經(jīng)標(biāo)記的牛病毒性腹瀉病毒疫苗的制作方法

專利名稱：經(jīng)標(biāo)記的牛病毒性腹瀉病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種經(jīng)標(biāo)記的牛病毒性腹瀉病毒疫苗。

背景技術(shù)：
牛病毒性腹瀉病毒(BVD病毒，或BVDV)是一種瘟病毒屬(Pestivirus)黃病毒科(Flaviviridae)的小RNA病毒。其與作為羊邊緣病和豬典型豬瘟的病原體的病毒密切相關(guān)。BVDV導(dǎo)致的疾病廣泛傳播，并且在經(jīng)濟(jì)上能夠造成毀滅性打擊。BVDV能夠?qū)е屡Ｈ旱姆敝硢栴}，并且能夠?qū)е铝鳟a(chǎn)或早產(chǎn)。BVDV能夠透過孕牛的胎盤，可能導(dǎo)致生下持久性感染(persistently viremic，PI)的小牛，這些小牛對(duì)病毒具有免疫耐受性，并且在它們的余生中都會(huì)持續(xù)性地在血中帶有病毒(Malmquist，J.Am.Vet.Med.Assoc.152763-768(1968)；Ross等，J.AmVet.Med.Assoc.188618-619(1986))。感染牛還會(huì)具有“粘膜病”，該疾病的特征在于溫度升高、腹瀉、咳嗽和患部粘膜潰瘍(Olafson等，CornellVet.36205-213(1946)；Ramsey等，NorthAm.Vet.34629-633(1953))。這些持續(xù)性感染的動(dòng)物提供了牛群中進(jìn)一步爆發(fā)粘膜病的病毒散播源(Liess等，Dtsch.Tieraerztl.Wschr.81481-487(1974))，并且非常容易被微生物感染而引起腸道疾病或肺炎(Barber等，Vet.Rec.117459-464(1985))。
BVD病毒被分類為兩種生物型之一?！癱p”生物型的那些在培養(yǎng)細(xì)胞中誘發(fā)細(xì)胞病理效應(yīng)，而“ncp”生物型的那些則不會(huì)(Gillespie等，Cornell Vet.5073-79(1960))。此外，識(shí)別了兩種主要的基因型(1型和2型)，二者均顯示引發(fā)多種臨床綜合征(Pellerin等，Virology 203260-268(1994)；Ridpath等，Virology 205-66-74(1994))。BVD病毒體(virion)的直徑為40-60納米。BVDV的核衣殼(nucleocapsid)由單個(gè)RNA分子和衣殼蛋白C組成。核衣殼被其中錨定有兩個(gè)糖蛋白(E1和E2)的脂質(zhì)膜所圍繞。第三糖蛋白Ems與包膜(envelope)松散地相連。BVDV基因組的長(zhǎng)度為約12.5kb，并且含有單個(gè)開放的讀取框(open reading frame)，該讀取框位于5’和3’-非轉(zhuǎn)譯區(qū)(NTR)之間(Collett等，Virology165191-199(1988))。約438kD的多蛋白(polyprotein)由該開放讀取框轉(zhuǎn)譯，并被細(xì)胞蛋白酶和病毒蛋白酶處理成至少11種病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白(Tautz等，J.Virol.71-5415-5422(1997)；Xu等，J.Virol.715312-5322(1997)；Elbers等，J.Virol.704131-4135(1996)；以及Wiskerchen等，Virology 184341-350(1991))。BVDV的基因順序?yàn)閜20/Npro、p14/C、gp48/Erns、gp25/E1、gp53/E2、p54/NS2、p80/NS3、p10/NS4A、p32/NS4B、p58/NS5A和p75/NS5B。p20/Npro(Stark等，J.Virol.677088-7093(1993)；Wiskerchen等，Virol.654508-4514(1991))是順式作用的類木瓜酶蛋白酶，其可以將其自身從合成蛋白的其余部分上裂解。衣殼蛋白(C)，也稱為p14，是一種堿性蛋白，其在染色體RNA的封裝和包被(enveloped)病毒體的形成中發(fā)揮作用。p14/C是不同瘟病毒之間的保留性基因組。三種包被蛋白，gp48/Erns、gp25/E1和gp53/E2均經(jīng)重度糖基化。Erns形成通過二硫鍵共價(jià)連接的同型二聚體。不存在疏水膜錨定區(qū)，顯示Erns與包膜松散地相連。Erns在感染牛中誘發(fā)高抗體效價(jià)(titer)，但是抗血清(antisera)限制了病毒中和活性。發(fā)現(xiàn)E1在病毒體中通過二硫鍵與gp53/E2共價(jià)連接。E1含有兩個(gè)用于將蛋白錨定在膜中的疏水區(qū)，并且作為引發(fā)移位(translocation)的信號(hào)多肽。E1不會(huì)在感染牛中誘發(fā)明顯的抗體反應(yīng)，這顯示其并未暴露在病毒體表面。與E1類似，E2也在其C-端具有膜錨定區(qū)。但是，與E1不同，E2非常具有抗原性(antigenic)，其是BVDV的最具免疫顯性(immunodominant)的蛋白之一。與E2結(jié)合的抗體可以有效地中和病毒感染，顯示其可能涉及病毒入侵。結(jié)構(gòu)蛋白下游的多蛋白區(qū)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，并且被兩種病毒解蛋白酶(viral proteolytic enzyme)處理。NS2-NS3結(jié)合被NS2編碼的鋅依賴蛋白酶(zinc-dependent蛋白酶)裂解。編碼NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B的BVDV多蛋白的C-端部分被NS3的N-端域所編碼的絲氨酸蛋白酶處理。NS3是另一種主要的BVDV免疫原(immunogen)，因?yàn)楦腥九?duì)其顯示強(qiáng)烈的體液反應(yīng)(strong humoral response)。相反，在BVDV感染的牛中未發(fā)現(xiàn)對(duì)其它非結(jié)構(gòu)蛋白的血清抗體，而僅僅能夠檢測(cè)到對(duì)NS4A的弱體液免疫反應(yīng)。
在細(xì)胞致病性BVDV分離株中排他性地發(fā)現(xiàn)NS3，且根據(jù)BVDV亞型與其它瘟病毒之間的比較，編碼該蛋白的區(qū)域是BVDV基因組中最具保留性的區(qū)域之一。NS3的C-端部分編碼RNA-依賴型NTP酶(NTPase)/解螺旋酶，根據(jù)高保留性解螺旋酶氨基酸序列之間的比較，BVDV解螺旋酶被分類為解螺旋酶超科-2(SF2)。在該超科中，有得自馬鈴薯y病毒(poty virus)、黃病毒和瘟病毒的類似蛋白，包括豬霍亂(典型豬瘟)病毒NS3解螺旋酶和得自其它黃病毒如西尼羅河病毒(WestNile virus)、黃熱病病毒、丙型肝炎病毒(HCV)和日本腦炎病毒的RNA解螺旋酶。HCV NS3的蛋白酶域和解螺旋酶域的分子結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破譯(Yao等，Nat Struct Biol.4463-7(1997)；Jin和Peterson，Arch BioxchemBiophys 32347-53(1995))。蛋白酶域包括雙筒狀折疊，其常見于胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶族成員中。解螺旋酶域含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)的β-α-β子域、以及由7個(gè)螺旋和3個(gè)短β股組成的第三子域，后者通常稱為解螺旋酶α-螺旋子域。三磷酸核苷(NTP)和RNA-結(jié)合位點(diǎn)以及解螺旋酶活性位點(diǎn)暴露在表面上，而蛋白酶位點(diǎn)則否，其面對(duì)解螺旋酶域取向。蛋白酶和解螺旋酶域通過短的表面暴露股共價(jià)連接，并且在大表面積上(

)上相互作用。但是，解螺旋酶活性位點(diǎn)遠(yuǎn)離該相互作用區(qū)取向。
目前可用的BVDV疫苗有那些含有化學(xué)上不活潑的野生型病毒的疫苗(McClurkin等，Arch.Virol.58119(1978)；Fernelius等，Am.J.Vet.Res.331421-1431(1972)；以及Kolar等，Am.J.Vet.Res.331415-1420(1972))。這些疫苗通常需要多次給藥，并引起短期免疫反應(yīng)，它們還不能防止病毒傳遞給胎兒(Bolin，Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract.11615-625(1995))。對(duì)于羊，已經(jīng)報(bào)道了基于純化E2蛋白的亞單位疫苗(Bruschke等，Vaccine 151940-1945(1997))。盡管該疫苗顯示保護(hù)胎兒免于被感染，但是保護(hù)僅限于病毒的同源菌株，而且在抗體效價(jià)和保護(hù)之間沒有關(guān)聯(lián)。
已經(jīng)使用下述病毒來制造修飾(modified)活病毒(MLV)BVDV疫苗該病毒通過在?；蜇i細(xì)胞中重復(fù)傳代(passageing)來減毒(attenuated)(Coggins等，Cornell Vet.51539(1961)；以及Phillips等，Am.J.Vet.Res.36135(1975))，或者通過為病毒賦予溫度敏感性表現(xiàn)型的化學(xué)誘導(dǎo)突變來減毒(Lobmann等，Am.J.Vet.Res.452498(1984)；和Lobmann等，Am.J.Vet.Res.47557-561(1986))。已經(jīng)證明單劑MLV BVDV疫苗足以提供對(duì)感染的保護(hù)，且免疫有效期在接種疫苗的牛中能夠延續(xù)多年(Coria等，Can.J.Con.Med.42239(1978))。此外，已經(jīng)報(bào)道了使用MLV疫苗時(shí)的交叉保護(hù)(Martin等，在“Proceedings of the Conference ofResearch Workers in Animal Diseases”，75183(1994)中)。但是，包括疫苗菌株向胎兒傳播在內(nèi)的安全考量是使用這些修飾活病毒疫苗的主要考慮因素(Bolin，Vet.Clin.NorthAm.Food Anim.Pract.11615-625(1995)). 基于以上說明，很明顯需要更有效的新型疫苗以控制BVDV的傳播。這種疫苗在未來的國(guó)家或地區(qū)性BVDV根除計(jì)劃中可能是非常寶貴的，而且還能夠與其它經(jīng)標(biāo)記的牛疫苗組合，表示畜牧業(yè)中的重大進(jìn)展。一種這樣的疫苗是“經(jīng)標(biāo)記”的疫苗。這種疫苗缺少野生型病毒中存在的免疫原決定子(determinant)。被野生型病毒感染的動(dòng)物出現(xiàn)對(duì)“標(biāo)記”免疫原決定子的免疫反應(yīng)，而接種疫苗的未感染動(dòng)物則不會(huì)，因?yàn)樵诮?jīng)標(biāo)記的疫苗(marked vaccine)中不存在決定子。通過使用針對(duì)標(biāo)記決定子的免疫檢測(cè)分析，能夠?qū)⒏腥緞?dòng)物與接種疫苗的未感染動(dòng)物區(qū)分開來。通過將感染動(dòng)物剔除出來，牛群能夠隨時(shí)間而變成無BVD的。除了去除BVD疾病威脅的好處之外，作為無BVD牛群的證明具有直接自由貿(mào)易的經(jīng)濟(jì)利益。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種牛病毒性腹瀉病毒，其包括至少一個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變，其中NS3域中的突變導(dǎo)致野生型NS3的單克隆抗體喪失識(shí)別力，但是其中病毒性RNA的復(fù)制和傳染性病毒的產(chǎn)生仍然保留。
本發(fā)明還涉及一種經(jīng)標(biāo)記的新型牛病毒性腹瀉病毒疫苗，其包括具有至少一個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變的牛病毒性腹瀉病毒，其中NS3不被NS3標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體如20.10.6、1.11.3、21.5.8和24.8所識(shí)別，但其中病毒RNA的復(fù)制和傳染性病毒的產(chǎn)生仍然保留。
本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)動(dòng)物屬于下述何種情況的方法已經(jīng)接種疫苗、或者未接種或感染BVDV。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種包括至少一個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變的牛病毒性腹瀉病毒，其中NS3的解螺旋酶域突變導(dǎo)致野生型牛病毒性腹瀉病毒的NS的單克隆抗體喪失識(shí)別力，但是其中病毒性RNA的復(fù)制和傳染性病毒的產(chǎn)生仍然保留。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種包括至少一個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變的牛病毒性腹瀉病毒，其中NS3不被NS3的單克隆抗體所識(shí)別，且其中NS3抗體選自20.10.6、1.11.3、21.5.8和24.8，但其中病毒性RNA的復(fù)制和傳染性病毒的產(chǎn)生仍然保留。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，病毒疫苗包括單個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，病毒疫苗包括在IGR環(huán)(IGR loop)中的解螺旋酶域突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在IGR環(huán)中在氨基酸殘基1841處的解螺旋酶域突變. 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在IGR環(huán)中在氨基酸殘基1843處的解螺旋酶域突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在IGR環(huán)中在氨基酸殘基1845處解螺旋酶域突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在KHP環(huán)中的解螺旋酶域突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在KHP環(huán)中在氨基酸殘基1867處的解螺旋酶域突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在KHP環(huán)中在氨基酸殘基1868處的解螺旋酶域突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在KHP環(huán)中在氨基酸殘基1869處的解螺旋酶域突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在SES環(huán)中的解螺旋酶域突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在SES環(huán)中在氨基酸殘基1939處的解螺旋酶域突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在SES環(huán)中在氨基酸殘基1942處的解螺旋酶域突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括兩個(gè)解螺旋酶域突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在IGR環(huán)中的兩個(gè)解螺旋酶域突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在IGR環(huán)中在氨基酸殘基1843和1845處的兩個(gè)解螺旋酶域突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在SES環(huán)中的兩個(gè)解螺旋酶域突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在SES環(huán)中在氨基酸殘基1939和1942處的兩個(gè)解螺旋酶域突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括三個(gè)解螺旋酶域突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在IGR環(huán)中的三個(gè)解螺旋酶域突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在IGR環(huán)中在氨基酸殘基1867、1868和1869處的三個(gè)解螺旋酶域突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在IGR環(huán)和SES環(huán)中在氨基酸殘基1845、1868和1939處的三個(gè)解螺旋酶域突變。
在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，提供了一種經(jīng)標(biāo)記的牛病毒性腹瀉病毒疫苗，其包含包括至少一個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變的牛病毒性腹瀉病毒，在該病毒中，NS3的解螺旋酶域突變導(dǎo)致引起野生型牛病毒性腹瀉病毒的NS3的單克隆抗體喪失識(shí)別力，但其中病毒性RNA的復(fù)制和傳染性病毒的產(chǎn)生仍然保留。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種區(qū)分被牛腹瀉病毒感染的動(dòng)物與用牛腹瀉病毒疫苗接種的動(dòng)物的方法。在該實(shí)施方式中，牛腹瀉病毒疫苗是包括至少一個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變的經(jīng)標(biāo)記的疫苗，且該方法包括 從試驗(yàn)動(dòng)物上獲得試樣； 在試樣中檢測(cè)牛腹瀉病毒；和 檢測(cè)牛腹瀉病毒是否包含突變。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，檢測(cè)牛腹瀉病毒的方法使用至少一個(gè)單克隆抗體。
一種優(yōu)選的方法包括包含在NS3的解螺旋酶域中的解螺旋酶域氨基酸突變的經(jīng)標(biāo)記的疫苗。
