GADD45β蛋白及其相關細胞因子在類風濕關節炎中的應用的制作方法

專利名稱：GADD45β蛋白及其相關細胞因子在類風濕關節炎中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及GADD45β蛋白及其相關細胞因子在類風濕關節炎中的應用，尤其是涉及GADD45β蛋白及其相關細胞因子在生物檢測和診斷方法的用途，具體地說，本發明涉及一種在類風濕關節炎的發病過程中起重要作用的蛋白-GADD45β蛋白及其相關的細胞因子、下游的激酶和抑制劑在診斷或治療類風濕關節炎上的用途。本發明還提供了相應的診斷試劑盒。
背景技術：
雖然類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)病因和發病機制尚不明確，如II型膠原和熱休克蛋白是類風關發病的自身抗原，雖然這些自身抗原在疾病病理過程中的作用并不十分清楚。但已公認T細胞介導的炎癥在類風關滑膜病變過程中起了很重要的作用，特別是Th1細胞，和炎癥有關的炎癥細胞因子和趨化因子介導了RA組織的損傷。已報導TNF-α拮抗劑和其受體治療RA有效。但類風關滑膜炎癥T細胞的啟動和持續存在的分子機制尚不清楚。
GADD45β屬于GADD45(growth arrest and DNA damage-inducible生長阻斷和誘導DNA損傷因子)家族，有三個成員GADD45α、GADD45β和GADD45γ，在進化上十分保守，產物也十分相似，但在體內功能各不相同。GADD45蛋白在轉錄水平受到調節，在一些重要的生理過程中發揮作用，包括G2/M期細胞周期檢查點及DNA修復。現在的研究表明GADD45家族蛋白具有抗增殖活性，能直接與細胞周期蛋白如PCNA，cdc2，cyclinB和p21相互作用來誘導細胞凋亡。盡管過程與GADD45α類似，GADD45β顯示了不同的生理活性。而GADD45β還有調節T細胞活化和分化的功能。有報導表明GADD45β通過絲裂原活化蛋白激酶家族(mitogen-activated proteinkinases，MAPKs)介導Th1細胞的分化。MAPKs是將胞外信號傳導到細胞核內的重要蛋白細胞外各種應激條件，如高滲透壓、熱休克、紫外線以及細胞因子、病原微生物成分-脂多糖(LPS)等都能通過該途徑來調節細胞功能、誘導分化及凋亡等生物效應，是細胞執行功能的重要機制。
已知GADD45β蛋白作為早期T淋巴細胞啟動劑，并與一系列與炎癥過程有關的前炎癥細胞因子的產生有關。GADD45β蛋白是一種具有多種功能的細胞內蛋白。GADD45β蛋白屬于調節T細胞生長、活化與分化的蛋白質，因為GADD45β蛋白具有促進Th1細胞分泌IFN-γ的作用。GADD45β蛋白可以通過活化胞內許多重要的激酶來介導細胞的功能，其中最主要的包括MAPK途徑的ERK，和P-38。GADD45β蛋白可以與這些激酶相互作用并導致后者發生磷酸化，而促進T細胞向Th1型分化并分泌多種細胞因子，如IFN-γ等發揮其作用。
同時，GADD45β蛋白還是抗細胞凋亡的主要分子。GADD45β蛋白的表達上調可以通過抑制JNK的活化而抑制細胞的凋亡，這點已經在一些腫瘤發生和進展的研究中得到證實。
GADD45β蛋白與T細胞的活化，向Th1方向的分化及發揮其功能等方面的研究剛剛開始展開。關于GADD45β蛋白和類風關的關系至今表達尚未見報道。尤其，在本發明之前，類風關滑膜浸潤T細胞和外周血中T細胞中GADD45β蛋白過表達和其在類風關中的功能關系尚未闡明。
由于類風濕關節炎的發病機理，尤其是類風關致病性CD4+T細胞的啟動和持續性存在的分子機制尚不清楚，因此極大地阻礙了類風濕關節炎的診斷和治療。因此，本領域長期以來一直迫切希望找到與RA的發病有關的物質，以便開發出具有輔助診斷類風濕關節炎及其它自身免疫疾病如紅斑狼瘡、多發性硬化癥等的有效試劑盒或檢測手段。

發明內容
本發明的目的就是提供一種GADD45β蛋白及其相關細胞因子在類風濕關節炎中的應用。
本發明目的是提供一種有效的輔助檢測或輔助檢測類風濕關節炎的方法和試劑盒。
本發明提供了一種GADD45β蛋白及其相關細胞因子和細胞凋亡的用途，用于制備檢測或輔助檢測類風濕關節炎的試劑，其中，所述的試劑包括GADD45β蛋白核酸和細胞因子、GADD45β蛋白下游激酶中的一種或其組合，所述相關細胞因子包括IFNr，TNFa，IL-12，18。
本發明提供了一種檢測類風濕關節炎的試劑盒，它含有容器和位于容器內的檢測GADD45β核酸或蛋白含量的試劑。優選的，所述檢測GADD45β核酸和蛋白含量的試劑是特異性擴增GADD45β蛋白的寡核苷酸引物或特異性抗GADD45β蛋白的抗體，所述的引物見序列表，為SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，其中，SEQID NO.1、SEQID NO.2分別為GAPDH的上游和下游引物；SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4為GADD45β的上游和下游引物，用于擴增GADD45β基因序列。
在一優選例中，所述的試劑盒還含有檢測下游激酶狀態的試劑，其中所述的激酶選自激酶包括MAPKs的ERK、P-38和JNK。而所述的檢測下游激酶狀態的試劑是特異性抗磷酸化激酶的抗體。
在另一優選例中，所述的試劑盒還含有檢測TNF-α或IFN-γ含量的試劑。
在另一優選例中，所述的試劑盒還含有檢測IL-12，IL-18的試劑。
本發明機理及研究圖1RA病人滑膜組織與正常人滑膜組織中基因U133A基因芯片表達譜。
