專利名稱：人參水溶性蛋白的分離純化制備方法
技術領域：
本發明屬于蛋白質分離純化技術領域，具體涉及一種采用緩沖液浸提、硫酸銨沉淀和各種層析柱層析技術相結合的人參水溶性蛋白的分離純化制備方法。
背景技術：
人參蛋白及多肽的研究始于六十年代，主要集中于人參多肽的提取方法。1963年，德國的F.Gstirnor等人首次從人參根中檢測出多種氨基酸谷氨酸、半光氨酸、酪氨酸等。1966年他們(Arch Pharm.1966，299(11)934～937)又采用電泳的方法從高麗白參的甲醇水提取液中得到5個小肽，未確定出一級結構。1980年，日本人Ando與Okada(Planta Medica.1980，3818～21)等發現人參水提取液中有一種強烈抑制腎上腺素誘導的脂肪分解的物質，此物質能被鏈霉蛋白酶(pronase)破壞，估計為蛋白或肽類化合物。經DEAE-Cellulose，Sephadex G-10，Avicel-Cellulose，Phosphoric-Cellulose等色譜手段分得一個14肽，氨基酸組成為2Asp，Thr，Ser，3Glu，3Gly，Ala，Val，Leu，Ile，未測出一級結構，之后也未查到繼續研究此肽的報道。1990年Takaku和Okada(Planta Medica.1990，5627～30)等又報道從高麗紅參中得到一種酸性物質，可以抑制腎上腺素誘導的脂肪分解并能刺激胰島素參與的脂肪合成，并確定該酸性物質為焦谷氨酸。同時他們還指出紅參中可能有一種非肽物質也有此活性。在此期間，韓國的Kim(CA.10868730s，107242499p)等報道從人參中分離純化到有抗脂肪分解活性的寡肽，但未給出一級結構。Yagi等人1994年從人參中提取到一種四肽成分Val-D-Glu-D-ArG-Gly。并證明一些非蛋白氨基酸對其調節神經系統活性至關重要。魏俊杰等人(白求恩醫科大學學報.1990，16(5)436～438)從生曬參中分離出兩種人參多肽，分別是分子量為1kDa的11肽和分子量為1.3kDa的12肽，它們具有降低2BS細胞內多糖含量和增強2BS細胞內琥珀酸脫氫酶活力的作用。Chen等(Peptide Research.1998，52137～142)人利用水醇提取法，結合離子交換、凝膠過濾和RP-HPLC從人參中分離出六種含α氨基酸的小肽，并通過氨基酸序列分析已測定其結構為氧化性的谷胱甘肽及其類似物，實驗證明，它具有調節動物睡眠的作用。另外，一種14肽也從人參中提取出來，結構為Glu-Thr-Val-Glu-Ile-Ile-ASP-Ser-Glu-Gly-Gly-Gly-ASP-Ala，它具有強烈的抗脂解活性(Jounal of Chromatography B.1996，687443～448)。吉林大學的張今等(高等學校化學學報.1985，61(4)376～380)，1985年報道用717型和732型離子交換樹酯柱從人參花蕾中分得兩個酸性肽，氨基酸組成分別為IASP-Thr-Ser-Glu-Gly-Ala-Val-Mat-Leu-Phe-Arg，分子量大于1.5kDa。IIASP-Thr-Ser-Glu-Gly-Ala-Val-Ile-Leu-Lys，分子量大于1.2kDa。1988年，他們(吉林大學自然科學學報.1988，475～78)又按照日本人Ando的分離程序及改進的分離程序(用Sephadex G-25凝膠過濾)從人參中分離出一個具有胰島素作用的14肽，認為是Ando得到的14肽，但存在一個氨基酸的差異，并用DABITC/PICTC雙偶合法測定了序列為Glu-Thr-Val-Glu-Ile-Ile-ASP-Ser-Glu-Gly-Gly-Gly-ASP-Ala。其后，又用CD譜研究了該肽的二級結構(生物化學與生物物理學報.1989，21(2)175～176)；生理活性研究表明有抗脂肪分解及降低血糖和肝糖作用(藥學學報.1990，25(6)401～402；藥學學報.1990，25(10)727～728)；對該肽的基因進行了化學合成和克隆(生物化學雜志.1990，6(3)193～195)。1991年又報道從紅參中經DEAE-Cellulose，Sephadex G-10和RP-HPLC純化得到兩個肽(藥學學報.1991，26(7)499～502)，其一為13肽3Gly，2Ser，2Glu，Ala，2Asp，Thr，Leu，Val；另一為15肽4Gly，3Ser，2Glu，2Ala，Asp，Thr，Leu，Ile。測出了15肽的N末端為Asp，各肽均未給出一級結構。
