專利名稱：：腦膜炎奈瑟氏球菌疫苗及其應用的制作方法腦膜炎奈瑟氏球菌疫苗及其應用本發明涉及疫苗及其用途，特別是用于腦膜炎球菌疾病(meningococcaldisease)的疫苗。此說明書中對在先發表的文件的列舉或討論不應必然理解為承認該文件是現有技術的一部分或者是公知常識。在此收入說明書中所列舉的文件作為參考。微生物感染一直是對人類和動物健康的嚴重威脅，特別是在許多病原性微生物，特別是細菌，對于抗微生物劑諸如抗生素有抗性或者可變得有抗性的情況下更是如此。接種疫苗提供了抗擊微生物感染的替代方法，但是常常難以鑒定適用于疫苗的免疫原，它們應當是安全的且對病原性微生物(特別是遺傳多樣的微生物)的多種不同分離抹有效。雖然有可能開發用基本上完整無損(intact)的微生物作為免疫原的疫苗，諸如通常在決定毒力的基因中包含一處或多處突變的減毒活細菌，但是并非所有微生物都適用于此方法，而且并非總是希望將此方法用于不能總是保證安全性的具體微生物。還有，有些微生物表達能模擬宿主蛋白的分子，而這些分子是疫苗中不想要的。對開發進一步的疫苗重要的一類具體微生物是腦膜炎奈瑟氏球菌(iV"Men'amem'"g/^fo)，它引起腦膜炎球菌疾病，這是一種危及生命的感染，盡管引入了偶聯的(conjugate)血清群C多糖疫苗，這種感染在歐洲、北美洲、發展中國家和其它地方仍然是兒童死亡的重要原因。這是因為由血清群B抹(7VwB)引起的感染仍然流行，該菌林表達a2-8連接的多聚唾液酸莢膜。關于腦膜炎奈瑟氏球菌的術語"血清群，，(serogroup)指在此細菌上表達的多糖莢膜。在英國引起疾病的常見血清群是B，而在非洲是A。腦膜炎球菌敗血病一直維持高病死率；而且幸存者常常遺留重大心理和/或軀體殘疾。在非特異性的前驅疾病后，腦膜炎球菌敗血癥可呈現為相應抗微生物療法和所有輔助措施(fbllsupportivemeasures)難以治愈的爆發性疾病。因此，抗擊腦膜炎球菌疾病的公眾健康威脅的最好方法是預防性接種疫苗。腦膜炎球菌感染的非特異性早期臨床征候和爆發性進程意味著治療常常是無效的。因此，認為接種疫苗是減輕由此病原體引起的全球疾病負擔的最有效策略(Feavers(2000)ABCofmeningococcaldiversity.Nature404,451-2)。用于預防腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y感染的現有疫苗基于位于細菌表面上的多糖莢膜(Andersonetal(1994)SafetyandimmunogenicityofmeningococcalAandCpolysaccharideconjugatevaccineinadults.InfectImmun.62,3391-33955;Leachetal(1997)InductionofimmunologicmemoryinGambianchildrenbyvaccinationininfancywithagroupAplusgroupCmeningococcalpolysaccharide隱proteinconjugatevaccine.JInfectDis.175,200-4;Liebermanetal(1996)SafetyandimmunogenicityofaserogroupsA/CNeisseriameningitidisoligosaccharide-proteinconjugatevaccineinyoungchildren.Arandomizedcontrolledtrial.J.AmericanMed.Assoc.275,1499-1503)。通向抗血清群B感染的疫苗的進展更為困難，因為它的莢膜，即a2-8連接的唾液酸的同聚物，在人體中是相對較差的免疫原。這是因為它共享在人細胞粘附分子N-CAM1上表達的表位(Finneetal(1983)Antigenicsimilaritiesbetweenbraincomponentsandbacteriacausingmeningitis.Implicationsforvaccinedevelopmentandpathogenesis.Lancet2,355-357)。事實上，產生抗血清群B莢膜的免疫應答可能實際上證明是有害的。鑒于此，仍然需要用于預防腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B感染的新疫苗。抗腦膜炎球菌疾病的保護作用的最可靠(validated)免疫學關聯測定(correlate)是血清殺菌測定法(SBA)。