本研究利用Afmetrix公司的人類全基因組基因芯片U133A對類風關組織的基因表達譜進行了全面分析，為本研究中類風關疾病的易感基因發展機制提供有意義的基因譜。病變滑膜組織來自膝關節置換手術。正常人滑膜組織來自于關節鏡手術。將滑膜組織無菌取自手術臺，置于無血清1640培養液中，盡快送至實驗室。于超凈臺內剪成小塊后立即進行mRNA并逆轉錄為cDNA并進行標記，然后與基因芯片雜交。由于在基因芯片的篩選研究中，雜交信號經計算機處理、分析，即可得到樣本中的基因表達譜信息和樣本之間的基因表達差異。鑒于基因芯片以上優點，該技術自建立以來，立即引起了學者們的廣泛關注，并已成為當今生命科學研究中最受歡迎的技術之。
圖1顯示了用轉錄組學-基因表達-單色基因芯片技術對RA病人的滑膜組織約38000個基因的表達譜進行檢測。并與正常人相同組織基因表達譜做對照。下圖中，每個點代表一種基因紅色點代表兩者共同表達的基因，藍色點代表有一種基因表達有差異，黃色點代表兩者均無此基因的表達。結果提示RA患者與正常人相比有很多有顯著差異表達的基因，但表達增高4倍以上的基因僅為30個左右(左側縱坐標的log2-10區域內的藍點所示)。
分析后發現有約30個基因在RA中表達增高4倍以上，其中GADD45β表達明顯增高。
圖2.基因芯片檢測RA滑膜組織中GADD45β的表達情況將基因芯片中所檢測的RA患者滑膜組織中的GADD45β的表達量與正常人的滑膜組織相比，可見RA的GADD45β的表達量增高，是正常人的9.6倍。
圖3.不同來源的單個核細胞GADD45β的表達。從60例RA患者外周血、關節液和滑膜組織來源的單個核細胞抽提RNA，定量PCR分析。對照單個核細胞來自20個健康志愿者。GADD45β表達量用同一樣本GAPDH的表達量標準化。相對量表達用ΔΔCT表示。GADD45β基因的相對含量用2-ΔΔCT計算。結果表明，在RA患者的單個核細胞的GADD45β基因的相對含量比正常人高，而在RA的組織中，以滑膜中的單個核細胞的GADD45β基因的相對含量最高。
圖4.RA患者T細胞中GADD45β基因的相對含量表達格局。用磁珠從10例RA患者外周血來源的單個核細胞分離T細胞，采用特異性抗CD3單抗標記后，用流式細胞儀檢測所分離T細胞純度超過97％。抽提RNA，定量PCR分析。對照T細胞來自10個健康志愿者。GADD45β表達量用同一樣本GAPDH的表達量標準化。相對量表達用ΔΔCT表示。GADD45β基因的相對含量用2-ΔΔCT計算。結果表明，在RA患者的T細胞的GADD45β基因的相對含量比正常人高至少3倍。
圖5.RA患者T細胞亞群中GADD45β基因的相對含量表達格局用磁珠從RA和正常人外周血中分離出CD4+T細胞和CD8+T細胞，用采用特異性抗CD4和CD8單抗標記后，用流式細胞儀檢測所分離CD4+T細胞和CD8+T細胞純度超過97％。用定量PCR分析GADD45β蛋白表達量。A.結果表明，GADD45β主要表達在CD4+T細胞中，RA患者CD4+T細胞中GADD45β表達量十分明顯，而CD8+T細胞中表達無明顯變化。在所有圖例中，星號代表在不同組別中比較具有統計學意義(p＜0.05)。B.在RA患者的CD4+T細胞的GADD45β基因的相對含量比正常人CD4+T細胞高，而在RA的組織中，以滑膜中的CD4+T細胞的GADD45β基因的相對含量最高。
圖6.顯示了用RA關節滑膜液刺激后單個核細胞和CD4+T細胞中GADD45β蛋白mRNA表達的分析結果。從RA患者關節中無菌抽取的滑膜液，經離心去除組織碎片之后，將3-5份滑膜液混勻之后加入至正常人外周血單個核細胞和CD4+T細胞中，分別在2小時、4小時、6小時、8小時、16小時、24小時檢測GADD45β表達量，結果發現，當將滑膜液以1∶8比例的稀釋加入上述細胞后，GADD45β表達從2小時開始增高，在8小時時達到高峰。然后緩慢下降，在24小時時基本恢復到初始水平。表明RA的關節滑液具有刺激正常人單個核細胞和CD4+T細胞中GADD45β表達上調的作用。
A.正常人的PBMC在不同濃度的RA-SF及相應的血清刺激下GADD45β蛋白表達的劑量曲線。當滑膜液被稀釋為1∶16時，刺激作用基本消失。
B.磁珠分離外周血CD2+T細胞(純度大于97％)，1∶8稀釋的RA-SF經過濾后分別加到隨機選擇的10個正常人和10個RA病人(年齡、性別相對應)的PBMC中。在不同的時間收取細胞進行實時定量PCR檢測GADD45β蛋白核酸的表達情況。圖中所示數據代表了用不同病人的RA-SF進行的四個獨立實驗的結果。用RA病人和正常人的CD4+T細胞的實驗也得到相同的結果。GADD45β蛋白表達的計算方法同圖1說明所述。
圖7.GADD45β蛋白mRNA表達增高與單個核細胞和CD4+T細胞在體外存活的時間呈正相關。從RA患者關節中無菌抽取的滑膜液，經離心去除組織碎片之后，將3-5份滑膜液混勻之后加入至正常人外周血單個核細胞和CD4+T細胞中，分別在下列時間檢測GADD45β蛋白mRNA表達0h，2h，4h，8h，16h。在24小時、48小時、72小時、96小時、120小時用Avinnex V和PI染色細胞檢測細胞凋亡的發生情況，同時以正常人血清作為對照。結果發現，加有以1∶8比例稀釋的滑膜液的細胞，無論是正常人還是RA病人中，GADD45β蛋白mRNA表達在2h即明顯表達，但是，正常人細胞中的GADD45β蛋白mRNA表達在2小時后即迅速下降，而RA病人細胞中GADD45β蛋白mRNA表達下降十分緩慢，在16小時仍然維持較高水平(圖A)。細胞出現凋亡的比例明顯低于對照組細胞。提示GADD45β蛋白mRNA表達增高與單個核細胞和CD4+T細胞在體外存活的時間呈正相關。而RA患者關節液通過上調GADD45β蛋白mRNA表達維持正常人外周血中單個核細胞及CD4+T細胞在體外存活的時間(圖B)，同樣的研究結果在RA病人的外周血細胞中也得到證實(圖C)。
