專利名稱：：骨橋蛋白的功能表位、與其特異性結合的單克隆抗體及用途的制作方法
技術領域：
：本發明屬于免疫學領域，更具體地，本發明公開了一種蛋白的功能表位、與其特異性結合的單克隆抗體和這些抗體的用途。
背景技術：
：自身免疫是指機體免疫系統針對自身組織成分產生了抗體和致敏淋巴細胞，引起免疫應答的現象。當自身免疫引起自身組織器官功能障礙并出現臨床癥狀者，稱為自身免疫病(autoimmunedisease，AID)。目前發現的自身免疫病有30余種，大多為原發性，少數為繼發性。原發性自身免疫病原因不明，與遺傳因素密切相關，分為器官特異性和非器官特異性。器官特異性AID的靶抗原和病變常局限于某一特定器官，非器官特異性AID的靶抗原和病變常呈全身性或系統性。近年來，自身免疫及其引起的疾病越來越受到人們的關注，全球約有幾億人正遭受著該病帶來的痛苦。該病病程長，可致殘，嚴重的可致死，由于此問題的廣泛性及嚴重性掀起了全球的自身免疫病的研究熱潮。自身免疫病發病機制十分復雜，目前對其確切的致病機理尚不完全清楚。暫且認為，具有某種遺傳特征(由AID相關基因多態性決定)的個體，由于某些內外致病因素刺激(自身抗原釋放、變構及超抗原分子模擬等)或自身免疫反應細胞基因突變、修飾等原因，導致抗原提呈細胞(APC)或樹突狀細胞異常活化、免疫調節網絡失衡(TH1/TH2平衡破壞)、自身免疫細胞多克隆活化或凋亡延遲等改變，從而可能發生自身免疫病。自身免疫性疾病發病涉及包括遺傳、感染、免疫功能異常等在內的眾多因素。盡管發病機制仍不明確，但是大量的研究發現各種炎癥因子，如TNF-a、IL-lb及IL-6等在自身免疫性疾病的患者中水平大大高于正常者，而且抗TNF-a單抗、IL-l受體拮抗劑具有明顯的治療效果，大大改善了患者的病情，尤其是對于某些自身免疫性疾病，如類風濕性關節炎、強直性脊柱炎、克隆氏病等(Thetherapeuticeffectsofanengineeredhumananti-tumournecrosisfactoralphaantibody(CDP571)inrheumatoidarthritis.1995.Br.J.Rheumatol.34:334-342;Infliximab(chimericantitumournecrosisfactoralphamonoclonalantibody)versusplaceboinrheumatoidarthritispatientsreceivingconcomitantmethotrexate:arandomisedphaseIIItrial.ATTRACTStudyGroup.Lancet.1999.354:1932-1939;Infliximabandmethotrexateinthetreatmentofrheumatoidarthritis.N.Engl.J.Med.2000.343:1594-1602)。雖然這些生物治療療效顯著，但仍不能完全的緩解和治療這些疾病。近年來的大量研究發現，趨化因子在自身免疫性疾病中也起到重要的作用，它們能夠精確的調節和控制白細胞向炎癥組織的遷移，并且減低凋亡活性、延長B、T細胞壽命，從而攻擊耙組織。骨橋蛋白(Osteopontin，0PN)，又稱為早期T淋巴細胞活化因子I(Eta-1)或分泌型磷蛋白I，含有Arg-Gly--Asp(RGD，精氨酸一甘氨酸一天門冬氨酸)三肽序列，分子量根據去磷酸化及糖基化形式的不同大約為44-66KD之間，是一種重要的多功能細胞夕卜基質蛋白(Eta—1(osteopontin):anearlycomponentoftype-1(cell-mediated)immunity.Science.2000.287:860-864)。OPN在骨組織細胞、巨噬細胞、活化的T細胞及上皮細胞等多種細胞上表達，在介導細胞的趨化、粘附、增殖和遷移，腫瘤轉移，骨組織的礦化與重建，免疫調節，信號轉導，以及對感染性疾病的免疫能力等方面有著重要的作用(OsteoprotegerinLigandIsaCytokinethatRegulatesOsteoclastDifferentiationandActivation.Cell,1998.93:65-176.Osteopontin:roleincellsignalingandcancerprogression.TRENDSinCellBiology2006.16:79-87.)。OPN主要是通過RGD及非RGD兩個途徑與細胞表面的受體相結合而實現其功能(InhibitionofArg-Gly--Asp(RGD)-mediatedCellAdhesiontoosteopontinbyaMonoclonalAntibodyagainstosteopontin.J.Bio.Chem.1994.269:23280-23285)，RGD途徑主要是與細胞表面的整合素受體(ayP3、ay日l、aYP5)結合，而非RGD途徑主要是與某些CD44的變異體(V6、V7)結合，從而介導細胞的多種生理功能(IntracellularOsteopontinIsanIntegralComponentoftheCD44-E固ComplexInvolvedinCellMigration.JOURNALOFCELLULARPHYSIOLOGY.2000:184:118-130)。總的說來，細胞所分泌的OPN經過磷酸化、糖基化，然后再經過凝血酶的剪切等一系列表達后修飾作用，以多種形式存在于機體中，每種形式可能有其獨特的功能，但目前的研究還不能充分說明，有待進一步的研究與探討。大量研究表明在自身免疫性疾病(類風濕性關節炎、多發性硬化癥，自身免疫性肝炎、克隆氏病等)中，組織及血漿中OPN的水平明顯上調(Expressionofosteopontinatsitesofboneerosioninamurineexperimentalarthritismodelofcollagerrinducedarthritis:possibleinvolvementofosteopontininbonedestructioninarthritis.ArthritisRheum.2002.46:1094-1101;Roleofosteopontininamplificationandperpetuationofrheumatoidsynovitis.了.Clin.Invest.2005.115:1060-1067.0steopontWEta-lupregulatedinCrohn，sdiseaseregulatestheThlimmuneresponse.Gut.2005.54:1254-1262.OsteopontinasaMediatorofNKTCellFunctioninTCell-MediatedLiverDiseases.Immunity,2004.21:539-550)。OPN通過與淋巴細胞，巨噬細胞表面的CD44及其他整合素受體結合，招募炎癥細胞在靶器官集聚，同時進一步的促進各種炎癥細胞的活化，分泌大量的促炎因子(TNF--a、IL-1P及IL-6)(EssentialroleofthecrypticepitopeSUVYGLRwithinosteopontininamurinemodelofrheumatoidarthritis.J.Clin.Invest.2003.112:18H88)。此外，在類風濕性關節炎(RA)中，OPN還可通過與破骨細胞表面的aY03和ciYP5受體介導骨的破壞吸收，加重RA的發病(Osteopontin.CritRevOralBiolMed.2000;11(3):279-303)。研究表明，在OPN基因缺失的小鼠中，關節炎的發病率及嚴重程度明顯降低(Osteopontindeficiencyprotectsjointsagainstdestructioninanti-typeIIcollagenantibodyinducedarthritisinmice.PNAS.2002.99(7):4556-4561)，ConA誘導的自身免疫性肝炎的發病率及肝臟破壞程度也明顯減輕(OsteopontinasaMediatorofNKTCellFunctioninTCell-MediatedLiverDiseases.Immunity:2004.21:539-550.)，而且對DSS誘導的小鼠克隆氏病也有保護作用(OsteopontindeficiencyprotectsmicefromDextransodiumsulfateinducedco]itis.工nflammBowelDis.2006,12(8):790-6)。在上述的模型中，抗OPN的多克隆抗體也可以明顯的降低類風濕性關節炎模型小鼠的發病，減輕關節腫脹、畸形的程度(essentialroleofthecryptic印itopeSLAYGLvRwithinosteopontininamurinemodelofrheumatoidarthritis.J.Clin.Invest.2003.112:181-188);對肝臟的炎癥也能明顯減輕(Osteopont;inasaMediatorofNKTCellFunctioninTCell-MediatedLiverDiseases.Immunity,2004.21:539-550)。由此可見，OPN是自身免疫性疾病的重要發病因素，OPN將是一個治療自身免疫性疾病的有效藥物靶點。
