水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11及其應(yīng)用的制作方法

專利名稱：水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11及其應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在真核生物細胞內(nèi)囊泡運輸過程中的膜融合主要是由SNARE蛋白介導(dǎo)的，SNARE蛋白的結(jié)構(gòu)高度保守。McNew等(2000McNew JA，Parlati F，F(xiàn)ukuda R，Johnston RJ，Paz K，Paumet F，SollnerTH，Rothman JE(2000)Compartmental specificity of cellular membrane fusion encoded in SNARE proteins.Nature，407(6801)153-159)對人類、果蠅、酵母和擬南芥的全基因組序列進行SNARE蛋白基因的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)它們所含SNARE蛋白家族成員的數(shù)目分別為35、20、21和68，擬南芥中SNARE蛋白數(shù)目明顯高于其他物種，且組成復(fù)雜。目前許多真核生物全基因組測序已經(jīng)完成，這為弄清SNARE蛋白家族在不同真核生物基因組范圍內(nèi)的分布和推測其功能提供了大量的信息，也有利于發(fā)現(xiàn)更多新的SNARE蛋白。
研究發(fā)現(xiàn)，植物中的SNARE蛋白促進植物細胞板形成，能與離子通道蛋白相互作用，有利于植物的正常生長發(fā)育，能提高植物的抗病性及參與植物的向重力性作用。植物SNARE蛋白不僅對植物生長發(fā)育起作用，在抵御生物與非生物脅迫過程中也起重要的作用(Pratelli et al.，2004 Pratelli R，Sutter JU，Blatt MR(2004)A new catch in the SNARE.Trends Plant Sci9(4)187-195)。Collins等(2003 Collins NC，Thordahl-Christensen H，Lipka V，Bau S，Kombrink E，Qiu J，Hückelhoven R，Stein M，F(xiàn)reialdenhoven A，Somerville SC，Schulze-Lefert P(2003)SNARE-protein-mediated diseaseresistance at the plant cell wall.Nature 425973-977)在研究與大麥非寄主抗性相關(guān)基因HvSyp121時，發(fā)現(xiàn)其突變體葉片被侵染部位聚集大量載著H2O2的囊泡，推測突變體細胞中囊泡未能與質(zhì)膜融合，H2O2介導(dǎo)的抗病信號傳導(dǎo)途徑受阻，使得病原菌分泌的有毒物質(zhì)進入植物體內(nèi)致病(Dangl et al.，2001 Dangl JL，Jones JD(2001)Plant pathogens and integrated defence responses to infection.Nature 411826-833；Tsanko et al.，2005 Tsanko SG，Jacques H(2005)Hydrogen peroxide as a signal controlling plantprogrammed cell death.J Cell Biol 168(1)17-20)。表明植物中SNARE蛋白與植物的基本抗病性即非寄主抗性相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于公開水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11及其應(yīng)用，該基因來自水稻，可作為目的基因?qū)胫参铮岣咧参锟共⌒裕M行植物品種改良。
技術(shù)方案水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的應(yīng)用，包括1)總RNA的提取選 用水稻抗稻瘟病菌品種“黑殼子粳”(太湖流域粳稻地方品種)，待水稻幼苗長至3-4葉期，用稻瘟病菌孢子(5×104ml-1)接種處理，24小時后立即取葉片液氮冷凍，保存于-80℃冰箱。取部分葉片，用研缽研碎，轉(zhuǎn)移入盛有Trizol裂解液的1.5mLEP管，充分振蕩后，抽提總RNA，電泳鑒定總RNA質(zhì)量；2)水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的克隆以 擬南芥基因AtNPSN11(Zheng et al.，2002 Zheng H，Bednarek SY，Sanderfoot AA，Alonso J，Ecker JR，Raikhel NV(2002)NPSN11 is a cell plate-associatedSNARE protein that interacts with the syntaxin KNOLLE.Plant Physiol 129530-539)序列為探針，搜索水稻基因組序列和EST序列數(shù)據(jù)庫，拼接得到880bp水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的全長序列，并設(shè)計兩端引物P15-TGCTTTTGGTTGTTGTGATCC-3，P25-CTGCTCTTGGTTGATTTGTTC-3。
