專利名稱：：一種環(huán)肽,其制備方法和其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及一種環(huán)肽化合物，其制備方法，及其在制備抗免疫抑制作用藥物中的應用。
背景技術(shù)：
：免疫抑制劑(Immunosuppressant)是一類具有免疫抑制的藥物，其主要功能是抑制機體異常的免疫反應，以用于多種器官移植(Organtransplantation)時的抗排斥反應和自身免疫性疾病(auto-immunediseases)的治療。20世紀，伴隨著外科手術(shù)和免疫抑制藥物的進展，器官移植已經(jīng)成為臟器功能衰竭的有效和常規(guī)治療手段。據(jù)資料統(tǒng)計，2005年，中國完成腎移植手術(shù)約8000例，肝移植手術(shù)近4000例，同期美國完成器官移植手術(shù)達14492例。目前，我國能夠移植的器官種類和每年實行移植手術(shù)的數(shù)量均處于亞洲首位，且我國器官移植的實施以每年5000余例次遞增。器官移植時及手術(shù)成功后，患者面臨的最大問題是如何保護移植的器官不被人體免疫系統(tǒng)排斥，使其能夠長期存活，現(xiàn)代醫(yī)學認為服用免疫抑制性藥物是最好的辦法。因此，器官移植領(lǐng)域的發(fā)展與免疫抑制藥物的創(chuàng)新發(fā)現(xiàn)密切相關(guān)，器官移植患者數(shù)量的逐年上升以及移植后終身服用抗排斥藥物的特點，同時決定了新型免疫抑制藥物的重要性和巨大市場潛力。自身免疫性疾病包括類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、腎病綜合征、重癥肌無力等等，范圍廣，病理復雜，遷延難愈，但該類疾病發(fā)生的基本病理機制是免疫耐受的缺失，因此采用免疫抑制劑進行治療，已成為醫(yī)學界的共識。鑒于器官移植手術(shù)逐年上升，且患者須終身服用，以及眾多自身免疫性疾病發(fā)病增加，治療困難且周期較長，因此研制新型免疫抑制藥物將會對其患者帶來福音，并具有較好的市場發(fā)展前景。免疫移植藥物的發(fā)展歷經(jīng)了幾個里程碑式的發(fā)展。I960年以前，由于缺少有效的免疫抑制劑，當時雖已開始腎移植，但移植后器官尚不能長期存活；I960年后的20年間硫唑嘌呤((Azathioprine，AZ)的發(fā)現(xiàn)，以及其與氫化潑尼松的聯(lián)合使用在某種程度上抑制了排斥反應，使得器官移植的范圍及成功率大大增加；1980年后迄今環(huán)孢菌素(CyclosporinA，CyA)的發(fā)現(xiàn)與臨床應用，使20多年來器官移植取得最重大進展(環(huán)孢菌素是瑞士諾華公司于1984年成功上市的產(chǎn)品，于1995年對其進行了劑型改造，形成了現(xiàn)在臨床中最為廣泛使用的新山地明)。近年來，繼環(huán)孢菌素后，一系列新型免疫抑制藥物從自然界中被發(fā)現(xiàn)，包括他克莫司(FK506)、西羅莫司、15-脫氧精胍菌素，麥考酚酸酯、賽尼哌，咪唑立賓，以及單克隆抗體、細胞因子類等。這些藥物雖然具有一定的治療作用，但由于缺乏選擇性和不容忽視的毒副作用如腎臟毒性、神經(jīng)毒性、誘發(fā)癌癥與感染等，因此目前可供使用的免疫抑制類藥物仍然遠遠不能滿足臨床的需求，也因此尋找高效、低毒的新型免疫抑制藥物仍是目前和今后國際制藥界的熱點之一。自然界在漫長的演化過程中，積累了眾多具有不同藥理作用特點的藥物分子寶庫，中草藥就是中華民族自古智慧地認識和利用自然的典型。我們認為從具有特定治療作用的中草藥中有望借助現(xiàn)代定向生物活性篩選手段發(fā)現(xiàn)具有治療意義的現(xiàn)代創(chuàng)新藥物，并循著這一哲學和方法學，曾經(jīng)高效、捷徑地發(fā)現(xiàn)了一批具有前景的藥用分子。風濕病的形成被認為是與免疫和抗炎藥理有關(guān)，因此從抗風濕中草藥中發(fā)現(xiàn)具有強生理活性、低副作用的免疫抑制活性物質(zhì)是可能的，如從民間治療類風濕關(guān)節(jié)炎的雷公藤中發(fā)現(xiàn)免疫抑制活性的雷公藤內(nèi)酯醇，并已經(jīng)進入臨床就是例證。因此，抗風濕中草藥可能是自然界中繼真菌后免疫抑制活性物質(zhì)的另一重要來源。