發明內容本發明公開了骨橋蛋白的功能表位，更具體地，為QLYXXYP或WLXPDP，其中X可以為任何氨基酸。本發明還公開了與上述功能表位特異性結合的抗骨橋蛋白的單克隆抗體。這些單克隆抗體的重鏈可變區氨基酸序列可以為SEQIDN0.4或SEQIDNO.8之一，輕鏈可變區氨基酸序列可以為SEQIDNO.6或SEQIDNO.IO之一。更具體的，本發明公開了抗骨橋蛋白的單克隆抗體23C3，其重鏈可變區氨基酸序列為SEQIDNO.4，輕鏈可變區氨基酸序列為SEQIDNO.6，恒定區為小鼠IgG恒定區。本發明還公開了抗骨橋蛋白的單克隆抗體F8E11，其重鏈可變區氨基酸序列為SEQIDN0.8，輕鏈可變區氨基酸序列為SEQIDNO.10，恒定區為小鼠IgG恒定區。本發明公開了一種DNA分子，編碼與上述功能表位特異性結合的抗骨橋蛋白的單克隆抗體。具體地，其編碼重鏈可變區的核苷酸序列可以為SEQIDNO.3或SEQIDNO.7之一，編碼輕鏈可變區的核苷酸序列可以為SEQIDNO.5或SEQIDNO.9之-一。本發明還公開了編碼抗骨橋蛋白的單克隆抗體23C3的重鏈可變區核苷酸序列為SEQIDNO.3，編碼其輕鏈可變區核苷酸序列為SEQIDNO.5。本發明更進一步公開了編碼抗骨橋蛋白的單克隆抗體F8E11的重鏈可變區的核苷酸序列為SEQIDNO.7，編碼其輕鏈可變區的核苷酸序列為SEQIDNO.9。本發明還公開了上述的抗骨橋蛋白的單克隆抗體在制備治療和/或預防自身免疫性疾病藥物中的應用。這些自身免疫性疾病可以為類風濕性關節炎、自身免疫性肝炎、強直性脊柱炎、克隆氏病。本發明所述的與本發明中公開的上述骨橋蛋白功能表位特異性結合的抗骨橋蛋白的單克隆抗體，包括但不限于重鏈可變區氨基酸序列SEQIDNO.4或SEQIDN0.8之一與輕鏈可變區氨基酸序列SEQIDN0.6或SEQIDNO.IO之一利用現有的分子生物學技術得到的單克隆抗體，還包括與本發明中公開的上述骨橋蛋白功能表位特異性相結合的利用現有的分子生物學技術可以得到的嵌合的單克隆抗體、人源化及全人源的單克隆抗體。具體地，本發明的申請人首先利用分子生物技術克隆人和鼠OPN基因，利用真核細胞表達了人和鼠的OPN蛋白，并通過細胞融合-雜交瘤的方法制備了兩株抗人的0PN單克隆抗體23C3和F8E11，還對這兩株單抗的基因進行了克隆并測定了其序列。本發明的申請人還建立了膠原誘導的DBA/1J小鼠關節炎模型、ConA誘導的自身免疫性肝炎模型、DSS誘導的小鼠克隆氏病模型，利用上述兩株單克隆抗體在這三種自身免疫性疾病模型中進行實驗，觀察其保護作用。利用關節炎模型進行實驗的實驗結果顯示，本發明公開的上述單克隆抗體可以顯著降低關節炎的發病指數、延遲發病時間，抑制破骨細胞的功能、降低關節炎的骨質破壞和吸收，還可以很好地保護骨吸收、有效地阻斷淋巴細胞的遷移，從而減輕或緩解關節炎疾病的癥狀。利用自身免疫性肝炎模型進行實驗的結果顯示，這些單克隆抗體通過中和肝臟組織中OPN蛋白、調控OPN的mRNA水平，降低促炎因子的水平、下調Thl型免疫反應NF-iB水平從而達到保護肝臟、降低死亡率的目的。利用克隆氏病模型進行實驗的實驗結果顯示，這些單克隆抗體可以中和組織中0PN蛋白，調控OPN的mRNA水平，降低MPO的活性、減少淋巴細胞和中性粒細胞的浸潤、降低促炎因子的水平，從而減輕炎癥及潰瘍程度，保護腸或/和結腸組織，緩解克隆氏病的癥狀，從而達到預防和/或治療的目的。本發明中所述的預防和/或治療，包括但不限于緩解或/和減輕疾病的各種癥狀。本發明的申請人還利用噬菌體展示技術鑒定了23C3與F8E11單抗作用的OPN不同的功能表位，這些功能表位為QLYXXYP或WLXPDP，其中X可以為任何氨基酸，從而進一步的闡明OPN分子的作用靶點。更具體地，本發明的申請人通過單克隆抗體抗原表位的淘選、噬菌體ELISA和蛋白質印跡鑒定、測序及序列分析推測出OPN不同的功能表位，進一步通過噬菌體與抗體結合能力分析選擇結合力最強的克隆合成了系列短肽，通過這些短肽與特異性抗體的結合實驗對這些功能性表位進行了鑒定。圖l:人、鼠OPN真核表達純化后的SDS--PAGE電泳圖，其中M代表蛋白質標準分子量。圖2:23C3和F8Ell為一抗的Westernblotting結果。圖3:23C3和F8E11單抗治療對CIA小鼠關節炎發病指數、發病時間及發病率的影響結果；圖3-1為各治療組CIA小鼠的關節炎發病指數；圖3-2為各治療組CIA小鼠的發病關節照片；圖3-3為各治療組CIA小鼠的發病率曲線；controlIg為對照抗體小鼠IgG(以下同)。圖4:23C3和F8E11單抗治療對CIA小鼠關節骨吸收的保護作用結果。圖5:23C3和F8E11單抗體外對淋巴細胞的遷移抑制作用結果。圖6:不同治療組CIA小鼠血漿及關節組織中OPN水平的變化結果；圖6-1血漿中OPN水平的變化實驗結果；圖6-2關節組織中OPN水平的變化實驗結果。圖7:不同治療組CIA小鼠關節組織中OPN受體水平的變化結果(na'ive為未處理的正常小鼠，以下同)。圖8:不同治療組CIA小鼠關節組織中各種細胞因子水平的變化結果。圖9:不同治療組體外淋巴細胞回憶應答反應的變化結果；圖9-l為不同治療組體外淋巴細胞回憶應答反應的變化結果；圖9-2為23C3和F8E11單抗體外對淋巴細胞回憶應答反應的抑制功能實驗結果。圖10:不同治療組CIA小鼠血清中自身抗體水平的變化結果。圖11:不同治療組CIA小鼠關節組織中RANKL/RANK/OPG水平的變化結果。圖12:不同治療組CIA小鼠尿液中D-pyr水平的變化結果。圖13:應用23C3和F8E11單抗對肝炎模型小鼠的死亡率影響結果。圖14:應用23C3和F8E11單抗對肝炎模型小鼠的肝臟保護作用結果；圖14-1為不同治療組血漿中ALT和AST水平；圖14-2為不同治療組肝臟HE及TUNEL染色結果，A，C，E，G:HE染色，B，D，F，H:TUNEL染色;I:各組TUNEL染色陽性細胞比例。圖15:不同治療組肝炎模型小鼠血漿及肝臟組織中OPN水平的變化結果；圖15-1為血漿中0PN水平變化結果；圖15--2為肝臟組織中0PN水平變化結果。圖1.6:不同治療組肝炎模型小鼠血漿及肝臟組織中各細胞因子水平的變化結果；圖16-1為不同治療組血清中TNF-a、IFNi的水平變化結果；圖16-2不同治療組肝組織中各類細胞因子的mRNA水平變化結果。圖17:不同治療組肝炎模型小鼠肝臟組織中NF-kB水平的變化結果(l為無肝炎小鼠組，2為對照抗體治療組，3為抗體23C3治療組，4為F8E11抗體治療組)。圖18:應用23C3和F8E11單抗對Crohn's病模型小鼠體重、疾病活動指數(DAI)及脾指數的影響結果；圖18-1為不同治療組小鼠的體重變化；圖18-2為不同治療組的疾病活動指數(DAI);圖18-3為不同治療組的脾臟指數。圖19:不同治療組Crohn's病模型小鼠結腸病理組織變化結果(A.正常組，B.23C3治療組，C.F8E11治療組，D.controlIg組)。圖20:應用23C3和F8E11單抗對Crohn's病模型小鼠腸組織髓過氧化物酶(MPO)活性的影響結果。圖21:不同治療組Crohn's病模型小鼠腸組織中TNF-a、IL-1P和IL-6mRNA水平的變化結果。圖22:不同治療組Crohn，s病模型小鼠腸組織及血漿中OPN水平的變化結果；圖221為血槳中0PN水平的變化結果；圖22-2為腸組織中OPN水平的變化結果。圖23:用23C3淘選三輪后的產出效率比較圖。圖24:23C3陽性噬菌體ELISA和WESTERN鑒定圖；圖24-1為陽性噬菌體ELISA鑒定圖；圖24-2為陽性噬菌體westernblot鑒定，其中圖24-2左圖為23C3抗體雜交結果圖，右圖為無關抗體SM5-1雜交結果圖。圖25:AlignX軟件序列分析23C3的結合表位結果。