進入90年代中期，由于現代生物技術在中藥領域的廣泛應用，對于人參蛋白的研究才日益增多。應用二維電泳技術現已表明人參中共有人參蛋白300多種，其中已被報道的僅有40多種(Journal of Chromatography B.2005，815147～155Journal of Plant Physiology.2004，161837～845)，主要包括(1)類RNA酶蛋白類RNA酶蛋白是人參的主要蛋白(ginseng major protein，GMP)，分子量為28kDa，其氨基酸序列與植物的RNA酶具有高度同源性(Comparative Biochemistryand Physiology B.2002，132551～557)。二維電泳分析顯示GMP的含量隨季節的變化而變化，因此這一蛋白也被認為是人參的儲存蛋白。(2)核糖核酸酶Lam和Ng從人參根中分離得到一種由27kDa和29kDa兩個亞基組成的非耐熱核糖核酸酶，其具有抗真菌、抗病毒和抑制增殖的活性(Biochemical and BiophysicalResearch Communications.2001，285419～423)。隨后他們又從人參花蕾中分離得到一分子量23kDa的核糖核酸酶，但卻沒有抗真菌、抗病毒和抑制增殖的活性(Protein Expression and Purification.2004，33195～199)。Gennady也從人參愈傷組織中分離得到兩種分子量都為18kDa的核糖核酸酶(FEBS Letters.1997，407207～210)。(3)幾丁質樣蛋白分子量1 5kDa，具有抗真菌功能(The InternationalJournal of Biochemistry and Cell Biology.2001，33，287～297)。(4)木聚糖酶從人參根部提取的木聚糖酶，分子量只有15kDa，明顯低于從其他藥用植物分離得到木聚糖酶，最適酶活溫度為50℃，具有人I型免疫缺陷病毒轉錄抑制的活性(LifeSciences.2002，703049～3058)。(5)皂苷β～葡萄糖苷酶從人參中分離的皂苷β～葡萄糖苷酶能水解人參皂苷Rg3，得到抗癌物質人參皂苷Rh2，分子量59kDa，最適酶活溫度為60℃(Chemical and Pharmaceutical Bulletin.2001，49795～798)。
發明內容
本發明的目的是提供一種高純度人參水溶性蛋白的制備方法，其是將人參勻漿液反復浸提、用硫酸銨等沉淀得到粗人參總蛋白，再經超濾以及各種層析柱純化，從而獲得多種高純度的人參水溶性蛋白產品。
本發明所述的制備方法包括如下步驟1)將鮮參切成小塊，按1～3ml/g的比例加入含0.1～0.3mol/L NaCl、pH＝7～8的0.01～0.03mol/L Tris-HCl緩沖液勻漿，得勻漿液；再加勻漿液10～20倍體積的上述緩沖液，于1～10℃條件下浸提12～36小時，浸提后于1～10℃、3000～10000r/min離心10～60min，取上清液；然后向浸提后沉淀的人參沉渣中加入與第一次浸提時相同體積的上述緩沖液，于1～10℃條件下再浸提12～36小時，浸提后于1～10℃、3000～10000r/min離心10～60min，取上清液；進行2～3次浸提操作后，合并所得上清液，即為人參總蛋白粗提液；2)向上述人參總蛋白粗提液中加入固體硫酸銨(硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、或磷酸鈉)至70～90％飽和度，混勻后于1～10℃靜置12～36小時，再于1～10℃、3000～10000r/min離心10～60min，取沉淀；然后按1～3ml/g的比例將沉淀溶于pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl緩沖液后裝入透析袋中，透析袋的截留分子量為6000～8000Da，于1～10℃透析12～36小時，透析保留液(透析后留在透析袋內的物質，以下均與此相同)1～10℃、3000～10000r/min離心10～60min，取上清液冷凍干燥后即為人參總蛋白樣品；3)先將人參總蛋白樣品用pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl緩沖液溶解，1～2g人參總蛋白樣品使用3000～6000ml緩沖液，再上樣于截流分子質量為10kDa的超濾儀進行超濾，分別收集大、小分子流出液，冷凍干燥后得到分子質量大于10kDa的大分子樣品A1和分子質量小于10kDa的小分子樣品A2；
