專利名稱：一種高效分離純化10－去乙酰基巴卡亭ⅲ(10－dabⅲ)的方法
技術領域：
本發明屬于從紅豆杉中提取藥用物質的技術，特別是對紅豆杉中提取的半成品10-去乙酰基巴卡亭III(解寫為10-DAB III)再進行分離純化成為高純度精品的方法。
背景技術：
10-去乙酰基巴卡亭III(10-DAB III)作為紅豆杉樹種中主要存在的一個結構單體，可以作為半合成抗腫瘤藥物紫杉醇和多西紫杉醇的前體。紫杉醇和多西紫杉醇在臨床上已經被用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌等治療，其療效好，毒副作用小，逐步成為抗腫瘤一線藥物。隨著癌癥病人的逐年增多，對紫杉醇和多西紫杉醇的需求日益加劇，對其原料的需求更甚。以往獲得紫杉醇都是采用天然紅豆杉的木質中提取分離，而用木質提取需要砍伐紅豆杉，由于紅豆杉樹資源的局限性和提取成本偏高等不利因素嚴重阻礙行業的發展。為了更好的滿足市場，目前，半合成獲取紫杉醇和多西紫杉醇已經成為大部分制藥企業獲得原料的首選模式，而半合成最重要的前體物就是10-DAB III，它廣泛分布于多種類型的紅豆杉枝葉中，枝葉本身就是可再生資源，所以如何高效快捷低成本的從紅豆杉枝葉中提取分離出高純度的10-DAB III中間體成為行業焦點。
目前，針對10-DAB III提取分離的文獻和專利有很多，基本上都是采用提取、分離、結晶三個步驟，而真正影響產品得率和純度的主要還是分離和結晶這兩個步驟。常規都采用甲醇或酒精進行浸泡提取，然后萃取濃縮，將初步得到的10-DAB III粗品進行硅膠柱層析分離，最后重結晶得到一定純度的合格品。通常，各個廠家提取得率都能達到95％左右，而影響純品10-DAB III最終得率的主要還是分離和結晶步驟。隨著市場的競爭和溶劑成本的增加，如何簡化分離純化工藝，快捷的得到高質量的10-DAB III，并盡可能少的利用有機溶劑成為控制成本的主要思路。
中國專利申請號02136678公開了從乙醇提取過的紅豆杉枝葉殘渣中提取10-DABIII的方法，并采用了正相制備色譜進行分離得到純品10-DAB III，該分離純化方法中雖然提到了的制備液相色譜分離過程，但所采用的溶劑體系和梯度洗脫手段在規模化生產中顯得工藝復雜，分離效率無法在生產實際中真正提高，且有溶劑消耗大等缺點。因為10-DAB III被提取到一定純度的情況下，在常規溶劑里的溶解能力降低，該專利中提到的用乙酸乙酯實際不能很好的溶解半成品10-DAB III，因為要產業化利用制備液相色譜進行分離必須要找到更適合的洗脫劑體系。
此外，中國專利公開號CN1473821A公開了一種提取10-DAB III的方法，該項專利里面采用常規的硅膠層析分離提取處理出的半成品10-DAB III，該方法耗費時間，溶劑消耗量大，因為常規硅膠的不可逆吸附，硅膠循環利用率低下，廢物排放多，也很容易造成得率的損失。
發明內容
本發明的目的是提供一種高效分離純化半成品10-DAB III，從而得到高純度的10-DAB III的方法。
該方法利用先進的直徑超過100mm的制備液相色譜高效分離系統，在球形硅膠作為固定相的情況下，通過獨特的用四氫呋喃溶解和四氫呋喃、正己烷和甲醇混合溶液作為洗脫溶劑體系，進行精確分離含量范圍在20％-60％之間的半成品10-DAB III，得到的10-DAB III純品含量超過99％。本發明首次發現四氫呋喃對10-DAB III獨特的溶解性能，并應用到高效制備液相色譜分離中，因為四氫呋喃良好的溶解性能，改善了10-DAB III在制備液相色譜中得分離度和分離峰型，提高了產品得率和純度，整體溶液需求量大大減少。整體分離過程真正實現了高效、低成本、環保，是產業化的最佳工藝路線。