SBA評估血清中抗體(經常是IgG2a亞類)介導補體在細菌細胞表面上沉積、組裝膜攻擊復合物、和裂解細菌的能力。在SBA中，將已知數目的細菌暴露于具有指定補體來源的血清的連續稀釋液。測定存活細菌的數目，將SBA定義為介導50%殺傷的最高血清稀釋度的倒數。SBA可預測抗血清群C感染的保護作用，它被廣泛用作抗TVmB感染的免疫力的代名詞(surrogate)。重要的是，在疫苗的臨床前評估中，SBA是免疫力的現成標志物，它提供了臨床試驗的合適終點。7VmB疫苗開發的大多數努力致力于確定有效的蛋白亞基。"反向疫苗學，，(Reversevaccinology)中有一項重大投資，其在基因組序列中尋找有可能在表面表達為異源抗原的蛋白，并測試它們在動物中產生有意義的應答的能力。然而，此方法受到如下限制l)用于預測表面表達的抗原的計算機算法，2)未能表達許多潛在免疫原，和3)對鼠免疫應答的完全依賴性。成功的疫苗的關鍵在于，確定針對廣泛多種疾病分離抹、而不是限于具體血清群或克隆組(clonalgroup),其都能引發保護作用的抗原。遺傳篩選方法(我們稱為對免疫原的遺傳篩選(GeneticScreeningforImmunogens)或GSI)被用來分離在遺傳多樣的微生物菌林間保守的抗原，其可以以腦膜炎球菌菌林為例。其做法是，用下文詳述的GSI鑒定微生物抗原諸如腦膜炎奈瑟氏球菌抗原；并通過評估由重組抗原引發的免疫應答功能和評估抗原的保護效力予以驗證(參見實施例和參見PCT/GB2004/005441(2005年7月7日作為WO2005/060995公開)，在此收入作為參考)。本質上，GSI法涉及鑒定微生物多肽的方法，該多肽與遭遇該微生物的動物中的免疫應答有關，該方法包括如下步驟(l)提供該微生物的多種不同突變體；(2)使所述多種微生物突變體與已產生抗該微生物或其一部分的免疫應答的動物的抗體接觸，在所述接觸的條件下，一旦所述抗體與所述微生物突變體結合，則殺死該微生物突變體；(3)選出步驟(2)中幸存的微生物突變體；(4)鑒定出任何幸存的微生物突變體中包含所述突變的基因；和(5)鑒定由該基因編碼的多肽。應當領會，根據鑒定這些多肽所采用的方式，將這些多肽作為抗原性多肽是高度恰當的。正如實施例中更為詳細所述的，通過GSI法鑒定的具體基因是腦膜炎奈瑟氏3求菌的NMB0377，NMB0264,NMB1333,NMB1036,NMB1176,NMB1359和NMB1138基因。腦膜炎奈瑟氏球菌的基因組序列可從例如TheInstituteofGenomeResearch(TIGR);www.tigr.org獲得。盡管這些基因構成已經測序的基因組的一部分，就發明人所知，它們尚未分離，由它們編碼的多肽尚未制得(且尚未分離)、而且沒有跡象表明它們所編碼的多肽可用作疫苗的成分。因此，本發明包括上文和實施例中所述的分離的基因、及變體和片段、及此類變體和片段的融合物，還包括上述基因編碼的多肽、及其變體和片段、及此類片段和變體的融合物。下文更詳細的描述了變體、片段和融合物。優選的是，上文給出的基因的變體、片段和融合物是編碼多肽的那些，所述多肽能產生抗腦膜炎奈瑟氏球菌的中和抗體。類似的，優選的是，對于上文已給出了序列的那些多肽，它們的變體、片段和融合物是產生抗腦膜炎奈瑟氏球菌的中和抗體的那些。中和抗體可以在有免疫系統的任何動物中生成，例如大鼠、小鼠或兔。本發明還包括分離的多核香酸，其編碼實施例中給出了序列(優選分離的編碼區)的那些多肽或編碼變體、片段或融合物。本發明還包括包含此類多核苷酸的表達載體和包含此類多核苷酸和載體的宿主細胞(詳見下文)。實施例中所述多肽是通過本發明方法鑒定得到的抗原。Sambrook&Russell(2001)MolecularCloning,alaboratorymanual,第三版，ColdSpringHarborlaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,在it匕j]欠入作為參考。基因的變體可通過例如在其它微生物中或在該微生物的其它林中鑒定相關基因，及克隆、分離或合成該基因來制備。典型的是，基因的變體是與上文給出的基因具有至少70%序列同一性，更優選至少85%序列同一性，最優選至少95%序列同一性的那些。當然，可容忍替代、刪除和插入。一種核酸序列和另一種之間的相似性程度可Y吏用UniversityofWisconsinComputerGroup的GAP程序來測定。基因的變體還指在嚴格條件下與該基因發生雜交的那些。所謂"嚴格"是指，將基因固定在膜上，探針(在本例中是長度>200個核苷酸)在溶液中，使基因與探針雜交，固定的基因/雜交的探針在0.1xSSC中于65。C清洗10分鐘。SSC指0.15M氯化鈉/0.015M杵檬酸鈉。