4)將大分子樣品A1用pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl緩沖液透析(透析袋的截留分子量為6000～8000Da)，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min離心5～15min、上清液再經0.22～0.45μm濾膜過濾后上樣于用此步驟所述緩沖液平衡好的Affi-gel(blue gel)親和層析柱，用pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl緩沖液洗柱直至樣品的280nm處吸收峰回到基線(用280nm紫外檢測器進行檢測)，再用含1～2mol/L NaCl的pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl緩沖液進行鹽階段洗脫，流速為0.1～3.0ml/min，分別收集得到未吸附樣品A1B1(未掛柱樣品)和鹽階段洗脫樣品A1B2；5)將鹽洗脫樣品A1B2用pH＝4.0～6.0、0.01～0.03mol/L醋酸銨-醋酸緩沖液透析(透析袋的截留分子量為6000～8000Da)，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min離心5～15min、上清液再經0.22～0.45μm濾膜過濾后上樣于用此步驟所述緩沖液平衡好的SP-Sepharose FF離子交換柱，用pH＝4.0～6.0、0.01～0.03mol/L醋酸銨-醋酸緩沖液洗柱直至樣品的280nm處吸收峰回到基線，再用含0～1mol/L NaCl的此步驟所述緩沖液進行鹽梯度洗脫，流速為0.1～3.0ml/min，收集第二個洗脫峰A1B2C2，得人參蛋白(Ginseng Protein)GP1，其分子量范圍在23～27kDa；通過SDS～PAGE凝膠電泳可判定本步驟所得產物為人參蛋白，因為只有蛋白才會在SDS～PAGE凝膠電泳上顯示條帶。分子量不同的蛋白其在SDS～PAGE凝膠電泳上的位置不同，得到的各蛋白分子量可以通過已知標準蛋白分子量的標準曲線方程來獲得；6)將樣品A1B1用pH＝4.0～6.0、0.01～0.03mol/L醋酸銨-醋酸緩沖液透析(透析袋的截留分子量為6000～8000Da)，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min離心5～15min、上清液再經0.22～0.45μm濾膜過濾后上樣于用此步驟所述緩沖液平衡好的SP-Sepharose FF離子交換柱，用pH＝4.0～6.0、0.01～0.03mol/L醋酸銨-醋酸緩沖液洗柱直至樣品的280nm處吸收峰回到基線，再用含0～1mol/L NaCl的此步驟所述緩沖液進行鹽梯度洗脫，流速為0.1～3.0ml/min，收集未吸附樣品A1B1C1；收集第一個洗脫峰A1B1C2，得人參蛋白GP2，其分子量范圍在60～70kDa；收集第二個洗脫峰A1B1C3；7)將樣品A1B1C1用pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl緩沖液透析(透析袋的截留分子量為6000～8000Da)，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min離心5～15min、上清液再經0.22～0.45μm濾膜過濾后上樣于用此步驟所述緩沖液平衡好的DEAE-Sepharose FF離子交換柱，用pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl緩沖液洗柱直至280nm處吸收峰回到基線，用含0～1mol/L NaCl的此步驟所述緩沖液進行鹽梯度洗脫，流速為0.1～3ml/min，收集第一個洗脫峰A1B1C1D1，得人參蛋白GP3，。