專利名稱：鏈親和素-腫瘤壞死因子α融合蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程和蛋白質工程領域，具體涉及腫瘤壞死因子a的重組蛋白。
技術背景腫瘤壞死因子a (TNFa)由細菌脂多糖等活化的單核一巨噬細胞產生，可引起腫瘤組 織出血壞死，具有如下功能能直接殺滅腫瘤細胞而不損傷正常細胞；能增強巨噬細胞的活 性和殺傷功能，增強巨噬細胞促進免疫應答的能力，發揮抗感染作用；能促進炎癥局部的中 性粒細胞的活性和聚集；能促進T淋巴細胞產生干擾素、IL-6等，增強機體抗病能力；能與 IL-1、 IL-2、干擾素等協同增強免疫力。但是，腫瘤壞死因子a血中濃度過高時，可引起休 克、高熱及肺、心臟和腎上腺損害，從而大大地限制了它的臨床應用。 發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種可以對腫瘤細胞進行快速表面修飾并能夠永久地錨 定在腫瘤細胞表面的新型腫瘤壞死因子a 。 本發明解決上述技術問題的技術方案是-一種融合蛋白，該蛋白主要由鏈親和素、接頭肽和腫瘤壞死因子a連接構成，其中鏈親 和素連接在接頭肽的N端，腫瘤壞死因子a連接在接頭肽的C端;所述的接頭肽為Ser Ser GIy Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。本發明融合蛋白可通過將鏈親和素基因、腫瘤壞死因子a基因以及連接所述的鏈親和素 和腫瘤壞死因子a的接頭多核苷酸通過基因重組、轉化構建工程菌表達獲得，其中基因重組 和轉化的方法均為本領域普通技術人員所熟識的技術。為了便于融合蛋白的分離純化，本發明所述的融合蛋白的鏈親和素部分的末端還可以連 接有純化標簽，如組氨酸標簽等。本發明所述的融合蛋白，其氨基酸序列可以是SEQNO.l或SEQN0.2。本發明還提供一種編碼本發明融合蛋白的融合基因，該融合基因由成熟鏈親和素cDNA、 腫瘤壞死因子a cDNA通過TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGG GGC GGATCC連接而成；該多核苷酸的成熟鏈親和素cDNA的末端還可以連接有CAT CAT CACCATCAC CAT。將所述的編碼本發明融合蛋白的融合基因通過基因重組插入到原核表達載體中，然后轉 化大腸桿菌可獲得能表達本發明融合蛋白的工程菌。本發明還提供一種高效表達本發明融合蛋白的工程菌，該工程菌是轉化了本發明融合基
因的pET24重組質粒的大腸桿菌BL21 (DE3)，其制備方法是將本發明融合基因克隆于帶有 T7啟動子的表達載體pET24中，構建成含有本發明融合基因的表達質粒，轉化大腸桿菌 BL21(DE3)后實現了高效表達，本發明融合蛋白在菌體中以包涵體的形式存在，表達量高達 30 40%;從包涵體中分離純化蛋白并復性處理后，即可獲得本發明融合蛋白。本發明融合蛋白同時具有鏈親和素和腫瘤壞死因子a的活性，可通過鏈親和素與生物素 的強力結合將腫瘤壞死因子a錨定在生物素化的腫瘤細胞表面，且能在Y射線滅活腫瘤細胞表 面穩定存在，并仍保持腫瘤壞死因子a的活性；但如果將本發明融合蛋白中的鏈親和素連接 在接頭肽的C端，則所得的融合蛋白沒有腫瘤壞死因子a的活性。經本發明融合蛋白表面修飾的腫瘤疫苗具有預防和治療腫瘤的作用，可用于制備預防和 治療腫瘤的疫苗。本發明所述的腫瘤疫苗是將本發明融合蛋白錨定在生物素化的腫瘤細胞表 面獲得的。本發明所述的腫瘤疫苗的制備充分利用了蛋白質的氨基(即-NH2)易生物素化以及生物 素與鏈親和素高效而強有力幾乎不可逆的結合這兩個特性，先用生物素化試劑將生物素化學 交聯到欲修飾的腫瘤細胞表面，然后本發明融合蛋白借助鏈親和素與生物素的特異結合將腫 瘤壞死因子a迅速永久地錨定在腫瘤細胞表面，從而使腫瘤壞死因子a在局部達到持續有效 的治療濃度，以至不會引起全身的毒副反應。此外，由于一個鏈親和素蛋白可結合四個生物 素，因此本發明融合蛋白錨定到腫瘤細胞的量是可以精確控制的。
圖1是6His-SA-L-TNF a -pET24重組質粒的結構圖。圖2是6His-SA-L-TNF a的SDS-PAGE電泳圖，其中1是蛋白質分子量標準，2是未誘 導全菌，3是誘導后全菌，4是包涵體，5和6是純化的融合蛋白。圖3是用抗TNFa單克隆抗體及熒光標記的二抗經流式細胞儀對錨定在生物素化的 816^0表面上本發明融合蛋白進行檢測的結果，左峰為未修飾的細胞(陰性對照)，而右峰 為錨定修飾的細胞。圖4是接種本發明腫瘤疫苗后的預防腫瘤小鼠模型的腫瘤生長情況曲線圖，以GFP-L-SA 修飾的B6.F10腫瘤細胞疫苗為實驗對照，其中實線表示本發明融合蛋白組，虛線表示 GFP-L-SA對照組。圖5是接種本發明腫瘤疫苗后的預防腫瘤小鼠模型的小鼠存活情況曲線圖，以GFP-L-SA 修飾的B6.F10腫瘤細胞疫苗為實驗對照，其中實線表示本發明融合蛋白組，虛線表示 GFP-L-SA對照組。圖6是接種本發明腫瘤疫苗后的治療腫瘤小鼠模型的小鼠存活情況曲線圖，以GFP-L-SA
修飾的B6.F10腫瘤細胞疫苗為實驗對照，其中實線表示本發明融合蛋白組，虛線表示 GFP-L-SA對照組。下面將通過實施例進一步說明本發明以及本發明具有的技術效果。