可制備基因(或變異基因)的片段，例如是完整基因的20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。優選的片段包括整個編碼序列或部分編碼序列。變體和片段可以與其它無關多核苷酸融合。多核苷酸編碼有免疫原性的多肽，所述多肽與遭遇所述微生物的動物的抗體反應，所述微生物是鑒定出該基因的微生物。抗原可以是由上文所鑒定的基因編碼的多肽，該多肽的序列可從該基因序列輕易推導。在其它實施方案中，抗原可以是所鑒定的多肽的片段，或者可以是所鑒定的多肽的變體，或者可以是所述多肽或片段或變體的融合物。因此，本發明的一個具體方面提供了包含選自SEQIDNo2,4,6,8,10,12,14中任一的氨基酸序列的多肽；或其片段或變體、或此類片段或變體的融合物。因此，本發明提供了下列分離的蛋白、或其片段或變體、或這些的融合物如下文所述的NMB1333，NMB0377,NMB0264,NMB1036,畫B1176，麗B1359和畫B1138。可制備所鑒定的多肽的片段，例如是完整多肽的20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。典型的，所述片段是至少10、15、20、30、40、50、100個或更多氨基酸，但少于500、400、300或200個氨基酸。可制備多肽的變體。"變體"包括保守或是非保守的插入、刪除和替代，其中此類變化基本上不改變所述蛋白的正常功能。"保守替代，，指諸如Gly,Ala;Val，lie,Leu;Asp,Glu;Asn,Gin;Ser,Thr;Lys,Arg;及Phe,Tyr組合。此類變體可使用眾所周知的蛋白工程和定點誘變方法來制備。一類具體的變體是由上述變異基因編碼的那些，例如來自相關微生物或該微生物其它林的那些。典型的，所述變異多肽與使用本發明方法所鑒定的多肽具有至少70%序列同一性，更優選至少85%序列同一性，最優選至少95%序列同一性。兩種多肽之間的百分比序列同一性可使用合適的計算機程序來測定，例如UniversityofWisconsinGeneticComputingGroup的GAP禾呈序,應當4貞會百分比同一性是在將多肽序列進行最佳比對后計算得出的。或者可使用ClustalW程序(Thompsonetal，(1994)iVwc/e/c爿c/A22，4673-80)來進行比對。所用參數可以如下快速成對比對參數K-元組(tuple)(詞(word))長(size);1,窗長(windowsize);5，擊夾口罰分(gappenalty);3,頂端只于角線凄t(numberoftopdiagonals);5。i平分方法(Scoringmethod):x百分比。多重比對參數缺口打開罰分(gapopenpenalty);10,缺口延伸罰分(gapextensionpenalty);0.05。i平分殺巨卩車(Scoringmatrix):BLOSUM。融合物可以是與任何合適多肽融合的融合物。典型的，所述多肽是能夠增強對與之融合的多肽的免疫應答的那些。融合配偶可以是便于純化的多肽，例如通過構成可在例如親和層析柱中固定的部分(moiety)的結合位點而便于純化的那些。因此，融合配偶可以包含寡組氨酸或結合鈷或鎳離子的其它氨基酸。它還可以是單克隆抗體的表位，諸如Myc表位。正如上文所討論的，變異多肽或多肽片段、或這些的融合物典型的是產生抗腦膜炎奈瑟氏球菌的中和抗體的那些。由此，本發明還包括制備如上所述抗原的方法，及通過該方法獲得的或可通過該方法獲得的抗原。可以如本領域眾所周知的，將本發明的多核苷酸克隆到表達載體等載體中。此類載體可存在于宿主細胞，諸如細菌、酵母、哺乳動物和昆蟲宿主細胞中。本發明的抗原可在合適的宿主細胞中由多核苦酸容易地表達，并從中分離，供疫苗中使用。典型的表達系統包括商品化的pET表達載體系列和大腸桿菌宿主細胞，諸如BL21。表達的多肽可通過本領域知道的任何方法來純化。方便的是，將抗原與如上所述結合親和柱的融合配偶融合，并使用該親和柱(例如鎳或鈷親和柱)純化該融合物。應當領會抗原或編碼抗原的多核苷酸(諸如DNA分子)特別適于用于疫苗。在那種情況中，抗原從生成該抗原的宿主細胞中純化(或者在通過肽合成來制備抗原的情況中，從該合成的任何污染物中純化抗原)。典型的是，在抗原所含有的污染性物質少于5%，優選少于2%、1%、0.5%、0.1%、0.01%之后，將抗原配制到疫苗中。抗原最好是基本上不含熱原。因此，本發明還包括含有抗原的疫苗，及制備疫苗的方法，包括將抗原與磷酸緩沖鹽水等合適載體組合。本發明的抗原可以單獨施用，但優選將其與一種或多種可接受的載體一起配成藥用配制劑。