用密度梯度離心分離到的外周血單個核細胞后，用磁珠分離外周血CD4+T細胞(純度大于97％)，1∶8稀釋的RA-SF經過濾后分別加到隨機選擇的6個正常人和6個RA病人(年齡、性別相對應)的PBMC和CD4+T細胞中。在不同的時間收取細胞進行Avinnex V和PI染色觀察細胞凋亡情況。圖中所示數據代表了用不同病人的RA-SF進行的三個獨立實驗的結果。
圖8.RA患者關節液具有上調正常人外周血中單個核細胞及CD4+T細胞Fas蛋白的表達，而對FasL的表達無明顯影響。從RA患者關節中無菌抽取的滑膜液，經離心去除組織碎片之后，將3-5份滑膜液混勻之后加入至正常人外周血單個核細胞和CD4+T細胞中，分別在24小時、48小時用實時定量PCR法檢測Fas和FasL表達，同時以正常人血清作為對照。結果發現，加有以1∶8比例稀釋的滑膜液的細胞中，細胞內的Fas基因轉錄出現在刺激后的4小時，在48小時達到高峰(圖A)，而FasL在早期無明顯變化，在與滑膜液共同孵育48小時后，FasL表達開始增加(圖B)。用Fas和FasL的特異性單抗染色也證實了同樣結果。
圖9.GADD45β蛋白mRNA表達增高與外周血中單個核細胞及CD4+T細胞合成IL-12、IFN-r和IL-10的表達呈正相關，即對外周血中單個核細胞及CD4+T細胞中IL-12、IFN-r具有上調作用，但是對IL-10的表達沒有明顯作用。從RA患者關節中無菌抽取的滑膜液，經離心去除組織碎片之后，將3-5份滑膜液混勻之后加入至正常人外周血單個核細胞和CD4+T細胞中，用密度梯度離心分離到的外周血單個核細胞后，用磁珠分離外周血CD4+T細胞(純度大于97％)，1∶8稀釋的RA-SF經過濾后分別加到隨機選擇的6個正常人和6個RA病人(年齡、性別相對應)的PBMC和CD4+T細胞中。分別在2小時、4小時、6小時、8小時、16小時、24小時、48小時收取細胞進行實時定量PCR檢測細胞因子的表達情況。結果發現，加有以1∶8比例稀釋的滑膜液的細胞中，IL-12，TNF-α，IFN-γ的表達量隨著細胞與滑膜液孵育的時間增加而表達，在24小時時達到高峰。而相比之下，IL-10的表達無明顯變化。在本發明中，試驗結果提示RA患者關節液通過刺激正常人GADD45β蛋白mRNA表達，促進外周血中單個核細胞及CD4+T細胞合成IL-12、IFN-r和IL-10的合成與表達，從而達到介導炎癥反應的作用。
圖10顯示了用GADD45β特異性SiRNA干擾后，伴隨著GADD45β表達的降低，IFN-γ和其它炎癥因子如TNF-α、IL-12明顯降低。將新鮮分離的人單個核細胞(human peripheral blood mononuclear cells，PBMC)重懸到2.5×107、/ml的濃度，取40μl的細胞懸液(即1×106的細胞)放在24孔培養板中，于37℃，5％co2培養箱中培養。
GADD45β特異性SiRNA的轉染轉染試劑為脂質體geneporter和含抗生素的無血清成分1640溶液，轉染體系(以24孔板為例)為250μl。
將12μl geneporter與113μl的1640(體積比為1∶6，總體積是125μl)輕輕混勻，室溫靜置3-5min；然后將2μl siRNA與123μl 1640輕輕混勻，(總體積125μl)室溫靜置3-5min；然后將混勻后的兩種液體再輕輕混勻，室溫靜置約20-25min(不超過30min)。再將混勻的液體加到細胞懸液中，充分吹打使RNA-geneporter復合體與細胞充分混勻。在37℃，5％CO2培養箱中培養5-7小時后，加含等體積的20％FBS和含抗生素的1640營養液繼續培養，24-48小時后，取培養的細胞做實時定量PCR，檢測干擾的效果。結果表明，伴隨著GADD45β表達的降低，IFN-γ和其它炎癥因子如TNF-α、IL-12明顯降低。
圖10表明在用GADD45β特異性SiRNA干擾后，隨著GADD45表達降低(圖10A)，炎癥因子IL-12，TNF-α，IFN-γ表達降低(圖10B)，同時淋巴細胞凋亡明顯增加(圖10C)，Fas/FasL表達降低(圖10D)。這些試驗證實了GADD45β控制滑膜浸潤炎性細胞分泌產生炎性因子，GADD45β的活化與否與局部炎癥環境有非常大的關系。GADD45β在滑膜浸潤T細胞中的持續性活化并通過Fas/FasL介導的途徑抑制凋亡、外周血致病性T細胞的分化、極化、抑制凋亡、及其效應緊密相關。通過下調GADD45β可以起到抑制致病性T細胞活化的作用。RA患者的滑膜液和外周血IL-12，IL-18能刺激T細胞中GADD45β的表達增高，進而向Th1型分化、抑制IL-10分泌和T細胞凋亡、并刺激分泌IFN-γ和IL-12，引起炎癥反應。使用RNA干擾的方法可以阻斷此過程.這為以后的基因治療和新藥物的篩選提供了堅實的基礎。
本發明闡明了GADD45β蛋白在RA炎癥過程和其它自身免疫條件中的作用機制。研究表明，類風關外周血單個核細胞和CD4+T細胞的GADD45β蛋白表達明顯增高，而正常人的外周血單個核細胞和CD4+T細胞的GADD45β蛋白表達能被炎癥關節滑膜液所誘導。GADD45β蛋白表達增高提供了一種在類風關患者體內致病性T細胞持續活化過程中，起放大炎癥的功能機制。在此基礎上完成了本發明。
在本發明中，首次發現GADD45β蛋白在病變的滑膜組織與細胞中的高表達，而且用體外病變滑膜液刺激的方法表明外周血T細胞上的過表達與局部炎癥環境有非常大的關系，GADD45β蛋白作為一種重要介質在類風濕關節炎患者病程中起了非常重要的作用。研究表明，GADD45β蛋白mRNA在RA患者關節滑膜液CD4+T細胞上高表達，與患者的病情嚴重程度相關聯。GADD45β蛋白在CD4+T細胞上的持續性高表達與關節局部滑膜液中的高水平的炎癥因子(IL-12，18)有關。RA患者的SF和IL-12均能刺激T細胞使GADD45β蛋白表達增高。GADD45β蛋白可以通過活化上調IFN-γ、IL-12和抑制IL-10分泌的方式，誘導Th1細胞分化并分泌IFN-γ來介導致病性T細胞的功能。
