專利名稱：：鞘氨醇磷酸膽堿拮抗劑用于恢復抗微生物肽的表達的用途的制作方法
技術領域：
：.本發明涉及使用鞘氨醇磷酸膽堿(sphingosylphosphorylcholine，SPC)拮抗劑用于例如在特應性皮炎患者的皮膚中恢復抗微生物肽(AMP)的表達水平的方法、SPC拮抗劑在制備用于恢復AMP表達的藥物中的用途、以及迎過分析候選化合物恢復AMP的表達水平的能力篩選SPC拮抗劑的方法。
背景技術：
：鞘氨醇磷酸膽堿(SPC)是溶性鞘脂(lysosphingolipid)家族成員，具有下式的N-脫酰鞘磷脂(N-deacylatedsphingomyeline)形式。化學式1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>SPC是通過SMN-脫酰酶從鞘磷脂(sphingomyelin,SM)生成的一種促分裂原(HiguchiKetal.，歷ocAe附./(2000),350,747-756)，并丘已知在C^+從內質網釋放中發揮作用，也參與細胞生長、增殖(Desaietal.,Bzoc/ie肌5!'o//z".^饑Co/wwww.(1991),181,361-366)和凋亡(JeonESetal.,Bfoc/wm歷o//^4cto.(2005)，1734(1);25-33)。特別地，已證明SPC在各種細胞中影響細胞重建或細胞遷移。例如，化、形態發生和黑素原生成(Be堪eretal.，戶roc.JVarf.爿caof.5W.￡/,S.A(1995)，92，5885-5889)。最近一些報道已經顯示1)在得自特應性皮炎(AD)忠者的角質層中SPC的表達與健康對照對象相比顯著增強(ReikoOkamotoetal.，Jowrwa/0/丄z》W及ejea/r/(2003)，44，93-102)，2)在AD患者的表皮中SM脫酰酶的活性異常地高(HiguchiKetal.,B/ocAe肌/(2000)，350747-756)，和3)—些皮膚屏障功能的病變是通過鞘磷脂酶合成酰胺的水平降低導致的(JunkoHaraetal.，/De/vw。to/.(2000)，115,406-413)。然而，迄今為止沒有關于增強的SPC農達導致皮膚病(例如AD)的機制的報道。抗微生物肽(AMP)是具有預防--些病原體(例如細菌、病毒和效-菌)感染的抗微生物活性的小分子量肽(GanzTetal.,C";rQp/"./m/mwo/.(1994)，6，584-589)。已證明AMP誘導血管發生、傷口愈合和趨化性(IzadpanahAetal"^m.y4cadDerwato/.(2005),52，381-390)，并具有帶正電和擁有親水性和疏水性殘基的結構特征。近來，已經確認金黃色葡萄球菌(S.在患有AD的患者的炎癥皮膚中的異常生長是由已知為AMP的人P-防衛素(HBD-2)和Cathelicidin(LL-37)的表達降低導致的，特別地，HBD-2和LL-37在特應性損傷中的表達水平顯著低于在銀屑病損傷中的表達水平(OngP.Y.etal.，WJ.Med(2002),347,1151-1160)。人防衛素可根據其結構特征分為a和p防衛素。a防衛素是富含精氨酸的單體多肽，每種多肽由大約30-35個氨基酸組成，并且在人體中已經鑒別了其6種同種型(HNP-1至4、HI>5和HD>6)。在p-防衛素的情形中，每種多肽由大約41-50個氨基酸組成，并且在人血清中已經通過生化手段鑒別了11種同種型(歷oc/;e/m'W7am/A/o/ecw/ar歷o/ogv;Vewj(2006)，1-7)，迄今為止通過人類基因組項目己經鑒別了28個人P-防衛素基因和43個小鼠p-防衛素基因(B.C.Schutteetal.,尸raceWwgso/決eiVariowa/i4cacfe/w;yo/S"'e"c&s(2002)，99,2129-2133)。