圖26:各種序列表位與抗體23C3結合力的比較結果。圖27:F8E11淘選效率比較圖。圖28:F8E11陽性噬菌體ELISA和westernblot鑒定圖；圖28-1為F8E11陽性噬菌體ELISA鑒定圖；圖28-2為F8E11陽性噬菌體westernb丄ot鑒定圖，其中圖28--2左圖為F8E11抗體雜交結果圖，右圖為無關抗體SM5-l雜交結果圖。圖29:AlignXA軟件序列分析F8E11的結合表位結果。圖30:各種序列表位與抗體F8E11結合力的比較結果。圖31:合成短肽與相應抗體的特異結合以及阻斷抗體與抗原結合的實驗結果；圖31-1為dot-blot檢測短肽與抗體的結合實驗結果；圖31-2為短肽阻斷試驗結果。圖32.23C3和F8E11特異識別表位在0PN分子上的相對部位。具體實施例方式以下結合實施例、實驗例進一步對本發明進行說明，這些實施例、實驗例不應理解為對本發明的限制。實施例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些用于構建載體和質拉的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質粒的方法或將質粒引入宿主細胞的方法以及經典的細胞融合和單克隆抗體篩選、分離和純化等方法。這樣的方法對于本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，并且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiais，T.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndedition,ColdspringHarborLaboratoryPress.本發明實施例或實驗例中未標明來源的原、輔料均為市售。實施例鼠抗人OPN單克隆抗體的制備實施例1.人OPNcDNA片段的克隆參照GENEBANK提供的人OPN的資料及序列，合成引物OPN引物有義(引物l):GGGAAGCTTACCATGAGAATTGCAGTGATTTG(HindIII)和OPN反義(引物2):GCCGGTACCATTGACCTCAGAAGATGCAC(Kpn1)。擴增人肝癌細胞株LM3(購自上海中山醫院)，用TRISOL試劑盒(INVITROGEN)提取RNA，通過RT-PCR(P腦EGA)，反應條件94°C5分鐘;94"C45秒，58°C30秒，72。C45秒，30個循環；72nC10分鐘。獲得963bp的DNA片段。通過凝膠回收試劑盒(上海生工)回收片段后，用限制型內切酶HindIII和KpnI酶切，凝膠電泳回收后，與經HindIII和KpnI雙酶切的質粒載體連接，轉化大腸桿菌DH10B后，篩選獲得有插入片段的陽性克隆。DNA序列測定確認。OPN基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。實施例2鼠OPNcDNA片段的克隆參照GENEB緒K提供的鼠OPN的資料及序列，合成引物鼠OPN引物有義(引物3):ATAAGCTTGGATGACGACGACAAGATGAGAATTGCAGTGATT(HindIII)和鼠0PN反義(引物4):ATCTCGAGTTAATTGACCTCAGAAGA(Kpn1)。分離鼠脾臟T淋巴細胞，用ConA激活30小時后，用TRISOL試劑盒(INVITROGEN)提取RNA，通過RT--PCR(PROMEGA)PCR反應采用熱啟動，反應條件94"C5分鐘;94"C45秒，55"C30秒，72"C45秒，30個循環;72"C10分鐘。獲得985bp的DNA片段。通過凝膠回收試劑盒(上海生工)回收片段后，用限制型內切酶HindIII和KpnI酶切，凝膠電泳回收后，與經HindI工I和KpnI雙酶切的質粒載體連接，轉化大腸桿菌DH10B后，篩選獲得有插入片段的陽性克隆。DNA序列測定確認。鼠OPN基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。實施例3.人、鼠OPN的真核細胞表達純化將實施例l、實施例2所得的序列正確的人、鼠OPN基因片段用相應的限制性內切酶酶切回收后，裝入pPICZa質粒中。轉染畢式酵母細胞，挑取單個克隆酵母，誘導表達出人、鼠OPN蛋白，收集酵母細胞表達上清，經陰離子交換、分子篩純化，SDS-PAGE證實得到人、鼠OPN純蛋白。純化后經SDS-PAGE電泳，結果見圖1。實施例4.鼠抗人OPN單克隆抗體的篩選與制備lOOug人OPN和等體積弗氏佐劑乳化后，腹腔注射BALB/C小鼠免疫接種，每二周后加強免疫一次，劑量同前。共免疫3次后，選取血清中抗OPN抗體滴度較高小鼠，分離其脾臟淋巴細胞，利用經典的PEG法，將小鼠脾臟淋巴細胞與NS-1細胞進行細胞融合。用lOug/mlOPN包被96孔板，采用ELISA法反復篩選獲得可穩定表達抗人OPN抗體的雜交瘤細胞株——23C3和F8E11。大量擴增單克隆細胞株23C3和F8E11，腹腔注射BALB/C小鼠5X107只，10天左右開始收集小鼠腹水，利用ProteinA柱，親和層析純化抗人OPN的單克隆抗體。Westernblotting試驗結果顯示，小鼠抗人OPN單克隆抗體23C3和F8E11不但與人OPN蛋白特異結合，同時與鼠OPN蛋白也有交叉反應。結果見圖2。市售抗0PN抗體(腿D公司)實施例23C3和F8E11的可變區基因克隆和序列測定收集23C3和F8E115Xl(flXl()7雜交瘤細胞，用TRIzol(InvitrogenCat.No.15596-026)抽提其總RNA，根據小鼠抗體恒定區序列，設計引物如下HGSP1:5'-GATACTGTGATCTGTTTG-3'HGSP2:5'-TCGCAGATGAGTCTGGAC-3'HGSP3:5'-ATGAACACACTCACATTG-3'LGSP1:5，-GAGGTTATGACTTTCATAGTCAGC-3，LGSP2:5，-AACACTGTCCAGGACACCATCTCG-3，LGSP3:5，-TCTGGGATAGAAGTTGTTCATGAG-3'采用Invitrogen5，RACEkit(Cat.No.18374-058)，分別以HGSP1，LGSP1為引物，合成第一鏈cDNA;在TdT和dCTP作用下，給第一鏈cDNA3，端加polyC尾;分別以HGSP2，HGSP3、LGSP2，LGSP3為5，引物，通過巢式PCR得到VH、VL的PCR產物；將PCR產物裝入pGEM-T載體中；挑取克隆抽提質粒，限制性內切酶鑒定得到陽性克隆，通過測序確定其序列。23C3重鏈可變區的核苷酸和氨基酸序列分別為SEQIDNO.3和SEQIDNO.4，23C3輕鏈可變區的核苷酸和氨基酸序列分別為SEQIDNO.5和SEQIDNO.6;F8E11重鏈可變區的核苷酸和氨基酸序列分別為SEQIDNO.7和SEQIDNO.8，F8E11輕鏈可變區的核苷酸和氨基酸序列分別為SEQIDNO.9和SEQIDNO.10。實驗例23C3和F8E11單抗對CIA關節炎模型小鼠的影響實驗實驗例123C3和F8E11單抗治療對CIA小鼠關節炎發病指數、發病時間及發病率的影響實驗100ug雞II型膠原(Condrex)和等體積的弗氏完全佐劑乳化后，經DBA/1J小鼠(32只)(雄性，8--IO周)尾部皮下初次免疫；21天后進行再次免疫，即將100ug雞II型膠原和等體積的弗氏不完全佐劑乳化后，尾部皮下再次免疫。將2次免疫后的小鼠分成4組，分別給予對照抗體(小鼠IgG，200ug/body，Sigma)、23C3單抗(200ug/body、100ug/body、50ug/body)、F8E11單抗(200ug/body、100ug/body、50ug/body);所有治療組均腹腔給藥，從第二次免疫當天開始給藥，隔天給藥，連續六次。從第二次免疫當天開始觀察關節炎發病指數、發病時間及發病率，共觀察30天。小鼠關節炎嚴重程度參照文獻(ARolefortheLymphotoxin/LIGHTAxisinthePathogenesisofMurineCollagen-InducedArthritis.RoyA.Fava，EvangeliaNotidis，JaneHunt,VeronikaSzanya，NoraRatcliffe，ApinyaNgam-ek，AntoninR.deFougerolles，AndrewSpragueandJeffreyLBrowning.TheJournalofImmunology,2003，171:115-126.)