例如，該區(qū)分檢測(cè)方法的實(shí)施方式可以包括以下步驟 向試樣中加入能夠檢測(cè)野生型牛腹瀉病毒或能夠檢測(cè)突變牛腹瀉病毒的經(jīng)標(biāo)識(shí)的抗體(labelled antibody)，其中該試樣含有來自試驗(yàn)動(dòng)物的體液；以及 通過將至少一種單克隆抗體與野生型牛腹瀉病毒或突變牛腹瀉病毒接觸，來測(cè)量經(jīng)標(biāo)識(shí)的抗體與野生型牛腹瀉病毒或與突變牛腹瀉病毒的結(jié)合親和力；以及 通過比較使用單克隆抗體與野生型BVDV的結(jié)合親和力結(jié)果相對(duì)于單克隆抗體與具有突變NS3的BVDV的結(jié)合親和力結(jié)果，來確定試驗(yàn)動(dòng)物的疫苗接種狀態(tài)。
優(yōu)選方法包括加入針對(duì)不同于突變NS3的域的經(jīng)標(biāo)識(shí)的第一抗體；和 加入針對(duì)NS3突變部分的經(jīng)標(biāo)識(shí)的第二抗體。
在該方法的一個(gè)實(shí)施方式中，第一抗體針對(duì)野生型病毒。
在該方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，第二抗體針對(duì)NS3的突變部分。
在該方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，第二抗體針對(duì)NS3，并且選自20.10.6、1.11.3、21.5.8和24.8。
在該方法的另一個(gè)實(shí)施方式，第二抗體針對(duì)選自IGR環(huán)、KHP環(huán)和SES環(huán)的至少一個(gè)NS3突變部分。
在該方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在IGR環(huán)中在選自1841、1843和1845的氨基酸殘基處的至少一個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變。
在該方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在KHP環(huán)中在選自1867、1868和1869的氨基酸殘基處的至少一個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變。
在該方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在SES環(huán)中在選自1939和1942的氨基酸殘基處的至少一個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變(mutation)。
在該方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，牛病毒性腹瀉病毒包括在IGR環(huán)和SES環(huán)中在氨基酸殘基1845、1868和1939處的至少一個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變。



參考以下說明、所附權(quán)利要求和附圖來舉例說明本發(fā)明的這些和其它特征、方面和優(yōu)點(diǎn)，其中 圖1描繪了NS3域。
圖2顯示了BVDV和HCV解螺旋酶域的序列校準(zhǔn)。
圖3顯示了BVDV解螺旋酶分子結(jié)構(gòu)的圖示。
圖4顯示了掃描突變體的位置。
圖5顯示了完整全長(zhǎng)(complete full length)BVDV前體和BVDV亞病毒復(fù)制子結(jié)構(gòu)的域圖(domain map)。
序列表說明 SEQ ID NO.1是來自牛病毒性腹瀉病毒的全長(zhǎng)未處理多蛋白。該序列中的殘基編號(hào)對(duì)應(yīng)于本文所述的突變。例如，被描述為“K1845A”的突變表示SEQ ID NO.1的1845位置處的賴氨酸殘基已經(jīng)被置換為丙氨酸殘基； SEQ ID NO.2是側(cè)出(flank)于p15aDI克隆位點(diǎn)(cloning site)的5’端以產(chǎn)生示例性突變的DNA質(zhì)粒碎片序列； SEQ ID NO.3是側(cè)出于p15aDI克隆位點(diǎn)的3’端以產(chǎn)生示例性突變的DNA質(zhì)粒碎片序列； SEQ ID NO.4是用于導(dǎo)入本文所述的I1841A突變的DNA 5’引物(primer)序列； SEQ ID NO.5是用于導(dǎo)入本文所述的I1841A突變的DNA 3’引物序列； SEQ ID NO.6是用于導(dǎo)入本文所述的R1843A突變的DNA 5’引物序列； SEQ ID NO.7是用于導(dǎo)入本文所述的R1843A突變的DNA 3’引物序列； SEQ ID NO.8是用于導(dǎo)入本文所述的K1845A突變的DNA 5’引物序列； SEQ ID NO.9是用于導(dǎo)入本文所述的K1845A突變的DNA 3’引物序列； SEQ ID NO.10是用于導(dǎo)入本文所述的K1867A突變的DNA 5’引物序列； SEQ ID NO.11是用于導(dǎo)入本文所述的K1867A突變的DNA 3’引物序列； SEQ ID NO.12是用于導(dǎo)入本文所述的H1868A突變的DNA 5’引物序列； SEQ ID NO.13是用于導(dǎo)入本文所述的H1868A突變的DNA 3’引物序列； SEQ iD NO.14是用于導(dǎo)入本文所述的P1869A突變的DNA 5’引物序列； SEQ ID NO.15是用于導(dǎo)入本文所述的P1869A突變的DNA 3’引物序列； SEQ ID NO.16是用于導(dǎo)入本文所述的E1939A突變的DNA 5’引物序列； SEQ ID NO.17是用于導(dǎo)入本文所述的E1939A突變的DNA 3’引物序列； SEQ ID NO.18是用于導(dǎo)入本文所述的R1942A突變的DNA 5’引物序列； SEQ ID NO.19是用于導(dǎo)入本文所述的R1942A突變的DNA 3’引物序列； SEQ ID NO.20是經(jīng)轉(zhuǎn)譯的BVDV的NS3區(qū)的域1(解螺旋酶)和域2(NTP酶)的肽序列；且 SEQ ID NO.21是經(jīng)轉(zhuǎn)譯的丙型肝炎病毒(HCV)的NS3區(qū)的域1(解螺旋酶)和域2(NTP酶)的肽序列 定義 以下定義可以應(yīng)用于本發(fā)明實(shí)施方式的說明中所使用的術(shù)語(yǔ)。以下定義優(yōu)先于通過引用方式并入本文的個(gè)別參考文件中所含的任何矛盾定義。
除非在本文中另行定義，本發(fā)明所使用的科技術(shù)語(yǔ)將具有本領(lǐng)域一般技術(shù)人員通常理解的含義。而且，除非上下文另外要求，單數(shù)形式的術(shù)語(yǔ)將包括復(fù)數(shù)含義，而復(fù)數(shù)形式的術(shù)語(yǔ)也將包括單數(shù)含義。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指天然和合成氨基酸、以及以與天然氨基酸相似的方式發(fā)揮作用的氨基酸類似物和擬氨基酸(aminoacid mimetic)。天然氨基酸是那些通過遺傳密碼(genetic code)編碼的氨基酸、以及后來經(jīng)過修飾的那些氨基酸，例如，羥基脯氨酸、羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。二十種常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸如α-氨基酸和α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常規(guī)氨基酸也可以是本發(fā)明的多肽的合適組分。非常規(guī)氨基酸的例子包括4-羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基賴氨酸、ε-N-乙基賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰基絲氨酸、N-甲酰基蛋氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其它類似氨基酸及亞氨酸(imino acid)。氨基酸類似物是指具有與天然氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即，碳與氫、羧基、氨基和R基團(tuán)連接。示例性的氨基酸類似物包括，例如，同絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜和蛋氨酸甲基锍。這種類似物具有修飾的R基團(tuán)(例如，正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但是保留了與天然氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。擬氨基酸是指其結(jié)構(gòu)與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同但以與天然氨基酸相似的方式發(fā)揮作用的化合物。
在本文中，氨基酸可以以其公知的三字母符號(hào)來指代，或者用IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)所推薦的一字母符號(hào)來稱呼。
氨基酸-單字母代碼三字母代碼 全名 GGly甘氨酸 VVal纈氨酸 氨基酸-單字母代碼三字母代碼 全名 LLeu亮氨酸 AAla丙氨酸 IIle異亮氨酸 SSer絲氨酸 DAsp天冬氨酸 KLys賴氨酸 RArg精氨酸 HHis組氨酸 FPhe苯丙氨酸 YTyr酪氨酸 TThr蘇氨酸 CCys半胱氨酸 MMet蛋氨酸 EGlu谷氨酸 WTrp色氨酸 PPro脯氨酸 NAsn天冬酰胺 QGln谷氨酰胺 XXaa未指明的氨基酸 本文所使用的術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物對(duì)象”表示包括任何對(duì)BVDV感染易感的動(dòng)物，如牛、羊和豬。“治療”或“疫苗接種”表示預(yù)防BVDV有毒菌株的感染或降低被其感染的風(fēng)險(xiǎn)、改善BVDV感染的癥狀、或加快從BVDV感染中恢復(fù)。
本文所使用的BVD“病毒”、“病毒分離株”或“病毒菌株”是指由病毒基因體、相關(guān)蛋白和其它化學(xué)成分(如脂質(zhì))組成的BVD。通常，BVD病毒具有RNA形式的基因體。RNA能夠逆轉(zhuǎn)錄為DNA以用于克隆(clone)。因此，當(dāng)本文提及核酸和BVD病毒序列時(shí)，包括病毒RNA序列和衍生自病毒RNA序列的DNA序列。為方便起見，下文的序列表中所描繪的BVD基因序列是指多肽序列和用于制造示例性突變的引物DNA序列。其各自所對(duì)應(yīng)的RNA序列對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是容易和明顯的。
多種I型和II型BVD病毒對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，并且可以通過，例如，American Type Culture Collection(美國(guó)種型培養(yǎng)收集會(huì))得到。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“保守性氨基酸置換”是通常在其側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸族中發(fā)生的那些。特別是，本文所使用的保守性氨基酸置換是下述情況與野生型來源的多肽相比，其對(duì)指定多肽的抗體識(shí)別沒有效果?；蚓幋a的氨基酸通常分為四組(1)酸性氨基酸＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性氨基酸＝賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性氨基酸＝丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；和(4)無電荷極性氨基酸＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸還同時(shí)被分類為芳族氨基酸。
因此，本文所使用的術(shù)語(yǔ)“非保守性氨基酸置換”是容易具有不同性質(zhì)、特別是對(duì)抗體識(shí)別可能具有不同性質(zhì)的那些。因此，非保守性氨基酸置換將引起不同的免疫反應(yīng)，例如，引起野生型來源多肽的抗體喪失識(shí)別力。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“致免疫(immunogenic)”是指突變BVD病毒或野生型BVD病毒在動(dòng)物中激發(fā)對(duì)I型和/或II型BVD病毒的免疫反應(yīng)的能力。免疫反應(yīng)可以是主要由細(xì)胞毒性T-細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)、或者主要由助手T-細(xì)胞(helper T-cells)介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)，其又激活B-細(xì)胞導(dǎo)致產(chǎn)生抗體。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“裸DNA”是指包括編碼本發(fā)明的藥劑的核苷酸序列以及用于控制其產(chǎn)生的短啟動(dòng)子區(qū)的質(zhì)粒。其被稱為“裸DNA”的原因在于質(zhì)粒沒有負(fù)載在任何遞送介質(zhì)上。當(dāng)這種DNA質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞如真核細(xì)胞時(shí)，其所編碼的蛋白在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“質(zhì)?！笔侵妇幋a可表達(dá)基因的任何核酸，包括線形或圓形核酸以及雙股核酸(double strand nucleic acid)或單股核酸。核酸可以是DNA或RNA，可以包括修飾核苷酸或核糖和核苷酸，并且可以通過例如甲基化或者加入保護(hù)基或帽結(jié)構(gòu)或尾結(jié)構(gòu)的方式來進(jìn)行化學(xué)修飾。
本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)“疫苗”是指預(yù)防感染或降低感染風(fēng)險(xiǎn)或改善感染癥狀的組合物。疫苗組合物對(duì)病原體的預(yù)防效果通常是通過在對(duì)象體內(nèi)誘發(fā)免疫反應(yīng)(細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和/或體液免疫反應(yīng))來實(shí)現(xiàn)的。通常來說，BVDV感染發(fā)生的消除或減少、癥狀的改善、或者加快從感染對(duì)象中清除病毒是疫苗組合物保護(hù)效果的指示。本發(fā)明的疫苗組合物提供了對(duì)BVD病毒引起的感染的保護(hù)效果。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“媒介物”是指允許或幫助核酸從一個(gè)環(huán)境轉(zhuǎn)移到另一個(gè)環(huán)境中的工具。根據(jù)本發(fā)明，例如，在重組DNA技術(shù)中使用的一些媒介物允許核酸如DNA片段(例如異源DNA片段，例如異源cDNA片段)轉(zhuǎn)移到宿主或靶細(xì)胞中以便復(fù)制核酸和/或由該核酸表達(dá)的蛋白。重組DNA技術(shù)中使用的媒介物的例子包括但不限于質(zhì)粒、染色體、人工染色體和病毒。

具體實(shí)施例方式 以下詳細(xì)說明用于幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。雖然如此，該詳細(xì)說明不應(yīng)被視為不適當(dāng)?shù)叵拗票景l(fā)明，因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的精神或范圍的情況下可以對(duì)本文所討論的實(shí)施方式加以修改和變化。
本文所引用的各參考文件的內(nèi)容，包括在這些主要參考文件中引用的參考文件的內(nèi)容，通過引用的方式并入本文。
標(biāo)準(zhǔn)程序可用于傳播和純化本發(fā)明可用的質(zhì)粒。用于傳播質(zhì)粒的優(yōu)選原核宿主細(xì)胞是E.coli GM2163細(xì)胞系，但是一些其它細(xì)胞型也可以使用。從質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄的RNA可以通過轉(zhuǎn)染而被引入能夠支持病毒生產(chǎn)的真核宿主細(xì)胞如MDBK細(xì)胞內(nèi)。病毒可以在這種宿主細(xì)胞生產(chǎn)，并且使用已知分離技術(shù)如蔗糖梯度離心而以高純形式從其中分離。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了其中包括一種或多種上述突變BVD病毒的致免疫組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及經(jīng)分離的(isolated)上述突變BVD病毒的基因核酸分子。本發(fā)明所使用的核酸分子包括RNA和DNA。
在該實(shí)施方式中，經(jīng)分離的BVD病毒基因核酸分子含有I型病毒的核酸序列，其中NS3域的至少一部分在解螺旋酶域突變。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了其中已經(jīng)加入上述BVD病毒的基因核酸序列的媒介物。這種媒介物可以被引入適用于生產(chǎn)大量基因核酸分子或適用于生產(chǎn)后裔突變BVD病毒的宿主細(xì)胞中。媒介物可以含有其它序列成分以促進(jìn)媒介物的傳播、分離和次克隆(subclone)；例如，允許在細(xì)菌和宿主細(xì)胞中傳播和選擇的可選擇標(biāo)記基因和復(fù)制起點(diǎn)。本發(fā)明的特別優(yōu)選的媒介物是p15aDI(參見圖5)。
本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式涉及其中已經(jīng)引入了本發(fā)明的突變BVD病毒的基因核酸分子的宿主細(xì)胞。本文所使用的“宿主細(xì)胞”包括用突變BVD病毒的基因核酸分子、包括通過合適的媒介物提供的基因核酸分子來轉(zhuǎn)化的任何原核細(xì)胞。本文所使用的“宿主細(xì)胞”還包括用突變BVD病毒感染或以其它方式攜帶突變BVD病毒的基因核酸分子的任何真核細(xì)胞。用于質(zhì)粒傳播的優(yōu)選原核宿主細(xì)胞是大腸桿菌GM2163細(xì)胞系，但是其它細(xì)胞型也可以使用。優(yōu)選的真核宿主細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞如MDBK細(xì)胞(ATCC CCL 22)。但是，其它培養(yǎng)細(xì)胞也可以使用。本發(fā)明還包括在這種宿主細(xì)胞中生產(chǎn)的任何后裔病毒。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，病毒可以在用于致免疫組合物中之前通過化學(xué)鈍化或在細(xì)胞培養(yǎng)中經(jīng)過連續(xù)傳代來減毒。減毒方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。
