抗人端粒酶逆轉錄酶單鏈抗體的制作方法

專利名稱：抗人端粒酶逆轉錄酶單鏈抗體的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程抗體技術領域，具體涉及一種用于抑制腫瘤細胞分裂生長，誘導 腫瘤細胞凋亡的基因工程單鏈抗體。
背景技術：
端粒、端粒酶與腫瘤的關系是近年來受到國際醫學界高度重視的研究熱點。腫瘤細胞 尤其是惡性腫瘤細胞常常因為獲得永生性而具有了無限增殖能力，而腫瘤細胞無限增殖能 力的維持則依賴于端粒酶的活性。大量研究表明，各類惡性腫瘤中幾乎都有端粒酶的異常
高表達(KimNW, 1994)。人端粒酶是由RNA和蛋白質組成，其中人類端粒酶逆轉錄酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTERT)是端粒酶的催化活性亞單位(TakayaraJ， 1998; KanayaT， 1998; TakayaraM， 1998)。已發現大約85%的人類惡性腫瘤具有hTERT 的高表達，所以抑制人端粒酶端粒酶逆轉錄酶的活性為抗腫瘤藥物的設計提供了新的目 標。
單鏈抗體(single chain Fv， ScFv)是一個重要的基因工程抗體，是在DNA水平上利用 基因工程方法使抗體重鏈可變區(VH)基因和輕鏈可變區(VL)基因通過一段約5 25個 氨基酸寡核苷酸(linker)的連接肽， 一般為(Gly4Ser) 4，首尾拼接而形成的重組蛋白。 具有(1)制備方法簡單，成本低；(2)免疫原性弱；(3)能均勻分布于腫瘤且與抗原 結合特異性強；(4)體內周轉快；(5)易于進一步進行基因工程改造等特點，因此它的 應用領域相當廣泛，尤其在腫瘤人工免疫治療方面。ScFv基因轉染細胞表達的細胞內抗體 是繼反義核酸、核酶和顯性負突變技術后又一巧妙的基因治療策略，同時又是用于表型敲 除研究的又一有力工具，可作用于各種靶分子。將含抗癌相關蛋白的抗體基因轉染細胞,細 胞表達的scFv與癌相關蛋白作用，可能間接抑制腫瘤的生長。目前這方面的研究主要集中 在腫瘤細胞高表達的某些蛋白及與腫瘤細胞耐藥、侵襲和轉移等相關的蛋白上。人端粒酶 逆轉錄酶的表達和激活在調節細胞生長和分化中起重要作用,因此他們也就成為抗癌治療 的新的耙標。

發明內容
本發明的目的是提供一種抗人端粒酶逆轉錄酶單鏈抗體基因，將該抗體的編碼基因導 入到腫瘤細胞內部進行表達。體內表達的抗體分子與相應的催化亞基特異性結合，可阻斷 端粒酶裝配，封閉腫瘤細胞中端粒酶逆轉錄酶的活性，從而抑制腫瘤細胞生長分裂，誘導 其凋亡。
本發明的內容包括利用生物工程技術，提供編碼抗hTERT-scFv基因和由此推斷的 氨基酸序列；提供含有所述的抗hTERT-scFv基因的表達質粒和利用該質粒轉化的工程菌； 同時提供從所述工程菌制備重組抗hTERT-scFv的方法，以及將抗hTERT-scFv基因作為治 療對人端粒酶逆轉錄酶陽性腫瘤藥物制劑應用。
本發明提出的重組抗hTERT-scFv基因，是由連接抗體的Vl和基因VH，建立一個抗 hTERT-scFv基因，該基因由738個堿基對組成。這種scFv的核苷酸序列為SEQ.ID.No.l 。 本發明的具體過程如下
1、 從穩定分泌人端粒酶逆轉錄酶單克隆抗體的雜交瘤細胞中提取、純化mRNA。體外 反轉錄cDNA。
2、 克隆輕鏈可變區基因，連入pGEM-T載體(Promega)，進行序列分析，經同源對 比分析，證實該基因片段為抗體輕鏈可變區基因，序列為SEQ.ID.N03。
3、 克隆重鏈可變區基因，連入pGEM-T載體，進行序列分析，經同源對比分析，證 實該基因片段為抗體重鏈可變區基因，序列為SEQ. ID. N04。
4、 連接抗體輕鏈，重鏈基因，以編碼(Gly4Ser) 4的連接DNA序列，連接抗體輕、 重鏈可變區，構建抗hTERT-scFv基因，序列為SEQ. ID. NOl。
將上述scFv基因克隆到商業化的pET28a表達載體(Novagen)上，轉化BL21宿主大腸 桿菌，獲得的轉化菌株為工程菌株Rosetta/hTERT-scFv。
培養該工程菌株，經IPTG誘導表達3-4小時，利用該單鏈抗體上融合的6個組氨酸 標簽，對其進行Ni柱親和層析純化，咪唑濃度梯度洗脫，得到本發明的分子量為30KD的 單鏈抗體蛋白，其序列為SEQ. ID. N02 。
TRAP-ELISA方法在體外檢測純化的hTERT單鏈抗體蛋白對HeLa細胞中內源端粒酶 逆轉錄酶活性的影響。
將上述scFv基因克隆到真核表達載體pEGFP-Cl(Clontech)上，構建可以用于腫瘤基因 治療的細胞內抗體表達質粒pEGFP-Cl-scFv。
