)定分泌幽門螺桿菌重組VacA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系ZYA2、ZYB5、ZYC8、ZYD4,它們由以下步驟制得采用基因工程誘導(dǎo)表達(dá)獲取的幽門螺桿菌VacA重組蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠,將免疫小鼠的脾細(xì)胞、活性大于95%的SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合,克隆篩選能持續(xù)穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。所述免疫小鼠脾細(xì)胞與活性大于95%的SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞按10:1比例進(jìn)行細(xì)胞融合,細(xì)胞融合時所用促進(jìn)劑PEG的分子量是4000,濃度是50%,細(xì)胞融合后置于96孔板中培養(yǎng)。在其制備步驟中于雜交瘤細(xì)胞融合后7-10天開始檢測培養(yǎng)上清中的抗體。所述的雜交瘤細(xì)胞用同系小鼠腹腔接種體內(nèi)誘生法獲得抗幽門螺桿菌重組VacA蛋白的單克隆抗體。其中腹腔接種雜交瘤細(xì)胞的劑量1X107毫升,體積是0.5毫升。整個制備工藝流程如附圖1所示VacA重組蛋白的制備通過BLAST對紀(jì)徐準(zhǔn)測序的五株有代表性的中國Hp菌株毒性亞單位進(jìn)行同源性比較,得到一個高度同源的基因片段為目的基因。以Hp(AF050320)標(biāo)準(zhǔn)株的vacA基因序列為依據(jù)設(shè)計引物,以臨床菌株基因組為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增,從vacA基因中擴(kuò)增出毒性片段V,克隆至原核表達(dá)載體PQE-30中,轉(zhuǎn)化表達(dá)菌DH5ci大量誘導(dǎo)表達(dá)。重組質(zhì)粒PQE-30-V的序列分析表明,所得序列完整,與文獻(xiàn)中國菌株相比有高度的同源性。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌DH5a大量誘導(dǎo)表達(dá)后,用N;T-NTA樹脂提純表達(dá)蛋白,SDS-PAGE分析可見單一條帶,圖象軟件分析表明純度可達(dá)93%以上。Westernblot鑒定NC膜顯色后在相對分子量27000處出現(xiàn)相應(yīng)的條帶,大小與預(yù)期的一致,表明重組蛋白具有良好的抗原性;Bradford法測定重組蛋白含量為0.8mg/ml;用HelicoBlot試劑盒檢測重組蛋白的兔抗血清與免疫前正常血清鑒定,可見重組蛋白的兔抗血清VacA抗體呈陽性,而對照為陰性,表明重組蛋白具有良好的免疫原性。此重組質(zhì)粒PQE-30-V保存于本實驗室。本發(fā)明采用雜交瘤技術(shù)制備抗幽門螺桿菌重組細(xì)胞空泡毒素VacA毒性片段的單克隆抗體,取得了成功,在制備過程中應(yīng)用到以下關(guān)鍵技術(shù)A.免疫BALB/c小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合比例本發(fā)明選用免疫BALB/c小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合比例為10:1。B.融合促進(jìn)劑的選擇本發(fā)明選用分子量為4000,濃度為50%的PEG作為融合促進(jìn)劑。原理細(xì)胞融合是實驗的中心環(huán)節(jié)。融合時選用PEG作為融合促進(jìn)劑,PEG分子量1000—6000均可用,最好用4000。PEG的典型濃度范圍為30%一50%,低于30%融合率低,高于50%時有毒性。PEG的分子量為4000時,以30%,40%,50%三種濃度作比較,結(jié)果表明50%的融合率相對較高而毒性相對不大,可作為細(xì)胞融合的適宜濃度。當(dāng)PEG的濃度增加到50%時,PEG可能與鄰近膜的水分相結(jié)合,使細(xì)胞之間只有幾個埃的空間水分被代替,由此降低細(xì)胞表面的極性,導(dǎo)致脂雙層不穩(wěn)定,引起細(xì)胞膜的融合。