專利名稱：：多價嵌合ospc疫苗原及診斷抗原的制作方法
技術領域：
：總的來說，本發明涉及萊姆氏病的疫苗和診斷。具體來說，本發明提供了嵌合的多價重組蛋白，其含有與哺乳動物感染有關的外表面蛋白(OspC)C類型的環5區和/或a螺旋5區/結構域的優勢免疫表位。
背景技術：
：萊姆病(Lymedisease)是北美和歐洲最常見的節肢動物傳播的疾病。它由螺旋體伯氏疏螺旋體(5orre/&^rgJo/^n')、伽氏疏螺旋體(AgaA7T^)和埃氏疏螺旋體(及a/ze")引起。哺乳動物的傳播通過被感染的硬蜱屬蜱的叮咬發生[Burgdorfer等，1982，Benach等，1983]。萊姆氏病有相當高的發病率，在美國和歐洲的某些地區，每年有多達3%的人口受到感染[Fahrer等，1991]。感染導致了多系統的炎性疾病，其早期癥狀可能包括游走性紅斑、低燒、關節痛、肌肉痛和頭痛[Steere等，1977a]。晚期臨床表現可以嚴重，部分可能包括關節炎[Steere等，1977a;Eiffert等，1998;Steere等，2004]、心臟炎[Asch等，1994;Nagi等，1996;Barthold等，1991]和神經性并發癥[Nachman禾[JPontrelli,2003;Coyle和Schutzer2002]。此夕卜，萊姆病具有顯著的社會-經濟成本，表現為由于擔心接觸蜱而減少戶外娛樂和社會活動。藥物經濟學研究表明，對萊姆病疫苗存在著明確的需求，特別是在每年發病風險超過1%的人群中[Meltzer等，1999;Shadick等，2001]。但是，目前還沒有商業化的疫苗可用。第一個人類萊姆病疫苗是基于OspA的LYMErix(GlaxoSmithKline);但是，它的使用期短，導致銷售下降，在2002年自動撤出了市場。銷售的下降可以追溯到對可能的副作用的真正的或感覺上的顧慮，這些副作用包括在HLA-DR4陽性的受者中理論上可能發生的慢性炎性關節炎[Kalish等，1993]。盡管正在開發新的基于OspA的疫苗原以減輕這種潛在的并發癥[Koide等，2005;Willett等，2004]，但關于基于OspA的疫苗的存活力的問題仍然存在。一個顧慮是保持長期保護所需要的加強的頻率。OspA在蜱的中腸中表達，在蜱進食后被快速下調，在哺乳動物中則不表達[Gilmore等，2001;Schwan等，1995]。基于OspA的疫苗的作用機理是靶向蜱內的螺旋體并防止它們傳播[deSilva等，1999]。由于傳播發生在蜱進食的48小時內，因此有效的保護依賴于抗OspA抗體的高循環滴度，這就需要頻繁加強。基于OspA的疫苗涉及的固有的問題可以通過使用在感染早期高水平表達、并引發殺菌性抗體的抗原來避免。在萊姆病疫苗開發中，OspC受到了相當的關注。它是22kDa的表面暴露的脂蛋白[Fuchs等，1992]，由在伯氏疏螺旋體(5.Zn^gc/or/eWwww/ato)復合物的分離體中普遍存在的26kb環狀質粒編碼[Marconi等，1993;Sadziene等，1993]。它的表達被蜱進食時被誘導，并在哺乳動物感染早期得以維持[Schwan，2004]，并且在感染期間遺傳穩定[Hodzic等，2000;Stevenson等，1994]。抗OspC抗體已經被證明對感染有保護作用，但是僅僅針對表達在序列上與疫苗原密切相關的OspC的株系[Gilmore等，1996;Bockenstedt等，1997;Gilmore和Mbow,1999;Mathiesen等，1998;Scheiblhofer等，2003;Jobe等，2003;Rousselle等，1998;Wallich等，2001;Mbow等，1999;Probert等，1997;Brown等，2005;Probert和LeFebvre1994]。對OspC的序列分析已經描繪出大約21個OspC種系組或類型，由字母命名加以區分(從A到U)[Seinost等，1999;Wang等，1999]。盡管在組內序列的變化一般少于2%，但在不同的OspC類型之間它可能高達22Q/。[Wang等，1999;Theisen等，1995;Brisson和Dykhuizen,2004]。這種類型間的表位變動最有可能解釋使用單一OspC類型進行免疫接種所能承擔的保護范圍有限。Dunn和Luft的美國專利6,248,562(2001年6月19日)描述了由至少兩個多肽組成的嵌合的疏螺旋體蛋白，這些多肽來自同樣的和/或不同的疏螺旋體種類的相應的和/或不相應的蛋白。摻入嵌合蛋白的嵌合多肽來自任何疏螺旋體菌株的任何疏螺旋體蛋白，包括OspA、OspB、OspC、OspD、p12、p39、p41,p66禾卩p93。嵌合蛋白可以被用作免疫診斷試劑，并作為針對疏螺旋體感染的疫苗免疫原。但是沒有指涉及OspC蛋白中存在的環5和a5表位。Livey的美國專利6,872,550和6,486,130(分別為2005年3月29日和2002年11月26日)描述了用作對抗含有OspC抗原的萊姆病的疫苗的構建體。但是，在這些專利中沒有提到環5和ce5表位。Dattwyler等的美國專利7,008,625(2006年3月7日)公開了在單一蛋白內多種不同疏螺旋體菌株和/或蛋白的抗原性多肽。嵌合的疏螺旋體蛋白由外表面蛋白OspA和外表面蛋白OspC的多肽片段構成。這些蛋白可以有效針對萊姆疏螺旋體病以及用于免疫診斷試劑。但是，沒有提到環5和第a5表位的特征。出版物"用于診斷萊姆病的重組嵌合疏螺旋體蛋白(RecombinantChimericBorreliaProteinsforDiagnosisofLymeDisease)"(MariaJ.C.Gomes-Solecki等，2000.J.Clin.Microbiol.，38:2530-2535)涉及兩個上面描述的專利。作者工程制造了重組嵌合體，每個都含有伯氏疏螺旋體關鍵的抗原性蛋白OspA、OspB、OspC、鞭毛蛋白(Fla或p41)和蛋白p93的一部分。這篇論文涉及診斷，但是在結束段落中描述了在免疫原方面的應用。作者提到了通過進一步研究重要表位的遺傳變異性可以產生更好的嵌合體，但是沒有提到OspC的環5和《5表位。到目前位置，現有技術未能提供針對多種OspC類型提供廣泛保護的疫苗，以用于預防和/或治療萊姆病。發明簡述本發明提供了用作萊姆病的疫苗和診斷的嵌合的多價重組蛋白。本發明部分基于對來自幾個不同的OspC種系組(類型)的新的保護性表位的發現和性質，這些表位每個都與哺乳動物(例如人類)萊姆病感染有關。這些表位的鑒定使得構建含有來自不同OspC感染類型的多個表位的嵌合蛋白成為可能。因此，當用作疫苗時，嵌合重組蛋白引發針對表達這些OspC類型并與哺乳動物萊姆病相關的多個疏螺旋體菌株的廣泛的保護。此外，嵌合蛋白可用作診斷工具以鑒別具有針對表位的抗體的個體，并從而確定個體是否已經暴露于或受到萊姆病病原體的感染。在本發明的某些實施方案中，表位是B細胞表位和/或優勢免疫表位。本發明的目的是提供含有來自兩個或多個外表面蛋白C(OspC)類型的環5區或a螺旋5區的表位、或其二者的嵌合重組蛋白。在一個實施方案中，OspC類型選自Smar、PLi、H13、PFiM、SLIO、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N禾卩C。在一個實施方案中，嵌合重組蛋白含有來自OspC類型A、B、K和D的表位。在另一個實施方案中，嵌合重組蛋白含有來自OspC類型E、N、I、C、A、B、K和D的表位。在另一個實施方案中，嵌合重組蛋白具有SEQIDNO:75或SEQIDNO:249中顯示的一級氨基酸序列。在某些實施方案中，OspC類型與侵襲性疏螺旋體感染有關。本發明還提供了在需要的個體中引發針對疏螺旋體的免疫應答的方法。該方法包括了給個體施用嵌合重組蛋白的步驟，該嵌合重組蛋白含有來自兩個或多個外表面蛋白C(OspC)類型的環5區或a螺旋5區的表位、或其二者。在本發明的一個實施方案中，OspC類型選自Smar、PLi、H13、PFiM、SLIO、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N和C。在本發明一個實施方案中，嵌合重組蛋白含有來自OspC類型A、B、K和D的表位。在另一個實施方案中，嵌合重組蛋白含有來自OspC類型E、N、I、C、A、B、K和D的表位。在另一個實施方案中，嵌合重組蛋白具有SEQIDNO:75或SEQIDNO:249中顯示的一級氨基酸序列。在某些實施方案中，OspC類型與侵襲性疏螺旋體感染有關。本發明還提供了確定個體是否已經暴露于或受到了疏螺旋體的感染的方法。該方法包括步驟l)從個體獲得生物學樣品；2)將生物學樣品暴露于至少一種重組嵌合蛋白，其中至少一種嵌合蛋白含有來自兩個或多個外表面蛋白C(OspC)類型的環5區或a螺旋5區的表位、或二者；以及3)確定在所述生物學樣品中抗體是否與至少一種嵌合蛋白結合，其中抗體結合的檢測指示了之前暴露于或受到疏螺旋體的感染。在本發明的一個實施方案中，OspC類型選自Smar、PLi、H13、PFiM、SLIO、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N和C。在本發明一個實施方案中，嵌合重組蛋白含有來自OspC類型A、B、K和D的表位。在本發明另一個實施方案中，嵌合重組蛋白含有來自OspC類型E、N、I、C、A、B、K和D的表位。在本發明另一個實施方案中，嵌合重組蛋白具有SEQIDNO:75或SEQIDNO:249中顯示的一級氨基酸序列。在某些實施方案中，OspC類型與侵襲性疏螺旋體感染有關。本發明還提供了針對含有來自兩個或多個外表面蛋白C(OspC)類型的環5區或a螺旋5區的表位、或二者的嵌合重組蛋白的抗體。在本發明的一個實施方案中，OspC類型選自Smar、PLi、H13、PFiM、SLIO、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N和C。在一個實施方案中，嵌合重組蛋白含有來自OspC類型A、B、K和D的表位。在另一個實施方案中，嵌合重組蛋白含有來自OspC類型E、N、I、C、A、B、K和D的表位。在另一個實施方案中，嵌合重組蛋白具有SEQIDNO:75或SEQIDNO:249中顯示的一級氨基酸序列。在某些實施方案中，OspC類型與侵襲性疏螺旋體感染有關。抗體可以是多克隆的或單克隆的。在一個實施方案中，抗體對于疏螺旋體屬螺旋體具有殺菌作用。本發明還提供了嵌合重組蛋白的免疫原性混合物(cocktail)。混合物中的每個嵌合重組蛋白含有來自兩個或多個外表面蛋白C(OspC)類型的環5區或a螺旋5區的表位、或二者。附圖簡述圖l、來自馬里蘭的人類患者的OspC序列的進化關系OspC類型鑒定。OspC基因被PCR擴增、測序，然后構建系統發生圖。分析中包括了22個ospC類型的數據庫序列描繪(指出了登記號)。為每個種系組指定的類型名稱(大寫字母)由大寫字母在每個分支上標出。自展值(1000次試驗)被顯示在對于組的區分關鍵的每個節點上。圖2、表明了在感染過程中抗體對OspC的反應主要是OspC類型特異性的。產生了幾種OspC類型的重組OspC蛋白(在圖中標明)，通過SDS-PAGE分離，使用指示的HRP偶聯的S蛋白或從用已知OspC類型的克隆分離物感染的小鼠收集的血清進行免疫印跡和篩選。圖3、A型OspC的優勢免疫表位的定位。截短的A類型OspC作為與S-Tag融合蛋白而產生并表達在大腸桿菌中。圖A顯示了截短OspC的示意圖。編號反映了伯氏疏螺旋體B31MIOspC的殘基編號。在圖A中，右邊的(+)或(-)表示每個截短的蛋白與感染抗體結合的能力。左邊的數字表示包含每個截斷的氨基酸殘基。在圖B和C中，用HRP偶聯的S蛋白篩選重組蛋白的免疫印跡以證實表達和上樣，或用被伯氏疏螺旋體B31MI，一種A類型OspC產生株感染的小鼠的血清(a-B31MI感染血清)來篩選。為了參比，在圖b和c中的箭頭指示了與ce-B31MI感染血清沒有免疫反應性的重組體的遷移位置。在每個免疫印跡的右邊顯示了分子量標記。圖4、以表格形式顯示了類型間和類型內水平的環5或a5表位的片段的比較性分析。圖5、證實了用不同的A型OspC產生菌株感染的多個動物中，環5抗體的反應。用感染血清篩選l)全長A型OspC或2)含有130-150位氨基酸的片段(包括環5)的免疫印跡。用于產生感染血清的菌株和被收集血清的特定小鼠(m)被標明在每個圖的上方。感染過程中收集血清時的時間點也被標出。每種都以等量的蛋白進行免疫印跡，并且暴露于膠片的時間量也都相同。圖6、ELISA:鑒定包含A型OspC靶定抗體的血清樣品。重組A型全長OspC、重組A型環5和牛血清白蛋白被用于包被ELISA板的孔。用來自人類萊姆體患者的血清篩選孔。所有的分析三份重復進行，給出平均值和標準偏差。所有的方法都描述在文本中。來自15號患者的血清被確定為對于伯氏疏螺旋體B31MI的抗體為IgG陰性，用作陰性對照。圖7A和B、通過PepSpot分析，鑒定包含A型OspC環5表位的特定殘基。跨越環5結構域的重疊肽在硝酸纖維素膜上產生和成斑。然后用來自被A型OspC產生菌株(B31MI)的克隆種群感染的小鼠的血清或用來自人類萊姆病患者的血清(已標明)篩選被固定的肽。(A)環5結構域的免疫印跡結果；(B)肽序列。圖8、證實了環5是表面暴露的以及針對環5的抗體具有殺菌作用。IFA和殺菌分析使用針對A型環5產生的抗血清進行。(A)結果證實了抗環5的抗血清的特異性。伯氏疏螺旋體B31MI、及p『feW的全細胞裂解液以及重組A型環5片段通過十二垸基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，免疫印跡，并使用抗A型環5抗血清(1:1000)進行篩選。蛋白標記的分子量在圖的右邊。圖9A和B、四價嵌合OspC試驗構建體的產生。A，產生四價ABKD嵌合疫苗原構建體的流程圖顯示在圖A中。在ABKD嵌合疫苗原中使用的類型特異性OspC表位由不同的條狀陰影代表。A型OspC的環5表位與B、K和D型的a螺旋5表位在第1輪PCR中進行擴增并凝膠純化。然后在后續輪的PCR中將這些起始的擴增子合并，以產生完全的嵌合構建體。由于擴增子的末端(接頭序列)是互補的，在變性后它們可以退火，以便在PCR后可以交疊地延伸。最后的擴增子被退火至IJpET46Ek/LIC載體中。B，在圖B中，顯示了ABKD嵌合疫苗原構建體的最終蛋白序列，標出了組成成分含有表位的區域和接頭序列。圖10、表明抗ABKD抗血清與ABKD嵌合疫苗原和全長的OspC的免疫反應性的Western印跡。免疫原性通過對ABKD嵌合疫苗原、A、B、K和D型全長重組OspC蛋白(被注明)和rBBN39(陰性對照)進行免疫印跡來評估。印跡用抗His標簽mAb進行篩選，以證實基本上相等的載樣量，或用代表性的抗ABKD抗血清進行篩選(在下方標明)。分子量顯示在右邊。觀察到了對A、B和K(但是不對D)的強IgG反應。圖11A和B、用ABKD嵌合疫苗原免疫的小鼠的血清反應性的ELISA滴定。A、對用ABKD嵌合疫苗原免疫的小鼠(n=12)或用PBS/佐劑假免疫的小鼠(n=3)的血清進行滴定，以測定與ABKD嵌合疫苗原或A、B、K和D型rOspC蛋白的反應性。圖A表明了所有血清對ABKD嵌合疫苗原構建體的免疫反應性的滴定(每只小鼠使用帶有不同符號的實線)。在假免疫的小鼠中沒有觀察到Ab反應(虛線)。B，也完成了對于每種OspC類型的特異性反應的滴定(沒有顯示曲線)，在1/2最大OD405處測定的滴度顯示在圖B中(每個小鼠l個點，水平線為平均滴度)。對照小鼠沒有滴度，沒有作圖。圖12、抗ABKD抗血清的免疫球蛋白同種型分布情況。ELISA孔用ABKD嵌合疫苗原構建體包被(100ng/L)，并用抗ABKD抗血清雙份探査(1:10000;n=12)。結合的Ig用生物素化的同種型特異性第二抗體(小鼠同種型分型試劑盒；ZymedLaboratories)和HRP偶聯的鏈親和素檢測。通過測量HRP介導的ABTS底物的轉化而產生的有色產物來對反應性進行定量。圖13A-D、構建ABKD疫苗變異體的示意圖。ABKDppa(圖A)是通過使用具有5'突出端以加上C末端氨基酸的反向引物來擴增原始的構建體而構建的。ABKDgg(未顯示)以同樣的方式構建，但是使用的是OCDH5ggLIC引物。ABKDD(圖B)、ADBK(圖C)禾卩ADBKD(圖D)都是通過使用加上了編碼接頭序列的尾部的引物，對組成序列進行PCR擴增而制備的。獲得的PCR產物被凝膠純化，通過交疊退火和延伸而連接起來。最終的產物被克隆到pET-46Ek/LIC載體中。含有OspC類型特異性表位的區域用字母表示，接頭序列用數字表示(參見插入的編碼氨基酸序列)。箭頭表示引物，5'突出的LIC尾部或接頭序列被標注在每個引物箭頭的尾部。圖14、嵌合疫苗原試驗構建體的考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE凝膠。疫苗原重組蛋白被表達在大腸桿菌中，通過鎳色譜進行親和純化，并通過BCA方法定量。將2/ig純化的蛋白在15%的SDS-PAGE凝膠(Criterion;Biorad)上進行電泳，并用考馬斯亮藍G-250染色。沒有注意到污染的蛋白，重組蛋白降解很少或沒有降解。圖15A和B、小鼠疫苗血清識別全長重組OspC的評估。在圖A中，A、B、K和D型重組OspC在PVDF上電泳并形成印跡(類型指示在頂部；500ng/道)，并用1:2500稀釋的來自用每種變異構建體(標注在左邊)免疫的小鼠的代表性血清探査。二級檢測使用過氧化物酶偶聯的山羊抗小鼠IgG(1:40000)和化學發光進行。分子量標注在右邊。圖B是小鼠疫苗血清與全長重組OspC的反應性的定量ELISA滴定的結果。針對每種疫苗構建體(標注在底部)產生的血清針對固定的全長重組A、B、K和D型OspC進行滴定。還包括了用PBS透析的ABKD構建體(ABKD*)[17]的滴度。條表示針對A(黑色)、B(灰色)、K(空心)和D(斜線)型的OspC的平均滴度。來自個體小鼠的滴度用空心三角形表示。下面列出的是平均滴度的數值，以及針對用PBS(ABKD*)或Arg/Glu緩沖液(ABKD)透析的ABKD構建體的相應滴度指示的滴度。圖16A-C、表位特異的同種型對三種疫苗構建體的反應。將A、B、K和D型OspC固定在ELISA板上，使用來自用ABKD、ABKDD或ADBKD構建體免疫的小鼠的免疫血清雙份探查。結合的Ig同種型用生物素化的同種型特異的第二抗體和過氧化物酶偶聯的鏈親和素檢圖17、免疫的小鼠的脾細胞對使用免疫原的體外再刺激的IFN-7反應。用6種疫苗構建體的每種免疫的3只小鼠的無紅細胞的脾細胞被收集，合并，用最初的免疫抗原三份平行再刺激(在24孔板中每mL10個細胞，抗原為10或5/ig/mL)。在三個對照孔中施用10mg/mLBSA或不使用蛋白。孵育(37°C，5%C02)96小時后，收集無細胞上清液，通過ELISA測定IFN-7的濃度。在所有情況下，BSA和無蛋白孔中的IFN-7濃度低于分析的檢測限。圖18A和B、評估抗體對弗氏佐劑或明礬中施用的ABBCD疫苗原的反應。