具體實施方式
下述實施例和實驗所用的材料及方法如下細胞株、菌株與質粒L929細胞株和816. 10(鼠黑色素瘤細胞株)；菌株Sfr印/owj;ces ovWm'!'(親和素鏈霉菌，ATCC), DH5a和BL21 (DE3);原核表達質粒pET24a (Kanar， Novagen)。主要生化試劑及材料DNeasy組織試劑盒和質粒DNA的制備試劑盒(Qiagen)，寡核苷 酸的合成(Sigma), Trizol, Superscript II逆轉錄酶，Platinum尸々DNA聚合酶和T4 DNA連接 酶(Invitrogen); TNF-標準品(R&D Systems),瓊脂糖和SDS-PAGE (Biorad); 2-Iminobiotin (Sigma)和Ni-NTA (Qiagen)填料；Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce)和抗TNFcc-單克隆抗體 (BD Biosciences Pharmingen)。DNA片段的連接、轉化及轉化子篩選，限制性內切酶分析，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳等 常夫見方法均參照文獻(Sambrook J， et al. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2nd edition, 1989)或廠家提供的產品說明書；DNA序列分 析在UTSW at Dallas的DNA測序服務中心完成。例1本發明融合蛋白6His-SA-L-TNF a的制備1、 用DNeasy組織試劑盒從親和素鏈霉菌抽提出細菌的基因組DNA,然后用其作為模板， 通過Platinum/ /5c DNA聚合酶進行PCR制備成熟鏈親和素cDNA 。引物5 ， GGAATTCCATATGCATCATCACCATCACCATGAGGCCGGCATCACCGGC ACCTGG 3， (55nt)和5'GGAATTCGGCGGATCCGCCCCCGCCGCTGCCTCCGCCCCCG CTGCCCCCGCTCGTCTGCTGAACGGCGTCGAGCGGGTTGCC 3， (82nt)。反應條件變性94。C， 2min，循環(94°C， 15s—60°C， 15s—68°C， 30s) 25輪，最后 68°C， 5min。2、 用Trizol抽提起PHA-活化的外周血單個核細,的總RNA，并以其作為模板，進行 RT-PCR制備成熟TNF a cDNA。引物5，GGAATTCATGGTTCGTTCTTCTTCTCGTACTCC3， (33 nt)和5， CCCAAGCTTTCA CAGAGCGATAATACCGAAGTATAC (36 nt)。反應條件變性94。C， 2min，循環(94°C， 15s—60。C， 15s—68°C， 30s) 25輪，最后 68。C， 5min。3、 構建6His-SA-L-TNF a -PET24重組質粒
制備的SA cDNA (不含終止碼，兩端分別含Ndel和EcoRI限制性內切酶位點)和TNF a cDNA (兩端分別含EcoRI和HindIII限制性內切酶位點)，將上述SA和TNFa基因片段克 隆于pET-24a載體中，獲得6His-SA-L- TNF a pET24重組表達質粒(結構圖如圖1所示)。 其中L為富含甘氨酸、絲氨酸的連接肽。重組表達質粒經DNA序列分析鑒定，驗證其正確無 誤。4、構建6His-SA-L-TNF a -pET24/ BL21工程菌6His-SA-L-TNFa-pET24重組表達質粒轉化BL21 (DE3)感受態細胞后，用含卡那霉素 的LB平皿篩選。挑取轉化平皿上的單菌落接種于加有卡那霉素(20ng/ml)的LB培養基中。 經37。C搖床培養擴增至吸光度A600為0. 4 0. 5時，加入終濃度為0. lmraol/L的IPTG， 37 'C誘導表達4h,離心(8000gX 10min)收獲菌體，將細胞破碎后用12%的SDS-PAGE檢測分析融 合蛋白的表達情況。5、 融合蛋白6His-SA-L-TNFa的表達融合蛋白6His-SA-L-TNF a在菌體中主要以包涵體的形式存在，其表達量達30~40%。6、 從包涵體中獲得融合蛋白6His-SA-L-TNFaa. 制備包涵體5克菌體懸于100ml lxPBS中，冰浴中超聲(電流270mA)， 30秒X10 次(每次間隔30秒);接著于4'C離心10分鐘(8000g)，將沉淀懸浮于100ml lxPBS (內含4mol/L 尿素，0.5%Triton X-IOO， 20mmol/L EDTA)中進行漂洗，隨后離心(1000gX10分鐘)收集沉 淀；漂洗兩次后，溶于100mmol/L磷酸鈉緩沖液，8mol/L尿素(pH 8.0)中，15000gX 15分鐘，取上清液。b. Ni-NTA柱層析將步驟a得到的上清液上樣于Ni-NTA柱(2.6X5cm)，用平衡液 (100mmol/L磷酸鈉緩沖液，8mol/L尿氣pH8.0)進行沖洗至樣品八28()恢復至基線；然后用洗 脫液(100mmol/L磷酸鈉緩沖液，8mol/L尿素，pH4.5)進行洗脫，洗脫液經SDS-PAGE鑒定， 收集融合蛋白質峰(融合蛋白6His-SA-L-TNFci的分子量為36KD)。