本發明高效分離制備用的四氫呋喃和正己烷均為分析純，經過一次重蒸并過濾。所用甲醇因為用量不大，分析純即可。
所采用的液相分析色譜儀來自北京創新通恒科技有限公司P3000型，分析柱采用kromasil品牌的C18(4.6mm×250mm，5um)，柱溫為37℃，流動相條件為乙腈+水(35+65)，流速為1ml/min；制備型液相色譜分離系統由北京創新通恒科技有限公司和成都普思生物科技有限公司聯合提供，制備柱為動態軸向壓縮裝置。選用球形硅膠色譜填料來自日本Fuji公司，顆粒大小為25-40um，孔徑大小為70A。所裝填的分離柱有效分離長度為35-40公分，分離柱效理論塔板數超過1.5萬。
在上述技術方案中采用的原料為從紅豆杉枝葉中初步提取得到的半成品10-DAB III，含量范圍通常在20％-60％之間，該原料可以自己提取得到，也可以由市場購買。半成品10-DAB III原料主要雜質都是和10-DAB III類似的大極性物質，該含量范圍的原料通過本發明方法一次性分離純化，即可高效快捷的得到純度超過99％的10-DAB III純品。
在上述技術方案所提到的高效分離過程主要包括以下幾個步驟得以實現一、樣品溶解將含量范圍在20％-60％之間的半成品10-DAB III原料，用重蒸過的四氫呋喃溶解，1克半成品10-DAB III原料用5-8毫升四氫呋喃溶解。溶解過程采用50℃-60℃的水浴加溫攪拌，可以利用超聲波加速溶解過程。溶解完成后，選用0.45um孔徑的有機相過濾膜進行過濾，過濾好的樣品液轉移到燒杯里，并擱置在40℃-50℃的水浴里進行保溫，獲得原料與四氫呋喃溶液作為分離純化步驟的進樣備用。
二、分離純化采用四氫呋喃、正己烷和甲醇混合溶液，作為原料四氫呋喃溶液洗脫分離10-DAB III的流動相。流動相的洗脫分離能力與四氫呋喃和正己烷的比例有關。經實驗分離洗脫劑中，甲醇、四氫呋喃、正己烷的體積比是，甲醇 1-----3％四氫呋喃 20-35％正己烷 64---78％通常需要保證10-DAB III在40-60分鐘由制備色譜柱里面被洗脫出來。同時，根據室溫的不同變化，產品被洗脫出來的時間也有變化，為了保證分離效果，流動相的洗脫極性都需要有所調整，在生產過程中，本發明采用了多種比例的的混合溶液，四氫呋喃占整個溶劑體系的比例為20％-35％不等，甲醇的比例始終控制在總體積的1％-3％左右，而甲醇的存在不影響產品洗脫出峰時間，僅僅是改善分離效果。
分離純化的具體操作1、樣品溶解先用四氫呋喃溶解粗原料10-DAB III，每克重量半成品10-去乙酰基巴卡亭III用5-8毫升四氫呋喃溶液。獲得原料與四氫呋喃溶液作為分離純化步驟的“進樣”備用。
2、泵入分離柱將溶解后的原料四氫呋喃溶液，用高壓輸液泵泵入高效制備分離柱，進樣(原料與四氫呋喃溶液)的量根據色譜柱所填裝的介質(如球形硅膠)總量為參照。通常，100克該類型的球形硅膠填料可以泵入含量25％粗原料10-DAB III2-10克，并且還應根據粗原料的20％-35％含量不同而有所調整進樣粗原料10-DAB III重量，最終目的都是保證最大效率的分離出合格的10-DAB III純品。
進樣(原料與四氫呋喃溶液)量的多少以進樣中實有10-DAB III的重量與球形硅膠的重量之比，根據實驗粗原料10-DAB III中實有0.50-2.50克10-DAB III，則配用100克球形硅膠填料，即重量比0.50-2.50％。也就是色譜柱所填裝的介質(如球形硅膠)總量為100克，溶解在四氫呋喃中的粗原料10-DAB III中實有0.50-2.50克10-DAB III。