同時,為保證融合的成功,骨髓瘤細(xì)胞的活性也相當(dāng)重要,只有活性大于95%時,才能保證融合的成功。本發(fā)明所用的PEG分子量為4000,濃度為50%,獲得良好融合效果。值得注意的是在操作過程中,動作要輕柔,注意防止污染。加不完全培養(yǎng)液時,應(yīng)盡量慢,避免液體加入過多、過快,導(dǎo)致細(xì)胞漲破死亡,因為在離心和高濃度的PEG的作用下,由于脫水而皺縮的細(xì)胞會因為加入不完全培養(yǎng)液而很快的膨脹,使細(xì)胞處于一種不穩(wěn)定的狀態(tài)中。當(dāng)加入液體太快、太多,細(xì)胞可能漲破。因而,當(dāng)處于高滲下的細(xì)胞在緩慢滴加不完全培養(yǎng)液過程中逐步與外環(huán)境相平衡時,處于不穩(wěn)定狀態(tài)下的細(xì)胞膜就很容易融合在一起。C、融合細(xì)胞培養(yǎng)板的選擇本發(fā)明最好選用96孔板培養(yǎng)融合細(xì)胞。原理細(xì)胞融合后可置于24孔板和96孔板中培養(yǎng),最好選用96孔板培養(yǎng),其優(yōu)點(diǎn)如下1)細(xì)胞克隆生長更分散,一旦形成克隆多已初步克隆化,很有可能在原代生長中就可得到單個雜交細(xì)胞的克隆,從而增加了建株的機(jī)會。2)可減少在同一孔中不同雜交瘤細(xì)胞的競爭性生長,從而避免非分泌性雜交瘤細(xì)胞的過度生長而壓抑或掩蓋有分泌單抗能力的雜交瘤細(xì)胞。3)96孔板的孔容量只有24孔板容量的1/5,所以對單個雜交瘤細(xì)胞克隆分泌的抗體可起一定的濃縮作用,從而相應(yīng)提高了篩選抗體的靈敏度。另外融合后的細(xì)胞于96孔板分布的密度也不宜過高(5X106cell/ml)以有利于后期的抗體篩選和亞克隆。本試驗中于96孔板中每孔加50ul,每只小鼠滴加2塊96孔板。D、取雜交細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測抗體的時間本發(fā)明采用雜交瘤細(xì)胞融合后7-10天開始檢測培養(yǎng)上清的抗體。原理由于經(jīng)ELISA檢測為陽性的孔中的雜交瘤集落可能不是來自于單個細(xì)胞,可能混有不分泌抗體的克隆,且不分泌抗體的克隆具有代謝優(yōu)勢,它比分泌抗體的克隆生長更快,所以要及早進(jìn)行抗體檢測和克隆化培養(yǎng),一旦檢測出陽性孔后,愈早克隆化愈好,以避免分泌抗體的克隆被不產(chǎn)生抗體的雜交細(xì)胞過度生長所淹沒。E.制備VacA單克隆抗體時,小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞的數(shù)量和濃度本發(fā)明在用小鼠腹腔接種制備單克隆抗體時,接種的雜交瘤細(xì)胞總量為lX107ml,體積為O.5ml。原理如下腹腔接種以大量制備單克隆抗體時,腹水瘤的形成和單抗的產(chǎn)量受到許多因素的影響,包括液體石蠟預(yù)注射的劑量、從液體石蠟引發(fā)到腹腔接種之間的時間間隔、腹腔接種的雜交瘤細(xì)胞數(shù)量和濃度、雜交瘤細(xì)胞本身的生長情況及小鼠的品系、性別和年齡等因素。其中,接種的雜交瘤細(xì)胞數(shù)量和濃度為重要因素。由于接種體積一般均為0.5-lml,因而接種濃度隨接種細(xì)胞總數(shù)而變化。本發(fā)明在制備腹水時,采用的雜交瘤細(xì)胞總量為lX107ml,體積為0.5ml,全部形成腹水,且產(chǎn)量較高。本發(fā)明對雜交瘤細(xì)胞株及單克隆抗體進(jìn)行了各種指標(biāo)的鑒定,結(jié)果如下1.雜交瘤細(xì)胞染色體檢查取雜交細(xì)胞株染色后進(jìn)行染色體計數(shù),經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理,結(jié)果雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)為90士4條,SP2/0骨髓瘤細(xì)胞為64士3條,小鼠脾細(xì)胞為40條;可見骨髓瘤細(xì)胞的標(biāo)志性染色體(中部及亞中部著絲點(diǎn))以及小鼠脾細(xì)胞的端著絲點(diǎn)染色體。