pEGFP-Cl-scFv和pEGFP-Cl質粒分別瞬時轉染HeLa細胞，轉染后三天內，每隔12 小時用PI染色法測定細胞周期分布及細胞凋亡。


圖1為抗hTERT-scFv基因工程菌表達分析圖。
其中1為pET28a/Rosetta誘導表達產物，2為pET28a-scFv/Rosetta基因工程菌表達 產物，3為純化得到的hTERT-scFv蛋白，分子量為30KD。 圖2為抗hTERT-scFv對端粒酶活性的抑制反應柱形圖。
其中左側為添加不相關蛋白的對照反應體系端粒酶活性，右側為加hTERT-scFv后反 應體系中的端粒酶活性，可以看到純化的hTERT-scFv對HeLa細胞端粒酶活性的抑制作用 可以達到42.6%。該圖代表三次獨立實驗的結果，數據經t檢測，"代表p〈0.001。
圖3為真核表達scFv基因后MTT法測定細胞活力的柱形圖。
分別轉染pEGFP-Cl-scFv和pEGFP-Cl質粒后每個不同的時間點(24h, 36h, 48h, 60h， 72h和84h)的HeLa細胞，用MTT法染色后，酶標儀測定0057()，與本底值比較，得相對 細胞活力。該圖代表三次獨立實驗的結果，數據經t檢測，Mt表p〈0.01，"代表p〈0.001。
圖4為真核表達scFv基因后PI染色法測定細胞周期的柱形圖。
分別轉染pEGFP-Cl-scFv和pEGFP-Cl質粒后每個不同的時間點(24h, 36h, 48h, 60h, 72h和84h)的HeLa細胞，用PI染色后，流式細胞術測定處于各細胞周期的細胞所占的百 分率。該圖代表三次獨立實驗的結果，數據經t檢測，Mt表p〈0.01，"代表p〈0.001。
具體實施方式
實施例1:
1、 細胞培養及鑒定將分泌hTERT單克隆抗體的雜交瘤細胞培養于含10。/。小牛血清 的完全RPMI1640培養基中。培養箱含5%C02的混合氣體，濕度為98%。用ELISA方法 鑒定培養上清中單抗的特異性和滴度。
2、 抗hTERT單克隆抗體輕鏈、重鏈可變區基因的克隆取生長良好雜交瘤細胞株， 用Trizol試劑提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，用PCR技術，在反應體系中加入cDNA和 一套抗體輕鏈或重鏈可變區引物，10XPCR反應緩沖液，終濃度為2.5mM的dNTP， 1 u L7k DNA聚合酶，總反應體系為50yL。進行30個循環反應，每個循環的條件是94'C變 性30秒，55'C退火30秒，72'C延伸1分鐘，最后一個循環結束后72'C保溫10分鐘。膠 回收輕鏈和重鏈可變區基因擴增產物后連入pGEM-T載體，轉化大腸桿菌保存陽性克隆。
輕鏈、重鏈可變區基因的篩選將輕鏈、重鏈可變區基因連入pGEM-T載體轉化大腸 桿菌DH5 a ， PCR驗證轉化子。DNA測序分析hTERT抗體重鏈可變區是由351個核苷酸 組成，其基因序列為SEQ.ID.No.3。輕鏈可變區是由325個核苷酸組成，其基因序列為 SEQ.ID.No.4。
3、 hTERT-ScFv的構建PCR分別在重鏈、輕鏈可變區片段兩端引入限制性內切酶 位點BawHI ， H/"dlI和編碼(Gly4Ser)4的連接DNA序列。回收純化后，再OVERLAP PCR 將重鏈和輕鏈可變區連接成端粒酶ScFv基因片段，割膠回收，用^/wHI和iVa I雙酶切 消化，割膠回收，連入預先切好的pET28a表達載體，轉化入大腸桿菌DH5a擴增，PCR 和限制性內切酶驗證轉化子。序列分析證明構建的單鏈抗體具有hTERT抗體的輕、重鏈可
變區以及(Gly4Ser) 4的連接肽，由738個核苷酸組成其基因序列為SEQ.ID.No.1。
4、 單鏈抗體基因的表達隨機選取陽性克隆進行小量表達篩選，挑單菌接種于 Kan+Cm+LB培養液中，pET28a/Rosetta為負對照，37'C搖床過夜，第二天按ly。接種于2mL 新鮮培養液中，37'C培養2-3h，吸出lmL未誘導菌液，置于1.5mL離心管中，余下菌液 加入IPTG至終濃度為lmM， 37。C培養3-4h。超聲裂解菌體蛋白，ELISA方法挑選與抗原 結合活性最高的陽性克隆，大量表達(圖l)。
5、 單鏈抗體蛋白的純化利用該單鏈抗體上融合的6個組氨酸標簽，對其進行Ni柱 親和層析純化，咪唑濃度梯度(20到100mM)洗脫得到分子量為30KD的單鏈抗體蛋白
(圖1 )。從DNA序列推導hTERT-scFv是由244個氨基酸組成，其序列為SEQ.ID.No.2。