本發明的主要優點在于(a)為類風濕關節炎的診斷或輔助診斷提供準確、高效的檢測方法。
(b)提供了有效篩選類風濕關節炎治療藥物的新方法。


圖1.RA病人滑膜組織與正常人滑膜組織中基因U133A基因芯片表達譜。
圖2.基因芯片檢測RA滑膜組織中GADD45β的表達情況。
圖3.不同來源的單個核細胞GADD45β的表達圖4.RA患者T細胞中GADD45β基因的相對含量表達格局。
圖5.RA患者T細胞亞群中GADD45β基因的相對含量表達格局圖6.顯示了用RA關節滑膜液刺激后單個核細胞和CD4+T細胞中GADD45β蛋白mRNA表達的分析結果。
圖7.GADD45β蛋白mRNA表達增高與單個核細胞和CD4+T細胞在體外存活的時間呈正相關。
圖8.RA患者關節液具有上調正常人外周血中單個核細胞及CD4+T細胞Fas蛋白的表達，而對FasL的表達無明顯影響。
圖9.GADD45β蛋白mRNA表達增高與外周血中單個核細胞及CD4+T細胞合成IL-12、IFN-r和IL-10的表達呈正相關，即對外周血中單個核細胞及CD4+T細胞中IL-12、IFN-γ具有上調作用，但是對IL-10的表達沒有明顯作用。
圖10顯示了用GADD45β特異性SiRNA干擾后，伴隨著GADD45β表達的降低，IFN-γ和其它炎癥因子如TNF-α、IL-12明顯降低，淋巴細胞凋亡明顯增加，Fas/FasL表達降低。
具體實施例方式
基于上述研究，本發明提供了一種檢測GADD45β蛋白表達狀態的用途，所述的GADD45β蛋白表達用于制備檢測或輔助檢測類風濕關節炎的試劑。
本發明還提供了一種檢測類風濕關節炎的試劑盒，它含有容器和位于容器內的檢測GADD45β蛋白含量的試劑，如特異性擴增GADD45β蛋白的寡核苷酸引物或特異性抗GADD45β蛋白的抗體。
此外，所述的檢測試劑盒還含有檢測IL-12，18、TNF-α或IFN-γ含量的試劑。
在本發明的試劑盒中，還可含有相應的特異性探針和/或PCR緩沖液等。
另一方面，本發明還涉及對GADD45β蛋白及其相關的炎性細胞因子，即IL-12，18、TNF-α或IFN-γ，或IL-12/18及其特異性的抗體，尤其是單克隆檢測的抗體。本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
以GADD45β蛋白為例，“特異性”是指抗體能結合于GADD45β蛋白或片段。較佳地，指那些能與GADD45β蛋白或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。
以GADD45β蛋白為例，“特異性”核酸或探針是指能與GADD45β蛋白mRNA特異性互補結合的片段。較佳地，指那些只能與GADD45β蛋白mRNA核酸或片段結合但不識別和結合于其它非相關蛋白核酸和mRNA分子的核酸或探針。本發明的核酸或探針可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。
一種檢測樣品中是否存在GADD45β蛋白的方法是利用GADD45β蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與GADD45β蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在GADD45β蛋白。根據抗體復合物的數量，可以定量確定GADD45β蛋白的數量。
一種檢測樣品中是否存在GADD45β蛋白核酸mRNA的方法是利用GADD45β蛋白核酸的特異性探針或引物進行檢測，它包括將樣品與GADD45β蛋白特異性探針接觸；觀察是否形成復合物，形成了復合物就表示樣品中存在GADD45β蛋白特異性核酸。根據核酸復合物的含量，可以定量確定GADD45β蛋白核酸的表達數量。
對于IL-12，18、TNF-α或IFN-γ的抗體，也都是本領域中已知的，可用常規方法制備，也可從在市場上購得。
在本發明中，還可以通過常規的核酸定量檢測技術，如熒光實時PCR技術，來檢測樣品中GADD45β蛋白及其相關炎性因子IL-12，18、TNF-α或IFN-γ的水平。
以GADD45β蛋白為例，GADD45β蛋白的多核苷酸也可用于類風濕關節炎的早期輔助診斷和治療。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微數組(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)或者聚苯烯板上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用GADD45β蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測GADD45β蛋白的轉錄產物。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1RA檢測方法患者和實驗材料本研究共收集60例RA患者。所有患者均符合美國風濕病學會的診斷標準。RA患者性別比為女42人，男18人；疾病年限為15±12年。患者年齡為54±19歲。完整配對樣本有25例，每位患者有外周血、關節液和關節滑膜組織。另外一組20例配對樣本有關節液和血清(不含細胞)。對照外周血單個核細胞和血清來自20個健康志愿者，性別和年齡與RA組相似。在樣本采集前1個月，患者沒有用過免疫抑制劑和免疫調節劑。在樣本收集前患者均簽署知情同意書。研究流程符合研究公約。