圖A是針對在弗氏佐劑中乳化的ABKD疫苗(實心條)或吸附于明礬的ABKD疫苗(斜線條)產生的小鼠血清中IgG的定量ELISA滴定的結果。血清針對固定的ABKD疫苗原或A、B、K和D型全長重組OspC進行滴定。圖B顯示了與固定的ABKD疫苗原結合的血清的同種型分布情況。結合的Ig同種型用生物素化的同種型特異的第二抗體和過氧化物酶偶聯的鏈親和素檢測。圖19、OspC蛋白序列一致性的成對比較的分布。使用PAM40計分矩陣將來自280個疏螺旋體分離株的OspC蛋白序列進行了Clustal比對，并計算了成對百分一致性。直方圖間隔為1%，百分一致性沒有低于50%的。圖20、指定的OspC類型的物種、地理和生物學分離數據。圖21A-C、代表性OspC蛋白序列的共有系統進化樹。包含氨基酸20-200(A)、20-130(B)和131-300(C)的OspC序列被自展(n二lOOO)，計算距離，產生鄰近的結合樹，并與嚴格一致性樹一致。赫姆斯疏螺旋體(B.AermW)的Vmp33序列被用作外類群。標記表示物種為伯氏疏螺旋體(Bb)、伽氏疏螺旋體(Bg)或埃氏疏螺旋體(Ba)、分離株的命名、指定的OspC類型(粗體)、以及該單一序列所代表的與其它菌株一致的OspC序列的數量(在括號中)。自引支持度顯示在所有區分OspC類型的節點上。圖22、PLj7型OspC(埃氏疏螺旋體)的ospC序列與Pki型(伽氏疏螺旋體；黑色實線)、F型(伯氏疏螺旋體；灰色實線)和M型(伯氏疏螺旋體；黑色虛線)的OspC的比較的啟動掃描(bootscan)分析。啟動掃描窗口為40個堿基，每步10個堿基。通過與100個自引復本的嚴格一致性進行比較。圖被簡化了，只顯示了那些輪排的樹(permutedtrees)的百分數超過50%的峰，水平為70%被認為代表了可能的重組，它們被標明。圖23、來自本研究中定義的所有OspC類型的OspC蛋白序列的含有表位的區域的比對。在OspC類型內有超過一個氨基酸差異的所有序列被代表性的序列指出。陰影的一致性閾值為80%。二級結構a螺旋和環(對應于B31結構)被顯示在比對序列的下方(Kumaran等，2001)。圖24、用于ABKD嵌合疫苗原的構建的親本OspC序列的ClustalX比對和包含在疫苗原中的含有表位的區域的物理位置。在親本序列的ClustalX比對中，A型(環5區，淺灰色框)和B、K及D型(a螺旋5區，深灰色框)OspC的含有表位的區域的位置被加亮。圖25A-J、示例的本發明嵌合疫苗原。構建體的標題表明構建體整合的OspC類型特異的環5和a螺旋5表位，及其次序。粗體X表示任選的接頭序列的位置。圖26、來自幾種疏螺旋體菌株的OspC的蛋白和DNA登記號。本發明實施方案的具體描述本發明是基于與人類萊姆病感染有關的OspC類型的新的、保護性的、類型特異性的表位的鑒定和表征。該新的表位位于OspC的羧基末端一半中的兩個結構域(區域)內。這兩個結構域以前都沒有被鑒定為具有高度的免疫原性。第一個結構域(在本文中被稱為"a螺旋5區/結構域"或"a5區/結構域"或"螺旋5區/結構域")位于160和200位殘基之間，并含有包括環6的一部分、a螺旋5和無結構的C末端結構域的二級結構元件(Kumaran等，2001)。第二個結構域(在本文中稱為"環5區/結構域")位于131和159位殘基之間，并含有包括a螺旋3的一部分、環5和第螺旋a的二級結構元件(Kumaran等，2001)。這些區域每一個都含有至少一個可用于本發明的實踐的表位。來自這兩個結構域的表位、或來自這兩個區域內的抗原性肽或多肽，單獨或優選與嵌合免疫原中的其它表位組合，可以用于本發明的實踐中。在本發明的某些實施方案中，表位是優勢免疫表位。通常表位是B細胞表位，盡管也不排除T細胞表位。新的表位的發現、以及對不同OspC類型的表位的作圖，使得構建含有多個線性、類型特異性的來自多個OspC類型的優勢免疫表位的多價嵌合蛋白成為可能。當用作疫苗時，多價重組嵌合蛋白引發針對疏螺旋體屬螺旋體的感染的廣泛保護作用，其中該疏螺旋體屬螺旋體表達的OspC類型與嵌合蛋白中的相應，即具，有高度感染性的那些疏螺旋體。此外，嵌合蛋白可用作診斷工具以鑒別個體具有針對嵌合蛋白中包含的表位的抗體，從而確定該個體是否已經暴露于和/或受到了萊姆病病原體的感染。為了便于理解本發明，提供了下面的定義-抗原歷史上用于指稱被抗體結合的實體的術語，也用于指誘導抗體產生的實體。近來的用法將抗原的意義限于被抗體結合的實體，而"免疫原"一詞用于誘導抗體產生的實體。當本文討論的實體兼有免疫原性和抗原性時，一般來說將根據其預期的應用將其稱為免疫原或抗原。術語"抗原"、"免疫原"和"表位"在本文中可以互換使用。B細胞表位抗原上被B細胞受體識別、并可以被分泌的抗體結合的特定化學結構域。該術語可以與"抗原性決定簇"互換使用。優勢免疫表位分子上誘導顯性的、或最強烈的免疫應答的表位。線性表位包含被肽鍵連接在一起以形成肽或多肽的單個、不間斷的連續氨基酸鏈的表位。這樣的表位可以通過其一級結構，即鏈中氨基酸的線性序列來描述。構象表位該表位包含的至少某些氨基酸不是不間斷的線性氨基酸序列的一部分，但這些氨基酸通過蛋白的二級、三級和/或四級相互作用被帶到與所述表位中的其它殘基接近。從一級結構來說，這些殘基可能距表位中的其它殘基位置很遠，但是由于蛋白的折疊可能與構象表位中的其它殘基在空間位置上接近。環5區/結構域OspC中包括了與圖23中顯示的A型OspC序列的131位到159位殘基排列在一起的殘基的區域。該區域中包含的B31菌株的OspC二級結構元件是a螺旋3的一部分、環5和第a螺旋4，如在Kumaran等(2001)所定義。a螺旋5區/結構域OspC中包括了與圖23中顯示的B31菌株(A型OspC)序列的160位到200位氨基酸排列在一起的殘基、以及圖23中沒有顯示的蛋白的C末端部分(B31序列的201-210位氨基酸)的區域。該區域中包含的B31菌株的OspC二級結構元件是環6的一部分、a螺旋5和無結構的C末端結構域，正如在Kumaran等所定義(2001)。蛋白大約100個或更多的氨基酸通過肽鍵共價連接的線性序列。多肽大約20個到大約100個氨基酸通過肽鍵共價連接的線性序列。肽大約20個或更少的氨基酸通過肽鍵共價連接的線性序列。術語"蛋白"、"多肽"和"肽"在本文中可以互換使用。嵌合蛋白其一級序列含有不會同時出現在自然中的單一分子中的多個肽、多肽和/或蛋白序列的重組蛋白。嵌合蛋白的價(例如"多價")是指嵌合疫苗原中包含的帶有OspC類型特異性表位的多肽的數量。例如二價嵌合體可以由A型5螺旋a和B型a螺旋5構成，或由A型a螺旋5和A型環5構成。在每個帶有多肽表位的區域中可能存在多個不同的表位。原始或天然或野生型序列與自然中發現的一樣的肽、多肽、蛋白或核酸的序列。重組肽、多肽、蛋白或核酸使用分子生物學技術例如克隆、聚合酶鏈反應(PCR)等生產和/或操作過的肽、多肽、蛋白或核酸。類型特異性主要與單一種系組有關的。侵襲性感染如果在人類感染過程中從蜱叮咬最初接種的周圍皮膚之外的地方(例如血漿、腦脊液等)分離到了帶有OspC類型的疏螺旋體，那么OspC蛋白被稱為是"與侵襲性感染有關"。因此，本發明提供了含有多個來自環5和/或ce螺旋5區的線性表位的重組嵌合蛋白，這些表位中至少兩個來自與侵襲性感染有關的不同OspC類型。優選，代表了大約2到大約20個、優選從大約6個到大約IO個不同的OspC類型的抗原性表位被包含在單一嵌合蛋白中。盡管通常一級結構中至少有兩個表位彼此不同并來源于不同的OspC類型，但也可能在嵌合體中包含單一類型表位的多個拷貝，或包含基于或來自同樣OspC類型的原始序列的幾個序列。盡管嵌合體中線性表位的總數可以略有不同，但一般來說范圍從大約10到20個。在本發明的一個實施方案中，優勢免疫表位選自Smar、PLi、H13、PFiM、SLIO、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N、C型OspC的兩種或多種。在一個實施方案中，嵌合蛋白是四價的，含有來自A、B、K和D型表位。在另一個實施方案中，嵌合蛋白是八價的，含有來自E、N、I、C、A、B、K和D型OspC的表位。但是，本領域的專業技術人員將會認識到，也可以使用來自其它OspC類型組合的表位，只要獲得的嵌合體產生適當的免疫應答、和/或作為疫苗有效地防止萊姆病就行。其它適當組合的例子包括但不限于l)E、N、I、C、A、B、K、D;2)A、B、K、D、E、N、C;3)1、C、A、B、K、D;以及4)C、A、B、K、D。在某些實施方案中，將同時包含環5和a螺旋5區。例如，"E、N、I、C、A、B、K、D"構建體可以同時含有每個E、N、I、C、A、B、K和D型OspC的環5和螺旋5區。但是，情況并不必須是這樣。例如，可以包含A型的環5區和E、N、I、C、B、K和D的a螺旋5區；或者可以僅包含每種OspC類型的環5區；或者僅包含a螺旋5區；或者可以包含其它組合(例如E、N、I和C型的環5區和A、B、K和D型的a螺旋5區)。對于本領域的專業技術人員來說可以產生許多這樣的組合，所有這樣的變化均旨在包含在本發明中。此外，嵌合體內表位的線性次序可以變化。一般來說，從氨基到羧基末端的次序為"環5區，a螺旋5區，環5區，a螺旋5區……"等。例如，在E、N、I、C、A、B、K、D構建體的情況下，優選的次序為，沿著嵌合體的長度方向，"E型環5區，E型a螺旋5區；N型環5區，N型a螺旋5區；I型環5區，I型a螺旋5區；"等，不同的OspC類型和/或不同的結構域選擇由中性接頭序列分隔開。但是，這種次序可以改變，這依賴于例如被選擇包含在嵌合體中的元件。可以使用任何的OspC類型和結構域的次序，只要獲得的嵌合體產生適合的免疫應答和/或作為疫苗有效地防止萊姆病、或能夠有效用于診斷就行。示例性的嵌合體序列的例子在圖25A-J中給出。來自幾個疏螺旋體菌株的OspC的關鍵的蛋白和DNA登記號以表格的形式顯示在圖26中。嵌合蛋白中包含的氨基酸序列可以包括a螺旋5區和/或環5區，或其抗原性片段。對于"抗原性片段"來說，我們是指含有至少一個在感染中被識別的線性表位的一級OspC序列的片段。這樣的表位，當表達在重組的OspC蛋白亞基中時，保留了以類似于結合表達在細胞表面的野生型蛋白的方式結合感染誘導的抗體的能力。單個抗原性片段可以包含一個以上的不同表位。本領域的專業技術人員將會認識到，測量抗體對表位的親和性或親和力略微有些不準確，在免疫應答過程中，由于例如親和成熟/體細胞超突變，親和性/親和力可以顯著地變化。但是，一般來說，抗體與嵌合蛋白結合的親和性/親和力與天然的完整a5或環5表現出的親和性相比，在至少大約50%的范圍內，優選大約60%，更優選大約70%，更加優選大約80%，最優選大約90-100%或甚至更高。一般來說，在嵌合體蛋白中包含的抗原性序列將含有大約20到大約100個氨基酸，優選從大約30個到大約70個氨基酸，嵌合蛋白本身將含有總共從大約160個到大約800個氨基酸，優選從大約240個到大約560個氨基酸。此外，抗原性序列在本文中可以被稱為"表位"，無論它們是否包含了完整的"天然"表位，只要它們具有本文描述的抗體結合特性就行。或者，合適的抗原片段或抗原性序列或表位當包含在嵌合蛋白中時，可以通過它們在施用嵌合蛋白的宿主中引發針對表位產生適當抗體的能力來鑒定。本領域的專業技術人員將會認識到抗體滴度的定義可以改變。在這里，"滴度"被取為在用100ng測試蛋白包被的ELISA孔中結合一半的可用結合位點的抗血清的稀釋度的倒數。一般來說，產生適當的抗體的特征為抗體滴度在大約100到大約IOO，OOO的范圍內，優選在大約IO，OOO到大約10,000000的范圍內。或者，特別是在診斷分析中，"滴度"應該為結合的背景水平的大約3倍。例如，要被認為是"陽性"，在測試中的反應性應該至少比在未感染的個體的血清中檢測到的反應性高3倍。優選抗體反應是保護性的，即與未接種的宿主相比，防止或減少了后來暴露于疏螺旋體的接種宿主中疾病癥狀的發展。本發明的一個示例性嵌合蛋白的氨基酸序列顯示在圖9B中。在該說明性實施方案中，嵌合體含有來自A型OspC的環5區氨基酸序列和來自B、K和D型OspC的a螺旋5區序列。在這種情況下，A型OspC序列來自菌株LDP56,核苷酸登記號為EF053513，蛋白登記號為ABK41054;B型OspC的序列來自菌株LDP73，核酸登記號為EF053525，蛋白登記號為ABK41066;K型OspC來自菌株LDP89，核苷酸登記號為EF053523，蛋白登記號為ABK41064;D型OspC來自菌株LDP116，核苷酸登記號為EF053527，蛋白登記號為ABK41068。本領域的專業技術人員將會認識到，來自許多疏螺旋體菌株的OspC是已知的或可以發現的，并可以用于本發明的實踐中。本領域的專業技術人員將會認識到，盡管在本發明的某些實施方案中，被選擇包含在本發明嵌合蛋白中的氨基酸序列直接對應于OspC蛋白的原始或天然序列的一級氨基酸序列，但這種情況不是必須的。包含在本發明嵌合蛋白中的表位的氨基酸序列可以略有改變并仍然適合用于本發明中。例如，可以進行某些保守氨基酸取代而對表位引發免疫應答的能力沒有有害的影響。本領域的專業技術人員將會認識到這種保守取代的本質，例如用帶正電荷的氨基酸取代另一個帶正電荷的氨基酸；用帶負電荷的氨基酸取代另一個帶負電荷的氨基酸；用疏水的氨基酸取代另一個疏水的氨基酸；等等。所有這種包含在本發明嵌合蛋白中的表位的序列的取代或改變都旨在被本發明包含，只要產生的表位仍然能夠引發適當的免疫應答就行。此外，包含在本發明的嵌合蛋白中的氨基酸序列不必須包涵全長的天然表位或含有表位的結構域。本領域的專業技術人員將會認識到，已知是或含有表位的氨基酸序列的截短的版本可以由于各種原因優選用于本發明中，只要序列滿足了為表位設置的標準就行。這樣被取代或以其它方式改變的氨基酸序列在本文中可以被稱為"基于"或"來自于"原始的野生型或天然序列。一般來說，線性表位所"來自"或線性表位所"基于"的OspC蛋白是自然中出現的OspC蛋白。這些天然的OspC蛋白也可以被稱為天然或野生型蛋白。出于多種原因可以導入這樣的對一級序列的改變，例如，為了消除或引入蛋白酶切割位點，為了增加或降低溶解性，為了促進或阻礙分子內或分子間相互作用例如折疊、離子相互作用、鹽橋等，否則它們可能干擾單個表位沿著嵌合體長徑的呈遞和可接近性。所有這樣的改變都旨在包涵在本發明的范圍之內，只要獲得的氨基酸序列能作用于引發針對表位所源自的OspC類型的保護性抗體反應就行。一般來說，這樣的取代序列將與相應的天然蛋白的序列具有至少大約50%的一致性，優選與野生型序列具有大約60-70、甚至70到80、或80到90%的一致性，優選大約95到大約100%的一致性。在本發明的某些實施方案中，嵌合疫苗原中的單個線性表位彼此之間被間插序列分隔開，這些間插序列在性質上或多或少為中性，即它們不參與或本身不引發針對疏螺旋體的免疫應答。這樣的序列在嵌合體的表位之間可以存在，也可以不存在。如果存在，它們可以，例如，用于分隔表位，并有助于表位彼此之間的空間隔離。或者，這樣的序列可以僅僅是重組加工程序例如克隆程序的人為產品。這樣的序列一般被稱為接頭或間隔肽，其許多例子為本領域的專業技術人員所熟知。參見例如Crasto,C.J.禾卩J，A.Feng.2000.LINKER:aprogramtogeneratelinkersequencesforfusionproteins.(LINKER:產生用于融合蛋白的接頭序列的程序)ProteinEngineering13(5):309-312，它是描述了無結構接頭的參考文獻。結構(例如螺旋)序列接頭也可以使用例如現有的已知具有二級結構的序列來進行設計，或者使用基本的已知生物化學原理來設計接頭。此外，其它的元件也可以出現在嵌合蛋白中，例如前導序列或給蛋白"加標簽"以便于蛋白的純化或檢測的序列，其例子包括但不限于組氨酸標簽、檢測標簽(例如S-tag或Flag-tag)、其它的抗原性氨基酸序列，例如含有已知的T細胞表位的序列和蛋白穩定基序等。此外，嵌合蛋白可以被化學修飾，例如通過酰胺化、磺酰化、脂化或本領域的專業技術人員所熟知的其它技術。本發明還提供了編碼本發明的嵌合蛋白的核酸序列。這樣的核酸包括DNA、RNA及其雜化物等。此外，本發明包含了含有或納入這些編碼序列的載體。適合的載體的例子包括但不限于質粒、粘粒、基于病毒的載體、表達載體等。在優選實施方案中，載體是質粒表達載體。本發明的嵌合蛋白可以通過任何適當的方法來生產，它們中的許多已經為本領域的專業技術人員所熟知。例如，蛋白可以被化學合成，或使用重組DNA技術來生產(例如在細菌細胞中，在細胞培養物中(哺乳動物、酵母或昆蟲細胞)，在植物或植物細胞中，或通過無細胞原核或基于真核的表達系統，通過其它的體外系統等)。本發明還提供了用于引發免疫應答的組合物，它可以被用作疫苗以預防或治療疏螺旋體感染，特別是在證實為萊姆病(萊姆疏螺旋體病)時。對于引發免疫應答來說，我們是指抗原的施用引起了特異性抗體的合成(以上述的滴度)，和/或細胞的增殖，正如通過例如311胸腺嘧啶的摻入所測量的那樣。對于"疫苗"來說，我們是指引發免疫應答的嵌合蛋白，與未被接種(例如只使用佐劑)的對照生物體相比，其產生針對疏螺旋體攻擊的保護作用，完全或部分防止或遏制了與疏螺旋體感染有關的癥狀(即萊姆病癥狀)的發展。組合物包括一種或多種本文描述的基本上純化的重組嵌合蛋白以及合適的藥用載體。組合物中的多種嵌合蛋白可以相同或不同，即組合物可以是不同嵌合體的"混合物"，或者組合物只含有單一類型的嵌合體。這種用作疫苗的組合物的制備對于本領域的專業技術人員來說是熟知的。一般來說，這樣的組合物被制備成液體溶液或懸浮液，但是也可以考慮固體形式例如片劑、丸劑、粉末等。也可以制備適合于在給藥前溶解或懸浮于液體中的固體形式。制劑也可以被乳化。活性成分可以與可藥用的并能與活性成分相容的賦形劑混合。適合的賦形劑是例如水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等或其組合。此外，組合物可以含有少量的輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑等。本發明的疫苗制劑還可以含有佐劑，適合的例子包括但不限于Seppic、QuilA、Alhydrogel等。如果需要口服形式施用組合物，可以加入各種增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑等。本發明的組合物可以含有任何這樣的附加成分以提供適合于給藥形式的組合物。在制劑中嵌合蛋白的最終含量可以變化。但是，一般來說，制劑中的量為大約0.01-99%重量/體積比。方法包括給哺乳動物施用在可藥用的載體中含有嵌合重組蛋白的組合物。本發明的疫苗制劑可以通過本領域的專業技術人員所熟知的許多種適合的方法中的任何一種來施用，包括但不限于通過注射、吸入、口服、鼻內、通過消化含有嵌合蛋白的食品等。在優選實施方案中，給藥模式是皮下或肌肉內。此外，組合物可以與其它的治療形式一起使用，例如增強免疫系統的物質、化療劑等。本發明提供了在哺乳動物中引發針對疏螺旋體的免疫應答和針對疏螺旋體感染進行免疫接種的方法。