對(duì)人il-6具有特異性的抗體分子的制作方法

專利名稱：：對(duì)人il-6具有特異性的抗體分子的制作方法對(duì)人IL-6具有特異性的抗體分子本發(fā)明涉及對(duì)IL-6抗原決定簇具有特異性的抗體分子。本發(fā)明還涉及該抗體分子的治療用途和該抗體分子的生產(chǎn)方法。IL-6是由各種細(xì)胞類型產(chǎn)生的多效性多功能細(xì)胞因子。最初將其鑒定為誘導(dǎo)B-細(xì)胞最終成熟為抗體產(chǎn)生細(xì)胞的B-細(xì)胞分化因子(BSF-2)(Hirano等，1986Nature324，73-76)。已經(jīng)表明IL-6在免疫調(diào)節(jié)、炎癥、造血作用和腫瘤發(fā)生中起著重要作用。在免疫系統(tǒng)內(nèi)，IL-6誘導(dǎo)提高多克隆免疫球蛋白含量的B-細(xì)胞抗體產(chǎn)生。它還誘導(dǎo)T細(xì)胞上的白細(xì)胞介素-2(IL-2)受體表達(dá)(Nomo等，1987，Immunol.Letters,15,3,249-253)并促進(jìn)活化T-細(xì)胞中的IL-2產(chǎn)生，由此誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T-細(xì)胞的生長和分化(Okada等，1988，JImmunol,141，5,1543-1549)。還已知IL-6能決定單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞(ChomaratP等，2000,NatureImmunol.，6，510-514)。IL-6的功能不限于免疫應(yīng)答，因?yàn)樗谠煅饔谩⒀ㄐ纬?、破骨?xì)胞形成、肝臟急性期應(yīng)答引發(fā)中起作用，導(dǎo)致C-反應(yīng)蛋白(CRP)和血清淀粉狀蛋白A(SAA)的升高。已知它對(duì)于表皮角化細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞、骨髓瘤和漿細(xì)胞瘤而言是生長因子(Grossman等，1989，ProtNatlAcadSci.86，(16)6367-6371;Horii等，1989，JImmunol,143，12，3949-3955;Kawano等，1988，Nature332，6159，83-85)。通過各種細(xì)胞類型來生產(chǎn)IL-6，這些細(xì)胞類型包括單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、表皮角化細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、T和B-細(xì)胞以及一些腫瘤細(xì)胞(Akira等，1"0，F(xiàn)ASEBJ.，4,11，2860-2867)。除了組成型產(chǎn)生IL-6的肺瘤細(xì)胞以外，正常細(xì)胞不表達(dá)IL-6，除非受到適當(dāng)?shù)拇碳?。IL-6是一種糖蛋白，是184個(gè)氨基酸的分子，根據(jù)翻譯后修飾，具有21至28kD的分子量。在一些細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)了可變剪接變體(Kishimoto等,1995,Blood,86，4，1243-1254)。IL-6受體(IL-6R)復(fù)合物由兩個(gè)功能不同的膜蛋白構(gòu)成，兩個(gè)膜蛋白為80kDIL-6特異性結(jié)合鏈(gp80)和130kD信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈(gpl30)。盡管IL-6不能直接結(jié)合gpl30，但可以結(jié)合IL-6R，產(chǎn)生IL-6/IL-6R/gp30的高親和性三元復(fù)合物。IL-6R以低親和性結(jié)合IL-6，然而，IL-6R不具有胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，因此這種連接單獨(dú)不能導(dǎo)致細(xì)胞激活。相似地，IL-6R的細(xì)胞表面表達(dá)并不意味著細(xì)胞對(duì)IL-6刺激有反應(yīng)。蛋白酶剪切導(dǎo)致可溶性IL-6R(sIL-6R;sgp80)的釋放，其可以結(jié)合循環(huán)的IL-6，并提高IL-6的半衰期。對(duì)于細(xì)胞激活，IL-6首先結(jié)合與IL-6R或sIL-6R結(jié)合的細(xì)胞；然后雜二聚IL-6/IL-6R復(fù)合物與細(xì)胞表面糖蛋白gpl30相結(jié)合。所得到的三元雜合物結(jié)合另一個(gè)IL-6/IL-6R/gp130，接著發(fā)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(BravoandHeath2000,EMBOJ.，19,(11),2399-2411;Boulanger等，2003，Science,300，5628，2101-2104)，因此結(jié)合細(xì)胞的和可溶性IL-6R都引起細(xì)胞激活。將通過結(jié)合細(xì)胞的IL-6R的IL-6信號(hào)傳導(dǎo)稱為順式(c")信號(hào)傳導(dǎo)，而將通過可溶性IL-6R的細(xì)胞激活描述為反式("a/7"信號(hào)傳導(dǎo)。可以通過sIL-6R由IL-6刺激表達(dá)gpl30但不表達(dá)IL-6R的細(xì)胞。已知人IL-6的中和鼠抗體能夠干擾人IL-6與IL、R(位點(diǎn)l)或與gpl30(位點(diǎn)2和3)的結(jié)合(Kalai等，1997，Eur.J.Biochem.249，690-700;Brakenhoff等，1990,JournalofImmunology,145，561-568;Wendling等，1993，JournalofRheumatology,29，259-262)。美國專利US5，856，135公開了將阻斷IL-6結(jié)合IL-6R的人IL-6人抗體的重構(gòu)。這些抗體源自小鼠單克隆抗體SK2，其中將來自小鼠抗體SK2可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植至人抗體的可變區(qū)。還已知IL-6的中和人自身抗體(Hansen等，Eur.J.Immunol,1995，25，348-354)。WO2004039826中描述了位點(diǎn)I嵌合鼠/人抗IL-6抗體，用于治療中。人源化的抗人IL-6受體單克隆抗體正處于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的III期臨床試驗(yàn)中(Kishimoto，2005,A麵RevI謹(jǐn)no1.23:1-21)。還報(bào)道了相同的抗體在節(jié)段性回腸炎的II期研究中是有效的。還在NZB/WF!小鼠的狼疳樣疾病中證明了抗IL-6和抗IL-6R抗體的功效(Fink等，1994，J.Clin.Invest.94，585;Mihara等，1998，Clin.Exp.Immunol.112，397)。將鼠IL-6受體的中和抗體抑制了疾病過繼轉(zhuǎn)移模型中的結(jié)腸炎(Yamamoto等，2000，JournalofImmunology,164,4878;Atreya等，2000，NatureMed6，583)。后一研究還證明了抗受體抗體在結(jié)腸炎的IL-10敲除小鼠模型中和在腸炎的TNBS模型中的功效。我們現(xiàn)已鑒定了一種在體內(nèi)，例如，在在此所述的體內(nèi)模型中特別有效的高親和性中和抗IL-6抗體。根據(jù)Kabat等設(shè)計(jì)的體系將抗體可變區(qū)中的殘基按常規(guī)編號(hào)。該體系歹'J于Kabat等，1987，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest中，USDepartmentofHealthandHumanServices,NIH，USA(此后稱為"Kabat等，(上文)，，)。除非另外指出，該編號(hào)體系用于本說明書中。Kabat殘基標(biāo)號(hào)并非總是直接對(duì)應(yīng)于氨基酸殘基的直線編號(hào)。實(shí)際的直鏈氨基酸序列可能含有比對(duì)應(yīng)于結(jié)構(gòu)成分的縮短，或插入到結(jié)構(gòu)成分中的嚴(yán)格Kabat編號(hào)更少或更多的氨基酸，不管是基礎(chǔ)可變結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的框架還是互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。對(duì)于給定的抗體，可以通過抗體序列與"標(biāo)準(zhǔn)"Kabat編號(hào)序列的同源性殘基的比對(duì)來確定殘基的正確Kabat編號(hào)。根據(jù)Kabat編號(hào)體系，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR位于殘基31-35(CDR-H1)，殘基50-65(CDR-H2)和殘基95-102(CDR-H3)。然而，根據(jù)Chothia(Chothia，C.和Lesk，A.M.J.Mol.Biol.，196，901-917(1987)),相當(dāng)于CDR-H1的環(huán)從殘基26延伸至殘基32。因此，如在此所用的"CDR-H1"包括殘基26至35，如結(jié)合Kabat編號(hào)體系和Chothia的拓樸環(huán)定義所描述的。根據(jù)Kabat編號(hào)體系，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR位于殘基24-34(CDR-L1),殘基50-56(CDR-L2)和殘基89-97(CDR-L3)。如在此所用的，術(shù)語"中和抗體"描述了能夠中和IL-6生物信號(hào)傳導(dǎo)活性的抗體，例如，通過阻斷IL-6與gpl30受體的位點(diǎn)3結(jié)合。體。IL-6多肽或表達(dá)多肽的細(xì)胞可以用來產(chǎn)生特異性識(shí)別IL-6的抗體。IL-6多肽可以是"成熟"多肽或其生物活性片段或衍生物。優(yōu)選，IL-6多肽是成熟多肽。IL-6多肽可以通過本領(lǐng)域公知的方法從包括表達(dá)系統(tǒng)的遺傳工程化宿主細(xì)胞來制備或可以從天然生物來源收集。在本申請(qǐng)中，術(shù)語"多肽"包括肽，多肽和蛋白質(zhì)。這些可交替使用，除非另外指出。在一些情況中，IL-6多肽可以是較大蛋白質(zhì)的一部分，如融合蛋白，例如，與親和性標(biāo)記物融合的?？梢垣@得針對(duì)IL-6多肽產(chǎn)生的抗體，其中動(dòng)物的免疫是必需的，通過將多肽給予動(dòng)物，優(yōu)選非人動(dòng)物，使用公知和常規(guī)的方案，參見，例如，HandbookofExperimentalImmunology,D.M.Weir(編輯)，Vol4,BlackwellScientificPublishers,Oxford,England,1986。可以免疫許多溫血?jiǎng)游?，如兔子，小鼠，大鼠，綿羊，奶?；蜇i。然而，一般優(yōu)選小鼠，兔子，豬和大鼠。本發(fā)明中所用的抗體包括完整的抗體及其功能活性片段或衍生物，并且可以是，但不限于，單克隆，人源化，完全人源性或嵌合的抗體。可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法如雜交瘤技術(shù)(Kohler&Milstein，1975,Nature,256:495-497)，三源雜交瘤技術(shù)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，ImmunologyToday,4:72)和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,pp77-96,AlanRLiss，Inc.，1985)來制備單克隆抗體。球蛋白可變區(qū)cDNA，通過例如Babcook，J.等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(15):7843-78481;WO92/02551;WO2004/051268和國際專利申請(qǐng)?zhí)朩O2004/106377中所述的方法。人源化抗體(其包括CDR-移植抗體)是來自非人物種的抗體分子，白分子的框架區(qū)(參見，例如，US5，585，089;WO91/09967)。將認(rèn)識(shí)到可能只需要轉(zhuǎn)移CDR的特異性決定殘基，而不是整個(gè)CDR(參見，例如，Kashmiri等，2005，Methods,36，25-34)。人源化抗體可以任選進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)源自非人物種的框架殘基，而CDR則源自該非人物種。嵌合抗體是那些由遺傳工程化的免疫球蛋白基因編碼的抗體，使得其輕鏈和重鏈基因由屬于不同物種的免疫球蛋白基因區(qū)段構(gòu)成。還可以使用本領(lǐng)域已知的各種噬菌體展示方法來產(chǎn)生本發(fā)明中所用的抗體，包括Brinkman等(J.Immunol.Methods,1995，182:41-50)，Ames等(J.Immunol.Methods,1995，184:177-186)，Kettleborough等(Eur.J.Immunol.1994，24:952-958)，Persic等(Gene,1997，1879-18)，Burton等(AdvancesinImmunology,1994，57:191-280)和WO90/02809;W091/10737;W092/01047;W092/18619;WO93/11236;WO95/15982;W095/20401和US5,698,426;5,223,409;5,403,484;5,580,717;5,427,908;5,750,753;5，821，047;5,571,698;5,427,908;5,516,637;5,780,225;5,658,727;5，733，743和5，969，108中公開的那些。完全人源性抗體是其中兩個(gè)重鏈和輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)(如果存在的話)全部是人來源的，或與人來源的序列基本上相同的，但不一定來自相同的抗體那些抗體。完全人源性抗體的實(shí)例包括例如通過上述的噬菌體展示方法產(chǎn)生的抗體和通過小鼠產(chǎn)生的抗體，其中鼠免疫球蛋白可變和恒定部分基因已經(jīng)由人副本替代，例如，如EP0546073B1，US5，545，806，US5，569'825，US5，625，126，US5，633'425，US5，661，016,US5，770'429，EP0438474Bl和EP0463151Bl中所概述的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對(duì)人IL-6具有特異性并包括重鏈的中和抗體，其中該重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有SEQIDN0:5所示CDR-H1序列的CDR，具有SEQIDNO:6所示CDR-H2序列的CDR和具有SEQIDNO:7所示CDR-H3序列的CDR中的至少一個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對(duì)人IL-6具有特異性并包括重鏈的中和抗體，其中該重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR-H1，CDR-H2和CDR-H3中的至少兩個(gè)選自以下SEQIDNO:5所示的CDR-Hl序列，SEQIDNO:6所示的CDR-H2序列，SEQIDNO:7所示的CDR-H3序列。