滑膜組織來自滑膜切除術或關節鏡手術。關節液3000rpm離心3分鐘收集上清立刻-80℃保存。Ficoll分離RA患者關節液和外周血得單個核細胞，立即進行細胞培養。組織切成小塊，立即勻漿抽提RNA。
RNA抽提和定量PCR用Qiagen公司Rneasy Mini試劑盒抽提總RNA。在純化RNA過程中用DNA酶消化基因組DNA。RNA-80℃保存。用Qiagen公司Sensiscript RT試劑盒逆轉錄RNA樣本。在cDNA合成中用隨機引物。
用定量PCR SYBR方法檢測GADD45β蛋白的mRNA表達，其特異性引物序列見表1。
表1.用于實時PCR分析的特異性引物

熱循環條件包括起始50℃ 2分鐘，隨后95℃ 10分鐘，2步PCR循環包括95℃ 15秒，60℃ 60秒，40個循環。數據收集，ABI 7900對資料作定量分析。GAPDH基因作為內參使不同標本總RNA量得以標準化。標本定量以GAPDH表達倍數表示。每個標本復孔平均值以閾值計算和表達(CT，每個PCR反應達到預定熒光閾值的循環數)。基因表達量用樣本CT值和內參GAPDHCT值的差值來表示。相對量表達以ΔΔCT計算。基因相對表達量為2-ΔΔCT。滑膜組織單細胞懸液制備手術取下的滑膜組織立即放入含有10％胎牛血清和1％青鏈霉素的完全RPMI介質中，剪成小塊。用Teflon Resin棒攆磨，用含有10％胎牛血清和1％青鏈霉素的完全RPMI介質反復沖洗，用70μm尼龍網過濾得到單細胞懸液。
CD4+和CD8+T細胞的分離和純化將收集的細胞用含2％FCS(胎牛血清)的PBS洗滌一次，并按1×107cell/ml的濃度重懸在含2％FCS的PBS中。然后用Dynal beads陽選出CD2+，CD4+和CD8+T細胞。分離后，用流式分析陰性細胞，檢測這些細胞中含CD2+，CD4+和CD8+T細胞的比例。陽選出的細胞一部分用來作純度分析，其余的用來抽提RNA并做實時PCR檢測。在所有實驗中，陽選效率都在97％以上。CD2+，CD4+和CD8+T細胞的純度也在97％以上。
T細胞刺激RA和正常人的PBMC，磁珠分離T細胞和CD4+T細胞后按每孔1×106個的數量放在24孔板上培養，用含10％的FBS和100U/ml青霉素和鏈霉素的RPMI 1640進行培養。在用RA-SF的刺激實驗中，在培養液中加入RA-SF(1∶8稀釋)。使用時，所有的RA-SF都要用Millex過濾器(Millipore公司)除菌。細胞在37℃，5％CO2的培養箱中培養2、4、8、16、24小時后收集。細胞收集后做實時PCR分析。在阻斷實驗中，抗人IL-12的單克隆抗體和同型對照抗體以10μg/ml的濃度加到用SF刺激的PBMC的培養液中。然后按照上面所述的過程處理。在研究特異性核酸和抗體阻斷時，也采用相同的操作流程。
特異性SiRNA干擾試驗為檢測GADD45β蛋白特異性SiRNA對GADD45β蛋白核酸表達的抑制和相應的炎性因子及對細胞凋亡的作用，用GADD45β特異性SiRNA對細胞進行干擾。將新鮮分離的人單個核細胞(human peripheral bloodmononuclear cells，PBMC)用GADD45β特異性SiRNA的轉染后，在37℃，5％CO2培養箱中培養5-7小時，然后加含等體積的20％FBS和含抗生素的1640營養液繼續培養24-48小時。取培養的細胞做實時定量PCR，檢測干擾的效果。
統計分析各組之間基因表達的差異情況采用曼-惠特尼U檢驗(TheMann-Whitney U Test)分析。P值小于0.05表示有顯著性差異。
結果結果如圖1-9和表1所示。
(a)類風關滑膜中GADD45β蛋白mRNA和蛋白水平的表達狀態用轉錄組學-基因表達-單色基因芯片技術對RA病人的滑膜組織約38000個基因的表達譜進行檢測。并與正常人相同組織基因表達譜做對照。分析后發現有約30個基因在RA中表達增高4倍以上，其中GADD45β表達明顯增高(圖1)。將基因芯片中所檢測的RA患者滑膜組織中的GADD45β的表達量與正常人的滑膜組織相比，可見RA的GADD45β的表達量增高，是正常人的9.6倍(圖2)。外周血單個核細胞(PBMC)，滑膜液單個核細胞(SFMC)和滑膜組織來自臨床RA患者，同時以健康人PBMC為對照。定量PCR檢測SFMC中單個核細胞和同一RA患者滑膜組織單個核細胞GADD45β蛋白的表達與其自身PBMC和健康對照PBMC上GADD45β蛋白的表達，如圖3所示在RA患者的單個核細胞的GADD45β基因的相對含量比正常人高，而在RA的組織中，以滑膜中的單個核細胞的GADD45β基因的相對含量最高(p＜0.01)。
如圖4所示，用磁珠從10例RA患者外周血來源的單個核細胞分離T細胞，抽提RNA，定量PCR分析。對照T細胞來自10個健康志愿者。結果表明，在RA患者的T細胞的GADD45β基因的相對含量比正常人高至少3倍。進一步用磁珠從RA和正常人外周血中分離出CD4+T細胞和CD8T細胞，分析RA患者T細胞亞群中GADD45β基因的相對含量表達格局，結果表明，GADD45β主要表達在CD4+T細胞中，RA患者CD4+T細胞中GADD45β表達量十分明顯(p＜0.05)，而CD8+T細胞中表達無明顯變化。而在RA患者的CD4+T細胞的GADD45β基因的相對含量比正常人CD4+T細胞高，而在RA的組織中，以滑膜中的CD4+T細胞的GADD45β基因的相對含量最高(圖5)。