進行評分。具體如下每只腿根據炎癥程度計分為0-4分，0分-無紅腫；1分-一個趾或指腫脹，或者輕微水腫；2分多個趾或指腫脹，或者中度水腫；3分-大多數趾或指腫脹，或者嚴重水腫；4分-所有趾或指腫脹，或者畸形。小鼠關節炎的疾病指數為前后肢炎癥分數的和。實驗結果見圖3-l，圖3-2，圖3-3。與對照治療組相比，23C3和F8E11單抗都可以顯著的降低關節炎發病指數，延遲發病時間，但對發病率無明顯影響，其中23C3單抗的治療效果好于F8E11。實驗例223C3和F8E11單抗治療對CIA小鼠關節骨吸收的保護作用實驗23C3單抗200ug組和對照治療組CIA小鼠(同實驗例1)，于二次免疫后30天進行X-ray檢測，觀察各發病關節的骨質破壞情況。結果見圖4，與治療組相比，23C3和F8E11單抗治療組小鼠各趾間關節骨吸收不明顯。提示23C3單抗對骨吸收具有良好的保護作用。實驗例323C3和F8E11單抗體外對淋巴細胞的遷移抑制作用實驗無菌分離CIA小鼠(實驗例1)的脾臟，過100目鋼網，PBS洗滌2次，用淋巴細胞分離液分離脾臟淋巴細胞，2000rpmX20分鐘，吸取淋巴細胞層，PBS洗滌2次，記數，并調整淋巴細胞濃度為5X107ml。24孔組織培養板，上層含有5um孔徑的濾膜，用10ug的OPN預包被下層。上層每孔加入5X105淋巴細胞，同時加入不同的抗體23C3、F8E11(抗OPN單抗)、Her_2抗體(無關抗體對照)、抗OPN多抗(購自CHEMICON);每種抗體兩種濃度100ug/ml、200ug/ml。在另一組中加入不同的肽段23C3肽(對應23C3的表位肽)、F8E11肽(對應F8E11的表位肽)、GRGDS肽，SM5-1肽(無關對照肽INPNNAPEVFAH)(上海業力公司合成)；每種肽段兩種濃度50Mm、潮Mm。37°C、5%(:02孵育2小時，PBS洗滌兩次，計數下層孔中細胞數目，取5個高倍鏡視眼，獲得平均值，然后乘以50。實驗結果如圖5。23C3和F8E11單抗都可以有效的阻斷淋巴細胞的遷移，而用23C3單抗阻斷淋巴細胞遷移效果最好，且具有劑量依賴性；同時23C3和F8E11單抗對應的23C3和F8E11表位肽段能有效的阻斷淋巴細胞遷移。實驗例4不同治療組CIA小鼠血漿及關節組織中0PN水平的變化實驗取不同時間點(0，7,14，28天)不同治療組DBA/1J小鼠(實驗例1)的血漿，鼠0PN的EL1SA試劑盒(R&D公司)檢測OPN的蛋白濃度。具體的說，小鼠外目此靜脈取血，即刻離心4000rpm，IO分鐘，分離血漿。以1:200稀釋加入至ELISA檢測試劑盒的96孔板中，常溫孵育l小時，PBST洗滌5次，加入生物素標記的抗OPN—抗，常溫孵育l小時，洗滌5次，加入親和素標記的二抗，常溫孵育l小時，洗滌6次后，底物頂B顯色，OD450檢測吸光度。根據標準曲線，計算血漿樣品中OPN的濃度。結果見圖6-1。對照組OPN水平大大高于23C3和F8E11治療組，在第14天OPN水平最高，為23C3和F8E11治療組的10倍，提示OPN蛋白水平可能與疾病發生及嚴重程度相關，而且降低OPN的水平，可降低關節炎的嚴重程度。取14天實驗例1中不同治療組CIA小鼠的關節組織，去除皮膚及肌肉組織，RNeasyMiniKit(QIAGEN)抽取組織總RNA，用SensiscriptRTKit(QIAGEN)反轉錄RNA為cDNA。根據Real-timePCR要求，設計OPN引物，見表1。SYBRGreenMasterMix(AppliedBiosystems)做Real-timePCR檢測OPN的mRNA水平。反應步驟為50°C，2分鐘；95°C，10分鐘；95°C，15秒和60°C，60秒，40個循環。GAPDH基因作為內參。實驗數據使用ABIPRISM7900sequencedetectionsystem(AppliedBiosystems)進行分析。實驗結果見圖6-2，23C3和F8E11單抗治療組關節組織OPN的水平大大低于對照組的OPN的水平，而且23C3組OPN水平更低。提示可能23C3和F8E11通過中和組織中0PN蛋白，調控OPN的mRNA水平。.實驗例5不同治療組CIA小鼠關節組織中OPN受體水平的變化實驗取14天實驗例1中不同治療組CIA小鼠的關節組織，去除皮膚及肌肉組織，RNeasyMiniKit(QIAGEN)抽取組織總RNA，用SensiscriptRTKit(QIAGEN)反轉錄RNA為cDNA。根據Real-timePCR要求，設計OPN各受體的引物。具體如表1。SYBRGreenMasterMix(AppliedBiosystemsM故Real-timePCR檢測OPN受體的組織mRNA水平。反應歩驟同實施例4。實驗數據使用ABIPRISM7900sequencedetectionsystem(AppliedBiosystems)進行分析。實驗結果見圖7，CD44、Pl、ci8在對照組及治療與正常小鼠比較無明顯變化；而av、P3、P5、a4、a9在對照組中明顯高于正常小鼠，經23C3和F8E11單抗治療后，其mRNA水平明顯降低。提示av、p3、05、a4、a9這五種OPN受體可能參與關節炎的發病；而且23C3和F8E11可能通過中和組織中0PN蛋白，調控OPN受體的mRNA水平。表1OPN各受體的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實驗例6不同治療組CIA小鼠關節組織中各種細胞因子的變化實驗取實驗例1中14天不同治療組CIA小鼠的關節組織，去除皮膚及肌肉組織，RNeasyMiniKit(QIAGEN)抽取組織總RNA，用SensiscriptRTKit(QIAGEN)反轉錄RNA為cDNA。根據Real-timePCR要求，設計各種細胞因子的引物。具體如上表l。SYBRGreenMasterMix(AppliedBiosystems)做Real-timePCR檢測細胞因子的組織mRNA水平。反應步驟同實施例4。實驗數據使用ABIPRISM7900sequencedetectionsystem(AppJiedBiosystems)進行分析。實驗結果見圖8，促炎細胞因子TNF-a、IL-1P禾卩IL-6的mRNA水平在對照組中明顯高于正常小鼠，經23C3和F8E11單抗治療后，其mRNA水平明顯降低。同時Thl型細胞因子IFNi和Th2型細胞因子IL-10的mRNA水平經23C3和F8E11單抗治療后也明顯降低。提示23C3和F8E11可能通過降低促炎因子的水平，從而降低關節炎的炎癥程度；而且不但可下調Thl型免疫反應，還可同時下調Th2型免疫反應。實驗例7.不同治療組體外淋巴細胞回憶應答反應的變化實驗無菌分離實驗例1中不同治療組CIA小鼠的脾臟和淋巴結，過100目鋼網，PBS洗滌2次，用淋巴細胞分離液分離脾臟淋巴細胞，2000rpmX20分鐘，吸取淋巴細胞層，PBS洗滌2次，記數，并調整淋巴細胞濃度為5X107ml。每孔加入5X1()5淋巴細胞，同時加入不同濃度的雞II型膠原刺激。37°C、5y。C0j瞎育72小時，在第56小時收取上清，用于細胞因子ifn-y和IL-10的檢湖ij;同時每孔加入100ul含:1h(0.5uCi)的培養液，繼續培養16小時后，細胞收集器收集細胞，y液閃儀檢測。在對照小鼠脾淋巴細胞回憶應答實驗的30ug膠原刺激組中，同時加入不同濃度的23C3單克隆抗體，檢測其對淋巴細胞回憶應答的抑制能力。實驗結果如圖9。23c3和f8e11單抗治療組淋巴細胞對雞II型膠原的應答能力明顯低于對照組小鼠，而且在應答過程中Thl型細胞因子IFNi和Th2型細胞因子IL-10的水平也明顯的低于對照組。而且23C3和F8E11單抗在體外能有效的抑制淋巴細胞對雞n型膠原的應答反應。在所有實驗組中，23C3組的抑制能力均大于F8E11。實驗例8不同治療組CIA小鼠血清中自身抗體水平的變化實驗取不同時間點(O，7，14，28天)實驗例1中的不同治療組DBA/1J小鼠的血清，ELJSA法檢測抗II型膠原自身抗體IgGl、IgG2a和總Ig的血清滴度。具體的說，小鼠外眥靜脈取血，室溫靜置2小時，離心4000rpm，10分鐘，分離血清。雞II型膠原100ng/孔包被96孔板，4。C過夜，PBS洗滌后10%脫脂奶粉封閉2小時，PBST洗滌3次，從1:2000開始倍比稀釋血清樣本，加入96孔板中，常溫孵育l小時，PBST洗滌5次，加入服P標記的兔抗小鼠IgGl、IgG2a和總Ig的抗體，37。C孵育2小時，洗滌5次，底物o-phenylenediamine顯色，OD450檢測吸光度。