在一個實施方案中，哺乳動物是人類。但是，本領域的專業技術人員將會認識到，其它哺乳動物可能也存在對這種免疫接種的需要，例如，制劑也可以用于獸醫目的。例子包括但不限于陪伴"寵物"例如狗、貓等；食物來源、工作和娛樂動物例如牛、馬、公牛、綿羊、豬、山羊等；或者甚至是作為疏螺旋體儲主的野生動物(例如小鼠、鹿)。本發明還提供了診斷劑和使用診斷劑來鑒別個體具有針對本發明的嵌合蛋白內包含的表位的抗體的方法。來自被懷疑已經暴露于疏螺旋體或正處于暴露于疏螺旋體風險中的個體(例如疏螺旋體螺旋體易感的人類、鹿或其它哺乳動物)的生物學樣品，與本發明的嵌合蛋白相接觸。使用現有的方法，檢測嵌合蛋白和生物學樣品中抗體之間是否存在結合反應。陽性結果(結合發生了，因此抗體存在)表明個體己經暴露于和/或感染了疏螺旋體。就此而論，根據分析的目的，可以構建特異性針對所關注的OspC類型的任何亞類的嵌合體，即所有可能的OspC類型可以包括、或可以不包括在診斷嵌合體中。此外，本發明的診斷方面不局限于臨床使用和家庭使用，對于在實驗室中作為研究工具也可能是有價值的，例如鑒定從蜱分離到的疏螺旋體屬螺旋體，研究OspC類型的地理分布等。本發明還涵蓋了針對本文公開的表位和/或嵌合體蛋白的抗體。這樣的抗體可以是多克隆的、單克隆的或嵌合的，并可以以本領域的專業技術人員所熟知的任何方式產生。在本發明的優選實施方案中，抗體是殺菌的(殺疏螺旋體的)，即將疏螺旋體屬螺旋體暴露于抗體導致螺旋體的死亡。這樣的抗體可以以多種方式使用，例如作為檢測試劑診斷先前在疏螺旋體中的暴露，作為研究疏螺旋體的試劑盒的試劑、治療疏螺旋體感染等。提供了下面的實施例以闡述本發明的各種實施方案，但是它們不應被認為以任何方式構成限制。實施例實施例1、在侵襲性人類萊姆病分離株中證明OspC類型多樣性和鑒定限定OspC抗體反應特異性的以前未表征的表位財萊姆病通過被伯氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體或埃氏疏螺旋體感染的硬蜱屬蜱的叮咬而傳播到人類。外表面蛋白C(OspC)被認為是參與傳播過程的重要毒力因子，并可能參與了哺乳動物中早期感染的建立(Grimm等，2004;Parl等，2004;Schwan等，1995)。OspC是可變的、大約22kDa的、表面暴露的、質粒編碼的脂蛋白(Fuchs等，1992;Marconi等，1993;Sadziene等，1993)。已經確定了三個OspC蛋白的晶體結構(Eicken等，2001;Kumaran等，2001)。蛋白主要是螺旋狀的，具有5個a螺旋，通過可變的環連接。據推測環形成了配體結合結構域(Eicken等，2001;Kumaran等，2001)。證據表明，OspC可能通過作為與唾液腺中未鑒定的受體結合的粘附素來幫助螺旋體從蜱中腸的轉移(Pal等，2004)。在回歸熱族群的幾個物種中已經鑒定出了OspC的種間同源基因，這提高了OspC相關蛋白在其它疏螺旋體物種中執行同樣功能的可能性(Marconi等，1993;Margolis等1994)。OspC的表達受環境的調控，受蜱進食的誘導，并且在哺乳動物早期感染中OspC是優勢抗原(Alverson等，2003;Schwan等，1998;Stevenson等，1995)。轉錄至少部分受到RpoN/S調控網絡的調控(Hubner等，2001)。應該注意到，關于在傳播期間和早期感染期間OspC表達的臨時性質的精確細節的報道有沖突(Ohnishi等，2001;Schwan等，1995)。OspC表現出明顯的遺傳和抗原多樣性(Theisen等，1995;Theisen等，1993)。已經描述了21個OspC種系組(在后文中稱為OspC類型)(Seinost等，1999;Wang等，1999)。OspC類型用字母命名(從A到U)來區分。對于數據庫中的幾百個OspC氨基酸序列進行的分析表明，OspC類型之間的趨異性可以高達30。/。，而在一種類型內一般少于6%。Seinost等假設在A、B、I和K型OspC與人類的侵襲性感染之間存在關聯(Seinost等，1999)。Lagal等也報道了通過單鏈構象多態性分析確定的特異性OspC變異體與侵襲性人類感染有關(Lagal等，2003)。但是，Alghaferi及其同事的最近的研究對于這種關聯的強度提出了疑問(Alghaferi等，2005)。OspC的類型或序列對功能和宿主-病原相互作用的影響代表了一個重要的、富于創造性的研究領域。對于OspC在萊姆病疫苗開發中的應用已經進行了研究(Bockenstedt等，1997;Gilmore等，2003;Gilmore等，1999a;Probert等，1994;Theisen等，1993;Wilske等，1996)。但是，OspC的變異以及對OspC抗原性結構的有限的了解使得這些工作很復雜。OspC具有保護性力，但是僅僅針對同樣的菌株(Bockenstedt等，1997;Gilmore等，1999;Gilmore等，1999b;Probert禾卩LeFebvre，1994;Wilske等，1996)。這表明保護性的表位位于序列高度可變的蛋白區域內。本研究的目的有幾層。首先，通過確定從馬里蘭州限定的患者人群中回收的侵襲性和非侵襲性分離株的OspC類型，尋求對OspC類型與侵襲性感染之間的推定關聯性的進一步評估。第二，在嘗試更好地理解針對OspC的反應抗體中，尋求確定該反應是否是類型特異性的。最后，通過鑒定在小鼠感染過程中引發抗體反應的表位，尋求OspC抗原性結構的確定。本文呈現的數據表明與侵襲性感染有關的OspC類型的數量超過以前的推測(Seinost等，1999)。此外，我們鑒定了兩個以前未表征的表位，并證實了針對OspC的抗體反應被顯示是類型特異性的。這些分析提供了重要的信息，增強我們對OspC在萊姆病致病機理中的作用的理解，并將便于基于OspC的疫苗的構建。魏餅一智廣》庸樣，J^糴逾潸游薦養,產主。從馬里蘭州人類患者回收的萊姆病分離株被用在這些分析中(表l)。患者在研究前提供了知情同意書，該研究被約翰霍普金斯醫學研究機構審查委員會(JohnHopkinsMedicineInstitutionalReviewBoard)批準。螺旋體在BSK-H完全培養基(Sigma)中在33"C下進行培養，通過暗視野顯微鏡監測，通過離心收集。對于某些分離株來說，通過以前描述的液面下鋪板(Sung等，2000)產生了克隆種群。為了確定個體菌落的ospC類型，對ospC基因進行了PCR擴增、測序，并進行了比較性序列分析(如下所述)。為了產生針對一系列表達已知類型的OspC蛋白的克隆種群的抗血清，將103個螺旋體在磷酸鹽緩沖液(PBS)中清洗，然后用針接種到C3H-HeJ小鼠中(皮下，肩胛之間；JacksonLabs)。小鼠的感染按照以前的描述(Zhang等，2005)，通過在接種后2或4周對耳穿刺活體組織使用耙定/7flB基因的引物進行實時PCR來證實。在0、2、4和8周時通過剪截尾巴從每只小鼠收集血液，收獲感染血清。其它在這些分析中使用的抗血清和感染血清在以前已經描述過了(McDowell等，2002)。表l、細菌分離株、來源信息和OspC類型<table>complextableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>"崩分/f、O印C分蕃浙^",教薪勵祭稱分折。為了確定OspC類型，按照以前的描述從每個菌株分離總DNA(Marconi等，2003)，并作為模板與OspC20(+)LIC和OspC210(-)UC引物一起進行PCR(表2)。PCR使用高保真聚合酶擴增(ExpandHighFidelitypolymerase(Roche))進行，使用下面的循環條件初始變性94t:2分鐘；94°C15秒、50°C30秒、60。C進行60秒10個循環；94°C15秒、50°C30秒、60°C60秒，最后20個循環每個額外加5秒；最后在68°C延伸7分鐘。使用QiaQuickPCR純化試劑盒(Qiagen)回收擴增子，用T4DNA聚合酶處理以產生單鏈突出端，退火到pET-32Ek/LIC載體(Novagen)中，并轉化到大腸桿菌NovaBlue(DE3)細胞中(Novagen)。這些程序的方法按照制造商的描述。根據氨芐青霉素抗性(50Atg/ml)篩選菌落，通過PCR篩選ospC插入片段。將選出的菌落轉移到LB肉湯中(Fisher)，在37"下振蕩(300rpm)培養，使用QiaFilterMidi質粒分離試劑盒(Qiagen)分離質粒。ospC插入片段由收費性服務測序(MWGBiotech)。將測定的序列翻譯并使用ClustalX(35)與缺省參數進行比對。為了確定OspC的類型，產生了鄰接樹，并計算了自展值(1000次試驗)。獲得的生物系統發生圖使用N-JPlotter顯示。數據庫中其它可用的OspC序列也被包含在分析中。使用NCBI分子模擬數據庫文件1GGQ、IflM禾P1G5Z(4，15)以及在ncbi.nlm.nih.gov/Stnicture/CN3D/cn3d.shtml網點上提供的CN3D軟件產生了OspC的結構模型。表2、在本研究中使用的聚合酶鏈反應引物<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>LIC尾部序列被下劃線。羞邀歪^游產生。為了產生全長和截短的OspC，基于伯氏疏螺旋體B31MI的A型ospC序列(Fraser等，1997)設計引物。引物具有允許退火連接到pET-32Ek/LIC載體(Novagen)中的尾部序列，該載體是不依賴連接酶的克隆(LIC)和表達載體。所有的LIC程序和以前的描述一樣(Hovis等，2004)。為了證實所有構建體的序列，使用QiaFilterMidi質粒純化試劑盒(Qiagen)從大腸桿菌NovaBlue(DE3)細胞中純化了重組質粒，并對插入片段進行測序(MWGBiotech)。SIXS-iMGJ浙免疫伊跡分叛。按照以前的描述(Roberts等，2002)，將蛋白在12.5%的標準預制凝膠(Biorad)中通過SDS-PAGE進行分離，并免疫轉印到PVDF膜上(Millipore)。使用S-蛋白辣根過氧化物酶(HRP)偶聯物(Novagen)證實重組蛋白的表達，該偶聯物檢測在本研究中所用的所有重組蛋白都攜帶的N-末端S-標簽融合。HRP偶聯的S-蛋白1:10,000稀釋使用。對于免疫印跡分析來說，從被感染的小鼠收集的血清以1:1000稀釋使用。HRP偶聯的山羊抗小鼠IgG被用作第二抗體(Pierce)，1:10,000稀釋使用。一般的免疫印跡方法和以前的描述一樣(Metts等，2003)。錄榮A與屋蘭///游乂類#錄瘋薪者^欲游分庳橫游分亞分氛從被分析的每個從馬里蘭州的人類萊姆病患者回收的分離株都成功地擴增了O^C。每個擴增子的序列被測定，并進行了比較性序列分析以確定OspC的類型(圖l)。鑒定了幾個不同的OspC類型的代表，包括A(n=6)、B(n=l)、C(n=l)、D(n=l)、H(n=2)、K(n=4)和N(t^3)。以前已經報道過只有A、B、I和K型OspC與人類中的侵襲性感染有關(Sdnost等，1999)。在該研究中，侵襲性分離株被限定為從血液、器官或腦脊液回收的分離株，而非侵襲性分離株是從皮膚回收的、但是沒有在身體的其它位置發現的分離株(Seinost等，1999)。但是，在這里證實了某些表達C、D和N型OspC的分離株是從血液(LDP84、LDP63、LDP116禾BLDP120)或腦脊液(LDC83)回收的，因此是侵襲性的。這項觀察結果表明特定的OspC類型與侵襲性感染之間的相關性可能不是嚴格的，關聯性的強度需要被重新評估。,^/貧減染過程中#/"對游貧體及應游類麥特^性分橋。為了確定在感染過程中針對OspC引發的抗體反應是否是類型特異性的，產生了A、B、C、D、H、K和N型重組OspC蛋白用作測試抗原。重組蛋白被免疫轉印，并使用來自A、B或DOspC類型的伯氏疏螺旋體分離株(如上面確定)感染的小鼠收集的血清進行篩選(圖2)。重組蛋白在大腸桿菌(E.coli)中的表達以及蛋白的相等載量，通過使用識別N-末端融合中的S-標簽的HRP偶聯的S-蛋白篩選一個免疫印跡來證實。當使用在感染2周時收集的抗伯氏疏螺旋體B31MI抗血清(A型OspC)進行篩選時，只有使用A型蛋白才能檢測到強反應性。針對OspC的強的和早期的IgG反應與較早的報道相符(Theisen等1995;Wilske等，1993)。在感染第8周收集的血清也主要與A型OspC反應，但是觀察到了與其它OspC類型的弱的交叉免疫反應性。在用LDP116和LDP73(分別為D和B型OspC分離株)感染的小鼠中對OspC的抗體反應也是類型特異性的。可以得出結論，在針對OspC的抗體反應中存在相當程度的類型特異性，該特異性提示體內優勢免疫表位位于蛋白的類型特異性結構域中。,V、嵐感染過程^歹/犮拔沐反應游錄絲表位游定泣。為了鑒定在感染過程中引發抗體反應的A型OspC的線性表位，產生了幾個重組OspC片段，并用ce-伯氏疏螺旋體B31MI感染血清(第8周)進行篩選(圖3)。B31MI是產生A型OspC的菌株。重組蛋白的表達通過使用HRP偶聯的S-蛋白的免疫印跡來證實。為了定位OspC的線性表位，用感染血清篩選OspC片段的免疫印跡。定位了含有l個或多個表位的兩個結構域，一個位于蛋白的C-末端一半a螺旋5的168和203位殘基之間，另一個在螺旋3和環5的136和150位殘基之間(在后文中分別稱為第a5和環5表位)。這些表位以前沒有在文獻中被表征過。o印C,身分析浙O印C翁稱游##"教^"欲。為了確定"5和環5表位在OspC蛋白上的空間位置，評估通過X-射線晶體學分析(Eicken等，2001;Kumaran等，2001)確定的坐標，并對單體和二體形式的A型OspC產生條帶和空間填充模型(數據未顯示)。單體形式的I和E型OspC蛋白也被模擬。這些分析表明在單體和二體形式的A、E和I型OspC蛋白上，環5表位均是表面暴露的。在最初的X-射線晶體學分析中，N-和C-末端的部分或者不是重組蛋白的一部分，或者不能被模擬。在任何情況下，被確定的結構表明N-和C-末端的位置彼此非常接近，并接近細胞膜。為了在類型內水平上評估環5和a5表位中的序列變異，對227個OspC序列進行了比對。這些分析表明，環5和a5表位在類型間水平上都是高度可變的，但是在類型內有相當高的保守性。圖4提供了(以表格的形式)每種OspC類型的環5和a5結構域序列，并標明了在分析的OspC序列中檢測到的每個特定序列的頻率。作為類型內水平上環5的保守性的證據，對57個A型環5表位序列的比較顯示出有53個與外面顯示的序列相同，只有1個或兩個殘基的差別。對于a5表位也觀察到了相似的結果。在43個A型OspC序列中，有42個在168和203位殘基之間是相同的。注意到被分析的a5表位序列較少，這是因為在許多情況下數據庫中可以獲得的序列是不完整的，缺少了C-末端的變化量。^"剪,對萃5表泣游拔#^應不慮漢#/"對個沐</、嵐游。鑒于環5的類型內保守性及其相對短的長度，環5表位可能是非常好的候選者，可用于開發嵌合的基于OspC環5的疫苗原。為了證實針對環5表位的抗體反應通常在感染過程中發生而且不是僅針對個體小鼠的，用來自被A型OspC產生菌株B31MI、LDP56和5A4感染的另外幾只小鼠的血清，篩査含有130-150位片段的環5的免疫印跡。在所有情況下，檢測到了識別該表位的抗體(圖5)。盡管在來自LDP56感染的小鼠2的感染血清中，針對環5的反應較弱，但較長時間的暴露清楚地顯示出環5在該動物中是抗原性的。這證實了針對這些表位的免疫應答不是僅針對個體動物的，并為它在疫苗開發中的可能的應用提供了進一步的支持。//論OspC被明確確定為萊姆病致病原因的重要因素(Grimm等，2004;Pal等，2004;Schwan等，1995)。有強烈的證據表明它在萊姆病螺旋體從中腸到唾液腺的轉移中發揮了重要作用(Pal等，2004)。此外，它在感染早期被選擇性表達，是優勢免疫抗原(Fingerle等，1995;Schwan等，1998;Wilske等，1993)，并且已經被別人假設為在萊姆病分離株的傳播能力中是關鍵的決定簇(Seinost等，1999)。本研究的目的是檢驗OspC類型和侵襲性感染之間的潛在關聯性，確定針對OspC的抗體反應是否是類型特異性的，并通過對感染過程中呈遞的線性表位進行定位來進一步定義OspC的抗原性結構。OspC的序列分析已描繪出了21個不同的OspC類型(Seinost等，1999)，已經推測它們中僅有4種(A、B、I和K型)與人類中的侵襲性感染有關(Seinost等，1999)。但是，最近的研究對這種推測的關聯性提出了疑問(Alghaferi等，2005)。為了進一步闡明這個問題，確定了從馬里蘭州人類患者回收的侵襲性和非侵襲性萊姆病分離株的OspC類型。為了完成這項任務，全長o印C基因被PCR擴增、測序，并進行了比較性序列分析。這些分析表明在該患者人群中與侵襲性人類感染有關的OspC類型還包括C、D和N型。盡管已經提出I型OspC產生菌株是與侵襲性人類感染有關的主要類型(Seinost等，1999)，但在馬里蘭州患者人群中沒有鑒定到攜帶I型o印C的侵襲性分離株。同樣地，Alghaferi等也沒有檢測到I型OspC產生菌株(Alghaferi等，2005)。綜合起來，這兩項研究已經在大巴爾的摩地區鑒定到了18種侵襲性分離株，分類如下A，n=5;B，n=2;C，n=l;D，n=l;H，n=l;K，n:3禾口N，n=7。因此，在該地理區域內，表現出產生A和N型OspC的侵襲性分離株占優勢。這些數據與只有4種OspC類型與人類中侵襲性感染有關的假說相悖。還需要對來自不同地理區域的更大的患者人群回收的分離株進行更多的分析以進一步評估OspC類型-侵襲性感染相關性的真實性，并確定在限定的地理區域中是否存在特定OspC類型流行程度的差異。使用OspC進行預防接種所提供的易變的保護作用結合不同OspC類型的描繪(Seinost等，1999)，增加了抗體反應可能是類型特異性的可能性。該假說得到了事實的支持，即用OspC預防接種被發現只提供了針對同樣菌株的保護作用(Bockenstadt等，1997;Gilmore等，1999a;Probert和LeFebvre，1994)。直到本報告之前，在感染過程中針對OspC的抗體反應的類型特異性還沒有被直接評估過。為了闡明這個問題，使用在表達已知OspC類型的克隆群體的小鼠中產生的感染血清，篩選了一系列A、B、C、D、H、K和N型全長重組OspC蛋白。感染血清的使用是重要的，因為這允許集中評估針對細菌在體內特異性呈遞的表位的抗體反應。這些分析顯示出，盡管在OspC的N和C末端結構域中存在強烈的序列保守性，但針對被分析的OspC類型的抗體反應是類型特異性的。例如，來自用A或D型菌株感染的小鼠的血清以類型特異性方式是免疫反應性的，與其它的OspC類型的交叉免疫性很少或沒有。盡管沒有分析對所有21個0spC類型的抗體反應，但上面顯示的數據表明了保守的結構域不是免疫優勢的，并且在感染過程中由細菌呈遞的OspC的線性表位被包含在蛋白的可變結構域中(即類型特異性結構域)。