短瓣花環(huán)肽F(brachysteminF)是從云南抗風濕中草藥短瓣花(5rac/^對ewmac"/_yam/w)中發(fā)現(xiàn)的一類具有抑制T-,B-淋巴細胞轉(zhuǎn)化的環(huán)八肽天然產(chǎn)物(臨床上使用的環(huán)孢菌素為真菌來源的環(huán)十一肽)，目前尚未見其結(jié)構(gòu)式報道，因此其是一種新化學物質(zhì)，其生物活性屬于首次發(fā)現(xiàn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種新的具有免疫抑制藥物藥用價值的化合物短瓣花環(huán)肽F(brachysteminF);另一目的在于提供一種從中草藥中提取、分離該發(fā)明化合物的方法；還在于提供該發(fā)明化合物在制備免疫抑制性藥物以及藥物組合物中的應用，以及其在器官移植和自身免疫系統(tǒng)疾病中的應用。本發(fā)明是基于中草藥中蘊藏的寶貴藥用分子資源，結(jié)合現(xiàn)代定向活性篩選的策略而發(fā)現(xiàn)的；旨在解決目前免疫抑制性藥物存在的缺陷，發(fā)展高效、低毒的新型治療藥物，用于器官移植和自身免疫性疾病的治療；其有益效果是從天然產(chǎn)物出發(fā)，產(chǎn)生新型免疫抑制劑，提高器官移植的成功率和患者的生存期，克服自身免疫性疾病的治療瓶頸，同時帶來巨大的市場經(jīng)濟效益。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案一種環(huán)肽，由3-15個氨基酸通過肽鍵連接而成。所述環(huán)肽中氨基酸種類為常見或不常見氨基酸、天然或合成氨基酸，其構(gòu)型為L-型或D-型，連接順序由氨基酸之間自由組合。優(yōu)選的環(huán)肽，是具有結(jié)構(gòu)式(I)的由8個常見氨基酸通過肽鍵連接而成的環(huán)肽，結(jié)構(gòu)中含有2個脯氨酸，2個色氨酸，l個酪氨酸，l個苯丙氨酸，1個丙氨酸和1個異亮氨酸。(I):短瓣花環(huán)肽F(BrachysteminF)的化學結(jié)構(gòu)式本發(fā)明的制備權(quán)利要求1環(huán)肽的方法是，取短瓣花(5rac/2少Wemw"c^yc/mw7)的根，曬干，粉碎，用90%乙醇回流提取，提取液合并，減壓濃縮后依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠和反相材料RP-18反復柱層析，以6當量鹽酸封管，110。C加熱水解l小時，噴以茚三酮試劑，通過比較水解前后斑點顯色狀況確定合并原則，制得結(jié)構(gòu)式(I)所示短瓣花環(huán)肽F(BmchysteminF)，其結(jié)構(gòu)為環(huán)(脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-色氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-色氨酸-酪氨酸)[cyclo(Pro-Pro-Ile-Ser畫Phe畫Ala-Ser國Tyr)]。更具體地，本發(fā)明從中草藥中提取分離本發(fā)明化合物短瓣花環(huán)肽F(BrachysteminF)的方法和步驟為采集短瓣花(萬rac/y^ewmaca/少a'"ww)的根(13kg)，曬干，教、碎。用90%乙醇回流提取4次，分別為2.0,1.5,l.O和l.O小時。提取液合并，減壓濃縮后依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取。乙酸乙酯萃取物50g經(jīng)硅膠柱層析(2.3kg,200-300目)，以氯仿-甲醇(100:0-70:30)梯度洗脫，收集流份經(jīng)薄層展開后，用6當量哉酸封管，110。C加熱水解l小時，噴以茚三酮試劑，通過比較水解前斑點不顯色，而水解后斑點呈現(xiàn)陽性反應以確定合并原則。共得到12個含環(huán)肽的組份，其中組份vni經(jīng)干柱硅膠柱層析，以乙酸乙酯-甲醇(10:1)和氯仿-甲醇(8:1)洗脫后，以上述方法進行薄層檢測，合并得環(huán)肽組份Vin-A(764mg)，本組份經(jīng)反相材料RP-18(40-63/zm)柱層析，以甲醇-水(50:50-55:45-63:37)梯度洗脫，收集含環(huán)肽的組得VIII-A-A(489mg)，本組份經(jīng)進一步硅膠柱層析，氯仿-甲醇(12:1)洗脫，得本發(fā)明的純化合物短瓣花環(huán)肽F(brachysteminF)(481mg)。