本發(fā)明的致免疫組合物還可以包括另外的活性成分如針對(duì)BVDV的其它致免疫組合物，例如，在共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)08/107,908、美國(guó)專利6,060,457、美國(guó)專利6,015,795、美國(guó)專利6,001,613和美國(guó)專利5,593,873中所述的那些，所有這些參考文件通過引用的方式以其整體并入本文。
而且，本發(fā)明的致免疫組合物可以包括一種或多種獸醫(yī)可接受的載體。本文所使用的“獸醫(yī)可接受的載體”包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣(coating)、輔劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑、殺細(xì)菌劑和殺真菌劑、等滲劑、吸收延緩劑、(adsorption delaying agents)等。稀釋劑可以包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、縮水甘油醇等。等滲劑可以包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖等。穩(wěn)定劑包括白蛋白等。輔劑包括但不限于RIBI輔劑系統(tǒng)(Ribi inc.)、明礬、氫氧化鋁凝膠、水包油乳液、油包水乳液(如Freund′s完全和不完全輔劑)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta Ga.)、SAF-M(Chiron，Emeryville Calif.)、

輔劑、皂草甘、Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，CambridgeMass.)、或其它皂草苷部分、單磷酸脂質(zhì)A、Avridine脂質(zhì)胺輔劑、得自大腸桿菌的熱不穩(wěn)定的腸毒素(重組或其它)、霍亂毒素或b胞壁酰二肽等。致免疫組合物還可以包括一種或多種其它免疫調(diào)節(jié)劑，例如白細(xì)胞間介素、干擾素或其它胞質(zhì)激素。
本發(fā)明的致免疫組合物可以根據(jù)給藥途徑來制成各種形式。例如，致免疫組合物可以制成適合注射用途的無菌水溶液或分散液形式，或者使用凍干技術(shù)制成凍干形式。凍干的致免疫組合物通常在4℃下保存，并且可以在有或沒有輔劑的情況下在穩(wěn)定溶液如鹽水和HEPES中重新構(gòu)建(reconsitute)。
本發(fā)明的致免疫組合物可以給予動(dòng)物對(duì)象以誘發(fā)對(duì)BVD病毒的免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式提供了通過對(duì)動(dòng)物對(duì)象給予有效量的上述本發(fā)明的致免疫組合物來刺激對(duì)BVD病毒的免疫反應(yīng)的方法。
根據(jù)本發(fā)明的方法，用于對(duì)動(dòng)物對(duì)象給藥的優(yōu)選致免疫組合物包括突變BVD病毒。將含有突變病毒(優(yōu)選通過化學(xué)鈍化或在培養(yǎng)中連續(xù)傳代來減毒)的致免疫組合物給予牛群，優(yōu)選通過腸胃外途徑，盡管其它給藥途徑也可使用，例如，經(jīng)口、經(jīng)鼻內(nèi)、肌內(nèi)、淋巴結(jié)內(nèi)、皮內(nèi)、腹內(nèi)、皮下、直腸或陰道給藥、或通過多種途徑的組合給藥。
免疫方案可以使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)來優(yōu)化?？梢詫?duì)動(dòng)物給予單一劑量，或者，可選的是，可以以2到10周的間隔對(duì)動(dòng)物接種兩次或更多次。在牛中誘發(fā)的免疫反應(yīng)的程度和性質(zhì)可以通過使用多種技術(shù)來評(píng)價(jià)。例如，可以從被接種的動(dòng)物收集血清，并且檢測(cè)BVD病毒的特異性抗體是否存在，例如，通過常規(guī)的病毒中和檢測(cè)方法。在淋巴組織中檢測(cè)反應(yīng)性CTL(responding CTL)可以通過例如T細(xì)胞增生的檢測(cè)方法來實(shí)現(xiàn)，后者是誘發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)的指示。相關(guān)技術(shù)在本領(lǐng)域中有詳細(xì)說明，例如Coligan等，Current Protocols in Immunology(免疫學(xué)的現(xiàn)行方案)，John Wiley & Sons Inc.(1994). 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及疫苗組合物。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的疫苗組合物包括有效量的一種或多種上述突變BVD病毒。純化的突變病毒可以直接用于疫苗組合物中，或者突變病毒可以通過化學(xué)鈍化或體外連續(xù)傳代來進(jìn)一步減毒。通常，疫苗在0.5到5毫升中含有約1×106到約1×108個(gè)病毒粒子、以及獸醫(yī)可接受的載體。有效提供保護(hù)效果的疫苗組合物中的病毒的精確量可以由獸醫(yī)領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。適用于疫苗組合物中的獸醫(yī)可接受的載體可以是上述任何一種載體。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的疫苗組合物包括突變病毒的氨基酸分子。編碼全部或部分BVD病毒基因組的DNA或RNA分子可以用于疫苗中。DNA或RNA分子可以以“裸”形式存在，或者可以與促進(jìn)細(xì)胞攝取的藥劑(如脂質(zhì)體或陽(yáng)離子脂質(zhì))一起給藥。典型的給藥途徑是肌內(nèi)注射約0.1到約5毫升疫苗。疫苗中的總多核苷酸通常應(yīng)當(dāng)是約0.1毫克/毫升到約5毫克/毫升。多核苷酸可以作為懸浮劑、溶液或乳液的一部分存在，但是通常優(yōu)選水性載體。使用核酸(DNA或mRNA)的疫苗和接種程序在本領(lǐng)域中已有詳細(xì)說明，例如美國(guó)專利5,703,055、美國(guó)專利5,580,859、美國(guó)專利5,589,466，上述參考文件全部通過引用并入本文。
本發(fā)明的疫苗組合物還可以包括另外的活性成分如BVDV的其它疫苗組合物，例如，如美國(guó)專利6,060,457、6,015,795、6,001,613和5,593,873中所述的那些。
疫苗接種可以通過一次接種或通過多次接種來進(jìn)行。如果需要，可以從被接種動(dòng)物收集血清并檢測(cè)是否存在BVD病毒的抗體。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，上述本發(fā)明的疫苗組合物用于治療BVDV感染。因此，本發(fā)明提供了通過對(duì)動(dòng)物給予治療有效量的本發(fā)明的突變BVD病毒來治療動(dòng)物對(duì)象中由BVD病毒引起的感染的方法。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定基因工程病毒(geneticallyengineered virus)是否需要在給藥之前減毒。本發(fā)明的突變病毒可以直接給予動(dòng)物對(duì)象而無需額外的減毒。治療有效的病毒量可以根據(jù)所使用的具體病毒、牛的狀況和/或感染程度而改變，并且可以由獸醫(yī)確定。
在本發(fā)明的實(shí)施中，本發(fā)明的疫苗組合物優(yōu)選通過腸胃外途徑給予牛，盡管其它給藥途徑也可以使用，例如，經(jīng)口、經(jīng)鼻內(nèi)、肌內(nèi)、淋巴結(jié)內(nèi)、皮內(nèi)、腹內(nèi)、皮下、經(jīng)直腸或經(jīng)陰道給藥、或通過多種途徑的組合給藥?？赡苄枰芳咏o藥，可以對(duì)用法用量進(jìn)行調(diào)整以提供最佳免疫。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了確定之前疫苗接種的減毒病毒是存在于動(dòng)物對(duì)象內(nèi)的BVD病毒的來源的方法。
本發(fā)明的突變BVD病毒與野生型BVD菌株在基因組成和所表達(dá)的蛋白中均可以區(qū)別。這種區(qū)別使得可以區(qū)分接種了疫苗的動(dòng)物和感染動(dòng)物，并且允許在聲稱爆發(fā)了與疫苗有關(guān)的事件時(shí)識(shí)別BVDV。例如，可以確定在某些實(shí)驗(yàn)室測(cè)試中被測(cè)試為陽(yáng)性的動(dòng)物是否攜帶毒性或致病性BVD病毒，或者僅攜帶先前通過疫苗接種而接種的本發(fā)明的突變BVD病毒。
可以采用多種檢測(cè)方法來進(jìn)行這種測(cè)定。例如，可以從測(cè)試為BVD陽(yáng)性的動(dòng)物對(duì)象中分離病毒，基于核酸的檢測(cè)方法可以用于確定是否存在突變BVD病毒基因，其是在之前的疫苗接種中使用的BVD病毒的指示?；诤怂岬臋z測(cè)方法包括南方墨點(diǎn)分析或北方墨點(diǎn)分析(Southern or Northern blot analysis)、PCR定序。或者，可以使用基于蛋白的檢測(cè)方法。在基于蛋白的檢測(cè)方法中，可以從測(cè)試為BVDV陽(yáng)性的動(dòng)物分離疑似感染的細(xì)胞或組織。可以從這些細(xì)胞或組織來制備細(xì)胞提取物，并使用病毒性蛋白的合適抗體來進(jìn)行西方墨點(diǎn)分析，該抗體可以清楚地識(shí)別是否存在之前所接種的突變病毒而不是識(shí)別是否存在野生型BVDV。
劑型和給藥 腸胃外給藥 本發(fā)明的化合物還可以直接給藥到血流、肌肉、或內(nèi)臟器官中。合適的腸胃外給藥方式包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、室內(nèi)(intraventricular)、尿道內(nèi)、胸內(nèi)、顱內(nèi)、肌內(nèi)和皮下等給藥途徑。合適的腸胃外給藥裝置包括針(包括微針)注射器、無針注射器和輸注技術(shù)。
腸胃外制劑通常是水溶液，其可以含有賦形劑如鹽、碳水化合物和緩沖劑(優(yōu)選pH為3到9)，但對(duì)于某些用途，它們可能更適合配制成無菌非水溶液、或者作為與合適的載體如無菌無熱原水聯(lián)合使用的干燥劑型。
在無菌條件下制備腸胃外制劑如通過凍干可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)制藥技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。
在制備腸胃外溶液中使用的式I的化合物的溶解度可以通過使用合適的配制技術(shù)來增加，如加入提高溶解度的藥劑。
腸胃外給藥制劑可以配制為立即釋放和/或改型釋放的。改型釋放制劑包括延遲釋放、持續(xù)釋放、脈沖釋放、控制釋放、定向釋放和按計(jì)劃釋放(programmed release)的。因此本發(fā)明的化合物可以配制為固體、半固體或觸變液體，以便作為提供活性化合物的改型釋放的植入型存儲(chǔ)器來給藥。這種制劑的例子包括涂藥支架和聚(dl-乳酸-共乙醇酸)(PGLA)微珠。
局部給藥 本發(fā)明的化合物還可以對(duì)皮膚或粘膜局部給藥，即，經(jīng)皮或經(jīng)粘膜。用于該目的的典型制劑包括凝膠、水凝膠、洗劑、溶液、乳膏、軟膏、撒布粉劑、敷料、泡沫、薄膜、皮膚貼劑、糯米紙(wafer)、植入體、海綿、顯微、繃帶和微乳液。也可以使用脂質(zhì)體。典型的載體包括醇、水、礦物油、液體石蠟、白石蠟、甘油、聚乙二醇和丙二醇?？梢约尤氪┩复龠M(jìn)劑——參見，例如，Transdermal PenetrationEnhancers.Applications，Limitations，and Potential(透皮滲透促進(jìn)劑應(yīng)用、限制和潛力)J.Pharm Sci，88(10)，955-958，by Finnin and Morgan(October 1999)。
其它局部給藥的方式包括通過電泳、離子電泳、光子電泳、聲波電泳、以及微針或無針(例如PowderjectTM、BiojectTM等)注射來遞送。
局部給藥制劑可以配制為立即釋放和/或改型釋放的。改型釋放制劑包括延遲釋放、持續(xù)釋放、脈沖釋放、控制釋放、定向釋放和按計(jì)劃釋放的。
吸入/鼻內(nèi)給藥 本發(fā)明的化合物還可以經(jīng)鼻內(nèi)或通過吸入給藥，通常是以干粉的形式(單獨(dú)、或作為混合物如與乳糖的干摻合物、或作為混合組分顆粒如與磷脂如磷脂酰膽堿混合)由干粉吸入器給藥；或者作為氣溶膠由壓力容器、泵、噴射器、霧化器(優(yōu)選使用電水動(dòng)力學(xué)的霧化器來產(chǎn)生細(xì)霧)、或噴霧器來給藥，其中使用或不使用合適的推進(jìn)劑如1，1，1，2-四氟乙烷或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷。對(duì)于鼻內(nèi)用途，粉末可以包括生物粘著劑如殼聚糖或環(huán)糊精。
壓力容器、泵、噴射器、霧化器或噴霧器含有本發(fā)明化合物的溶液或懸浮液，該溶液或懸浮液包括例如乙醇、含水乙醇、或適用于活性物的分散、增溶或延長(zhǎng)釋放的其它試劑、作為溶劑的推進(jìn)劑、以及任選的表面活性劑(如脫水山梨糖醇三油酸酯、油酸或寡乳酸)。
在用于配制干粉或懸浮劑之前，藥物產(chǎn)品被微粉化至適合通過吸入輸送給藥的尺寸(通常小于5微米)。這可以通過任何合適的粉化方法來實(shí)現(xiàn)，例如通過螺旋噴射研磨、流體床噴射研磨、超臨界流體加工以形成納米顆粒、高壓均化或噴干。
用于吸入器或吹入器的膠囊(例如由明膠或羥丙基甲基纖維素制成)、泡罩(blister)和卡筒可以配制為含有本發(fā)明的化合物、合適的粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉、以及改性劑(如l-亮氨酸、甘露醇或硬脂酸鎂)的混合物。乳糖可以是無水的，或者可以是一水合物形式，優(yōu)選后者。其它合適的賦形劑包括葡聚糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨糖醇、木糖醇、果糖、蔗糖和海藻糖。
在使用電水動(dòng)力學(xué)來產(chǎn)生細(xì)霧的霧化器中使用的合適溶液制劑的每次促動(dòng)(per actuation)可以含有1微克到20毫克本發(fā)明的化合物，且促動(dòng)體積可以為1微升到100微升。典型制劑可以包括式I的化合物、丙二醇、無菌水、乙醇和氯化鈉?？梢蕴娲际褂玫目蛇x溶劑包括甘油和乙二醇。
可以向那些計(jì)劃用于吸入/鼻內(nèi)給藥的本發(fā)明的制劑中加入合適的矯味劑如薄荷腦和左旋薄荷腦、以及甜味劑如糖精或糖精鈉。
用于吸入/鼻內(nèi)給藥的制劑可以配制為立即釋放和/或改型釋放的(使用，例如，PGLA)。改型釋放制劑包括延遲釋放、持續(xù)釋放、脈沖釋放、控制釋放、定向釋放和按計(jì)劃釋放的。
在干粉吸入器和氣溶膠的情況中，劑量單位由輸送計(jì)量量(metered amount)的閥的方式來確定。本發(fā)明的單位通常設(shè)為給予含有10納克到100微克的式I的化合物的一個(gè)計(jì)量量或“一噴”?？?cè)談┝客ǔ?微克到100毫克，其可以在單劑中給予，或者更通常地在一日內(nèi)分為多劑給予。
直腸/陰道內(nèi)給藥 本發(fā)明的化合物可以以例如栓劑、陰道環(huán)劑或灌腸劑的形式來經(jīng)直腸或經(jīng)陰道給藥。可可脂是傳統(tǒng)的栓劑基質(zhì)，但是可以根據(jù)需要使用各種替代產(chǎn)品。
用于直腸/陰道給藥的制劑可以配制為可以配制為立即釋放和/或改型釋放的。改型釋放制劑包括延遲釋放、持續(xù)釋放、脈沖釋放、控制釋放、定向釋放和按計(jì)劃釋放的。
眼部/耳部給藥 本發(fā)明的化合物還可以直接給藥到眼部或耳部，通常是以在調(diào)節(jié)了pH的等滲無菌鹽水中的微粉化懸浮液或溶液的滴劑的形式給予。適用于眼部和耳部給藥的其它制劑包括軟膏、可生物降解的植入體(例如，可吸收的凝膠海綿、膠原)和不能生物降解的植入體(如聚硅氧烷)、糯米紙、透鏡(lense)、以及顆?；蚺菽到y(tǒng)如納米微粒或脂質(zhì)體。聚合物如交聯(lián)聚丙烯酸、聚乙烯醇、透明質(zhì)酸、纖維素聚合物(如羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素或甲基纖維素)、或者雜多糖聚合物如結(jié)冷膠(gelan gum)可以與防腐劑如苯扎氯銨(benzalkonium chloride)一起加入。這種制劑也可以通過離子電泳來輸送。
用于眼部/耳部給藥的制劑可以配制為立即釋放和/或改型釋放(modified released)的。改型釋放制劑包括延遲釋放、持續(xù)釋放、脈沖釋放、控制釋放、定向釋放和按計(jì)劃釋放的。
組分試劑盒(KIT-OF-PARTS) 因?yàn)榭赡苄枰獙⒒钚曰衔锝M合給藥以便例如治療特定疾病或癥狀，本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括將兩種或更多種藥物組合物(其中至少一種含有根據(jù)本發(fā)明的疫苗)方便地以適于將多種組合物共同給藥的試劑盒的形式組合。
因此，本發(fā)明的試劑盒包括兩種或更多種單獨(dú)的藥物組合物(其中至少一種包括根據(jù)本發(fā)明的疫苗)、以及用于獨(dú)立地保存所述組合物的器件(例如，如容器、分隔瓶(divided bottle)或分隔式鋁箔包裝)。這種試劑盒的例子是注射器和注射針等。
本發(fā)明的試劑盒特別適用于給予不同劑型，例如，用于以不同給藥間隔來給予獨(dú)立的組合物的口服或腸胃外制劑、或者用于滴定彼此獨(dú)立的組合物。為幫助獸醫(yī)，試劑盒通常包括給藥指示。
本發(fā)明通過以下實(shí)施例進(jìn)一步說明，但是不表示受其限制。
實(shí)施例 實(shí)施例1.NS3域抗原決定部位的定位 使用抗原決定部位定位方法來識(shí)別NS3蛋白中由一組mAb辨識(shí)的特定抗原決定部位。該方法需要將各個(gè)試驗(yàn)片段進(jìn)行PCR放大，然后在體外轉(zhuǎn)譯截?cái)嗟鞍?truncated protein)，最后用各種mAb測(cè)試其反應(yīng)性。為了初步識(shí)別NS3上的抗原區(qū)，將表現(xiàn)該區(qū)域的一組7個(gè)DNA片段(圖1)放大。每個(gè)片段在其5’端包含T7啟動(dòng)子，然后是起始密碼子(initiation codon)，并在3’端包含終止密碼子。這些DNA片段用作模板以使用