在這些已經被報道在AD患者的皮膚中表達被抑制的人P-防衛素(HBD)中，HBD-1主要在腎臟、女性生殖器官、呼吸器官、胰臟、牙齦、舌和鼓膜的上皮細胞中表達；而HBD-2在皮膚、肺、呼吸道、牙齦和鼓膜中表達，但是在泌尿器官(例如腎臟和膀胱)以及唾液腺「l，完全缺乏(J.Harderetal.,A^/MW(1997)，387,861)。另外，HBD-3在皮膚中表達，而HBD-4在男性生殖器官和胃中表達。HBD-1和HBD-3組成型表達；而大多數HBD(包括HBD-2和HBD-4)的表達是誘導型的，僅僅應答特定條件例如感染(J.M.Schroderetal.，/wf./fi/oc/;e附.CW/歷o/.(1999)，31,645-651)。在這些誘導型HBD中，已經提示HBD-2的表達被NF-kB通過MEK1/2-ERK1/2信號途徑上調(Tsutsumi-IshiiYetal.，/￡ew&c.歷o/.(2002)，71,154-162)，并被TNF-ct、IL-la、IL-卩或LPS增強(KWChaetal.,_/Va//.」cadScf.(2000)，97，3016-3021)，因為//5￡>-2基因啟動子區域包含NF-icB結合位點。另外，己經報道HBD-4的表達可被微生物(例如肺炎鏈球菌(S./w//wo"/fle))通過PMA-PKC信號途徑誘導(J.R.Garciaetal.，化S五5J(2001),15,1819-1821)，HBD畫3的表達水平可應答于TNF-a、IL-ip和IFN-"y而提高。因此，本發明人努力確定特應性皮炎的病理學機制，并且發現SPC顯著地降低AMP(特別是HBD-1至-4(屬于人防衛素P家族，并且已經報道其表達在AD患者的皮膚中降低)、Cathelicidin(LL-37)和Dermcidin)的表達
發明內容技術問題因此，本發明的一個目的是提供一種用于在抗微生物肽(AMP)表達降低的哺乳動物中將AMP的表達恢復至有效水平的方法。本發明的另一個目的是提供鞘氨醇磷酸膽堿(SPC)拮抗劑在制各用于恢復哺乳動物屮AMP的表達的藥物中的用途。本發明的另一個目的是提供一種篩選用于恢復AMP的表達的候選物的有效方法。技術方案根據本發明的一個方面，提供了用于在需要恢復AMP表達的哺乳動物中恢復AMP的表達的方法，包括將SPC拮抗劑以治療劑量施用給所述哺乳動物的歩驟。根據本發明的另一個方而，提供了SPC拮抗劑在制備用于在需耍恢復AMP表達的哺乳動物中將AMP的表達恢復至正常水平的藥物中的用途。根據本發明的另-一個方而，提供了用于篩選SPC拮抗劑的方法，包括步驟I)用SPC或其衍生物處現對象以下調AMP的表達;2)用SPC拮抗劑候選物處現所述對象并分析在所述對象中AMP表達的恢復水平。當與所附附圖聯系起來時，本發明的上述及其他目的和特征從本發明的如下描述中顯而易見，所述附圖分別示出圖1:RT-PCR分析結果，顯示HaCaT細胞中HBD-1至-4、hCAP-18/LL-37和DCD的mRNA表達水平(組成型或被TNF-a誘導)以SPC劑量依賴性方式被抑制；圖2:RT-PCR分析結果，顯示HaCaT細胞中HBD-2、HBD-3和DCD的mRNA表達水平(組成型或被PMA誘導)以SPC劑量依賴性方式被抑制；圖3:RT-PCR分析結果，顯示HaCaT細胞中HBD-2和HBD-3的mRNA表達水平(被TNF-a誘導并被SPC抑制)通過給予2-氨基-2-辛基羥甲基-丙烷-1，3-二醇或N-(2-(萘-2-基氧基)乙基)丙-2-烯-l-胺恢復以及圖4:免疫組化測定結果，顯示ICR小鼠中HBD-1和HBD-2的蛋白質表達水平(被PMA誘導并被SPC抑制)通過給予2-氨基-2-辛基輕甲基-丙烷-l，3-二醇或N-(2-(萘-2-基氧基)乙基)丙-2-烯-l-胺恢復至正常水平。具體實施例方式在本發明的方法中使用的用于將AMP的表達恢復至正常水平的SPC拮抗劑可以是任何一種已知能夠抑制SPC的活性或拮抗SPC下調AMP表達的機制的SPC拮抗劑。SPC拮抗劑的代表性實例包括與SPC活性位點結合的競爭性抑制劑、與SPC活性位點之外的其他位點結合以使活性位點失活的非競爭性抑制劑、SPC細胞內定位的抑制劑、降解SPC或誘導SPC降解的物質、以及SPC誘導的AMP表達下調途徑的阻斷劑。