c. 透析復性將Ni-NTA柱層析純化獲得的6His-SA-L-TNFa融合蛋白調至OD28o-0.2, 在大于20倍體積的透析液(100mmol/L NaHC03， 1.0mol/L尿素，lmmol/L還原型谷胱苷肽, 0.2mmol/L氧化型谷胱苷肽，pH 9.0)中4'C透析復性12小時；然后在50mmol/L NaHC03， 500mmol/LNaCl， pH 11中繼續透析6小時；離心除去不溶物，收集上清。(1.2-Iminobiotin親和柱層析用平衡液(50mmol/LNaHCO3， 500mmol/LNaCl， pH 11)洗 脫5個柱體積后(柱體積0.5X2cm)，將收集的己復性融合蛋白質液上親和層析柱，并用平衡 液洗脫至樣品A28o恢復至基線；然后，用50mmol/LNaAc，pH4.0洗脫，分管收集各洗脫峰， 并用IOX平衡液(500mmol/L NaHC03， 5mol/L NaCl， pH 11)將收集的融合蛋白質液調至
pH8.0，并過濾除菌分裝，儲存于一20'C。
所得融合蛋白6His-SA-L-TNF a用SDS-PAGE鑒定，結果如圖2所示。
7、利用L929細胞殺傷法對TNFa的活性進行測定，測得的TNFa活性為
ED5o=0,l~0.5ng/ml。
例2 6His-SA-L-TNF a修飾的腫瘤疫苗的制備
將107個B16.F10細胞懸浮在lml 1 XPBS中，加入0.5mg Sulfo-NHS-LC-Biotin并混勻 后，室溫下作用30分鐘；用1XPBS洗滌細胞3次后，每106個B16.F10細胞加入200ng 6His-SA-L-TNFa融合蛋白，冰上作用30分鐘；1 XPBS洗滌細胞1次后，然后用y射線滅活 (20000rad)，即可。
例3本發明融合蛋白對腫瘤細胞的修飾效果及其穩定性檢測
用抗TNF a單克隆抗體及熒光標記的二抗經流式細胞儀對錨定在生物素化的B16.F10表 面上的6His-SA-L-TNFa融合蛋白進行檢測，結果見圖3，幾乎100%的腫瘤細胞被修飾，且 腫瘤細胞表面有大量的TNFa 。對錨定在腫瘤細胞表面的6His-SA-L-TNFa融合蛋白的穩定 性經流式細胞儀進行分析表明，在一周內這些錨定的融合蛋白在細胞表面的數量無顯著下降。
例4對錨定在生物素化的B16.F10表面上的本發明融合蛋白進行TNFa生物活性的測定
首先將表面己錨定了 6His-SA-L-TNFa融合蛋白的106個B16.F10經超聲破碎，離心收集 其不溶的膜性成分；然后將其懸浮于100^1完全培養基中，用L929細胞殺傷法對其中的TNF a進行生物活性測定，結果顯示殺傷活性依賴于己錨定修飾細胞的不溶膜性成分的劑量，表 明6His-SA-L-TNF a融合蛋白錨定在細胞表面后仍然能保持TNF a的生物活性。
例5本發明融合蛋白修飾的B6.F10腫瘤細胞疫苗預防腫瘤的效果
(1) 材料
本發明腫瘤疫苗制備方法見實施例2; GFP-L-SA-6His (即綠色熒光蛋白和鏈親和素的 融合蛋白)修飾的、y射線滅活(20000rad)的B6.F10腫瘤細胞作為實驗的陰性對照。
(2) 方法
分別將106個GFP-L-SA-6His修飾的、y射線滅活(20000rad)的B6.F10腫瘤細胞以及 本發明腫瘤疫苗接種于C57BL/6小鼠左肋腹部的皮內，14天后加強一次；7天后，將105未 經任何處理的B6.F10腫瘤細胞接種于小鼠右肋腹部的皮下，然后觀察腫瘤的生長情況和小鼠 在40天內的成活情況
(3) 結果
有40%的免疫小鼠獲得100%的保護(即無腫瘤生長)，陰性對照組全部有腫瘤生長(圖 4)。同時，本發明腫瘤疫苗的預防接種組的生存數及生存期顯著高于GFP修飾的陰性對照組
(圖5)。
例6本發明融合蛋白修飾的B6.F10腫瘤細胞疫苗治療腫瘤的效果。
(1) 材料
本發明腫瘤疫苗制備方法見實施例2; GFP-L-SA-6His (即綠色熒光蛋白和鏈親和素的 融合蛋白)修飾的、Y射線滅活(20000rad)的B6.F10腫瘤細胞作為實驗的陰性對照。
(2) 方法
將105個未經任何處理的86110腫瘤細胞接種于小鼠右肋腹部的皮下；4， 11和18天后， 分別將106個6His-SA-L-TNFa修飾的、Y射線滅活(20000rad)的B6.F10腫瘤細胞接種于 C57BL/6小鼠左肋腹部的皮內，然后觀察腫瘤的生長情況和小鼠在40天內的成活情況。
(3) 結果
如圖6所示，本發明腫瘤疫苗治療組的生存數及生存期顯著高于GFP修飾的陰性對照組。SEQUENCE LISTING
<110>南方醫科大學
<120>鏈親和素-腫瘤壞死因子a融合蛋白
<160〉 2
<170〉 Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 329
<212> PRT <213>人工序列
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (2)..(7) <223>組氨酸標簽
<220>
<221> CHAIN