表明該細(xì)胞系確為小鼠B淋巴細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交瘤細(xì)胞。2.雜交瘤細(xì)胞分泌單抗能力的鑒定ELISA檢測細(xì)胞株經(jīng)小鼠腹水產(chǎn)生的單抗的效價為1:1.28X104,表明該細(xì)胞株具有分泌高滴度抗體的能力。3.雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定性鑒定經(jīng)方陣滴定確定VacA最適包板濃度為0.3ug/0.lml,以這個濃度的rVacA包板,可以保證間接ELISA對抗體的準(zhǔn)確檢測。共檢測223孔,待測孔OD值/陰性孔OD值》2.1共有68孔,與肉眼所見相同,鏡下見相應(yīng)孔中有克隆的雜交瘤細(xì)胞生長;再經(jīng)過兩次克隆后,待測孔OD值/陰性孔0D值》2.l僅有25孔,分別為四株雜交瘤細(xì)胞來源,再次進(jìn)行單克隆后,所有克隆孔ELISA檢測均為陽性,說明雜交瘤細(xì)胞具有較好的穩(wěn)定性。雜交瘤細(xì)胞株在體外連續(xù)傳30代、反復(fù)6次液氮凍存復(fù)蘇和液氮凍存1.5個月后復(fù)蘇,分別以間接ELISA法測定,其分泌的單抗效價不變,腹水效價為l:1.28X104,表明雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定性好。4.制備的單抗的免疫球蛋白類別、亞類及輕鏈型別的鑒定是確認(rèn)McAb的關(guān)鍵性指標(biāo),對McAb的純化和應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。本發(fā)明實驗動物免疫共四次,免疫時間相對較長,采用雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清為樣品,而避免使用含單克隆抗體的腹水,因為在腹水中還含有小鼠自身的各類Ig,會影響鑒定結(jié)果。用HyCultbiotechnology公司的抗體亞型檢測試劑盒進(jìn)行鑒定結(jié)果ZYA2為IgG2b類;ZYB5為IgM類;ZYC8和ZYD4為IgGl類。輕鏈均為K型。5.單抗的抗原結(jié)合特異性的鑒定免疫印跡分析在硝酸纖維素膜上,只在VacA抗原泳道區(qū)域出現(xiàn)一條明顯的特異性條帶(27KDa),而在對照因素孔(即HpaA抗原泳道)無特異條帶出現(xiàn),表明該單克隆抗體能與VacA抗原發(fā)生特異性結(jié)合。重組VacA單克隆抗體的應(yīng)用本發(fā)明用所制備的單克隆抗體,采用間接ELISA法,建立了檢測胃粘膜標(biāo)本上HpVacA抗原的試驗方法,以診斷HpVacA產(chǎn)毒株感染,此試驗方法可用于生產(chǎn)商品化的試劑盒。用建立的間接ELISA法對50份臨床胃黏膜隨機(jī)標(biāo)本進(jìn)行HpVacA抗原檢測,其中以快速尿素酶試驗(快速Hp檢測試紙購自珠??寺】萍加邢薰咎峁?,直接涂片鏡檢確定為Hp陽性的30份,陰性20份。同時與HelicoBlot試劑盒免疫印跡分析(惠州市愛立科生物有限工程公司產(chǎn)品,按說明書操作)比較。結(jié)果(見表l)完全一致。其中Hp陽性標(biāo)本中,VacA的陽性率與文獻(xiàn)報道的也相符,表明所建立的檢測HpVacA抗原的間接ELISA法可進(jìn)一步制備商品化試劑盒。表150份胃黏膜標(biāo)本HpVacA抗原檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>利用本發(fā)明提供的單克隆抗體可制備診斷VacA陽性株感染的ELISA試劑盒,也可制備相應(yīng)的疫苗和治療VacA陽性株感染的試劑。本發(fā)明的有益效果是重組HpVacA單克隆抗體及制備方法國內(nèi)外未見報道,該方法可用于大量制備VacA的單克隆抗體,制備的VacA單克隆抗體可用于生產(chǎn)診斷VacA產(chǎn)毒株感染的ELISA試劑盒,也可作為被動免疫制劑用于治療VacA產(chǎn)毒株感染,在科研上還可用于免疫組織化學(xué),以研究VacA的致病機(jī)制,具有巨大的商業(yè)價值。