專利名稱：多靶點miRNA反義核苷酸技術的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種反義核苷酸技術。
背景技術：
反義核苷酸是一段與mRNA或DNA特異性配對結合從而阻斷其基因表達 的人工合成的RNA或DNA分子。反義核苷酸能通過封閉或抑制腫瘤細胞和 病毒的關鍵編碼基因來特異性抑制細胞增殖和病毒的復制，是治療腫瘤、病毒 性疾病和其它相關疾病的新型藥物。目前正在進行研究的反義核苷酸藥物有 IO余種，其中抗腫瘤作用的有7種，抗病毒作用的l種，其它如作用于心血 管、代謝、免疫及細胞粘附系統的有4種。疾病的發生，往往是幾個或多個基 因綜合作用的結果，目前這些反義核苷酸藥物設計均是針對某個單一致病基因 或某個調節病毒基因蛋白表達(酶)的關鍵序列來設計的。微RNAs (miRNAs) 的發現改變了我們對調節基因表達機制的理解。根據miRNAs在基因組中的數 量(預計在人類基因中含量>1%，調節1~10%的基因)和表達水平(一些miRNAs 在每個細胞中的拷貝數>1000)說明miRNAs在人體內是一種含量豐富的RNA 種類。而且每個miRNA具有調節數百個mRNAs的潛能；因此miRNAs在細 胞中有廣泛的功能。目前已證明包括癌癥在內的一系列人類疾病中miRNAs 是這些疾病新的治療靶點。因此，沉默miRNAs最有效的途徑是利用miRNA 的反義核苷酸。根據疾病中miRNAs功能變化針對性的設計反義核苷酸藥物進 行干預，這是在miRNAs研究和miRNAs治療中一種基本的途徑。這些miRNA 反義核苷酸的結合具有特異性、劑量依賴性，有效性和不可逆性。這個方法已 被用來鑒定miRNAs的許多細胞學功能，且人們已經相信它是治療疾病的一種 合理的對策。目前沉默miRNAs的主要方法為Anti-miRNA反義抑制劑 (Anti-miRNA antisense inhibitors or anti-miRNA oligonucleotides, AMO )方法， 但該方法存在耙向性單一，作用效力差的問題。
發明內容
本發明是為了解決現有沉默miRNAs的方法存在靶向性單一，作用效力差 的問題，而提出了多靶點miRNA反義核苷酸技術。多耙點miRNA反義核苷
酸技術通過以下方法實現 一、通過基因芯片篩選或文獻提供，找到可調節關
鍵基因的miRNA; 二、根據所選定的多個靶miRNA，人工合成所選定靶miRNA 各自的反義核苷酸鏈，稱為反義單元；三、將不同的靶miRNA的反義單元設 計到一個能同時沉默多個靶miRNAs的單條核苷酸序列中，即實現多靶點 miRNA反義核苷酸技術。本發明將針對不同miRNA為靶標的多個反義核苷酸 整合到單一核苷酸片段中，這種片段對miRNAs具有多靶向性——復合 miRNAs (combined anti-miRNA oligonucleotides, CAMO)，它是尋找miRNAs 耙點和研究miRNAs功能的一種改良途徑，這主要是由于CAMO的"單片段-多耙點"方法可以是攜帶重復的同一反義單元的同型體或者是攜帶多種耙向不 同miRNA的反義單元的異型體。由于一個特定的mRNA被多種miRNA調節， 為了獲得基因的最佳干擾效果需要同時靶向多種miRNA，而本發明可以做到 這一點，這是CAMO方法優于AMO方法之處。由于不同目的需要多種不同 反義單元集合的組合，CAMO為此提供了一個具有創新和理性設計的方法， 為確認和鑒別miRNA的靶點和它們在基因調控過程中的作用等功能分析中提 供了一種精密的工具。本發明可以作為一種簡單而直接的方法，可對其它包含 多種miRNA及多種基因的生物過程進行研究。CAMO方法與現有方法相比較 其最大優勢在于，可以使一個藥物分子調節多個靶向基因，作用效果更加顯著， 解決了現有方法靶向性單一，作用效力差的問題。