<222> (8)..(153)
<223>鏈親和素核心部分，與成熟的全長抗生物素相比，在N-端缺失了 13個氨基酸。 <220>
<221> DOMAIN
<222> (154)..(171)
<223>接頭汰并且其3'端含有BamHI和EcoRI的酶切位點。 <220>
<221> CHAIN
<222> (172)..(329) <223>人成熟TNFa。
<400> 1
Met His His His His His His Glu Ala Gly He Thr Gly Thr Trp Tyr 15 10 15
Asn Gin Leu Gly Ser Thr Phe lie Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala 20 25 30Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr 35 40 45
Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly 50 55 60
Thr Ala Leu Gly T卬Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala 65 70 75 80
His Ser Ala Thr Thr T卬Ser Gly Gin Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala 85 90 95
Arg lie Asn Thr Gin T卬Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn 100 105 110
Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys 115 120 125
Pro Ser Ala Ala Ser lie Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn 130 135 140
Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gin Gin Ser Ser Gly Gly er Gly Gly 145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Phe Met Val Arg Ser Ser 165 170 175
Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro 180 185 190
Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu 195 200 205
Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser 210 215 220
Glu Gly Leu Tyr Leu lie Tyr Ser Gin Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly 225 230 235 240
Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr He Ser Arg He Ala 245 250 255
Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala He Lys Ser Pro 260 265 270
Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu 275 280 285
Pro He Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 290 295 300
Ser Ala Glu He Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly 305 310 315 320
Gin Val Tyr Phe Gly He He Ala Leu 325
<210> 2
<211> 323
<212> PRT <213>人工序列
<220>
〈221〉 CHAIN
<222> (1)..(147)
<223>鏈親和素核心部分，與成熟的全長抗生物素相比，在N-端缺失了 13個氨基酸。 <220>
<221> DOMAIN
<222> (148)..(165)
<223>鏈接肽，并且其3'端含有BamHI和EcoRI的酶切位點
<220>
<221〉 CHAIN
<222> (166)..(323) <223>人成熟TNFa。
<400> 2
Met Glu Ala GJy lie Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gin Leu Gly Ser Thr 15 10 15