將步驟1)獲得的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以此為模板用高保真Pfu酶進行PCR擴增，PCR程序如下94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性45s，56℃復(fù)性1min，72℃延伸1.5min，35個循環(huán)后，72℃延伸5min，最后Tag酶72℃保溫10min末端加A后克隆至pGEM-T載體，委托上海生工公司測序獲得水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的cDNA序列SEQ ID NO.1；3)植物表達載體的構(gòu)建 根據(jù)水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的cDNA序列(見SEQ ID NO.1)，在起始密碼子ATG附近設(shè)計引物P3并引入限制性內(nèi)切酶位點XbaI，引物序列為P35-ATTCTAGATGGATTTGGAGTCGGTCA-3，以步驟2)中獲得的PCR擴增產(chǎn)物為模板，用P3和P2引物經(jīng)PCR擴增后，將OsNPSN11的cDNA克隆至中間載體pGEM-T，利用引物P3引入的XbaI酶切位點和pGEM-T載體上的SalI酶切位點進一步克隆至雙元表達載體pCAMBIA1301，測序鑒定確保表達載體中編碼區(qū)閱讀框架正確；4)轉(zhuǎn)基因植株的獲得 將步驟3)獲得的表達載體pCAMBIA1301轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，進一步轉(zhuǎn)入水稻感稻瘟病菌品種“蘇御糯”，對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行PCR，Southern雜交以及RT-PCR驗證后進行水稻的抗病性評價，將生長至3-4葉期的轉(zhuǎn)基因T1代植株進行稻瘟病菌孢子接種處理，7天后調(diào)查植株的病級數(shù)以及發(fā)病葉片病斑數(shù)目和病斑長度，與對照相比具有明顯抗性的轉(zhuǎn)基因水稻植株即為獲得的抗稻瘟病菌轉(zhuǎn)基因植株。
有益效果1、本發(fā)明公開了水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11及其所編碼的蛋白質(zhì)。水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11為水稻中首次報道，mRNA表達分析表明該基因受稻瘟病菌接種誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炞C明該基因的過量表達提高了水稻對稻瘟病菌的抗性。因此有望可作為目的基因?qū)胫参?，提高植物抗病性，以進行植物品種改良。
2、本發(fā)明的OsNPSN11基因來自水稻，具有適合于水稻等單子葉植物表達的優(yōu)化密碼子，其基因工程受體植物除了雙子葉植物，如大豆、棉花、煙草等之外更加適合于水稻、玉米、小麥等單子葉植物。
3、對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行PCR，Southern雜交以及RT-PCR驗證后進行水稻的抗病性評價。將生長至3-4葉期的轉(zhuǎn)基因T1代植株進行稻瘟病菌孢子接種處理，7天后調(diào)查植株的平均病級數(shù)為2.5級，發(fā)病葉片平均病斑數(shù)目為4.25個及病斑平均長度為0.58mm，而對照植株的平均病級數(shù)為7級以及發(fā)病葉片平均病斑數(shù)目為44個及病斑平均長度為5.00mm，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株與對照相比表現(xiàn)出對稻瘟病菌的明顯抗性。
4、利用本發(fā)明OsNPSN11基因作為目的基因構(gòu)建植物表達載體，其中可用任何一種啟動子例如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、Ubiquitin啟動子或其它啟動子，該表達載體中必要時可包括增強子，不論是轉(zhuǎn)錄增強子或翻譯增強子。為了簡化轉(zhuǎn)化細胞的鑒定可使用選擇性標(biāo)記包括具有抗生素抗性的酶，也可利用顏色變化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或發(fā)光(例如熒光素酶)來識別的化合物的酶類，也可用無標(biāo)記選擇。所用的表達載體可使用Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒，植物病毒載體等。轉(zhuǎn)化方法可用經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法或其它方法轉(zhuǎn)化植物。