在木發明中，所述SPC拮抗劑可以經全身或局部施用給需要恢復AMP表達的對象，例如忠有與AMP表達降低相關的病變(例如特應性皮炎(AD))的哺乳動物，包括人。本發明的方法中的SPC拮抗劑合適的單次劑量可以根據各種相關因素(包括待治療的疾病、施用途徑、患者的年齡和體重、以及患者癥狀的嚴重性)確定。進一步地，本發明提供了一種用于篩選可行的SPC拮抗劑的方法，包括步驟I)用SPC或其衍生物處理對象以下調AMP的表達;和2)用SPC拮抗劑候選物處理所述對象并分析所述對象中AMP表達的恢復水平。在本發明的方法中，所述對象可以是受試細胞或哺乳動物。所述受試細胞可以是任何一種表達AMP或能夠針對誘導性物質應答性表達AMP的已知細胞，優選角質形成細胞；所述哺乳動物可以是嚙齒動物例如小鼠、大鼠或旱獺，優選無毛小鼠。根據本發明的一個實施方式，在步驟1中，可以將SPC或其衍生物以從大約lnM至大約40mM(從大約0.002°/。(w/w)至大約2%(w/w))的濃度范圍施用給對象。當濃度低于nM時，無法實現所希望的對AMP表達的抑制當濃度高于40mM時，受試細胞可能發生形態改變，或在哺乳動物中可能出現副作用。進一步地，當AMP顯示誘導型表達時，例如在本發明的方法的分析中使用HBD-2和HBD-4吋，可以進一步包括在步驟1的SPC處理之前或同吋用AMP表達的誘導性物質處理對象。所述AMP表達的誘導性物質可選自由Ca2+、TNF-a、IL-ip、IFN"T和佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(PMA)組成的組，優選TNF-a和PMA。在步驟2中，可用SPC拮抗劑候選物處理在步驟1中進行AMP表達下調的對象，并分析AMP表達的恢復水平。可以使用一種已知用于測量基因或蛋白質表達的方法分析AMP的表達水平。例如，可通過RT-PCR或印跡分析(例如RNA印跡)并使用它們的基因或其片段作為探針分析AMP的基因表達；可以使用抗AMP的抗體通過進行酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(R1A)、三明治測定(sandwichassay)、蛋白質印跡、免疫印跡或免疫組化染色法分析AMP的蛋白質表達。SPC顯著降低已有報道在特應性皮炎忠者體內被抑制的人|3-防衛素(HBD-1、HBD-2、HBD-3和HBD-4)、Cathelicidin(LL-37)和Dermcidin的表達。因此，SPC拮抗劑可用于預防和治療與AMP的表達降低相關的病變例如特應性皮炎，并且可以通過分析AMP基因或蛋白質表達的恢復水平而有效地篩選可行的SPC拮抗劑。以下實施例用于進一步闡明本發明而不限制其范圍。進一步地，以下給出的固體在固體混合物中的百分比、液體在液體中的百分比、以及固體在液體中的百分比分別是基于wt/wt、vol/vol和wt/vol表示的；并且所有反應均在室溫進行，除非另外特別說明。參考實施例AMP的表達水平的分析在如下實施例中，通過進行多于3次的RT-PCR((94。C，1min;51~60°C，lmin:72。C，2min)50次循環；引物濃度5pmoI/反應，模板含量50ng/反應)分析受試細胞和對照細胞中AMP的mRNA表達模式，所述RT-PCR使用特異于人防衛素家族(HBD-1至-4)、Cathelicidin(hCAP-18/LL-37)、Dermcidin(DCD)的基因的引物，GAPDH作為對照。所使用的引物序列列于表l。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>通過掃描所得的RT-PCR照片估計各個條帶密度并使用student'st檢驗檢驗估計的密度值，檢測AMP的mRNA表達水平。只有當受試組和對照組的估計p值小于0.05吋才認為受試細胞和對照細胞之間的差異是顯著的。