載體必須是"可接受的"，這是指，載體應與本發明的抗原相容、且對該載體的受體無害。典型的是，載體是無菌且不含熱原的水或鹽水。疫苗還可包含佐劑。優選對患者進行主動免疫接種(activeimmunisation)。在此方法中，將一種或多種抗原制成含有合適佐劑和載體的免疫原性配制劑，并以已知方式施用于患者。合適的佐劑包括弗氏完全或不完全佐劑，胞壁酰二肽，EP109942、EP180564和EP231039的"Iscoms，，，氫氧化鋁、皂苷、DEAE-葡聚糖、中性油(諸如miglyol)、植物油(諸如花生油)、脂質體、Pluronic多元醇或Ribi佐劑系統(參見例如GB-A-2189141)。"Pluronic"是注冊商標。待免疫的患者是需要獲得抗微生物感染的保護的患者。本發明還包括藥用組合物，其包含本發明的多肽、或其變體或片段、或這些的融合物、或者本發明的多核芬酸、或其變體或片段、或這些的融合物及如上文所討論的藥學可接受的載體。前述本發明抗原(或編碼此類抗原的多核芬酸)或其配制劑可通過任何常規方法來施用，包括口服和腸胃夕卜(例如皮下或肌肉內)注射。治療可以由單劑或一段時間里的多劑組成。應當領會本發明的疫苗，根據其抗原成分(或多核苦酸)，可用于人用藥物和獸用藥物領域。由微生物引起的疾病在許多動物如家畜中是已知的。本發明的疫苗，在含有適宜的抗原或編碼抗原的多核苷酸時，可用于人，但也可用于例如牛、綿羊、豬、馬、犬和貓，及用于家禽諸如雞、火雞、鴨和鵝。因此，本發明還包括給個體接種疫苗以抵抗孩i生物的方法，該方法包括給個體施用如上所述的抗原(或編碼抗原的多核芬酸)或疫苗。本發明還包括如上所述的抗原(或編碼抗原的多核苷酸)在制備給個體接種的疫苗中的用途。本發明的抗原可以用作疫苗中的唯一抗原，或者它可以與針對相同或不同疾病微生物的其它抗原聯合使用。關于腦膜炎奈瑟氏球菌，所得到的對iVmB有反應性的抗原可以與抗A和/或C血清群的疫苗中所使用的成分聯合。它還可以方便的與抵抗嗜血菌(//aemop/n7w力和/或肺炎鏈球菌(5/tococcwsp"ewmow/ae)而才是供寸呆護的4元原性成分聯合。另外的抗原性成分可以是多肽，或者它們可以是其它抗原性成分，諸如多糖。多糖也可用于增強免疫應答(參見例如Makelaetal(2002)ExpertRev,Vaccines1，399-410)。在上文疫苗和疫苗接種方法中特別優選的是，抗原是由上文(和實施例中)所述任何基因編碼的多肽或者上述變體或片段或融合物(或編碼所述抗原的多核苷酸)，而且需要接種疫苗進行抵抗的疾病是腦膜炎奈瑟氏球菌感染(腦膜炎菌疾病)。下面將通過如下非限制性實施例更為詳細的描述本發明。實施例l:腦膜炎奈瑟氏球菌中對免疫原的遺傳篩選(GSI)GSI在此實施例中的應用包括，在腦膜炎奈瑟氏球菌的插入突變體文庫中，篩選對殺菌性抗體的殺傷作用較不敏感的菌株。GSI詳見PCT/GB2005/005441(2005年7月7日作為WO2005/060995公開)。在7VmB的已測序分離抹MC58的突變體文庫中，通過用抗莢膜陰性相同抹(acapsuleminusofthesamestrain)的小鼠血清進行篩選，我們證明了GSI的有效性。總共40,000個突變體用經同源菌株腹膜內免疫小鼠而產生的血清進行分析；此血清抗野生型菌林的SBA是約2,000。在將文庫暴露于1:560稀釋的血清(它殺死所有野生型細菌)時檢測到存活的突變株。為了確定存活突變抹中的轉座子插入就是抵抗殺傷作用的能力的原因，將這些突變回交(backcross)到親本^^朱中，并證實了回交突變株在SBA中比野生型對殺傷作用更有抵抗力。通過標志獲救(markerrescue)分離轉座子插入位點，以此4企查受該轉座子影響的基因的序列。我們發現了其中兩種受影響的基因TspA和NMB0338。TspA是引發強CD4+T細胞應答的表面抗原，可被患者血清識另'J(Kiziletal(1999)InfectImmun.67，3533-41)。NMB0338基因的功能在此之前是未知的，其編碼據預測含有兩個跨膜結構域且位于細胞表面的多肽。由NMB0338編碼的氨基酸序列是MERNGVFGKIVGNRIIiRMSSEHAAASYPKPCKSFKLAQSWFRVRSCljGGVFIYGANMKIj工YTV工KI工IIjIjIjFIjI^AVINTDAVTFSYIjPGGKFDIjPIjIWIjFGAFWGI工FGMFAIjFGRIjIjSIjRGENGRIjRAEVKKNARLTGKEIjTAPPAQNAPESTKGP(SEQIDNo15)除了公共健康的要求以外，將iVmB用于GSI有數項實用優勢a)這種細菌可進行遺傳跟蹤(tractable);b)通過效應器免疫機制對該細菌造成的殺傷可直接測定；c)可獲得三種具有不同血清群和克隆譜系的分離抹的基因組序歹ll(分別是血清群A的IV-A、血清群B的ET-5和血清群C的ET-37);和d)有詳細表征的臨床資源可供此項工作所用。