即環(huán)(脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-色氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-色氨酸-酪氨酸)[cyclo(Pro國Pro隱Ile國Ser-Phe畫Ala-Ser-Tyr)]。本發(fā)明的另一種制備本發(fā)明環(huán)肽的方法，是采用組合化學或有機合成的方法制備。此外，本發(fā)明提供了其中含有治療有效量的權(quán)利要求1或2或3的環(huán)肽化合物和/或藥學上可接受的載體的藥物組合物，以及其中含有治療有效量的權(quán)利要求1或2或3的環(huán)肽化合物和/或藥學上可接受的載體的免疫抑制劑。本發(fā)明的環(huán)肽化合物可用在制備免疫抑制作用藥物中，以及用在器官移植和免疫系統(tǒng)疾病中的治療或輔助治療。本發(fā)明化合物可用于直接制備免疫抑制藥物，可用于藥物研究模板，通過組合化學方法合成一系列由不同種類、個數(shù)、構(gòu)型常見或非常見氨基酸以不同連接順序連接形成的環(huán)肽衍生物，用于系列免疫抑制藥物的發(fā)現(xiàn)和制備。本發(fā)明化合物可以直接應用，可以與其它藥物包括植物提取物組成組合物的形式使用，可以使用不同的藥用輔料，制成多種固體制劑和液體制劑，包括注射劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明的藥物可經(jīng)注射(靜注、肌注)和口服兩種形式給藥。使用量可根據(jù)用藥途徑、患者的年齡、體重、所治療的疾病的類型和嚴重程度等變化進行一次或多次使用。對成人來說，給藥量每天1100mg比較合適。具體實施例方式下面用本發(fā)明的實施例來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。實施例1:短瓣花環(huán)肽F[BrachysteminF:cyclo(Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Ala-Ser-Tyr)]的制備及結(jié)構(gòu)鑒定采集失豆辦花(S/^c/y/i^wwzaca/少cz'm/m)的t艮(13kg)，曬干，^)"碎。用90%乙醇回流提取4次，分別為2.0,1.5,l.O和l.O小時。提取液合并，減壓濃縮后依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取。乙酸乙酯萃取物50g經(jīng)硅膠柱層析(2.3kg,200-300目)，以氯仿-甲酉拿(100:0-70:30)梯度洗脫，收集流份經(jīng)薄層展開后，用6當量鹽酸封管，110。C加熱水解l小時，噴以茚三酮試劑，通過比較水解前斑點不顯色，而水解后斑點呈現(xiàn)陽性反應以確定合并原則。共得到12個含環(huán)肽的組份，其中組份VIII經(jīng)干柱硅膠柱層析，以乙酸乙酯-甲醇(10:1)和氯仿-甲醇(8:1)洗脫后，以上述方法進行薄層檢測，合并得環(huán)肽組份VIII-A(764mg)，本組份經(jīng)反相材料RP-18(40-63—柱層析，以甲醇-水(50:50-55:45-63:37)梯度洗脫，收集含環(huán)肽的組得VIII-A-A(489mg)，本組份經(jīng)進一步硅膠柱層析，氯仿-甲醇(12:1)洗脫，得本發(fā)明的純化合物短瓣花環(huán)肽F(brachysteminF)(481mg)。即環(huán)(脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-色氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-色氨酸-酪氨酸)[cyclo(Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Ala-Ser-Tyr)]。此化合物為新化合物，通過氨基酸分析和光譜資料(MS:ESI/IonTrap，ESI/Q-TOF，MALDI/TOF和NMR)推定其結(jié)構(gòu)式為cyclo(Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Ala-Ser-Tyr)，命名為短瓣花環(huán)肽F(BrachysteminF)。