例如，抗體可以包括其中CDR-Hl具有SEQIDNO:5所示序列和CDR-H2具有SEQIDN0:6所示序列的重鏈?；蛘撸贵w可以包括其中CDR-Hl具有SEQIDNO:5所示序列和CDR-H3具有SEQIDNO:7所示序列的重鏈，或抗體可以包括其中CDR-H2具有SEQIDNO:6所示序列和CDR-H3具有SEQIDN0:7所示序列的重鏈。為了避免疑惑，可以理解包括所有的排列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對(duì)人IL-6具有特異性并包括重鏈的中和抗體，其中該重鏈的可變區(qū)包括SEQIDNO:5所示的CDR-H1序列，SEQIDNO:6所示的CDR-H2序列和SEQIDNO:7所示的CDR-H3序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對(duì)人IL-6具有特異性并包括輕鏈的中和抗體，其中該輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有SEQIDN0:8所示CDR-L1序列的CDR，具有SEQIDNO:9所示CDR-L2序列的CDR和具有SEQIDNO:10所示CDR-L3序列的CDR中的至少一個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對(duì)人IL-6具有特異性并包括輕鏈的中和抗體，其中該輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR-Ll，CDR-L2和CDR-L3中的至少兩個(gè)選自以下SEQIDNO:8所示的CDR-Ll序列，SEQIDNO:9所示的CDR-L2序列，SEQIDNO:10所示的CDR-L3序列。例如，抗體可以包括其中CDR-Ll具有SEQIDNO:8所示序列和CDR-U具有SEQIDN0:9所示序列的輕鏈?；蛘撸贵w可以包括其中CDR-Ll具有SEQIDNO:8所示序列和CDR-L3具有SEQIDNO:10所示序列的輕鏈，或抗體可以包括其中CDR-L2具有SEQIDNO:9所示序列和CDR-L3具有SEQIDNO:10所示序列的輕鏈。為了避免疑惑，可以理解包括所有的排列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對(duì)人IL-6具有特異性并包括輕鏈的中和抗體，其中該可變結(jié)構(gòu)域包括SEQIDNO:8所示的CDR-L1序列，SEQIDNO:9所示的CDR-L2序列和SEQIDNO:10所示的CDR-L3序列。將認(rèn)識(shí)到可以對(duì)本發(fā)明提供的CDR進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加和/或缺失，而不會(huì)顯著改變抗體結(jié)合IL-6和中和IL-6活性的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地測試任何氨基酸置換、添加和/或缺失的影響，例如，通過使用實(shí)施例中所述的方法來測定IL-6結(jié)合和中和。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了對(duì)人IL-6具有特異性并包括一個(gè)或多個(gè)選自CDRH-1(SEQIDNO:5)、CDRH-2(SEQIDNO:6)、CDRH-3(SEQIDNO:7)、CDRL-1(SEQIDNO:8)、CDRL-2(SEQIDNO:9)和CDRL-3(SEQIDNO:10)的CDR的抗體，其中一個(gè)或多個(gè)CDR中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸由另一個(gè)氨基酸來替代。本發(fā)明的抗體分子優(yōu)選分別包括互補(bǔ)輕鏈或互補(bǔ)重鏈。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體包括重鏈和輕鏈，其中重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括SEQIDNO:5所示的CDR-Hl序列，SEQIDNO:6所示的CDR-H2序列和SEQIDNO:7所示的CDR-H3序列，并且其中輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括SEQIDNO:8所示的CDR-L1序列，SEQIDNO:9所示的CDR-L2序列和SEQIDNO:10所示的CDR-L3序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對(duì)人IL-6具有特異性并包括重鏈和輕鏈的抗體，其中重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括SEQIDNO:5所示的CDR-Hl序列，SEQIDNO:6所示的CDR-H2序列和SEQIDNO:7所示的CDR-H3序列，并且其中輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括SEQIDNO:8所示的CDR-Ll序列，SEQIDNO:9所示的CDR-L2序列和SEQIDNO:IO所示的CDR-L3序列，其中一個(gè)或多個(gè)CDR中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸由另一個(gè)氨基酸來替代。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包括重鏈，其中重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括SEQIDN0:2中所示的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包括重鏈，其中重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有至少60%SEQIDNO:2中所示序列的同一性或相似性的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包括重鏈，其中重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有至少70%、80%、90%、95%或98%SEQIDNO:2中所示序列的同一性或相似性的序列。如在此所用的"同一性"表示在比對(duì)序列的任何特定位置，序列之間的氨基酸殘基相同。如在此所用的"相似性"表示在比對(duì)序列的任何特定位置，序列之間的氨基酸殘基屬于相似的類型。例如，用亮氨酸替代異亮氨酸或纈氨酸。通常可以相互替代的其他氨基酸包括，但不限于-苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸(具有芳香側(cè)鏈的氨基酸)；一賴氨酸，精氨酸和組氨酸(具有堿性側(cè)鏈的氨基酸)；-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性側(cè)鏈的氨基酸)；一天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺側(cè)鏈的氨基酸)；和一半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫側(cè)鏈的氨基酸)?？梢匀菀椎赜?jì)算出同一性和相似性的程度(ComputationalMolecularBiology(計(jì)算分子生物學(xué))，Lesk，A.M.編輯，OxfordUniversityPress,NewYork,1988;Biocomputing.InformaticsandGenomeProjects(生物計(jì)算。信息學(xué)和基因組計(jì)劃)，Smith,D.W.編輯，AcademicPress,NewYork,1993;ComputerAnalysisofSequenceData(序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin,H.G.編輯,HumanaPress,NewJersey,1994;SequenceAnalysisinMolecularBiology(分子生物學(xué)中的序歹'j分才斤)vonHeinje,G.，AcademicPress，1987;SequenceAnalysisPrimer(序歹'J分4斤引物)，Gribskov,M.和Devereux,J.編輯，MStocktonPress,NewYork,1991)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包括輕鏈，其中該輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括SEQIDN0:4中所示的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包括輕鏈，其中該輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有至少60%SEQIDNO:4中所示序列的同一性或相似性的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包括輕鏈，其中該輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有至少70%、80%、90°/。、95%或98%SEQIDNO:4中所示序列的同一性或相似性的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括重鏈和輕鏈，其中該重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括SEQIDNO:2中所示的序列和其中該輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括SEQIDNO:4中所示的序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，包括重鏈和輕鏈，其中該重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有至少60%SEQIDNO:2中所示序列的同一性或相似性的序列，而該輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有至少60%SEQIDNO:4中所示序列的同一性或相似性的序列。優(yōu)選，抗體包括重鏈和輕鏈，其中該重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有至少70%、80%、90%、95%或98%SEQIDN0:2中所示序列的同一性或相似性的序列，而該輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有至少70%、80%、90%、95%或98%SEQIDNO:4中所示序列的同一性或相似性的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是大鼠抗體，其中重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括SEQIDN0:2中所示的序列，并且輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括SEQIDN0:4中所示的序列。在此將該大鼠抗體稱為"1WE09，，或"供體"抗體。SEQIDNO:1和2中各自提供了大鼠抗體132E09的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的完整核苷酸序列和氨基酸序列。SEQIDNO:3和4中各自提供了大鼠抗體132E09的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的完整核苷酸序列和氨基酸序列。SEQIDNO:5、6、7、8、9和10中所示的CDR源自大鼠抗體132E09。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是CDR-移植抗體。如在此所用的，術(shù)語"CDR-移植抗體"指的是如下的抗體，其中重鏈和/或輕鏈含有一個(gè)或多個(gè)來自供體抗體(例如，大鼠抗體)并移植入受體抗體(例如，人抗體)的重鏈和/輕鏈可變結(jié)構(gòu)域框架的CDR(包括，如果需要，一個(gè)或多個(gè)修飾的CDR)。對(duì)于綜述，參見Vaughan等，NatureBiotechnology,li，535-539,1998。優(yōu)選，一個(gè)或多個(gè)CDR獲自大鼠抗體132E09(SEQIDNO:5、6、7、8、9和10)。在一個(gè)不是轉(zhuǎn)移完整CDR的實(shí)施方案中，只有一個(gè)或多個(gè)來自上述任一CDR的特異性決定殘基被轉(zhuǎn)移至人抗體框架(參見，例如，Kashmiri等，2005，Methods,36，25-34)。在一個(gè)實(shí)施方案中，只有來自上述一個(gè)或多個(gè)CDR的特異性決定殘基被轉(zhuǎn)移至人抗體框架。在另一個(gè)實(shí)施方案中，只有來自上述每個(gè)CDR的特異性決定殘基被轉(zhuǎn)移至人抗體框架。將CDR或特異性決定殘基移植時(shí)，考慮產(chǎn)生CDR的供體抗體的類別/類型，可以使用任何合適的受體可變區(qū)框架序列。優(yōu)選，本發(fā)明的CDR-移植抗體具有至少一個(gè)包括人受體框架區(qū)的可變結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)或多個(gè)源自上述供體抗體的CDR。因此，提供了中和CDR-移植抗體，其中可變結(jié)構(gòu)域包括人受體框架區(qū)和非人(優(yōu)選，大鼠)供體CDR?？捎糜诒景l(fā)明中的人框架的實(shí)例是K0L、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和P0M(Kabat等，上文)。例如，K0L和NEWM可以用于重鏈，REI可以用于輕鏈，而EU、LAY和P0M可以用于重鏈和輕鏈?；蛘?，可以使用人種系序列；這些序列在hup://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/可獲得。在本發(fā)明的CDR-移植抗體中，受體重鏈和輕鏈不是必需要源自相同的抗體，如果需要，可以包括復(fù)合鏈，其具有源自不同鏈的框架區(qū)。用于本發(fā)明的CDR-移植抗體重鏈的優(yōu)選框架區(qū)源自人亞組VH3序列1-43-72和JH4(顯示于圖2中；SEQIDNO:19和20)。因此，提供了包括至少一個(gè)非人供體CDR的中和CDR-移植抗體，其中重鏈框架區(qū)源自人亞組序列1-43-72和JH4。人JH4的序列如下(YFDY)WGQGTLVTVSS(SEQIDNO:20)。YFDY基序是CDR-H3的一部分并且不是框架4的一部分(Ravetch，JV.等，1981，Cel1，27,583-591)。供體序列是圖2中所示的132E09VH序列(SEQIDNO:2)，并且供體CDR(SEQIDNO:5、6和7)是帶下劃線的。用于本發(fā)明CDR-移植抗體輕鏈的優(yōu)選框架區(qū)源自人種系亞組VK1序列2-1-(1)012和JK2，顯示于圖2中(SEQIDNO:21和22)。因此，提供了包括至少一個(gè)非人供體CDR的中和CDR-移植抗體，其中輕鏈框架區(qū)源自人亞組序列VK12-1-(1)012和JK2。JK2序列如下(YT)FGQGTKLEIKR(SEQIDNO:22)。YT基序是CDR-L3的一部分并且不是框架4的一部分(Hieter，PA.等，1982,J.Biol.Chem.，257，1516-1522)。供體序列是圖2中所示的132E09VL序列(SEQIDNO:4),供體CDR(SEQIDNO8、9和10)是帶下劃線的。