3、分離純化采用四氫呋喃、正己烷和甲醇混合溶液作為流動相，分離過程中，用紫外檢測器以254nm的波長進行在先跟蹤監測，用收集瓶接收不同時間出來的10-DAB III餾份，取樣后用液相色譜分析，將合格的餾份合并在一起，用旋轉蒸發器在50-60℃的溫度下抽真空回收溶劑、獲得純度為99％的10-DAB III產品。回收后的溶劑可以再次調配循環使用，得到的純度為99％的10-DAB III產品通過真空干燥器進一步烘干即可成最終產品。對于不合格的餾份產品，可以重新富集蒸干，再次制備分離。如此操作過程，保證了產品的有效得率和回收率，循環使用溶劑，節約了成本。
本發明所指的粗原料10-DAB III、10-DAB III原料、半成品10-DAB III、10-去乙酰基巴卡亭III、半成品10-去乙酰基巴卡亭III、10-DAB III為同一概念。
本說明書指的四氫呋喃、正己烷和甲醇三種材料為分折純，但本發明不限止僅用分折純。
本發明優越性在于經多次實驗測定，用本四氫呋喃先溶解粗原料10-DAB III，和用四氫呋喃、正己烷和甲醇的混和溶劑作為分離洗脫劑的提純方法可獲得99％純度的10-DAB III。而現有用甲醇或酒精溶解、乙酸乙酯洗脫劑的提純方法只能獲得最高94-96％純度的10-DAB III。
本發明的優點該方法利用四氫呋喃溶解半成品10-去乙酰基巴卡亭III，再放入動態軸向壓縮液相制備色譜柱，采用四氫呋喃、正己烷和甲醇混和溶劑作為洗脫流動相，通過一至兩次的分離制備就可以得到的含量達到99％的10-DAB III純品。該方法高效、成本低、環保，產品回收率高等優點，具有進一步產業化生產的應用價值。
在洗脫過程中，利用高效的制備液相色譜分離系統分離10-DAB III，并利用100mm的大規模制備液相柱實現了規模化生產分離，整過分離工藝過程穩定，重現性好，環保、高效，分離總得率高，為使用更大型的制備液相色譜分離10-DAB III收集到充分的數據。
圖一，含量為23％的半成品10-DAB III高效分離制備液相色譜圖；圖二，含量為53％的半成品10-DAB III高效分離制備液相色譜圖；圖三，分離純化得到含量為99％的10-DAB III純品液相分析圖譜。
具體實施例實施例1、半成品10-去乙酰基巴卡亭III原料是低含量，樣品溶解和分離純化都有四氫呋喃的方法稱取含量為23％的10-DAB III原料粉末100克，用100mm的動態軸向壓縮液相制備色譜柱，填料為20-45um的球形硅膠，孔徑為70A，總共填裝了1650克填料(10-DABIII填料的重量比1.40％左右)，分離色譜柱長40cm，流動相為22∶77∶1＝四氫呋喃∶正己烷∶甲醇(體積比)。
稱好含量為23％的10-DAB III原料粉末100克樣品，用四氫呋喃在50℃下用超聲波促溶解，過濾，每次向壓縮液相制備色譜柱進樣50克。采用四氫呋喃、正己烷和甲醇上配合比的混合溶液作為流動相，分離時間為60分鐘，分離過程用254nm的紫外檢測器監測，流動相洗脫流速為300ml/min，用幾個容積為一升的收集瓶收集10-DABIII的不同時間段的餾份峰。分離完畢后，用分析液相色譜檢測個部分餾分，富集合格餾分50℃用旋轉蒸發器回收產品，烘干，得到17克產品。不合格的餾份再次蒸干溶樣制備分離，如法收集，蒸干，合并合格產品，稱重為4克，計算總得率為91％。測定17克產品10-DAB III的純度為99％。
圖1為含量為23％的10-DAB III原料高效分離制備液相色譜圖，圖三，分離純化得到含量為99％的10-DAB III純品液相分析圖譜。
