專利名稱：：自體蛋白作為載體蛋白用于半抗原抗體的制備的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種半抗原抗體的制備方法，特別是動物自體蛋白作為載體蛋白用于半抗原抗體的制備方法。
背景技術：
：半抗原是具有與抗體結合能力但是不能刺激機體產生抗體的分子。抗原是具有異源性、結構復雜性和一定分子量大分子的三個必要元素組成，而半抗原雖具有異源性和結構復雜性，但因為分子量不夠大，在體內單獨不足以被免疫細胞識別和提呈所以不能激活淋巴細胞，產生抗體，但可以被已經生成的抗體所識別，即具有免疫反應性但沒有免疫原性。要想制備小分子半抗原抗體，第一步就是要讓低分子量的小分子半抗原變大分子，之后再按照完全抗原的方法制備抗體。小分子變大分子一般有二種方法，一是將小分子自身互相交聯成同類分子聚體，二是將小分子與大分子偶聯。第一種方法不引入新的化合物，不會帶入新的抗原結構，但有時不容易化學交聯，而完全抗原最低分子量要求也要數千到一萬，小分子要經過多次聚體化才能達到要求，也有可能使表位基團在反復聚合中被改變和屏蔽。第二種方法使用大分子量蛋白作為載體，將小分子半抗原偶聯到蛋白分子表面組成完全抗原。這種交聯方法比較簡單，不足之處在于引入新的蛋白結構，出現不需要的抗原表位，產生大量不需要的抗體。通常載體蛋白使用牛血清白蛋白(bovieserumalbumiuBSA)、卵清蛋白(ovalbumin0V)、鑰孔嘁血蘭素蛋白(HemocyaninKLH)和牛、馬、羊Y球蛋白等。這些蛋白的特點是分子量比較大，商品化樣品容易得到，所以被廣泛使用。但同時因為上述蛋白對于免疫宿主而言通常不是自身蛋白，加之較大的分子量，其本身就是一個完全抗原引起抗體產生，而載體蛋白上的抗原表位遠遠超過半抗原的表位數量，被免疫動物對載體蛋白產生的抗體比主要針對半抗原本身的還要多。這樣對特定需要抗體的效價和特異性造成很不利的影響
發明內容為了解決上述問題，我們提出采用動物自體蛋白用作免疫載體蛋白的技術克服以上通用方法所產生的這種弊端。因為同一個體動物蛋白注入自身體內，沒有免疫原性，機體只對載體蛋白上的半抗原產生免疫反應，從而產生抗特定半抗原的抗體。用于特異性抗血清制備的動物，一般選用體量較大的動物，以便一次免疫獲得足量的抗血清，如大鼠、家兔、山羊、綿羊等，這些種類的動物體重一般從300克到30千克不等，盡管體重差異較大，但都具備可以一次抽取2-20毫升血液而不影響動物健康的條件。利用抽取的2-20毫升血液，可以分別純化得到10-100毫克y球蛋白或10-100毫克血清白蛋白，這樣數量的蛋白足夠作為半抗原載體蛋白的所需劑量，用于隨后的同一個體動物的免疫。主要
發明內容如下一種半抗原抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟首先，采用動物自體蛋白作為載體蛋白與半抗原產生偶聯反應得偶聯完全抗原，然后用偶聯完全抗原免疫動物制得半抗原抗體。所述載體蛋白是取自被用于免疫動物的自體蛋白。所述自體蛋白是血清中的高豐度蛋白，具體的可以是白蛋白或Y球蛋白。所述制備方法是多克隆抗體的制備，也可以用于單克隆抗體的制備，免疫動物包括小鼠、大鼠和家兔。目前制備多克隆抗體(抗血清)絕大多數是選擇免疫家兔，從家兔血清制備血清白蛋白，方法同樣可以采用的利凡諾絡合提取法，但也可以用硫酸銨沉淀法分歩獲得Y球蛋白(40%飽和硫酸銨再加蛋白A親和層析)和血清白蛋白(40%飽和硫酸銨)。圖1是實施例1的BSA電泳圖，其中l:自制兔血清白蛋白2:商品化兔血清白蛋白(sigma純度〉99%);圖2是FK506的結構式；圖3是FK506與不同載體蛋白偶聯后抗血清效價的測定結果；圖4是BNP與不同載體蛋白偶聯后抗血清效價的測定結果。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。本實施例中采用利凡諾法純化獲得兔血清白蛋白。具體步驟如下1)家兔耳緣靜脈取血10ml，4"下過夜放置；2)4000rpm/分鐘，4。C下離心15分鐘，取上清為兔血清，體積為4.5毫升；3)兔血清加用50y。