此外，在本發(fā)明的CDR-移植抗體中，框架區(qū)不需要具有與受體抗體完全相同的序列。例如，可以將稀有殘基改變成對(duì)于受體鏈類別或類型而言更常出現(xiàn)的殘基?；蛘?，可以改變受體框架區(qū)中選定的殘基，使得它們對(duì)應(yīng)于供體抗體中相同位置上發(fā)現(xiàn)的殘基(參見，Reichmann等，1998，Nature,332,323-324)。應(yīng)當(dāng)保持這樣的改變至恢復(fù)供體抗體親和性所必需的最小化。選擇受體框架區(qū)中可能需要改變的殘基的方案列于WO91/09967中。優(yōu)選，在本發(fā)明的CDR-移植抗體分子中，如果受體重鏈具有人VH3序列1-43-72和JH4，那么重鏈的受體框架區(qū)除了一個(gè)或多個(gè)CDR以外，至少在位置49還包括供體殘基(根據(jù)Kabat等，(上文))。因此，提供了CDR-移植抗體，其中至少重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置49的殘基是供體殘基。優(yōu)選，在根據(jù)本發(fā)明的CDR-移植抗體分子中，如果受體輕鏈具有人亞組VK1序列2-l-(l)012和JK2，那么輕鏈的受體框架區(qū)中沒有使用供體殘基，并且只轉(zhuǎn)移了一個(gè)或多個(gè)CDR。供體殘基是來自供體抗體的殘基，即，最初產(chǎn)生CDR的抗體，在本發(fā)明的情況中，是大鼠抗體132E09。因此，本發(fā)明提供了其中重鏈可變區(qū)包括gH13序列(圖2;SEQIDNO:11)的抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包括重鏈，其中該重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有至少60%SEQIDNO:11中所示序列的同一性或相似性的序列。優(yōu)選，抗體包括重鏈，其中該重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有至少70°/。、80%、90%、95%或98%SEQIDNO:11中所示序列的同一性或相似性的序列。此外，本發(fā)明提供了其中輕鏈可變區(qū)包括gL10(圖2;SEQIDNO:13)的抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包括輕鏈，其中該輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有至少60%SEQIDNO:13中所示序列的同一性或相似性的序列。優(yōu)選，抗體包括輕鏈，其中該輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有至少70%、80%、90%、95%或98%SEQIDNO:13中所示序列的同一性或相似性的序列。優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的CDR-移植抗體包含包括gH13序列(SEQIDNO:11)的重鏈和包括gL10序列(SEQIDNO:13)的輕鏈。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包括重鏈和輕鏈，其中該重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有至少60%SEQIDNO:11中所示序列的同一性或相似性的序列，并且該輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有至少60%SEQIDNO:13中所示序列的同一性或相似性的序列。優(yōu)選，抗體包括重鏈和輕鏈，其中該重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有至少70%、80%、90°/。、95%或98%SEQIDNO:11中所示序列的同一性或相似性的序列，其中該輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有至少70%、80%、90%、95%或98%SEQIDNO:13中所示序列的同一性或相似性的序列。本發(fā)明的抗體分子可以包括具有全長重鏈和輕鏈或其片段的完整抗體分子，并且可以是，但不限于，F(xiàn)ab，修飾的Fab，F(xiàn)ab，，F(xiàn)(ab，)2,Fv,單域抗體，scFv，二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)抗體，Bis-scFv，雙抗，三抗，四抗和上述任一的抗原決定部位結(jié)合片段(參見，例如，Holliger和Hudson,2005,NatureBiotech.23(9):1126-1136;Adair和Lawson，2005，DrugDesignReviews-Online2(3)，209-217)。形成和制造這些抗體片段的方法是本領(lǐng)域已知的(參見，例如，Verma等，1998,JournalofImmunologicalMethods,216，165-181)。用于本發(fā)明中的其他抗體片段包括國際專利申請(qǐng)WO2005/003169,WO2005/003170和WO2005/003171中所述的Fab和Fab，片段。多價(jià)抗體可以包括多重特異性或可以是單特異性的(參見，例如，W092/22853和W005/113605)。本發(fā)明抗體分子的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，如果存在，可以考慮該抗體分子被提議的功能，特別是可能需要的效應(yīng)物功能來進(jìn)行選擇。例如，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM結(jié)構(gòu)域。特別地，打算將抗體分子用于治療用途并且需要抗體效應(yīng)分子時(shí)，可以使用人IgG恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，尤其是IgGl和IgG3同型?；蛘?，打算將抗體分子用于治療目的但不需要抗體效應(yīng)物功能時(shí)，例如對(duì)于簡單阻斷IL-6活性，可以使用IgG2和IgG4同型。將認(rèn)識(shí)到還可以使用這些恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的序歹寸變體。例3口，可以4吏用Angal等，MolecularImmunology,1993，30(1)，105-108中所述的將位置241的絲氨酸變?yōu)楦彼岬腎gG分子。特別優(yōu)選的是包括這種改變的IgG4恒定結(jié)構(gòu)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以理解抗體可以經(jīng)受各種翻譯后修飾。這些修飾的類型和程度通常取決于用來表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞系以及培養(yǎng)條件。這樣的修飾可以包括糖基化、甲疏氨酸氧化、二酮基哌嗪形成、天冬氨酸異構(gòu)化和天冬酰胺脫酰胺中的變化。常見的修飾是由于羧肽酶的作用而失去羧基端堿性殘基(如賴氨酸或精氨酸)(如Harris,RJ，/^/i7a/C力層"o,/7力/705:129-134,1995)。因此，SEQIDNO:16的抗體重鏈的C-端賴氨酸可以不存在。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的抗體是對(duì)人IL-6具有特異性的中和抗體，其中重鏈恒定區(qū)包括人IgG4恒定區(qū)，其中位置241的絲氨酸已經(jīng)由脯氨酸替代，如Angal等，上文中所述的。因此，本發(fā)明提供了其中重鏈包括SEQIDNO:16所示序列或由SEQIDNO:16所示序列構(gòu)成的抗體。優(yōu)選，輕鏈恒定區(qū)是CK。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了其中重鏈包括SEQIDNO:16所示序列或由SEQIDNO:16所示序列構(gòu)成和輕鏈包括SBQIDNO:18所示序列或由SEQIDNO:18所示序列構(gòu)成的抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包括重鏈，其中該重鏈包括具有至少60%SEQIDNO:16中所示序列的同一性或相似性的序列。優(yōu)選，抗體包括重鏈，其中該重鏈包括具有至少70%、80%、90%、"％或98%SEQIDNO:16中所示序列的同一性或相似性的序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包括輕鏈，其中該輕鏈包括具有至少60%SEQIDNO:18中所示序列的同一性或相似性的序列。優(yōu)選，抗體包括輕鏈，其中該輕鏈包括具有至少70°/0、80%、90%、95°/?；?8%SEQIDNO:18中所示序列的同一性或相似性的序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包括重鏈和輕鏈，其中該重鏈包括具有至少60%SEQIDNO:16中所示序列的同一性或相似性的序列，而該輕鏈包括具有至少60%SEQIDNO:18中所示序列的同一性或相似性的序列。優(yōu)選，抗體包括重鏈和輕鏈，其中該重鏈包括具有至少70%、80°/。、90%、95%或98%SEQIDNO:16中所示序列的同一性或相似性的序列，而該輕鏈包括具有至少70%、80°/。、90%、95%或98%SEQIDNO:18中所示序列的同一性或相似性的序列。本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的抗體結(jié)合的人IL-6的特異性區(qū)域或抗原決定部位，特別是包括CDR-Hl(SEQIDNO:5)、CDR-H2(SEQIDNO:6)、CDR-H3(SEQIDNO:7)、CDR-L1(SEQIDNO:8)、CDR-L2(SEQIDNO:9)或CDR-L3(SEQIDNO:10)任一的抗體，例如，抗體132E09，或包括重鏈可變區(qū)序列g(shù)H13(SEQIDNO:11)和/或輕鏈可變區(qū)序列g(shù)LIO(SEQIDNO:13)的抗體。可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適的抗原決定部位作圖方法結(jié)合本發(fā)明提供的任一種抗體來鑒定這種人IL-6多肽的特異性區(qū)域或抗原決定部位。這樣的方法的實(shí)例包括篩選源自結(jié)合本發(fā)明抗體的IL-6的不同長度的肽，使用可以特異性結(jié)合含有抗體識(shí)別的抗原決定部位序列的抗體的最小片段?？梢酝ㄟ^合成或通過IL-6多肽的蛋白水解消化來產(chǎn)生IL-6肽。例如，可以通過質(zhì)傳分析來鑒定結(jié)合抗體的肽。在另一個(gè)實(shí)施例中，NMR光譜學(xué)可以用來鑒定本發(fā)明抗體結(jié)合的抗原決定部位，如在此的實(shí)施例中所述的。一定鑒定出，可以使用結(jié)合本發(fā)明抗體的抗原決定片段，如果需要，作為免疫原來獲得結(jié)合相同抗原決定部位的其他中和抗體。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明抗體結(jié)合的人IL-6的抗原決定部位至少包括人IL-6的氨基酸殘基S47、C50、E93、R104、F105、E106、T149、K150、A153、Q156、Q159和S169(根據(jù)Boulanger等的殘基編號(hào)，Science,300,2101-2104)。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明抗體結(jié)合的人IL-6的抗原決定部位包括氨基酸殘基S47、C50、E93、R104、F105、E106、T149、K150、A153、Q156、Q159和S169以及一個(gè)或多個(gè)選自C44、S53、A58、V96、Q152、Q154、N155、W157、T163、L165和E172的殘基。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明抗體結(jié)合的人IL-6的抗原決定部位包括氨基酸殘基C44、S47、C50、S53、A58、E93、V96、R104、F105、E106、T149、K150、Q152、A153、Q154、N155、Q156、W157、Q159、T163、L165、S169和E172。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對(duì)人IL-6具有特異性的中和抗體，其結(jié)合成熟人IL-6的抗原決定部位，其包括氨基酸殘基S47、C50、E93、R104、F105、E106、T149、K150、A153、Q156、Q159和S169。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對(duì)人IL-6具有特異性的中和抗體，其結(jié)合成熟人IL-6的抗原決定部位，其包括氨基酸殘基S47、C50、E93、R104、F105、E106、T149、K150、A153、Q156、Q159和S169以及一個(gè)或多個(gè)選自C44,S53，A58，V96，Q152，Q154，N155，W157,T163,L165和E172的殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對(duì)人IL-6具有特異性的中和抗體，其結(jié)合成熟人IL-6的抗原決定部位，其包括氨基酸殘基C44、S47、C50、S53、A58、E93、V96、R104、F105、E106、T149、K150、Q152、A153、Q154、N155、Q156、W157、Q159、T163、L165、S169和E172。將認(rèn)識(shí)到也可以基于未加工的IL-6前體的氨基酸編號(hào)來進(jìn)行上述殘基的編號(hào)(SwissProt登錄號(hào)P05231)。使用該編號(hào)，根據(jù)Boulanger等(上文)的上述編號(hào)的殘基，如C44、S47、C50、S53、A58、E93、V96、R104、F105、E106、T149、K150、Q152、A153、Q154、N155、Q156、W157、Q159、T163、L165、S169和E172分別變成C72、S75、C78、S81、A86、E121、V124、R132、F133、E134、T177、K178、Q180、A181、Q182、N183、Q184、W185、Q187、T191、L193、S197和E200。優(yōu)選，本發(fā)明的抗體阻斷gpl30受體與人IL-6的位點(diǎn)3的結(jié)合。交叉阻斷本發(fā)明的抗體與IL-6結(jié)合的抗體可以相似地用于中和IL-6活性中。因此，本發(fā)明還提供了對(duì)人IL-6具有特異性的中和抗體，其交叉阻斷上述任一種抗體與人IL-6的結(jié)合和/或被那些抗體中任一種交叉阻斷以免結(jié)合IL-6。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的抗體結(jié)合與上述抗體相同的抗原決定部位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，交叉阻斷中和抗體結(jié)合與上述抗體結(jié)合的抗原決定部位相連和/或重疊的抗原決定部位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明這一方面的交叉阻斷中和抗體和/或重疊的抗原決定部位?？梢允褂帽绢I(lǐng)域任何合適的方法來鑒定交叉阻斷抗體，例如，使用竟?fàn)嶦LISA或BIAcore，其中交叉阻斷抗體與人IL-6的結(jié)合可防止本發(fā)明的抗體的結(jié)合，或反之亦然。