附圖1制備重組VacA單克隆抗體的工藝流程圖具體實施例(共ll例)實施例1動物免疫及血清抗體效價的檢測(1)動物免疫取大約68周齡雌性SPF級BALB/c小鼠2只,將VacA重組蛋白用生理鹽水配成20(ntg/ml的蛋白溶液,與福氏完全佐劑(購自北京鼎國)等比例充分乳化混勻后,取lml(蛋白含量為lOOPg/ml)混懸液分別于腹部、肘窩、腹股溝、頜下及頸部等皮下多點(diǎn)注射免疫,每只小鼠lml/次;間隔兩周后,以同樣劑量的VacA重組蛋白加福氏不完全佐劑的混懸液進(jìn)行頸背部皮下多點(diǎn)注射,再次免疫;在細(xì)胞融合前三天,用VacA重組蛋白以100l^g/只腹腔注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫。共免疫3次。另取一只正常BALB/c小鼠作對照。(2)血清抗體效價的檢測(間接ELISA法)方陣滴定法確定抗原和酶標(biāo)抗體的最佳工作濃度分別以IO、6、3、1.5、lPg/mlVacA重組蛋白為抗原包被聚乙烯微孔板,100ul/L4。C濕盒中過夜后,分別加入免疫鼠血清和用樣品稀釋液倍半稀釋(1:10、1:20、1:40、1:80、1:160……)的免疫鼠血清作方陣滴定,以同系未免疫小鼠血清為陰性對照,間接ELISA檢測血清VacA重組蛋白的抗體,以最高稀釋度的免疫血清達(dá)到陽性,且陰性對照OD值較低的抗原濃度,作為最適抗原包被濃度,再測定HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體的最佳工作濃度。確定的最佳工作濃度為VacA重組蛋白每孔100W(0.3ug),HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體1:5000。血清抗體效價檢測抗原包被取純化的VacA抗原每孔(0.3ug)包被聚苯乙烯反應(yīng)板,放濕盒中4。C過夜。棄包被液,以洗滌液洗滌3次并扣干,力B200W封閉液后置濕盒中4'C封閉2h,然后洗滌3次并扣干。檢測抗體加入待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清,同時設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照。陰性對照加入相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液,每孔IOOW;陽性對照加入免疫鼠血清(1:1000稀釋),100W/孔;空白對照孔加入PBS,對照孔均設(shè)復(fù)孔。置濕盒中37t:溫育1小時。加二抗每孔加100141:5000的HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體,置濕盒中37°C30min,洗滌3次并拍干。顯色每孔加100W底物溶液,濕盒中37t:避光顯色15-20min后,測定450nm處0D值即可判定結(jié)果。結(jié)果判定以空白對照孔調(diào)零,如待測孔OD值大于或等于陰性對照孔的2.1倍,即判定為陽性;如待測孔0D值小于陰性對照孔的1.5倍,即判定為陰性;如介于1.5和2.1之間,則為可疑陽性。(3)結(jié)果于加強(qiáng)免疫后的4天,測定小鼠血清抗體產(chǎn)生情況,2只小鼠血清抗體效價分別為1:320和1:640,選擇效價為1:640的小鼠用于單克隆抗體的制備。實施例2骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備融合前兩周復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0),待細(xì)胞生長穩(wěn)定后,以終濃度為2(^g/ml8-氮雜鳥嘌呤完全培養(yǎng)液培養(yǎng)兩周,篩選次黃嘌呤一鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型細(xì)胞。于融合前48小時將SP2/0細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng),選取生長旺盛、形態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。