到目前為止只發表了幾項探索OspC的表位的定位或鑒定的研究。線性和構象表位都已被鑒定。Gilmore和Mbow證明了分別在前導肽之外短達6個殘基的獨立N-末端刪除和C-末端截掉13個殘基消除了了與單克隆抗體B5的結合(Gilmore等1999a;Gilmore，1998)。從這個結果可以推論B5單克隆抗體識別構象限定的表位(Gilmore等，1999b)。在該構象限定的表位中沒有鑒定包含抗體識別位點的精確殘基。與用單克隆抗體B5觀察到的相反，針對細胞關聯的天然OspC的多克隆抗體反應的分析表明，刪除OspC的C末端最后IO個殘基或N末端的延伸區不會消除OspC被感染過程中引發的IgG的識別。這種結果上的差別推斷是關注多克隆抗體還是單克隆抗體的反映。該數據當然不排除構象表位的存在，同時也清楚地證明了在OspC中存在線性表位。在較早的研究中，Mathieson等也報道了OspC中的線性表位(Mathieson等，1998)。他們發現OspC的C末端7個殘基構成了被從歐洲神經疏螺旋體病患者收集的血清中的IgM所識別的線性表位。盡管在該報告中沒有評估IgM結合，但刪除OspC的C末端10個殘基不會消除IgG結合。被感染誘導的IgG識別的表位顯示位于蛋白的幾個位點上。但是，這并不表明C末端表位不存在或不被感染期間引發的抗體所識別，而是表示在OspC中的其它位置上存在其它的表位。對較短OspC片段的免疫印跡分析允許對OspC表位的更準確定位。OspC的抗原性區被定位到兩個區域。一個跨過136-150位殘基，另一個跨過168-210位殘基。使用X-射線衍射分析獲得的坐標產生的結構模型，將136-150位殘基主要放置在表面暴露的環中，稱為環5(Kumaran等，2001)。環5在OspC的單體和二體模型中都是表面暴露的，并位于明顯的轉彎中。盡管已經證實重組OspC事實上形成二體，但還沒有確定天然的OspC是否在體內形成二體或更大的寡聚體。OspC的二體模型指出了一個明顯被包埋的界面，它包括了>30%以上的蛋白。這種程度的包埋界面表明了單體之間緊密的相互作用，被認為是蛋白的二體形式是生物學活性形式的指示(Kumaran等，2001;Eicken等，2001;Zuckert等，2001)。在OspC二體中，環5中的殘基被預計是推定的構象限定的配體結合袋的一部分，可能有生物學重要性。該帶電荷的袋排列有含有羰基的氨基酸，例如谷氨酸和天冬氨酸殘基。對于A、I(Kumaran等，2001)和E(Eicken等，2001)三種類型的OspC蛋白已經測定了晶體結構。在所有這些蛋白中，該推定的結合袋的溶劑結構是明顯高度保守的。環5對感染血清中的抗體的可接近性支持了該結構域可能是表面暴露的和可能可用于配體結合的假說。盡管環5和推定的配體結合袋具有強烈的類型間結構保守性，該結構域的序列在類型間水平上是高度可變的。c6結構域168-210位跨越殘基的序列在類型間水平上也是可變的，除了最后20個殘基是高度保守的之外。為了確定在類型內水平下是否存在足夠的保守性可以構建由一系列類型特異性表位組成的嵌合OspC疫苗，對OspC的序列進行了比對，并構建了樹形圖。通過這些分析，確定了227個序列的OspC類型(數據未顯示)。發現了環5和a5表位在類型內水平上都是高度保守的。例如，在57個序列中的54個中，A型OspC蛋白的環5表位是一致的，而在43個A型序列的42個中，o;5表位是保守的。在其它OspC類型中也注意到了這些結構域的顯著保守性，在C到I、M、N和O型中在環5和a5表位中表現出了絕對的類型內保守性。本研究證實了在侵襲性分離株中存在比以前認識到的更大的OspC多樣性。本研究還證實了在小鼠中針對OspC的抗體反應主要是類型特異性的，是由以前未表征的環5和a5表位限定的。較早的研究和這里提交的數據清楚地證實了單一OspC蛋白不會賦予針對多樣性菌株的保護作用(Bockenstedt等，1997)。一種可能的預防接種方法是利用在本報告中鑒定的表位開發重組嵌合OspC疫苗原。環5表位或環5和a5表位的組合，如果在人類中被證明具有一致的抗原性的話，將可以提供最大的希望。這些表位在長度上相對較短，是線性的，并且在類型內水平上高度保守。根據這些特點可以證明，構建可以賦予針對高度多樣化的萊姆病分離株的保護作用的環5-a5嵌合免疫原在技術上是可行的。實施例2、人類中針對A型OspC環5結構域的抗體反應的分析以及環5表位在萊姆病疫苗開發中的可能應用的評估萊姆病螺旋體的外表面蛋白C(OspC)是22kDa的優勢免疫(Fuchs等，1992)抗原，在蜱進食時和感染早期表達(Schwan等，1995)。盡管在天然感染過程中產生針對產生OspC的強烈抗體反應，但該反應并不能導致細菌被清除，因為OspC的產生在感染確立后不久就關閉了(Schwan等，1995)。OspC作為重要的毒力因子和萊姆病疫苗開發的潛在候選者而出現。但是，開發基于OspC的疫苗的努力受到了它在菌株間的異質性的阻礙(Theisen等，1993;Wilske等，1996;Wilske等，1993)。盡管用OspC預防接種引發了具有高度保護性的反應，但大多數研究報道的僅僅是菌株特異性的保護作用(Bockenstedt等，1997;Gihnore等，1996;Mbow等，1999;Probert等，1997;Rousselle等，1998;Scheiblhofer等，2003)。最近的分析為我們對OspC的抗原結構和菌株特異性保護作用的基礎的理解提供了重要的了解。已經定義了21種OspC類型，命名從A到U(Lagal等，2003;Seinost等，1999;Wang等，1999)。通過用產生特定OspC類型的伯氏疏螺旋體克隆種群感染小鼠，證實了在感染早期抗體反應主要是OspC類型特異性的(參見實施例1)。這表明在感染早期呈遞的優勢表位可能位于OspC的類型特異性結構域內。盡管較早的研究表明在21個OspC類型中只有4個與侵襲性感染有關(Seinost等，1999)，但最近的研究證實產生其它OspC類型的分離株也能夠建立侵襲性感染(Alghaferi等，2005;實施例l)。但是，A型OspC在引起人類侵襲性感染的菌株中顯然是主要的。A型OspC的表位作圖分析表明在小鼠中引發反應的優勢線性表位之一位于環5結構域中(參見實施例1)。環5結構域在類型間水平上是高度可變的，但是在給定類型的序列中是保守的(參見實施例l)。在本研究中，我們提煉了表位的位置，證實了它在完整細菌上的表面暴露，并證實了它引發了殺菌性抗體。大多數尋求確定OspC的優勢免疫表位的研究是使用小鼠進行的(Bockenstedt等,1997;Gilmore等，1996;Mbow等，1999;Probert等，1994)。但是，已經證明了針對某些表位的抗體反應在人類相對于小鼠和其它哺乳動物中是不同的(Lovrich等，2005)。本研究的第一個目的是確定OspC的環5結構域是否是被在人類感染期間引發的抗體所識別。理想情況下，這些分析可以使用從A型產生菌株的克隆種群感染的個體中收集的血清來進行。因為人們不能絕對肯定地確定個體是被異源的還是被同源的種群所感染，因此我們尋求鑒定對A型特異性序列表現出反應的患者血清。為了完成這個任務，通過酶聯免疫吸附分析(ELISA)對從患有游走性紅斑(萊姆病早期階段)的患者中收集的一組血清樣品進行了篩選。重組A型OspC和含有環5130到150位殘基的重組A型OspC的亞片段被用來包被96孔板(250ng重組蛋白/孔；0.1MNa2HPO4;4。C過夜)。將板封閉(磷酸鹽緩沖鹽水中的10%脫脂奶粉，0.5%Tween20;37°C2小時)和清洗，在每個孔中加入人類萊姆病患者血清(1:400稀釋)(37°C;1小時)。加入辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗人免疫球蛋白G(IgG;Sigma)(50/U，1:40,000稀釋)(1小時；37°C)，然后按照供應商(Sigma)的說明加入TMB底物(3，3，5，5-四甲基聯苯胺)。使用讀板器測定450nm的光密度值。用牛血清白蛋白包被另外的孔作為陰性對照。所有的分析都進行三份。顯示了平均的A450值和標準偏差。如圖6所示，發現幾個血清樣品對全長A型OspC和環5片段都具有強烈的IgG反應。血清樣品8和44與環5片段顯示出最強的免疫反應性，因此被選擇用于進一步的分析。為了更精確地確定環5結構域中被感染誘導的抗體所識別的殘基，使用來自患者8和44的血清和來自A型OspC產生株B13MI的克隆種群感染的小鼠的血清篩選了PepSpot陣列(參見實施例1)。PepSpot陣列由跨越A型OspC的環5結構域的12個到13個殘基重疊的肽組成(2個氨基酸步驟)，它們在Whatman50纖維素膜上成斑(150nmol/cm2;JPTPeptideTechnologiesGmbH，Berlin,德國)。將PepSpot膜阻斷(磷酸鹽緩沖液中的5%脫脂奶粉-0.5%Tween20)，清洗，用小鼠和人類血清樣品(分別用阻斷液1:1000和1:400稀釋)進行篩選，使用種類特異性的抗IgG抗血清檢測抗體的結合。盡管組成免疫反應性結構域的具體殘基在小鼠和人中略微有些不同，但主要的表位位于130到146位殘基之中(圖7)。在A型OspC序列中，該區域涵蓋了a螺旋3的C末端區域和環5的N-末端部分。OspC的晶體結構將環5在空間上放置在蛋白的明顯的彎曲上(Eicken等，2005;Kumaran等，2001;圖24)。該環已經被推斷是可能的配體結合袋的一部分(Kumaran等，2001)。為了確定環5是否展示在細胞表面并且在體外生長的螺旋體中可接近抗體，使用抗環5抗血清進行了免疫熒光分析(IFA)。使用伯氏疏螺旋體B31MI(A型OspC)，萬.paAm'的全細胞裂解液和帶有S-標簽的重組A型OspC進行的免疫印跡分析證明了環5抗血清是特異性的，建立了該抗血清對IFA的適合性。通過IFA分析的菌株由伯氏疏螺旋體B31MI(A型OspC)和LDP74(K類OspC)組成。螺旋體在33。C生長，轉移到37°〇生長3天以刺激OspC的表達。IFA使用被透化的細胞(丙酮固定的)和未透化的細胞(空氣干燥的)進行，標準方法按照以前的描述(Roberts等，2002)。載玻片使用1:1000稀釋的小鼠環5抗血清、小鼠免疫前的血清或兔鞭毛蛋白抗血清進行篩選。檢測使用AlexaFluor568偶聯的山羊a-小鼠IgG或AlexaFluor488偶聯的山羊a-兔IgG(10/ig/ml，在阻斷緩沖液中)進行。如果合適，載玻片在OlympusBX51熒光顯微鏡下使用若丹明或熒光素濾光片組觀察，或者通過暗視野顯微鏡觀察，并使用OlympusMagnaFIRE照相機照相。通過IFA觀察到的標記是高度特異性的，并與免疫印跡分析一致；產生A型的分離株是表面標記的，而伯氏疏螺旋體LDP74的K型OspC不是(數據未顯示)。此外，與在升高的溫度下OspC的上調相一致，IFA顯示出生長在37"C的螺旋體表面標記比生長在33'C的細胞明顯更多。識別內膜錨定的周質蛋白的Q!-FlaB抗血清不能標記未透化的細胞，但是可以容易地標記用丙酮透化的細胞(數據未顯示)。該對照證實了環5表位事實上是表面暴露的，并且用在IFA中的實驗條件不破壞細胞的完整性，并從而人為暴露了不是天然呈遞于細菌表面上的表位。環5抗血清有效結合細胞表面的OspC的能力增加了相互作用可能是殺菌性的可能性，正如對于針對全長OspC的抗體已經所證明的那樣(Bockenstedt等，1997;Ikushima等，2000;Jobe等2003;Lovrich等，2005;Rousselle等，1998)。為了確定耙定環5的抗體是否也表現出殺菌活性，使用在33C或移向37。C的溫度下培養的伯氏疏螺旋體分離株B31MI和LDP74進行了殺菌分析。通過離心收獲螺旋體、清洗，調整到每500Ad5xl()S個細胞(在BSK-H培養基中)，然后將12.5/xl轉移到無菌的0.65ml的微量離心管中。然后加入10Ml熱失活(56°C;30分鐘)的環5血清，加入或不加入豚鼠補體(7.5/d;SigmaChemical,St.Louis,Mo.)，將成分混合并在33或37'C孵育8小時。加入總共的水，使用Live/DeadBacLight染料(MolecularProbes,Eugene,Oreg.)按照制造商的說明書對螺旋體進行染色。簡單來說，將兩種染料加入到細胞中；SYT09和碘化丙啶。這些染料可以分辨活的細菌(即具有完整的膜)和膜損壞的細菌。活的細菌由于被SYT09染色而發出綠色熒光，而死的或損壞的細菌由于被碘化丙啶染色而發出紅色熒光。在用免疫前的熱失活的血清(含有或不含有補體)處理后，觀察到的帶有被破壞的膜的細胞的基線水平為25%。相反，暴露于抗a-環5抗血清的細胞有大約70%顯示出膜破壞。殺菌活性被確定是補體依賴性的。在用抗環5抗體處理后，在這里觀察到的空泡效應與使用其它抗OspC抗體時報道的一致(Bockenstedt等，1997;Escudero等，1997)。另外重要的是注意到與溫度升高時OspC的上調相一致，在生長于37°C下的螺旋體中死細胞的百分率同樣比生長在33i:下的細菌高(數據未顯示)。從這些數據明確說明了抗環5抗體是殺菌性的。數份報告已經為開發萊姆病疫苗概括出了清晰有力的合理性(綜述見Hanson和Edelman，2004)。但是，到目前為止，還沒有商業化的疫苗。在開發具有廣泛保護性的萊姆病疫苗的努力中，Baxter推行一種產生14種不同的全長重組OspC蛋白的疫苗混合物的策略(Hanson和Eddman，2004)。但是，該混合物被認為具有不可接受的反應原性。反應原性可能是由引發針對混合物中每種類型的OspC蛋白的獨特的保護性表位的足夠的反應而需要的大量蛋白所引起的。使用多種全長蛋白的混合物疫苗的潛在的問題是錯誤地導向針對保守的、無關的、非保護性表位的抗體反應的可能性。通過開發由每種優勢OspC類型的天然呈遞的優勢免疫線性表位構成的嵌合的重組免疫原，可能能夠克服這個問題。這種普遍的概念源自使用來自在不同感染階段表達的蛋白的表位開發瘧疾疫苗的嘗試(Hanson和Edelman，2004)。同樣的概念已經應用于A型鏈球菌的六價M蛋白疫苗的開發中(Dale，1999)，以及針對幾種其它病原體的疫苗的開發中，并獲得了極大的成功(Apta等，2006;Caro-Aguilar等，2005;Fan等，2005;Horvath等，2005;Kotloff等，2005;McNeil等，2005;Wang等，2005)。隨著對OspC的物理和抗原結構的新的了解，現在開發有效的、重組多價的、嵌合的OspC疫苗是可能的。新鑒定的環5結構域非常適合于包含在這樣的疫苗中。實施例3、基于OspC的四價重組嵌合疫苗原的開發萊姆病是北美和歐洲最常見的節肢動物傳播的疾病。目前，還沒有商業化的疫苗可用于人類。外表面蛋白C(OspC)具有抗原性和表達特性，使得它成為有吸引力的疫苗候選者；但是序列的異質性阻礙了它用作疫苗原。序列分析已經鑒定了21個明確定義的OspC種系組或"類型"(命名為A到U)。本研究報告了在人類和鼠類感染中B、K和D型OspC呈遞的線性表位的作圖，以及利用這些表位(以及以前鑒定的A型OspC線性表位)開發重組的四價嵌合疫苗原。構建體被發現在小鼠中具有高度的免疫原性，被誘導的抗體能夠表面標記體外培養的螺旋體。重要的是，疫苗接種誘導針對表達構建體中摻入的每種類型OspC的菌株的補體依賴性殺菌抗體。這些結果表明，有效的和廣泛保護性的、基于OspC的、多價萊姆病疫苗可以作為重組嵌合蛋白被生產。#辨與方法伯氏疏螺旋體分離株和培養伯氏疏螺旋體分離株B31MI(A型OspC)、LDP73(B型)、LDP116(D型)和LDP74(K型)的克隆種群[參見實施例1]按照以前的描述通過液面下鋪板來獲得[Sung等，2000]。每個克隆的OspC類型通過PCR擴增(Taq聚合酶，Promega)和w/C的DNA測序來確定，并通過系統發育分析分派類型[參見實施例l]。螺旋體按照指示在33或37。C下在完全BSK-H培養基(Sigma)中培養。不使務遂接艨游克潑浙f資(V-^)0印C歪^游生產通過每個分離株的相應基因的PCR擴增，產生了全長的B、K和D型OspC以及一系列截短物和片段。引物被設計成具有5'突出部，以允許pET-32Ek/LIC載體中不依賴連接酶的克隆(LIC)(表3)[實施例l]。所有的LIC方法基本上按照制造商(Novagen)的說明進行。簡單來說，在擴增和再生單鏈尾巴后，將擴增子與pET-32Ek/LIC載體退火，然后轉化到NovaBhie(DE3)大腸桿菌細胞中并繁殖。回收質粒并通過DNA測序證實插入片段的序列。為了蛋白純化，純化的質粒被用于轉化大腸桿菌BL21(DE3)細胞，并通過在對數生長期在培養基中加入IPTG(1mM)誘導蛋白表達，然后繼續保溫3小時。通過從pET-32Ek/LIC載體表達而加上的N-末端融合含有Trx-標簽、S-標簽以及六聚組氨酸(His-標簽)基序。His-標簽被用于允許通過鎳親和層析純化重組蛋白。簡單來說，將細胞裂解，分別用benzonase核酸酶和重組溶菌酶將核酸和細胞壁肽聚糖降解。按照制造商(Novagen)的說明，可溶的蛋白離心(16000xg，15分鐘)澄清，通過固定的鎳柱，清洗并洗脫。被洗脫的蛋白使用截留分子量為10kDa的膜(Slid-a-lyzer,Pierce)對磷酸鹽緩沖液(PBS;pH7.4)進行深度透析，最終的蛋白濃度通過<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>^藶欲跡分析；5、D浙《型C^7C游表泣^凰。為了允許對感染期間相關的表位進行作圖，用104個表達B、K或D型OspC的螺旋體克隆種群感染C3H/HeJ小鼠，在第2、4、6、8和12周通過尾部取血收集血液。這些血清按照實施例1中的描述被用來篩選純化的OspC蛋白和截短物。將重組蛋白進行SDS-PAGE，轉移至UPVDF上，用1:1000稀釋的類型特異性鼠感染血清(在第6周收集)進行篩選。同樣，重組蛋白用來自已知被表達B、K或D型OspC的伯氏疏螺旋體菌株感染的患者的血清(1:400)(由Dr.AllenSteere好意提供)進行篩選。使用適合的IgG特異性辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的第二抗體，結果通過化學發光顯示。拜份浚合疫度嚴游稱建浙表這。選擇A型的環5區(131至lj149位氨基酸)和B(160-201位氨基酸)、K(161-201位氨基酸)和D(161-201位氨基酸)型的a螺旋5區包含在四價試驗疫苗原中。使用上述的重組質粒和表4中列出的引物對每個含有表位的區域進行PCR擴增。PCR條件是標準的，開始為2分鐘94'C的變性步驟，然后進行35個循環的94。C變性15秒、50°C引物退火30秒和72'C延伸60秒，最后72C延伸7分鐘。引物被設計為具有載體特異性的LIC尾部或具有未結構的蛋白酶抗性接頭序列作為5'突出部(圖9A)[Crasto和Feng，2000]。