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了對(duì)人IL-6具有特異性的中和抗體，其交叉阻斷抗體132E09或其重鏈包括序列g(shù)H13(SEQIDNO:11)的抗體或其輕鏈包括序列g(shù)L10(SEQIDNO:13)的抗體或包括CDR-Hl(SEQIDNO:5)、CDR-H2(SEQIDNO:6)、CDR-H3(SEQIDNO:7)、CDR-Ll(SEQIDNO:8)、CDR-L2(SEQIDNO:9)或CDR-L3(SEQIDNO:10)任一個(gè)的抗體與人IL-6的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所提供的交叉阻斷抗體抑制80%或更高，85%或更高，90%或更高，或95%或更高的132E09或其重鏈包括序列g(shù)H13(SEQIDNO:11)的抗體或其輕鏈包括序列g(shù)LIO(SEQIDNO:13)的抗體或包括CDR-Hl(SEQIDNO:5)、CDR-H2(SEQIDNO:6)、CDR-H3(SEQIDNO:7)、CDR-Ll(SEQIDNO:8)、CDR-L2(SEQIDNO:9)或CDR-L3(SEQIDNO:10)任一個(gè)的抗體與人IL-6的結(jié)合?？商鎿Q地或另外，根據(jù)本發(fā)明這一方面的中和抗體可以被本發(fā)明的任一抗體交叉阻斷以免與人IL-6結(jié)合。因此，還提供了對(duì)人IL-6具有特異性的中和抗體分子，其被抗體132E09或其重鏈包括序列g(shù)Hl3(SEQIDNO:11)的抗體或其輕鏈包括序列g(shù)LIO(SEQIDNO:13)的抗體或包括CDR-Hl(SEQIDNO:5)、CDR-H2(SEQIDNO:6)、CDR-H3(SEQIDNO:7)、CDR-L1(SEQIDNO:8)、CDR-L2(SEQIDNO:9)或CDR-L3(SEQIDNO:10)任一個(gè)的抗體交叉阻斷以免結(jié)合人IL-6。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明這一方面所提供的中和抗體80%或更高，85°/?；蚋撸?0%或更高，或95%或更高被132809或其重鏈包括序列8}113(SEQIDNO:11)的抗體或其輕鏈包括序列g(shù)LIO(SEQIDNO:13)的抗體或包括CDR-H1(SEQIDNO:5)、CDR-H2(SEQIDNO:6)、CDR-H3(SEQIDNO:7)、CDR-L1(SEQIDNO:8)、CDR-L2(SEQIDNO:9)或CDR-L3(SEQIDNO:10)任一個(gè)的抗體抑制以免結(jié)合人IL-6。本發(fā)明的抗體分子優(yōu)選對(duì)于人IL-6具有高結(jié)合親和性，優(yōu)選微微摩爾。可以使用本領(lǐng)域已知的任何合適方法來測量親和性，包括在此的實(shí)施例中所述的BIAcore。優(yōu)選，使用在此的實(shí)施例中所述的重組人IL-6來測量親和性。優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的抗體分子對(duì)于人IL-6具有低于500pM的親和性。優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的抗體分子對(duì)于人IL-6具有低于50pM的親和性。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體分子具有約1至約500pM的親和性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體分子具有約1至約50pM的親和性。優(yōu)選，本發(fā)明的抗體分子對(duì)于人IL-6具有約1至約20pM的親和性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體對(duì)于人IL-6具有8至12pM的親和性。將認(rèn)識(shí)到可以使用本領(lǐng)域已知的任何合適方法來改變本發(fā)明提供的抗體的親和性。因此，本發(fā)明還涉及本發(fā)明抗體分子的變體，其對(duì)于人IL-6具有提高的親和性。通過各種親和力成熟方案可以獲得這樣的變體，這些方案包括使CDR突變(Yang等，J.Mol.Biol.，392-403，1995)、鏈改組(Marks等，Bio/Technology，H，779-783，1992)、使用大腸桿菌的增變林(Low等，J.Mol.Biol.塁，359-368,1996)、DNA改組(Patten等，Curr.Opin.Biotechnol，！，724-733，1997)、噬菌體展示(Thompson等，J.Mol.Biol.,256，77-88，1996)和有性PCR(Crameri等，Nature,里，288-291，1998)。Vaughan等(上文)討論了這些親和力成熟的方法。本發(fā)明的抗體分子優(yōu)選中和IL-6活性，例如，在實(shí)施例中所述的體外和體內(nèi)測定中。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些抗體與人IL-6的位點(diǎn)3結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對(duì)人IL-6具有特異性的中和抗體，其能夠在低于100pM的濃度下抑制0.038nM人IL-650%的活性，所述抑制活性是基于IL-6誘導(dǎo)的T1165細(xì)胞增殖來測量的。在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制50%IL-6的抗體濃度為低于50pM,更優(yōu)選低于20pM。優(yōu)選，測定中所用的人IL-6是人重組IL-6。在一個(gè)實(shí)施方案中，中和抗體是人源化或完全人源性抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對(duì)人IL-6具有特異性的中和抗體，其能夠在低于lnM的濃度下抑制3.84nM人IL-650%的活性，所述抑制活性是基于HUVEC應(yīng)答人IL-6和sIL-6R的MCP-1產(chǎn)生所測量的。優(yōu)選，測定中所用的人IL-6是人重組IL-6。在一個(gè)實(shí)施方案中，中和抗體是人源化或完全人源性抗體。如果需要，根據(jù)本發(fā)明的抗體可以與一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)分子綴合。將認(rèn)識(shí)到，在一個(gè)實(shí)施方案中，效應(yīng)分子可以包括單個(gè)效應(yīng)分子或兩個(gè)或多個(gè)這樣的分子，使得連接形成可以與本發(fā)明的抗體連接的單個(gè)部分。在希望獲得與效應(yīng)分子連接的抗體片段的情況下，可以通過標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)或重組DNA方法來制備，其中將抗體片段直接或通過偶聯(lián)劑與效應(yīng)分子連接。將這樣的效應(yīng)分子與抗體綴合的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的(參見，Hellst謂等，ControlledDrugDelivery(受控藥物遞送)，第2版，Robinson等編輯，1987，pp.623-53;Thorpe等，1982，Immunol.Rev.,62:119-58和Dubowchik等，1999，PharmacologyandTherapeutics,83，67-123)。特定的化學(xué)方法包括，例如，W093/06231、92/22583、W089/00195、W089/01476和W003031581中所述的那些。或者，在效應(yīng)分子是蛋白質(zhì)或多肽的情況下，可以使用重組DNA方法實(shí)現(xiàn)連接，例如，如在WO86/01533和EP0392745中所述的。如在此所用的術(shù)語效應(yīng)分子包括，例如，抗腫瘤劑，藥物，毒素，生物活性蛋白，例如，酶，其他抗體或抗體片段，合成或天然產(chǎn)生的聚合物，核酸及其片段，例如，DNA,RNA及其片段，放射性核素，特別是放射性碘化物，放射性同位素，螯合金屬，納米顆粒和受體基團(tuán)，如熒光化合物或可以通過NMR或ESR光鐠學(xué)檢測的化合物。效應(yīng)分子的實(shí)例可以包括細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑，包括對(duì)細(xì)胞有害(例如，殺傷)的任何試劑。實(shí)例包括combrestatin、海兔毒素、埃博霉素、癌基因抑活藥、maytansinoid、根瘤菌素、軟海綿素、桿孢菌素、哈米特林、紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁、絲裂霉素、足葉乙甙、替尼泊苷、長春新堿、長春花堿、秋水仙素、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、普卡霉素、放線菌素D、l-脫氫睪酮、腎上腺糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、心得安和嘌呤霉素，及其類似物或同系物。效應(yīng)分子還包括，但不限于，抗代謝物(例如，甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥噪呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶達(dá)卡巴溱)，烷化劑(例如，二氯曱基二乙胺、thioepachlorambuci1、美法侖、卡氮芥(BSNU)和環(huán)己亞硝脲(CCNU)、cyclothosphamide、白消安、二溴甘露醇、鏈脲菌素、絲裂霉素C和順-二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)，蒽環(huán)類(例如，柔紅霉素(之前稱為道諾霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，更生霉素(之前稱為放線菌素)、博來霉素、光神霉素、氨茴霉素(AMC)、刺孢霉素或duocarmycin)以及抗有絲切割劑(例如，長春新堿和長春花堿)o其他效應(yīng)分子可以包括螯合的放射性核素，如min和，、Lu177、鉍213、锎252、銥192和鴒187錸188;或藥物，如但不限于，烷基磷酸膽堿、拓樸異構(gòu)酶I抑制劑、taxoid和蘇拉明。其他效應(yīng)分子包括蛋白質(zhì)、肽和酶。目標(biāo)酶包括，但不限于，蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶。目標(biāo)蛋白質(zhì)、多肽和肽包括，但不限于，免疫球蛋白，毒素，如相思豆毒素、篦麻毒素A、假單胞菌外毒素或白喉毒素，蛋白質(zhì)，如胰島素、腫瘤壞死因子、a-干擾素、p-干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子或組織血纖維蛋白溶酶原激活劑、血松形成劑或抗血管生成劑，例如，血管他丁或內(nèi)皮他丁，或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，如淋巴因子、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、神經(jīng)生長因子(NGF)或其他生長因子和免疫球蛋白。其他效應(yīng)分子可以包括例如可用于診斷中的可檢測物質(zhì)?？蓹z測物質(zhì)的實(shí)例包括各種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)、放射性核素、正電子發(fā)射金屬(用于正電子發(fā)射斷層掃描中)以及非放射性順磁性金屬離子。對(duì)于可以與抗體綴合用作診斷劑的金屬離子，總地參見美國專利US4，741，900。合適的酶包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基包括抗生物素蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白和生物素；合適的熒光物質(zhì)包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹酰氯和藻紅蛋白；合適的發(fā)光物質(zhì)包括魯米諾；合適的生物發(fā)光物質(zhì)包括螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；合適的放射性核素包括1251、131I、mIn和"Tc。在另一實(shí)施例中，效應(yīng)分子可以提高抗體在體內(nèi)的半衰期，和/i適的這種類型的^應(yīng)分j的實(shí)例包括聚合物、白蛋白:白蛋白、結(jié)合蛋白或白蛋白結(jié)合化合物，如在W005/117984(05年12月15日乂>開)中所述的。在效應(yīng)分子是聚合物的情況下，通?？梢允呛铣苫蛱烊淮嬖诘木酆衔?，例如，任選取代的直鏈或支鏈聚亞烷基、聚亞烯基或聚氧化亞烷基聚合物或支鏈或直鏈多糖，例如，同-或雜-多糖。可以存在于上述合成聚合物上的特定任選的取代基包括一個(gè)或多個(gè)羥基、甲基或甲氧基。合成聚合物的特定實(shí)例包括任選取代的直鏈或支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其是任選取代的聚(乙二醇)，如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。特定的天然存在的聚合物包括乳糖、直鏈淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。如在此所用的"衍生物"旨在包括反應(yīng)性衍生物，例如，巰基選擇性反應(yīng)基團(tuán)，如馬來酰亞胺等。反應(yīng)基團(tuán)可以直接或通過連接物區(qū)段與聚合物連接。將認(rèn)識(shí)到在一些情況中，這種基團(tuán)的殘基構(gòu)成產(chǎn)物的一部分，作為抗體片段與聚合物之間的連接基團(tuán)。按照需要，聚合物的大小可以不同，但通常為500Da至50000Da的分子量范圍，優(yōu)選5000至40000Da,更優(yōu)選20000至40000Da。特別地，可以基于產(chǎn)物的預(yù)期用途來選擇聚合物大小，例如，定位于某些組織如腫瘤的能力或延長循環(huán)半衰期(對(duì)于綜述，參見Chapman,2002，AdvancedDrugDeliveryReviews,54，531-545)。因此，例如，在打算使產(chǎn)物離開循環(huán)并滲透組織的情況下，例如，用于腫瘤的治療中，可以有利地使用小分子量的聚合物，例如，具有約5000Da的分子量。對(duì)于其中產(chǎn)物保留在循環(huán)中的應(yīng)用，可以有利地使用較高分子量的聚合物，例如，具有20000Da至40000Da的分子量。特別優(yōu)選的聚合物包括聚亞烷基聚合物，如聚(乙二醇)，或尤其是，曱氧基聚(乙二醇)或其衍生物，并且尤其是具有約15000Da至約40000Da的分子量。在一個(gè)實(shí)施例中，將用于本發(fā)明中的抗體與聚(乙二醇)(peg)部分連接。在一個(gè)特定實(shí)施例中，抗體是抗體片段，并且可以通過位于peg、分子，例如這J:團(tuán)為任何、;^離的氨::亞氨基^巰基、羥基或羧基。這樣的氨基酸可以在抗體片段中天然存在或可以使用重組DNA方法工程化至片段中(參見，例如，US5，219，996;US5，667，425;W098/25971)。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體分子是修飾的Fab片段，其中修飾是在其重鏈的C-端添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，使得可以連接效應(yīng)分子。