實施例l:SPC降低AMP表達的分析(1)受試細胞中的分析將人角質形成細胞系HaCaT(Dr.N.E.Fusenig，DuetschesKrebsforschungszentrum，Heidelberg,Germany)以1乂105個細胞/孔的量接種于6孔平板，并于37。C和5。/dC02的條件下，在添加了10%胎牛血清(FBS)和1%抗生素(青霉素-鏈霉素，Gibco，USA)的Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM，GibcoBRL)中培養24小時。將一些培養的細胞用20ngTNF-a或者40或80nM佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(PMA)處理以誘導呈現誘導型表達的AMP的表達，同吋加入0、1、10或20pMSPC。一些培養的細胞不進行處理(對照細胞)。與參考實施例的方法一樣，對受試細胞和對照細胞進行RT-PCR，以分析其AMP的mRNA表達水平，作為SPC處理濃度的函數。結果示于圖1和2。如圖1和2所示，HBD-1至-4、hCAP-18/LL-37和DCD的mRNA表達水平在HaCaT細胞中以SPC劑量依賴性方式被顯著抑制。特別地，HBD-2、HBD-3和DCD的mRNA表達水平被SPC處理明顯地抑制。(2)受試動物中的分析將8周齡大、體重大約為25~30g雄性的ICR小鼠(CharlesRiverLaboratories,MA，USA)用20pl于丙酮中的PMA(2.5pg/nl)對其耳朵、背部和腹部區域的皮膚進行處理以誘導AMP的表達，同吋，給這些小鼠中的一部分分別應用20^1的0.1%或1%SPC，6小吋之后進行同樣的SPC處理。給一些不用PMA處理的小鼠僅應用丙酮(對照組)。24小吋后，從被處理的皮膚以6mm的穿刺(punching)收集組織樣品，每一樣品中包埋在OCT(最佳切割溫度)化合物中并于-20'C冷凍。將每一冷凍組織樣品切成4nm厚的切片，固定在載玻片上，并于室溫與抗-HBD-l或抗-HBD-2抗體(Santacruse，USA)—起溫育超過1小時。對每…個獲得的樣品用Envision試劑盒(DAKO，USA)進行免疫組化分析。結果示于圖4((a)至(d))。如圖4((a)至(d))屮的結果所示，在ICR小鼠皮膚中HBD畫1和HBD-2的蛋白質表達以SPC劑量依賴性方式顯著降低。實施例2:通過分析AMP表達的恢復水平篩選SPC拮抗劑(1)受試細胞中的分析將HaCaT細胞以1"05個細胞/孔的濃度接種于6孔平板，并于37°C和5%C02的條件下在添加了10%FBS和1%青霉素-鏈霉素(Gibco)的DMEM中培養24小時。將培養的細胞用20ngTNF-a處理以誘導HBD-2的表達，同時加入lO[iMSPC以抑制AMP表達。之后，每一組用0、0.1、1或10ppm的2-氨基-2-辛基羥甲基-丙烷-l，3-二醇或N-(2-(萘-2-基氧基)乙基)丙-2-烯-1-胺處理。一些培養的細胞不進行處理(對照細胞)，或僅用20ngTNF-a或10nMSPC進行處理。根據參考實施例的方法，對受試細胞和對照細胞進行RT-PCR，以確定HBD-2和HBD-3的mRNA表達水平。結果示于圖3。如圖3所示，HBD-2和HBD-3的mRNA表達在用2-氨基-2-辛基羥甲基-丙烷-l，3-二醇或N-(2-(萘-2-基氧基)乙基)丙-2-烯-l-胺處理的受試細胞中顯著恢復。因此，這些結果提示可以通過本發明的方法容易地檢測到SPC拮抗劑。(2)受試細胞中的分析將20nlPMA(2.5pg/nl)應用于8周齡大、體重大約為25~30g的毎只雄性ICR小鼠的耳朵、背部和腹部區域的皮膚以誘導HBD-1和HBD-2的表達，同吋應用2(^1的1°/。SPC以抑制AMP表達。用20^1的1%2-氨基-2-辛基羥甲基-丙烷-1,3-二醇或N-(2-(萘-2-基氧基)乙基)W-2-烯-l-胺處理這些小鼠中的一部分，6小吋之后進行同樣的SPC處現。