其分子量范圍在10～20kDa；8)將樣品A1B1C3用含1～2mol/L硫酸銨的pH＝7～8、0.01～0.03mol/LTris-HCl緩沖液透析(透析袋的截留分子量為6000～8000Da)，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min離心5～15min、上清液經0.22～0.45μm濾膜過濾后上樣于用此步驟所述緩沖液平衡好的Phenyl Sepharose 6 FF疏水層析柱，用含1～2mol/L硫酸銨的pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl緩沖液洗柱直至樣品的280nm處吸收峰回到基線，流速為0.1～3ml/min，收集未吸附部分A1B1C3D1，得人參蛋白GP4，其分子量范圍在60～70kDa；9)將樣品A2上樣于用pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl緩沖液平衡好的Sephadex G-25凝膠過濾層析柱，用此步驟所述緩沖液洗脫至樣品的280nm處吸收峰回到基線，流速為0.1～3ml/min，收集第一個洗脫峰A2B1，得人參蛋白GP5，其分子量范圍在5～10kDa；10)上述各步驟獲得的人參蛋白樣品GP1～GP5，分別經過pH＝7～8、0.01～0.03mol/LTris-HCl緩沖液于1～10℃透析12～36h，透析袋截留分子量范圍為6000～8000Da，透析保留液再于1～10℃、3000～10000r/min離心10～60min，上清液冷凍干燥后即得各種人參水溶性蛋白。
本發明具有的優點在于獲得各人參蛋白的純化工藝簡單、周期短、見效快，所得樣品在SDS～PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳中除GP4以外均顯示一條帶，說明已達到電泳純，收率分別為GP1(56％)、GP2(67％)、GP3(81％)、GP4(92％)、GP5(89％)。采用SP-Sepharose FF和DEAE-Sepharose FF離子交換柱層析具有純化效果好、上樣量大、樣品得率較高且可用于放大生產的特點。
圖1實施例1制備的人參總蛋白及各純化蛋白的SDS～PAGE電泳圖。
如圖1所示，其中M表示的是分子量標準蛋白，自上而下分子量依次為97kDa、66kDa、43kDa、31kDa、20kDa、14kDa；GP1～GP5為各純化蛋白；GP為人參總蛋白。
具體實施例方式
實施例15種人參蛋白的分離純化1、人參總蛋白的提取稱取100g鮮參切成小塊，加300ml含0.15mol/L NaCl的pH＝7.4的0.01mol/L Tris-HCl緩沖液勻漿，勻漿液再加3000ml含0.15mol/L NaCl的pH＝7.4的0.01mol/L Tris-HCl緩沖液于4℃條件下浸提24小時，浸提后于4℃、6000r/min離心30min，得上清液3100ml；然后向沉淀的人參沉渣中再加入3000ml含0.15mol/L NaCl的pH＝7.4的0.01mol/L Tris-HCl緩沖液，于4℃條件下再浸提24小時，浸提后于4℃、6000r/min離心30min，得上清液3000ml；合并2次浸提所得上清液，即得人參總蛋白粗提液6100ml；2、硫酸銨沉淀向上述步驟獲得的6100ml人參總蛋白粗提液中加入3148克固體硫酸銨(80％飽和度)，混勻后于4℃靜置24小時，再于4℃、6000r/min離心30min，得沉淀3.2克；然后按3ml/g的比例將沉淀溶于pH＝7.4、0.01mol/LTris-HCl的緩沖液后裝入透析袋中，透析袋截留分子量是8000Da，4℃透析24小時，透析保留液再于4℃、6000r/min離心30min，取上清液凍干后得人參總蛋白樣品2g，見電泳圖1中的GP；GP中包含有下述步驟制備的GP1～GP5各蛋白，除GP1～GP5各蛋白外還有分子量范圍在15～25kDa之間的兩條帶沒被分離出來，GP1為類RNA酶蛋白，具有抗真菌、抗病毒和轉錄抑制活性；GP3為殼多糖酶樣蛋白，具有抗真菌功能；GP4為人參核糖核酸酶，該蛋白主要由29kDa和27kDa兩個亞基組成，具有抗真菌和抗病毒的活性；采用本發明所述方法獲得的人參蛋白GP2和GP5未見文獻報道；3、超濾取上述步驟制備的人參總蛋白樣品1g，用pH＝7.4、0.01mol/L Tris-HCl緩沖液溶解至3000ml，再用截留分子量為10kDa的超濾膜超濾，凍干，分別得到900mg分子量大于10kDa的大分子組份A1和100mg分子量小于10kDa的小分子組份A2；4、親和層析用pH＝7.4、0.01mol/L