兔網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物系統(tǒng)(Promega；Madison，WI)和放射性標(biāo)記的蛋氨酸和半胱氨酸通過體外轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯來產(chǎn)生S35-標(biāo)記的蛋白片段。得到的轉(zhuǎn)譯蛋白片段包括全長(zhǎng)NS3蛋白、解螺旋酶和蛋白酶、以及解螺旋酶的各個(gè)子域。(根據(jù)BVDV和HCV NS3蛋白的序列校準(zhǔn)來識(shí)別蛋白酶、解螺旋酶和解螺旋酶子域的邊界。)一組識(shí)別BVDVNS3的12個(gè)mAb，包括若干由診斷實(shí)驗(yàn)室使用以檢測(cè)牛的BVDV感染的mAb，用于將轉(zhuǎn)譯蛋白免疫沉淀。這些單克隆抗體在本領(lǐng)域是已知的并且如Deregt等，Mapping of two antigenic domains on the NS3protein of the pestivirus bovine viral diarrhea virus(瘟病毒牛腹瀉病毒的NS蛋白上兩個(gè)抗原域的定位)，Veterinary Microbiology(2005)，108(1-2)，13-22中的“previously prepared(先前制備)”部分所述。然后通過SDS-PAGE和熒光圖象攝影來分析免疫沉淀物。
免疫沉淀(immunoprecipitation)概述在表1中。所有12個(gè)mAb和多克隆血清(polyclonal serum)均識(shí)別全長(zhǎng)NS3和一個(gè)或多個(gè)解螺旋酶子域，同時(shí)都不識(shí)別蛋白酶片段。3個(gè)mAb(1.11.3、21.5.8和24.8)使全長(zhǎng)解螺旋酶和域1-域2(d1-d2)片段免疫沉淀，但不能使d2-d3片段免疫沉淀，顯示這些3抗體識(shí)別解螺旋酶蛋白的域1。mAb 21.5.8和24.8與d1片段結(jié)合，但mAb 1.11.3則否，顯示1.11.3抗體比21.5.8和24.8mAb對(duì)抗原決定部位構(gòu)造更敏感。mAb 2.32.5識(shí)別全長(zhǎng)解螺旋酶，并一定程度上識(shí)別d1-d2片段，但不識(shí)別d2-d3片段，顯示其也可以識(shí)別域1。d1-d2片段的弱結(jié)合可能暗示d1-d2片段和全長(zhǎng)解螺旋酶之間由2.32.5識(shí)別的抗原決定部位不同。mAb 4.11.4和16.1.5均與全長(zhǎng)NS3和解螺旋酶結(jié)合，但僅與d1-d2和d2-d3片段弱結(jié)合，顯示它們可能對(duì)解螺旋酶第二域中的抗原決定部位具有特異性。4個(gè)mAb 5.2.1、9.10.4、12.7.3和15.14.6識(shí)別全長(zhǎng)NS3和解螺旋酶。它們還與d2-d3片段弱結(jié)合，但是不與d1-d2片段結(jié)合，顯示它們識(shí)別域3中的抗原決定部位。它們均不與單個(gè)d3片段結(jié)合，顯示在沒有其它子域的情況下可能不會(huì)發(fā)生d3的正確折疊。mAb 19.7.6與NS3和全長(zhǎng)解螺旋酶結(jié)合，但是不與任何其它片段結(jié)合。該抗體的識(shí)別可能需要存在未擾動(dòng)的解螺旋酶蛋白。mAb 20.10.6與NS3、全長(zhǎng)解螺旋酶、以及d1-d2和d2-d3片段非常好地結(jié)合。其還識(shí)別單個(gè)d2片段，顯示該抗體所識(shí)別的域2中的抗原決定部位不受缺少域1和3的影響。12個(gè)mAb均不與全長(zhǎng)蛋白酶結(jié)合，這并不令人驚訝，因?yàn)樯踔羴碜愿腥玖薆VDV的牛的多血清(POLY)在我們的試驗(yàn)中也不識(shí)別蛋白蛋白酶，這明顯表示蛋白酶的抗原性不高。這與HCV中的蛋白酶、解螺旋酶和NS4A(蛋白酶輔助因子)蛋白的取向是一致的，在HCV中蛋白酶在解螺旋酶和NS4A蛋白之間的取向使其極少留下容易與抗體結(jié)合的表面結(jié)構(gòu)。根據(jù)這些結(jié)果，域1是引入得到經(jīng)標(biāo)記的病毒的突變的示例性目標(biāo)。
表1.NS3子域的免疫沉淀
實(shí)施例2.BVDV和HCV解螺旋酶的序列校準(zhǔn) 為了基于BVDV解螺旋酶域1中的突變來產(chǎn)生經(jīng)標(biāo)記的病毒，需要進(jìn)一步精制(refinement)該域中的抗原決定部位。希望去除免疫主導(dǎo)的(immunodominant)抗原決定部位，而不會(huì)明顯改變解螺旋酶的功能。為了幫助識(shí)別待突變的候選抗原決定部位，BVDV解螺旋酶的分子模型非常有用。由于HCV解螺旋酶的分子模型是已知的，其可以用作建模(modeling)的樣板。對(duì)BVDV和HCV解螺旋酶的域1的氨基酸序列進(jìn)行校準(zhǔn)，以開始產(chǎn)生域1的分子模型的過程。它們之間的主要序列相同性(primary sequence identity)為約34％。為說明BVDV解螺旋酶域1的次級(jí)結(jié)構(gòu)，使用來自Genetic Computer Group軟件包(University ofWisconsin；Madison，WI)的Pileup程序，并使用NADL BVDV菌株作為原型序列，來校準(zhǔn)衍生自各種BVDV分離株和其它瘟病毒的47個(gè)NS3序列。由所校準(zhǔn)的序列，產(chǎn)生多重序列檔案(multiple sequence file，MSF)，并將其提交到JPred服務(wù)器(Cuff等，Bioinformatics，14892-893(1998))，以便使用PHD預(yù)測(cè)方法來進(jìn)行次級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(Rost and Sander，J.Mol.Biol.23513-26(1993)。Silicon Graphics Indigo2 Impact 10000工作站(Silicon Graphics；Mountain View，CA)用于所有分子建模研究。Molecular Operating Environment(MOE)2001.01版(ChemicalComputing Group，Inc.；Montreal，Quebec)和SYBYL 6.7軟件(TriposAssociates Inc.；St.Louis，MO)用于分子建模和可視化(visualizations)。來自HCV(SEQ ID NO.21)和BVDV(SEQ ID NO.20)NS3蛋白的域1和域2的氨基酸序列是根據(jù)初級(jí)序列(primary sequence)同源性和次級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)來校準(zhǔn)的(圖2)。然后使用HCV蛋白的相應(yīng)區(qū)域作為樣板來產(chǎn)生BVDV NS3的域1和域2的初步分子模型。如圖3所示，在α-螺旋和β-股之間存在若干環(huán)和回轉(zhuǎn)(turn)，包括α1-β2(IGR環(huán))、α2-β3(KHP)、β4-β5(DMA)和α3-β7(SES)，導(dǎo)致形成遠(yuǎn)離解螺旋酶催化中心和解螺旋酶-蛋白酶交互表面的暴露表面。該區(qū)域可能成為高抗原性區(qū)。選擇所識(shí)別的三個(gè)環(huán)KHP環(huán)、IGP環(huán)和SES環(huán)作為致突變(mutagenesis)研究的目標(biāo)。
實(shí)施例3通過掃描突變發(fā)生來定位mAb結(jié)合位點(diǎn) 為進(jìn)一步確定域1中與多個(gè)mAb結(jié)合的抗原決定部位，采用掃描突變發(fā)生的方法。簡(jiǎn)要的說，使用PCR放大，將BVDV解螺旋酶域1序列的短片段(SEQ ID NO.20)用相應(yīng)的HCV序列(SEQ ID NO 21)置換，然后對(duì)得到的片段用限制性內(nèi)切酶消化和接合，得到圖4所示的“掃描突變體”。如實(shí)施例1中所述進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯、以及免疫沉淀。各種mAb與突變體的反應(yīng)性的概述如表2所示。
Table 2.掃描突變體與mAb的反應(yīng)性 實(shí)施例4.通過丙氨酸置換突變發(fā)生來詳細(xì)分析mAb結(jié)合位點(diǎn) 為進(jìn)一步確定域1中與多個(gè)mAb結(jié)合的抗原決定部位，并識(shí)別這些區(qū)域中用于抗體結(jié)合的關(guān)鍵殘基，在三個(gè)區(qū)域I1841-R1846、K1867-S1872和S1938-I1941中共產(chǎn)生16個(gè)單個(gè)氨基酸(丙氨酸)置換突變，并測(cè)試其抗體結(jié)合。氨基酸殘基的坐標(biāo)是根據(jù)SEQ ID NO.1。因此，“I1841A”表示在SEQ ID NO.1中編號(hào)為1841的坐標(biāo)處用丙氨酸置換異亮氨酸。當(dāng)然，在其它BVDV分離株中，不同的特定氨基酸可以存在于示例性序列的特定坐標(biāo)處。因此，在變異BVD病毒或構(gòu)造以表達(dá)變異BVD病毒的質(zhì)粒的解螺旋酶域的相同位置處的突變將導(dǎo)致變異的未修飾病毒多肽的抗體的識(shí)別力的同等喪失。使用本領(lǐng)域已知的PCR重疊延長(zhǎng)技術(shù)(PCR overlap extension technique)來構(gòu)造置換突變體(參見，例如，Ho等，Gene，77(1)51-9(1989))。簡(jiǎn)言之，PCR用于產(chǎn)生各自編碼解螺旋酶的域1和域2的丙氨酸置換片段。每個(gè)片段在其5’端編碼T7啟動(dòng)子序列和轉(zhuǎn)譯起始密碼子，并在3’端編碼終止密碼子。最初，進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)以產(chǎn)生編碼置換區(qū)域的5’半部和3’半部的重疊片段。在重疊區(qū)，通過在PCR中使用的致突變寡核苷酸引物來將單個(gè)氨基酸突變引入兩個(gè)片段的序列中。通過在瓊脂糖凝膠中電泳來分離每個(gè)PCR的產(chǎn)物，從每個(gè)反應(yīng)中純化具有正確尺寸的單個(gè)譜帶。將純化的DNA片段混合并用作第二PCR的樣板，以產(chǎn)生單一的置換片段。重復(fù)該全過程以產(chǎn)生每一種所需置換片段。各片段的序列通過DNA測(cè)序來證實(shí)。使用這些片段作為樣板，通過如上所述的體外轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯來產(chǎn)生S35-標(biāo)記的蛋白片段。使用mAb來進(jìn)行免疫沉淀，然后進(jìn)行SDS-PAGE分析，這用于確定突變的抗原決定部位是否仍然能被抗體識(shí)別。
E1939A和R1942A完全破壞了與mAb 1.11.3的結(jié)合，顯示這兩個(gè)殘基對(duì)于抗體結(jié)合非常關(guān)鍵。這兩種氨基酸位于同一個(gè)α3-β7(SES)環(huán)上(圖3)，顯示被該抗體識(shí)別的抗原決定部位通過該環(huán)形成。位于解螺旋酶分子的兩個(gè)獨(dú)立區(qū)域(α1-β2(IGR)和α2-β3(KHP)環(huán))上的兩個(gè)其它突變I1841A和K1867A，顯示與mAb 21.5.8的結(jié)合顯著降低，而其它抗體則否?？梢杂蛇@些結(jié)果得到的一個(gè)結(jié)論是該mAb所識(shí)別的抗原決定部位可能包括在天然分子中位置緊密相鄰的兩個(gè)不同的環(huán)。這與圖3所示的分子模型相符。突變R1843A破壞了與mAb 24.8的結(jié)合，但對(duì)與其它抗體的結(jié)合沒有效果。同樣，這顯示了該殘基是位于α1-β2(IGR)環(huán)上的關(guān)鍵抗原決定部位的一部分。R1942A突變對(duì)于與mAb 24.8的結(jié)合的部分效果顯示，α3-β7(SES)環(huán)與α1-β2(IGR)環(huán)一起構(gòu)成被該抗體識(shí)別的抗原決定部位?？偠灾?，在BVDV解螺旋酶的域1中準(zhǔn)確地定位了三個(gè)mAb識(shí)別的抗原決定部位。識(shí)別了那些抗原決定部分中的關(guān)鍵殘基，其位于初級(jí)序列地三個(gè)獨(dú)立區(qū)域中，但在三級(jí)構(gòu)造中緊密相鄰。這些抗原決定部位的功能在BVDV亞病毒復(fù)制子的部分進(jìn)一步檢驗(yàn)。
表3.丙氨酸置換突變體的免疫沉淀
實(shí)施例5.亞病毒BVDV復(fù)制子方面的解螺旋酶域1突變的構(gòu)造亞病毒復(fù)制子的結(jié)構(gòu) 制造成功的病毒疫苗的所需品質(zhì)是獲得高效價(jià)病毒收率的能力。因此，標(biāo)記突變(marker mutation)不應(yīng)顯著干擾病毒復(fù)制。由于解螺旋酶活性對(duì)于BVDV RNA的復(fù)制是必要的，我們不僅需要評(píng)估所制造的全部域1點(diǎn)突變體的抗體識(shí)別力喪失，還需要評(píng)估其解螺旋酶催化活性的保留。全長(zhǎng)BVDV前病毒分子克隆(molecular clone)在大腸桿菌(E.coli)中的復(fù)制和基因操作是困難的，因?yàn)橘|(zhì)粒在增殖過程中是不穩(wěn)定的。因此，構(gòu)建p15aDI以幫助對(duì)突變體的篩選，該p15aDI含有表達(dá)NS3并支持病毒RNA復(fù)制的截?cái)?truncated)亞病毒復(fù)制子，但是缺少病毒結(jié)構(gòu)基因。p15aDI來源于含有全長(zhǎng)BVDV基因的傳染性前病毒親代質(zhì)粒(pNADLp15a)。其更具可操作性，因?yàn)槠淙狈Υ蠖鄶?shù)結(jié)構(gòu)基因和NS2編碼區(qū)，位于NS3上游的唯一序列由部分N蛋白與與牛泛素(ubiquitin)之間的融合構(gòu)成(圖5)。只有當(dāng)有效RNA復(fù)制導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄放大、由此引起病毒蛋白表達(dá)提高時(shí)，才可以通過免疫組織化學(xué)來檢測(cè)由該復(fù)制子表達(dá)的NS3蛋白。因此，NS3的檢測(cè)可以用作有效RNA復(fù)制和解螺旋酶催化活性的間接證明。
BVDV解螺旋酶域1突變的產(chǎn)生 在亞病毒復(fù)制子方面產(chǎn)生一組12個(gè)不同的解螺旋酶域1突變，并且分析病毒RNA復(fù)制和抗原決定部位識(shí)別喪失。這些突變中的8個(gè)僅含有一個(gè)氨基酸改變，包括IGR環(huán)中，I＞A(氨基酸殘基1841)，R＞A(1843)和K＞A(1845)；KHP環(huán)中，K＞A(1867)，H＞A(1868)和P＞A(1869)；SES環(huán)中，E＞A(1939)和R＞A(1942)。2個(gè)突變體含有兩個(gè)氨基酸改變，包括IGR環(huán)中，R＞A(1843)和K＞A(1845)；以及SES環(huán)中，E＞A(1939)和R＞A(1942)。2個(gè)突變體含有三個(gè)氨基酸改變K＞A(1867)，H＞A(1868)和P＞A(1869)，均在IGR環(huán)中；以及K＞A(1845)，H＞A(1868)和E＞A(1939)，影響多個(gè)環(huán)。盡管為方便起見在示例性突變中使用丙氨酸，但非保守性氨基酸置換可以用作合適的突變。每個(gè)突變體均使用上述的重疊PCR策略產(chǎn)生。為每個(gè)所需突變?cè)O(shè)計(jì)一組特定的重疊引物(表4)。為篩選目的，每個(gè)引物組還含有額外的沉默核苷酸變化(silentnucleotide change)，其將導(dǎo)致在突變位點(diǎn)附近產(chǎn)生獨(dú)特的新限制性內(nèi)切酶裂解位點(diǎn)。重疊PCR片段用作第二輪放大的樣板，并且僅使用兩個(gè)外側(cè)引物(outside primer)來進(jìn)行。為產(chǎn)生含有多個(gè)氨基酸變化的片段，使用先前的突變片段作為樣板，重復(fù)放大反應(yīng)。然后，通過在PCR過程中產(chǎn)生的兩個(gè)獨(dú)特的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(Bsm B I and Sma I)來將完全突變片段克隆到亞病毒復(fù)制子骨架中。突變的PCR片段和亞病毒復(fù)制子骨架均用Bsm B I和Sma I消化，用堿性磷酸酶(NEB，Inc.)處理，用瓊脂糖凝膠電泳來純化，并使用T4DNA接合酶(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)在16℃接合(ligate)過夜。用接合反應(yīng)等分試樣(aliquotof lighted reaction)將STBL2大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen；Carlsbad，CA)轉(zhuǎn)化并接種于選擇性培養(yǎng)基上。通過質(zhì)粒DNA純化、然后用限制性內(nèi)切酶消化來篩選菌落。通過序列分析來進(jìn)一步確定具有所需尺寸的質(zhì)粒。
表4 實(shí)施例6.突變亞病毒復(fù)制子的表征 體外轉(zhuǎn)錄和RNA轉(zhuǎn)染 使用T7RNA聚合酶和MEGAscriptTM(Ambion；Austin，TX)，在體外合成轉(zhuǎn)錄體。DNA樣板用Ksp I線性化，并且用T4DNA聚合酶處理以除去3’外懸部分。在轉(zhuǎn)染之前，通過瓊脂糖凝膠電泳來分析轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的產(chǎn)物。將1-5微克RNA加入到含有6微克Lipofectin(Invitrogen)的200微升Opti-MEM(Invitrogen)中，并且在室溫培養(yǎng)10到15分鐘。同時(shí)，在六孔板(直徑為35毫米)中生長(zhǎng)的Madin Darby牛腎(MDBK)細(xì)胞單層(50到60％融合)用不含RN酶(RNase-free)的PBS洗滌兩次，并用Opti-MEM洗滌一次。在最終洗滌之后，將轉(zhuǎn)染混合物加入到每個(gè)孔中，然后在室溫在輕輕搖動(dòng)下培育10分鐘。然后，向每個(gè)孔中加入1毫升Opti-MEM，并且將板在37℃繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。然后，向每個(gè)孔中加入含有2-3％牛供體小牛血清的3毫升Opti-MEM。