具體實施例方式
實施例1選用水稻品種“黑殼子粳”(為太湖流域粳稻地方品種，為抗稻瘟病菌品種)，待水稻幼苗長至3-4葉期后，用稻瘟病菌孢子進行接種處理，24小時后立即取葉片液氮冷凍，保存于-80℃冰箱。取部分葉片，用研缽研碎，轉(zhuǎn)移入盛有Trizol裂解液的1.5mLEP管(TRIzol Reagents，購自Invitrogen，USA)，充分振蕩后，抽提總RNA，電泳鑒定總RNA質(zhì)量。
以擬南芥基因AtNPSN11(Zheng et al.，2002 Zheng H，Bednarek SY，Sanderfoot AA，Alonso J，EckerJR，Raikhel NV(2002)NPSN11 is a cell plate-associated SNARE protein that interacts with the syntaxin KNOLLE.PlantPhysiol 129530-539)序列為探針，搜索水稻基因組序列和EST序列數(shù)據(jù)庫，拼接得到880bp水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的全長序列，并設(shè)計兩端引物(P15-TGCTTTTGGTTGTFGTGATCC-3，P25-CTGCTCTTGGTTGATTTGTTC-3。)以總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板用高保真Pfu酶(購自Roche)進行PCR擴增，PCR程序如下94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性45s，56℃復(fù)性1min，72℃延伸1.5min，35個循環(huán)后，72℃延伸5min，最后Tag酶(購自鼎國公司，北京)72℃保溫10min末端加A后克隆至pGEM-T載體(購自Promega)，委托上海生工公司測序獲得水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的cDNA序列。
分析上述獲得的水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的cDNA序列SEQ ID NO.1及其編碼蛋白SEQ ID NO.2，該基因編碼的蛋白序列與擬南芥AtNPSN11蛋白序列的一致性為69％，在C端都存在保守結(jié)構(gòu)域Qb-SNARE結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域。
實施例2用實例1中設(shè)計的引物P1、P2進行半定量RT-PCR分析接種處理后水稻3-4葉期地上部幼苗的表達，結(jié)果表明，接種稻瘟病菌孢子2小時后OsNPSN11的表達增強，經(jīng)灰度掃描分析，其mRNA表達量為對照的8倍，接種處理24h后表達有所減弱，表明OsNPSN11基因的表達與稻瘟病菌處理有關(guān)。
實驗例3根據(jù)根據(jù)實施例1得到的OsNPSN11的全長序列(見SEQ ID NO.1)，在起始密碼子ATG附近設(shè)計引物P3并引入限制性內(nèi)切酶位點XbaI(P35-ATTCTAGATGGATTTGGAGTCGGTCA-3)，以實施例1中獲得的擴增產(chǎn)物為模板，用P3和P2引物經(jīng)PCR擴增后，將OsNPSN11的cDNA克隆至中間載體pGEM-T，利用引物P3引入的XbaI酶切位點和pGEM-T載體上的SalI酶切位點進一步克隆至雙元表達載體pCAMBIA1301，測序鑒定確保表達載體中編碼區(qū)閱讀框架正確，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，進一步轉(zhuǎn)入水稻感稻瘟病菌品種“蘇御糯”(太湖流域粳稻地方品種)，對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行PCR，Southern雜交以及RT-PCR驗證后進行水稻的抗病性評價。將生長至3-4葉期的轉(zhuǎn)基因T1代植株進行稻瘟病菌孢子接種處理，7天后調(diào)查植株的平均病級數(shù)為2.5級，發(fā)病葉片平均病斑數(shù)目為4.25個及病斑平均長度為0.58mm，而對照植株的平均病級數(shù)為7級以及發(fā)病葉片平均病斑數(shù)目為44個及病斑平均長度為5.00mm，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株與對照相比表現(xiàn)出對稻瘟病菌的明顯抗性。
綜上所述，本發(fā)明人提供的OsOSNPSN11基因是首次在水稻中分離的新基因，為水稻中首次報道，其功能與水稻抗病性相關(guān)，可作為目的基因?qū)胫参?，提高植物抗病性，以進行植物品種改良?？衫帽景l(fā)明OsNPSN11基因作為目的基因構(gòu)建植物表達載體，其中可用任何一種啟動子例如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、Ubiquitin啟動子或其它啟動子，該表達載體中必要時可包括增強子，不論是轉(zhuǎn)錄增強子或翻譯增強子。為了簡化轉(zhuǎn)化細胞的鑒定可使用選擇性標(biāo)記包括對抗生素抗性的酶，也可利用顏色變化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或發(fā)光(例如熒光素酶)來識別的化合物的酶類，也可用無標(biāo)記選擇。所用的表達載體可使用Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒，植物病毒載體等。轉(zhuǎn)化方法可用經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法或其它方法轉(zhuǎn)化植物。