(NH4)2S(V沉淀，將沉淀去除后，以lmol/L鹽酸調節pH值為4.3-4.4，放置一小時后，用帆布自然過濾，刮去沉淀物；4)將沉淀物包于玻璃紙透析帶中，留取適當容積驅除空氣，扎口，對流水進行透析，直至硫酸銨含量低于2g/L時為止，得透析液；5)合并透析液，量取體積，加入氯化納攪拌溶解，質量濃度達8.5g/1，用帆布自然過濾，取濾液測定蛋白質含量，再加入無熱原水稀釋蛋白質的質量濃度至12-20g/l。加固體辛酸鈉使蛋白質的質量濃度達2g/l，以lmol/1鹽酸調節pH值到5-5.2,攪拌溶解后，0-5'C下放置過夜。次日重調pH值到5-5.2，置水浴中加熱至67。C時，加入2g/1(0.2%)活性碳，攪拌15min升溫到69'C，保溫lh，然后冷卻至45'C以下，用帆布自然過濾，取濾液；6)調整蛋白質的質量濃度到100mg/ml，過濾除菌，凝膠電泳法鑒定其純度〉95%,見圖1所示；7)-2CTC液體保存。實施例1FK506多克隆抗體的制備FK506屬大環內酯類抗生素，由一個半酮基，a、e雙酮基及23個環組成，其分子式為C44He9N012H20，分子量為822。其結構式如圖2。它單獨不能作為抗原免疫動物獲得特異性抗體，需要與一個載體蛋白偶聯獲得免疫原性。我們采用酸酐法獲得FK506的衍生物，然后用EDC法與自體血清白蛋白偶聯。具體步驟如下1)20mg的FK506用5ml吡啶溶解，加入50mg戊二酸酐，80。C回流反應4小時，并用硅膠薄層層析法檢測反應進行程度，至接近完全反應時停止回流反應；2)減壓蒸餾除去溶劑吡啶，得到FK506戊二酸單酯；3)將10mgFK506戊二酸單酯用0.5mlDMF(二甲基甲酰胺)溶解；20mg自制兔血清白蛋白用2ml0.05M的PBS(pH7.2)溶解。4)2ml含20rag自制兔血清白蛋白的溶液中加入50mgEDC(碳二亞胺)充分混勻反應10分鐘，將0.5mlFK506戊二酸單酯溶液緩慢滴加入白蛋白溶液中，反應30分鐘，再加入50mgEDC4'C反應過夜。5)上述反應液用0.05M的PBS(pH7.2)充分透析24小時。電泳法檢測標記效果。采用同樣的方法偶聯FK506同牛血清白蛋白，作為免疫用。采用同樣的方法偶聯FK506同KLH，作為檢測用。3免疫后抗體滴度測定采用常規方法免疫動物，免疫分兩組，每組免疫三只兔子。兔血清白蛋白組采用自體白蛋白與FK506偶聯的抗原去免疫動物(分別為RSA-lft，RSA-2tt及RSA-3ft)。牛血清白蛋白組采用牛血清白蛋白與FK506偶聯的抗原去免疫動物(分別為BSA-1#，BSA-2ft及BSA-3ft)。三次免疫后，每只兔子耳緣靜脈取血5ml，直接ELISA法測抗血清效價，方法如下1)包被用pH9.6、0.05MCBS(碳酸鹽緩沖液)稀釋FK506-KLH到2Pg/ml，每孔100)4，4'C過夜包被；2)用5。/。PBST脫脂奶粉，37'C下封閉一小時；3)抗血清稀釋，兩組血清都從l:1000開始，用5%PBST脫脂奶粉進行兩倍梯度稀釋，共有12個稀釋度，每個稀釋度設立兩復孔。以免疫前的血清作為陰性對照，做同樣梯度稀釋；4)加樣后，37'C下反應一小時；5)二抗用5%PBST脫脂奶粉做1:10000稀釋，加樣后37。C下反應一小時；6)加入TMB顯色10分鐘，2M硫酸終止酶標儀450nm處比色。結果見圖3，表l，從圖表中可以看到與自體蛋白偶聯后免疫動物，獲得的抗FK506抗血清的效價高于采用牛血清白蛋白偶聯FK506免疫動物獲得的抗血清。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2BNP采用雙功能交聯劑法與血清白蛋白偶聯BNP(B-typenatriureticp印tide，腦鈉肽)的氨基酸序列從氨基端到羧基依次為SSKMYQGSGCPGFKMDRLSSSSGLGCKVLRRR，是含32個氨基酸殘基的肽，BNP相對分子質量為3.46X103，它也不足以作為一個完全抗原去免疫動物，需要與載體蛋白偶聯以獲得免疫原性。采用雙功能交聯劑法與血清白蛋白偶聯。具體步驟如下1)取腦納素(BNP)lmg，溶解于lml雙蒸餾水；10mg自制的兔血清白蛋白，溶解于lml濃度為lmol/L的PBS(pH7.5)內；2)把半抗原溶液與兔血清白蛋白溶液振蕩混勻；3)邊攪拌邊滴加入0.25%(體積比)戊二醛lml。