根據標準曲線，計算血清樣品中自身抗體的滴度。結果見圖10，對照組IgGl、IgG2a和總Ig的血清滴度均大大高于23C3和F8E11治療組，在第14天IgGl、工gG2a和總Ig的血清滴度最高。提示自身抗體水平可能與疾病發生及嚴重程度相關，而且23C3和F8Ell單抗可通過降低IgGl、IgG2a和總Ig的水平，從而降低關節炎的嚴重程度。實驗例9.不同治療組CIA小鼠關節組織中RANKL/RANK/OPG水平的變化實驗取第28天實施例1中不同治療組小鼠(實驗例1)的關節組織，去除皮膚及肌肉組織，RNeasyMiniKit(QIAGEN)抽取組織總RNA，用SensiscriptRTKit(QIAGEN)反轉錄RNA為cDNA。根據Real-timePCR要求，設計RANKL、RANK和OPG的弓l物。具體同上表1。SYBRGreenMasterMix(AppliedBiosystems)Real-timePCR檢測RANKL、RANK和OPG的組織mRNA水平。反應步驟同實施例中人、鼠0PN的真核細胞表達純化步驟。實驗數據使用ABIPRISM7900sequencedetectionsystem(AppliedBiosystems)進行分析。實驗結果見圖11，促破骨細胞分化和增殖的調節因子RANKL和RANKmRNA水平在對照組中明顯高于正常小鼠，經23C3和F8E11單抗治療后，其mRNA水平明顯降低。OPG水平在對照組和治療組則無明顯變化。提示23C3和F8E11可能通過下調RANKL和RANK的水平，從而抑制破骨細胞的功能，降低關節炎的骨質破壞和吸收。實驗例10不同治療組CIA小鼠尿液中D--pyr水平的變化實驗收集不同治療組DBA/1J小鼠(實驗例l)二次免疫后第30天的尿液，小鼠D-pyrELISA試劑盒檢測D-pyr(R&D公司)的水平。結果如圖12所示，23C3和F8E11單抗治療組尿液中D-pyr明顯低于對照組，而且23C3單抗治療組中D-pyr的水平最低。實驗例23C3和F8E11單抗對肝炎模型小鼠的影響實驗實驗例1.應用23C3和F8E11單抗對肝炎模型小鼠的死亡率影響實驗C57BL/6(雄性，8-IO周)小鼠(購自第二軍醫大學實驗動物中心)腹腔給予無關對照抗體工g(Sigma)、23C3及F8E11單克隆抗體，每組10只，每只小鼠200ug，2小時后，每只尾靜脈注射200ul的ConA(30mg/ml)，誘導急性爆發型肝炎，24小時連續觀察23C3和F8E11單抗對肝炎小鼠的死亡率影響。實驗結果見圖13。與對照治療組相比，23C3和F8E11單抗組可以顯著地降低小鼠的死亡率，其中23C3單抗的保護作用更強。實驗例2應用23C3和F8E11單抗對肝炎模型小鼠的肝臟保護作用實驗C57BL/6(雄性，8-10周)小鼠腹腔給予無關對照抗體Ig(Sigma)、23C3及F8E11單克隆抗體，每組10只，每只小鼠200ug，2小時后每只尾靜脈注射200ul的ConA(30mg/ml)，誘導急性爆發型肝炎。取注射ConA后各治療組小鼠O、3、6、12、24和48小時的血清，檢測ALT和AST水平的變化；同時取12小時各組小鼠的肝臟，作HE和TUNEL染色，觀察肝臟的壞死、炎癥浸潤及細胞凋亡情況。實驗結果見圖14，圖14--1結果表明與對照治療組相比，23C3和F8E11單抗組都可以顯著的降低血清中ALT和AST的水平，其中23C3單抗組ALT和AST在各個時間點水平都低于其它組；從圖14-2中可見，23C3和F8E11單抗組肝壞死程度輕，炎癥細胞浸潤程度明顯低于對照組；TUNEL染色可見，對照組肝細胞凋亡嚴重，有近60%的肝細胞凋亡，而23C3和F8E11治療組分別約為20%和30%。因此，上述的肝損傷指標和病理指標都提示23C3和F8E11單抗都具有明顯的肝臟保護作用，而且23C3的效果優于F8E11。實驗例3不同治療組肝炎模型小鼠血漿及肝臟組織中OPN水平的變化實驗取不同時間點(0，3，6，12，24小時)不同治療組C57BL/6小鼠(實驗例2)的血漿，鼠OPNELISA試劑盒檢測OPN的蛋白濃度。具體的說，小鼠外眥靜脈取血，即刻離心4000rpm，10分鐘，分離血漿。以1:200稀釋加入至ELISA檢測試劑盒的96孔板中，常溫孵育1小時，PBST洗滌5次，加入生物素標記的抗OPN—抗，常溫孵育l小時，洗滌5次，加入親和素標記的二抗，常溫孵育l小時，洗滌6次后，底物TMB顯色，OD450檢測吸光度。根據標準曲線，計算血漿樣品中OPN的濃度。結果見圖15-1。對照組0PN水平大大高于23C3和F8E11治療組，23C3治療組0PN水平在各個時間均最低。取6小時不同治療組小鼠(實驗例2)的肝臟組織，RNeasyMiniKit(QIAGEN)抽取組織總RNA，用SensiscriptRTKit(QIAGEN)反轉錄醒為cDNA。根據Real--timePCR要求，設計0PN引物，見表l。SYBRGreenMasterMix(AppliedBiosystems)做Real-timePCR檢測OPN的mRNA水平。反應步驟為50°C，2分鐘；95°C，10分鐘；95°C，15秒和60°C，60秒，40個循環。GAPDH基因作為內參。實驗數據使用ABIPRISM7900sequencedetectionsystem(AppliedBiosystems)進行分析。實驗結果見圖15-2，23C3和F8E11單抗治療組肝臟組織0PN的水平均大大低于對照組的OPN水平，提示OPN單抗可能通過中和組織中0PN蛋白，調控OPN的mRNA水平。實驗例4.不同治療組肝炎模型小鼠血漿及肝臟組織中細胞因子水平的變化實驗取不同時間點(0，3，6，12，24小時)不同治療組C57BL/6小鼠(實驗例2)的血漿，鼠TNF-ct、IFN-YELISA試劑盒(R&D)檢測TNF-a、IFN-y的蛋白濃度。具體的說，小鼠外眥靜脈取血，室溫靜置2小時，分離血清。以l:100稀釋加入至ELISA檢測試劑盒的96孔板中，常溫孵育1小時，PBST洗滌5次，加入生物素標記的抗TNF-a、1FN-y—抗，常溫孵育1小時，洗滌5次，加入親和素標記的二抗，常溫孵育l小時，洗滌6次后，底物頂B顯色，0D450檢測吸光度。根據標準曲線，計算血漿樣品中TNF-ci、IFN-Y的濃度。實驗結果見圖16-1，細胞因子TNF-a、IFN7的水平在對照組中明顯高于23C3和F8E11單抗治療組，其中在3小時TNF-a、IFNi水平最高，23C3單抗治療組水平最低。取6小時不同治療組小鼠的肝臟組織，RNeasyMiniKit(QIAGEN)抽取組織總RNA，用SensiscriptRTKit(QIAGEN)反轉錄RNA為cDNA。根據Real-timePCR要求，設計各種細胞因子的引物。具體如表1。SYBRGreenMasterMix(AppliedBiosystems)做Real-timePCR檢測細胞因子的組織m腿水平。反應步驟同實施例3。實驗數據使用ABIPRISM7900sequencedetectionsystem(AppliedBiosystems)進行分析。實驗結果見圖16-么促炎細胞因子TNF-a、IL-IP和IL-6的mRNA水平在對照組中明顯高于正常小鼠，經23C3和F8E11單抗治療后，其mRNA水平明顯降低；同時Thl型細胞因子IFN-y的mRNA水平在23C3和F8E11單抗治療組也明顯降低，其中23C3作用效果好于F8E11。提示23C3和F8E11可能通過降低促炎因子的水平，從而降低肝臟的炎癥程度；而且23C3和F8Ell還可下調Thl型免疫反應。實驗例5不同治療組肝炎模型小鼠肝臟組織中NF-kB活性的變化實驗采用電泳遷移率變動分析(EMSA)，檢測肝臟組織中NF-kB活性。NE-PER核與胞漿抽提試劑盒(PierceBiotechnology公司)提取不同治療組6小時的肝臟組織(實施例2)核蛋白。以考馬斯亮藍法檢測核提取物蛋白濃度，分裝置于-80。C冰箱中保存備用。EMSA探針采用NF-KB互補的雙鏈寡核苷酸序列(5'AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG「3')，3'端生物素標記(3'端標記試劑盒，PierceBiotechnology公司)。組織核蛋白提取物用5%的非變性凝膠電泳，轉膜，然后和探針紫外交聯，LightShiftChemiluminescentEMSAi式劑盒(PierceBiotechnology公司)顯影。結果如圖17。對照治療組(controlIg)的NF-kB水平顯著高于naive小鼠，而經23C3和F8E11單抗治療后，NF-kb水平明顯下降。