本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度880bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型核苷酸
(iii)序列描述SEQ ID NO.1(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度261aa(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)序列描述SEQ ID NO.2
序列表<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11及其應(yīng)用<130>說明書<140>00<141>2007-03-10<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>SEQ ID NO.1<211>880<212>DNA<213>Oryza sativa(水稻)<221>5’UTR<222>(1)..(60)<221>CDS<222>(61)..(843)<221>3’UTR<222>(847)..(880)<400>1tgcttttggt tgttgtgatc cctgtggggc tcgggttccg gccggtgtag gggaggggag60atg gat ttg gag tcg gtc aac ccg gag ctc gcc gag atc gac ggc cag 108Met Asp Leu Glu Ser Val Asn Pro Glu Leu Ala Glu Ile Asp Gly Gln1 5 10 15atc ggc gac atc ctc cgc gca ttg caa aat ggg ttc cag aag ctg gat 156Ile Gly Asp Ile Leu Arg Ala Leu Gln Asn Gly Phe Gln Lys Leu Asp20 25 30aag atc aag gat gcc aat cga cgg agc agg caa ctc gaa gag ctc act 204Lys Ile Lys Asp Ala Asn Arg Arg Ser Arg Gln Leu Glu Glu Leu Thr35 40 45gat aag atg cgg gat tgc aag agg ctt atc aag gac ttt gag cga gtt 252Asp Lys Met Arg Asp Cys Lys Arg Leu Ile Lys Asp Phe Glu Arg Val50 55 60gtc aaa gat atg gca gga agt acc gat cct gag act gct agg atg ctt 300Val Lys Asp Met Ala Gly Ser Thr Asp Pro Glu Thr Ala Arg Met Leu65 70 75 80
cat gat agg aaa cag tca atg atc aaa gaa ttg aac tcc tat gtt gct348His Asp Arg Lys Gln Ser Met Ile Lys Glu Leu Asn Ser Tyr Val Ala85 90 95ttg aag aaa caa tat gca agt gaa aat aag cga gtt gat ctt ttt gat396Leu Lys Lys Gln Tyr Ala Ser Glu Asn Lys Arg Val Asp Leu Phe Asp100 105 110ggc cca agt gtt gaa gat ggc ttt ggt gaa gaa aat gtc ctg tta gca444Gly Pro Ser Val Glu Asp Gly Phe Gly Glu Glu Asn Val Leu Leu Ala115 120 125tca aat atg aca aac caa cag tta atg gat caa gga aac caa cta atg492Ser Asn Met Thr Asn Gln Gln Leu Met Asp Gln Gly Asn Gln Leu Met130 135 140gat gag act gat caa gct att gca aga tct aaa cag acc gtc caa gag540Asp Glu Thr Asp Gln Ala Ile Ala Arg Ser Lys Gln Thr Val Gln Glu145 150 155 160acc atc aat gta ggt aca gaa act gca gct gct