專利名稱：一種新的具有抗腫瘤活性的肽類化合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，是指從皖南尖吻蝮蛇蛇毒中提取獲得的一種肽類化合物。
背景技術：
尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus Guenther)屬蝰蛇科蝮亞科尖吻蝮屬，是一種劇毒蛇。分布于我國江南大部分地區和臺灣省，是我國特有種類。尖吻蝮蛇毒中含有多種生理活性物質，主要是酶和毒素。尖吻蝮蛇毒酶主要有L-氨基酸氧化酶，乳酸脫氫酶，蛋白酶，磷脂酶，透明質酸酶和膠原蛋白酶，類凝血酶，激肽釋放酶，纖溶酶(Fibrinlytic enzyme)。(中國毒蛇學南寧廣西科技出版社1995.)。尖吻蝮蛇毒毒素主要包括出血毒素、神經毒素和膜毒素。
神經毒素是一類相對分子質量小的堿性多肽，相對分子質量為6000～12000，pH值9以上。膜毒素的作用部位是細胞膜，使膜的通透性增加。膜毒素一般含60個氨基酸，4對二硫鍵，表現為強堿性，pI值為10～12，對熱穩定，對水解酶有較強抗性。蛇毒細胞毒素對體外培養的多種動物和人的腫瘤細胞有溶解作用，能夠強烈破壞游離細胞，尤其是惡性腫瘤細胞。Braganca(Bragaca BM，Pater NT，Badrinath PG.Biochem Biophys Acta)從印度眼鏡蛇毒中分離出細胞毒組分，發現其破壞吉田肉瘤的能力比破壞人或大鼠紅細胞的能力強千倍。仲曉燕(仲曉燕，劉玉芬，王晴川。中華眼鏡蛇毒細胞毒素14的純化及抗癌活性。中國藥理學報，1993，14279-282.)等測定了細胞毒素對MGC(人胃癌細胞)、CNE(人鼻咽癌細胞)、Hela細胞(人宮頸癌細胞)和乳鼠心肌細胞的細胞毒活性，結果表明對3種人癌細胞均有明顯的殺傷作用。雷丹青等(雷丹青，王秋雁，劉綿林等.中國藥理學報，2002，18(1)61-64.)研究了廣西眼鏡蛇細胞毒對CNE，YAC(淋巴瘤細胞株)和卵巢癌細胞生長的抑制作用。中國醫科大學蛇毒研究室證明蛇島蝮蛇毒能夠抑制腫瘤的生長，通過體外微量元素培養方法，發現了眼鏡蛇毒對鼻咽癌、肝癌、胃癌、子宮頸癌等四種人腫瘤細胞和骨髓癌細胞等兩種小鼠傳代細胞的殺傷作用最強，其次是蝮蛇毒。蛇毒細胞毒素在體內能引起腫瘤體積縮小，延長荷瘤小鼠的存活時間(管錦霞，羅肖萍，曾諶文等.廣州醫學院學報，1997，117-19.)。
章良等從尖吻蝮蛇蛇毒中分離到了兩個抗癌組分ACTX-6和ACYX-8，對體外培養的人鼻咽癌細胞株(KB)，胃癌細胞株(BGC)，結腸癌細胞株(CACO-2)，卵巢癌細胞株(HO8910)，肺癌細胞株(A549)均有很強的抑制作用。并發現ACTX-6對A549和BGC的抑制作用明顯優于5-氟尿嘧啶(5-FU)。實驗室還對ACTX-6的體內抗小鼠移植性肉瘤(S180)、艾氏癌腹水型(EAC)、肝瘤實體型(Heps)的活性進行了研究，表明具有較強的抑瘤活性(Zhang liang，Li hong，Wu wutong.Journal of Chinese pharmaceutical sciences，2004，13(2)97-102.)。從文獻可以看出，以往研究的尖吻蝮蛇中的活性蛋白質及多肽，分子量都在1000Da以上，而我們發現的這個化合物分子量只有429Da。
發明內容
本化合物是從尖吻蝮蛇蛇毒中提取的，提取方法如下1溶解稱取尖吻蝮蛇蛇毒2g，溶于400ml緩沖液(Tris-HCl pH 8.0 10mmol)中，充分溶解。
2超濾10000rpm離心10min，取上清，10000Da濾膜超濾(400ml-200ml)，收集濾出液，冷凍干燥濃縮。
3陰離子交換分離純化采用SOURCE Q色譜介質，色譜柱先用平衡液(A液10mmol Tris-HClpH 8.0)平衡后，將冷凍干燥后的濃縮液上樣，上樣后用平衡液洗出未吸附組分，然后用洗脫液(B液10mmol Tris-HCl pH 8.0+0.5mol·ml-1NaCl)進行梯度洗脫，程序為0％-100％B 30ml，流速0.8ml/min，檢測波長為280nm。(圖1)4反相色譜純化收集上述分離的第2個組分，用反相色譜純化。色譜柱為RESOURCE RPC，用平衡液(A液2％乙腈(含0.05％TFA))平衡后，上樣，然后用洗脫液(B液90％乙腈(含0.05％TFA))進行梯度洗脫，程序為0-100％B 20ml，流速為1ml/min，檢測波長為280nm。(圖2)5收集主峰(峰1)，冷凍干燥，即為樣品。
物理常數和圖譜信息如下電噴霧離子化質譜452.18(M+Na)+430.10(M+H)+
該化合物的1H13C核磁共振數據，見表 同時還測定了該化合物多種二維核磁共振譜，包括COSY，HSQC，HMBC和ROESY(混合時間分別為0.7s和1.0s)，確定了該化合物的化學結構及該化合物的所有的氫原子和碳原子的歸屬。結構如下
具體實施例方式體外抗腫瘤活性，采用方法為MTT，腫瘤細胞株為SMMC-7721(肝癌細胞)。結果如下
SMMC-7721的IC50為4.46×10-8mol/L。
本發明化合物的體外抗腫瘤活性極強，有望成為抗腫瘤藥物或抗腫瘤先導化合物。對我國原創藥物的研究開發具有重要意義。
圖1蛇毒低分子量超濾濃縮液的SOURCE Q離子交換色譜分離2SOURCE Q峰2的RESOURCE RPC反相色譜分離圖。
權利要求
1一種具有抗腫瘤活性的肽類化合物，其特征在于分子式是C20H23O6N5，具有如下結構
2權力要求1所述的肽類化合物的用途，其特征在于用于制備抗腫瘤藥物。
全文摘要
本發明涉及醫藥技術領域，是從皖南尖吻腹蛇中分離純化的一種新的抗腫瘤活性的肽類化合物。結構式如上圖體外抗腫瘤活性證明該 化合物對肝腫瘤細胞有抑制作用，其半數抑制濃度(IC
文檔編號C07D207/00GK101058572SQ20071002058
公開日2007年10月24日 申請日期2007年3月13日 優先權日2007年3月13日
發明者孔毅, 吳梧桐, 張紅梅, 黃春洪, 劉建寧 申請人:中國藥科大學