(b)關節滑液和細胞因子能誘導GADD45β蛋白表達為了闡述T細胞上GADD45β蛋白的表達能否被含有不同細胞因子的關節液所誘導，隨機抽取RA患者和健康志愿者外周血分離PBMC用于功能實驗。首先體外分離PBMC，然后加入不同稀釋倍數的關節液，隨后分離CD4+T細胞，用定量PCR方法分析GADD45β蛋白mRNA的表達。研究中用RA關節滑膜液刺激后，分析單個核細胞和CD4+T細胞中GADD45β蛋白mRNA表達。結果發現，當將滑膜液以1∶8比例的稀釋加入上述細胞后，GADD45β表達從2小時開始增高，在8小時時達到高峰。然后緩慢下降，在24小時時基本恢復到初始水平。表明RA的關節滑液具有刺激正常人單個核細胞和CD4+T細胞中GADD45β表達上調的作用(圖6)。由于關節滑液中含有豐富的IL-12和IL-18，而IL-12和IL-18是GADD45β表達的有效誘導劑。此外，關節滑液中還含有TNF-α，IFN-γ，這些細胞因子均具有上調GADD45β表達的作用。因此，病變的關節滑液通過多種混合的細胞因子，誘導GADD45β的表達。
試驗中，為了闡明GADD45β蛋白的過表達是否和類風關滑膜組織及外周血的炎癥環境和細胞因子的關系，首先用用ELISA方法檢測5種細胞因子濃度，在RA患者關節液和自身配對血清及正常對照血清中檢測IL-18、IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ。RA關節液和血清中IL-18和IL-12濃度比正常對照血清明顯增高(p＜0.01)，而關節滑液中的TNFa和IFNr比RA患者血清高，即正常人血清要高。這一結果首先提示RA患者關節液中2種細胞因子的表達與T細胞GADD45β蛋白的表達相關，即；IL-12/18能刺激GADD45β蛋白的表達。IL-12/18刺激GADD45β蛋白的表達也主要在CD4+T細胞而不是CD8+T細胞。IL-12/18刺激CD4+T細胞，ELISA檢測培養上清中IFN-γ濃度顯著增加，與GADD45β蛋白的表達水平相關。IL-12/18刺激GADD45β蛋白表達的呈劑量依賴的方式并能部分被抗IL-12/18抗體所阻斷，說明關節液中的IL-12/18的確或至少部分能誘導GADD45β蛋白的表達。
由于類風關患者外周血中IL-12/18的水平也比正常人顯著增高，試驗結果與滑膜液刺激的相似.這說明在中，晚期病人體內，全身性的炎癥因子的增高，對于T細胞，尤其是CD4+T細胞的活化和效應的發揮是必需的。GADD45β蛋白起到銜接和放大作用，也是類風關全身癥狀產生的機制之一。
(c)誘導GADD45β蛋白表達能夠延長T細胞在體外存活的時間在上述試驗中，除了分析關節滑液對GADD45β表達上調的作用之外，還分析了與GADD45β表達上調的作用的相應結果，即細胞在體外存活的時間和相關蛋白表達。
將1∶8稀釋的RA-SF分別加到隨機選擇的6個正常人和6個RA病人(年齡、性別相對應)的PBMC和CD4+T細胞中。在不同的時間收取細胞進行Avinnex V和PI染色觀察細胞凋亡情況，同時以正常人血清作為對照。結果發現，加有以1∶8比例稀釋的滑膜液的細胞中，細胞出現凋亡的比例明顯低于對照組細胞。提示RA患者關節液具有維持正常人外周血中單個核細胞及CD4+T細胞在體外存活時間的作用。而對于目前公認的與細胞凋亡有關的基因表達情況進行分析，發現加入RA患者關節液具有上調正常人外周血中單個核細胞及CD4+T細胞Fas蛋白的表達，而對FasL的表達無明顯影響。用Fas和FasL的特異性單抗染色也證實了同樣結果。這一結果被用GADD45βSiRNA特異性干擾后的結果得到了驗證。圖10表明在用GADD45β特異性SiRNA干擾后，Fas表達也幾乎消失，但FasL表達無明顯變化。表明關節滑膜液可能通過上調細胞Fas表達，活化炎性細胞，而不促進其FasL表達結果，使其維持活化狀態而持續在局部的存活，導致局部炎癥和組織損傷。
(d)誘導GADD45β蛋白表達具有上調RA病人炎癥因子表達的作用在上述試驗中，伴隨著關節液刺激RA患者外周血中單個核細胞及CD4+T細胞誘導GADD45β蛋白表達，這些細胞中的IL-12、IFN-r的表達上調，而IL-10的表達沒有明顯變化。如圖9所示，加有以1∶8比例稀釋的滑膜液的細胞中，IL-12，TNF-α，IFN-r的表達量隨著細胞與滑膜液孵育的時間增加而表達，在24小時時達到高峰。而相比之下，IL-10的表達無明顯變化。但是，當用關節液刺激正常人外周血中單個核細胞及CD4+T細胞誘導GADD45β蛋白表達時，這些細胞中的IL-10表達上調，而IL-12、IFN-r的表達沒有明顯變化。提示，正常人單個核細胞或CD4+T細胞在受到病灶滑膜液的刺激時，可以通過合成釋放IL-10而抵抗炎癥因子的作用，起到保護機體不受滑膜液的活化的作用。而RA病人的單個核細胞或CD4+T細胞對滑膜液的刺激作用十分敏感，表現為迅速合成釋放炎癥因子，加劇病灶的炎癥作用。這種不同的反應格局，提示RA病人的調控發生紊亂。而炎癥因子的合成增加直接與GADD45β的表達呈正相關，這點在GADD45β SiRNA特異性試驗中得到證實。圖10表明在用GADD45β特異性SiRNA干擾后，炎癥因子IL-12，TNF-α，IFN-γ表達降低，淋巴細胞凋亡增加。
GADD45β蛋白是與細胞生存，分化和死亡密切相關的蛋白質.尤其在應激狀態下，可以活化細胞內許多激酶，包括MAPKs途徑的ERK，P38，以及JNK，來調節細胞的生長阻滯，損傷后修復.同時也是介導TGF-β功能的主要分子。在不同細胞中的功能也不相同。在T細胞中，是介導T細胞向Th1分化，分泌IFN-γ的關鍵分子。本發明結果證實了這一點。
討論到目前為止，RA的病原和發病機制仍然不完全清楚。除了T細胞、B細胞和補體等因素的參與之外，在RA關節滑膜液中還存在許多促炎癥因子和細胞凋亡抑制因子。它們相互作用形成一個復雜的調控網絡，在RA的形成和發展中起重要作用。針對TNF-α的治療在臨床所取得的療效已經充分證實了炎癥因子的重要性。在RA關節滑膜液中找出一個維持這種調控網絡的關鍵性的炎癥因子對于認識RA的發病過程和開發新的治療手段是有重要意義的。本研究首次對GADD45β在RA病人的表達情況作了系統研究，并對GADD45β與其它細胞因子間的作用和炎性細胞的凋亡作了深入研究。這些發現既有助于認識GADD45β在RA中的作用，也有助于認識它在其它炎癥反應中的作用。