ctc aaa tca cag aca588Thr Ile Asn Val Gly Thr Glu Thr Ala Ala Ala Leu Lys Ser Gln Thr165 170 175gag caa atg agc aga att gtt aat gaa ctg gat tcc att cat ttc tcc636Glu Gln Met Ser Arg Ile Val Asn Glu Leu Asp Ser Ile His Phe Ser180 185 190att aaa aag gca tca caa atg gtg aaa gaa att ggt agg cag gtt gca684Ile Lys Lys Ala Ser Gln Met Val Lys Glu Ile Gly Arg Gln Val Ala195 200 205act gat cgc tgc atc atg gcc ttg ctt ttt ctc att gtt gct gga gtc732Thr Asp Arg Cys Ile Met Ala Leu Leu Phe Leu Ile Val Ala Gly Val210 215 220ata gca ata ata gtc gtt aag att gta aac cca cag aac aag act atc780Ile Ala Ile Ile Val Val Lys Ile Val Asn Pro Gln Asn Lys Thr Ile225 230 235 240cga gac att cct ggt ctc gct cca cca gtt agc aga agg cta ttg agt828Arg Asp Ile Pro Gly Leu Ala Pro Pro Val Ser Arg Arg Leu Leu Ser245 250 255att gta gaa gac atc tgaacttcat acatgtgaac aaatcaacca agagcag 880Ile Val Glu Asp Ile260
<210>SEQ ID NO.2<211>261<212>PRT<213>Oryza sativa(水稻)<400>2Met Asp Leu Glu Ser Val Asn Pro Glu Leu Ala Glu Ile Asp Gly Gln1 5 10 15Ile Gly Asp Ile Leu Arg Ala Leu Gln Asn Gly Phe Gln Lys Leu Asp20 25 30Lys Ile Lys Asp Ala Asn Arg Arg Ser Arg Gln Leu Glu Glu Leu Thr35 40 45Asp Lys Met Arg Asp Cys Lys Arg Leu Ile Lys Asp Phe Glu Arg Val50 55 60Val Lys Asp Met Ala Gly Ser Thr Asp Pro Glu Thr Ala Arg Met Leu65 70 75 80His Asp Arg Lys Gln Ser Met Ile Lys Glu Leu Asn Ser Tyr Val Ala85 90 95Leu Lys Lys Gln Tyr Ala Ser Glu Asn Lys Arg Val Asp Leu Phe Asp100 105 110Gly Pro Ser Val Glu Asp Gly Phe Gly Glu Glu Asn Val Leu Leu Ala115 120 125Ser Asn Met Thr Asn Gln Gln Leu Met Asp Gln Gly Asn Gln Leu Met130 135 140Asp Glu Thr Asp Gln Ala Ile Ala Arg Ser Lys Gln Thr Val Gln Glu145 150 155 160Thr Ile Asn Val Gly Thr Glu Thr Ala Ala Ala Leu Lys Ser Gln Thr165 170 175Glu Gln Met Ser Arg Ile Val Asn Glu Leu Asp Ser Ile His Phe Ser180 185 190Ile Lys Lys Ala Ser Gln Met Val Lys Glu Ile Gly Arg Gln Val Ala195 200 205Thr Asp Arg Cys Ile Met Ala Leu Leu Phe Leu Ile Val Ala Gly Val210 215 220Ile Ala Ile Ile Val Val Lys Ile Val Asn Pro Gln Asn Lys Thr Ile225 230 235 240Arg Asp Ile Pro Gly Leu Ala Pro Pro Val Ser Arg Arg Leu Leu Ser
245 250 255Ile Val Glu Asp Ile260<210>SEQ ID NO.3<211>21<212>DNA<213>人工合成<221>引物P1<222>(1)..(21)<400>3tgcttttggt tgttgtgatc c 21<210>SEQ ID NO.4<211>21<212>DNA<213>人工合成<221>引物P2<222>(1)..(21)<400>4ctgctcttgg ttgatttgtt c 21<210>SEQ ID NO.5<211>26<212>DNA<213>人工合成<221>引物P3<222>(1)..(26)<400>5attctagatg gatttggagt cggtca2權(quán)利要求