Tris-HCl緩沖液平衡Affi-Gel(blue gel)層析柱，先將大分子組份A1用pH＝7.4、0.01mol/L Tris-HCl緩沖液透析，透析袋截留分子量是8000Da，透析保留液于4℃以12000r/min離心10min，取上清液，經0.22μm濾膜過濾，所得過濾液再加入Affi-Gel(blue gel)層析柱內，用pH＝7.4、0.01mol/L Tris-HCl緩沖液洗柱直至樣品的280nm處吸收峰回到基線，采用含1.5mol/L NaCl的此步驟所述緩沖液進行鹽階段洗脫，收集得到未吸附部分A1B1850mg和1.5mol/L NaCl洗脫樣品A1B2 50mg，洗脫流速0.3ml/min，用UV280nm檢測洗脫過程；5、陽離子交換層析用pH＝5.0、0.01mol/L醋酸銨-醋酸緩沖液平衡SP-Sepharose FF層析柱，將A1B2用此步驟所述緩沖液透析，透析袋截留分子量是8000Da，透析保留液于4℃以12000r/min離心10min，取上清液，經0.22μm濾膜過濾，所得過濾液再加入SP-Sepharose FF層析柱內，用pH＝5.0、0.01mol/L醋酸銨-醋酸緩沖液洗柱直至樣品的280nm處吸收峰回到基線，采用含0～0.5mol/LNaCl的此步驟所述緩沖液進行梯度洗脫，洗脫流速0.5ml/min，收集第二個洗脫峰；將第二個洗脫峰A1B2C2于pH＝7.4、0.01mol/LTris-HCl緩沖液4℃透析24小時，透析保留液再于4℃、6000r/min離心30min，取上清液凍干后保存，得人參蛋白樣品GP1(18mg)，其分子量是25kDa，電泳見圖1中的GP1，UV280nm檢測洗脫過程；6、用pH＝5.0、0.01mol/L醋酸銨-醋酸緩沖液平衡SP-Sepharose FF層析柱，將A1B1用此步驟所述緩沖液透析，透析袋截留分子量8000Da，透析保留液于4℃以12000r/min離心10min，取上清液，經0.22μm濾膜過濾，所得過濾液加入SP-Sepharose FF層析柱內，用pH＝5.0、0.01mol/L醋酸銨-醋酸緩沖液洗柱直至樣品的280nm處吸收峰回到基線，再用含0～0.5mol/L NaCl的此步驟所述緩沖液進行梯度洗脫，洗脫流速0.5ml/min，收集得到未吸附部分A1B1C1、第一個洗脫峰A1B1C2和第二個洗脫峰A1B1C3，將A1B1C2于pH＝7.4、0.01mol/L Tris-HCl緩沖液4℃透析24小時，透析保留液再于4℃、6000r/min離心30min，取上清液凍干后保存，得人參蛋白樣品GP2(49mg)，其分子量是65kDa，電泳見圖1中的GP2，UV280nm檢測洗脫過程；7、陰離子交換層析用pH＝7.4、0.01mol/L Tris-HCl緩沖液平衡DEAE-Sepharose FF層析柱，將A1B1C1用此步驟所述緩沖液透析，透析袋截留分子量是8000Da，透析保留液于4℃以12000r/min離心10min，取上清液，經0.22μm濾膜過濾，所得過濾液加入DEAE-Sepharose FF層析柱內，用pH＝7.4、0.01mol/LTris-HCl緩沖液洗柱直至樣品的280nm處吸收峰回到基線，用含0～0.5mol/L NaCl的此步驟所述緩沖液進行梯度洗脫，洗脫流速0.5ml/min，收集得到兩個洗脫峰，將第一個洗脫峰A1B1C1D1于pH＝7.4、0.01mol/L Tris-HCl緩沖液4℃透析24小時，透析保留液再于4℃、6000r/min離心30min，取上清液凍干后保存，得人參蛋白樣品GP3(24mg)，其分子量是15kDa，電泳見圖1中的GP3，UV280nm檢測洗脫過程；8、疏水層析用含1.7mol/L硫酸銨的pH＝7.4、0.01mol/L Tris-HCl緩沖液平衡Phenyl-Sepharose 6FF(high sub)疏水層析柱，將A1B1C3用此步驟所述緩沖液透析，透析袋截留分子量是8000Da，透析保留液于4℃以12000r/min離心10min，取上清液，經0.22μm濾膜過濾，所得過濾液加入Phenyl-Sepharose 6 FF(high