Phe lie Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu 20 25 30
Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr 35 40 45
Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly T卬Thr 50 55 60
Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80
Ser Gly Gin Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg lie Asn Thr Gin Trp 85 90 95
Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala T卬Lys Ser Thr Leu 100 105 110
Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser He 115 120 125
130
135
140
Val Gin Gin Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160Gly Ser Ala Glu Phe Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp 165 170 175Lys Pro Val Ala His Val VaAla Asn Pro Gin Aa Gu Gly Gin Leu 180 185 190Gin T卬Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu 195 200 205Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu lie 210 215 220Tyr Ser Gin Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val 225 230 235 240Leu Leu Thr His Thr lie Ser Arg He Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys 245 250 255Val Asn Leu Leu Ser Ala He Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro 260 265 270Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro lie Tyr Leu Gly Gly 275 280 285Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu lie Asn Arg 290 295 300Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly lie 305 310 315 320lie Ala Leu
權利要求
1、一種融合蛋白，該蛋白主要由鏈親和素、接頭肽和腫瘤壞死因子α連接構成，其中鏈親和素連接在接頭肽的N端，腫瘤壞死因子α連接在接頭肽的C端；所述的接頭肽為Ser SerGly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。
2、 根據權利要求1所述的融合蛋白的鏈親和素部分的末端還連接有純化標簽。
3、 一種融合基因，該融合基因編碼權利要求1或2所述的融合蛋白。
4、 一種表達載體，該載體含有權利要求3所述的融合基因。
5、 一種工程菌，該工程菌轉化了權利要求4所述的表達載體。
6、 根據權利要求5所述的工程菌，其特征在于該工程菌是轉化了本發明融合基因的 pET24a重組質粒的大腸桿菌BL21 。
7、 權利要求1所述的融合蛋白在制備腫瘤疫苗中的應用。
8、 如權利要求7所述的應用，其中所述的腫瘤疫苗是將權利要求1或2所述的融合蛋白 錨定到經過生物素化的腫瘤細胞的表面獲得的。
全文摘要
本發明提供一種融合蛋白，該蛋白主要由鏈親和素、接頭肽和腫瘤壞死因子α連接構成，其中鏈親和素連接在接頭肽的N端，腫瘤壞死因子α連接在接頭肽的C端；所述的接頭肽為SerSerGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。該融合蛋白同時具有鏈親和素和腫瘤壞死因子α的活性，可通過鏈親和素與生物素的強力結合將腫瘤壞死因子α錨定在生物素化的腫瘤細胞表面，且能在γ射線滅活腫瘤細胞表面穩定存在，并仍保持腫瘤壞死因子α的活性。經本發明融合蛋白表面修飾的腫瘤疫苗具有預防和治療腫瘤的作用，可用于制備預防和治療腫瘤的疫苗。
文檔編號C07K19/00GK101148478SQ200710030120
公開日2008年3月26日 申請日期2007年9月6日 優先權日2007年9月6日
發明者周明乾, 林來新妹, 胡志明, 高基民 申請人:南方醫科大學