實驗例23C3和F8Ell單抗對Crohn's病模型小鼠的影響實驗實驗例123C3和F8E11單抗對Crohn's病模型小鼠體重、疾病活動指數(DAI)及脾指數的影響實驗以葡聚糖硫酸鈉(DSS)飲水法復制小鼠實驗性結腸炎30只，即以30g/LDSS代替飲用水給予小鼠飲用，連續7天。將上述小鼠隨機平均分為3組controlIg對照治療組、23C3單抗治療組、F8E11單抗治療組。腹腔給藥，制模當天開始給藥，連續3天，每次200ug/body。每天記錄實驗小鼠的體重，根據每天小鼠大便的性狀，潛血試驗及體重變化評價小鼠的疾病活動指數(評分標準見表2);表2.疾病活動指數(DAI)評分標準記分體質量下降(%)大便性狀便血0無正常陰性1卜5正常陰性26-10半稀便隱血(+)310-15半稀便隱血(+)4>15稀便肉眼血便DAI=(體質量下降分數+大便性狀分數+便血分數)/3第7天取小鼠脾臟，稱重，計算脾指數(脾臟重量/體重)。實驗結果如圖18-1、圖18-2、圖18-3。對照治療組的所有動物均可觀察到大便松軟或腹瀉、血便及體重減輕，而兩個單抗治療組的小鼠大便較成形、血便及體重減輕較不明顯。各組的疾病活動指數，兩各單抗治療較對照治療組明顯降低，而且23C3組好于F8E11治療組。對照治療組小鼠的脾臟指數相對于正常小鼠明顯升高，而兩個單抗治療組脾臟指數升高不明顯。實驗例2不同治療組Crohn's病模型小鼠結腸病理組織變化實驗取第7天的不同治療組的病變結腸組織(實驗例1)，PBS洗滌后，用10%甲醛固定，常規石蠟包埋，連續2um組織切片，HE染色。光鏡下觀察不同治療組的組織學改變。具體評分標準見表3。表3.病理組織損害評分標準<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>結果如圖19所示。光鏡下可見對照治療組結腸組織結構不完整，潰瘍深，范圍大及炎性滲出物，有大量淋巴細胞和中性粒細胞浸潤，并可見數量不等的單個核細胞和嗜酸性粒細胞；與對照組相比，23C3和F8E11單抗治療組，組織結構較完整，炎癥及潰瘍程度輕，淋巴細胞和中性粒細胞浸潤少，組織評分明顯低于對照治療組。實驗例3應用23C3和F8E11單抗對Crohn's病模型小鼠腸組織髓過氧化物酶(MPO)活性的影響實驗腸組織髓過氧化物酶(MPO)活性的檢測用商品化的試劑檢測。取各個治療組0、3、7天的結腸組織(實驗例l)，稱取相同的重量后，剪碎，冰浴勻漿(在含O.5。/。HTAB緩沖液中)30秒，勻漿液超聲10秒鐘，反復凍融3次，15000gX15分鐘。0.lml勻漿上清加入2.9ml0.167mg/ml的0-dianisidinehydrochloride,并加入O.0005。/g的HA,，檢測0D460。根據公式換算MPO的活性，1個單位的MP0活性等于l分鐘ltool的過氧化物酶降解。結果如圖20所示。各組MPO的活性具有時間依賴性，隨著炎癥進展，MPO的活性也逐漸增加。其中對照治療組MP0水平在第3和7天明顯高于23C3和F8E11單抗治療組，而且23C3組對MP0活性水平最低。實驗例4不同治療組Crohn，s病模型小鼠腸組織中TNF-a、IL-1P和IL-6mRNA水平的變化實驗取第3天和第7天不同治療組小鼠的腸組織(實驗例1)，RNeasyMiniKit(QIAGEN)抽取組織總■，用SensiscriptRTKit(QIAGEN)反轉錄RNA為cDNA。根據Real-timePCR要求，設計各種細胞因子的引物。具體如表l。SYBRGreenMasterMix(AppliedBiosystems)做Rea卜-timePCR檢測細胞因子的組織mRNA水平。反應步驟同實施例3。實驗數據使用ABIPRISM7900sequencedetectionsystem(AppliedBiosystems)進行分析。實驗結果見圖21，促炎細胞因子TNF-a、IL-1{3和IL-6的mRNA水平在對照組中明顯高于正常小鼠，經23C3和F8E11單抗治療后，其mRNA水平明顯降低；其中23C3作用更強。提示23C3和F8E11可能通過降低促炎因子的水平，從而降低結腸的炎癥程度。實施例5不同治療組Crohn's病模型小鼠腸組織及血漿中0PN水平的變化實驗取不同時間點(O，3，7天)不同治療組C57BL/6小鼠(實驗例l)的血漿，鼠OPNELISA試劑盒檢測OPN的蛋白濃度。具體的說，小鼠外眥靜脈取血，即刻離心4000rpm，IO分鐘，分離血漿。以1:200稀釋加入至ELISA檢測試劑盒的96孔板中，常溫孵育l小時，PBST洗滌5次，加入生物素標記的抗OPN—抗，常溫孵育1小時，洗滌5次，加入親和素標記的二抗，常溫孵育1小時，洗滌6次后，底物TMB顯色，OD450檢測吸光度。根據標準曲線，計算血漿樣品中OPN的濃度。結果見圖22-1。對照組OPN水平大大高于23C3和F8E11治療組，23C3治療組OPN水平在各個時間均最低。取第7天不同治療組小鼠(實驗例1)的結腸病變組織，RNeasyMiniKit(QIAGEN)抽取組織總RNA，用SensiscriptRTKit(QIAGEN)反轉錄RNA為cDNA。根據Real-timePCR要求，設計OPN引物，見表1。SYBRGreenMasterMix(AppliedBiosystems)做Rea1-timePCR檢測OPN的mRNA水平。反應步驟為50°C，2分鐘；95°C，10分鐘；95°C，15秒和6(TC，60秒，40個循環。GAPDH基因作為內參。實驗數據使用ABIPRISM7900sequencedetectionsystem(AppliedBiosystems)進行分析。實驗結果見圖22-2，23C3和F8E11單抗治療組結腸組織0PN的水平均大大低于對照組的OPN水平，提示OPN單抗可能通過中和組織中0PN蛋白，調控OPN的mRNA水平。實驗例manti-hOPN(23C3、F8E11)單克隆抗體抗原表位的鑒定實驗實驗例1mantihOPN(23C3)單克隆抗體抗原表位的淘選實驗采用隨機肽庫免疫淘選法，整個過程在96-孔板上進行。23C3單克隆抗體100ug/ml，100ul/孔4。C包被過夜，10%脫脂奶粉(TBST稀釋)封閉過夜，1XTBST(Tween-200.1%)洗滌6次；噬菌體隨機肽庫(購自NEB，Ph.D.-12PhageDisplayP印tideLibraryKit)4X10'"pfu+100ul正常小鼠血清，室溫輕搖1小日寸。IXTBST(Tween-200.1%)、1XPBSPH5.0、1XPBSPH3.5分別洗滌5次；用含lmg/m]BSA的Glycine-CIPH2.2洗脫，室溫輕搖15分鐘，15ulTris-CIPH9.1中和。LOul用于測滴度，其余擴增。擴增產物經PEG/NaCl沉淀，測滴度，同時進行第二輪淘選，相同過程進行第三輪淘選。每次加入噬菌體數相同(4X1(Tpfu)，三輪淘選output噬菌體數分別為2.76xl03pfu、3.45xl05pfu、3.08xlOHpfu;淘選效率分別是第一輪的125和1116倍，結果表明淘選富集效果明顯。見圖23。實驗例2phageclonesELISA和westernblot鑒定實驗EL]SA過程在96孔板進行，23C3單克隆抗體100ug/ml，50ul/孔4。C包被過夜，10%脫脂奶粉(TBST稀釋)37"C封閉2小時，1XTBST(Tween-200.1%)洗滌5次；各單克隆噬菌體擴增上清用1XTBS稀釋后，均以5X108pfu/50ul，對照抗體為鼠單抗SM5-1(申請人自己制備，制備過程參照文獻SM5-1:anewmonoclonalantibodywhichishighlysensitiveandspecificformelanocyticlesions.ArchDermatolRes.2000Dec;292(12):583-9.以下均同)，陰形對照噬菌體為4E4(該克隆為SM5-1的陽性克隆申請人篩選獲得篩選過程同上。以下均同)。室溫結合1小時，lXTBST(Tween.200.1%)洗滌5次后，每孔加入200ul1:5000稀釋的服P標記的抗-M13抗體(Pharmacia#27-9411-01)，室溫震蕩作用1小時，lXTBST(Tween-200.1%)洗滌5次，晶美公司ELISA檢測試劑盒A:B=1:1新鮮配置的反應底物50ul/孔，室溫1-5分鐘。2NH2S0J冬止反應。每個克隆對23C3和對照抗體SM5-1均設3復孔平行檢測。0D450記錄結果表明，陽性克隆與抗體的反應是特異的。