6、 單鏈抗體蛋白對hTERT活性抑制的檢測依照TRAP-ELISA端粒酶活性檢測試劑 盒說明書操作，收集2Xl(^體外培養的人宮頸癌HeLa細胞，裂解緩沖液抽提蛋白，以蛋 白裂解液為模板，并在反應體系中添加純化的單鏈抗體蛋白，以添加無關單鏈抗體蛋白的 反應作為負對照，以未添加單鏈抗體的HeLa細胞裂解液中的端粒酶逆轉錄酶活力為100%。 該反應液在25"C孵育30分鐘后作為模板迸行PCR，迸行35個循環反應，每個循環的條件 是94'C30秒，59X:60秒。檢測到該純化的單鏈抗體對端粒酶活性有42.6%的抑制活性， 實驗重復三次后取平均數土S.D (圖2)。
本發明構建的抗hTERT單鏈抗體具有兩個抗原結合臂，可以有效地和靶抗原結合。單 鏈抗體分子量只相當于完整抗體的1/6，在臨床應用上比完整抗體優越免疫原性弱，對 實體瘤滲透能力強，可以用基因工程手段發酵生產。與傳統的單克隆抗體藥物相比，其可 以驚醒大規模細菌發酵生產，且價格低廉，易于普及應用，是一種極具應用潛力的抗體形 式。
實施例2:
1、 hTERT-scFv真核表達載體的構建設計引物，使用PCR方法在hTERT-scFv基因 的兩端引入H/wcffll和Ba附HI酶切位點。在反應體系中加入模版和引物，10XPCR反應緩沖 液，終濃度為2. 5mM的dNTP， 1 u LT^DNA聚合酶，總反應體系為50 u L。進行30個循環 反應，每個循環的條件是94'C變性30秒，6CTC退火30秒，72'C延伸1分鐘，最后一個 循環結束后72"C保溫10分鐘。用^wtHI和臉oI雙酶切消化，割膠回收，連入預先切好 的pEGFP-Cl真核表達載體，轉化入大腸桿菌DH5a擴增，PCR和限制性內切酶驗證轉化 子。序列分析驗證陽性克隆。
2、 本發明依照產品說明書，使用LipofectAMINETM2000脂質體(Invitrogen)進行轉 染，轉染后24-84小時，進行細胞生長效應測定。以每孔5X1()S個細胞的密度接種6孔板，
在鋪板率達到90%時，將2.5^il脂質體和3嗎質粒分別溶解于250 plOPTI-MEM，室溫靜 止5分鐘后，將脂質體和質粒均勻混合，室溫靜止25分鐘。在6孔板中加入1.5mL無血 清培養基后，加入轉染混合液，孵育5小時后，更換新鮮完全培養基。實驗組質粒為 pEGFP-Cl-scFv，對照組為載體質粒pEGFP-Cl 。
3、 MTT法檢測細胞存活率轉染24小時后每個不同的時間點((24h, 36h, 48h， 60h, 72h 和84h)，對照組和實驗組細胞分別用胰酶消化，調整密度為1X10V孔接種96孔板，24小 時后加入MTT， MTT用PBS緩沖液配成5mg/mL溶液，每孔加10uL，孵育3小時，使 MTT還原為甲月替。吸出上清液，加入100uL的酸化異丙醇溶解甲月替。酶標儀(Bio-Rad) 檢測570nm波長處吸光值OD57Q。將各測試孔的OD值減去本底OD值(完全培養基加 MTT，無細胞)，各重復孔的OD值取平均數，細胞的存活率- (實驗組細胞OD/對照組細 胞OD) X100% (圖3)。
4、 PI染色法檢測細胞周期轉染24小時后每個不同的時間點(24h, 36h, 48h, 60h, 72h 和84h)，分別收集6孔板中對照組和實驗組細胞(包括已經漂浮的細胞)，PBS洗滌后，于 70%的乙醇中，4。C固定過夜，1000rpm離心10分鐘后，加入RNase A (10昭/mL)和PI (50嗎/mL)， 37。C反應15分鐘，流式細胞術分析細胞周期(圖4)。
本發明以人端粒酶逆轉錄酶為靶點，結合基因工程技術，構建了具有分子量小，實體 組織穿透力強，免疫原性低等優點的單鏈抗體，該抗體被證明有很好的抗原結合力。且由 于該單鏈抗體可以有效地與端粒酶的催化亞基結合從而顯著降低了端粒酶活性。在基于抗 人端粒酶逆轉錄酶單鏈抗體基因的基因治療中，我們也觀測到了該胞內抗體的表達對細胞 生長和周期顯著的阻礙作用。因此，本發明有可作為一種新型的抗腫瘤制劑；且由于該基 因工程抗體制備工藝簡單，成本低廉，所以有巨大的市場潛力。
序列表樣例
<no〉復旦大學
<120>抗人端粒酶逆轉錄酶單鏈抗體
<160/ 2 〈170〉 <21()〉 1 <211> 738 <212> DNA
〈213〉大腸桿菌種65"sc力eri'c/n'a coU
<220〉 <400> 1<formula>formula see original document page 8</formula>
<213〉大腸桿菌種65"sc力en'c/n'a coh'J
<221〉 V—segment