在融合前換新鮮培養(yǎng)液一次,用吸管輕輕吹下,收集于20ml離心管中;1000rpm,5-8分鐘,將細(xì)胞重懸于50ml無血清培養(yǎng)液中,并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為卜5X10Vml備用。滿足細(xì)胞活性在95%以上。實施例3制備飼養(yǎng)細(xì)胞懸液取未免疫的小鼠,撥除眼球放血,分離血清作陰性對照。處死后,取5ml無血清培養(yǎng)液注入腹腔,無菌吸取腹腔巨噬細(xì)胞懸液,以無血清培養(yǎng)液離心洗滌一次(1000rpm,5分鐘);重懸浮于含次黃嘌呤(H)、胸腺嘧啶核苷(T)、氨基碟呤(A)的HAT培養(yǎng)液(調(diào)整細(xì)胞濃度2X10Vml,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔O.lml含2Xl(f個細(xì)胞,于37'C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)。實施例4制備脾細(xì)胞懸液在小鼠加強(qiáng)免疫后的第四天,將免疫小鼠摘除眼球放血,分離血清用于陽性對照;處死小鼠,消毒后無菌暴露腹腔,摘取脾臟,去除脂肪和結(jié)締組織,用無血清培養(yǎng)液沖洗三次。將脾臟移入盛有5ml無血清培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中,置于200目不銹鋼篩網(wǎng)上,用注射器針芯輕輕研磨脾臟,并用無血清培養(yǎng)液沖洗,收集脾細(xì)胞懸液,以1000rpm,5分鐘,棄去上清液,重懸浮于無血清1640培養(yǎng)液中,離心洗滌一次,懸浮于不完全培養(yǎng)液中。每只小鼠約獲得2.0X108個脾細(xì)胞,P/。臺酚藍(lán)染色后不著色細(xì)胞約占97%,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.0X107ml。實施例5PEG融合細(xì)胞將制備的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞按1:6比例混合,在尖底塑料離心管中混勻成糊狀,以1000rpm,5分鐘,棄上清,用食指輕彈離心管底部,使細(xì)胞沉淀團(tuán)塊稍松散。將離心管置于37'C預(yù)溫的盛水燒杯中,緩緩注入lml50%PEG溶液,靜置90秒鐘,立即加入37i:預(yù)溫的30ml無血清培養(yǎng)液,使PEG稀釋而終止細(xì)胞融合。以800rpm,8分鐘,棄上清,重懸浮于40mlHAT培養(yǎng)液中。實施例6間接ELISA法篩選陽性克隆方法同實施例1(2)實施例7抗體陽性細(xì)胞的克隆化篩選用彎吸管吹打抗體陽性細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)的細(xì)胞,懸浮于完全培養(yǎng)液中。用血球計數(shù)板計數(shù),用含20°/。胎牛血清的1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至100、50、10個/ml。將雜交瘤細(xì)胞懸液接種于含有2X104詞養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板中,每孔加100W,使每孔分別含IO、5、l個細(xì)胞。在37'C、596C02及飽和濕度條件下靜置培養(yǎng),于顯微鏡下觀察克隆形成情況并記錄。1周后半量換液,以后每2-3天換液一次??寺』囵B(yǎng)后第14天,細(xì)胞集落長至l/4孔大,用ELISA法檢測有無VacA抗體分泌。第16天再重復(fù)檢測一次。第20天,取兩次ELISA檢測均為陽性且顯微鏡下觀察為單克隆的孔進(jìn)行第二次克隆化培養(yǎng),方法均同于第一克隆化培養(yǎng)。第二次克隆化培養(yǎng)后5-7天再選擇抗體分泌陽性且顯微鏡下觀察是單克隆的孔進(jìn)行第三次克隆化培養(yǎng),及3次亞克隆,直至100%的克隆分泌特異性抗體為止。