RNA復(fù)制和抗體識(shí)別的分析 在37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)后，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞用80％并同固定，并根據(jù)生產(chǎn)商的指示，使用Vectastain Elite ABC試劑盒(Vector Laboratories；Burlingame，CA)來進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析(IHC)。識(shí)別解螺旋酶域2的單克隆抗體20.10.6用于使NS3陽(yáng)性的細(xì)胞可視化，作為有效RNA復(fù)制的指示劑。用野生型BVDV RNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以及多種突變體復(fù)制子顯示可用mAb 20.10.6強(qiáng)力染色，顯示各突變病毒解螺旋酶支持有效的vRNA復(fù)制。只有突變K1867A/H1868A/P1869A不能產(chǎn)生可檢測(cè)的NS3蛋白，顯示這組突變顯著干擾病毒RNA的復(fù)制。
用野生型或突變復(fù)制子轉(zhuǎn)染的所有細(xì)胞也都使用mAb 1.11.3、21.5.8和24.8來測(cè)試(表5)。各個(gè)環(huán)顯示被這三種抗體之一所識(shí)別，因?yàn)槊總€(gè)環(huán)中的突變均導(dǎo)致三種抗體之一的識(shí)別力喪失。特別是，IGR環(huán)中的殘基突變R1843A和/或K1845A導(dǎo)致mAb 24.8識(shí)別的完全喪失。同時(shí)，未影響mAb 20.10.6、1.11.3和21.5.8的識(shí)別。在KHP環(huán)中，突變K1867A消除了mAb 21.5.8的識(shí)別，而不會(huì)影響被其它三種抗體的識(shí)別。同樣，在SES環(huán)中的兩個(gè)點(diǎn)突變導(dǎo)致mAb 1.11.3識(shí)別的喪失，如同雙重突變體一樣。此外，三重突變體(K1845A/H1868A/E1939A)導(dǎo)致被1.11.3和24.8mAb識(shí)別的喪失，而不會(huì)影響mAb 20.10.6和21.5.8的抗體識(shí)別。
總之，識(shí)別了導(dǎo)致消除mAb識(shí)別和結(jié)合的三個(gè)解螺旋酶環(huán)中的若干突變。此外，發(fā)現(xiàn)可以同時(shí)破壞兩種抗體的識(shí)別位點(diǎn)，而仍然保持解螺旋酶功能。因此，這些獨(dú)立的突變體中的每個(gè)或它們的結(jié)合能夠用作包括解螺旋酶區(qū)域突變的經(jīng)標(biāo)記的BVDV疫苗。
表5.mAb與解螺旋酶突變體的免疫反應(yīng)活性
實(shí)施例7.經(jīng)標(biāo)記的病毒的產(chǎn)生和分析 為評(píng)價(jià)所關(guān)注的NS3蛋白中突變對(duì)病毒復(fù)制和傳染性的效果，必須將突變移動(dòng)到含有全長(zhǎng)BVDV序列的前病毒引物(pNADLp15A)中。選擇用于進(jìn)一步研究的三個(gè)突變序列是K1845A-H1868A-E1939A、R1942A和E1939A。含有所關(guān)注的每個(gè)單獨(dú)的變異序列的DNA片段被克隆到pNADLp15A中，再利用獨(dú)特的Bsm BI和Sma I限制性內(nèi)切位點(diǎn)。接合混合物轉(zhuǎn)移到大腸桿菌GM2163細(xì)胞(New England Biolabs，Inc.；Beverly，MA)中，然后接種到選擇性培養(yǎng)基商。培養(yǎng)過夜后，篩選存在含有正確序列的質(zhì)粒的菌落。選擇表示每個(gè)突變的一個(gè)克隆體(R1942A、E1939A和K-H-E)，并且如實(shí)施例6中所述地從這些克隆體來制備病毒RNA。MDBK細(xì)胞用每個(gè)RNA制劑轉(zhuǎn)染，并在37℃培養(yǎng)64小時(shí)。為各突變體建立RD細(xì)胞(ATCC；Rockville，MD)的重復(fù)轉(zhuǎn)染。如實(shí)施例6所述地固定一組轉(zhuǎn)染細(xì)胞以進(jìn)行IHC染色，并且從第二組中，從接種瓶(seeded flask)中刮取細(xì)胞，并在-80℃存儲(chǔ)以用于未來增殖的原料。
為進(jìn)一步評(píng)價(jià)由這些克隆體生產(chǎn)的病毒，將從轉(zhuǎn)染試驗(yàn)收獲的培養(yǎng)液通到新鮮的RD細(xì)胞單層上。在吸附和培養(yǎng)過夜后，固定細(xì)胞以進(jìn)行IHC分析。分析結(jié)果在表6中顯示。野生型和突變病毒均被mAb20.10.6(對(duì)照抗體)所識(shí)別。野生型病毒也被mAb 1.11.3和24.8所識(shí)別。突變體E1939A與mAb 24.8結(jié)合，但是不與1.11.3結(jié)合。突變體K-H-E僅被mAb 20.10.6識(shí)別，且不被1.11.3或24.8識(shí)別。突變體R1942A驗(yàn)證了與mAb 24.8的反應(yīng)性，但是與1.11.3則沒有。
表6.用經(jīng)標(biāo)記的病毒感染的細(xì)胞的IHC分析
還評(píng)價(jià)每種經(jīng)標(biāo)記的病毒的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。使用標(biāo)準(zhǔn)病毒滴定方案來預(yù)先確定各種原料病毒的效價(jià)。在時(shí)間過程研究中，將新鮮的RD細(xì)胞單層接種在組織培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)過夜，并在第二天用預(yù)定量的各種病毒感染。在吸附和洗滌后，收集初始組樣品，(第“0”小時(shí))。隨后，在感染后第14、19、24、39、43、47和65小時(shí)收集樣品。使用Spearman-Karber法(Hawkes，R.A.In E.H.Lennette(ed.)，DiagnosticProcedures for Viral，Rickettsial and Chlamydial Infections(病毒、里克次氏體屬微生物和衣滴蟲感染的診斷程序)，p.33-35；第七版.AmericanPublic Health Association Publications，Washington，D.C.)來確定病毒效價(jià)，并且以TCID50/毫升表示。與野生型(親代)BVD病毒相比，所有突變體以類似于、或者在某些情況中稍好于野生型的速度生長(zhǎng)(表7)。
表7.野生型和突變BVD病毒的效價(jià)(TCID50/毫升)比較
當(dāng)通過一組單克隆抗體來測(cè)定時(shí)，某些產(chǎn)生的突變導(dǎo)致特定免疫特征明顯(immunologically distinct)的抗原決定部位改變。當(dāng)在傳染性病毒顆粒方面分析抗體識(shí)別時(shí)，得到類似結(jié)果。含有不會(huì)干擾傳染性病毒的產(chǎn)生的突變的克隆體仍將導(dǎo)致mAb的識(shí)別的喪失，表示可用作有效的經(jīng)標(biāo)記的BVDV疫苗菌株的新菌株。
實(shí)施例8.在幼齡小牛模型中檢測(cè)的疫苗效力 得到BVDV陰性的健康小牛，隨機(jī)分為多個(gè)研究組，并且保持在臨床獸醫(yī)師的監(jiān)督之下。將測(cè)試疫苗與無菌輔料結(jié)合，并且通過肌內(nèi)(IM)或皮下(SC)注射來給藥。相距21到28天來給予兩劑疫苗。然后在最后一次疫苗接種1型或2型BVDV菌株之后21到28天來激發(fā)(challenge)動(dòng)物。激發(fā)接種體以分為每鼻孔2毫升的4毫升劑量經(jīng)鼻內(nèi)給予。對(duì)照組由未接種、未激發(fā)動(dòng)物和/或未接種、激發(fā)動(dòng)物組成，其也在整個(gè)研究過程中保持。
每日監(jiān)控臨床參數(shù)，包括直腸溫度、憂郁、厭食和腹瀉。使用與1型或2型BVDV菌株組合的一系列血清稀釋液來通過牛細(xì)胞培養(yǎng)中的恒定病毒、血清降低檢測(cè)試驗(yàn)來測(cè)定血清中和效價(jià)。嘗試由周圍血液來進(jìn)行牛細(xì)胞培養(yǎng)中的BVDV的激發(fā)后分離。通過間接免疫熒光分析來測(cè)定BVDV陽(yáng)性細(xì)胞培養(yǎng)。為了驗(yàn)證激發(fā)后的保護(hù)，必須證實(shí)接種疫苗的組中的感染比對(duì)照組中的感染降低。
實(shí)施例9.孕母牛-小牛模型中的疫苗效力試驗(yàn) 得到BVDV陰性的育齡母牛和育齡小母牛，隨機(jī)分為疫苗接種試驗(yàn)組和安慰劑(對(duì)照)組。相隔21到28天，通過肌內(nèi)(IM)或皮下(SC)注射來對(duì)母牛接種疫苗或安慰劑兩次。第二次接種后，所有母牛接受IM前列腺素注射來使其同步發(fā)情。顯示發(fā)情的母牛使用合格的BVDV陰性精液來人工受精育種。懷孕約60天后，通過直腸觸診來測(cè)定母牛的懷孕狀態(tài)。約6周后，從各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選出已證實(shí)懷孕的母牛。通過鼻內(nèi)接種BVDV 1型或2型來激發(fā)每頭母牛。在激發(fā)日及激發(fā)后多個(gè)時(shí)間間隔收集血樣，以進(jìn)行BVDV分離。
激發(fā)后28天，進(jìn)行左側(cè)剖腹手術(shù)，由各母牛中抽取羊水。就在手術(shù)之前，從各母牛收集血樣以進(jìn)行血清中和試驗(yàn)。剖腹分娩之后，由各胎牛收集血樣。然后對(duì)胎牛實(shí)施無痛致死術(shù)，以無菌方式收集組織以分離BVDV。在發(fā)生自然流產(chǎn)時(shí)，在檢得流產(chǎn)及兩周后由母牛收集血樣。將對(duì)應(yīng)得血樣和流產(chǎn)胎牛進(jìn)行血清學(xué)檢驗(yàn)和病毒分離。通過不存在胎牛感染和后期流產(chǎn)來證實(shí)疫苗效力。
實(shí)施例10.經(jīng)標(biāo)記的疫苗得診斷檢測(cè) 根據(jù)指示，用活減毒BVDV疫苗或鈍化的NS3-突變(經(jīng)標(biāo)記)的BVDV疫苗來接種各年齡的牛。在接種疫苗后2-3周或更晚收集血樣。為了區(qū)分接受經(jīng)標(biāo)記的BVDV疫苗的牛和被BVDV田間(野生型)菌株感染的牛，可以通過差異診斷檢測(cè)來測(cè)試血樣。具有抗原決定部位特異性氨基酸突變的NS3蛋白當(dāng)以經(jīng)標(biāo)記的疫苗形式呈現(xiàn)在牛群中時(shí)，可以引起產(chǎn)生與NS3蛋白的突變的抗原決定部位結(jié)合、但不與野生型病毒上存在的未突變抗原決定部位結(jié)合的特異性抗體的生產(chǎn)。在野生型病毒方面，相反敘述為真，即特異性抗體可以識(shí)別NS3蛋白上的野生型抗原決定部位，但不能識(shí)別突變形式。檢測(cè)抗體結(jié)合特異性和親和力的方法在本領(lǐng)域中是公知的，包括但不限于免疫檢測(cè)分析如ELISA、競(jìng)爭(zhēng)性免疫檢測(cè)分析、放射性免疫檢測(cè)分析、西方墨點(diǎn)、間接免疫熒光檢測(cè)分析等。
競(jìng)爭(zhēng)性ELISA可以是間接或直接檢測(cè)方法。直接競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)方法的一個(gè)例子如本文所述。所有或部分野生型病毒抗原，包括NS3蛋白(天然或合成來源的)可以用作抗原源。在堿性條件下用抗原涂布ELISA板之后，將牛血清樣品和稀釋劑與抗原決定部位mAb的最佳稀釋劑一起加入，并培養(yǎng)30-90分鐘。將山葵過氧化酶或堿性磷酸酶與mAb結(jié)合，以允許進(jìn)行結(jié)合的比色分析。洗滌培養(yǎng)板之后，加入對(duì)酶具有特異性的發(fā)色基質(zhì)，在最終培養(yǎng)步驟后，在適合所用基質(zhì)的波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的光密度。根據(jù)牛血清與涂布培養(yǎng)板的NS3蛋白的反應(yīng)性水平，可以抑制標(biāo)識(shí)mAb的結(jié)合。不與mAb結(jié)合表示在識(shí)別野生型特異性抗原決定部位的牛血清中存在抗體，其是自然感染(野生型)干擾的指示。相反，用具有抗原決定部位特異性突變的經(jīng)標(biāo)記疫苗來免疫的牛血清將不含與涂布培養(yǎng)板的NS3蛋白結(jié)合的抗體。因此，mAb將與NS3蛋白結(jié)合，并且導(dǎo)致隨后的發(fā)色。
本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮上述公開內(nèi)容后能夠得到多種變化。例如，其它BVDV病原性菌株可以以類似于本文所揭示的方式通過NADL菌株在NS3解螺旋酶域中突變。盡管本文的示例性突變使用了丙氨酸，但是其它非保守性氨基酸置換或其它導(dǎo)致保留復(fù)制但喪失對(duì)野生型NS3的抗體的識(shí)別力的其它突變也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些例子僅僅是示例性的。
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Leu Lys Pro Gly Pro Leu Phe Tyr Gln Asp Tyr Lys Gly Pro Val Tyr
1 5 10 15
His Arg Ala Pro Leu Glu Leu Phe Glu Glu Gly Ser Met Cys Glu Thr
20 25 30
Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu Tyr His
35 40 45
Ile Tyr Val Cys Ile Asp Gly Cys Ile Ile Ile Lys Ser Ala Thr Arg
50 55 60
Ser Tyr Gln Arg Val Phe Arg Trp Val His Asn Arg Leu Asp Cys Pro
65 70 75 80
Leu Trp Val Thr Thr Cys Ser Asp Thr Lys Glu Glu Gly Ala Thr Lys
85 90 95
Lys Lys Thr Gln Lys Pro Asp Arg Leu Glu Arg Gly Lys Met Lys Ile
100 105 110
Val Pro Lys Glu Ser Glu Lys Asp Ser Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala
115 120 125
Thr Ile Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gln Val Arg Lys Lys Gly Lys
130 135 140
Thr Lys Ser Lys Asn Thr Gln Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys
145 150 155 160
Pro Gln Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala
165 170 175
Ile Ile Ala Ile Val Leu Phe Gln Val Thr Met Gly Glu Asn Ile Thr
180 185 190
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Gln Trp Asn Leu Gln Asp Asn Gly Thr Glu Gly Ile Gln Arg Ala Met
195 200 205
Phe Gln Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Trp Pro Glu Lys
210 215 220
Ile Cys Thr Gly Val Pro Ser His Leu Ala Thr Asp Ile Glu Leu Lys
225 230 235 240
Thr Ile His Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Lys Thr Asn Tyr Thr Cys
245 250 255
Cys Arg Leu Gln Arg His Glu Trp Asn Lys His Gly Trp Cys Asn Trp
260 265 270
Tyr Asn Ile Glu Pro Trp Ile Leu Val Met Asn Arg Thr Gln Ala Asn
275 280 285
Leu Thr Glu Gly Gln Pro Pro Arg Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr
290 295 300
Asp Arg Ala Ser Asp Leu Asn Val Val Thr Gln Ala Arg Asp Ser Pro
305 310 315 320
Thr Pro Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly
325 330 335
Ile Leu Met Arg Gly Pro Cys Asn Phe Glu Ile Ala Ala Ser Asp Val
340 345 350
Leu Phe Lys Glu His Glu Arg Ile Ser Met Phe Gln Asp Thr Thr Leu
355 360 365
Tyr Leu Val Asp Gly Leu Thr Asn Ser Leu Glu Gly Ala Arg Gln Gly
370 375 380
Thr Ala Lys Leu Thr Thr Trp Leu Gly Lys Gln Leu Gly Ile Leu Gly
385 390 395 400
Lys Lys Leu Glu Asn Lys Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Ala
405 410 415
Ser Pro Tyr Cys Asp Val Asp Arg Lys Ile Gly Tyr Ile Trp Tyr Thr
420 425 430
Lys Asn Cys Thr Pro Ala Cys Leu Pro Lys Asn Thr Lys Ile Val Gly
435 440 445
Pro Gly Lys Phe Gly Thr Asn Ala Glu Asp Gly Lys Ile Leu His Glu
450 455 460
Met Gly Gly His Leu Ser Glu Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Val Leu
465 470 475 480
Ser Asp Phe Ala Pro Glu Thr Ala Ser Val Met Tyr Leu Ile Leu His
485 490 495
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Phe Ser Ile Pro Gln Ser His Val Asp Val Met Asp Cys Asp Lys Thr