所有的擴增子在使用TAE緩沖液的瓊脂糖凝膠中通過電泳進行分析并進行凝膠純化(QiaQuick凝膠提取試劑盒，Qiagen)。然后后續輪的PCR中使用被純化的產物作為模板。在第二輪中，A型環5和B型a螺旋5的擴增子被合并作為模板。變性后，擴增子通過它們的互補接頭序列進行退火，以允許使用A型環5正向引物和B型a螺旋5反向引物進行交疊延伸和隨后的擴增。K和D型a螺旋5序列以同樣方式被加入到構建體中，除了在前IO個循環后將退火溫度升高到6(TC以增加退火特異性之外。最終的產物被退火到編碼N-末端六聚組氨酸標簽融合(Novagen)的pET-46Ek/LIC表達載體中，轉化NovaBlue(DE3)大腸桿菌細胞。通過對純化的質粒進行DNA測序來證實疫苗原的序列。蛋白的表達和純化按照上面的描述完成。表4、用于產生ABKD嵌合疫苗原的PCR引物。LIC尾巴用粗體表示，接頭序列被下劃線。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>使用四價ABKD嵌合疫苗原免疫小鼠26周齡的雄性C3H/HeJ系小鼠用完全弗氏佐劑(CFA)按1:1比率乳化的50pg嵌合疫苗原進行免疫接種。給藥的疫苗原的總體積為200/^，分開用于腹膜內和皮下脂肪中。三只對照小鼠施用CFA中的PBS進行假免疫接種。在第2和第4周，小鼠用在弗氏不完全佐劑中的50Mg蛋白進行加強。假接種的小鼠接受佐劑中的PBS。在首次注射之前和第6周時，通過剪尾對所有小鼠進行取血。^i:"^會資度嚴游,度嚴絲游伊仿通過免疫印跡分析和ELISA評估疫苗原的免疫原性。免疫印跡按照上面的描述產生和篩選。通過免疫印跡對每種純化的重組蛋白(A、B、K、D型OspC以及嵌合疫苗原)lMg進行分析。重組的BBN39，一種來自伯氏疏螺旋體的無關的帶有His-標簽的蛋白(旁系同源蛋白家族163)，被用作陰性對照。為了證實同樣的蛋白載量，用抗His標簽的單克隆抗體(mAb)(1:2000，Novagen)篩選一個斑點。為了評估對免疫接種的反應，同樣的斑點用1:500稀釋的小鼠抗ABKD抗血清進行篩選。HRP偶聯的山羊抗小鼠IgG(1:40000稀釋)被用作第二抗體，通過化學發光觀察結合。ELISA分析使用96孔板(Costar3590;Corning)進行，每個孔用碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中的100ng疫苗構建體或重組OspC(A、B、K或D型)進行包被(4°C16小時)。將板封閉(1%BSA的PBS，含有0.2%Tween-20(PBS-T);2小時)，用PBS-T洗3次，在雙份板的孔中加入連續稀釋的抗ABKD抗血清(100/iL;1:50到1:109350稀釋)(l小時)。HRP偶聯的山羊抗小鼠IgG(1:20000)被用作第二抗體，ABTS用作顯色底物。在ELISA讀板器(ELx808;Biotek)上，在反應速度是線性時，在405nm讀取吸光度。通過對吸光值曲線用四參數邏輯方程(SigmaPlot)擬合S形曲線并計算對應于最高吸光度平臺的50%的稀釋度的倒數，來計算滴度。貧v45AD貧體反應游,瘦承歪^，摔M分布通過用每孔100ng嵌合構建體包被雙份ELISA板來評估抗ABKD抗體反應的同種型分布。按照上面的描述進行洗板和封閉。雙份分析了從12只被免疫的小鼠收集的抗ABKD抗血清(100/iL;1:10000倍；1小時)。被結合的疫苗原特異性Ig通過與同種型特異的生物素化的第二抗體孵育(l小時；小鼠同種型試劑盒；Zymed)來檢測。結合的生物素化抗體通過HRP偶聯的鏈親和素(30分鐘)和生色底物ABTS來檢測。所有的孵育都在室溫完成。為了確定ABKD嵌合疫苗原中包含的表位是否呈遞在體外培養的伯氏疏螺旋體的表面，進行了IFA分析。為了最大化OspC的生產，將產生A、B、K和D型OspC的克隆種群的培養物的溫度從33X:改變為37°C。通過離心(7000xg，15分鐘)收集5mL濃培養物(大約107-108個細胞/mL)中的螺旋體，用PBS洗3次，重新懸浮在5mLPBS中，將lOOiuL鋪在帶電荷的玻片(SuperfrostPlus,FisherScientific)的2cm2面積上。一組玻片空氣干燥，另一組用丙酮固定。將玻片封閉(1小時，3。/。BSA的PBS-T)，然后用1:100稀釋的抗ABKD抗血清、免疫前血清或1:1000稀釋的兔抗鞭毛蛋白抗血清進行篩選(1小時)。被結合的抗體通過Alexafluor568偶聯的山羊抗小鼠IgG或Alexafluor488-偶聯的山羊抗兔IgG(10/ig/mL封閉緩沖液)進行檢測。在每個步驟之間玻片用PBS-T洗3次，所有的孵育都是在加濕的暗室中于室溫進行1小日寸。玻片帶有Fluoromount-G(ElectronMicroscopySciences)，視情況在OlympusBX51熒光顯微鏡下用若丹明或熒光素濾光片組觀察，或者通過暗視野顯微鏡觀察，使用OlympusMagnaFire數碼照相機照相。殺慮惠絲游伊仿體外評估抗ABKD抗血清殺死伯氏疏螺旋體的能力。如上所述，將溫度從33'C移到37"的螺旋體用BSK-H培養基洗3次，細胞密度被調整為大約1()S細胞/mL。將8mL細胞與8mL豚鼠樸體(Sigma)和4ML每種試驗血清混合(在56。C熱失活；30分鐘)。對照包括不含補體的熱失活抗ABKD抗血清、只有補體、和合并的含有補體的熱失活的免疫前血清。視需要，通過加入BSK-H培養基將總反應體積調整到20/xL，將樣品在37。C孵育18小時。使用BacLightLIVE/DEAD分析(MolecularProbes),和使用帶有熒光素或若丹明濾光片組的OlympusBX51熒光顯微鏡對5個高倍率視野中活的和死的/損傷的細胞進行人工計數，評估殺死情況。錄榮鑒定V、嵐浙乂類感燊過程^至遂游5、Df/7K星yO卬C游表泣到目前為止，已經從被確定患有侵襲性感染的患者中回收了A、B、C、D、H、I、K和N型OspC[Seinost等，1999;實施例1;Alghaferi等，2005]。從這些OspC類型中選擇了4個(A、B、K和D)來為使用多價嵌合OspC疫苗的原理建立驗證。因為只鑒定了在感染期間呈遞的A型OspC的表位，因此在本研究中第一步是鑒定B、K和D型OspC中與感染相關的表位。為了完成這項任務，用來自被伯氏疏螺旋體(B、K或D型OspC)的克隆種群感染的小鼠的血清、或已經被確定至少部分被產生B、K或D型OspC的伯氏疏螺旋體菌株感染的人類萊姆病患者的血清(個人交流，Dr.AllenSteere和KathrynJones)，對每種類型的截短物或片段的免疫印跡進行篩選。在小鼠中第6周時的抗體反應是類型特異性的；但是，某些人類血清顯示出類型間的交叉免疫反應性(數據未顯示)，表明這些患者可能感染了混合的螺旋體種群。對于小鼠感染血清來說，B型OspC的表位位于a螺旋5中(175和200位氨基酸之間)。人類的感染血清與位置相同的片段(164到185位氨基酸)反應，表明B型的a螺旋5區是抗原性的。在小鼠中，K型OspC的表位被作圖在148到160位氨基酸之間，在人類中作圖于第a螺旋5區中(160到175位氨基酸之間)。在小鼠和人類中，D型OspC的表位被作圖在a螺旋5區(167到180位氨基酸之間)，盡管人類血清識別其它多個表位。這些數據表明適合選擇B、K和D型OspC的a螺旋5區包含在四價ABKD疫苗原構建體中。，份淤合0印Ci^度嚴游賴建、表這浙錄眾使用上面定義的B、K和D型a螺旋5表位和較早的研究中[實施例l]定義的A型環5表位，產生了由4個含有表位的區域構成的多價的嵌合重組疫苗原。這些表位由短的、無結構的、具有蛋白酶抗性的接頭序列相連(圖9B)。重組疫苗原長度為169個氨基酸，分子量為18.0kDa，等電點為6.49。其結構被預測為基本上是螺旋的[Gasteiger等2005;Kneller等，l闊，并具有高穩定指數[G腦p腿d等，1990]。在用PBS透析后，重組疫苗原有一些沉淀；但是，大約500/ig/mL保持溶解，該溶解的蛋白被用于所有的實驗。純化的疫苗原蛋白的SDS-PAGE分析證實了分子量18kDa的單一條帶，沒有污染蛋白。凝會,虔嚴,^腐^游力i^嚴絲為了評估ABKD嵌合疫苗原及其個體組成表位的抗體反應，對0311/1^11小鼠施用弗氏佐劑中的疫苗原。從被免疫的(11=12)和假(？83+佐劑)免疫的小鼠(n=3)收集血清，并評估與ABKD嵌合疫苗原和A、B、K和D型全長重組OspC蛋白的反應性。Western印跡分析證實了抗ABKD抗血清與疫苗原蛋白和A、B和K型重組OspC發生強烈的反應。相反，與嵌合構建體的C末端D型OspC表位的反應性相當弱(圖10)。任何血清都與陰性對照蛋白(r-BBN39)沒有反應性，來自假免疫小鼠的血清不與任何蛋白反應。對血清反應性的基于ELISA的定量滴定證實了針對ABKD嵌合疫苗原蛋白的高滴度IgG反應，平均滴度為27800(圖11A)。通過對與固定的全長重組OspC蛋白的結合進行評估，完成了對針對類型特異性的表位的反應性的滴定。觀察到了針對個體表位的抗體滴度顯著不同(圖11B)。值得注意的是，表位特異性的滴度隨著接近疫苗原的C末端而降低。貧J3^)貧i獰游扇度承歪^^^麥分布免疫球蛋白同種型分布對于評估疫苗特異性抗體的潛在效應器功能是關鍵的。為了評估ABKD嵌合疫苗原誘導的免疫球蛋白重鏈類別轉換，通過ELISA確定同種型分布。主要的同種型是IgGl，略低一些的是IgG2a和IgG2b。6周的血清只顯示出有限水平的IgM、IgG3或IgA(圖12)。顧接,i^^^分析通過間接免疫熒光顯微鏡評估了針對ABKD嵌合疫苗原的每個表位引發的抗體與疏螺旋體細胞表面上的OspC結合的能力。在產生A、B、K和D型OspC的細胞上觀察到了特異性的表面標記(數據未顯示)。熒光信號的強度與類型特異性滴度相一致，并具有對于帶有A或B型OspC細胞所觀察到的最大強度的熒光。帶有K或D型細胞的熒光強度較弱，染色不規則，使細胞具有斑駁的外表。在用匹配的免疫前血清進行探測的細胞中沒有觀察到反應性。抗鞭毛蛋白抗體對空氣固定的細胞沒有表面標記，這被用來證實細胞的外膜是完整的，并且被檢測的表位天然呈遞于細胞的表面。正如預期的那樣，用丙酮通透化的細胞被抗鞭毛蛋白抗體所標記(數據未顯示)。^剪^WAX)凝合度葳嚴遂療豫欽接神誘導殺蘑貧銀使用LIVE/DEADBacLight分析[Tily等，2001;Ledin等，2005;Elias等，2000;Montgomaery等，2006;Elias等，2002;Shin等，2004]評估了抗ABKD抗血清的殺菌活性。檢測了針對帶有包含在嵌合疫苗構建體中的所有類型的OspC的菌株的殺菌活性。與抗ABKD抗血清一起孵育，誘導了明顯的細胞聚集。活的和死的細胞都存在于聚集體中。由于對聚集體中細胞進行計數的固有的困難度，只對沒有聚集的游離細胞進行計數來確定了活的和死的細胞的百分數。對于所有4種OspC類型來說，用于殺菌分析的培養物中死細胞的背景水平大約為20-30%。該死細胞的背景水平與在我們實驗室中在將培養物從33°。轉移到37。C以上調OspC表達后觀察到的相一致。在殺菌分析中，殺死以補體依賴性的方式進行，死細胞的百分率顯著地增加到背景之上，到56-90%。在所有情況下死細胞的數量至少為在任何對照中看到的死細胞數量的兩倍。僅用補體不引發殺菌。合并的免疫前血清不引發殺菌活性，表明針對疫苗原的特異性免疫應答為殺菌活性所必需。嫌幾項研究已經探索了萊姆病螺旋體的OspC作為潛在的疫苗原的可能應用。盡管用OspC免疫接種引發了保護性的抗體反應，但已有報道保護作用主要是菌株特異性的[Gilmore等，1996;Scheiblhofer等，2003;Wallich等，2001;B層n等，2005;Probert禾口LeFebvre，1994;Gilmore等，2003]。使用多種OspC蛋白的混合物引發更廣的保護作用的嘗試被證明是不成功的。Baxter試驗了由14種不同的全長OspC變異體組成的OspC混合物；但是，它們不能引發針對每個變異體的獨特結構域的足夠的抗體滴度，而這是產生廣泛保護作用的先決條件。此外，還報道了不能接受反應原性[Hanson等，2004]。對于混合物疫苗的普遍的擔心是可能會誤導針對在感染中不是天然呈遞以及不能引發保護性抗體的表位的抗體反應。嵌合疫苗的產生提供了一種替代方法，可以避開這些在使用簡單的重組蛋白的混合物時遇到的問題。在針對癥疾[Hanson等2004;Caro-Aguilar等，2005]、A類鏈球菌[McNeil等，2005;Dale等，2005;Hu等，2002;Dale,1999;Kotloff等，2005;Horvath等，2005]和幾種病毒[Apt等，2006;Fan禾卩Mei，2005;Wang等，2005;Bouche等，2005]的疫苗的開發中，已經探索由一系列優勢免疫表位組成的嵌合疫苗。如果多價OspC疫苗要具有廣泛的保護作用，必需在疫苗原中摻入足夠多的表位以引發針對多樣的菌株的保護性反應。系統進化分析極大地便利了朝向這種疫苗原的構建前進的能力，在系統進化分析中已描繪了21個不同的0spC類別，命名從A到U[Seinost等，1999],其中只有一個亞類已經與人類中的侵襲性感染相關聯[Seinost等，1999;實施例l;Alghaferi等，n2005]。嵌合疫苗原的開發需要對OspC的表位結構的詳細理解。以前己有幾個報道描述了OspC表位的位置[Gilmore等，1996;Jobe等，2003;Lovrich等，2005]。兩項研究報道了負責引發殺菌性抗體的表位位于OspC的C末端結構域中[Jobe等，2003;Lovrich等，2005];但是，因為該結構域是相對保守的，因此不清楚為什么針對C末端的抗體不具有廣泛的保護作用。Matheisen等也建議C末端是抗體反應的主要目標，并注意到了從歐洲神經疏螺旋體病患者獲得的血清與全長OspC的反應性高于與C末端截去了10個氨基酸的形式的反應性[Mathiesen等，1998]。從此，推斷必定是C末端表位；但是，因為測試的抗原由未知類型的單一0spc變異體構成，C末端的更廣泛識別可能是由于該結構域的更高的保守性，而不必須表明C末端是免疫優勢的。Gilmore等證實了用非變性的，而不是變性的，重組OspC免疫接種小鼠產生了針對同源分離株的攻擊的保護作用[Gilmore等，1996;Gilmore禾PMbow，1999]，表明保護性表位可能是構象限定的。在另一項分析中，Gilmore等分析了來自單一類型的OspC(A型)的有限數量的截短OspC與造成被動免疫的抗OspC單克隆抗體的免疫反應性[Gilmore禾BMbow，1999]。刪除N-端或C-端消除了重組蛋白被單克隆抗體檢測，進一步提示了構象或不連續表位的存在。還不清楚單克隆抗體識別的表位是否是免疫優勢的、是否與自然感染過程相關、或是否在不同的OspC類型中是保守的。最近，已經對A型OspC的線性優勢免疫表位進行了作圖，發現它位于環5和a螺旋5區內[實施例1]。含有A型環5表位的重組蛋白在小鼠中引發了殺菌性抗體，提高了個體類型特異性表位可以用于疫苗開發中的可能性[參見實施例2]。在本報告中，對感染早期呈遞的B、K和D型OspC表位作圖，并已經構建了基于這些表位的四價嵌合疫苗原。該ABKD嵌合疫苗原在小鼠中是高度免疫原性的，引發結合細胞表面的OspC的抗體，并以補體依賴性的方式有效地殺死產生A、B、K和D型OspC的菌株。在我們開發四價嵌合試驗疫苗的工作中，第一步是鑒定在小鼠和人類感染過程中出現的B、K和D型OspC的線性表位。這些分析基本上是按照實施例1中鑒定A型OspC的環5和ce螺旋5表位的描述進行。簡單來說，使用來自克隆分離株感染的小鼠和來自至少部分被表達相應OspC類型的菌株感染的人類的血清篩選了廣泛的B、K和D型OspC截短物和片段組。使用來自實驗感染小鼠的血清進行精確的表位作圖是可能的；但是，在自然感染的人類中，抗體反應將針對更廣泛的表位陣列。這并不令人吃驚，可能反映了針對早期感染過程中通常不在細菌細胞表面呈遞的OspC表位的抗體反應的擴展。新的表位，其中某些可能來自OspC的保守結構域(例如a螺旋l)，一旦細菌細胞死亡并從膜上釋放OspC時，可以變得能夠接近。這表明了在表位作圖中使用人類血清樣品的警告；即感染的準確過程一般來說是不清楚的，感染種群的克隆性是值得懷疑的[Wang等，1999;Ruzic-Sabljic等，2006;Hofmeister等，1999;Guttman等，1996;Rijpkema等，1997]。無論如何，從人類血清樣品的分析中可以清楚地看到，第a螺旋5區中的表位在感染過程中被產生A、B、K和D型OspC的菌株所識別。此外，在幾種不同類型OspC產生菌株中對a螺旋5的反應的一致性可能是該OspC結構域功能相關性的指示。盡管a螺旋5和環5的序列在OspC類型之間是可變的，但這些區域在每個類型內是高度保守的[參見實施例l]。這表明對于嵌合疫苗來說，只有有限數量的OspC表位對于產生廣泛的保護作用來說是需要的。作為開發廣泛保護性的疫苗原的第一步，A型的環5表位和來自B、K和D型OspC的a螺旋5表位被用于開發試驗疫苗原。使用被設計成編碼接頭序列的引物，對含有這些表位的區域進行PCR擴增。這允許在產生嵌合的構建體中使用PCR交疊延伸，并提供了將表位與短的、無結構的、具有蛋白酶抗性的氨基酸序列分離開的方法[Crasto和Feng,2000]。在本研究中開發的實驗性的基于OspC的、四價ABKD嵌合疫苗原在所有的試驗小鼠(n=12)中引發了一致的、高滴度的IgG抗體反應。此外，疫苗原引發了針對每種被摻入的表位的抗體。有趣的是，表位特異性滴度顯得受到表位在構建體中的位置的影響。從N-末端表位(A型的環5)到C-末端的表位(D型的aa螺旋5)，滴度逐漸減小。C-末端表位滴度降低的現象在早期基于鏈球菌M蛋白的嵌合疫苗的研究中也有報道[Dale等，1993;Dale等，1996]。這種滴度的位置特異性影響的基礎還不清楚，但是可能是由于C-末端結構的體內降解或改變[Dale等，1999]。盡管針對疏螺旋體感染的保護作用所必需的Th細胞因子反應和相關的免疫球蛋白同種型的分布還沒有被完全解決[Kraiczy等，n2000;Widhe等，2004;Keane-Myers等，1995;Keane-Myers等，1996;Keane-Myers和Nickell，1995]，但該模式的確定是疫苗原開發中的重要步驟，可以提供關于不同的疫苗原構建體的潛在保護能力的重要信息。反應的同種型分布通過ELISA確定，觀察到了與混合的Thl和Th2細胞因子反應有關的重鏈Ig同種型。在本研究中注意到的類型轉換提示了充分的T細胞輔助，即使是在疫苗原中沒有摻入確定的T-細胞表位的情況下。使用預測性肽結合算法對鼠(H2Ak/H2Ek)和人類(HLA-DRB1)II類MHC亞群進行了疫苗原序列分析，發現了疫苗原中預計能結合所有可用的等位基因的可能的T-細胞表位[Rammensee等，1999;Zhang等，2005]。