<222〉 (l)... (116)
<223〉抗端粒,抗體重鏈可變區
〈220>
《221〉 V—segment
〈222〉 (137)... (244)
<223>抗端粒酶抗體輕鏈可變區
《22()>
<221〉 N_segment <222> (117)... (236)
<223〉連接抗端粒酶抗體輕繭鏈可變區的連接肽 "0()> 2
ttg cag ctg cag gag tct ggt gga gga ttg gtg cag cct咖ggg tea ttg咖etc tea 60 Leu Gin U'u (Uri Glu Ser Gly Gly Giy Lt，u Val Gin P—ro Lys (;iy Ser Leu Lys Leu Ser 1 5 10 15 20
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tat, gcc gat tea gtg aaa gac agg etc acc ate tec aga gat gat tea caa. aac atg etc 240 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Leu Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Gin A幼Met Leu 65 70 75 80
tat etc cfia a.tg acc aac ttg a幼act ga.g gac Tyr Leu Gin Met Thr Asn Leu Lys Thr Ghi Asp 85 90 95 100
aca gcc acg tat tac tgt gtg a.gc ggc 300 Thr Ala Th'r Tyr Tyr Cys Val Ser Glytat get ttg gac tac tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tec tea ggt gga ggc ggt 360
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tea ggc gga ggt ggc tct ggc ggt gga ggt teg ggt gga ggc ggt teg gac a.tt gtg atg 420
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Thr (;ln Ser l:)e() Ala. Ser Leu A:l.a. Va.Ser Leu (;:l.y Gin Arg Ala. Th:r :[le Se:r Cys Arg 145 150 155 160
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Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gl.y Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gin Gin Lys Pro 165 170 175 180
gga cag cca ccc aga etc etc ate tat ctt gta. tec aac eta gaa tct ggg gtc cct gec 600
Gly Gin Pro Pro Arg Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 185 190 195 200
agg tt.c agt ggc a.gt ggg u't ggg a('.a gac ttc acc etc aac ate cat cct gtg ga名gag 660
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn lie His Pro Val Glu Glu 205 210 215 220
gag gat, get gca acc tat ta.(: tgt: (:ag (:ac a", agg gag ctt: aca cgt teg gag ggg gga 720
Glu As!) Ala Ala Thr Tyr Tyr Cy's Gin His lie Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly
225 230 235 240 cca age 't.gg a.aa Pro Ser Trp Lys <210> 3 <211〉 351 <212〉 DNA
<213〉大腸桿菌種(^sc力e/7'c/w'a coh'J
<220〉
732
<40()> 3
atgUgcagc tgca卿gtc tggtggagga Uggtgcagc ctaaagggtc
tcatgtgcag cct.ctggatt c.accctcat]t acctac.gcca tgaactgggt
cc鄧gafmgg gttt.gg肌tg gattactcgc ataag肌gta腦igtaatafi
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ctcta.tctcc eiaatga,ccaa cttgaaaact, g鄧ga,caca.g ccacgtatta ggctatgctt tggactactg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc a <210〉 4
〈211 〉 325
<212、跳
<213>大腸桿菌種(r&r力er/c力is co7/J
<220>
〈■400/ 4
ggacattgtg atgacccagt ct，ccagcttc cttagctgta tctctggggc catctcatgc agggccagca aaagtgtcag tacatc.tggc tatagttata ccaacagaaa ccaggacagc cacccagact cctcatctat cttgtatcca tggggtccct gcc鄉t，tca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcaccc tcctgtggag gaggaggatg ctgcaaccta ttactgtcag caca.ttaggg
ccgccaggct :120
ttttgcaaca 180
acaaaacatg 240
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aga,gggccac 60 tgcactggaa 120 accteigtiatc 180 tcaacatcca 240 agcttac(icg 300
ttcggagggg ggaccaagct ggaaatga 32權利要求
1、一種抗人端粒酶逆轉錄酶單鏈抗體基因，該單鏈抗體基因是由738個核苷酸組成，其序列為SEQ.ID.No.1。
2、 一種抗人端粒酶逆轉錄酶單鏈抗體蛋白，由244個氨基酸組成，其序列為 SEQ. ID. No. 2。
3、 一種如權利要求1所述的單鏈抗體作為治療端粒酶逆轉錄酶陽性腫瘤的藥物制劑 的應用。
4、 一種如權利要求1所述的抗人端粒酶逆轉錄酶單鏈抗體基因的制備方法，其特征 在于具體步驟如下(1) 從穩定分泌人端粒酶逆轉錄酶單克隆抗體的雜交瘤細胞中提取、純化mRNA，體外 反轉錄cDNA;(2) 克隆輕鏈可變區基因，連入pGEM-T載體，進行序列分析，經同源對比分析，證實 該基因片段為抗體輕鏈可變區基因，序列為SEQ. ID.N03;(3) 克隆重鏈可變區基因，連入pGEM-T載體，進行序列分析，經同源對比分析，證實 該基因片段為抗體重鏈可變區基因，序列為SEQ. ID. N04;(4) 連接抗體輕鏈，重鏈基因，以編碼(Gly4Ser) 4的連接DNA序列，連接抗體輕、 重鏈可變區，構建抗hTERT-scFv基因，序列為SEQ. ID. N01 。
全文摘要
本發明屬基因工程抗體技術領域，具體涉及一種功能性表達純化的新的多肽——抗端粒酶逆轉錄酶單鏈抗體(ScFv)，以及此多肽基因作為腫瘤基因治療制劑的應用。該基因工程抗體是由一條連接肽將天然抗體輕鏈和重鏈可變區首尾相接的單一肽鏈，通過正確折疊，兩個可變區由非共價鍵形成具有抗原結合功能的片段，具有親本抗體結合抗原的特性和功能，該抗體可以與腫瘤細胞里廣泛而特異性表達的人端粒酶逆轉錄酶結合并使其失去原有活性，從而影響腫瘤細胞活力，以及細胞周期的分布，并明顯地誘導了腫瘤細胞的程序性死亡。且該ScFv分子量小，僅為完整抗體分子的1/6，易穿入固體組織及腫瘤內部，是具有應用價值的腫瘤基因治療制劑。
文檔編號C07K16/40GK101104854SQ200710038640
公開日2008年1月16日 申請日期2007年3月29日 優先權日2007年3月29日
發明者任大明, 朱向瑩, 陳麗珊 申請人:復旦大學