GSI有兩項潛在限制。第一，殺菌性抗體的靶物可能是必不可少的。但這不太可能，因為iVwB中殺菌性抗體的所有已知耙物都不是必不可少的，而且當前許可的細菌疫苗無一靶向必不可少的基因產物。第二，血清中含有抗多種抗原的抗體，失去單一一種抗原可能不影響突變林的存活。我們早就證明，甚至在用抗同源菌抹的血清進行篩選的過程中，使用適宜稀釋度的血清仍然鑒定到相關抗原。GSI的主要優點在于1)高通量步驟不涉及過分要求技術的或昂貴的流程(諸如蛋白表達/純化和免疫接種)；和2)試驗中可使用人樣品，而非僅僅依賴于動物數據。GSI可迅速查明表面蛋白中引發殺菌活性的那些蛋白，從而可以更詳細分析相對較少的候選物。1.使用GSI鑒定殺菌性抗體的靶物使用抗異源菌抹的鼠血清、并且使用人血清來鑒定交叉反應性抗原。所述血清得自i)用異源菌抹經全身性途徑免疫的小鼠所述菌抹的選擇和/或構建使得避免具有相同免疫型(immunotype)和亞血清型(sub-serotype)的分離才朱；ii)感染了腦膜炎奈瑟氏球菌已知分離株的患者的急性期和恢復期血清(由NorthwickPark的DrR.Wall提供)；iii)接受NmB分離抹H44/76的指定外膜泡(outermembranevesicle,OMV)疫苗的志愿者的免疫前和免疫后才羊品(由MeningococcalReferenceLaboratory提供)。這些血清來源都具有特定的優點和缺點。_<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>a)在GSI中，使用經異源菌抹(即已測序的血清群A或C菌林)免疫的動物的血清，對MC58突變抹文庫進行篩選。我們證明，用減毒活7VwB免疫接種引發了抗血清群A和C菌抹的交叉反應性殺菌性抗體應答。通過被破壞的基因的標志獲救，鑒定了在有人血清時存活增強的突變抹中不存在的抗原。b)鑒定了賦予針對異源血清殺傷作用的抵抗力的突變，并且確定了該基因產物是否也是已測序的血清群A和C菌抹(分別是Z2491和FAM18)的殺傷靶物。在基因組數據庫查找這些基因的同系物。當存在同系物時，從MC58突變株擴增轉座子插入，并將其轉化導入血清群A和C菌抹。比較每個血清群的突變抹和野生型菌林的相對存活。因此，GSI可快速給出關于殺菌活性的靶物在腦膜炎奈瑟氏球菌任何血清群、免疫型和亞血清型的不同菌抹中是否保守、且是否可達到(accessible)的信息。c)使用恢復期病人或接受異源OMV疫苗(衍生自H44/76)的人的血清，測試能抵抗小鼠血清而存活增強的突變抹。這解決靶物是否能夠在人體中引發殺菌性抗體的重要問題。在其它疫苗方法中，此信息只能在按照GMP要求生產疫苗候選物之后，在臨床試驗的晚期耗費很多財力以后獲得。優點在于，GSI是使用現有的簡單技術進行的高通量分析。在人體中引發殺菌性抗體、且介導殺傷多個菌林的抗原可得到迅速鑒定，因為GSI在使用細菌菌抹和血清方面是靈活的。以與使用鼠血清選擇的突變株相同的方式分析使用人血清選擇的突變抹。2.評估重組GSI抗原的抗體應答使用商品化載體，在大腸桿菌中表達蛋白和疫苗，所述蛋白作為殺菌性抗體的靶物、并被恢復期患者的血清識別。通過PCR從MC58擴增相應的可讀框，并連接到載體諸如pCRTopoCT或pBAD/His中，以容許蛋白分別在T7或阿拉伯糖誘導型啟動子的控制下表達。從細胞總蛋白中純化出上述重組蛋白，該過程是在鎳或鈷柱上通過與所述蛋白C末端融合的His標簽進行的。成年新西蘭白兔皮下注射25嗎純化蛋白及弗氏不完全佐劑，共兩次免疫接種，其間間隔四周。在免疫接種前，通過全細胞ELISA，檢查動物血清中已有的抗7V/w抗體。用初始血清滴度<1:2的動物進行免疫接種實驗。第二次免疫接種的兩周后獲取免疫接種后血清。為了確認特異性抗體已經產生，通過i)針對純化的蛋白的Western分析和ii)使用野生型和相應突變抹(通過GSI產生)的細胞進行的ELISA，測試免疫前和免疫后血清。針對MC58(同源菌林)，及已測序的血清群A和C菌抹，用兔免疫血清進行SBA。試驗至少進行兩次，每次一式三份。將SBA〉8視為顯著。所得結果提供了蛋白候選物是否能作為重組蛋白引發殺菌性抗體的證據。3.確定GSI抗原的保護功效測試所有候選物保護動物抵抗活細菌攻擊的能力，因為這能在單個試驗中評估任一方面的免疫力(細胞免疫力或體液免疫力)。我們建立了抗活細菌感染的主動免疫和保護模型。