預測的結合肽之一，LANSVKELT，在構建體中重復了3次，該重復對于引發Th反應可能是重要的[Jiang等，1999;Ahlborg等，1998;Kj讓lf等，1997;Theisen等，2000]。盡管對可能的T-細胞表位的分析不是窮盡式的，但預測支持了我們的數據，表明嵌合疫苗原可以在小鼠中引發T-淋巴細胞輔助。此外，它提示該構建體在人類中可能也是這樣做的，不需要合并混雜的T-細胞表位序列。弗氏佐劑在產生這種同種型分布中的重要性還不了解，但是對于明磯和其它適合用于人類的佐劑來說，需要評估反應和同種型分布[tenHagen等，1993;Lindblad，2004;Petrovsky禾口Aguilar，2004;Brewer等，1999;McNeela和Mills,2001]。此外，嵌合疫苗原的表位次序或結構的改變可以提供一種機制，通過它可以對免疫應答進行定制，以最大化體內保護作用[Tongren等，2005;Cai等，n2004]。對于疫苗開發來說，因為對疫苗原的反應是生產性的，被引發的抗體必須能夠結合到完整的伯氏疏螺旋體細胞的表面并導致殺菌。IFA分析顯示出在產生A、B、K和D型OspC的菌株的細胞表面有很強的標記。即使針對D型表位的抗體滴度比更靠近N-末端的表位引發的滴度明顯要低，但D型產生菌株的表面標記也相當明顯。在每種OspC類型的培養物中的細胞亞群中觀察到沒有被抗ABKD抗血清標記，表明那些細胞不表達OspC。但是，在體內，已經證實了在從蜱向哺乳動物的傳播過程中以及哺乳動物感染早期，大多數的細胞、即便不是所有的、都表達OspC[Gilmore等，2001;Zhong等，1997]。抗ABKD抗體有效殺死細胞的能力也被評估。來自疫苗接種的小鼠的血清以補體依賴性方式有效殺死表達A、B、K和D型OspC蛋白的螺旋體。盡管對于所有的OspC類型來說，殺死低于100%,這可能是在種群的細胞中，體外OspC表達的異質性的作用，這種現象在體內己經被很好地記錄了[Schwan等，1995;Schwan和Piesman，2000;Hu等，1996]。本實施例描述了新的、重組的、嵌合的、多價的、基于OspC的萊姆病疫苗的構建及其原理證明。使用基于表位的重組嵌合蛋白允許在同一個構建體中覆蓋多種OspC類型，并避開誤導針對無關的蛋白結構域的免疫應答的潛在的問題。對主動感染過程中被識別的線性表位的作圖是嵌合疫苗開發的關鍵組成，對于4種與人類侵襲性感染有關的OspC類型已經被成功完成。包含在疫苗原中的表位引發了類型特異性的IgG抗體，它們能夠結合疏螺旋體細胞表面的OspC，并行使補體介導的殺菌。實施例4、針對目的在于提高免疫原性的嵌合多價萊姆病疫苗變異體的免疫應答在本研究中，我們探索了改善構建體的溶解性，并評估了表位布置、表位重復以及包含推定的C-末端穩定化標簽對免疫應答的潛在影響。這些分析為廣泛保護性的OspC疫苗和普遍意義上構建嵌合疫苗的設計策略提供了新的了解。翻鄉C游表這微眾A、B、K和D型重組全長OspC蛋白按照以前的描述產生[參見實施例1和2]。簡單來說，來自伯氏疏螺旋體分離株B31MI(A型OspC)、LDP73(B型)、LDP74(K型)和LDP116(D型)的克隆種群的cwpC基因被PCR擴增，使用具有5'突出的引物，以允許在pET-32Ek/LIC載體(Novagen)中不依賴連接酶的克隆(LIC)[實施例l]。在擴增和再生單鏈尾部后，將擴增子與pET-32Ek/LIC載體退火，載體轉化到NovaBlue(DE3)大腸桿菌細胞中并進行增殖。通過DNA測序(MWG-Biotech)證實插入序列之后，使用IPTG(lmM)誘導蛋白的表達。通過鎳親和層析，使用pET-32Ek/LIC表達標簽編碼的六聚組氨酸基序(Novagen)來純化蛋白。將咪唑洗脫的蛋白穿過截留分子量為10kDa的膜(Slid-a-lyzer，Pierce)對磷酸鹽緩沖鹽水(PBS;pH7.4)深度透析，蛋白濃度通過BCA分析(Pierce)進行定量，制備物的純度通過SDS-PAGE評估。爿5KZ)疫薪變弄體游溝建、表達浙錄化為了研究跨疫苗構建體的具體表位的IgG滴度降低的可能機制和解決方法，構建了原始疫苗的多種變異體。所有的疫苗變異體都是基于以前描述的ABKD疫苗原的序列[實施例3]，并含有同樣的含有表位的序列。這些包括A型的環5區(131到149位氨基酸)以及B型(160-201位氨基酸)、K型(161-201位氨基酸)和D型(161-201位氨基酸)的o;螺旋5區(圖13小圖)。ABKDppa和ABKDgg分別在原始的ABKD構建體的C-末端加上了Pro-Pro-Ala或Gly-Gly基序。這兩種構建體都是通過使用反向引物(表5)擴增原始的ABKD構建體而制備的，這些引物通過編碼適當氮基酸的5'突出部加入基序(圖13A)。其它的疫苗變異體通過交疊退火和延伸技術制備，與原始的ABKD疫苗原的構建[實施例3]中使用的相同。ABKDD構建體通過使用帶有編碼無結構的、具有蛋白酶抗性的接頭的3'尾部序列的反向引物，再次擴增ABKD構建體而制備。這使得PCR產物退火到含有D型OspC表位的序列中，所述序列已經使用在5'端編碼互補接頭的序列擴增，對退火的構建體進行后續的交疊延伸和擴增(圖13B)。ADBK構建體通過將分別擴增的含有A和D型表位的區域彼此退火，然后與從原始ABKD構建體擴增的B和K型a螺旋5表位區域進行退火而制備(圖13C)。ADBKD構建體通過將來自ABKD和ADBK序列的重組子退火而制備(圖13D)。在所有情況下，PCR擴增以GoT叫Green(Promega)完成，使用起始2分鐘的94X:變性步驟，接著為35個循環的94'C15秒、引物在5(TC退火30秒、在72'C延伸60秒，最后72"C延伸7分鐘。所有在這些疫苗原的構建中使用的引物列在表5中。所有的PCR產物在用作后續PCR反應的模板之前被凝膠純化(Qiagen)。最后的擴增子通過不依賴連接酶的克隆退火到pET-46Ek/LIC載體中，并轉化到Novablue(DE3)大腸桿菌細胞中。使用T7引物篩選具有插入片段的菌落，回收質粒(QiafilterMidi，Qiagen)，通過DNA測序證實插入片段。重組蛋白按照上面的描述表達和純化。在純化后，將疫苗蛋白通過截留分子量為10kDa的膜(Slid-a-lyzer,Pierce)對PBS(pH7.4)或含有100mM磷酸鹽、100mMNaCl、50mM精氨酸、50mM谷氨酸的pH8緩沖液(Arg/Glu緩沖液)[GoIovanov等，2004]進行透析，更換3次緩沖液。構建體的純度通過SDS-PAGE進行評估。表5、用于構建嵌合疫苗原的引物。LIC尾部用粗體表示，接頭序列被下劃線。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>種構建體3只)。因為變異體的免疫原性將被互相比較，因此希望以摩爾基礎施用蛋白，以補償每單位疫苗原質量的表位數的差別。每只小鼠每次免疫接種接受大約2.8納摩爾蛋白，為50]LigABKD、ABKDppa、ABKDgg和ADBK構建體或62.5jugABKDD和ADBKD構建體。小鼠用在弗氏完全佐劑中的疫苗免疫，然后在第2周和第4周用弗氏不完全佐劑加強。在第一次接種前和第6周，通過剪尾從所有小鼠收集血清。為了確定佐劑對總的和表位特異性抗體的滴度的影響以及對同種型分布的影響，用如上所述在弗氏佐劑中乳化的、或吸附在明礬(ImjectAlum,Pierce)上的ABKD疫苗原免疫小鼠(每種佐劑6只)，在第6周通過剪尾收集血清。疫漭^^沐誘導游表位錄^絲/gG裙度游,仿通過Western印跡和ELISA對每種疫苗原的免疫原性進行了評估。在western印跡中，A、B、K、D型重組OspC以每道500ng在還原性樣品緩沖液中上樣，在12.5%的SDS-PAGE凝膠Criterion,Biorad)上電泳，然后電轉印到PVDF(Immobilon-P，Millipore)。用含有0.2%Tween-20的磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS-T)中的1%BSA封閉印跡。使用PBS-T1:2500稀釋的每種抗血清探査印跡1小時，然后洗3次。為了證實同樣的蛋白載量，一個印跡用抗His標簽的單克隆抗體(l:2000;Novagen)進行篩選。第二級檢測使用1:40000稀釋的過氧化物酶偶聯的山羊抗小鼠IgG和化學發光(SuperSignalPico，Pierce)進行。對于定量分析來說，通過ELISA分析確定OspC類型特異性IgG的滴度。A、B、K或D型重組OspC被包被在96孔板上(Costar3590;Corning)，100ng/孔，在碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中于4"C進行16小時。將板封閉(含有0.2%Tween-20的PBS(PBS-T)中的1。/。BSA;2小時)，用PBS-T洗3次，然后在雙份板的孔中加入連續稀釋的抗疫苗原抗血清(lOOpL)(l小時)。HRP偶聯的山羊抗小鼠IgG(1:20000)用作第二抗體，ABTS用作生色底物。在反應速度為線性時，在ELISA讀板器(ELx808;Biotek)上于405nm讀取吸光度，通過四參數邏輯方程(SigmaPlot)將S形曲線擬合成吸光度曲線擬合來計算滴度。滴度被報告為對應于50%最大吸光度平臺的稀釋度的倒數。表泣特，絲,資球歪冷,#麥分*游據定通過ELISA評估了針對ABKD、ABKDD和ADBKD疫苗變異體構建體的抗體反應的同種型分布。將96孔板用每孔100ng的A、B、K和D型重組OspC包被。按照上面的描述對板進行封閉和清洗。抗疫苗原的抗血清被加入到板中，進行雙份分析(100iitL;1:10000;1小時)。結合的表位特異性Ig通過與同種型特異性的生物素化第二抗體孵育(1小時；小鼠同種型分型試劑盒；Zymed)來檢測。第二抗體通過過氧化物酶偶聯的鏈親和素(30分鐘)和生色底物ABTS來檢測。所有的孵育都在室溫下進行。i^葳特^絲r沐^紛遞產生ZFW-7浙幾4游,/定被免疫接種的小鼠的脾細胞的細胞因子反應通過使用疫苗原按照修改的Abuodeh等[1999]的方法在體外再刺激來進行評估。被接種的小鼠通過二氧化碳麻醉來安樂死，無菌取出脾臟并放置在RPMI培養基中(Sigma)。將用每種疫苗構建體接種的3只小鼠的脾臟合并，通過使用22號針頭反復向脾被膜中注射RPMI來收獲細胞。將細胞懸浮液轉移到50mL離心管中，200xg5分鐘收獲細胞。通過在3mL8.3mg/mL的氯化銨(R-7757，Sigma)中暴露1分鐘來裂解紅細胞。然后用20mLRPMI(Sigma)稀釋氯化銨，將細胞離心并清洗3次。將細胞重新懸浮在10mL含有10%FCS、lOOpg/mL鏈霉素、100U/mL青霉素、2.5Mg/mL兩性霉素B的RPMI中。細胞用錐蟲藍染色以評估存活性，用血細胞計數器進行計數，將所有的細胞懸浮液調整到107個細胞/mL。以107個細胞/孔的量將細胞等分到24孔板(Costar3526)中(每種疫苗原類型12個孔)。使用5或10/xg/mL的免疫疫苗原剌激三份孔。對照包括三份用10/ig/mL的無關蛋白一一牛血清白蛋白刺激的孔和未刺激的孔(無蛋白)。所有的板在37t:、5y。C02下孵育96小時，然后收獲上清液并冷凍在-8(TC下，等候對細胞因子進行ELISA定量。為了對Thl/Th2細胞因子IFN-7和IL-4的水平進行定量，按照制造商的說明書使用基于ELISA的分析(ELISA-Max;Biolegend)。簡單來說，將捕獲抗體包被在96孔ELISA板上，將板封閉，將雙份100/iL的每種培養上清液在板中孵育2小時。對于IL-4檢測來說，使用未稀釋的培養上清液，而對于IFN-7來說，用未稀釋的和用PBS1:20稀釋的上清液來測試。使用含有已知濃度的每種細胞因子的樣品來產生標準曲線。通過生物素化第二抗體、然后通過HRP偶聯的鏈親和素和使用TMB底物的生色檢測來檢測結合的細胞因子。茲菜變#沐瘦葳稱建體游裕建、表這浙錄眾使用具有5'突出部的引物與交疊退火和延伸PCR技術，產生了原始ABKD疫苗的5種變異體(圖13)。所有這些構建物的DNA序列得以證實。疫苗原的選擇的理化性質顯示在表6中[Gasteiger等，2005]。通過鎳層析純化重組疫苗原后，注意到了有相當比例的重組蛋白在針對PBS透析過程中沉淀。這在ABKD疫苗原的初始報告中也被注意到了[實施例3]。盡管分子量較高的構建體ABKDD和ADBKD在PBS中具有較高的溶解度，重組蛋白的沉淀仍然明顯。因此，基于Golovanov等[2004]的工作開發了修改的透析緩沖液(Arg/Glu緩沖液)。緩沖液的pH從PBS(pH7.4)增加到pH8.0，以增加緩沖液的pH與重組蛋白的等電點(pl6.49或6.85)之間的差別。此外，鹽濃度從150mM降低到100mM，并加入了50mM精氨酸和50mM谷氨酸。使用該緩沖液，沒有注意到任何重組蛋白的沉淀，可溶性蛋白的濃度明顯增加。正如通過SDS-PAGE可見，重組蛋白是純的，不含有降解產物(圖14)。表6、疫苗原的理化性質<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>i^箭辰,^沐游扇資嚴性為了評估ABKD疫苗變異體的相對免疫原性，將小鼠用弗氏佐劑中的每種變異體進行免疫。通過western印跡評估血清的表位特異性反應性，其中血清被用于探測4種類型中每一種的PVDF固定的重組OspC。蛋白被證實在印跡上帶有同樣的載量，正如通過與標簽特異性的小鼠抗His標簽單克隆抗體的反應性所評估的那樣。來自被免疫的小鼠的血清證實了在與每種重組OspC蛋白的反應性水平上存在疫苗原依賴性差異(圖15A)。值得注意的是，在用ABKDppa和ABKDgg變異體接種的小鼠中與D型ce螺旋5表位的反應性降低了，最明顯的是用ADBK變異體。為了以定量的方式評估這些變化，通過ELISA，再通過使用4種類型的每種全長重組OspC作為固定的抗原，完成了IgG與每種包含在構建體中的OspC型特異性表位的反應性滴定。滴度基本上模擬了定性western印跡的發現，證實了在免疫血清與個體表位的反應性中的疫苗特異性差異(圖15B)。最顯著的區別在與D型表位的反應性中見到，對于ABKDppa、ABKDgg和ADBK變異體可見特別低的滴度。疫度變^體特#絲競度球歪A游，辨潛分布為了更詳細地了解變異體疫苗原誘導的免疫應答，通過表位特異性滴度測定，完成了3個具有最好的疫苗潛力的變異體(ABKD、ABKDD、ADBKD)的表位特異性免疫球蛋白同種型分布。總的來說，在抗原特異性免疫球蛋白中，存在著占優勢的IgGl、少量的IgG2a和IgG2b，以及非常少的IgG3或IgM，這種模式以前已經被注意到了[實施例3](圖16)。對于所有的表位和所有的疫苗變異體來說，Ig同種型的模式是相似的，只有一個例外。在用ABKDD免疫的小鼠中K和D型表位特異性IgG2a和IgG2b的反應性比用ABKD或ADBKD變異體免疫的小鼠高。i^欺特,性r浙fi潘應游7%//77^潘應厲7游生產為了評估在ABKD疫苗原中變異誘導的細胞因子環境和Thl/Th2平衡的潛在的影響，用已經用于免疫小鼠的疫苗原在體外重新刺激小鼠的脾細胞。在不同免疫的小鼠之間注意到了IFN-7的誘導水平的顯著差異。所有的疫苗變異體都與培養上清液中IFN-7水平的增加有關，盡管ADBK和ADBKD具有的水平比其它疫苗原誘導的高2到3倍(圖17)。在所有情況下，濃度為5pg/mL和10/xg/mL的抗原都誘導IFN-7，其水平在0.5到8.6ng/mL的范圍內。來自未刺激的脾細胞或用牛血清白蛋白刺激的脾細胞的的細胞培養上清液都具有低于15.6pg/mL的分析檢測限的IFN々水平。在疫苗刺激的和對照的培養上清液中都沒有檢測到IL-4，表明濃度低于2.0pg/mL的分析檢測限。佐，類智對拔體激度浙^^麥分布游嚴喊為了確定佐劑類型對針對疫苗原反應的影響，用在弗氏佐劑中乳化的或吸附于明礬的ABKD蛋白對小鼠進行免疫。在用明礬佐劑免疫的小鼠中，針對整個疫苗原以及針對每個組分表位的IgG滴度都稍低，盡管在兩種佐劑之間反應的總體模式相似(圖18A)。盡管IgGl水平相似，但用明礬免疫的小鼠具有減少的疫苗原特異性IgG3、IgG2a和IgG2b(圖18B)。表位特異性同種型分布與使用整個疫苗原時觀察到的分布非常相似(數據未顯示)。//論使用含有多個B細胞表位的嵌合蛋白，與全蛋白多價疫苗原和肽偶聯物相比，在疫苗開發中具有潛在的優勢。僅包含保護性表位序列減小了誤導針對親本分子或肽載體中無關表位的反應的可能性。如果，象OspC那樣，具有在重組疫苗原中是優勢免疫的、但是在感染過程中不被細菌呈遞的大的保守結構域[實施例1;Kumaran等，2001;Eicken等，2001]，這將是重要的。這樣的表位與保護性免疫應答的產生無關。但是，產生新的蛋白的需要考慮到可能封閉表位或影響蛋白的穩定性和溶解性的分子間和分子內相互作用。在本實施例中，我們對基于OspC的重組的多價嵌合萊姆病疫苗原進行了深入的研究。原始的ABKD疫苗在小鼠中是高度免疫原性的，被誘導的IgG結合細菌細胞表面上的天然OspC并引發補體依賴性的殺菌作用[實施例3]。盡管這成功了，但ABKD構建體還有兩個因素需要改進，它在PBS中的溶解性差，這妨礙了重組蛋白的生產并可能影響儲存穩定性，以及針對蛋白中的個體表位的IgG滴度的差異。具體來說，滴度隨著表位與疫苗的C-末端的接近而減小。本研究的目的是改進疫苗原的溶解性，以及使用在表位位置、表位重復以及包含穩定基序方面不同的修改過的疫苗原以改進整體的和表位特異性的免疫應答。在較早的研究中，已經注意到重組疫苗原在針對PBS透析后有明顯的沉淀[實施例3]。這種差溶解性不僅限制了疫苗原的生產，而且也對疫苗的免疫原性有影響。ABKD構建體在對PBS透析后能夠達到的最大濃度是0.5mg/mL，通常更低。OspC的晶體結構表明在天然OspC蛋白中螺旋5表位區參與了單體內4個螺旋的成束[Kumaran等，2001;Eicken等，2001]。這可以導致疫苗原蛋白之內和之間的暴露的疏水螺旋面之間的相互作用，進而引起沉淀。在透析緩沖液中加入精氨酸和谷氨酸被發現使所有重組疫苗原蛋白的溶解度增加了4到100倍(表7)。這種增加的溶解性的基礎可能是通過與精氨酸和谷氨酸側鏈的脂肪族部分的相互作用，精氨酸和谷氨酸與帶有相反電荷的暴露的殘基、以及與疏水殘基的相互作用[Golovanov等，2004]。使用在Arg/Glu緩沖液中透析的ABKD構建體免疫的小鼠具有比用PBS透析的ABKD疫苗原免疫的小鼠明顯更高的滴度[實施例3]。Arg/Glu緩沖液可以導致更有優勢的折疊模式或更少的分子間或分子內相互作用，因而使表位能夠更好地與B-細胞受體接近。精氨酸和谷氨酸與重組蛋白的吸附明顯不干擾表位識別。Arg/Glu緩沖液已經被報道在體外針對蛋白酶的活性有保護作用[Golovanov等，2004]。盡管在PBS和Arg/Glu透析的樣品中都沒有明顯的蛋白酶降解現象，但不能排除體內針對蛋白水解裂解的保護作用。