加畢后再攪拌510rain，在室溫下繼續反應23h后，用電泳法鑒定偶聯效率，即可用于免疫動物用。采用同樣的方法偶聯牛血清白蛋白與重組腦納素，作為動物免疫用。采用常規方法免疫動物，免疫分兩組，每組免疫三只兔子。兔血清白蛋白組采用自體白蛋白與BNP偶聯的抗原去免疫動物；牛血清白蛋白組采用牛血清白蛋白與BNP偶聯的抗原去免疫動物；兩組的分組編號同上。三次免疫后，每只兔子耳緣靜脈取血5ml，直接ELISA法測抗血清效價，方法如下1)包被用pH9.6、濃度為0.05M的CBS稀釋BNP到2ug/ml，每孔100W，4'C過夜包被；2)5%PBST脫脂奶粉，37"C下封閉一小時；3)抗血清稀釋，兩組血清都從l:1000開始，用5。/。PBST脫脂奶粉進行兩倍梯度稀釋，共有12個稀釋度，每個稀釋度設立兩復孔。陰性血清做同樣稀釋作為陰性對照；4)加樣后，37'C下反應一小時；5)二抗用5%PBST奶粉1:10000稀釋，加樣后37'C下反應一小時；6)加入TMB顯色10分鐘，2M硫酸終止酶標儀450nm處比色。結果見圖4，表2，從圖表中可以看到與自體蛋白偶聯后免疫動物，獲得的抗BNP抗血清的效價高于采用牛血清白蛋白偶聯BNP免疫動物獲得的抗血清。表2OD415血清稀釋比RSA-lttRSA-2ttRSA-3ftBSA-1#BSA-2#BSA-3tt1:10002.792.7312.5312.9912.9912.8411:20002.7592.752.552.1472.6132.4631:40002.6082.6592.4591.8571.9061.7561:80002.1732.1211.9211.2691.2141.0641:160001.5861.7361.5360.5810.9910.8411:320000.9481.0550.8550.2750.3110.1611:640000.4520.580.380.1420.1980.0481:1280000.3050.2780.0780.0820.1120.1421:2560000.1770.1790.1990.0950.0890.119l:5薦00.1110.110.130.0730.0710.1011:10240000.0740.0780.0980.0680.0650.095(-)0.0660.0640.0840.0560.0560.086從結果中可以看出與自體蛋白偶聯后免疫動物，其抗血清的效價高于牛血清白蛋白對照組。這是由于自體蛋白同半抗原偶聯后免疫動物，機體針對自身的蛋白是不會產生抗體，所產生的抗體都是針對小分子化合物和小肽的。因此采用自體蛋白作為載體蛋白，所制備的半抗原抗體效價更高，特異性更好。權利要求1、一種半抗原抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟首先，采用動物自體蛋白作為載體蛋白與半抗原產生偶聯反應得偶聯完全抗原，然后用偶聯完全抗原免疫動物制得半抗原抗體。2、根據權利要求1的制備方法，其特征在于，所述載體蛋白是取自被用于免疫動物的自體蛋白。3、根據權利要求2的制備方法，其特征在于，所述自體蛋白是血清中的高豐度蛋白。4、根據權利要求3的制備方法，其特征在于，所述高豐度蛋白是白蛋白或Y球蛋白。5、根據權利要求1的制備方法，其特征在于，所述制備方法是多克隆抗體的制備。6、根據權利要求1的制備方法，其特征在于，所述制備方法是單克隆抗體的制備，免疫動物包括小鼠、大鼠和家兔。全文摘要本發明涉及一種半抗原抗體的制備方法，具體來說，是用動物自體蛋白偶聯半抗原制得完全抗原，然后用該完全抗原免疫動物來制備抗體。使用上述方法制備抗體的過程中不會引入外來的蛋白，機體所產生的抗體都是針對小分子化合物和小肽半抗原的，而針對自身的蛋白不會產生抗體。因此采用自體蛋白作為載體蛋白，所制備的半抗原抗體效價更高，特異性更好。文檔編號C07K16/18GK101165069SQ20071004664公開日2008年4月23日申請日期2007年9月29日優先權日2007年9月29日發明者司徒維娜,驥徐,楊子義,賈世香,高景燕申請人:上海富純中南生物技術有限公司