在此模型中，成年小鼠在第O天和第21天免疫，在第28天腹膜內接受活細菌攻擊，為葡聚糖鐵(作為補充性鐵來源)中的106或107CFUMC58。該模型類似于評估Tbps免疫的保護功效的模型(Danveetal(1993)Vaccine11,1214-1220)。未免疫動物在感染后4小時內發生菌血癥，到24小時時顯示出全身性疾病的征候。我們早就能夠證明減毒iVw菌抹和蛋白抗原二者抗腦膜炎球菌活菌攻擊的保護功效；PorA是引發殺菌性抗體的外膜蛋白，但其抗原性變動很大，因此不是首選的疫苗候選物(Bartelal(1999)InfectImmun..67,3832-3846)。六周齡BALB/c小鼠(每組35只動物)在第0和21天皮下接受25嗎重組蛋白及弗氏不完全佐劑，然后在第28天腹膜內接受106(15只動物)或107(15只動物)CFUMC58攻擊。使用兩種攻擊劑量來檢驗疫苗在高和低攻擊劑量的功效；在第28天從每組中剩余的五只動物及從第一次免疫接種前的五只動物獲取血清，并保存于-70。C供進一步的免疫學試驗。對照組的動物接受i)單獨的佐劑；ii)重組的再折疊PorA;或iii)7Vw減毒活菌抹。為了降低對照組中動物的總數，一次測試多個有五個候選物的組(組的數目=5個候選物+3個對照)。通過MannWhitneyU4企驗比較各組動物的存活情況。在每組15只小鼠/劑時，這些實驗顯示出25%的組間存活差異。對于針對攻擊顯示出顯著保護作用的疫苗，進行重復實驗以確認該發現。另外，為了確定使用候選物進行的疫苗接種還引發抵抗菌血癥的保護作用，在第二次實驗過程中測定菌血癥的水平；在感染后22小時在經免疫和未免疫動物中采集血樣(此時菌血癥水平最高)。使用雙尾(two-tailed)Student-T檢驗分析結果，以確定在接種疫苗的動物中菌血癥是否顯著減輕。所使用的其它材料和方法腦膜炎奈瑟氏球菌的誘變為了對腦膜炎奈瑟氏球菌的研究，通過體外誘變構建突變抹。用Tn5衍生物對腦膜炎奈瑟氏球菌的基因組DNA進行誘變，所述Tn5衍生物含有編碼卡那霉素抗性的標志物和在大腸桿菌中有功能的復制起點。這些元件通過Tn5的復合(composite)末端聯合在一起。用Tn5的高活性變體進行轉座反應，并用T4DNA聚合酶和連接酶在有ATP和多種核苷酸的條件下修復DNA。用該修復的DNA將腦膜炎奈瑟氏球菌轉化成卡那霉素抗性菌。Southern分析證實，每個突變株只包含所述轉座子的單一插入。血清殺菌測定法(Serumbactericidalassay,SBA)將細菌在固體培養基(含Levanthals補充物的腦心浸液培養基(brainheartinftisionmedia))上培養過夜，然后在實驗當天的上午在固體培養基上再次劃線，培養4小時。此后，將細菌收集到磷酸鹽緩沖鹽水中并計數。SBA在lml體積、含有補體來源(幼兔或人)、以及約105個菌落形成單位的條件下進行。在溫育結束時收集細菌，并涂布到固體培養基上以回收幸存的細菌。分離轉座子插入位點通過標準方法從感興趣的突變抹回收基因組DNA，并用尸vwll、￡coiV和Dral消化3小時，然后通過酚抽提來純化。接著將DNA以100微升體積在有T4DNA連接酶的情況下于16。C自我連接過夜，沉淀，然后用于通過電穿孔將大腸桿菌轉化成卡那霉素抗性菌。實施例2:其它篩選及其結果GSI已經用于篩選大約40,000個MC58插入突變林的文庫。該文庫是使用含有pACYC184復制起點的轉座子、通過體外Tn5誘變構建的。選擇MC58是因為它是腦膜炎奈瑟氏球菌的血清群B分離林，而且此菌抹的完整基因組序列已知。總是以野生型菌林作為對照來平行篩選該文庫，而且顯示了從該文庫和野生型回收的菌落數。下列的另外的抗原使用基本上如上所述的方法鑒定得到NMB1333核酸序列CAAATACGTTATCAAGGTCAGGTATTGAACCCTTCGAGCTGGATACGTTGA畫B1333氨基酸序列MRYKPLLLALMLVFSTPAVAAHDAAHNRSAEVKKQTKNKKEQPEAAEGKKEKGKNGAVKDKKTGGKEAAKEGKESKKTAKNRKEAEKEATSRQSARKGREGDKKSKAEHKKAHGKPVSGSKEKNAKTQPENKQGKKEAKGQGNPRKGGKAEKDTVSANKKVRSDKNGKAVKQDKKYREEKNAKTDSDELjKAAVAAATNDVENKKALiLjKQSEGMIiljHVSlSrSIjKQIjQEER工RQERIRQARGNLASVNRKQREAWDKFQKLjNTEIjNRIiKTEVAATKAQISRFVSGNYKNSQPNAVAIjFIjKNAEPGQKNRFIiRYTRYVNASNREWKDLjEKQQKALAVQEQKINNELARLKKIQANVQSIjIjKKQGVTDAAEQTESRRQNAKIAKDARKKLEQKGNEQQ:LNKIiLiSNIiEKKKAEHR工QDAEAKRKIjAEARLAAAEKARKEAAQQKAEARRAEMSNLTAEDRNIQAPSVMG工GSADGFSRMQGRLKKPVDGVPTGIjFGQNRSGGDIWKGVFYSTAPATVESIAPGTVSYADEIjDGYGKVVVVDHGENYISIYAGLSEISVGKGYMVAAGSKIGSSGSIjPDGEEGIjYLQIRYQGQVLNPSSWIRGCAACCGGCGCATCCAAACCGTGTATTCTGGGCGCGGGATATTATTATTGANMB0377氨基酸序列MRYKPLLLALMLVFSTPAVAAHDAAHNRSAEVKKQTKNKKEQPEAAEGKKEKGKNGAVKDKKTGGKEAAKEGKESKKTAKNRKEAEKEATSRQSARKGREGDKKSKAEHKKAHGKPVSGSKEKNAKTQPENKQGKKEAKGQGNPRKGGKAEKDTVSANKKVRSDKNGKAVKQDKKYREEKNAKTDSDELjKAAVAAATNDVENKKALiLjKQSEGMIiljHVSlSrSIjKQIjQEER工RQERIRQARGNLASVNRKQREAWDKFQKLjNTEIjNRIiKTEVAATKAQISRFVSGNYKNSQPNAVAIjFIjKNAEPGQKNRFIiRYTRYVNASNREWKDLjEKQQKALAVQEQKINNELARLKKIQANVQSIjIjKKQGVTDAAEQTESRRQNAKIAKDARKKLEQKGNEQQ:LNKIiLiSNIiEKKKAEHR工QDAEAKRKIjAEARLAAAEKARKEAAQQKAEARRAEMSNLTAEDRNIQAPSVMG工GSADGFSRMQGRLKKPVDGVPTGIjFGQNRSGGDIWKGVFYSTAPATVESIAPGTVSYADEIjDGYGKVVVVDHGENYISIYAGLSEISVGKGYMVAAGSKIGSSGSIjPDGEEGIjYLQIRYQGQVLNPSSWIRNMB0264核酸序列MRYKPLLLALMLVFSTPAVAAHDAAHNRSAEVKKQTKNKKEQPEAAEGKKEKGKNGAVKDKKTGGKEAAKEGKESKKTAKNRKEAEKEATSRQSARKGREGDKKSKAEHKKAHGKPVSGSKEKNAKTQPENKQGKKEAKGQGNPRKGGKAEKDTVSANKKVRSDKNGKAVKQDKKYREEKNAKTDSDELjKAAVAAATNDVENKKALiLjKQSEGMIiljHVSlSrSIjKQIjQEER工RQERIRQARGNLASVNRKQREAWDKFQKLjNTEIjNRIiKTEVAATKAQISRFVSGNYKNSQPNAVAIjFIjKNAEPGQKNRFIiRYTRYVNASNREWKDLjEKQQKALAVQEQKINNELARLKKIQANVQSIjIjKKQGVTDAAEQTESRRQNAKIAKDARKKLEQKGNEQQ:LNKIiLiSNIiEKKKAEHR工QDAEAKRKIjAEARLAAAEKARKEAAQQKAEARRAEMSNLTAEDRNIQAPSVMG工GSADGFSRMQGRLKKPVDGVPTGIjFGQNRSGGDIWKGVFYSTAPATVESIAPGTVSYADEIjDGYGKVVVVDHGENYISIYAGLSEISVGKGYMVAAGSKIGSSGSIjPDGEEGIjYLQIRYQGQVLNPSSWIRATTATGTGGGAATCCGCGCGGCTGTTTGAAAACATCGGCACCGTCGGCGACGGCATGGCAACCCTGTCCAAACCGCACACCATCCTCGACAAGCCCCGGGCACTGCCGCTGAACGTGCCGCAAGGCGCAATCAAATTTGAACACGTCGATTTCTCCTACGAAGCGGGCAAACCGCTGCTCAACGGCTTCAACCTCACCATCCGCCCGGGCGAAAAAGTCGGCTTGATCGGACGCAGCGGCGCGGGCAAATCCACCATCGTCAACCTGCTTTTGCGCTTCTACGAACCGCAAAGCGGCACGGTTTCGATCGACGGGCAGGACATAAGCGGCGTTACCCAAGAATCTTTACGCGCCCAAATCTGGGCGCACCAGAGCGGCGGCTTCCTCAACGAACACGTCGAGTGGCAGCACGACTGA畫B0264氨基酸序列FQFMGKIVEWLGKYAPAELFAEKSWELAAMAAMMVFSVAWAFAASNVRLGTLGGVFPMRLSHGAREAAYAKGSMEEFMVTVRAGMRLjATLjLjHSCSFIVNTSLTIjSTAALGIWIjWHNGGVGVSIDGQDISGVTQESLRAQIGLVTQDTSLLHRSWDNI工YGRPDATDAEMVSAAERAEAAEAA工GESLDKMMDGKTV工A工AHRLST工AAMDRLWIjDKGR工工EEGTHAEIjLEKRGIjYAKLWAHQSGGFLNEHVEWQHDNMB1036核酸序列CGCTTTACCGACATCCGCATGATGGCGTAANMB1036氨基酸序列TIDYVKDKPFAPEGEAWDKAVEYWRTIjVSDEGAVFDKEYRFNAEDIEPQVTWGTSPEMVLD工SSKVPNPAEETDPVKRSGMERALjEYMGIjEAGTPLNEIPVDIVF工GSCTNSR工ED:LREAAAIAKDRKKAANVQRVLIVPGSGLVKEQAEKEGLDKIF工EAGFEWREPGCSMCLAMNADRLTPGQRCASTSNRNFEGRQGNGGRTHLVSPAMAAAAAVTGRFTD工RMMANMB1176核酸序列ATGAAAGACAAGCACGATTCTTCCGCCATGCGGCTGGACAAATGGCTTTGGGCGGCACGTGACCGCCGCCAACTGGACAGGCTGAAAAAAGGAGACTGGTAA畫B1176氨基酸序列MKDKHDSSAMRLiDKWIjWAARFFKTRSLAQKHIEIiGRVQVNGSKVKNSKT工D工GD工IDLTLNSLiPYK工KVKGIjNHQRRPASEARI^YEEDAKTATIjREERKQIiDQFSRITSAYPDGRPTKRDRRQLDRIjKKGDWNMB1359核酸序列CTGCCGGAAAACTTGTTTTTCTCCGACGCATTCACGCCGTCCGCATCATAANMB1359氨基酸序列MNHTVTIjPDQTTFAANDGETVLTAAARQNIjNIjPHSCKSGVCGQCKAEIjVSGDIQMGGHSEACGSPAMTEQTKNIjFVQQHKIjPENIjFFSDAFTPSASNMB1138核酸序列GACCGCCGCCAACTGGACAGGCTGAAAAAAGGAGACTGGTAANMB1138氨基酸序列NSIjPYK工KVKGIjNHQRRPASEARIjIjYEEDAKTATIjREERKQIjDQFSRITSAYPDGRPTKRDRRGLiDRIiKKGDW序列表序列編號(SEQIDNo)序列1麗B1333DNA2NMB1333蛋白3畫B0377DNA4畫B0377蛋白NMB0264DNA6畫B0264蛋白7麗B1036DNA8NMB1036蛋白9畫B1176DNA10薩B1176蛋白11畫B1359DNA12NMB1359蛋白13畫B1138DNA14NMB1138蛋白權利要求1.包含選自SEQIDNo2，4，6，8，10，12，14中任一的氨基酸序列的多肽；或其片段或變體、或此類片段或變體的融合物。2.編碼依照權利要求1的多肽的多核苷酸。3.用于藥物的依照權利要求1的多肽或依照權利要求2的多核苦酸。4.用于疫苗的依照權利要求1的多肽或依照權利要求2的多核苷酸。5.用于制備依照權利要求1的多肽的方法，該方法包括在宿主細胞中表達權利要求2的多核苷酸并分離所述多肽。6.用于制備依照權利要求1的多肽的方法，包括化學合成所述多肽。7.對個體接種疫苗以抵抗腦膜炎奈瑟氏球菌的方法，該方法包括對個體施用依照權利要求1的多肽或依照權利要求2的多核苷酸。8.依照權利要求1的多肽或依照權利要求2的多核芬酸在制備疫苗中的用途，該疫苗用于接種個體以抵抗腦膜炎奈瑟氏球菌。9.藥用組合物，包含依照權利要求1的多肽或依照權利要求2的多核苷酸及藥學可接受的載體。全文摘要描述了可用于疫苗的多種多肽、或其變體或片段、或這些的融合物。所述多肽可以是包含選自SEQIDNo2，4，6，8，10，12，14中任一的氨基酸序列的多肽；或其片段或變體、或此類片段或變體的融合物，而且可用于抗腦膜炎奈瑟氏球菌的疫苗。文檔編號C07K14/22GK101370514SQ200680051689公開日2009年2月18日申請日期2006年12月21日優先權日2004年12月23日發明者克里斯托弗·M·唐,李延文申請人:帝國改革有限公司