實施例8擴(kuò)大培養(yǎng)將100%克隆分泌特異性抗體的陽性孔,在顯微鏡下觀察培養(yǎng)至細(xì)胞集落約2/3孔大,轉(zhuǎn)移細(xì)胞至24孔培養(yǎng)板,待其長至2/3孔大時,轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板,待細(xì)胞生長良好,并長至3/4孔大時,轉(zhuǎn)移細(xì)胞至5ml培養(yǎng)瓶,當(dāng)細(xì)胞長滿瓶底3/4時,再傳代培養(yǎng)。取陽性克隆孔細(xì)胞株采用有限稀釋法進(jìn)行4次克隆化,其中有四株細(xì)胞隨著克隆次數(shù)增多,抗體陽性細(xì)胞生長孔從60%增至100%,其分泌的單抗可與重組蛋白VacA特異結(jié)合,表明得到了可分泌抗HpVacA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。選取細(xì)胞形態(tài)較好的細(xì)胞生長孔進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)與凍存,并命名為ZYA、ZYB、ZYC和ZYD(ZY代表操作者和項目負(fù)責(zé)人姓氏"張、楊"拼音的第一字母)。實施例9VacA單克隆抗體的大量制備(1)腹水制備擴(kuò)大培養(yǎng)陽性雜交瘤細(xì)胞按105個細(xì)胞/ml從96孔培養(yǎng)板、24孔培養(yǎng)板、6孔培養(yǎng)板、10ml培養(yǎng)瓶,逐步擴(kuò)大培養(yǎng)。收集雜交瘤細(xì)胞1000rpm離心10分鐘,收集雜交瘤細(xì)胞,并用無血清培養(yǎng)液洗滌1-2次,盡量洗去雜蛋白,計數(shù)然后配成濃度為107ml的細(xì)胞懸液。用106個細(xì)胞/只小鼠,無菌條件下腹腔注射一周前已腹腔接種無菌醫(yī)用液體石蠟0.5ml/只的BALB/C小鼠(尤其經(jīng)產(chǎn)母鼠較好)。雜交瘤細(xì)胞以腹水瘤形式在小鼠腹腔內(nèi)大量繁殖。10-15天后小鼠腹部脹大,腹腔內(nèi)出現(xiàn)腹水,此時即可收集腹水,3000rpm離心10分鐘,取上清。(2)飽和硫酸銨鹽析法初步純化抗體用50%飽和硫酸銨將收集好的腹水用0.02mol/L、PH7.2的PBS4倍稀釋。邊搖邊逐滴緩慢加入硫酸銨,使其濃度達(dá)到50%飽和度,然后靜置2h以上,使其形成沉淀物。以12000rpm,15min,棄上清,將沉淀溶于原腹水體積2倍的PBS中。用50%飽和硫酸銨和33%飽和硫酸銨分級提取抗體(方法同上)交替進(jìn)行2-3次,最后將沉淀溶于小體積的0.OIMPH7.2的PBS(磷酸鹽緩沖液)。溶解物置于經(jīng)處理后的透析袋中,以0.01MPBS于4r透析過夜即可得純化的單克隆抗體。實施例10特性鑒定單克隆抗體的免疫球蛋白類別、亞類及輕鏈型別的鑒定是確認(rèn)McAb的關(guān)鍵性指標(biāo),對McAb的純化和應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。抗體因分子量大小、帶電量、溶解度及與抗原作用的不同分為不同的類型和亞類。本次實驗動物免疫共四次,免疫時間相對較長,其中三株產(chǎn)生的抗體為IgG,另一株分別是IgM。不同抗體類型和亞類具有不同的效應(yīng)功能,就鼠IgG而言,IgG2a、IgG2b、IgG3均能激活補(bǔ)體,IgGl反之。在增強(qiáng)吞噬細(xì)胞吞噬功能方面,IgGl最強(qiáng),其次是IgG3、IgG2a,IgG2b。在本發(fā)明中,我們采用雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清為樣品,而避免使用含單克隆抗體的腹水,因為在腹水中還含有小鼠自身的各類Ig,會影響鑒定結(jié)果。實施例11ELISA法檢測胃粘膜標(biāo)本HpVacA抗原1.技術(shù)流程經(jīng)處理的胃粘膜一作為抗原包被酶標(biāo)板(18小時,4°C)—洗板(3次)+封閉液(4小時,4°C)—洗板(3次)+制備的單克隆抗體一孵育(40分鐘,37°C)—洗板(3次)+酶標(biāo)抗體(辣根過氧化物酶標(biāo)記)一孵育(30分鐘,37°C)洗板(3次)+底物液一孵育(20分鐘,37°C)+終止液(10分鐘,避光)一顯色2.