提高生產率的蛋白因子、新穎細胞系和其應用的制作方法

專利名稱：提高生產率的蛋白因子、新穎細胞系和其應用的制作方法
提高生產率的蛋白因子、新穎細胞系和其應用
本發明提供用其基因組穩定地整合了編碼特定異源調節蛋白的 基因的有效表達細胞系來制備非腺病毒靶病毒或靶蛋白的方法。
背景技術：
來自真核細胞的生物藥物制品是現代醫藥的組成部分。然而， 增加生產率和提高安全性是仍需要實質性優化的重要參數。在優化 努力中的最主要的瓶頸就是細胞基質本身。能夠被導入已準許用于 生物制藥方法的細胞系以提高來自這樣的操作細胞的產物之產率的 安全轉基因極為有價值。
腺病毒為感染廣謙動物的非包膜(棵露)雙鏈DNA病毒。最好的 已表征成員中有人腺病毒血清型5 (Ad5)。所述病毒為感冒癥狀的常 見病因，感染通常發生在孩童時期。
可以對腺病毒進行遺傳操作，復制缺陷的腺病毒，包括Ad5 (其 序列的GenBank登錄號為AC—000008),被用作基因治療和治療性 疫苗接種用的載體。為了得到復制缺陷病毒，基因組DNA的很大的 區域被非病毒序列置換。喪失的病毒功能由用載體中所缺失基因穩 定轉染的宿主細胞系以反式來提供。開發的早期系統之一由腺病毒 載體組成，該載體缺失細胞系上產生的提供相應El蛋白的調節El 區。
用于該目的的最普通的細胞系為293細胞系。該細胞系于1977 年通過將片段化的腺病毒基因組DNA轉染到原代人細胞中而產生 (Graham等,J. Gen, Virol. 36, 59-74 (1977)),在此之前很久人們認識 到可將腺病毒用作基因治療載體。隨后證明所得到的細胞系含有包 括El區在內的基因組DNA的核苦酸1-4344 (Louis等，Virology 233，423-429 (1997));這一表征證明El區可用于使原代細胞無限增殖化和 轉化。
鄰近E1區的是pIX的基因("蛋白9";在基因組DNA中為核苦酸 3609-4031)。 pIX的啟動子植埋于El區的E1B組分內。稱為啟動子封 堵的機制允許pIX在病毒感染周期病毒DNA復制開始的延遲早期表 達，同時病毒DNA拷貝數量增加(Fessler和Young， J. Virol. 72， 4049-4056 (1998))。盡管該基因存在于已整合入293細胞中的4344個 核苷酸內，但即使用靈敏的放射性標記方法也不能檢測到pIX表達 (Spector等，J. Virol. 36， 860-871(1980》。
如上所述，業已通過使病毒基因組缺失El區產生了復制缺陷型 腺病毒載體。El產物對病毒復制必不可少，因此，El區功能必須通 過腺病毒包裝細胞(例如293細胞系)中的穩定El轉基因以反式來提 供。由于pIX基因接近El區，因而pIX基因導致在缺失型腺病毒載 體和宿主基因組中的El之間頻繁重組。這種重組事件產生復制型腺 病毒(RCA),對于載體制備而言這是嚴重的污染。為了抑制這種重組 事件，使pIX從腺病毒基因組缺失。在這些實驗進程中，認識到pIX 通過增加主要結構單元六鄰體的相互作用而使腺病毒衣殼對熱應激 和空間應激穩定(Colby和Shenk， J. Virol. 39, 977-980 (1981); Ghosh-Choudhury等，EMBO J. 6， 1733-1739 (1987))。在缺失pIX情 況下的形態發生產生溫度敏感型病毒，這種病毒不能遞送大于野生 型35938個堿基對的105。/。的基因組DNA分子。為了仍允許具有正常 的包裝能力和熱穩定性，將pIX蛋白穩定導入計劃作為腺病毒載體的 包裝細胞的細胞系(Krougliak和Graham, Hum. Gene Ther. 6, 1575-1586 (1995); WO 99/57296和Imler等，Gene Therapy 3， 75-84 (1996》。