針對含有精氨酸和谷氨酸的緩沖液的透析可能是一種有用的工具，可以用于其它具有明顯的分子間相互作用的新的嵌合蛋白。表7、針對PBS或Arg/Glu緩沖液透析的疫苗原的可溶性蛋白濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>以前已經在嵌合鏈球菌M蛋白疫苗原中報道了免疫應答差與C-末端表位位置的關系，這可能是由于與C-末端有關的結構問題或被羧肽酶的蛋白水解降解[Dale等，1993;Dale等，1996;Dale等，1999]。已經提出了許多方法保護肽和重組蛋白免遭蛋白酶活性，包括C-末端的酰胺化或PEG化、氨基(N)末端的乙酰化以及添加保護性的氨基酸基序[Brickerhoff等，1999;Powell等，1992;Lee等，2005;Alvarez等，2004;Kawarasaki等，2003;Walker等，2003]。氨基酸基序也已經被報道能夠通過抑制羧肽酶的作用而穩定蛋白的C-末端；但是，它們的保護能力只對幾個蛋白進行了評估。評估了兩個穩定性基序增加針對ABKD疫苗原的抗體反應的能力。加入兩個中性的親水Gly殘基可以降低羧肽酶C和D的活性，這兩種酶分別對疏水的和堿性的C-末端氨基酸具有特異性[Alvarez等，2004;Kawarasaki等，2003;Remington和bredam，1994]。加入Pro-Pro-Ala基序可以通過并列的、大體積的脯氨酸殘基在空間上阻礙羧肽酶的前進[Walker等，2003]。為了評估加入這些基序對針對ABKD嵌合疫苗原的抗體反應的影響，用ABKDgg或ABKD卯a構建體免疫小鼠。在這兩種情況下，與用未修飾的ABKD構建體免疫的小鼠相比，血清針對多種表位中的一種具有較低的平均IgG滴度。ABKDppa構建體對D型特異性IgG的滴度降低了，盡管這主要是由于單一的異常值。ABKDgg構建體對K和D型表位的滴度降低了。在IgG滴度的基礎上，使用任何這些基序的任何一個都沒有優勢。對C-末端表位的滴度的降低表現為不是由那些被這些基序賦予了抗性的羧肽酶的作用所介導的，盡管有可能任何由于蛋白酶保護作用導致的優勢可能被Arg/Glu緩沖液所提供的類似的保護作用所掩蓋[Golovanov等，2004]。為了研究涉及對C-末端表位的免疫應答差的可能的結構因素，產生了幾種其它的構建體。在嵌合鏈球菌疫苗中，在C末端重復N-末端表位通過未知的機制"保護"了先前的C-末端表位[Dale等，1999;Dale等，2005;Hu等，2002;McNeil等，2005]。基于這種成功，開發了ABKD疫苗原的類似變異體。產生了ABKDD構建體以評估針對D型表位的反應是否能夠被第二個C-末端D型表位所保護。為了評估滴度的降低是否主要是由于C-末端表位的位置，將D型表位移到第二位最靠近N-末端的位置(ADBK)。最后，使用ADBKD構建體來評估重復的C-末端表位的保護作用，并使用ABKDD，評估重復的表位對特異性免疫應答的影響。在ABKDD疫苗原中表位重復使D型特異性IgG滴度加倍，但是同時引起了針對鄰近的K型表位的滴度降低。在ADBK構建體中，當D型表位被放置在更N-末端的位置上時，D型特異性IgG滴度被顯著降低了。此外，在ADBK構建體中針對C-末端的K型表位的反應性與ABKD中的相比被提高了。加上C-末端D型表位(ADBKD)沒有增加K型特異性滴度；但是，它產生了明顯增加的、盡管不是加倍的、針對D型表位的滴度。這些結果表明D型表位的C-末端位置比內部位置優選，另加的"保護性"C-末端表位對C-末端表位沒有明顯的保護作用。在該疫苗原中表位特異性滴度的主要決定因素不是它與C-末端的接近性，而更可能是嵌合蛋白的三級結構。疫苗原誘導的Ig同種型可能對體內保護效應有重要意義。通過改變表位或它們的次序，可能可以改變同種型的分布[Tongren等，2005]，從而改變抗體的效應子功能。為了測定表位特異性的同種型分布，將針對最有希望的疫苗原(ABKD、ABKDD、ADBKD)的抗血清與固定的A、B、K或D型重組OspC相結合，并使用同種型特異性的抗血清檢測結合的抗體。正如以前對ABKD疫苗原報道的那樣[實施例3]，主要的同種型是IgGl、以及水平略低的IgG2a和IgG2b，這取決于構建體，以及低水平的IgM和IgG3。在ABKD和ADBKD抗血清之間表位特異性Ig同種型分布是類似的，IgG2a和IgG2b的水平從N-到C-末端表位降低，模擬了總IgG滴度。ABKDD對于所有的表位有一致的IgG2a和lgG2b水平，盡管K型特異性總IgG滴度較低。ABKD疫苗原引發補體依賴性的殺菌抗體[實施例3]。在小鼠中，IgGl不激活補體[Dangl等，1988;Miletic和Frank，1995]，表明大部分被誘導的同種型可能不具有保護作用。盡管已經報道了OspA特異性IgGl可以通過不依賴補體的機制殺死疏螺旋體[Munson等，2000],ABKD疫苗原誘導的抗體的殺菌作用是補體依賴性的[實施例3]。被引發的同種型分布可能受到使用C3H/HeJ小鼠---種萊姆病研究的標準動物模型一一的影響。在伯氏疏螺旋體感染期間，已經注意到了C3H/HeJ和BALB/c系小鼠之間的體液免疫的差異，特別是在總IgG水平，特別是在IgG2a的水平上，這二者在C3H/HeJ小鼠中都較高[Yang等，1992;Keane-Myers禾PNickell，1995]。此外，C3H/HeJ小鼠種系缺少TLR-4，盡管預計它對于預防接種或感染期間針對萊姆病的保護作用不是關鍵的，因為疏螺旋體不產生脂多糖[Takayama等，1987;Barthold等，1990]。因為普遍接受的是體液殺疏螺旋體活性是補體依賴性的，因此引發Thl細胞因子反應可能是有利的，因為它出現在許多細菌性疾病中(綜述于[Spellberg可Edwards,2001])。在主動感染過程中細胞因子參與萊姆病及其后遺癥的發展和消退。幾項研究已經發現IL-4對于發展殺疏螺旋體的抗體反應來說不是關鍵的細胞因子[Munson等，2000;Potter等，2000;Christie等，2000;Satoskar等，2000-64],意味著Thl型反應可能與保護作用有關。此外，分泌IFN-7的Thl細胞促進了與萊姆病有關的心臟炎的消退[Bockenstedt等，2001;Kelleher等，1998]。相反，在感染過程中，關節炎的嚴重性和皮膚螺旋體的載量通過施用重組IL-4減少，通過施用a-IL-4抗體而增加[Keane-Myers和Nickell，1995;Keane-Myers等，1996]。在天然感染過程中，IFN-7的生產與慢性萊姆病的發展有關[Widhe等，2004]，并與萊姆關節炎中關節腫脹的程度有關[Gross等，1998]。IFN-7還涉及抑制從體外淋巴結培養物中誘導殺疏螺旋體的抗OspA抗體的產生有關[Munson等，2002]。為了研究免疫接種誘導的Th細胞因子環境，在體外用疫苗原、Thl(IFN-7)和Th2(IL-4)細胞因子對小鼠脾細胞進行了重新剌激，并通過ELISA定量。在用疫苗原重新刺激的細胞的上清液中檢測到了IFN-7，盡管其濃度根據構建體而不同。相反，在任何脾細胞上清液中沒有檢測到IL-4。ABKD、ABKDppa和ABKDD構建體都具有類似的IFN々濃度。ADBKD具有幾乎雙倍的IFN-7濃度，ADBK的水平甚至更高。在重新剌激的細胞的上清液中IFN-7水平與總的表位特異性血清IgG滴度或同種型分布之間沒有明顯的相關性。細胞因子和相關的Ig同種型分布可以通過選擇免疫佐劑來改變。弗氏完全佐劑與Thl細胞因子反應有關[Cribbs等，2003;Shibaki和Katz,2002],它可以增加IgG2a的水平。唯一目前被批準用于人類的佐劑是明礬，它已知增加Th2細胞因子的分泌[Cribbs等，2003;Brewer等，1999;Lindblad，2004;Petrovsky和Aguilar，2004]。在用明磯免疫的小鼠中，注意到了與使用弗氏佐劑相比，針對疫苗原及其組成表位的IgG滴度預料中的適度降低。此外，與IgGl相比，IgG3、IgG2a和IgG2b同種型成比例降低。這證實了使用這種佐劑時預期的較低Thl細胞因子反應。但是，疫苗原繼續引發能夠結合補體的抗體，表明針對構建體的明顯改變或對佐劑的修飾對于有效的反應來說可能不是必需的。在本實施例中，我們研究了對潛在的嵌合多價萊姆病疫苗原的改變，其目的是優化被誘導的體液免疫應答。通過用對Arg/Glu緩沖液進行透析來增加其溶解性，實現了構建體免疫原性的顯著提高。這可能在體內減少了蛋白相互作用，使更多的表位暴露[Theisen等，2000]。加上蛋白酶保護性的C-末端基序或加上"保護性的"C-末端表位都不能改進針對疫苗原的免疫應答。對表位進行重新排序導致了針對被移動的表位的免疫應答顯著降低。針對本疫苗構建體中的組成表位的免疫應答的差別被顯示主要是依賴于蛋白的結構，而不是蛋白對蛋白酶消化的抗性。此外，有證據表明疫苗原引發的Th細胞因子和IgG同種型可以被嵌合構建體的結構和佐劑的制劑所改變。本研究在對針對嵌合疫苗原的亞最適免疫應答的基礎、以及改進這些反應的方法方面，提供了重要的信息。實施例5、可用的OspC序列分析證實了廣泛保護性多價嵌合萊姆病疫苗的可行性為了便于進一步發展廣泛保護性的嵌合構建體，我們對可以從數據庫中獲得的OspC序列進行了系統發育分析。被分析的OspC片段跨越20到200位的殘基(使用對B31MI序列的編號)。數據庫中較短的序列被排除出這些分析，留下來自280個疏螺旋體菌株的序列用于分析。分派每個序列的OspC類型通過比對(PAM40計分矩陣)和兩兩一致性矩陣分析來確定。與以前的研究一致，表現出95%或更高的序列一致性的序列被認為屬于同樣的OspC類型(Attie等，2006;Wang等，1999)(圖19)。觀察到了序列比較的明確雙峰分布，不同的OspC類型序列之間平均序列一致性為65%，類型內部的一致性大于97%。除了被Wang等(1999)描述的21個類型之外，還定義了其它17個簇群。對于包含少于3個序列的簇群我們沒有指派OspC類型。在新的OspC類型的命名中，我們選擇了維持現有的從A到U的OspC類型命名(Wang等，1999)，根據包含在每個簇群中的原型菌株對其它的類型進行命名。在280個被分析的序列中，有202個被指派了OspC類型，它們都來自引起萊姆病的種類。沒有被指派到OspC類型的78個序列包括引起萊姆病的螺旋體(51個分離株)和其它的疏螺旋體種類(27個分離株)。獲得每個OspC序列的分離株的地理和生物學來源以表格的形式顯示在圖20中。大部分伯氏疏螺旋體分離株來自北美(80%)，少數來自歐洲(16%)和亞洲(4%)。53%的伯氏疏螺旋體、48%的埃氏疏螺旋體和79%的伽氏疏螺旋體OspC序列來自從人類收集到的分離株。值得注意的是來自人類分離株的伽氏疏螺旋體OspC序列主要是腦脊液(CFS)來源的(68%)，而埃氏疏螺旋體分離株主要來自皮膚(83%)。相反，伯氏疏螺旋體來源的OspC序列是來自從人類皮膚(51%)、血漿(30%)和CSF(19%)回收的分離株。這些發現與這些生物體引起的已知疾病類型一致，表明在本報告中評估的OspC序列的樣品代表了萊姆病螺旋體的真實種群。為了便于進一步的系統發育分析，通過刪除一致的序列將被分析的序列組減少到74個。然后使用Phylip(v.3.66)系統發育分析軟件包使用自展(n=1000)對這些序列進行比對和分析。使用DayhoffPAM矩陣計算跨越20到200、20到130和131到200位區域的距離，通過鄰近結合產生樹。凡/^mWOspC直系同源(Vmp33)序列被用作外類群(Margolis等，1994)。通過多數性規則(對于組的包含來說界限為50%)產生嚴格一致性樹(consensustree)。在DayhoffPAM模型下通過最大似然率方法重新為嚴格一致性樹計算距離(圖21)。使用OspC的20-200位氨基酸片段產生的嚴格一致性樹在終端節點得到很好的支持，所有確定的OspC類型按照預期分簇。盡管自展分析對幾個較深的分支獲得了的支持較少(圖21A)，但這并不是沒有預料到的，因為序列間擴展的一致區域使它們的系統發育差異很精細。使用OspC的20-200和20-130位氨基酸片段產生的嚴格一致性樹顯示出類似的系統發育分簇(圖21A、21B)，這主要基于物種的同一性。但是，使用131-200位氨基酸產生的嚴格一致性樹(圖21C)產生了明顯不同的分簇模式，沒有得到自展分析的強有力支持。這種觀察符合不同OspC類型的菌株之間已經發生o^C基因的短片段之間的重組的假說。OspC類型之間OspC短片段重組的證據可以在特定的序列中看見。例如，埃氏疏螺旋體的OspC類型PLj7的序列，在20-130位氨基酸的結構域中具有的區域與在形成Pki簇的伽氏疏螺旋體的OspC序列中看到的相同。在PLj7的131-200位區域中，高變的環5和環6區具有的基序分別與F和M型伯氏疏螺旋體OspC中看到的相同。重組的其它證據來自使用SimPlot(v.3.5.1)的啟動掃描(Lole等，1999)。在啟動掃描中，通過在滑動窗口中(40個堿基的窗口，每步間隔10個堿基)為序列片段產生系統發育樹(Kimura模型，Ts/Tv比率=2.0，鄰近結合)，來評估潛在的重組。這些樹被自展(n=100)，報告了該窗口中支持序列分組的輪排的樹的數量。當大于70%輪排的樹將序列歸集在窗口中時，一般認為重組的跡象得到了支持。在上面描述的類型中(圖22)以及大量其它類型中(數據未顯示)，發現了可能的重組的跡象。OspC變異性的發生是通過現有的OspC類型之間的交換而不是通過超突變的證據，為在廣泛保護性疫苗原中需要包含的OspC類型特異性表位的絕對數量存在限度提供了證據。因為目前作圖的線性表位都包含在OspC的C-末端區域(131-200位氨基酸)中，確定嵌合疫苗原所需的表位的理論數量是可能的。通過在74個上述的代表性序列中檢查該區域，含有獨特表位的區域的數量通過消除一致的或僅有一個氨基酸變化的序列被減少到了34個(圖22)。通過表位作圖可能可以進一步限制這個數量，因為某些表位可以賦予針對兩種或多種OspC類型的保護作用。考慮到那些與人類疾病、或更具體來說侵襲性人類疾病有關的OspC類型，所需的表位數量也可以進一步減少(參見實施例1)。對于針對OspC表位亞類進行預防接種的一種理論上的顧慮是可能驅動了針對未包含在疫苗原中的類型的選擇性，從而增加了帶有那些罕見等位基因的種群的比例。但是，因為人類僅僅是偶然宿主，免疫接種明顯改變蜱載體或哺乳動物儲主中表達特定OspC類型的菌株的種群分布是不可能的。概括來說，OspC數據庫的深入的本質使得完全的分析得以進行，它已經定義了新的OspC類型，并提供了關于它們被分離的頻率和與人類疾病的相關性的信息。數據表明，在廣泛保護性的嵌合疫苗原中需要包含的含有OspC表位的序列的數量是有限的，嵌合疫苗原的開發是可行的。實施例6、八價嵌合體的構建ENICABKD八價構建體顯示在下面，使用PROTPARAM程序計算的構建體的幾個性質被列出。被命名為"L#"的片段是接頭序列。"RS"標明了在制造構建體中使用的限制性位點的位置。<----T7VG----->RS<-----------------------E型---------------1AHHHHHHVDDDDiaTGIiKSEHAVLGLDNLTDDNAQRAiriKKHAlTKDICGAASIiEKrjFKAVB-------------<L9;>-----.....------——N型-----------------xLSIULSKAAQDTLKNAPGVGATTDEEAKKAIIiRTNAIKDKGADEIiEKLFKSVESLAKAAQDAT----------------'I型----------------><Ii7><-------------121QMLKTNNDKTKGADEXjEKLFESVKNLSKAAKEMIjTNSVKELTSTEPSEEFTKKLKEKHTD.....-C型--------.....--------><L8RS<------A型-----181LGKKDATDVHAKBAILKTNGTKDKGAAELEKLFESGEDVSETBTNKLKEKHTDLGKEGSMLl><----------------B型-----------------x:Ij2x-----------——K型------------------><L3><-------.....—-D型.....301ELEKLFKAVEtTLAKAAKEMLANSVKEIiTSSMSVLKTHNAKDiCGAEELVKLSESVAGIiIiKA361AQA工liANSVKELTSPVVAESPKKP(SEQm"NO:249)氨基酸的數量384分子量41263.7理論等電點6.52氨基酸組成Ala(A)5113.3%Arg(R)20.5%Asn(N)205.2%Asp(D)256.5%Cys(C)00.0%Gin(Q)1.3%Glu(E)4210.9%Gly(G)215.5%His(H)123.1%Ue(I)71.8%Leu(L)4612.0%Lys(K)6216.1%Met(M)71.8%Phe(F)71.8%Pro(P)1.3%Ser(S)277.0%Thr(T)266.8%Trp(W)00.0%Tyr(Y)00.0%ValCV)194.9%帶負電荷的殘基的總數(Asp+Glu):67帶正電荷的殘基的總數(Arg+Lys):64原子組成碳c1787氫H2983氮N501氧0597硫s7分子式C1787H2983N501O597S7原子總數5875估計的半衰期考慮序列的N-末端是A(Ala)。估計的半衰期是4.4小時(哺乳動物網織紅細胞，體外)〉20小時(酵母，體內)〉10小時(大腸桿菌，體內)不穩定性指數不穩定指數(II)被計算為12.58這將蛋白分類為穩定脂肪族指數81.46總平均親水性(GRAVY):-0.668當施用于試驗動物時，發現該嵌合蛋白構建體引發強烈的免疫應答，并針對萊姆病的發展提供了保護。參考文就；AbuodehRO,ShubitzLF，SiegelE,SnyderS，PengT,OrsbornKI等，ResistancetoGocc!'c^o/i/e51/mm"/51inmiceafterimmunizationwithrecombinantproteinoraDNAvaccineofaproline-richantigen.(在用富含脯氨酸抗原的重組蛋白或DNA疫苗免疫后小鼠中針對粗球孢子菌的抗性)InfectImmun1999Jun;67(6):2935-40.AhlborgN,NardinEH,PerlmannP,BerzinsK，AnderssonR.Immunogenicityofchimericmultipleantigenpeptidesbasedon尸/a57woc/^/m/a/c/pan/附antigens:impactofepitopeorientation.