sub)疏水層析柱內，用含1.7mol/L硫酸銨的pH＝7.4、0.01mol/LTris-HCl緩沖液洗柱直至樣品的280nm處吸收峰回到基線，收集得到未吸附部分A1B1C3D1，將A1B1C3D1于pH7.4、0.01mol/LTris-HCl緩沖液4℃透析24小時，透析保留液再于4℃、6000r/min離心30min，取上清液凍干后保存，得人參蛋白樣品GP4(308mg)，其分子量是66kDa，電泳見圖1中的GP4，洗脫流速0.5ml/min，UV280nm檢測洗脫過程；9、凝膠過濾層析取100mg A2凍干品，溶于1ml pH＝7.4、0.01mol/L Tris-HCl緩沖液中，于4℃以12000r/min離心10min，取上清液，經0.22μm濾膜過濾，所得過濾液加入已用此步驟所述緩沖液平衡好的Sephadex G-25凝膠層析柱中，用此緩沖液洗脫，收集得到第一個洗脫峰A2B1，將A2B1于pH7.4、0.01mol/L Tris-HCl緩沖液4℃透析24小時，再于4℃、6000r/min離心30min，取上清液凍干后保存，得人參蛋白樣品GP5(55mg)，其分子量是8kDa，電泳見圖1中的GP5，洗脫流速0.3ml/min，UV280nm檢測洗脫過程。
權利要求
1.人參水溶性蛋白的分離純化制備方法，其包括如下步驟(1).將鮮參切成小塊，按1～3ml/g的比例加入含0.1～0.3mol/L NaCl、pH＝7～8的0.01～0.03mol/L Tris-HCl緩沖液勻漿，浸提后合并所得上清液，即為人參總蛋白粗提液；(2).向上述人參總蛋白粗提液中加入固體硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉或磷酸鈉至70～90％飽和度，混勻后于1～10℃靜置12～36小時，再于1～10℃、3000～10000r/min離心10～60min，取沉淀；然后按1～3ml/g的比例將沉淀溶于pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl緩沖液后裝入透析袋中，透析袋截留分子量為6000～8000Da，1～10℃透析12～36小時，透析保留液于1～10℃、3000～10000r/min離心10～60min，取上清液冷凍干燥后即為人參總蛋白樣品；(3).將人參總蛋白樣品上樣于截流分子質量為10kDa的超濾儀進行超濾，分別收集大、小分子流出液，冷凍干燥后得到分子質量大于10kDa的大分子樣品A1和分子質量小于10kDa的小分子樣品A2；(4).將樣品A1用pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl緩沖液透析、透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min離心5～15min、上清液經0.22～0.45μm濾膜過濾后上樣于用此步驟緩沖液平衡好的Affi-gel(bluegel)親和層析柱，洗柱直至樣品的280nm處吸收峰回到基線，再用含1～2mol/L NaCl的此步驟緩沖液進行鹽階段洗脫，流速為0.1～3.0ml/min，分別收集得到未吸附樣品A1B1和鹽階段洗脫樣品A1B2；(5).將鹽洗脫樣品A1B2用pH＝4.0～6.0、0.01～0.03mol/L醋酸銨-醋酸緩沖液透析，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min離心5～15min、上清液經0.22～0.45μm濾膜過濾后上樣于用此緩沖液平衡好的SP-Sepharose FF離子交換柱，洗柱直至樣品的280nm處吸收峰回到基線，再用含0～1mol/L NaCl的此緩沖液進行鹽梯度洗脫，流速為0.1～3.0ml/min，收集第二個洗脫峰A1B2C2，得人參蛋白GP1，其分子量范圍在23～27kDa；(6).將樣品A1 B1用pH＝4.0～6.0、0.01～0.03mol/L醋酸銨-醋酸緩沖液透析，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min離心5～15min、上清液經0.22～0.45μm濾膜過濾后上樣于用此緩沖液平衡好的SP-SepharoseFF離子交換柱，用緩沖液洗柱直至樣品的280nm處吸收峰回到基線，再用含0～1mol/L NaCl的此緩沖液進行鹽梯度洗脫，流速為0.1～3.0ml/min，收集未吸附樣品A1B1C1，收集第一個洗脫峰A1B1C2，得人參蛋白GP2，其分子量范圍在60～70kDa，并收集第二個洗脫峰A1B1C3；(7).