關(guān)鍵技術(shù)(1)胃粘膜標(biāo)本的處理將胃粘膜標(biāo)本液氮研磨、破碎組織、低溫離心取上清液。(2)最佳工作濃度利用方陣滴定法確定最佳工作濃度為胃黏膜標(biāo)本包被濃度l:2,單抗稀釋倍數(shù)為l:10,酶標(biāo)二抗的稀釋度為l:2500。(3)界值50份無Hp感染者胃黏膜檢測結(jié)果OD,^平均值為0.25,標(biāo)準(zhǔn)方差是0.072,故陰陽性臨界值為0.466,為了應(yīng)用方便將臨界值定為0.5。權(quán)利要求1、一種能持續(xù)穩(wěn)定分泌幽門螺桿菌重組VacA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系ZYA2、ZYB5、ZYC8、ZYD4,它們由以下步驟制得采用基因工程誘導(dǎo)表達(dá)獲取的幽門螺桿菌VacA重組蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠,將免疫小鼠的脾細(xì)胞、活性大于95%的SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合,克隆篩選能持續(xù)穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。2、如權(quán)利要求1所述的能持續(xù)穩(wěn)定分泌幽門螺桿菌重組VacA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系ZYA2、ZYB5、ZYC8、ZYD4,其中所述免疫小鼠脾細(xì)胞與活性大于95X的SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞按10:l比例進(jìn)行細(xì)胞融合,細(xì)胞融合時所用促進(jìn)劑PEG的分子量是4000,濃度是50%,細(xì)胞融合后置于96孔板中培養(yǎng)。3、如權(quán)利要求1所述的能持續(xù)穩(wěn)定分泌幽門螺桿菌重組VacA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系ZYA2、ZYB5、ZYC8、ZYD4,在其制備步驟中于雜交瘤細(xì)胞融合后7-10天開始檢測培養(yǎng)上清中的抗體。4、一種幽門螺桿菌重組VacA單克隆抗體,其特征在于對權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞用同系小鼠腹腔接種體內(nèi)誘生法獲得抗幽門螺桿菌重組VacA蛋白的單克隆抗體。5、如權(quán)利要求4所述的幽門螺桿菌重組VacA單克隆抗體,其中腹腔接種雜交瘤細(xì)胞的劑量1X107毫升,體積是0.5毫升。6、一種幽門螺桿菌重組VacA單克隆抗體在制備診斷VacA陽性株感染的ELISA試劑盒中的應(yīng)用。7、一種幽門螺桿菌重組VacA單克隆抗體在制備治療VacA陽性株感染的試劑中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及能持續(xù)穩(wěn)定分泌幽門螺桿菌重組VacA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系,特別涉及對該雜交瘤細(xì)胞用同系小鼠體內(nèi)誘生法獲得抗幽門螺桿菌重組VacA蛋白的單克隆抗體??膳c幽門螺桿菌重組VacA蛋白特異性結(jié)合,制備的VacA單克隆抗體作為包被抗體可用于生產(chǎn)診斷VacA產(chǎn)毒株感染的ELISA試劑盒,也可作為被動免疫制劑用于治療VacA產(chǎn)毒株感染,在科研上還可用免疫組織化學(xué)的方法,研究VacA的致病機(jī)制,具有巨大的商業(yè)價值。文檔編號C07K16/18GK101096656SQ200710078498公開日2008年1月2日申請日期2007年5月24日優(yōu)先權(quán)日2007年5月24日發(fā)明者張紹蘭,楊致邦申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)