優(yōu)選，附加的氨基酸形成含有一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸的效應(yīng)分子可以與其連接的修飾鉸鏈區(qū)。可以使用多個(gè)位點(diǎn)來連接兩個(gè)或多個(gè)peg分子。優(yōu)選，通過位于抗體片段中的至少一個(gè)半胱氨酸的巰基共價(jià)連接PEG分子。每個(gè)與修飾抗體片段連接的聚合物分子可以共價(jià)連接到位于該片段中的半胱氨酸殘基的硫原子上。共價(jià)連接通常是二硫鍵，或特別是，硫-碳鍵。在巰基用作連接點(diǎn)的情況下，可以使用適當(dāng)激活的效應(yīng)分子，例如，巰基選擇性衍生物，如馬來酰亞胺和半胱氨酸衍生物。激活的聚合物可以用作如上所述的聚合物修飾的抗體片段制備中的原料。激活的聚合物可以是含有巰基反應(yīng)基團(tuán)的任何聚合物，如a-卣代羧酸或酯，例如，碘乙酰胺，酰亞胺，例如，馬來酰亞胺，乙烯砜或二石危化物。這樣的原料可購得(例如，Nektar，之前為ShearwaterPolymersInc.,Huntsville，AL，USA)或可以使用常規(guī)化學(xué)方法從可購得的原料制備。特定的PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可從Nektar，之前為Shearwater;RappPolymere;和SunBio獲得)和M-PEG-SPA(可從Nektar,之前為Shearwater獲得)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是修飾的Fab片段或雙Fab，其是PEG化的，即，具有與其共價(jià)連接的PEG(聚(乙二醇))，例如，根據(jù)EP0948544或EP1090037中所述的方法[還可以參見"Poly(ethyleneglycol)Chemistry,BiotechnicalandBiomedicalApplications"(聚(乙二醇)化學(xué)、生物技術(shù)和生物醫(yī)藥應(yīng)用)，1992，J.MiltonHarris(編輯)，PlenumPress，NewYork，"Poly(ethyleneglycol)ChemistryandBiologicalApplications"(聚(乙二醇)化學(xué)和生物應(yīng)用)，1997，J.MiltonHarris和S.Zalipsky(編輯)，AmercianChemicalSociety,WashingtonDC和"BioconjugationProteinCouplingTechniquesfortheBiomedicalSciences"(生物醫(yī)藥科學(xué)的生物綴合蛋白偶聯(lián)技術(shù))，1998,M.Aslam和A.Dent,GrovePublishers,NewYork;Chapman,A.2002，AdvancedDrugDeliveryReviews2002，54:531-545]。在一個(gè)實(shí)施例中，PEG與鉸鏈區(qū)的半胱氨酸連接。在一個(gè)實(shí)施例中，PEG修飾的Fab片段具有共價(jià)連接修飾鉸鏈區(qū)中的單個(gè)巰基的馬來亞酰胺基團(tuán)。賴氨酸殘基可以共價(jià)連接馬來亞酰胺基團(tuán)，并且賴氨酸殘基上的每個(gè)胺基可以連接具有大約20，OOODa分子量的甲氧基聚(乙二醇)聚合物。因此，與Fab片段連接的PEG的總分子量可以為大約40，OOODa。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對(duì)人IL-6具有特異性的中和抗體分子，其是修飾的Fab片段，具有包括SEQIDN0:11所示序列的重鏈和包括SEQIDNO:13所示序列的輕鏈，并且在其重鏈的C-端具有含有至少一個(gè)半胱氨酸殘基的修飾鉸鏈區(qū)，效應(yīng)分子可以與其相連。優(yōu)選，效應(yīng)分子是PEG，并使用(W098/25971和WO2004072116)中所述的方法來連接，借此使賴酰氨-馬來亞酰胺基團(tuán)與重鏈C-端的半胱氨酸殘基連接，并且使賴酰氨殘基的每個(gè)氨基與具有約20，OOODa分子量的甲氧基聚(乙二醇)殘基共價(jià)連接。因此，與抗體的PEG連接的總分子量為大約40，OOODa。在另一個(gè)實(shí)施例中，可以使用國際專利申請(qǐng)WO2005/003169、W02005/003170和WO2005/003171中所述的方法使效應(yīng)分子與抗體片段連接。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明抗體分子的重鏈和/或輕鏈的分離DNA序列。優(yōu)選，DNA序列編碼本發(fā)明抗體分子的重鏈或輕鏈。本發(fā)明的DNA序列可以包括合成DNA，例如，通過化學(xué)方法、cDNA、基因組DNA或其任意組合來產(chǎn)生。DNA序列。例如，如果需要，可以從測定的DNA序列或基于相應(yīng)的氨基酸序列合成編碼一部分或全部抗體重鏈和輕鏈的DNA序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以廣泛獲得編碼受體框架序列的DNA，并可以基于已知的氨基酸序列來容易地合成。分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以用來制備編碼本發(fā)明抗體分子的DNA序列?？梢允褂霉押塑账岷铣杉夹g(shù)來完全或部分地合成所需的DNA序列。如果合適，可以使用定點(diǎn)誘變和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。合適DNA序列的實(shí)例提供于SEQIDN0:1;SEQIDNO:3;SEQIDNO:12;SEQIDNO:14;SEQIDNO:15和SEQIDNO:17。SEQIDNO:15中的核苷酸1-57和SEQIDNO:17中的核苷酸1-60編碼來自鼠抗體B72.3的信號(hào)肽序列(WhitUe等，1987，ProteinEng.1(6)499-505)，將其切割來獲得本發(fā)明的中和抗體分子。因此，本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明抗體重鏈的分離DNA序列，其包括SEQIDNO:15的核苷酸58-2008。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明抗體輕鏈的分離DNA序列，其包括SEQIDNO:17的核普酸61-705。本發(fā)明還涉及包括一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明DNA序列的克隆或表達(dá)載體。因此，提供了包括一個(gè)或多個(gè)編碼本發(fā)明抗體的DNA序列的克隆或表達(dá)載體。優(yōu)選，克隆或表達(dá)載體包括兩個(gè)DM序列，分別編碼本發(fā)明抗體分子的輕鏈和重鏈。優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的載體包括SEQIDNO:15和17的序列。SEQIDNO:15中的核苷酸1-57和SEQIDNO:17的核苷酸1-60編碼來自鼠抗體B72.3的信號(hào)肽序列，最優(yōu)選將其切割來獲得本發(fā)明的中和抗體分子。可以用來構(gòu)建載體的一般方法、轉(zhuǎn)染方法和培養(yǎng)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在這方面，參考"CurrentProtocolsinMolecularBiology"(分子生物學(xué)通用實(shí)驗(yàn)方案)，1999，F(xiàn).M.Ausubel(編輯)，WileyInterscience，NewYork和ColdSpringHarborPublishing生產(chǎn)的ManiatisManual。還提供了包括一個(gè)或多個(gè)克隆或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，這些載體包括一個(gè)或多個(gè)編碼本發(fā)明抗體的DNA序列?？梢允褂萌魏魏线m的宿主細(xì)胞/載體系統(tǒng)來表達(dá)本發(fā)明抗體分子的DNA編碼序列?？梢允褂眉?xì)菌，例如，大腸桿菌和其他微生物系統(tǒng)，或還可以使用真核生物，例如哺乳動(dòng)物的宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，參見Verma等，1998,JournalofImmunologicalMethods,216，165-181。合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括CH0、NS0、骨髓瘤或雜交瘤細(xì)胞。合適表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例包括WO87/04462中所述的谷氨酰胺合酶表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的抗體分子的方法，包括在適于從編碼本發(fā)明抗體分子的DNA表達(dá)蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)含有本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞，并分離抗體分子?？贵w分子可以只包括重鏈或輕鏈多肽，在該情況下，只需要使用重鏈或輕鏈多肽編碼序列來轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。對(duì)于包括重鏈和輕鏈兩者的產(chǎn)物的生產(chǎn)，可以用兩種栽體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，第一種栽體編碼輕鏈多肽，而第二種載體編碼重鏈多肽?；蛘?，可以使用單個(gè)載體，該栽體包括編碼輕鏈和重鏈多肽的序列。因?yàn)楸景l(fā)明的抗體可用于治療和/或預(yù)防病理狀況，所以本發(fā)明還提供了藥物或診斷組合物，其包含本發(fā)明的抗體分子和一種或多種藥物學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。因此，提供了本發(fā)明的抗體用于制備藥物的用途。通常作為無菌藥物組合物的一部分來提供組合物，該藥物組合物通常包括藥物學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的藥物組合物可以另外包括藥物學(xué)上可接受的助劑。本發(fā)明還提供了制備藥物或診斷組合物的方法，包括加入并混合本發(fā)明的抗體分子和一種或多種藥物學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。抗體分子可以是藥物或診斷組合物中的唯一活性成分或可以伴隨其他活性成分，包括其他抗體成分，例如，抗-TNF、抗-IL-ip、抗-T細(xì)胞、抗-IFNy或抗-LPS抗體，或非抗體成分，如黃嘌呤。藥物組合物優(yōu)選包括治療有效量的本發(fā)明的抗體。如在此所用的術(shù)語"治療有效量"指的是治療、緩解或預(yù)防目標(biāo)疾病或病癥需要的治療劑的量，或呈現(xiàn)出可檢測治療或預(yù)防效果需要的治療劑的量。對(duì)于任何抗體，最初可以在細(xì)胞培養(yǎng)物測定或動(dòng)物模型中估算治療有效量，所述動(dòng)物模型通常為嚙齒動(dòng)物、兔子、狗、豬或靈長類動(dòng)物。動(dòng)物模型還可以用來確定合適的濃度范圍和給藥途徑。然后這樣的信息可以用來確定人體內(nèi)的有用劑量和給藥途徑。對(duì)于人患者的確切治療有效量將取決于病態(tài)的嚴(yán)重程度，受治療者的一般健康，受治療者的年齡、體重和性別，飲食，給藥的時(shí)間和頻率，藥物組合，反應(yīng)敏感性以及對(duì)治療的耐受性/應(yīng)答。該用量可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定，并且在臨床醫(yī)師判斷的范圍內(nèi)。通常，治療有效量為0.01fflg/kg至50mg/kg，優(yōu)選0.lmg/kg至20fflg/kg。藥物組合物通?？梢猿尸F(xiàn)為含有預(yù)定含量的本發(fā)明的活性劑/劑的單位劑型?？梢詫⒔M合物單獨(dú)給藥于患者或可以與其他活性劑、藥物或激素聯(lián)合給藥(例如，同時(shí)、按次序或分開)。本發(fā)明的抗體分子的施用劑量取決于待治療病癥的性質(zhì)、存在的炎癥的程度以及抗體分子是預(yù)防使用還是用于治療已有的病癥。給藥頻率將取決于抗體分子的半衰期及其效果的持續(xù)時(shí)間。如果抗體分子具有短的半衰期(例如，2至10小時(shí))，則每天可能需要給予一劑或多劑?；蛘?，如果抗體分子具有長的半衰期(例如，2至15天或2至30天)，則可能只需要每天一次，每周一次或甚至每1個(gè)月或2個(gè)月一次給藥。藥物學(xué)上可接受的載體自身應(yīng)當(dāng)不會(huì)誘導(dǎo)對(duì)接受組合物的個(gè)體有害的抗體產(chǎn)生并且應(yīng)當(dāng)是沒有毒性的。合適的載體可以是大的、緩慢代謝的大分子，如蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)體、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和無活性的病毒粒子?？梢允褂盟幬飳W(xué)上可接受的鹽，例如，無機(jī)酸鹽，如氫氯化物、氬溴化物、磷酸鹽和硫酸鹽，或有機(jī)酸鹽，如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽和苯甲酸鹽。治療組合物中的藥物學(xué)上可接受的載體可以另外含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這樣的組合物中可以存在輔助物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑或pH緩沖物質(zhì)。這樣的載體能夠?qū)⑺幬锝M合物配制成片劑、丸劑、糖衣藥丸、膠嚢、液體、凝膠、糖漿、漿液和懸浮液，用于被患者攝取。給藥的優(yōu)選形式包括適于非腸道給藥的形式，例如，通過注射或灌輸，例如，通過快速濃注或連續(xù)灌輸。在產(chǎn)品是用于注射或灌輸?shù)那闆r下，可以采用油性或水性載體中的懸浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制劑，如懸浮劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，抗體分子可以是干燥形式，在使用前用合適的無菌液體重構(gòu)。一旦配制，本發(fā)明的組合物就可以直接給藥于受治療者。待治療的患者可以是動(dòng)物。然而，優(yōu)選組合物適于給藥于人受治療者?？梢酝ㄟ^多種給藥途徑來給予本發(fā)明的藥物組合物，包括，但不限于，口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、脊髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)過真皮、經(jīng)皮(例如，參見W098/20734)、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸、局部、舌下、陰道內(nèi)或直腸途徑。無針注射器也可以用來給予本發(fā)明的藥物組合物。通常，可以將治療組合物制成注射劑，如液體溶液或懸浮液。還可以制備適于在注射之前在液體載體中溶解或懸浮的固體形式。通常通過皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射，或遞送至組織的細(xì)胞間隙來實(shí)現(xiàn)組合物的直接遞送。