500 505 510
Gln Leu Asn Leu Thr Val Glu Leu Thr Thr Ala Glu Val Ile Pro Gly
515 520 525
Ser Val Trp Asn Leu Gly Lys Tyr Val Cys Ile Arg Pro Asn Trp Trp
530 535 540
Pro Tyr Glu Thr Thr Val Val Leu Ala Phe Glu Glu Val Ser Gln Val
545 550 555 560
Val Lys Leu Val Leu Arg Ala Leu Arg Asp Leu Thr Arg Ile Trp Asn
565 570 575
Ala Ala Thr Thr Thr Ala Phe Leu Val Cys Leu Val Lys Ile Val Arg
580 585 590
Gly Gln Met Val Gln Gly Ile Leu Trp Leu Leu Leu Ile Thr Gly Val
595 600 605
Gln Gly His Leu Asp Cys Lys Pro Glu Phe Ser Tyr Ala Ile Ala Lys
610 615 620
Asp Glu Arg Ile Gly Gln Leu Gly Ala Glu Gly Leu Thr Thr Thr Trp
625 630 635 640
Lys Glu Tyr Ser Pro Gly Met Lys Leu Glu Asp Thr Met Val Ile Ala
645 650 655
Trp Cys Glu Asp Gly Lys Leu Met Tyr Leu Gln Arg Cys Thr Arg Glu
660 665 670
Thr Arg Tyr Leu Ala Ile Leu His Thr Arg Ala Leu Pro Thr Ser Val
675 680 685
Val Phe Lys Lys Leu Phe Asp Gly Arg Lys Gln Glu Asp Val Val Glu
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Met Asn Asp Asn Phe Glu Phe Gly Leu Cys Pro Cys Asp Ala Lys Pro
705 710 715 720
Ile Val Arg Gly Lys Phe Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Pro Ala Phe
725 730 735
Gln Met Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Thr Val Ser Cys Thr Ser
740 745 750
Phe Asn Met Asp Thr Leu Ala Thr Thr Val Val Arg Thr Tyr Arg Arg
755 760 765
Ser Lys Pro Phe Pro His Arg Gln Gly Cys Ile Thr Gln Lys Asn Leu
770 775 780
Gly Glu Asp Leu His Asn Cys Ile Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val
PRH47110AJ SEQ ID NOS
785 790 795 800
Pro Gly Asp Gln Leu Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Ile Glu Ser Cys Lys
805 810 815
Trp Cys Gly Tyr Gln Phe Lys Glu Ser Glu Gly Leu Pro His Tyr Pro
820 825 830
Ile Gly Lys Cys Lys Leu Glu Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Val Asp
835 840 845
Ser Thr Ser Cys Asn Arg Glu Gly Val Ala Ile Val Pro Gln Gly Thr
850 855 860
Leu Lys Cys Lys Ile Gly Lys Thr Thr Val Gln Val Ile Ala Met Asp
865 870 875 880
Thr Lys Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Tyr Glu Ile Ile Ser Ser
885 890 895
Glu Gly Pro Val Glu Lys Thr Ala Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Lys Thr
900 905 910
Leu Lys Asn Lys Tyr Phe Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr
915 920 925
Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Glu Val Thr Asp
930 935 940
His His Arg Asp Tyr Phe Ala Glu Ser Ile Leu Val Val Val Val Ala
945 950 955 960
Leu Leu Gly Gly Arg Tyr Val Leu Trp Leu Leu Val Thr Tyr Met Val
965 970 975
Leu Ser Glu Gln Lys Ala Leu Gly Ile Gln Tyr Gly Ser Gly Glu Val
980 985 990
Val Met Met Gly Asn Leu Leu Thr His Asn Asn Ile Glu Val Val Thr
995 1000 1005
Tyr Phe Leu Leu Leu Tyr Leu Leu Leu Arg Glu Glu Ser Val Lys
1010 1015 1020
Lys Trp Val Leu Leu Leu Tyr His Ile Leu Val Val His Pro Ile
1025 1030 1035
Lys Ser Val Ile Val Ile Leu Leu Met Ile Gly Asp Val Val Lys
1040 1045 1050
Ala Asp Ser Gly Gly Gln Glu Tyr Leu Gly Lys Ile Asp Leu Cys
1055 1060 1065
Phe Thr Thr Val Val Leu Ile Val Ile Gly Leu Ile Ile Ala Arg
1070 1075 1080
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Arg Asp Pro Thr Ile Val Pro Leu Val Thr Ile Met Ala Ala Leu
1085 1090 1095
Arg Val Thr Glu Leu Thr His Gln Pro Gly Val Asp lle Ala Val
1100 1105 1110
Ala Val Met Thr Ile Thr Leu Leu Met Val Ser Tyr Val Thr Asp
1115 1120 1125
Tyr Phe Arg Tyr Lys Lys Trp Leu Gln Cys Ile Leu Ser Leu Val
1130 1135 1140
Ser Ala Val Phe Leu Ile Arg Ser Leu Ile Tyr Leu Gly Arg Ile
1145 1150 1155
Glu Met Pro Glu Val Thr Ile Pro Asn Trp Arg Pro Leu Thr Leu
1160 1165 1170
Ile Leu Leu Tyr Leu Ile Ser Thr Thr Ile Val Thr Arg Trp Lys
1175 1180 1185
Val Asp Val Ala Gly Leu Leu Leu Gln Cys Val Pro Ile Leu Leu
1190 1195 1200
Leu Val Thr Thr Leu Trp Ala Asp Phe Leu Thr Leu Ile Leu Ile
1205 1210 1215
Leu Pro Thr Tyr Glu Leu Val Lys Leu Tyr Tyr Leu Lys Thr Val
1220 1225 1230
Arg Thr Asp Thr Glu Arg Ser Trp Leu Gly Gly Ile Asp Tyr Thr
1235 1240 1245
Arg Val Asp Ser Ile Tyr Asp Val Asp Glu Ser Gly Glu Gly Val
1250 1255 1260
Tyr Leu Phe Pro Ser Arg Gln Lys Ala Gln Gly Asn Phe Ser Ile
1265 1270 1275
Leu Leu Pro Leu Ile Lys Ala Thr Leu Ile Ser Cys Val Ser Ser
1280 1285 1290
Lys Trp Gln Leu Ile Tyr Met Ser Tyr Leu Thr Leu Asp Phe Met
1295 1300 1305
Tyr Tyr Met His Arg Lys Val Ile Glu Glu Ile Ser Gly Gly Thr
1310 1315 1320
Asn Ile Ile Ser Arg Leu Val Ala Ala Leu Ile Glu Leu Asn Trp
1325 1330 1335
Ser Met Glu Glu Glu Glu Ser Lys Gly Leu Lys Lys Phe Tyr Leu
1340 1345 1350
Leu Ser Gly Arg Leu Arg Asn Leu Ile Ile Lys His Lys Val Arg
1355 1360 1365
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Asn Glu Thr Val Ala Ser Trp Tyr Gly Glu Glu Glu Val Tyr Gly
1370 1375 1380
Met Pro Lys Ile Met Thr Ile Ile Lys Ala Ser Thr Leu Ser Lys
1385 1390 1395
Ser Arg His Cys Ile Ile Cys Thr Val Cys Glu Gly Arg Glu Trp
1400 1405 1410
Lys Gly Gly Thr Cys Pro Lys Cys Gly Arg His Gly Lys Pro Ile
1415 1420 1425
Thr Cys Gly Met Ser Leu Ala Asp Phe Glu Glu Arg His Tyr Lys
1430 1435 1440
Arg Ile Phe Ile Arg Glu Gly Asn Phe Glu Gly Met Cys Ser Arg
1445 1450 1455
Cys Gln Gly Lys His Arg Arg Phe Glu Met Asp Arg Glu Pro Lys
1460 1465 1470
Ser Ala Arg Tyr Cys Ala Glu Cys Asn Arg Leu His Pro Ala Glu
1475 1480 1485
Glu Gly Asp Phe Trp Ala Glu Ser Ser Met Leu Gly Leu Lys Ile
1490 1495 1500
Thr Tyr Phe Ala Leu Met Asp Gly Lys Val Tyr Asp Ile Thr Glu
1505 1510 1515
Trp Ala Gly Cys Gln Arg Val Gly Ile Ser Pro Asp Thr His Arg
1520 1525 1530
Val Pro Cys His Ile Ser Phe Gly Ser Arg Met Pro Phe Arg Gln
1535 1540 1545
Glu Tyr Asn Gly Phe Val Gln Tyr Thr Ala Arg Gly Gln Leu Phe
1550 1555 1560
Leu Arg Asn Leu Pro Val Leu Ala Thr Lys Val Lys Met Leu Met
1565 1570 1575
Val Gly Asn Leu Gly Glu Glu Ile Gly Asn Leu Glu His Leu Gly
1580 1585 1590
Trp Ile Leu Arg Gly Pro Ala Val Cys Lys Lys Ile Thr Glu His
1595 1600 1605
Glu Lys Cys His Ile Asn Ile Leu Asp Lys Leu Thr Ala Phe Phe
1610 1615 1620
Gly Ile Met Pro Arg Gly Thr Thr Pro Arg Ala Pro Val Arg Phe
1625 1630 1635
Pro Thr Ser Leu Leu Lys Val Arg Arg Gly Leu Glu Thr Ala Trp
1640 1645 1650
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Ala Tyr Thr His Gln Gly Gly Ile Ser Ser Val Asp His Val Thr
1655 1660 1665
Ala Gly Lys Asp Leu Leu Val Cys Asp Ser Met Gly Arg Thr Arg
1670 1675 1680
Val Val Cys Gln Ser Asn Asn Arg Leu Thr Asp Glu Thr Glu Tyr
1685 1690 1695
Gly Val Lys Thr Asp Ser Gly Cys Pro Asp Gly Ala Arg Cys Tyr
1700 1705 1710
Val Leu Asn Pro Glu Ala Val Asn Ile Ser Gly Ser Lys Gly Ala
1715 1720 1725
Val Val His Leu Gln Lys Thr Gly Gly Glu Phe Thr Cys Val Thr
1730 1735 1740
Ala Ser Gly Thr Pro Ala Phe Phe Asp Leu Lys Asn Leu Lys Gly
1745 1750 1755
Trp Ser Gly Leu Pro Ile Phe Glu Ala Ser Ser Gly Arg Val Val
1760 1765 1770
Gly Arg Val Lys Val Gly Lys Asn Glu Glu Ser Lys Pro Thr Lys
1775 1780 1785
Ile Met Ser Gly Ile Gln Thr Val Ser Lys Asn Arg Ala Asp Leu
1790 1795 1800
Thr Glu Met Val Lys Lys Ile Thr Ser Met Asn Arg Gly Asp Phe
1805 1810 1815
Lys Gln Ile Thr Leu Ala Thr Gly Ala Gly Lys Thr Thr Glu Leu
1820 1825 1830
Pro Lys Ala Val lle Glu Glu Ile Gly Arg His Lys Arg Val Leu
1835 1840 1845
Val Leu Ile Pro Leu Arg Ala Ala Ala Glu Ser Val Tyr Gln Tyr
1850 1855 1860
Met Arg Leu Lys His Pro Ser Ile Ser Phe Asn Leu Arg Ile Gly
1865 1870 1875
Asp Met Lys Glu Gly Asp Met Ala Thr Gly Ile Thr Tyr Ala Ser
1880 1885 1890
Tyr Gly Tyr Phe Cys Gln Met Pro Gln Pro Lys Leu Arg Ala Ala
1895 1900 1905
Met Val Glu Tyr Ser Tyr Ile Phe Leu Asp Glu Tyr His Cys Ala
1910 1915 1920
Thr Pro Glu Gln Leu Ala Ile Ile Gly Lys Ile His Arg Phe Ser
PRH47110AJ SEQ ID NOS
1925 1930 1935
Glu Ser Ile Arg Val Val Ala Met Thr Ala Thr Pro Ala Gly Ser
1940 1945 1950
Val Thr Thr Thr Gly Gln Lys His Pro Ile Glu Glu Phe Ile Ala
1955 1960 1965
Pro Glu Val Met Lys Gly Glu Asp Leu Gly Ser Gln Phe Leu Asp
1970 1975 1980
Ile Ala Gly Leu Lys Ile Pro Val Asp Glu Met Lys Gly Asn Met
1985 1990 1995
Leu Val Phe Val Pro Thr Arg Asn Met Ala Val Glu Val Ala Lys
2000 2005 2010
Lys Leu Lys Ala Lys Gly Tyr Asn Ser Gly Tyr Tyr Tyr Ser Gly
2015 2020 2025
Glu Asp Pro Ala Asn Leu Arg Val Val Thr Ser Gln Ser Pro Tyr
2030 2035 2040
Val Ile Val Ala Thr Asn Ala Ile Glu Ser Gly Val Thr Leu Pro
2045 2050 2055
Asp Leu Asp Thr Val Ile Asp Thr Gly Leu Lys Cys Glu Lys Arg
2060 2065 2070
Val Arg Val Ser Ser Lys Ile Pro Phe Ile Val Thr Gly Leu Lys
2075 2080 2085
Arg Met Ala Val Thr Val Gly Glu Gln Ala Gln Arg Arg Gly Arg
2090 2095 2100
Val Gly Arg Val Lys Pro Gly Arg Tyr Tyr Arg Ser Gln Glu Thr
2105 2110 2115
Ala Thr Gly Ser Lys Asp Tyr His Tyr Asp Leu Leu Gln Ala Gln
2120 2125 2130
Arg Tyr Gly Ile Glu Asp Gly Ile Asn Val Thr Lys Ser Phe Arg
2135 2140 2145
Glu Met Asn Tyr Asp Trp Ser Leu Tyr Glu Glu Asp Ser Leu Leu
2150 2155 2160
Ile Thr Gln Leu Glu Ile Leu Asn Asn Leu Leu Ile Ser Glu Asp