實施例2、半成品10-去乙酰基巴卡亭III原料是高含量，樣品溶解和分離純化都有四氫呋喃的方法稱取原料的10-DAB III粉末60克(含量為53％)，用100mm的動態軸向壓縮液相制備色譜柱，填料為20-45um的球形硅膠，孔徑為70A，總共填裝了1650克填料(10-DAB III填料的重量比1.92％左右)，分離色譜柱長35cm，流動相為26∶73∶1＝四氫呋喃∶正己烷∶甲醇(體積比)。
稱好含量為53％的10-DAB III原料粉末60克樣品，用四氫呋喃在55℃下用超聲波促溶解，過濾，每次進樣30克。采用四氫呋喃、正己烷和甲醇上配合比的混合溶液作為流動相，分離時間為55分鐘，分離過程用254nm的紫外檢測器監測，流動相洗脫流速為300ml/min，用幾個容積為一升的收集瓶收集10-DAB III的不同時間段的餾份峰。分離完畢后，用分析液相色譜檢測個部分餾分，富集合格餾分50℃用旋轉蒸發器回收產品，烘干，得到25克產品。不合格的餾份再次蒸干溶樣制備分離，如法收集，蒸干，合并合格產品，稱重為4.5克，計算總得率為93％。測定25克產品10-DAB III的純度為99％。
圖二，含量為53％的半成品10-DAB III高效分離制備液相色譜圖；圖三，分離純化得到含量為99％的10-DAB III純品液相分析圖譜。
實施例3本實施例同于實施例2的各步驟，僅四氫呋喃∶正己烷∶甲醇(體積比)＝30∶68∶2。
實施例4本實施例同于實施例2的各步驟，僅四氫呋喃∶正己烷∶甲醇(體積比)＝35∶64∶1。
實施例5本實施例同于實施例2的各步驟，僅四氫呋喃∶正己烷∶甲醇(體積比)＝20∶77∶3。
權利要求
1.一種高效分離純化10-去乙酰基巴卡亭III(10-DAB III)的方法，包括樣品溶解和后分離純化步驟，其特征在于樣品溶解步驟是用四氫呋喃溶解半成品10-去乙酰基巴卡亭III；分離純化步驟是用四氫呋喃、正己烷和甲醇的混和溶劑作為分離洗脫劑，用液相分離方法，對樣品溶解步驟獲得的過濾物洗脫分離，得到高純度半成品10-去乙酰基巴卡亭III。
2.如權利要求書1所述的一種高效分離純化10-去乙酰基巴卡亭III(10-DAB III)的方法，其特征在于半成品10-去乙酰基巴卡亭III四氫呋喃的配比關系是，每克重量半成品10-去乙酰基巴卡亭III用5-8毫升四氫呋喃溶液。
3.如權利要求書1所述的一種高效分離純化10-去乙酰基巴卡亭III(10-DAB III)的方法，其特征在于分離洗脫劑中，甲醇、四氫呋喃、正己烷的體積比是，甲醇 1-----3％四氫呋喃 20-35％正己烷64---78％。
4.如權利要求書1所述的一種高效分離純化10-去乙酰基巴卡亭III(10-DAB III)的方法，其特征在于分離純化步驟用的吸附劑為20-45um球形硅膠，孔徑為70A。
全文摘要
本發明一種高效分離純化10－去乙酰基巴卡亭III(10－DAB III)的方法公開了一種可獲取高純度10－去乙酰基巴卡亭III的方法，該方法利用四氫呋喃溶解半成品10－去乙酰基巴卡亭III，再放入動態軸向壓縮液相制備色譜柱中，采用四氫呋喃、正己烷和甲醇混和溶劑作為洗脫流動相，通過一至兩次的分離制備就可以得到的含量純度達到99％的10－DAB III純品。該方法高效、成本低、環保，產品回收率高等優點，具有進一步產業化生產的應用價值。
文檔編號C07D305/00GK101045719SQ20071004901
公開日2007年10月3日 申請日期2007年4月30日 優先權日2007年4月30日
發明者張黎, 劉丁, 董維珍 申請人:成都普思生物科技有限公司