至今由于對自身反應性Th1細胞的早期活化研究較少，人們只是粗略知道T細胞被自身抗原活化而最終導致自身免疫病，但是究其調節機制知之甚少。如哪些蛋白或調控基因控制著自身反應性T細胞活化？是什么導致了自身反應性T細胞向Th1方向極化而導致了Th1/Th2平衡失調？調節Th1細胞早期活化因子是什么？這些活化的T細胞是如何在體內維持的？這些問題我們至今不能回答。而研究回答這些問題對于不僅對闡明RA乃至自身免疫病的發病機理有重要的理論意義，并且對于尋找RA生物治療的靶點、新型藥物的研發均具有重大的理論意義和應用價值。
本發明中，首先設計實驗來估計GADD45β蛋白的異常表達與RA患者滑膜與外周血中CD4+T細胞活化，分化和效應間的關系，以及和細胞因子的關系。然后闡明在類風關滑膜中誘導GADD45β蛋白過表達的細胞因子和GADD45β蛋白在介導T細胞分泌IFN-γ等中的作用。
研究結果表明GADD45β蛋白在RA病人滑膜和外周血T細胞中的表達顯著升高，與病程相關，并CD4+T細胞的表達較CD8+T細胞高，可以作為病情判斷和預后評價的依據。在RA患者外周血和滑膜液中單個核細胞中檢測到GADD45β表達量比正常人外周血中的GADD45β表達量高出8倍以上。更有意義的是，因為外周血的獲取和檢查更加實際，這為類風關的監測提供了可能。與類風關相關的炎癥因子IL-18和IL-12在滑膜和血清中的表達均增加，且與GADD45β蛋白的增加水平相關。更為阻斷GADD45β蛋白的表達和其介導的炎癥因子的產生以及其它的眾多功能，提供了可能。
序列表<110>上海交通大學醫學院<120>GADD45β蛋白及其相關細胞因子在類風濕關節炎中的應用<130>demo<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>19<212>RNA<213>合成的<220>
<223>primer<400>1gaaggtgaag gtcggagtc19<210>2<211>20<212>RNA<213>合成的<220>
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<220>
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權利要求
1.一種GADD45β蛋白及其相關細胞因子在類風濕關節炎中的用途，用于制備檢測或輔助檢測類風濕關節炎的試劑，其中，所述的試劑包括GADD45β蛋白和細胞因子、GADD45β蛋白下游激酶中的一種或其組合，所述相關細胞因子包括上調GADD45β表達的作用IFNγ、TNFα和GADD45β表達的有效誘導劑IL-12，IL-18。
2.利用權利要求1所述的用途制備的一種試劑盒，它含有容器和位于容器內的檢測GADD45β核酸或蛋白含量的試劑，所述的檢測GADD45β核酸和蛋白含量的試劑是特異性擴增GADD45β蛋白的寡核苷酸引物或特異性抗GADD45β蛋白的抗體，所述引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEO ID NO.4，其中，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2分別為GAPDH的上游和下游引物；SEQID NO.3、SEQ ID NO.4為GADD45 β的上游和下游引物。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，含有檢測下游激酶狀態的試劑，其中所述的激酶選自激酶包括MAPKs的ERK、P-38和JNK，而所述的檢測下游激酶狀態的試劑是特異性抗磷酸化激酶的抗體。
4.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還含有檢測IL-12/18，TNF-α或IFN-γ中一種或其組合含量的試劑。
5.利用權利要求1所述的用途檢測類風濕關節炎的方法第一，患者和實驗材料準備收集RA患者，所有患者均符合美國風濕病學會的診斷標準；完整配對樣本中，每位患者有外周血、關節液和關節滑膜組織，另外一組例配對樣本有關節液和血清，但不含細胞；對照T細胞和血清來自健康志愿者，性別和年齡與RA組相似；滑膜組織來自滑膜切除術或關節鏡手術，組織切成小塊，分離單個核細胞或立即勻漿抽提RNA；關節液3000rpm離心3分鐘收集上清立刻-80℃保存；Ficoll分離RA患者關節液和外周血得單個核細胞，立即進行細胞培養，或直接用于RNA抽提；第二，RNA抽提和定量PCR用Qiagen公司Rneasy Mini試劑盒抽提總RNA，在純化RNA過程中用DNA酶消化基因組DNA，RNA-80℃保存，用RT試劑盒逆轉錄RNA樣本，在cDNA合成中用隨機引物；用定量PCR SYBR方法檢測GADD45β蛋白的mRNA表達，其特異性引物序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4；熱循環條件包括起始50℃ 2分鐘，隨后95℃ 10分鐘，2步PCR循環包括95℃ 15秒，60℃ 60秒，40個循環；數據收集，ABI7900對資料作定量分析；以GAPDH基因作為內參，標本定量以GAPDH表達倍數表示；每個標本復孔平均值以閾值計算和表達；基因表達量用樣本CT值和內參GAPDH