還可以將組合物給藥至損傷中。劑量治療可以是單劑量計(jì)劃或多劑量計(jì)劃。將認(rèn)識(shí)到組合物中的活性成分是抗體分子。因而，它將易于在胃腸道中降解。因此，如果要使用胃腸道途徑來給予組合物，組合物將需要含有保護(hù)抗體以免降解，但一旦從胃腸道吸收便可釋放抗體的成分。藥物學(xué)上可接受栽體的全面討論可在Remington，sPharmaceuticalSciences(MarkPublishingCompany,N.L1991)中獲得。還設(shè)想可以通過使用基因治療來給予本發(fā)明的抗體。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，將合適DNA成分控制下的編碼抗體分子重鏈和輕鏈的DNA序列引入到患者中，使得從該DNA序列表達(dá)并就地裝配抗體鏈。本發(fā)明還提供了用于控制炎癥疾病的抗體分子。優(yōu)選，抗體分子可以用來減輕炎癥過程或預(yù)防炎癥過程。還提供了根據(jù)本發(fā)明的抗體分子用于治療和/或預(yù)防由IL-6介導(dǎo)的或與提高的IL-6水平相關(guān)的病理性疾病。本發(fā)明進(jìn)一步提供了根據(jù)本發(fā)明的抗體分子在制造治療和/或預(yù)防由IL-6介導(dǎo)的或與提高的IL-6水平相關(guān)的病理性疾病藥物中的用途。優(yōu)選，病理性疾病選自感染(病毒、細(xì)菌、真菌和寄生物)、與感染相關(guān)的內(nèi)毒素休克、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、全身發(fā)作幼年型特異性關(guān)節(jié)炎(JIA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、哮喘、骨盆炎癥疾病、阿爾茨海默氏病、節(jié)段性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、過敏性腸綜合征、卡斯?fàn)柭喜?、?qiáng)直性脊推炎、皮肌炎、葡萄膜炎、海綿體炎、乳糜瀉、膽嚢病、藏毛病、腹膜炎、牛皮癬、脈管炎、外科手術(shù)粘連、中風(fēng)、I型糖尿病、萊姆關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、免疫介導(dǎo)的中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥疾病(如多發(fā)性硬化和格-巴二氏綜合征)、其他自體免疫疾病、腮腺炎、外傷(外科手術(shù))、移植物抗宿主疾病、移植排異、癌癥(實(shí)體腫瘤，如黑素瘤、肝母細(xì)胞瘤、肉瘤、鱗狀上皮細(xì)胞癌、移行細(xì)胞癌、卵巢癌和血液性惡性疾病，特別是急性骨髓性白血病、慢性脊髓性白血病、胃癌和結(jié)腸癌)、心臟病(包括缺血性疾病，如心肌梗塞以及動(dòng)脈粥樣硬化)、血管內(nèi)血凝固、骨吸收、燒傷患者、骨質(zhì)疏松、牙周病和胃酸過少。優(yōu)選，病理性疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或系統(tǒng)性紅斑狼掩(SLE)。本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的抗體分子用于治療或預(yù)防疼痛。本發(fā)明進(jìn)一步提供了根據(jù)本發(fā)明的抗體分子在制造治療或預(yù)防疼痛的藥物中的用途。本發(fā)明的抗體分子可以用于需要降低IL-6在人體或動(dòng)物體內(nèi)作用的任何治療中。IL-6可以在體內(nèi)循環(huán)或可以以不良的高水平存在于體內(nèi)的特定部位，例如炎癥部位。優(yōu)選將本發(fā)明的抗體分子用于控制炎癥疾病。本發(fā)明還提供了治療患有由IL-6介導(dǎo)的疾病或處于由IL-6介導(dǎo)的疾病風(fēng)險(xiǎn)中的人或動(dòng)物受治療者的方法，該方法包括將治療有效量的本發(fā)明的抗體分子給藥于受治療者。本發(fā)明的抗體分子還可以用于診斷，例如，體內(nèi)診斷，以及用于涉及IL-6的疾病狀態(tài)的成像中。通過以下只是說明性的實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，實(shí)施例將參照附圖，其中圖1顯示了240.gl重鏈(圖2a;SEQIDNO:11)和輕鏈(圖2b;SEQIDNO:13)序列的嫁接設(shè)計(jì)。符號(hào)(I)突出顯示了供體受體嫁接的框架序列之間的差異。CDR是單下劃線的。這些按照Kabat來限定，除了CDR-Hl，其包括Kabat和Chothia限定。帶雙下劃線的序列是嫁接物中保留的供體框架殘基。圖2a顯示了240.glIgG4重鏈的翻譯序列，顯示了內(nèi)含子/外顯子邊界。圖2b顯示了240.gl輕鏈的翻譯序列，顯示了內(nèi)含子/外顯子邊界。圖3a顯示了抗體240，gl對(duì)人重組的、人哺乳動(dòng)物衍生的、恒河猴、彌猴和鼠IL-6誘導(dǎo)的T1165細(xì)胞增殖的抑制。圖3b顯示了抗體240.gl對(duì)HUVEC中人重組IL-6和sIL-6R誘導(dǎo)的MCP-1產(chǎn)生的抑制。圖3c顯示了抗體240.gl對(duì)HUVEC中IL-17誘導(dǎo)的內(nèi)源IL-6和sIL-6R誘導(dǎo)的MCP-1產(chǎn)生的抑制。圖4.通過給予CA030-240.gl(位點(diǎn)3抗體)體內(nèi)中和小鼠中hlL-6誘導(dǎo)的SAA，n-7-8/組，除了PBS，n=6。使用Bonferronipost測試通過ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與IL-6單獨(dú)相比較，"P〈0.01。"W橫舉和一疾才法將大腸桿菌菌林INVocF，(Invitrogen)用于轉(zhuǎn)化和常規(guī)培養(yǎng)生長。DNA卩艮制和修飾酶獲自RocheDiagnosticsLtd.和NewEnglandBiolabs。使用MaxiPlasmid純化試劑盒(QIAGEN，目錄號(hào)12165)進(jìn)行質(zhì)粒制備。使用ABIPrismBigDye終止測序試劑盒(目錄號(hào)4304149)進(jìn)行DNA測序反應(yīng)并在ABI3100自動(dòng)化測序儀(AppliedBiosystems)上運(yùn)行。使用AutoAssembler(AppliedBiosystems)程序分析數(shù)據(jù)。從INVITROGEN獲得寡核苷酸。在Entelechon構(gòu)建合成基因。使用裝配ELISA測定Fab和IgG的濃度。實(shí)施例1:132E09的分離以兩周的間隔皮下注射重《且人IL-6(Peprotech)來免疫大鼠，最初用弗氏完全佐劑，隨后用弗氏不完全佐劑。最后一次免疫后一至兩周收集脾臟，并制備單細(xì)胞懸浮液。在照射的鼠胸腺瘤EL4細(xì)胞和兔子T細(xì)胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基存在下在96孔微量滴定平板中培養(yǎng)免疫大鼠的淋巴細(xì)胞一周。在ELISA中篩選上清液中人IL-6特異性抗體的存在。進(jìn)一步在DS1細(xì)胞系測試中篩選陽性中和人IL-6的生物作用的能力(Bock等,1993，Cytokine,5，480-489)。根據(jù)選擇淋巴細(xì)胞抗體方法(Babcook等，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93，7843-7848;WO92/02551)從陽性微量滴定平板孔中分離分泌具有合適結(jié)合特征的抗體的單個(gè)B細(xì)胞，并且通過逆轉(zhuǎn)錄PCR從單個(gè)大鼠B細(xì)胞克隆重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。以重組IgG形式表達(dá)可變區(qū)來證實(shí)結(jié)合，并選擇132E09用于人源化和進(jìn)一步的研究。將大鼠可變區(qū)序列登記為CA030一00240。V-區(qū)序列顯示于SEQIDNO:1至4中。實(shí)施例2:132E09的CDR-嫁接設(shè)計(jì)一系列人源化VL和VH區(qū)，其中將CDR超變區(qū)加上來自132E09的不同數(shù)量框架殘基嫁接至人V-區(qū)受體框架上。設(shè)計(jì)十個(gè)嫁接的VL區(qū)(gLl-10)并通過寡核苷酸裝配和PCR突變來構(gòu)建基因。還使用兩個(gè)不同的框架區(qū)，VH31-43-"和VH31-33-H，總共構(gòu)建了13個(gè)嫁接的VH區(qū)(gHl-13)。將輕鏈嫁接的序列亞克隆至人輕鏈表達(dá)載體pKH10.1中，其含有編碼人C-K恒定區(qū)的DNA(Km3異型)。將重鏈嫁接的序列亞克隆至人Y-4表達(dá)載體pVhg仆FL中，其含有編碼人Y-4恒定區(qū)的DNA，該恒定區(qū)含有鉸鏈穩(wěn)定突變S241P(Angal等，上文)。將質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中并在IL-6結(jié)合和體內(nèi)測試中篩選產(chǎn)生的抗體的活性。使用Lipofectamine2000程序根據(jù)制造商的說明(InVUrogen，目錄號(hào)11668)進(jìn)行CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。產(chǎn)生的13個(gè)重鏈嫁接中，兩個(gè)只在位置49含有單個(gè)框架供體殘基(Ala)，并使用兩個(gè)不同的重鏈框架來產(chǎn)生這些。VH31-33-21嫁接在CHO細(xì)胞中表達(dá)很差并且顯示出降低的IL-6親和性。相反，使用VH31-43-72框架的嫁接表達(dá)很好并且保留了供體抗體的親和性。結(jié)合只轉(zhuǎn)染CDR了的輕鏈嫁接gLl0來選擇這種只包括單個(gè)供體框架殘基的重鏈嫁接。圖l顯示了供體大鼠序列132E09和受體人框架之間的比對(duì)。重鏈?zhǔn)荏w框架是人生殖系序列VH3l-33-72，具有來自人JH-區(qū)生殖系JH4該位置的框架4。輕鏈?zhǔn)荏w框架是人生殖系序列VK12-1-(1)012，具有來自人JK-區(qū)生殖系JK2該位置的框架4。gH13和gL10的嫁接序列顯示于圖1中(SEQIDNO:ll、12、13和14)。將該嫁接的抗體稱為CA030—00240.gl。作為如上所述的在位置241包括絲氨酸至脯氨酸置換的完整IgG4來產(chǎn)生這。完整翻譯的重鏈和輕鏈序列各自顯示于圖2a和2b中。SEQIDNO:16中提供了重鏈的氨基酸序列，而SEQIDNO:18中為輕鏈。SEQIDNO:15和17中各自提供了重鏈和輕鏈的DNA編碼序列。SEQIDNO:15和圖2a中的核苷酸1-57編碼了來自鼠抗體B72.3VH的信號(hào)肽序列，而SEQIDNO:17和圖2b中的核苷酸1-60編碼了來自鼠抗體B72.3VL的信號(hào)肽序列。鼠抗體B72.3描述于Whittle等中，1987，ProteinEng.1(6)499-505。實(shí)施例3:結(jié)合親和性，見M規(guī)^潛合#'歸量BIAcore技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)控了生物分子之間的結(jié)合而不需要標(biāo)記。相互作用物之一，稱為配體，直接固定或捕獲于固定的表面上，而另一個(gè)，稱為分析物，在溶液中流過捕獲的表面。傳感器檢測傳感器表面上的物質(zhì)改變，因?yàn)榉治鑫锝Y(jié)合配體在表面上形成復(fù)合物。這對(duì)應(yīng)于聚集過程。用緩沖液替代分析物時(shí)，監(jiān)控解離過程。在親和性BIAcore測試中，配體是CA030-00240.gl完整IgG4，并且分析物是人IL-6。儀器Biacore3000，BiacoreAB，Uppsala,Sweden傳感器芯片CM5(研究級(jí))，目錄號(hào)BR-1001-14,BiacoreAB，Uppsala,Sweden。將芯片保存在4°C。BIA標(biāo)準(zhǔn)化溶液70%(w/w)甘油。BIAmaintenance試劑盒目錄號(hào)的一部分BR-1002-51,BiacoreAB，Uppsala，Sweden。將BIAmaintenance試劑盒保存在4'C。胺偶聯(lián)試劑盒目錄號(hào)BR-1000-50,BiacoreAB,Uppsala，Sweden。乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)。在蒸餾水中制成75mg/mL并以200pL等份存儲(chǔ)在-70匸。N-羥基琥珀酸亞胺(NHS)。在蒸餾水中制成11.5mg/mL并以200jiL等份存儲(chǔ)在-70'C。1M鹽酸乙醇胺-NaOHpH8.5。以200jaL等份存儲(chǔ)在-70t:。緩沖液跑膠緩沖液HBS-EP(0.01MHEPESpH7.4，0,15MNaCl，3mMEDTA，0.005%表面活性劑P20)。目錄號(hào)BR-1001-88,BiacoreAB，Uppsala,Sweden。緩沖液存儲(chǔ)在4t:。固定緩沖液醋酸鹽5.0(IO慮醋酸鈉pH5.0)。目錄號(hào)BR-1003-51,BiacoreAB，Uppsala，Sweden。緩沖液存儲(chǔ)在4。C。配體捕獲AffinipureF(ab，)2片段山羊抗人IgG，F(xiàn)c片段特異性的。JacksonIm麵oResearchInc(Pennsylvania,USA)，目錄號(hào):109-006-098。試劑存儲(chǔ)在4°C。分析物重組人IL-6(R&DSystemsEuropeLtd,Abingdon,0xon。目錄號(hào)206-IL-050,批號(hào)A131402A)，存儲(chǔ)在-70"C，并且對(duì)于每次實(shí)驗(yàn)融化一次。通過CH0細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重組彌猴IL-6和重組恒河猴IL-6。以非純化且非定量的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液來使用該材料。再生溶液用蒸餾水從11.6M儲(chǔ)液(BDH，Poole，England。目錄號(hào)101254H)通過稀釋制備40mMHCl。用蒸餾水從50mM儲(chǔ)液通過稀釋制備5mMNaOH。目錄號(hào)BR-1003-58，BiacoreAB，Uppsala,Sweden。測試方法4吏用BIAcore3000(BIAcoreAB)進(jìn)行BIA(生物分子相互作用分析)。通過胺偶聯(lián)化學(xué)性質(zhì)將AffinipureF(ab，)2片段山羊抗人IgG,Fc片段特異性的(JacksonImmunoResearch)固定于CM5傳感器芯片上至《5000應(yīng)答單位(RU)的捕獲水平。將HBS-EP緩沖液(lOmMHEPESpH7.4，0.15MNaCl，3mMEDTA，0.005%表面活性劑P20，BIAcoreAB)用作跑膠緩沖液，使用10p1/min的流速。通過固定的抗人IgG-Fc將10ju14jug/mL的CA030-240.gl注射液用于捕獲。隨著30jul/niin流速的不同濃度的CA030-240.gl來滴定人IL-6。通過10jaL40mMHCl注射液，接著5pL5raM10jaL/min流速的NaOH注射液來再生表面。使用BIA評(píng)價(jià)軟件(3.2版本)按照標(biāo)準(zhǔn)方法分析背景底物結(jié)合曲線。從擬合算法測定動(dòng)力學(xué)參數(shù)。該研究中使用了一批CA030—240.gl。在20nM或4氐于20nM的人IL-6濃度測量親和性。