隨著認識到pIX修飾病毒粒子表面，業已產生pIX-融合蛋白，目 的是擴大腺病毒載體的宿主范圍，或了解病毒粒子的形態發生和細 胞內遷移(由Parks綜述，Mol. Ther. 11, 19-25 (2005》。
盡管很明顯pIX為結構蛋白，但也有提示pIX為腺病毒復制的調
節蛋白。pIX作為轉錄的反式激活蛋白起作用，以增強E1A表達，這 是一種甚至可能通過在感染步驟中從衣殼引入PIX蛋白而作為病毒 因子發揮作用的功能(由Parks綜述，Mol. Ther. U， 19-25 (2005》。還 闡述了 PIX連同早期蛋白E4 Orf3與稱作PML小體的亞核包含物相互 作用(Puvion-Dutilleul等，Exp. Cell. Res. 218， 9-16 (1995); Leppard和 Everett, J. Gen. Virol. 80， 997-1008 (1999))。它們是250 nm-500腿大 小的動態聚合物，已提出其參與細胞分化的調節(Wang等，Science 279,1547-1551 (1998))、細胞凋亡的控制(Quignon等，Nature Gen. 20， 259-265 (1998))和對病毒感染的反應(M6ller和Schmitz， Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 51， 295-300 (2003》。
因為PIX蛋白的多效性，我們將其導入到細胞泉，以沖企查PIX是 否增加細胞增殖或與腺病毒或腺病毒載體無關的生物藥物制品的生 產特性。普遍需要在已建立的細胞系中調節這些特性的因子。
舉例而言，減毒(弱毒)病毒是有希望的疫苗候選者接種時它們 模擬天然感染，但需要更長時間使受接種者建立所期需的保護性免 疫應答。隨著無免疫應答患者(例如由于HIV感染)人數越來越多，高 減毒抹合乎需要。然而，減毒林仍然發生(通常為良性)感染，即使在 缺乏功能性免疫系統時高減毒株在細胞水平也被封阻。建立和保持 減毒的常用方法是在不同宿主組織中進行病毒傳代。舉例而言，意 欲用于人類疫苗接種的麻滲病毒和腮腺炎病毒在原代細胞、在雞胚 或來自雞胚的組織培養中傳代。新一代疫苗基于也依靠原代雞細胞 生產的高減毒痘病毒。因此，能取代原代雞細胞并且同時因二次操 作(secondary manipulation)(例如將PIX轉基因導入)甚至不太有效保護 其本身抵抗病毒感染的細胞系可提供高度期需的基質。
為了其它目的可優選哺乳動物(而不是禽類)細胞系。這樣的優選 細胞系已經存在，并已通過了衛生當局關于由生物藥物制品引起的
安全性和風險的檢查。此時，也非常期望能增加可利用的應用范圍 或生產效率而不危及安全性特征的二次操作(例如導入PIX轉基因)。
發明概述
當制備業已被腺病毒基因pIX (或其嵌合融合類似物)穩定轉染的 細胞系時，我們出乎意料地觀察到pIX在禽類細胞和人細胞中起表型
作用。對于禽類細胞，這一點尤其令人意想不到，因為禽類細胞不
能被不人腺病毒感染，而禽腺病毒(例如CELO或禽腺病毒8型)并不 編碼PIX同系物的(Ojkic和Nagy, J. Gen. Virol. 81， 1833-1837(2000))。 此外，我們觀察到，PIX的穩定存在增加了細胞對由雙鏈RNA類似 物誘導的易感性，其很可能是通過toll樣受體3。可能由于這個原 因，我們還出人意料地觀察到PIX蛋白的存在提高了高減毒痘病毒 在禽類宿主細胞中的產量。由于痘病毒感染的細胞不太被雙鏈RNA 類似物誘導，因此我們可能發現了先前未曾闡述過的PIX蛋白和痘病 毒抗干擾素基因之間的相互作用。我們還觀察到穩定轉染的細胞系 所釋放的蛋白質產物(不僅僅是病毒)的產量意想不到地提高了。 因此，本發明提供