圖1 a是結合序列片斷嵌入到HEK293細胞中的熒光素酶基因的3' UTR 上的基因片段圖，圖l b是CAM021/155/17和規則的AMO消除抑制效應的 對比圖，圖lc是CAM01/133和規則的AMO消除抑制效應的對比圖；圖2a 是在人乳腺癌細胞MCF-7中導入CAM021/155/17與分別導入miR-21， miR-155和miR-17-5p的三種反義核苷酸片段的腫瘤抑制基因的TGFBI， APC 和BCL2L11的增加情況對比圖，圖2 b是在離體的新生鼠心室肌細胞中 CAMOl/133轉染增加HCN2蛋白水平和AMOl與AM0133共轉染增加HCN2 蛋白水平的對比圖，圖2c是消除3'UTRs和miRNAs相互作用結果后熒光素 酶活性表達圖，圖2d是用CAMOl/133沉默HCN2和CACNA1C基因3' UTRs 后和miRNAs相互作用結果后熒光素酶活性表達圖，圖2e是本發明在MCF-7 細胞系中對細胞生存能力的影響圖，圖2f是CAMOs的靶miRNAs相互作用 的結果圖。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式中多靶點miRNA反義核苷酸技術通過以下 方法實現 一、通過基因芯片篩選或文獻提供，找到可調節關鍵基因的miRNA; 二、根據所選定的多個靶miRNA，人工合成所選定靶miRNA各自的反義核苷 酸鏈，稱為反義單元；三、將不同的靶miRNA的反義單元設計到一個能同時 沉默多個靶miRNAs的單條核苷酸序列中，即實現多耙點miRNA反義核苷酸 技術。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟二的多 個為2 5個。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟三中將 不同目標miRNA的反義單元設計到一個能同時沉默多個耙miRNAs的單條核 苷酸序列中是通過以下方法實現的用一條八個核苷酸的鏈來連接兩個不同目
標miRNA的反義單元，其中八個核苷酸的鏈的兩端分別連接于兩個不同的目 標miRNA的反義單元的5'和3'，反義單元兩端的五個核苷酸由亞甲基橋鎖 定。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
三的不同點在于八個核苷酸 的鏈為CTTAAATG。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
五本實施方式舉出實例證明本發明，本實施方式通過以下 方法實現現在MiR-21、 miR-155、和miR-17-5p被證明為致癌miRNAs，它 們在一些實體瘤中過度表達，miR-l和miR-133是決定肌肉特性的miRNAs， 分析測定出它們使各自目標miRNAs失活的能力，將一條有5個耙miRNAs 的結合序列(miR-21， miR-155， miR-17-5p, miR-l and miR-133)的片斷嵌入到 HEK293細胞中的熒光素酶基因的3' UTR上。
本實施方式中將有5個耙miRNAs結合序列(miR-21， miR-155， miR-17-5p， miR-l andmiR-133)的片斷嵌入到HEK293細胞中的熒光素酶基因的3'UTR上 是通過以下方法實現的如圖la所示用一條八個核苷酸的鏈接(加下劃線
標記)來連接兩端的反義單元，兩端的五個核苷酸由亞甲基橋鎖定；每一個反
義單元(大寫粗體)5'端的八個氨基酸中插入的堿基替換突變(小寫粗體)并 把突變的CAMOs列為了陰性對照。如圖1 b所示CAM021/155/17消除了
HEK293細胞中m汲-21， miR-155和miR-17-5p這三種物質引起熒光素酶活性 的抑制效應，同時作為陰性對照的突變體CAM021/155/17(MT CAM021/155/17)沒有這種作用，如圖lc所示用CAMOl/133也能觀察到相 似的結果。
為驗證上述結果，用3' UTR包含miRNA靶點的選擇性基因評估了這兩 個CAMOs在蛋白水平的作用；如圖2a所示在人乳腺癌細胞MCF-7中導入 CAM021/155/17與分別導入miR-21， miR-155和miR-17-5p三種反義核苷酸 片段相比，CAM021/155/17更為顯著的增加了腫瘤抑制基因TGFBI， APC和 BCL2L11的水平。如圖2b所示在離體的新生鼠心室肌細胞中，CAM01/133 轉染顯著的增加了兩種離子通道蛋白HCN2 (起搏點通道的一個亞單位)和 Cavl.2 (CACNA1C編碼的L型^通道的a亞型)的水平；HCN2的3' UTR包 括miR-l和miR-133兩者的假定靶點，CACNA1C的3'UTR僅僅包含一個 miR-133的靶點，顯然，在HCN2的蛋白水平產生顯著作用的既不是AMOl 也不是AM0133，當一個基因被多個miRNAs同時調節時，使用規則AMOs 會產生假陰性結果，AM01和AM0133共轉染也增加HCN2的蛋白水平，但 是與CAMOl/133相比程度明顯降低，說明CAM01/133轉染增加HCN2的蛋 白水平高。