測定的CA030-240.gl的親和性值在9.02-10.50pM范圍內(nèi)，平均±s.e.m.為9.76±0.74pM(表1.1)。4吏用固定于BIAcore芯片上的人IL-6是不可能測量親和性的，因?yàn)楣潭↖L-6導(dǎo)致了天然構(gòu)象的喪失。因?yàn)椴豢赡芏繌浐锘蚝愫雍颕L-6，因此也不可能測定它們與CA030-00240.gl相互作用的真實(shí)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。然而，結(jié)合感應(yīng)圖的目測表明CA030-00240.gl結(jié)合這些非人靈長類動(dòng)物的IL-6，具有與人IL一6相似的親和性。表l.l:CA030—240.gl對(duì)人IL-6的親和性<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>實(shí)施例5:體外中和測定使用兩種不同的測定來確定抗體CA030-00240.gl(此后縮寫成240.gl)的功效。第一種使用了鼠IL-6依賴性細(xì)胞系，稱為T1165，應(yīng)答鼠、恒河猴、彌猴和人IL-6而增殖。這種IL-6向細(xì)胞表面IL-6受體的直接信號(hào)傳導(dǎo)，連同稱為gpl30的信號(hào)傳導(dǎo)受體亞基稱為順式信號(hào)傳導(dǎo)。第二種測定使用了用人IL-6加可溶性IL-6受體(IL-6R)刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，讀出的是單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的產(chǎn)生。在該測定中，IL-6通過外源加入或可以通過用細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-17(IL-17)刺激HUVEC來產(chǎn)生。這兩種測定變型稱為反式信號(hào)傳導(dǎo)，因?yàn)镠UVEC沒有表達(dá)IL-6R，并且只有當(dāng)外源加入IL-6和可溶性IL-6R兩者時(shí)才能應(yīng)答即產(chǎn)生MCP-1。使用這些不同的測定，可以產(chǎn)生240.gl針對(duì)人(重組的和天然的)、恒河猴、彌猴和鼠IL-6的ND5Q(50%中和劑量)值。#辨培養(yǎng)基T1165培養(yǎng)基-RPMI1640，補(bǔ)充了10°/。胎牛血清、青霉素(IOO單位/ml)、鏈霉素(50jLig/ml)、谷氨酰胺(2mM)和10ng/ml人重組IL-6，R&Dsystems,UK。HUVEC培養(yǎng)基-大血管內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(LVECBM)TCSCellworks，UK，大血管內(nèi)皮細(xì)胞生長補(bǔ)充劑TCSCellworks，UK和抗生素補(bǔ)充劑TCSCellworks，l)K。在PBS中以6.83mg/ml的濃度在內(nèi)部產(chǎn)生CA03000240.gl。人IL-6R&Dsystems,UK，人哺乳動(dòng)物衍生的IL-6(用人IL-610017108/67的CHO轉(zhuǎn)染內(nèi)部衍生的)，恒河猴IL-6(用恒河猴IL-610017108/67的CHO轉(zhuǎn)染內(nèi)部衍生的)，彌猴IL-6(用彌猴IL-610017108/67的CHO轉(zhuǎn)染內(nèi)部衍生的)，鼠IL-6R&Dsystems,UK?？谷薓CP-1捕獲抗體(555055)和抗人MCP-1檢測抗體(554664)和人重組MCP-1(890225)，BDBiosciences,CA?？股锼氐鞍祖溇?HRP(AMDEX)Amershambioscience,UK。凝血酶MerckBiosciences,Darmstadt,Germany。sIL-6RR&Dsystems,UK。人IL-17R&Dsystems,UK。T1165測試-CellTUer96AQueousPromega，CA。TMBlue(Serologicals,GA)。炎y^77勿應(yīng)^/Z-f沐肅^;^崖^豸量W〃.活^在使用前4天將T1165細(xì)胞融化，并在補(bǔ)充10%FCS、抗生素、谷氨酰胺和10ng/ml人IL-6的RPMI1640中培養(yǎng)。使用錐蟲藍(lán)排除來監(jiān)控細(xì)胞生活力，只使用至少90%視為活的細(xì)胞。在使用前，將細(xì)胞在不存在人IL-6的RPMI1640中洗滌兩次。然后將細(xì)胞計(jì)數(shù)并以5x104細(xì)胞/孔的密度分配至96孔平板中。在分開的平板中，在lng/ml(0.038nM)固定濃度的人重組的、人哺乳動(dòng)物衍生的(也稱為人CHOIL-6)、恒河猴、彌猴或鼠IL-6的存在下孵育連續(xù)稀釋的"(J.gl。然后將預(yù)先混合的240.gl和IL-6的混合物轉(zhuǎn)移至含有T1165細(xì)胞的孔中，將其在潮濕的5%C02大氣中在37r孵育48小時(shí)。在孵育的最后六個(gè)小時(shí)中，加入20mlCellTiter96AQueous來測定增殖細(xì)胞的數(shù)量。將240.gl對(duì)T1165細(xì)胞的IL-6依賴性增殖的抑制表示為只用IL-6處理的孔減去含有細(xì)胞但不含有IL-6的對(duì)照孔的抑制百分比。可以在圖3a中看到240.gl針對(duì)人重組的、人哺乳動(dòng)物衍生的、恒河猴、彌猴和鼠IL-6誘導(dǎo)的細(xì)胞系T1165增殖的活性。240.gl有效地抑制了人重組的、人哺乳動(dòng)物衍生的、恒河猴、彌猴IL-6活性，但沒有抑制鼠IL-6活性。人重組IL-6的ND50為1.1±0.5ng/ml(7.26±3.3pM)。人哺乳動(dòng)物衍生的IL-6的ND50為3.6±2.4ng/ml(23.76±15.84pM)。恒河猴IL-6的ND50為2.2±1.lng/ml(14.52+7.26pM)。彌猴IL-6的ND50是5,4土1.lng/ml(35.64±7.26pM)。炎^/Z-f希f漆遂/Z-6#<7MC詐^#<^-/Z^4Wf風(fēng)^活#將HUVEC(TCSCellworks，UK)生長于大血管內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(LVECBM)中，并在培養(yǎng)物中傳代不超過五次。在使用前使細(xì)胞生長直至75%匯合。使用胰蛋白酶/EDTA使細(xì)胞分離，在新鮮LVECBM中重懸浮并洗滌一次。然后將細(xì)胞計(jì)數(shù)并以2x104細(xì)胞/孔的密度分配至96孔平底平板中。然后將細(xì)胞在潮濕的5%C02大氣中在37。C培養(yǎng)過夜。第二天，將細(xì)胞在補(bǔ)充生物素化的凝血酶(3U/ml)的新鮮培養(yǎng)基中洗滌，并放在一邊。在分開的平板中，在人重組IL-6(50ng/ml;3.84nM)和500ng/ml(10.15nM)固定濃度的sIL-6R存在下孵育連續(xù)稀釋的240.gl。此外，還用刺激HUVEC產(chǎn)生IL-6的人重組IL-17(25ng/ml;1.18nM)和500ng/ml(10.15nM)固定濃度的sIL-6R孵育了240.gl。然后將預(yù)先混合的240.gl和IL-6/sIL-6R或IL-17/sIL-6R復(fù)合物轉(zhuǎn)移至含有HUVEC的孔中，將其在潮濕的5%C02大氣中在37X:孵育24小時(shí)。孵育階段后，收集無細(xì)胞上清液并通過夾層ELISA測定人MCP-1水平(下文中給出實(shí)驗(yàn)方案)。將240.gl對(duì)IL-6/sIL-6R或IL-17/sIL-6R誘導(dǎo)的MCP-1產(chǎn)生的抑制表示為用IL/sIL-6R或IL-1VsIL-6R處理的孔減去含有細(xì)胞但不含有刺激物的對(duì)照孔的抑制百分比。此外，加入對(duì)照以表明在不存在sIL-6R情況下細(xì)胞對(duì)加入人IL-6的應(yīng)答。鮮-/M，用2ing/ml濃度的抗MCP-1捕獲抗體覆蓋NuncMaxisorp平板。將平板在+4。C孵育過夜，然后在PBS加0.1%吐溫20(洗滌緩沖液)中洗滌兩次。將平板在PBS加5%牛血清白蛋白中阻斷1小時(shí)。然后用洗滌緩沖液將平板洗滌四次，并加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。將平板在室溫孵育兩小時(shí)。然后將平板洗滌并加入濃度為lmg/ml的生物素化抗-MCP-l抗體。將平板再孵育2小時(shí)，然后洗滌四次。然后加入1:5000稀釋度的抗生物素蛋白鏈菌素-HRP，并將平板孵育30分鐘。將平板洗滌最后四次并加入TMB底物。在630nm進(jìn)行比色讀數(shù)，在492nm進(jìn)行背景讀數(shù)。在GenesisII軟件上使用四參數(shù)邏輯曲線擬合從標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生MCP-1濃度?？梢栽趫D3b中看到HUVEC中240.gl針對(duì)人重組IL-6和sIL-W誘導(dǎo)的反式信號(hào)傳導(dǎo)的活性。240.gl有效地抑制了人重組IL-6和sIL-6R誘導(dǎo)的HUVEC的MCP-1產(chǎn)生。ND50為64士62ng/ml(422±409pM)?？梢栽趫D3c中看到HUVEC中240.gl針對(duì)IL-17誘導(dǎo)的內(nèi)源IL-6和sIL-6R誘導(dǎo)的順式信號(hào)傳導(dǎo)的活性。240.gl有效地抑制了IL-17誘導(dǎo)的內(nèi)源IL-6和sIL-6R誘導(dǎo)的HUVEC的MCP-1產(chǎn)生。ND50為93±70ng/ml(614±462pM)。錯(cuò)論240.gl能夠中和人重組的、人哺乳動(dòng)物衍生的、恒河猴和彌猴IL-6在IL-6順式信號(hào)傳導(dǎo)測定中的生物活性，但不能中和鼠IL-6。此外，240.gl可以中和重組或內(nèi)源IL-6誘導(dǎo)的IL-6反式信號(hào)傳導(dǎo)。實(shí)施例6:體內(nèi)活性已知IL-6誘導(dǎo)急性期蛋白。在小鼠中，最突出的急性期蛋白是血清淀粉狀蛋白A(SAA)。人IL-6能夠作用于鼠受體，因此可以將人IL-6注射至小鼠中，并測量血清中的SAA產(chǎn)生。給Balb/c小鼠s.c.注射位點(diǎn)3特異性抗hlL-6抗體，CA030—240.gl完整IgG4。24小時(shí)后，給小鼠腹膜內(nèi)注射30pg/kg的hlL-6(Peprotech目錄號(hào)200-06，批號(hào)0203B16)。20小時(shí)后，通過心臟穿刺采血，并收集血清，用于通過ELISA(Tridelta，批號(hào)2MT022)來確定血清淀粉狀蛋白A(SAA)。如圖4中所述的，CA030—240.gl抑制了hlL-6的SAA誘導(dǎo)，注意到在0.3、0.1和0.03mg/kg的劑量，SAA在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低。11=7-8/組，除了PBSn=6。使用Bonfer訓(xùn)ipost測試通過A,A進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與IL-6單獨(dú)相比較。"P<0.01。兩個(gè)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了0.3和0.lmg/kg劑量的CA030-240.gl顯著抑制了IL-6(30pg/kg)誘導(dǎo)的SAA。實(shí)施例7:CA030-00240.gl抗原決定部位作圖使用NMR技術(shù)將人IL-6上CA030-00240.gl識(shí)別的抗原決定部位作圖，使用240.gl作為Fab，片段。這需要在大腸桿菌中表達(dá)人IL-6,并用15N/13C/2H穩(wěn)定同位素來統(tǒng)一標(biāo)記。對(duì)于游離的IL-6，獲得完整的序列特異性主鏈共振分配，并使用3DTROSYHNCO光譜檢測了通過CA030-00240.gl的Fab'片段的結(jié)合誘導(dǎo)的這些信號(hào)位置的改變。f效入種》這和趁必從含有蛋白成熟形式的編碼序列的大腸桿菌表達(dá)載體(pET3d)制備人IL-6。在Tuner(DE3)pLysS細(xì)胞中表達(dá)蛋白，獲得高產(chǎn)量的不溶性產(chǎn)物。從生長于合適標(biāo)記的富集培養(yǎng)基(Celtone)上的細(xì)胞制備15N、"N/"C和"N尸C尸H標(biāo)記的IL-6樣品。使用公知的程序從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞純化IL-6。最初，將從1升培養(yǎng)基中收獲的細(xì)胞重懸浮于40mL緩沖液A中[100mMKC1，2mMDTT，10mMTris-HClpH8.5，25%(w/v)蔗糖，溶解的蛋白酶抑制劑片(Boehringer)]。加入lOmL緩沖液B[300mMTris-HClpH8.5，lOOmMEDTA，4mg/ml溶菌酶]并將懸浮液在水上孵育10-30分鐘，偶爾攪拌一下。然后加入50ml緩沖液C[1MLiCl，20mMEDTA，0.5%(v/v)NP-40]，并將懸浮液通過20，OOOpsi的弗氏壓碎器(FrenchPress)兩次。然后將勻漿在16，000grpm4"C離心15分鐘，并保留沉淀。將沉淀重懸浮于40ml緩沖液D中[10mMTris-HClpH8.5，0.lmMEDTA，0.5MLiCl，0.5%(v/v)NP-40，lmMDTT,溶解的蛋白酶片]，并與之前一樣通過弗氏壓碎器和離心。重復(fù)該過程。然后將沉淀重懸浮于40ml緩沖液E中[10mMTris-HClpH8.5，0.lmMEDTA，0.5%(v/v)NP-40，lmMDTT，溶解的蛋白酶片]，并與之前一樣通過弗氏壓碎器和離心。重復(fù)該過程。將最后的沉淀溶解于6mL6MGuHCl,50mMTris-HClpH8.0中，并在48，000g在41C離心30分鐘。保留上清液，并通過分光光度來定量溶解的IL-6。將溶解的IL-6稀釋于2.5mg/mL的5MGuHCl,50mMNaCl，50mMTris-HCl,2mMGSH，0.2mMGSSG，lmMEDTA，pH8，0，并在25。C孵育1小時(shí)。然后將樣品進(jìn)一步以逐滴的方式稀釋至250jLig/mL的50mMNaCl，50mMTris-HCl，2mMGSH,0.2mMGSSG,lmMEDTA，pH8.0并在25"C孵育3小時(shí)。通過在30，OOOg在4TC離心30分鐘來除去該階段中形成的任何沉淀。將澄清的物質(zhì)對(duì)50mMTris-HCl，10%(v/v)甘油，pH9.0滲析，在4X:持續(xù)最少16小時(shí)，換兩次緩沖液。滲析后，通過在30，000g在4X:離心30分鐘來澄清溶液。保留上清液，并裝載于8mLmonoQ(AmershamBiosciences)離子交換柱上，并用線性梯度的氯化鈉(0-1.0M)洗脫。通過SDS-PAGE鑒定含有再折疊的IL-6的級(jí)分，然后合并并稀釋于25mM磷酸鈉，100mMNaCl，0.01%(w/v)NaN"pH6.5中。產(chǎn)生CA030-00240.gl的Fab，片段，純化并配制于25mM磷酸鈉，100mMNaCl，0.01%(w/v)NaN3，pH6.5中。制備IL-6和CA030—00240.glFab，片段的1:1復(fù)合物，通過混合等摩爾量濃度為0.2-0.6aiM的蛋白質(zhì)用于NMR分析。對(duì)0.35ml蛋白樣品和pH6.5的25mM磷酸鈉、100mM氯化鈉和0.01%(w/v)疊氮化鈉緩沖液(95°/出20和5%D20)中的復(fù)合物進(jìn)行NMR實(shí)驗(yàn)。制備"N/"C,H標(biāo)記的IL-6和未標(biāo)記的CA030-00240.glFab，片段的1:1復(fù)合物，通過混合等摩爾量的蛋白質(zhì)來獲得0.lmM的終濃度，用于NMR分析。