見圖24-1.Westernblot過程擴增后的噬菌體單克隆上清經20%PEG/NaCl沉淀純化后，1X1010pfu/lane10%SDS-PAGE電泳，360mA恒流1小時轉至硝酸纖維素膜，10%脫脂奶粉4。C封閉過夜或者室溫封閉2小時；1XTBST(Tween-200.1%)洗滌3次，每次10分鐘；與10ug/ml—抗室溫反應1小時，lXTBST(Tween-200.1%)洗滌5次，每次10分鐘；1:1000稀釋HRP標記的兔抗鼠IgG(北京中山公司)室溫反應l小時，ECLkit(Tiangen公司)反應1-2分鐘，醫用X射線感藍膠片壓片曝光。結果見圖24-2。圖24-2左圖為23C3抗體雜交結果，圖24-2右圖為無關抗體SM5-1雜交結果；這些結果顯示陽性克隆與抗體的反應是特異的(對照抗體為鼠單抗SM5-1，陰形對照噬菌體為4E4(該克隆為SM5-1的陽性克隆)。實驗例3測序及序列分析單鏈DNA提取試劑盒(上海捷瑞公司)制備模版，-96引物測序，Chromas讀取序列，25個陽性克隆有15個獨立序列；AlignX分析，結果見圖25，可以看出，23C3的可能抗原表位為WLXPDP。實驗例4Phage克隆與抗體結合能力分析實驗例3得到的各個克隆均以5X107pfu投入到包被有抗體的96-孔板，經過相同條件的淘選。(對照抗體SM5-1;無關對照噬菌體4E4)，對洗脫后的噬菌體進行滴度測定。(參見blood2006-04-014639)結果顯示hOPN序列中，表位W43LNP46DP48,其中W43，P46，48在介導23C3--hOPN的結合中起重要作用。選擇結合力最強的克隆之一5F12:DVYWLMPDPPTS合成短肽。結果見圖26。實驗例5對manti-hOPN(F8E11)單克隆抗體抗原表位的淘選隨機肽庫淘選整個過程在96孔板上進行。100ug/ml，100ul/孔F8E11抗體4。C包被過夜，10X脫脂奶粉(TBST稀釋)封閉過夜，lXTBST(Tween-200.1%)洗滌6次；噬菌體隨機肽庫(購自NEB，Ph.D.-12TMPhageDisplayP印tideLibraryKit)4X1010pfu+lOOul正常小鼠血清，室溫輕搖1小時。IXTBST(Tween-200.1%)、1XPBSPH5.0、1XPBSPH3.5分別洗滌5次；用含lmg/mlBSA的Glycine-CIPH2.2洗脫，室溫輕搖15分鐘，15ulTris-CIPH9.l中和。10ul用于測滴度，其余擴增。擴增產物經PEG/NaCl沉淀，測滴度，同時進行第二輪淘選，相同過程進行第三輪淘選。每次加入噬菌體數相同(4X1010pfu)，三輪淘選output噬菌體數分別為2.38x103pfu、9.2x105pfu、1.86x107pfu;淘選效率分別是第一輪的386和7803倍，結果表明淘選富集效果明顯。見圖27。實驗例6phageclonesELISA和westernblot鑒定ELISA過程在96-wellplate進行，F8E11單克隆抗體100ug/ml，50ul/孔4。C包被過夜，10X脫脂奶粉(TBST稀釋)37。C封閉2小時，lXTBST(Tween-200.1%)洗滌5次；各單克隆噬菌體擴增上清用1XTBS稀釋后，均以5X108pfu/50ul，對照抗體為鼠單抗SM5-1，陰形對照噬菌體為4E4(該克隆為SM5-1的陽性克隆)。室溫結合1小時，1XTBST(Tween--200.1%)洗滌5次后，每孔加入200ul1:5000稀釋的HRP標記的抗M13抗體(Pharmacia#27—9411—01)，室溫震蕩作用1小時，lXTBST(Tween--200.1%)洗滌5次，晶美公司ELISA檢測試劑盒A:B=1:1新鮮配置的反應底物50ul/孔，室溫1-5分鐘。2NH,S04終止反應。每個克隆對F8E11和對照抗體SM5-l均設3復孔平行檢測。0D450記錄結果表明，陽性克隆與抗體的反應是特異的。如圖28-1。Westernblot過程擴增后的噬菌體單克隆上清經20%PEG/NaCl沉淀純化后，1X1010pfu/lane10%SDS-PAGE電泳，360mA恒流1小時轉至硝酸纖維素膜，10。/。脫脂奶粉4。C封閉過夜或者室溫封閉2小時；lXTBST(Tween-200.1%)洗滌3次，每次10分鐘；與10ug/ml—抗室溫反應1小時，lXTBST(Tween-200.1%)洗滌5次，每次10分鐘；1:IOOO稀釋HRP標記的兔抗鼠IgG(北京中山公司)室溫反應l小時，ECLkit(Tiangen公司)反應1-2分鐘，醫用X射線感藍膠片壓片曝光。結果見圖28-2，圖28-2左圖為F8E11抗體雜交，圖28-2右圖為無關抗體SM5-1雜交；箭頭所示為目標條帶；結果顯示陽性克隆與抗體的反應是特異的(對照抗體為鼠單抗SM5--1，陰形對照噬菌體為4E4(該克隆為SM5--1的陽性克隆))。實驗例7測序及序列分析單鏈DNA提取試劑盒(上海捷瑞公司)制備模版，-96引物測序，Chromas讀取序列，32個陽性克隆有18個獨立序列；AlignX分析，結果如圖29，可以看出，F8E11的可能抗原表位為:QLYXXYP。實驗例8Phage克隆與抗體結合能力分析各個克隆均以5X107pfu投入到包被有抗體的96孔板，經過相同條件的淘選。(對照抗體SM54;無關對照噬菌體4E4)，對洗脫后的噬菌體進行滴度測定。(參見blood2006-04014639)結果顯示hOPN序列中，表位QLYXXYP，其中QLY和YP在介導F8E11-hOPN的結合中起重要作用，單獨的LY或YP不足以介導兩者的結合，不過Q在結合中不是至關重要的。結果見圖30。根據以上實驗結果，選擇結合力最強的克隆6A8:TVKQLYTLYPAA合成短肽。實驗例9合成短肽與抗體的特異性結合實驗Dot--blot實驗分別取3X10ngKLH-4B5(無關對照)、KLH-5F12、KLH-6A8,各點三個點，實驗例4和實驗例8得到的每種短肽均與三種不同的抗體雜交，經過封閉、洗膜、一抗室溫反應1小時、洗膜、HRP標記抗鼠二抗室溫反應1小時，洗膜、壓片曝光。無關短肽與23C3和F8E11均不反應，KLH-5F12、KLH-6A8均能與相應的抗體有特異的反應，同時可以看出0PN的兩個單抗沒有交叉反應，結果如圖31-1。短肽對噬菌體-抗體結合的阻斷實驗100ug/ml50ul/孔抗體包被96-孔板，4'C過夜，10。/。脫脂奶粉封閉，1XPBST洗3次，備用.100ug/ml短肽與噬菌體混勻后，加入抗體包被的板，室溫，輕搖，l小時，lXTBST(Tween-200.1%)、IXPBSPH5.0、1XPBSPH3.5各洗5次；Glycine--CIPH2.2lmg/mlBSA洗脫15分鐘，Tris--ClPH9.1，中和，測滴度。每個短肽均分三組①phage②phage+p印tide③phage+irrelativep印tide。該濃度的短肽5F12的阻斷效率為71%，6A8的阻斷效率為89%。結果如圖31-2。結果表明F8E11和23C3兩個抗體的表位均位于0PN第四外顯子處，兩者之間相隔約10個氨基酸，但兩者沒有交叉反應。兩表位的位置和序列如圖32所示，序列見SQEIDNO.11。SEQUENCELISTING<110>上海國健生物技術研究院〈120〉骨橋蛋白的功能表位、與其特異性結合的單克隆抗體及用途<130〉Eta-1(osteopontin):anearlycomponentoftype-l(cell-mediated)immunity.Science.2000.287:860-86411〈160〉〈170>〈210〉〈211〉<212><213>〈400〉atgagaattgcaggctgattgccacatggcgtgtcctctgagccatgaccgactccattggatgagtctcccagcaaccggatagtgtggtaccctgatggcatacaaggggg鄉g;acEiaagcagtccaattgatagtccatgaagatacgtatttctcPfitentlnversion3.11935腿人工序列1cagtgatttgcttttgcctcctaggcatcacctgtgccat60ctggemgttctg3ggat嵌igcagctttaca,tgctgtg120taaaccctgacccatctcagaagcagaatctcctagcccc180tgactttaaacaagagacccttccaagtaagtxcaacgaa240acatggatgatatggatgatga卿tgatgatgaccatgtggacagccag300actcgaacgactctgatgatgtagatgacactgatgattctcaccagtct360accattctgatgaatctgatgaactggtcactgattttcccacggacctg420aagttttcactccagttgtccccacagtagtggccgaggt■tttatggactgaggtxafiaatctaagaagtttcgcagacctgacatccag540ctacagacgaggacatcacctcacacatgga卿cg鄧gagttgaatggt600ccatccccgttgcccaggacctgaacgcgccttctgattgggacagccgt660gttatgaaacgagtcagctgga_tgaccag￡igtgctgaaaccc3C3gccax720gattatataagcgg肌agccaatgatgagagCa￡ltg￡lgC￡lttccgatgtg780aggaactttccaaagtcagccgtgaattccacagccatga已tttcac已gc840tgctggttgt3gscccca^aagt卿gaagcctgaaattt900￡ltg￡l￡Ltt3g￡ltagtgcatcttctga935〈210〉2〈211〉985〈212〉DNA〈213>人工序列〈400>23tg卿ttgggtgactgatt,tggccggtcctctgaaggaggattctgaccgtcactgcccaacggccgtttctgatgggtg3gt由atcgatagtcc已caaggacacgaatttctcacagttccttcagtgatttgcLggctigclxtgcctgacccaaa￡igg￡itga_tggacgacgatggactcggaCt￡Lgt￡lC￡LC3ga,ggtgatagaggagtccct3caacgga^agacttgagcaaagcaagttcagctagtcctactttgcattgctcatttxtcttttgcctgagaggagtmgatctcagaagctttaagcaatgatgacgattgaatxtgacagcdg3cactcttggcttattgtitgccacacgatgtcatcgggC￡lgCC￡ltttccaei3g3gcaaagccagcagaccctaaggagttcatctt￡lgt￡l￡i3a￡iCcagtttttggcattgctttacagcccagaatctccgaaactcttcg3tg3tg3Cggaatctcaccttcactccaagg￡LCtg￡iggtcctgttgcccgagtcaagtcagccagg卿ctggaacatcagt肌ggaagtctgaggtca犯gaaaaagtcctcctccctttgcgccac已atgg￡lg￡LCC￡leittcggatgatcgtccctacceiaagtcttigtcacctctcaagcttctgagagctggatgagtgccgatcaagagccacaaatgataggtagttagtgaggCCCggtg￡L￡l￡Ltcctatagccg犯tgctgtgcaatgaaagctgcag卿gcgtctgatgagagtcgatgtcgagtttccagcatg犯gagccatgccctctaccaagtctggtcggatgtggtttcacagctctgaaattc3ggcaa肌acgtt鄉cagg60120180240300360420480540600660720780840900960985〈210〉3<211>354〈212〉DNA〈213〉人工〈■>3atggcccagccctaaagggteitg咖tgggcaaagtaatagccatgtatt序列cggccatggccgaggtgc￡igCgggtgg￡lgtctggtggaggattggtgcag60ttcatgtgcagcctctggattcaccttcaatatctacgcc120tccgccaggctccaggaaagggtttggaatgggttgctcgcat犯g犯gt180attatacaacatattatgccgattcagtgaaagacaggttcaccatctcc240gctctatctgcaaatgaacatgaggacaca3003Ctgtgtg￡lgaca朋tgggagactectggggccaaggcacC3Ct354〈210〉4<211>118<212〉PRT<213〉人工序列<400〉4MetAlaGluValGinArg15LysGlySerLeuLyslie20lieTyrAlaMetAsnTrp35TrpValAlaArglieArg50AlaAspSerValLysAsp6570ValGluSerSerValSer55ArgCysAla25ArgGin40G丄nSerGly10AlaAlaAsnPheThrlieGlySerProAsnSer75GlyGlyGlyTyr60ArgLeuValGin15PheThrPhe30LysGlyLeu45ThrThrTyrAspAspSerProAsnGluTyrGin8038SerMetLeuTyrLeu85MetTyrTyrCysVal100ThrLeuThrValSer115〈210〉5〈211〉324〈212〉DNA<213>人工序列<400>5g￡lC￡lttgtg3tgacccagtctccagcctccctatctgtatctgtggg卿aactgtcacc60atcacatgtca,gt,ttttt￡igcatggtatcagcaga已acag120ggaaaatctcctxfigctcctggtxtatgctgcaacaaacttagctgatggtgtgccstca180aggttcagtggcagtgg3tcaggcacacagttttccctcaagatcaacagcctgcagtct240gaagattttgggacttattactgtcaacatttttggggtactccattcacgttcggctcg300gggac認gtacgt324〈210〉6<211〉108<212〉PRT〈213〉人工序列<400>6AsplieValMetThr15GluThrValThrlie20LeuAlaTrpTyrG]n35TyrAlaAlaThrAsn50SerGlySerGlyThr65GluAspPheGlyThr85ThrPheGlySerGly100〈210〉7<211〉354〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉7atggccgacgtgatgctggtggagtctggaggaggcttggtacagcctgggggUctctg60agactctcctgtgcaacttctgggttcaccttcactgattactacatgagttgggtccgc12039GinMetAsnAsnLeuLysThrGluAspThrAla9095ArgGinMetGlyAspTyrTrpGlyGinGlyThr105110SerGinSerProAlaSerLeuSerValSerValGly1015ThrCysArgAlaSerGluAsnlieTyrSerPhe2530GinLysGinG丄yLysSerProGinLeuLeuVal4045LeuAlaAspGlyValProSerArgPheSerGly5560GinPheSerLeuLyslieAsnSerLeuGinSer707580TyrTyrCysGinHJsPheTrpGlyThrProPhe9095ThrLysLeuGlulieLysArg105cagcctccaggaaagggacttgaatttttgggttttattaacaacagagttcalAccatctgtgaagggtcggttceiccaagcatcctctatcttcaaatgaacaccctgagagctgagggcaagatatgcgatggactactggggtxaaggaacctcag〈210〉8<211〉118<212〉PRT<213〉人工序列〈400〉8MetAlaAspVal1GlyGlySercaaataaagctaaaggttac180tttccagagatagttcccaa240acagtgccacttattactgt300tcaccgtctcctcg354AspTy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