2165 2170 2175
Leu Pro Ala Ala Val Lys Asn Ile Met Ala Arg Thr Asp His Pro
2180 2185 2190
Glu Pro Ile Gln Leu Ala Tyr Asn Ser Tyr Glu Val Gln Val Pro
2195 2200 2205
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Val Leu Phe Pro Lys Ile Arg Asn Gly Glu Val Thr Asp Thr Tyr
2210 2215 2220
Glu Asn Tyr Ser Phe Leu Asn Ala Arg Lys Leu Gly Glu Asp Val
2225 2230 2235
Pro Val Tyr Ile Tyr Ala Thr Glu Asp Glu Asp Leu Ala Val Asp
2240 2245 2250
Leu Leu Gly Leu Asp Trp Pro Asp Pro Gly Asn Gln Gln Val Val
2255 2260 2265
Glu Thr Gly Lys Ala Leu Lys Gln Val Thr Gly Leu Ser Ser Ala
2270 2275 2280
Glu Asn Ala Leu Leu Val Ala Leu Phe Gly Tyr Val Gly Tyr Gln
2285 2290 2295
Ala Leu Ser Lys Arg His Val Pro Met Ile Thr Asp Ile Tyr Thr
2300 2305 2310
Ile Glu Asp Gln Arg Leu Glu Asp Thr Thr His Leu Gln Tyr Ala
2315 2320 2325
Pro Asn Ala Ile Lys Thr Asp Gly Thr Glu Thr Glu Leu Lys Glu
2330 2335 2340
Leu Ala Ser Gly Asp Val Glu Lys lle Met Gly Ala Ile Ser Asp
2345 2350 2355
Tyr Ala Ala Gly Gly Leu Glu Phe Val Lys Ser Gln Ala Glu Lys
2360 2365 2370
Ile Lys Thr Ala Pro Leu Phe Lys Glu Asn Ala Glu Ala Ala Lys
2375 2380 2385
Gly Tyr Val Gln Lys Phe Ile Asp Ser Leu Ile Glu Asn Lys Glu
2390 2395 2400
Glu Ile Ile Arg Tyr Gly Leu Trp Gly Thr His Thr Ala Leu Tyr
2405 2410 2415
Lys Ser Ile Ala Ala Arg Leu Gly His Glu Thr Ala Phe Ala Thr
2420 2425 2430
Leu Val Leu Lys Trp Leu Ala Phe Gly Gly Glu Ser Val Ser Asp
2435 2440 2445
His Val Lys Gln Ala Ala Val Asp Leu Val Val Tyr Tyr Val Met
2450 2455 2460
Asn Lys Pro Ser Phe Pro Gly Asp Ser Glu Thr Gln Gln Glu Gly
2465 2470 2475
Arg Arg Phe Val Ala Ser Leu Phe Ile Ser Ala Leu Ala Thr Tyr
2480 2485 2490
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Thr Tyr Lys Thr Trp Asn Tyr His Asn Leu Ser Lys Val Val Glu
2495 2500 2505
Pro Ala Leu Ala Tyr Leu Pro Tyr Ala Thr Ser Ala Leu Lys Met
2510 2515 2520
Phe Thr Pro Thr Arg Leu Glu Ser Val Val Ile Leu Ser Thr Thr
2525 2530 2535
Ile Tyr Lys Thr Tyr Leu Ser Ile Arg Lys Gly Lys Ser Asp Gly
2540 2545 2550
Leu Leu Gly Thr Gly Ile Ser Ala Ala Met Glu Ile Leu Ser Gln
2555 2560 2565
Asn Pro Val Ser Val Gly Ile Ser Val Met Leu Gly Val Gly Ala
2570 2575 2580
Ile Ala Ala His Asn Ala Ile Glu Ser Ser Glu Gln Lys Arg Thr
2585 2590 2595
Leu Leu Met Lys Val Phe Val Lys Asn Phe Leu Asp Gln Ala Ala
2600 2605 2610
Thr Asp Glu Leu Val Lys Glu Asn Pro Glu Lys Ile Ile Met Ala
2615 2620 2625
Leu Phe Glu Ala Val Gln Thr Ile Gly Asn Pro Leu Arg Leu Ile
2630 2635 2640
Tyr His Leu Tyr Gly Val Tyr Tyr Lys Gly Trp Glu Ala Lys Glu
2645 2650 2655
Leu Ser Glu Arg Thr Ala Gly Arg Asn Leu Phe Thr Leu Ile Met
2660 2665 2670
Phe Glu Ala Phe Glu Leu Leu Gly Met Asp Ser Gln Gly Lys Ile
2675 2680 2685
Arg Asn Leu Ser Gly Asn Tyr Ile Leu Asp Leu Ile Tyr Gly Leu
2690 2695 2700
His Lys Gln Ile Asn Arg Gly Leu Lys Lys Met Val Leu Gly Trp
2705 2710 2715
Ala Pro Ala Pro Phe Ser Cys Asp Trp Thr Pro Ser Asp Glu Arg
2720 2725 2730
Ile Arg Leu Pro Thr Asp Asn Tyr Leu Arg Val Glu Thr Arg Cys
2735 2740 2745
Pro Cys Gly Tyr Glu Met Lys Ala Phe Lys Asn Val Gly Gly Lys
2750 2755 2760
Leu Thr Lys Val Glu Glu Ser Gly Pro Phe Leu Cys Arg Asn Arg
2765 2770 2775
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Pro Gly Arg Gly Pro Val Asn Tyr Arg Val Thr Lys Tyr Tyr Asp
2780 2785 2790
Asp Asn Leu Arg Glu Ile Lys Pro Val Ala Lys Leu Glu Gly Gln
2795 2800 2805
Val Glu His Tyr Tyr Lys Gly Val Thr Ala Lys Ile Asp Tyr Ser
2810 2815 2820
Lys Gly Lys Met Leu Leu Ala Thr Asp Lys Trp Glu Val Glu His
2825 2830 2835
Gly Val Ile Thr Arg Leu Ala Lys Arg Tyr Thr Gly Val Gly Phe
2840 2845 2850
Asn Gly Ala Tyr Leu Gly Asp Glu Pro Asn His Arg Ala Leu Val
2855 2860 2865
Glu Arg Asp Cys Ala Thr Ile Thr Lys Asn Thr Val Gln Phe Leu
2870 2875 2880
Lys Met Lys Lys Gly Cys Ala Phe Thr Tyr Asp Leu Thr Ile Ser
2885 2890 2895
Asn Leu Thr Arg Leu Ile Glu Leu Val His Arg Asn Asn Leu Glu
2900 2905 2910
Glu Lys Glu Ile Pro Thr Ala Thr Val Thr Thr Trp Leu Ala Tyr
2915 2920 2925
Thr Phe Val Asn Glu Asp Val Gly Thr Ile Lys Pro Val Leu Gly
2930 2935 2940
Glu Arg Val Ile Pro Asp Pro Val Val Asp Ile Asn Leu Gln Pro
2945 2950 2955
Glu Val Gln Val Asp Thr Ser Glu Val Gly Ile Thr Ile Ile Gly
2960 2965 2970
Arg Glu Thr Leu Met Thr Thr Gly Val Thr Pro Val Leu Glu Lys
2975 2980 2985
Val Glu Pro Asp Ala Ser Asp Asn Gln Asn Ser Val Lys Ile Gly
2990 2995 3000
Leu Asp Glu Gly Asn Tyr Pro Gly Pro Gly Ile Gln Thr His Thr
3005 3010 3015
Leu Thr Glu Glu Ile His Asn Arg Asp Ala Arg Pro Phe Ile Met
3020 3025 3030
Ile Leu Gly Ser Arg Asn Ser Ile Ser Asn Arg Ala Lys Thr Ala
3035 3040 3045
Arg Asn Ile Asn Leu Tyr Thr Gly Asn Asp Pro Arg Glu Ile Arg
PRH47110AJ SEQ ID NOS
3050 3055 3060
Asp Leu Met Ala Ala Gly Arg Met Leu Val Val Ala Leu Arg Asp
3065 3070 3075
Val Asp Pro Glu Leu Ser Glu Met Val Asp Phe Lys Gly Thr Phe
3080 3085 3090
Leu Asp Arg Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ser Leu Gly Gln Pro Lys
3095 3100 3105
Pro Lys Gln Val Thr Lys Glu Ala Val Arg Asn Leu Ile Glu Gln
3110 3115 3120
Lys Lys Asp Val Glu Ile Pro Asn Trp Phe Ala Ser Asp Asp Pro
3125 3130 3135
Val Phe Leu Glu Val Ala Leu Lys Asn Asp Lys Tyr Tyr Leu Val
3140 3145 3150
Gly Asp Val Gly Glu Leu Lys Asp Gln Ala Lys Ala Leu Gly Ala
3155 3160 3165
Thr Asp Gln Thr Arg Ile Ile Lys Glu Val Gly Ser Arg Thr Tyr
3170 3175 3180
Ala Met Lys Leu Ser Ser Trp Phe Leu Lys Ala Ser Asn Lys Gln
3185 3190 3195
Met Ser Leu Thr Pro Leu Phe Glu Glu Leu Leu Leu Arg Cys Pro
3200 3205 3210
Pro Ala Thr Lys Ser Asn Lys Gly His Met Ala Ser Ala Tyr Gln
3215 3220 3225
Leu Ala Gln Gly Asn Trp Glu Pro Leu Gly Cys Gly Val His Leu
3230 3235 3240
Gly Thr Ile Pro Ala Arg Arg Val Lys Ile His Pro Tyr Glu Ala
3245 3250 3255
Tyr Leu Lys Leu Lys Asp Phe Ile Glu Glu Glu Glu Lys Lys Pro
3260 3265 3270
Arg Val Lys Asp Thr Val Ile Arg Glu His Asn Lys Trp Ile Leu
3275 3280 3285
Lys Lys Ile Arg Phe Gln Gly Asn Leu Asn Thr Lys Lys Met Leu
3290 3295 3300
Asn Pro Gly Lys Leu Ser Glu Gln Leu Asp Arg Glu Gly Arg Lys
3305 3310 3315
Arg Asn Ile Tyr Asn His Gln Ile Gly Thr Ile Met Ser Ser Ala
3320 3325 3330
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Gly Ile Arg Leu Glu Lys Leu Pro Ile Val Arg Ala Gln Thr Asp
3335 3340 3345
Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ile Arg Asp Lys Ile Asp Lys Ser
3350 3355 3360
Glu Asn Arg Gln Asn Pro Glu Leu His Asn Lys Leu Leu Glu Ile
3365 3370 3375
Phe His Thr Ile Ala Gln Pro Thr Leu Lys His Thr Tyr Gly Glu
3380 3385 3390
Val Thr Trp Glu Gln Leu Glu Ala Gly Val Asn Arg Lys Gly Ala
3395 3400 3405
Ala Gly Phe Leu Glu Lys Lys Asn Ile Gly Glu Val Leu Asp Ser
3410 3415 3420
Glu Lys His Leu Val Glu Gln Leu Val Arg Asp Leu Lys Ala Gly
3425 3430 3435
Arg Lys Ile Lys Tyr Tyr Glu Thr Ala Ile Pro Lys Asn Glu Lys
3440 3445 3450
Arg Asp Val Ser Asp Asp Trp Gln Ala Gly Asp Leu Val Val Glu
3455 3460 3465
Lys Arg Pro Arg Val Ile Gln Tyr Pro Glu Ala Lys Thr Arg Leu
3470 3475 3480
Ala Ile Thr Lys Val Met Tyr Asn Trp Val Lys Gln Gln Pro Val
3485 3490 3495
Val Ile Pro Gly Tyr Glu Gly Lys Thr Pro Leu Phe Asn Ile Phe
3500 3505 3510
Asp Lys Val Arg Lys Glu Trp Asp Ser Phe Asn Glu Pro Val Ala
3515 3520 3525
Val Ser Phe Asp Thr Lys Ala Trp Asp Thr Gln Val Thr Ser Lys
3530 3535 3540
Asp Leu Gln Leu Ile Gly Glu Ile Gln Lys Tyr Tyr Tyr Lys Lys
3545 3550 3555
Glu Trp His Lys Phe Ile Asp Thr Ile Thr Asp His Met Thr Glu
3560 3565 3570
Val Pro Val Ile Thr Ala Asp Gly Glu Val Tyr Ile Arg Asn Gly
3575 3580 3585
Gln Arg Gly Ser Gly Gln Pro Asp Thr Ser Ala Gly Asn Ser Met
3590 3595 3600
Leu Asn Val Leu Thr Met Met Tyr Gly Phe Cys Glu Ser Thr Gly
3605 3610 3615
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Val Pro Tyr Lys Ser Phe Asn Arg Val Ala Arg Ile His Val Cys
3620 3625 3630
Gly Asp Asp Gly Phe Leu Ile Thr Glu Lys Gly Leu Gly Leu Lys
3635 3640 3645
Phe Ala Asn Lys Gly Met Gln Ile Leu His Glu Ala Gly Lys Pro
3650 3655 3660
Gln Lys Ile Thr Glu Gly Glu Lys Met Lys Val Ala Tyr Arg Phe
3665 3670 3675
Glu Asp Ile Glu Phe Cys Ser His Thr Pro Val Pro Val Arg Trp
3680 3685 3690
Ser Asp Asn Thr Ser Ser His Met Ala Gly Arg Asp Thr Ala Val
3695 3700 3705
Ile Leu Ser Lys Met Ala Thr Arg Leu Asp Ser Ser Gly Glu Arg
3710 3715 3720
Gly Thr Thr Ala Tyr Glu Lys Ala Val Ala Phe Ser Phe Leu Leu
3725 3730 3735
Met Tyr Ser Trp Asn Pro Leu Val Arg Arg Ile Cys Leu Leu Val
3740 3745 3750
Leu Ser Gln Gln Pro Glu Thr Asp Pro Ser Lys His Ala Thr Tyr
3755 3760 3765
Tyr Tyr Lys Gly Asp Pro Ile Gly Ala Tyr Lys Asp Val Ile Gly
3770 3775 3780
Arg Asn Leu Ser Glu Leu Lys Arg Thr Gly Phe Glu Lys Leu Ala
3785 3790 3795
Asn Leu Asn Leu Ser Leu Ser Thr Leu Gly Val Trp Thr Lys His
3800 3805 3810
Thr Ser Lys Arg Ile Ile Gln Asp Cys Val Ala Ile Gly Lys Glu
3815 3820 3825