CT值的差值來表示，相對量表達以ΔΔCT計算，基因相對表達量為2-ΔΔCT；第三，ELISA檢測外周血與關節液細胞因子蛋白含量用ELISA Kit定量檢測血清和關節液中的細胞因子濃度；首先用純化的抗細胞因子小鼠抗體包板，洗滌后用含10％胎牛血清的PBS封閉非特異性結合位點1小時，隨后洗滌；關節液或血清和標準品一起用PBS稀釋后加入，每份標本均作雙復孔；板孵育2小時，隨后用PBS-T洗滌；加入生物素結合的檢測抗體孵育2小時；洗滌后，加入Avidin結合的辣根過氧化物酶和3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺(3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine)顯色，以合適波長檢測，用計算機軟件定量分析細胞因子濃度；第四，滑膜組織單細胞懸液制備手術取下的滑膜組織立即放入含有10％胎牛血清和1％青鏈霉素的完全RPMI介質中，剪成小塊后攆磨，用含有10％胎牛血清和1％青鏈霉素的完全RPMI介質反復沖洗，用70μm尼龍網過濾得到單細胞懸液；第五，CD4+和CD8+T細胞的分離和純化將收集的細胞用含2％胎牛血清(FCS)的PBS洗滌一次，并按1×107cell/ml的濃度重懸在含2％FCS的PBS中；然后用Dynal beads陽選出CD2+，CD4+和CD8+T細胞；分離后，用流式細胞儀，檢測這些細胞中含CD2+，CD4+和CD8+T細胞的比例；陽選出的細胞一部分用來作純度分析，其余的用來抽提RNA并做實時PCR檢測；第六，T細胞刺激RA和正常人的PBMC，磁珠分離T細胞和CD4+T細胞后按每孔1×106個的數量放在24孔板上培養，用含10％的FBS和100U/ml青霉素和鏈霉素的RPMI 1640進行培養；再用RA-SF的刺激實驗中，在培養液中加入RA-SF，以1∶8稀釋；使用時，所有的RA-SF都要用過濾器除菌；細胞在37℃，5％CO2的培養箱中培養2、4、8、16、24小時后收集；細胞收集后做實時定量PCR分析；在阻斷實驗中，抗人IL-12的單克隆抗體和同型對照抗體以10μg/ml的濃度加到用SF刺激的PBMC的培養液中；然后按照上面所述的過程處理；第七，特異性SiRNA干擾試驗，用GADD45β特異性SiRNA對細胞進行干擾將新鮮分離的人單個核細胞(human peripheral blood mononuclearcells，PBMC)用GADD45β特異性SiRNA轉染后，在37℃，5％CO2培養箱中培養5-7小時，然后加含等體積的20％FBS和含抗生素的1640營養液繼續培養24-48小時。取培養的細胞做實時定量PCR，檢測干擾的效果；最后，各組之間基因表達的差異情況采用曼-惠特尼U檢驗分析，P值小于0.05表示有顯著性差異。
6.利用權利要求1建立的一種篩選治療類風濕關節炎和抗腫瘤的藥物的方法，其特征在于，包括步驟(a)設立實驗組和對照組，所述的實驗組由2-50個非人哺乳動物類風濕關節炎模型構成，而對照組由1-50個非人哺乳動物類風濕關節炎和模型構成，并且對于對照組不施用候選物質；(b)將候選物質施用于實驗組，并觀察實驗組動物中GADD45β核酸和蛋白的水平，并與對照組的動物中的GADD45β核酸和蛋白進行比較，其中與對照組相比實驗組動物中GADD45β核酸和蛋白水平下降不小于30％，就表示該候選物質是潛在的治療類風濕關節炎的藥物。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于其中與對照組相比實驗組動物中GADD45β核酸和蛋白水平下降不小于50％，就表示該候選物質是較佳的治療類風濕關節炎的藥物。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于其中與對照組相比實驗組動物中GADD45β核酸和蛋白水平下降不小于60％，就表示該候選物質是更佳的治療類風濕關節炎的藥物。
9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于其中與對照組相比實驗組動物中GADD45β核酸和蛋白水平下降不小于70％，就表示該候選物質是最佳的治療類風濕關節炎的藥物。
10.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中還包括進一步比較實驗組動物和對照組蛋白中GADD45β蛋白或IL-12的表達水平，所述的GADD45β蛋白下游激酶選自MAPKs途徑的ERK、P-38和JNK，其中與對照組相比實驗組動物中激酶活化水平或IFN-γ，或IL-12水平下降不小于30％，就表示該候選物質是潛在的治療類風濕關節炎的藥物。
全文摘要
本發明涉及GADD45β蛋白及其相關細胞因子在類風濕關節炎中的應用，尤其是涉及GADD45β蛋白及其相關細胞因子在生物檢測和診斷方法的用途，具體地說，本發明涉及一種在類風濕關節炎的發病過程中起重要作用的蛋白－GADD45β蛋白及其相關的細胞因子、下游的激酶和抑制劑在診斷或治療類風濕關節炎上的用途。本發明還提供了相應的診斷試劑盒。一種GADD45β蛋白及其相關細胞因子在類風濕關節炎中的用途，用于制備檢測或輔助檢測類風濕關節炎的試劑，其中，所述的試劑包括GADD45β蛋白和細胞因子、GADD45β蛋白下游激酶中的一種或其組合，所述相關細胞因子包括上調GADD45β表達的作用IFNγ、TNFα和GADD45β表達的有效誘導劑IL－12，IL－18。
文檔編號C07K14/435GK101093221SQ200710004549
公開日2007年12月26日 申請日期2007年1月8日 優先權日2006年3月13日
發明者李寧麗, 張冬青, 王利, 何東儀, 沈佰華 申請人:上海交通大學醫學院