短瓣花環(huán)肽F(BradiysteminF)的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)氨基酸分析用日立835—50型氨基酸分析儀，分析條件為樣品經(jīng)6當量鹽酸110QC封管水解24小時；質(zhì)譜(MS)用ESI/IonTrap以確定碎片裂解途徑，ESI/Q-TOF以確定精確分子量，MALDI/TOF配以CID以提供序列方向；核磁共振譜。HNMR和13CNMR)用BrukerAM-400光譜儀測定，TMS為內(nèi)標，pyridine—^為測試溶劑；柱層析及薄層層析用硅膠為青島海洋化工廠產(chǎn)品；反相材料RP-18為曰本Daiso有限公司產(chǎn)品。短瓣花環(huán)肽F(BrachysteminF)的結(jié)構(gòu)式如下所示短瓣花環(huán)肽F(BmchysteminF):白色無定形粉末；i/:0.25(乙酸乙酉旨/甲醇4:1);0.33(氯仿/甲醇6:1);0.45(75%甲醇，RP-18);分子式C43H58N8011;分子量862;MS:MALDI/CID給出"a"series:-Tyr-Pro-Pro-Ile/Leu-Ser-Phe-Ala-Ser-和"y，，series:-(TyrPro)-Pro-Ile/Leu-Ser-Phe-Ala-Ser-;對750.5進行MS3給出Ser-Phe誦Ala-Ser;HR德885.4042[M+Na]+(calcd.forC43H58N8OnNa:885.4123);^NMR(py-《，400MHz)，13CNMR(py-^，100MHz):見表l。表l:短瓣花環(huán)肽F(BrachysteminF)的核磁共振波譜數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例2:按實施例1的方法制得短瓣—花環(huán)肽F(BrachysteminF),按常規(guī)法加注射用水，精濾，灌封滅菌可制成注射液。實施例3:按實施例l的方法制得短瓣花環(huán)肽F(BrachysteminF),將其溶于無菌注射用水中，用無菌漏斗過濾，分裝，低溫冷凍干燥后無菌熔封即得粉針劑。實施例4:按實施例1的方法制得短瓣花環(huán)肽F(BrachysteminF)，將其與適當藥用輔料混合制成片心，包衣即得腸溶片。實施例5:按實施例1的方法制得短瓣花環(huán)肽F(BrachysteminF),按常規(guī)法配以各種藥用輔料可制成各種其它固體和液體制劑。實施例6:本發(fā)明化合物短瓣花環(huán)肽F(BrachysteminF)及其與藥用輔料組成的藥物組合物的免疫抑制藥理作用。(1)實驗原理利用純系小鼠脾T/B淋巴細胞增殖反應，觀察樣品對細胞或體液免疫系統(tǒng)的影響。(2)實驗方法常規(guī)無菌采取Balb/C小鼠的脾臟，輕輕研磨后，過200目鋼網(wǎng)，RPMI1640培養(yǎng)液洗一次，2000rpmX5min離心，細胞沉淀用雙蒸水1min，雙鹽水lmin破壞紅細胞，離心棄上清，1640培養(yǎng)液調(diào)細胞濃度至2X106/ml，10u1/孔，種于96孔板，同時加ConA-(終濃度5jig/ml)或LPS(終濃度15jig/ml)，90ul/孔。加不同濃度樣品l(H4/孔，同時設(shè)陽性藥物環(huán)胞素A為陽性對照，加誘導劑、但未加藥為陰性對照孔，未加誘導劑和未加藥為空白對照孔。37°C、5%C02孵育72h，培養(yǎng)結(jié)束前4h，加MTTIO(M(終濃度0.04%)，培養(yǎng)結(jié)束后，測定OD值(激發(fā)波長540nm)。淋巴細胞轉(zhuǎn)化率=(陰性對照孔OD值-樣品孔OD值)/(陰性對照孔OD值-空白對照孔OD值)*100(3)實驗結(jié)果見表2(實驗報告由中國醫(yī)學科學院協(xié)和醫(yī)科大學藥物研究所提供)。表2短瓣花環(huán)肽F(BrachysteminF)對！