于25"C對(duì)于游離IL-6和對(duì)于IL-6:CA030-00240.glFab，片段的復(fù)合物，在裝配了三重共振("N/"C,H)冷凍探針的800MHzBrukerAvance分光計(jì)上獲取NMR數(shù)據(jù)。^f吏用標(biāo)準(zhǔn)HNCACB、CBCA(CO)NH和HNCO光鐠(Wittekind，M.和Mueller，L.(1993)/他^2)eso/3，系歹寸B101(2)，201;Grzesiek，S.和Bax，A.(1993)/^/o依o/3(2)，185-204;Muhandiram,D.R.和Kay，L.E.(1994)/船g"We^/，系歹寸B103(3)，203;Grzesiek,S.和Bax，A.(1992)/yl/a^7yew力96(2)，432)來制備游離IL-6的完整序列特異性主鏈共振分配(15N，"C和110，使用0.9mM15N/13C均勻標(biāo)記的樣品。使用3DTR0SYHNC0光鐠檢測由CA030-00240.glFab，片段結(jié)合誘導(dǎo)的IL-6主鏈信號(hào)位置的改變(Salzmann，M.等(1998)ProcNatlAcadSciUSA95(23)，13585-13590)。表1中提供了用于所有3DNMR實(shí)驗(yàn)的典型獲取參數(shù)。使用NMRPipe處理所有光鐠(Delaglio，F(xiàn).等，(1995)JBiomolNMR6(3)，277-293)，使用線性預(yù)測將3D數(shù)據(jù)的15N維度中的有效獲取時(shí)間延長至約30ms。在所有維度中使用中等的分辨率增強(qiáng)，使用位移正弦平方函數(shù)。使用Sparky進(jìn)行光鐠的分析(Goddard，T.D.和Kneller，D.G.SPARKY3.In.，加利福尼亞大學(xué)，舊金山)。Fab結(jié)合數(shù)據(jù)的分析使用最小位移方法(Farmer,B.T.等，(1996)NatStructMolBiol3(12),995;Muskett,F,W.等，(1998)JBiolChem273(34)，21736-21743)來測定由CA030-00240.glFab，片段結(jié)合引起的IL-6NMR信號(hào)位置的改變。最初，在它們中心挑選出游離IL-63DHNCO光語和結(jié)合gl32E09Fab的IL-63DTR0SYHNC0光譜中的所有峰。對(duì)于復(fù)合物和游離蛋白質(zhì)光譜之間的溫度差異來校正15N和化學(xué)位移值(對(duì)于15N未-O.8ppm，對(duì)于'H為-O.05ppm)(Baxter,N.J.和Williamson,M.P.(1997)/5/,/順9(4)，359-369)。通過使用MicrosoftExcel來計(jì)算15N、13C和'H結(jié)合的化學(xué)位移差異來獲得游離和Fab結(jié)合的IL-6之間峰位置的最小改變，用于將游離蛋白質(zhì)的HNCO光語中的每個(gè)指定峰與Fab復(fù)合物的TR0SY-HNC0光語中觀察到的所有峰相比較。根據(jù)以下公式(公式1)來定義結(jié)合的酰胺質(zhì)子、氮和碳化學(xué)位移差異(△5)，其中A5HN、△"和△5。對(duì)應(yīng)于比較的HNCO峰對(duì)之間的屮、"N和"C位移的差異，并且ou和ctc是說明酰胺質(zhì)子、酰胺氮和碳化學(xué)位移范圍差異需要的0.2和0.33的換算系數(shù)。對(duì)于每個(gè)單獨(dú)的HNC0峰，按照最低可能的結(jié)合的位移值(△5)來獲得Fab結(jié)合誘導(dǎo)的最小位移。A3=V(A^J+(A《w'"J+(A&aJ(公式1)為了鑒定IL-6上的Fab結(jié)合位點(diǎn)(抗原決定部位)，將結(jié)合的最小位移對(duì)蛋白質(zhì)序列的柱狀圖用來揭示含有顯著紊亂信號(hào)的IL-6片段。如果對(duì)于單個(gè)氨基酸的合并的化學(xué)位移改變的大小超過了所有氨基酸合并的化學(xué)位移改變的平均極限值加該平均值的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差，選擇這些殘基進(jìn)一步評(píng)價(jià)為Fab結(jié)合位點(diǎn)中可能接觸的殘基。最后在高分辨率的IL-6結(jié)構(gòu)上檢測候選結(jié)合位點(diǎn)殘基的位置(Xu，G.Y.等(1997)/W5/'o/268(2)，468-481)，并且只有位于蛋白質(zhì)表面的殘基被認(rèn)為是Fab結(jié)合可利用的。使用兩個(gè)不同的極限來鑒定Fab結(jié)合的殘基，平均最小位移+lSD(0.143)和平均最小位移+2SD(0.213)。發(fā)現(xiàn)抗體的結(jié)合位點(diǎn)包括Trpl57的關(guān)鍵位點(diǎn)3信號(hào)殘基(Boulanger等，2003，Science,300，2101-2104)。使用上文中Boulanger等所用的氨基酸編號(hào)，發(fā)現(xiàn)抗體240gl至少結(jié)合以下的殘基(平均+2SD(0.213))S47、C50、E93、R104、F105、E106、T149、K150、A153、Q156、Q159和S169。抗體可以結(jié)合以下所有的殘基(平均+lSD(0.143))C44、S47、C50、S53、A58、E93、V96、R104、F105、E106、T149、K150、Q152、A153、Q154、N155、Q156、W157、Q159、T163、L165、S169和E172。將認(rèn)識(shí)到還可以基于未加工的IL-6前體的氨基酸編號(hào)來將相同的殘基編號(hào)(SwissProt登錄號(hào)P05231)。使用該編號(hào)，抗體240g.1至少結(jié)合以下的殘基S75、C78、E121、R132、F133、E134、T177、K178、A181、Q182、Q187和S197。抗體可以結(jié)合以下所有的殘基C72、S75、C78、S81、A86、E121、V124、R132、F133、E134、T177、K178、,0、A181、Q182、N183、Q184、W185、Q187、T191、L193、S197和E200。表1:NMR實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>使用14ppm的掃描寬度和85ms的獲取時(shí)間來獲得直接的^測定(W或")。當(dāng)然可以理解只是通過實(shí)施例描述了本發(fā)明，而決不意味著限制，并且可以進(jìn)行細(xì)節(jié)的改變，而在此后權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本發(fā)明每個(gè)實(shí)施方案的優(yōu)選特征加以必要的改變同樣適用于其他各個(gè)實(shí)施方案。本說明書中引用的所有出版物，包括但不限于專利和專利申請(qǐng)，均在此引入作為參考，如同每個(gè)出版物具體并單獨(dú)表示在此引入作為參考一樣，好象全部列出一樣。權(quán)利要求1.對(duì)人IL-6具有特異性并包括重鏈的中和抗體，其中所述重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有SEQIDNO5所示CDR-H1序列的CDR，具有SEQIDNO6所示CDR-H2序列的CDR和具有SEQIDNO7所示CDR-H3序列的CDR中的至少一個(gè)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的中和抗體，其中重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括SEQIDNO:5所示的CDR-H1序列，SEQIDNO:6所示的CDR-H2序列和SEQIDNO:7所示的CDR-H3序列。3.對(duì)人IL-6具有特異性并包括輕鏈的中和抗體，其中所述輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有SEQIDNO:8所示CDR-L1序列的CDR，具有SEQIDNO:9所示CDR-L2序列的CDR和具有SEQIDNO:10所示CDR-L3序列的CDR中的至少一個(gè)。4.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的中和抗體，另外包括輕鏈，其中所述輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有SEQIDNO:8所示CDR-L1序列的CDR，具有SEQIDNO:9所示CDR-L2序列的CDR和具有SEQIDNO:10所示CDR-L3序列的CDR中的至少一個(gè)。5.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4的中和抗體，其中所述輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括SEQIDNO:8所示的CDR-L1序列，SEQIDNO:9所示的CDR-L2序列和SEQIDNO:10所示的CDR-L3序列。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的抗體，其中所述重鏈包括序列g(shù)H13(SEQIDNO:11)。7.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的抗體，其中所述輕鏈包括序列g(shù)LIO(SEQIDNO:13)。8.對(duì)人IL-6具有特異性并具有包括序列g(shù)H13(SEQIDNO:11)的重鏈和包括序列g(shù)LIO(SEQIDNO:13)的輕鏈的中和抗體。9.對(duì)人IL-6具有特異性的中和抗體，其中所述輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有與權(quán)利要求8抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域至少60%同一性或相似性的序列，并且其中所迷重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括具有與權(quán)利要求8抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域至少60%同一性或相似性的序列。10.對(duì)人IL-6具有特異性并具有包括SEQIDNO:2所示序列的重鏈和包括SEQIDNO:4所示序列的輕鏈的中和抗體。11.對(duì)人IL-6具有特異性并具有包括SEQIDN0:16所示序列的重鏈和包括SEQIDNO:18所示序列的輕鏈的中和抗體。12.對(duì)人IL-6具有特異性的中和抗體，其中重鏈和輕鏈與權(quán)利要求11抗體的相應(yīng)重鏈和輕鏈為至少60%相同或相似。13.具有500pM或更高的對(duì)人IL-6的結(jié)合親和性的人源化或完全人中和抗體。14.具有50pM或更高的對(duì)人IL-6的結(jié)合親和性的人源化、完全人或嵌合中和抗體。15.人IL-6上被權(quán)利要求8的抗體結(jié)合的抗原決定部位。16.根據(jù)權(quán)利要求15的抗原決定部位，包括人IL-6的氨基酸殘基S47、C50、E93、R104、F105、E106、T149、K150、A153、Q156、Q159和S169。17.根據(jù)權(quán)利要求16的抗原決定部位，包括氨基酸殘基S47、C50、E93、R104、F105、E106、T149、K150、A153、Q156、Q159和S169以及一個(gè)或多個(gè)選自C44、S53、A58、V96、Q152、Q154、N155、W157、T163、L165和E172的殘基。18.對(duì)人IL-6具有特異性的人源化、完全人或嵌合中和抗體，其與權(quán)利要求15、權(quán)利要求16或權(quán)利要求17的抗原決定部位結(jié)合。19.對(duì)人IL-6具有特異性的人源化、完全人或嵌合中和抗體，其交叉阻斷權(quán)利要求8的抗體與人IL-6的結(jié)合或被權(quán)利要求8的抗體交叉阻斷以免結(jié)合人IL-6。20.對(duì)人IL-6具有特異性的中和抗體，其能夠在低于100pM的濃度下抑制0.038nM人IL-650%的活性，所述抑制活性是基于IL-6誘導(dǎo)的T1165細(xì)胞增殖來測量的。21.對(duì)人IL-6具有特異性的中和抗體，其能夠在低于lnM的濃度下抑制3.84nM人IL-650%的活性，所述抑制活性是基于HUVEC應(yīng)答人IL-6和sIL-6R的MCP-1產(chǎn)生所測量的。22.根據(jù)權(quán)利要求20或權(quán)利要求21的中和抗體，其交叉阻斷權(quán)利要求8的抗體與人IL-6的結(jié)合。23.根據(jù)權(quán)利要求19-22任一項(xiàng)的抗體，其具有50pM或更高的對(duì)人IL-6的結(jié)合親和性。24.編碼根據(jù)權(quán)利要求1至14或18-23任一項(xiàng)抗體的重鏈和/或輕鏈的分離DNA序列。25.根據(jù)權(quán)利要求24的分離DNA序列，其中所述編碼重鏈的DNA序列包括SEQIDNO:12或SEQIDNO:15中所示的序列或SEQIDNO:15的核苷酸58-2008。26.根據(jù)權(quán)利要求24的分離DNA序列，其中所述編碼輕鏈的DNA序列包括SEQIDNO:14或SEQIDNO:17所示的序列或SEQIDNO:17的核苷酸61-705。27.包括一個(gè)或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求24-26任一項(xiàng)的DM序列的克隆或表達(dá)載體。28.根據(jù)權(quán)利要求27的栽體，其中所述載體包括SEQIDNO:15中所示的序列和SEQIDN0:17中所示的序列。29.包括一個(gè)或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求27或權(quán)利要求28的克隆或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。30.對(duì)人IL-6具有結(jié)合特異性的抗體的生產(chǎn)方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求29的宿主細(xì)胞并分離抗體。31.藥物組合物，包含權(quán)利要求1至14或18-23任一項(xiàng)的抗體，結(jié)合一種或多種藥物學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。32.根據(jù)權(quán)利要求31的藥物組合物，另外包含其他活性成分。33.根據(jù)權(quán)利要求1至14或18-23任一項(xiàng)的抗體或根據(jù)權(quán)利要求31或權(quán)利要求32的藥物組合物，用于治療或預(yù)防由IL-6介導(dǎo)的，或與提高的IL-6水平相關(guān)的病理性疾病。34.具有500pM或更高的對(duì)人IL-6的結(jié)合親和性的人源化或完全人中和抗體在制造治療或預(yù)防由IL-6介導(dǎo)的或與提高的IL-6水平相關(guān)的病理性疾病的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及具有IL-6抗原決定簇特異性的抗體分子，該抗體分子的治療用途和所述抗體分子的生產(chǎn)方法。文檔編號(hào)C07K16/24GK101356194SQ200680050784公開日2009年1月28日申請(qǐng)日期2006年12月4日優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日發(fā)明者A·G·波普魯維爾,M·C·辛格哈爾,R·E·戈里納斯,R·亞當(dāng)斯,Y·張申請(qǐng)人:Ucb醫(yī)藥有限公司