(基于惡性疙原蟲抗原的嵌合多抗原肽的免疫原性表位取向的影響)Vaccine1998;16(1):38陽44.Alghaferi,M.Y.,J.M.Anderson,J.Park,P.G.Auwaerter,J.N.Aucott,D.E.Norris,禾口J.S.Dumler.2005.5orre//aZwrgf/o;/en'oypCheterogeneityamonghumanandmurineisolatesfromadefinedregionofNorthernMarylandandSouthernPennsylvania:Lackofcorrelationwithinvasiveandnon-invasivegenotypes.(來自馬里蘭州北部和賓夕法尼亞州南部的確定地區的人類和鼠類分離株之間伯氏疏螺旋體o^C的異源性缺少與侵襲性和非侵襲性基因型的關聯性)J.Clin.Microbiol.43:1879-1884.AlvarezP,BuscagliaCA,CampetellaO.Improvingproteinpharmacokineticsbygeneticfusiontosimpleaminoacidsequences.(通過與簡單的氨基酸序列進行基因融合改進蛋白的藥代動力學)JBiolChem2004Jan30;279(5):3375-81.Alverson，J.，S.F.Bundle,C.D.Sohaskey，M.C.Lybecker，禾口D.S.Samuels.2003.Transcriptionalregulationoftheos/v45andoypCpromotersfrom5orre"fl(來自伯氏疏螺方定體的os/A8禾口0^C啟動子的轉錄調控)Mol.Microbiol.48:1665-1677.Apta,D.，K.Raviprakashb,A.Brinkman，A.Semyonov，S.Yang，C.Skinnera，L.Diehl,R.Lyons,K.Porter,禾口J.Punnonen.2006.Tetravalentneutralizingantibodyresponseagainstfourdengueserotypesbyasinglechimericdengueenvelopeantigen.(單一嵌合登革熱包膜抗原對四種登革熱血清型的四價中和抗體反應)Vaccine24:335-344.AschES,BujakDI，WeissM,PetersonMG，WeinsteinA.Lymedisease:aninfectiousandpostinfectioussyndrome.(萊々母病ft染性禾口后傳染性綜合征)JRheumatol1994;21(3):454-61.Attie，O.,J.F.Bruno,Y.Xu,D.Qiu，B.J.Luft，禾卩W.G.Qiu.2006.Co-evolutionoftheoutersurfaceproteinCgene(oypC)andintraspecificlineagesof5ore/Za6wrgJo;/en'■sewsw5^n'CointhenortheasternUnitedStates.(美國東北部伯氏疏螺旋體的外表面蛋白C基因(o印C)和種間譜系的共進化)InfectGenetEvolE-pub.BartholdSW,BeckDS，HansenGM,TerwilligerGA,MoodyKD.Lymeborreliosisinselectedstrainsandagesoflaboratorymice.(選定禾中系和年齡的實驗室小鼠的萊姆疏螺旋體病)JInfectDis1990Jul;162(1):133-8.BartholdSW，PersingDH，ArmstrongAL，PeeplesRA.KineticsofBo^Te/ffl!6wrgGo//er/disseminationandevolutionofdiseaseafterintradermalinoculationofmice.(真皮內接種小鼠后伯氏疏螺旋體傳播的動力學和疾病的進展)AmJPathol1991;139(2):263-73.BenachJL,BoslerEM，HanrahanJP，ColemanJL，BastTF,HabichtGS，等SpirochetesisolatedfromthebloodoftwopatientswithLymedisease.(從兩個患有萊姆病的患者的血液中分離的螺旋體)NEnglJMed1983;308:740-2.Bockenstedt,L.K.,E.Hodzic，S.Feng,K.W.Bourrel,A.deSilva，R.R.Montgomery,E.Fikrig,J.D.Radolf,禾卩S.W.Barthold.1997.Z)wrgJo^/^n'strain-specificOspCmediatedimmunityinmice.(,J、鼠中伯氏疏螺旋體菌株特異性OspC介導的免疫性)Infect.Immun.65:4661-4667.BockenstedtLK,KangI,ChangC,PersingD，HaydayA，BartholdSW.CD4+Thelper1cellsfacilitateregressionofmurineLymecarditis.(CD4+1型輔助性T細胞促進了鼠類萊姆心臟炎的消退)InfectImmun2001Sep;69(9):5264-9.BoucheFB，SteinmetzA,YanagiY，MullerCP.Inductionofbroadlyneutralizingantibodiesagainstmeaslesvirusmutantsusingapolyepitopevaccinestrategy.(使用多表位疫苗策略誘導針對麻疹病毒突變株的廣譜中和抗體)Vaccine2005;23(17-18):2074-7.BrewerJM，ConacherM，HunterCA，MohrsM，BrombacherF,AlexanderJ.Aluminiumhydroxideadjuvantinitiatesstrongantigen-specificTh2responsesintheabsenceofIL-4-orIL-13-mediatedsignaling.(氫氧化鋁佐劑在不存在IL-4或IL-13介導的信號下啟動了強烈的抗原特異性的Th2反應)JImmunol1999;163(12):6448-54.BrinckerhoffLH,KalashnikovW，ThompsonLW,YamshchikovGV,PierceRA，GalavottiHS，等TerminalmodificationsinhibitproteolyticdegradationofanimmunogenicMART國l(27-35)peptide:implicationsforpeptidevaccines.(末端修飾抑制了免疫原性的MART-1(27-35)肽的蛋白水解降解作用對于肽類疫苗的意義)IntJCancer1999Oct29;83(3):326-34.BrissonD,DykhuizenDE.05pCdiversityin^So^reZ/aZmrgdo^/"erZ:Differenthostsaredifferentniches.(伯氏疏螺旋體中的o印C多樣性不同的宿主是不同的生態位)Genetics2004;168:713-22.BrownEL,KimJH,Reisenbichl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g，I.N.，D.E.Dykhuizen，W.Qiu，J.J.D腿，E.M.Bosler，禾口B.J.Luft.1999.Geneticdiversityofo印CinalocalpopulationofZt^gdor/en'化m/5tn'"o.(在伯氏疏螺旋體的當地禾中群中os/C的遺傳多樣性)Genetics151:15-30.Wang，X.N-，G.P.Zhang,J.Y.Zhou,C.H.Feng,Y.Y.Yang,Q.M.Ii,J.Q.Guo，H.X.Qiao,J.Xi，D.Zhao，G.X.Xing,Z.L.Wang,S.H.Wang，Z.J.Xiao，X.W.Li,和R.G.Deng.2005.IdentificationofneutralizingepitopesontheVP2proteinofinfectiousbursaldiseasevimsbyphage-displayedheptapeptidelibraryscreeningandsyntheticpeptidemapping.(通過噬菌體展示的七肽文庫篩選和合成肽作圖鑒定傳染性法氏囊病病毒的VP2蛋白上的中和表位)ViralImmunol.18:549-557.WidheM，JareforsS，EkerfeltC,VrethemM，BergstromS,ForsbergP，等5o^re/^-specificinterferon-gammaandinterleukin-4secretionincerebrospinalfluidandbloodduringLymeborreliosisinhumans:associationwithclinicaloutcome.(人類萊姆疏螺旋體病期間腦脊液和血液中的疏螺旋體特異性干擾素-7和白介素-4的分泌與臨床結果的關系)JInfectDis2004;189(10):1881-91.WidheM，JareforsS，EkerfeltC,VrethemM,BergstromS,ForsbergP，等5orre//a-specificinterferon-gammaandinterleukin-4secretionincerebrospinalfluidandbloodduringLymeborreliosisinhumans:associationwithclinicaloutcome.(人類萊姆疏螺旋體病期間腦脊液和血液中的疏螺旋體特異性干擾素-7和白介素-4的分泌與臨床結果的關系)JInfectDis2004;189(10):1881-91.WillettTA，MeyerAL，BrownEL，HuberBT.Aneffectivesecond-generationoutersurfaceproteinA-derivedLymevaccinethateliminatesapotentiallyautoreactiveTcellepitope.(消除了潛在的自身反應性T細胞表位的有效的第二代外表面蛋白A衍生的萊姆疫苗)ProcNatlAcadSciUSA2004;101(5):1303-8.Wilske,B.，U.Busch,V.Fingerle，S.Jauris-Heipke,V.Preac-Mursic,D.Robler，禾口G.Will.1996.ImmunologicalandmolecularvariabilityofOspAandOspC:implicationsforBorreliavaccinedevelopment.(OspA禾口OspC的免疫和分子可變性對疏螺旋體疫苗開發的意義)Infection24:208-212.Wilske,B.,V.Preac-Mursic,S.Jauris，A.Hofinann，I.Pradel,E.Soutschek，E.Schwab,G.Will,禾卩G.Wanner.1993.ImmunologicalandmolecularpolymorphismsofOspC,animmunodominantmajoroutersurfaceproteinof5ore//fl6wrgdor/en'.(OspC，伯氏疏螺方定體的免疫顯性的主要外表面蛋白的免疫和分子多態性)Infect.Immun.61:2182-2191.YangL，MaY，SchoenfeldR,GriffithsM，EichwaldE，AraneoB，等EvidenceforB-lymphocytemitogenactivityin5o/re//fl!Zn^gJor/en'-infectedmice.(在伯氏疏螺旋體感染的小鼠中B-淋巴細胞的有絲分裂原活性的證據)InfectImmun1992Aug;60(8):3033-41.ZhangGL，KhanAM,SrinivasanKN,AugustJT,BrusicV.MULTIPRED:acomputationalsystemforpredictionofpromiscuousHLAbindingpeptides.(MULTIPRED:預測混雜的HLA結合肽的計算系統)NucleicAcidsRes2005;33(W):172-9.Zhang,H.，A.Raji,M.Theisen，P.R.Hansen,andR.T.Marconi.2005.bdrF2oftheLymediseasespirochetesiscoexpressedwithaseriesofcytoplasmicproteinsandisproducedspecificallyduringearlyinfection.(萊姆病螺旋體的bdrF2與一系列細胞質蛋白共表達，并在感染早期被特異性產生)J.Bacteriol.187:175-184.ZhongW，StehleT,MuseteanuC，SiebersA，GernL5KramerM,等TherapeuticpassivevaccinationagainstchronicLymediseaseinmice.(在小鼠中針對慢性萊姆病的治療性被動接種)ProcNatlAcadSciUSA1997;94(23):12533-8.ZuckertWR,KerentsevaTA，LawsonCL，BarbourAG.Structuralconservationofneurotropism-associatedVspAwithinthevariable5orre"aVsp-OspClipoproteinfamily.(可變的疏螺旋體Vsp-OspC脂蛋白家族中與趨神經性有關的VspA的結構保守性)JBiolChem2001;276(1):457陽63.盡管本發明已經參照其優選實施方案進行了描述，但本領域的專業技術人員將會認識到，在隨附的權利要求的精神和范圍內進行修改后，本發明仍然能夠被實踐。因此，本發明不限于上面描述的實施方案，而是應該進一步包括在本文提供的描述的精神和范圍之內的所有修改及其等價物。權利要求1.嵌合重組蛋白，包含來自兩種或多種類型的外表面蛋白C(OspC)的環5區或α螺旋5區或這二者的表位。2.權利要求l中的嵌合重組蛋白，其中所述OspC類型選自Smar、PLi、H13、PFiM、SLIO、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa，、B、K、N禾卩C。3.權利要求2中的嵌合重組蛋白，其中所述嵌合重組蛋白包含來自A、B、K和D型OspC的表位。4.權利要求2中的嵌合重組蛋白，其中所述嵌合重組蛋白包含來自E、N、I、C、A、B、K和D型OspC的表位。5.權利要求1中的嵌合重組蛋白，其中所述嵌合重組蛋白具有SEQIDNO:75或SEQIDNO:249中顯示的一級氨基酸序列。6.權利要求1中的嵌合重組蛋白，其中所述OspC類型與侵襲性疏螺旋體感染有關。7.在需要的個體中引發針對疏螺旋體的免疫應答的方法，包括下述步驟給所述個體施用包含來自兩種或多種類型的外表面蛋白C(OspC)的環5區或a螺旋5區或這二者的表位的嵌合重組蛋白。8.權利要求7中的方法，其中所述OspC類型選自Smar、PLi、HI3、PFiM、SLIO、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa，、B、K、N、C。9.權利要求7中的方法，其中所述嵌合重組蛋白包含來自A、B、K和D型OspC的表位。10.權利要求7中的方法，其中所述嵌合重組蛋白包含來自E、N、I、C、A、B、K和D型OspC的表位。11.權利要求7中的方法，其中所述嵌合重組蛋白具有SEQIDNO:75或SEQIDNO:249中顯示的一級氨基酸序列。12.權利要求7中的方法，其中所述OspC類型與侵襲性疏螺旋體感染有關。13.確定個體是否已經暴露于或感染了疏螺旋體、或這二者的方法，包括下列步驟從所述個體獲得生物學樣品；將所述生物學樣品暴露于至少一種重組嵌合蛋白，其中所述至少一種嵌合蛋白包含來自兩種或多種類型的外表面蛋白C(OspC)的環5區或a螺旋5區或這二者的表位；以及確定在所述生物學樣品中抗體是否與所述至少一種嵌合蛋白結合，其中抗體結合的檢測指示了以前暴露于或感染了疏螺旋體。14.權利要求13中的方法，其中所述OspC類型選自Smar、PLi、H13、PFiM、SLIO、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa，、B、K、N禾BC。15.權利要求13中的方法，其中所述嵌合重組蛋白包含來自A、B、K和D型OspC的表位。16.權利要求13中的方法，其中所述嵌合重組蛋白包含來自E、N、I、C、A、B、K和D型OspC的表位。17.權利要求13中的方法，其中所述嵌合重組蛋白具有SEQIDNO:75或SEQIDNO:249中顯示的一級氨基酸序列。18.權利要求13中的方法，其中所述OspC類型與侵襲性疏螺旋體感染有關。19.針對含有來自兩種或多種類型的外表面蛋白C(OspC)的環5區或a螺旋5區或這二者的表位的嵌合重組蛋白的抗體。20.權利要求19中的抗體，其中所述OspC類型選自Smar、PLi、H13、PFiM、SLIO、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa,、B、K、N禾BC。21.權利要求19中的抗體，其中所述嵌合重組蛋白包含來自A、B、K和D型OspC的表位。22.權利要求19中的抗體，其中所述嵌合重組蛋白包含來自E、N、I、C、A、B、K和D型OspC的表位。23.權利要求19中的抗體，其中所述嵌合重組蛋白具有SEQIDNO:75或SEQIDNO:249中顯示的一級氨基酸序列。24.權利要求19中的抗體，其中所述OspC類型與侵襲性疏螺旋體感染有關。25.權利要求19中的抗體，其中所述抗體是多克隆的。26.權利要求19中的抗體，其中所述抗體是單克隆的。27.權利要求19中的抗體，其中所述抗體對于疏螺旋體屬螺旋體來說是殺菌性的。28.嵌合重組蛋白的免疫原性混合物，其中所述混合物中的每種嵌合重組蛋白包含來自兩種或多種類型的外表面蛋白C(OspC)的環5區或a螺旋5區或這二者的表位。全文摘要提供了用作疫苗和用于診斷萊姆病的嵌合多價重組蛋白。該嵌合蛋白含有外表面蛋白(OspC)類型的環5區和/或α螺旋5區的表位。OspC類型可能與哺乳動物疏螺旋體感染有關。文檔編號C07K14/195GK101374858SQ200680051874公開日2009年2月25日申請日期2006年11月29日優先權日2005年11月29日發明者克里斯托弗·厄爾哈特,理查德·托馬斯·馬爾科尼申請人:弗吉尼亞州立大學