78-淋巴細胞增殖的抑制活性數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>結(jié)果表明，短瓣花環(huán)肽F對T-ZB-淋巴細胞的增殖均具有較強的免疫抑制活性，且對T-淋巴細胞的抑制活性優(yōu)于對B-淋巴細胞的作用，其lC5o分別達到0.14jdg/ml禾B3.0pg/ml，即本發(fā)明化合物對細胞和體液免疫均具有抑制作用。這一結(jié)果表明本發(fā)明化合物可用于免疫抑制藥物的制備，用于器官移植、自身免疫性疾病或過敏性疾病的治療。權(quán)利要求1、一種環(huán)肽，由3-15個氨基酸通過肽鍵連接而成。2、如權(quán)利要求1所述環(huán)肽，其特征是環(huán)肽中氨基酸種類為常見或不常見氨基酸、天然或合成氨基酸，其構(gòu)型為L-型或D-型，連接順序由氨基酸之間自由組合。3、如權(quán)利要求l所述環(huán)肽，其特征是具有結(jié)構(gòu)式(I)的由8個常見氨基酸通過肽鍵連接而成的環(huán)肽4、如權(quán)利要求3所述的環(huán)肽，其特征是其中8個氨基酸為2個脯氨酸，2個色氨酸，l個酪氨酸，l個苯丙氨酸，l個丙氨酸和l個異亮氨酸。5、制備權(quán)利要求1或2或3或4環(huán)肽的方法，取短瓣花(Srac/23^emmaca/_ycz>wm)的根，曬干，粉碎，用90%乙醇回流提取，提取液合并，減壓濃縮后依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠和反相材料RP-18反復柱層析，以6當量鹽酸封管，110。C加熱水解l小時，噴以茚三酮試劑，通過比較水解前后斑.結(jié)構(gòu)式(1)。點顯色狀況確定合并原則即得所述環(huán)肽。6、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征是取短瓣花的根，曬干，粉碎，用90%乙醇回流提取4次，分別為2.0,1.5,l.O和l.O小時，提取液合并，減壓濃縮后依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱層析，以100:0-70:30的氯仿/甲醇梯度洗脫，收集流份經(jīng)薄層展開后，用6當量鹽酸封管，110°C加熱水解1小時，噴以茚三酮試劑，通過比較水解前斑點不顯色，而水解后斑點呈現(xiàn)陽性反應以確定合并原則，共得到12個含環(huán)肽的組份，其中組份vm經(jīng)干柱硅膠柱層析，以10:1乙酸乙酯/甲醇和8:1氯仿/甲醇洗脫后，以上述方法進行薄層檢測，合并得環(huán)肽組份vni-A，本組份經(jīng)反相材料RP-18柱層析，以50:50-55:45-63:37甲醇/水梯度洗脫，收集含環(huán)肽的組份Vin-A-A，本組份經(jīng)進一步硅膠柱層析，12:1氯仿/甲醇洗脫，得結(jié)構(gòu)式(I)短瓣花環(huán)肽F化合物，即環(huán)脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-色氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-色氨酸-酪氨酸。7、制備權(quán)利要求1或2或3或4環(huán)肽的方法，采用組合化學或有機合成的方法制備。8、一種藥物組合物，其中含有治療有效量的權(quán)利要求1或2或3或4的環(huán)肽化合物和/或藥學上可接受的載體。9、一種免疫抑制劑，其中含有治療有效量的權(quán)利要求1或2或3或4的環(huán)肽化合物和/或藥學上可接受的載體。10、權(quán)利要求1或2或3或4環(huán)肽化合物在制備免疫抑制作用藥物中的應用。11、權(quán)利要求1或2或3或4環(huán)肽化合物在制備器官移植輔助藥物中的應用。全文摘要一種環(huán)肽，由3-15個氨基酸通過肽鍵連接而成，環(huán)肽中氨基酸種類為常見或不常見氨基酸、天然或合成氨基酸，其構(gòu)型為L-型或D-型，連接順序由氨基酸之間自由組合。優(yōu)選結(jié)構(gòu)式(I)由8個常見氨基酸通過肽鍵連接而成的環(huán)肽，此環(huán)肽的制備方法，及其在制備免疫抑制作用藥物中的應用。文檔編號C07K5/12GK101161674SQ20071006603公開日2008年4月16日申請日期2007年7月13日優(yōu)先權(quán)日2007年7月13日發(fā)明者青呂,程永現(xiàn)申請人:中國科學院昆明植物研究所