Glu Gly Asn Trp Leu Val Lys Pro Asp Arg Leu Ile Ser Ser Lys
3830 3835 3840
Thr Gly His Leu Tyr Ile Pro Asp Lys Gly Phe Thr Leu Gln Gly
3845 3850 3855
Lys His Tyr Glu Gln Leu Gln Leu Arg Thr Glu Thr Asn Pro Val
3860 3865 3870
Met Gly Val Gly Thr Glu Arg Tyr Lys Leu Gly Pro Ile Val Asn
3875 3880 3885
Leu Leu Leu Arg Arg Leu Lys Ile Leu Leu Met Thr Ala Val Gly
3890 3895 3900
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Val Ser Ser
3905
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物-側(cè)出于突變片段的p15aDI克隆位點(diǎn)的5’端
<400>2
gaggccgtta acatatca18
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物-側(cè)出于突變片段的p15aDI克隆位點(diǎn)的3’端
<400>3
cctaaatcac tttgaccctg ttgctgt27
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物-用于引入I1841A突變的5’引物
<400>4
gaggcagggc gccacaagag agtattagtt30
<210>5
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入I1841A突變的3’引物
<400>5
cttgtggcgc cctgcctcct ctataactgc tt32
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入R1843A突變的5’引物
<400>6
gagataggcg cccacaagag agtattagtt30
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入R1843A突變的3’引物
<400>7
PRH47110AJ SEQ ID NOS
cttgtgggcg cctatctcct ctataac27
<210>8
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入K1845A突變的5’引物
<400>8
atagggcgcc acgcgagagt attagttctt at32
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入K1845A突變的3’引物
<400>9
tctcgcgtgg cgccctatct cctctataac30
<210>10
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入K1867A突變的5’引物
<400>10
ttggctcacc catcgatctc ttttaaccta agga34
<210>11
<211>37
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入K1867A突變的3’引物
<400>11
agagatcgat gggtgagcca atctcatata ctggtag37
<210>12
<211>31
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入H1868A突變的5’引物
<400>12
aaagctccat cgatctcttt taacctaagg a31
<210>13
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入H1868A突變的3’引物
<400>13
agagatcgat ggagctttca atctcatata ctgg34
PRH47110AJ SEQ ID NOS
<210>14
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入P1869A突變的5’引物
<400>14
cacgcgagca taagctttaa cctaaggata gggg34
<210>15
<211>36
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入P1869A突變的3’引物
<400>15
ttaaagctta tgctcgcgtg tttcaatctc atatac36
<210>16
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入E1939A突變的5’引物
<400>16
ccatcgattt tcagcgagta taagggttgt cg32
<210>17
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入E1939A突變的3’引物
<400>17
ctcgctgaaa atcgatggat cttcccgata at32
<210>18
<211>42
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入R1942A突變的5’引物
<400>18
ccatcgattt tcagagagta tagcggttgt cgccatgact gc 42
<210>19
<211>41
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于引入R1942A突變的3’引物
<400>19
accgctatac tctctgaaaa tcgatggatc ttcccgataa t 41
<210>20
<211>166
<212>PRT
PRH47110AJ SEQ ID NOS
<213>人工
<220>
<223>BVDV的NS3域的片段
<400>20
Ser Lys Asn Arg Ala Asp Leu Thr Glu Met Val Lys Lys Ile Thr Ser
1 5 10 15
Met Asn Arg Gly Asp Phe Lys Gln Ile Thr Leu Ala Thr Gly Ala Gly
20 25 30
Lys Thr Thr Glu Leu Pro Lys Ala Val Ile Glu Glu Ile Gly Arg His
35 40 45
Lys Arg Val Leu Val Leu Ile Pro Leu Arg Ala Ala Ala Glu Ser Val
50 55 60
Tyr Gln Tyr Met Arg Leu Lys His Pro Ser Ile Ser Phe Asn Leu Arg
65 70 75 80
Ile Gly Asp Met Lys Glu Gly Asp Met Ala Thr Gly Ile Thr Tyr Ala
85 90 95
Ser Tyr Gly Tyr Phe Cys Gln Met Pro Gln Pro Lys Leu Arg Ala Ala
100 105 110
Met Val Glu Tyr Ser Tyr Ile Phe Leu Asp Glu Tyr His Cys Ala Thr
115 120 125
Pro Glu Gln Leu Ala Ile Ile Gly Lys Ile His Arg Phe Ser Glu Ser
130 135 140
Ile Arg Val Val Ala Met Thr Ala Thr Pro Ala Gly Ser Val Thr Thr
145 150 155 160
Thr Gly Gln Lys His Pro
165
<210>21
<211>145
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>HCV的NS3域的片段
<400>21
Pro Pro Ala Val Pro Gln Thr Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro
1 5 10 15
Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln
20 25 30
Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly
35 40 45
Phe Gly Val Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg
50 55 60
PRH47110AJ SEQ ID NOS
Thr Gly Val Arg Ala Ile Thr Thr Gly Gly Pro Ile Thr Tyr Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp
85 90 95
Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ser Thr Ser Ile Leu
100 105 110
Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala G1u Thr Ala Gly Ala Arg Leu
115 120 125
Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Hly Ser Ile Thr Val Pro His
130 135 140
Pro
14權(quán)利要求
1.一種牛病毒性腹瀉病毒，其包括至少一個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變，其中NS3的解螺旋酶域中的突變導(dǎo)致野生型牛病毒性腹瀉病毒的NS3的單克隆抗體喪失識(shí)別力，但其中病毒RNA的復(fù)制和傳染性病毒的產(chǎn)生仍然保留。
2.一種牛病毒性腹瀉病毒，其包括至少一個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變，其中NS3不被NS3單克隆抗體所識(shí)別，其中所述NS3抗體選自20.10.6、1.11.3、21.5.8和24.8，但其中病毒RNA的復(fù)制和傳染性病毒的產(chǎn)生仍然保留。
3.如權(quán)利要求1所述的牛病毒性腹瀉病毒，其中病毒疫苗包括一個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變。
4.如權(quán)利要求1所述的牛病毒性腹瀉病毒，其包括在IGR環(huán)中的解螺旋酶域突變。
5.如權(quán)利要求4所述的牛病毒性腹瀉病毒，其包括在IGR環(huán)中在氨基酸殘基1841處的解螺旋酶域突變。
6.如權(quán)利要求4所述的牛病毒性腹瀉病毒，其包括在IGR環(huán)中在氨基酸殘基1843處的解螺旋酶域突變。
7.如權(quán)利要求4所述的牛病毒性腹瀉病毒，其包括在IGR環(huán)中在氨基酸殘基1845處的解螺旋酶域突變。
8.如權(quán)利要求1所述的牛病毒性腹瀉病毒，其包括在KHP環(huán)中的解螺旋酶域突變。
9.如權(quán)利要求8所述的牛病毒性腹瀉病毒，其包括在KHP環(huán)中在氨基酸殘基1867處的解螺旋酶域突變。
10.如權(quán)利要求8所述的牛病毒性腹瀉病毒，其包括在KHP環(huán)中在氨基酸殘基1868處的解螺旋酶域突變。
11.如權(quán)利要求8所述的牛病毒性腹瀉病毒，其包括在KHP環(huán)中在氨基酸殘基1869處的解螺旋酶域突變。
12.如權(quán)利要求1所述的牛病毒性腹瀉病毒，其包括在SES環(huán)中的解螺旋酶域突變。
13.如權(quán)利要求12所述的牛病毒性腹瀉病毒，其包括在SES環(huán)中在氨基酸殘基1939處的解螺旋酶域突變。
14.如權(quán)利要求12所述的牛病毒性腹瀉病毒，其包括在SES環(huán)中在氨基酸殘基1942處的解螺旋酶域突變。
15.如權(quán)利要求1所述的牛病毒性腹瀉病毒，其中所述病毒包括兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變。
16.如權(quán)利要求15所述的牛病毒性腹瀉病毒，其包括兩個(gè)解螺旋酶域突變。
17.如權(quán)利要求16所述的牛病毒性腹瀉病毒，其中所述兩個(gè)解螺旋酶域突變是在IGR環(huán)中。
18.如權(quán)利要求17所述的牛病毒性腹瀉病毒，其中所述在IGR環(huán)中的兩個(gè)解螺旋酶域突變是在氨基酸殘基1843和1845處。
19.如權(quán)利要求16所述的牛病毒性腹瀉病毒，其中所述兩個(gè)解螺旋酶域突變是在SES環(huán)中。
20.如權(quán)利要求19所述的牛病毒性腹瀉病毒，其中所述在SES環(huán)中的兩個(gè)解螺旋酶域突變是在氨基酸殘基1939和1942處。
21.如權(quán)利要求15所述的牛病毒性腹瀉病毒，其包括三個(gè)解螺旋酶域突變。
22.如權(quán)利要求21所述的牛病毒性腹瀉病毒，其中所述三個(gè)解螺旋酶域突變是在IGR環(huán)中。
23.如權(quán)利要求22所述的牛病毒性腹瀉病毒，其中所述在IGR環(huán)中的三個(gè)解螺旋酶域突變是在氨基酸殘基1867、1868和1869處。
24.如權(quán)利要求21所述的牛病毒性腹瀉病毒，其包括在IGR環(huán)和SES環(huán)中在氨基酸殘基1845、1868和1939處的三個(gè)解螺旋酶域突變。
25.一種經(jīng)標(biāo)記的牛病毒性腹瀉病毒疫苗，其包括包含至少一個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變的牛病毒性腹瀉病毒，其中NS3的解螺旋酶域突變導(dǎo)致野生型牛病毒性腹瀉病毒的NS3的單克隆抗體喪失識(shí)別力，但是其中病毒RNA的復(fù)制和傳染性病毒的產(chǎn)生仍被保留。
26.一種區(qū)分被牛腹瀉病毒感染的動(dòng)物與用牛腹瀉病毒疫苗接種的動(dòng)物的方法，其中所述牛腹瀉病毒疫苗是包括至少一個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變的經(jīng)標(biāo)記的疫苗，所述方法包括
從試驗(yàn)動(dòng)物得到試樣；
檢測(cè)所述試樣中的牛腹瀉病毒；和
確定該牛腹瀉病毒是否包括突變。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述檢測(cè)牛腹瀉病毒的方法使用至少一種單克隆抗體。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述經(jīng)標(biāo)記的疫苗的解螺旋酶域氨基酸突變是在NS3的解螺旋酶域中。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其包括下述步驟
向試樣中加入能夠檢測(cè)野生型牛腹瀉病毒或能夠檢測(cè)突變牛腹瀉病毒的標(biāo)識(shí)抗體，其中該試樣含有得自試驗(yàn)動(dòng)物的體液；以及
通過將至少一種單克隆抗體與所述野生型牛腹瀉病毒或與所述突變牛腹瀉病毒接觸，來測(cè)量所述標(biāo)識(shí)抗體與所述野生型牛腹瀉病毒或與所述突變牛腹瀉病毒的結(jié)合親和力；以及
比較使用針對(duì)野生型BVDV病毒的單克隆抗體與針對(duì)帶突變NS3的BVDV病毒的單克隆抗體的結(jié)合親和力結(jié)果，來確定試驗(yàn)動(dòng)物的疫苗接種狀態(tài)。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其包括下述步驟
加入針對(duì)非突變NS3的域的經(jīng)標(biāo)識(shí)的第一抗體；以及
加入針對(duì)NS3突變部分的經(jīng)標(biāo)識(shí)的第二抗體。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述第一抗體針對(duì)野生型病毒。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述第二抗體針對(duì)NS3的突變部分。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述第二抗體針對(duì)NS3，并且選自20.10.6、1.11.3、21.5.8和24.8。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述第二抗體針對(duì)選自IGR環(huán)、KHP環(huán)和SES環(huán)的至少一個(gè)NS3突變部分。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述牛病毒性腹瀉病毒包括在IGR環(huán)中在選自1841、1843和1845的氨基酸殘基處的至少一個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變。
36.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述牛病毒性腹瀉病毒包括在KHP環(huán)中在選自1867、1868和1869的氨基酸殘基處的至少一個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變。
37.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述牛病毒性腹瀉病毒包括在SES環(huán)中在選自1939和1942的氨基酸殘基處的至少一個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變。
38.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述牛病毒性腹瀉病毒包括在IGR環(huán)和SES環(huán)中在氨基酸殘基1845、1868和1939處的至少一個(gè)解螺旋酶域氨基酸突變。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牛病毒性腹瀉病毒，其包括至少一種解螺旋域氨基酸突變，其中NS3域中的突變導(dǎo)致野生型NS3的單克隆抗體喪失識(shí)別力，但是其中病毒RNA的復(fù)制和傳染性病毒的產(chǎn)生仍然保留。本發(fā)明可用于例如生產(chǎn)經(jīng)標(biāo)記的牛病毒性腹瀉病毒疫苗或用于識(shí)別已接種和已感染或未接種的動(dòng)物。
文檔編號(hào)C07K14/18GK101355963SQ200680050797
公開日2009年1月28日 申請(qǐng)日期2006年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月7日
發(fā)明者黃騏騏, G·謝潑德 邁克爾·, 曹雪梅, 加布里埃爾·齊巴思 申請(qǐng)人:輝瑞產(chǎn)品公司