24小時后，從被處理的皮膚以6mm的穿刺收集組織樣品，包埋在OCT(最佳切割溫度)化合物中，并于-20'C冷凍。將每一冷凍組織樣品切成4Mm厚的切片，固定在載玻片上，并于室溫用抗-HBD-l或抗-HBD-2抗體(Santacruse，USA)溫育超過1小時。對每一樣品用Envision試劑盒(DAKO，USA)進行免疫組化分析，結果示于圖4((d):柳。如圖4((d)至(f))中的結果所示，在用2-氨基-2-辛基羥甲基-丙烷-1，3-二醇或N-(2-(萘-2-基氧基)乙基)丙-2-烯-l-胺處理的受試組中，被SPC抑制的HBD-1和HBD-2的表達水平恢復至正常水平。因此，這些結果提示可以通過本發明的方法容易地檢測到SPC拮抗劑。雖然根據上述特定實施方式對本發明進行了描述，但是應當認識到本領域技術人員可以對本發明進行各種修飾及改變，這些修飾及改變也落入由所附權利要求書所限定的本發明的范圍。權利要求1.鞘氨醇磷酸膽堿拮抗劑在制備用于在需要恢復抗微生物肽的表達的哺乳動物中將抗微生物肽的表達恢復至正常水平的藥物中的用途。2.權利要求^的用途r其中所述"氨醇磷酸ii:堿拮抗劑通過抑制鞘敏醇磷酸膽堿的活性或拮抗鞘氨醇磷酸膽堿下調抗微生物肽表達的途徑而恢復抗微生物肽的表達。3.權利耍求2的用途，其中所述鞘氨醇磷酸膽堿拮抗劑選自山與鞘氨醇磷酸膽堿活性位點結合的競爭性抑制劑、與鞘氨醇磷酸膽堿活性位點之外的其他位點結合以使活性位點失活的非競爭性抑制劑、鞘氨醇磷酸膽堿細胞內定位的抑制劑、誘導鞘氨醇磷酸膽堿降解的物質、鞘氨醇磷酸膽堿誘導的抗微生物肽表達下調途徑的阻斷劑、及其混合物組成的組。4.權利耍求1的用途，其，l'所述哺乳動物患有特應性皮炎。5.權利要求1的用途，其中所述鞘氨醇磷酸膽堿拮抗劑經全身或局部施用給所述哺乳動物。6.—種用于篩選鞘氨醇磷酸膽堿拮抗劑的方法，包括步驟1)用鞘氨醇磷酸膽堿或其衍生物處理對象以下調抗微生物肽的表達；和2)用鞘氨醇磷酸膽堿拮抗劑候選物處理所述對象并分析所述對象中抗微生物肽表達的恢復水平。7.權利要求6的方法，其中所述對象是受試細胞或除人以外的哺乳動物。8.權利要求7的方法，其中所述受試細胞表達抗微生物肽或能夠針對誘導性物質應答性表達抗微生物肽。9.權利要求8的方法，其中所述受試細胞是角質形成細胞。10.權利要求7的方法，其中所述哺乳動物是小鼠、大鼠或早獺。11.權利要求6的方法，其中在步驟1中，將鞘氨醇磷酸膽堿或其衍生物以從lnM至40mM的濃度施用給所述對象。12.權利要求6的方法，進一步包括在步驟1的鞘氨醇磷酸膽堿處理之前或同時用抗微生物肽表達的誘導性物質處理對象。13.權利要求12的方法，其中所述誘導性物質選自由Ca2+、TNF-a、1L-ip、IFN-y、佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(PMA)、及其混合物組成的組。14.權利要求6的方法，其中在步驟2中通過測定抗微生物肽的基因或蛋白質表達水平分析抗微生物肽表達的恢復水平。15.權利要求14的方法，其中所述抗微生物肽的基因或蛋白質表達水平通過選自由逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)、RNA印跡、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、三明治測定、蛋白質印跡、免疫印跡、免疫組化染色法及其組合組成的組的方法測定。全文摘要SPC抑制特應性皮炎患者體內的人β防衛素(HBD-1、HBD-2、HBD-3和HBD-4)、Cathelicidin(LL-37)和Dermcidin的表達，因此，SPC拮抗劑可用于預防和治療與AMP表達降低相關的病變。文檔編號C07K1/00GK101443347SQ200680054636公開日2009年5月27日申請日期2006年12月8日優先權日2006年5月18日發明者成基士,成大石,樸鍾喜,李昌勛,趙仙娥,赫金,金亨俊,金光美,金大權,金正鑄申請人:株式會社Amorepacific