為了驗證TGFBI, APC和BCL2L11確實分別是miR-21， miR-155和 miR-17-5p的同源耙點，且HCN2和CACNA1C是miR-l和miR-133的同源耙 點，我們從這些基因中把3'UTRs包含有miRNAs預測位點的3'UTRs或片斷 插入到熒光素酶受體載體的3' UTR。這個嵌合病毒載體包括TGFBI， APC和 BCL2L11 3'UTRs，同時含有miR-21， miR-155和miR-17-5p，還含有AMOs， CAM021/155/17或突變的CAM021/155/17,且被共轉染入HEK293細胞 中，如圖2c所示，消除3'UTRs和miRNAs相互作用結果后熒光素酶活性表 達的是CAM021/155/17而不是突變的CAM021/155/17,然而沒有一個AMO 完全逆轉熒光素酶活性的表達；如圖2d所示用CAMOl/133沉默HCN2和 CACNA1C基因3' UTRs，可以觀察到相似的熒光素酶活性表達結果，說明 TGFBI, APC和BCL2L11確實分別是miR-21 ， miR-155和miR-17-5p的同源耙 點，且HCN2和CACNA1C是miR-l和miR-133的同源耙點。
CAM021/155/17被設計用來靶定這三個在許多癌癥中過度表達頻率最高
的致癌miRNAs，如圖2e所示我們觀察到它在MCF-7細胞系中對細胞生存 能力的影響，從對照組和MT CAM021/155/17組的結果表明濃度為lOnM CAM021/155/17使存活細胞減少了 1 18%，而為了達到同樣的效果AMO的 濃度必須達到100nM。用AMO-21， AMO-15和AMO-17各10nM(總共30nM, AMO-混合物1)或者各3.3nM(總共lOnM，AMO-混合物2)共轉染后對細胞 的生存比10nM CAM021/155/17產生更加明顯的減少，說明本發明的靶定效 果好。
為了證明CAMOs的作用確實是它們的靶miRNAs相互作用的結果，我們 測定miRNAs，如圖2f所示:AMOs通過未知的機制降解耙miRNAs，而CAMOs 則顯著的下調它們的靶miRNAs，并且這些CAMOs沒有影響它們的耙基因的 mRNA水平，說明CAMOs的作用確實是它們的靶miRNAs相互作用的結果。
權利要求
1、 多耙點miRNA反義核苷酸技術，其特征在于多靶點miRNA反義核苷 酸技術通過以下方法實現 一、通過基因芯片篩選或文獻提供，找到可調節關 鍵基因的miRNA; 二、根據所選定的多個耙miRNA，人工合成所選定耙miRNA 各自的反義核苷酸鏈，稱為反義單元；三、將不同的耙miRNA的反義單元設 計到一個能同時沉默多個靶miRNAs的單條核苷酸序列中，即實現多耙點 miRNA反義核苷酸技術。
2、 根據權利要求1所述的多靶點miRNA反義核苷酸技術，其特征在于 步驟二中的多個為2 5個。
3、 根據權利要求1所述的多靶點miRNA反義核苷酸技術，其特征在于 步驟三中將不同目標miRNA的反義單元設計到一個能同時沉默多個耙 miRNAs的單條核苷酸序列中是通過以下方法實現的用一條八個核苷酸的鏈 來連接兩個不同目標miRNA的反義單元，其中八個核苷酸的鏈的兩端分別連 接于兩個不同的目標miRNA的反義單元的5'端和3'端，反義單元兩端的五 個核苷酸由亞甲基橋鎖定。
4、 根據權利要求3所述的多靶點miRNA反義核苷酸技術，其特征在于 八個核苷酸的鏈為CTTAAATG。
全文摘要
多靶點miRNA反義核苷酸技術，本發明涉及一種反義核苷酸技術。他是為了解決現有沉默miRNAs的方法存在靶向性單一，作用效力差的問題。多靶點miRNA反義核苷酸技術通過以下方法實現一、通過基因芯片篩選或文獻提供，找到可調節關鍵基因即致病基因的miRNA；二、將多條反義核苷酸設計到一個能同時沉默多個靶miRNAs的單條核苷酸序列中，即實現多靶點miRNA反義核苷酸技術。本發明可以作為一種簡單而直接的方法，可對其它包含多種miRNA及多種基因的生物過程進行研究。CAMO方法與現有方法相比較其最大優勢在于，可以使一個藥物分子調節多個靶向基因，作用效果更加顯著，解決了現有方法靶向性單一，作用效力差的問題。
文檔編號C07H21/00GK101121934SQ20071007202
公開日2008年2月13日 申請日期2007年4月11日 優先權日2007年4月11日
發明者初文峰, 呂延杰, 楊寶峰, 王志國, 白云龍 申請人:哈爾濱醫科大學;王志國