1.水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11，該基因的cDNA序列為SEQ ID NO.1。
2.權(quán)利要求1所述水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11所編碼氨基酸序列為SEQ IDNO.2。
3.權(quán)利要求1所述水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的應(yīng)用，包括1)總RNA的提取選用水稻抗稻瘟病菌品種“黑殼子粳”，待水稻幼苗長至3-4葉期，用稻瘟病菌孢子5×104ml-1接種處理，24小時后立即取葉片液氮冷凍，保存于-80℃冰箱。取部分葉片，用研缽研碎，轉(zhuǎn)移入盛有Trizol裂解液的1.5mLEP管，充分振蕩后，抽提總RNA，電泳鑒定總RNA質(zhì)量；2)水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的克隆以擬南芥基因AtNPSN11序列為探針，搜索水稻基因組序列和EST序列數(shù)據(jù)庫，拼接得到880bp水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的全長序列，并設(shè)計兩端引物P15-TGCTTTTGGTTGTTGTGATCC-3，P25-CTGCTCTTGGTTGATTTGTTC-3。將步驟1)獲得的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以此為模板用高保真Pfu酶進行PCR擴增，PCR程序如下94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性45s，56℃復(fù)性1min，72℃延伸1.5min，35個循環(huán)后，72℃延伸5min，最后Tag酶72℃保溫10min末端加A后克隆至pGEM-T載體，測序獲得水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的cDNA序列SEQID NO.1；3)植物表達載體的構(gòu)建根據(jù)水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的cDNA序列SEQ ID NO.1，在起始密碼子ATG附近設(shè)計引物P3并引入限制性內(nèi)切酶位點XbaI，引物序列為P35-ATTCTAGATGGATTTGGAGTCGGTCA-3，以步驟2)中獲得的PCR擴增產(chǎn)物為模板，用P3和P2引物經(jīng)PCR擴增后，將OsNPSN11的cDNA克隆至中間載體pGEM-T，利用引物P3引入的XbaI酶切位點和pGEM-T載體上的SalI酶切位點進一步克隆至雙元表達載體pCAMBIA1301，測序鑒定確保表達載體中編碼區(qū)閱讀框架正確；4)轉(zhuǎn)基因植株的獲得將步驟3)獲得的表達載體pCAMBIA1301轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，進一步轉(zhuǎn)入水稻感稻瘟病菌品種“蘇御糯”，對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行PCR，Southern雜交以及RT-PCR驗證后進行水稻的抗病性評價，將生長至3-4葉期的轉(zhuǎn)基因T1代植株進行稻瘟病菌孢子接種處理，7天后調(diào)查植株的病級數(shù)以及發(fā)病葉片病斑數(shù)目和病斑長度，與對照相比具有明顯抗性的轉(zhuǎn)基因水稻植株即為獲得的抗稻瘟病菌轉(zhuǎn)基因植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11及其應(yīng)用方法，屬于基因工程領(lǐng)域。該基因的cDNA序列SEQ ID NO.1及其編碼氨基酸序列SEQID NO.2。本發(fā)明基因OsNPSN11為水稻中首次報道，mRNA表達分析表明該基因受稻瘟病菌接種誘導(dǎo)，對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行PCR，Southern雜交以及RT－PCR驗證后進行水稻的抗病性評價，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株與對照相比表現(xiàn)出對稻瘟病菌的明顯抗性。因此，OsNPSN11可作為目的基因?qū)胫参?，提高植物的抗病性?br> 文檔編號C07K14/415GK101058812SQ20071002137
公開日2007年10月24日 申請日期2007年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月10日
發(fā)明者張紅生, 鮑永美, 王建飛, 黃驥, 王州飛 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)