將樣品A1B1C1用pH＝7～8、0.01～0.03mol/LTris-HCl緩沖液透析，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min離心5～15min、上清液經0.22～0.45μm濾膜過濾后上樣于用此緩沖液平衡好的DEAE-Sepharose FF離子交換柱，洗柱直至280nm處吸收峰回到基線，用含0～1mol/L NaCl的此緩沖液進行鹽梯度洗脫，流速為0.1～3ml/min，得到第一個洗脫峰A1B1C1D1，為人參蛋白GP3，其分子量范圍在10～20kDa；(8).將樣品A1B1C3用含1～2mol/L硫酸銨的pH＝7～8、0.01～0.03mol/LTris-HCl緩沖液透析，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min離心5～15min、上清液經0.22～0.45μm濾膜過濾后上樣于用此緩沖液平衡好的Phenyl Sepharose 6 FF疏水層析柱，用緩沖液洗柱直至樣品的280nm處吸收峰回到基線，流速為0.1～3ml/min，得到未吸附部分A1B1C3D1，為人參蛋白GP4，其分子量范圍在60～70kDa；(9).將樣品A2上樣于用pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl緩沖液平衡好的Sephadex G-25凝膠過濾層析柱，用此緩沖液洗脫至樣品的280nm處吸收峰回到基線，流速為0.1～3ml/min，得到第一個洗脫峰A2B1，為人參蛋白GP5，其分子量范圍在5～10kDa；(10).收集上述各步驟獲得的人參蛋白樣品GP1～GP5，分別經過pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl緩沖液1～10℃透析12～36h，透析袋截留分子量范圍為6000～8000Da，透析保留液再于1～10℃、3000～10000r/min離心10～60min，取上清液冷凍干燥后即得人參水溶性蛋白。
2.如權利要求1所述的人參水溶性蛋白的分離純化制備方法，其特征在于步驟(1)浸提是向勻漿后得到的勻漿液中加入10～20倍體積的此步驟所述緩沖液，于1～10℃條件下浸提12～36小時，浸提后于1～10℃、3000～10000r/min離心10～60min，取上清液；然后向沉淀的人參沉渣中加入與第一次浸提時相同體積的同種緩沖液，于1～10℃條件下再浸提12～36小時，浸提后于1～10℃、3000～10000r/min離心10～60min，取上清液；進行2～3次浸提后，合并所得上清液。
3.如權利要求1所述的人參水溶性蛋白的分離純化制備方法，其特征在于步驟(2)是向人參總蛋白粗提液中加入固體硫酸銨至70～90％飽和度。
4.如權利要求3所述的人參水溶性蛋白的分離純化制備方法，其特征在于步驟(2)是向人參總蛋白粗提液中加入固體硫酸銨至80％飽和度。
5.如權利要求1所述的人參水溶性蛋白的分離純化制備方法，其特征在于步驟(3)超濾步驟前先將人參總蛋白樣品用pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl緩沖液溶解，1～2g人參總蛋白樣品使用3000～6000ml緩沖液。
全文摘要
本發明屬于蛋白質分離純化技術領域，具體涉及一種采用緩沖液抽提、硫酸銨沉淀和親和層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析分離純化制備人參蛋白的方法。其是將人參勻漿液浸提后加入固體硫酸銨至80％飽和度，經Tris－HCl緩沖液平衡透析、高速離心后超濾、多種層析純化后得到5種人參蛋白(Ginseng Protein)GP1－GP5，其中GP1為類RNA酶，GP3為殼多糖酶樣蛋白，GP4為人參核糖核酸酶，GP2和GP5兩種蛋白均為首次報道。本發明具有純化效果好、上樣量大、樣品收率較高且可用于放大生產等特點。所得樣品在SDS－PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳中除GP4以外均顯示一條帶，說明已達到電泳純。
文檔編號C07K1/34GK101092448SQ200710055850
公開日2007年12月26日 申請日期2007年7月6日 優先權日2007年7月6日
發明者趙雨, 張巍, 李紅艷, 惠歌, 李銀清, 姜先剛, 唐任能, 幺寶金 申請人:長春中醫藥大學