(l)用于制備非腺病毒靶病毒或一種或多種靶蛋白的方法，該方 法包括
(a) 培養表達細胞，該表達細胞可通過用所述靶病毒、或攜帶編碼 所述輩巴病毒的核酸序列的載體、或攜帶編碼所述一種或多種靶蛋白的 核酸序列的載體感染或轉染宿主細胞而得到，該表達細胞在其基因 組中已經穩定整合了編碼作為異源調節蛋白的腺病毒PIX或其功能變 異體的基因，并穩定表達所迷調節蛋白或其功能變異體(其中該非腺 病毒靶病毒不含調節蛋白，且所述靶蛋白不同于所述調節蛋白或其功 能變異體)，和
(b) 分離所述靶病毒或靶蛋白；(2) 上述(1)的優選實施方案，其中所述PIX蛋白或其功能變異體
與非同源病毒因子合作，調節除所述蛋白質之外的因子的亞細胞分 布，調節轉錄和/或細胞生長，提高細胞生產不含所述調節蛋白的病
毒和生產不同于所述調節蛋白或其功能變異體的蛋白質的生產率；
(3) 上述(1)和(2)的優選實施方案，其中腺病毒pIX作為具有另一 種蛋白的融合蛋白來提供，其中所述另一種蛋白調節或擴大腺病毒 pIX的活性或亞細胞分布，例如腺病毒pIX與視黃酸受體a融合，優 選為具有SEQ ID NO:4中所示序列的融合蛋白，或與GFP融合并含 有NLS，優選為具有SEQIDNO:23中所示序列的融合蛋白；
(4) 上述(l)-(3)的優選實施方案，其中宿主和表達細胞為脊推動物 細胞，包括哺乳動物細胞和禽類細胞，優選哺乳動物細胞為來自人 腦的細胞，禽類細胞為來自鴨視網膜的細胞或來自鴨體節的細胞；
(5) 上述(l)-(4)的優選實施方案，其中宿主和表達細胞來自人腦， 優選來自人胎腦，最優選為NC5T11細胞，并且所述細胞攜帶編碼作 為異源調節蛋白的腺病毒PIX或其功能變異體的核酸序列，優選所述 異源調節蛋白由SEQ ID NO:l 、 SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:22中所 示的核酸編碼；
(6) 上述(5))的優選實施方案，其中宿主細胞為NC5T11弁34細胞， 表達細胞來自NC5T11#34細胞，所述NC5T11#34細胞保藏于DSMZ, 保藏號為DSM ACC2744;
(7) 上述(l)-(4)的優選實施方案，其中宿主和表達細胞為禽類細 胞，優選來自鴨視網膜或鴨體節，所述細胞攜帶編碼作為異源調節 蛋白的腺病毒PIX或其功能變異體的核酸序列，優選所述異源調節蛋 白由SEQ ID NO:l 、 SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:22中所示的核酸編
碼；
(8) 上述(7)的優選實施方案，其中宿主細胞為CR.PIX (17allb)細 胞，表達細胞來源于CR.PIX (17allb)細胞，所述CR.PIX (17allb)細 胞保藏于DSMZ，登錄號為DSM ACC2749;
(9) 如上(l)-(8)中所定義的用于生產靶病毒或一種或多種靶蛋白的
表達細胞，優選所述表達如上(5H8)中所定義；
(10) 用于制備如上(9)中所定義的表達細胞的方法，該方法包括用 病毒、或用攜帶編碼所述病毒的核酸序列的載體、或用攜帶編碼所述 一種或多種靶蛋白的核酸序列的載體來感染或轉染如上(l)-(8)中所定 義的宿主細胞系；
(11) 如上(5)-(8)中所定義的宿主細胞；
(12) 用于制備上述(11)的宿主細胞的方法，該方法包括用攜帶所 述調節蛋白或其功能變異體的載體來轉染合適的起始細胞；
(13) 如上(7)中所定義的表達細胞用于制備靶病毒或一種或多種靶 蛋白的用途；
(14) 融合蛋白，其包含至少一個包含調節蛋白的第一結構域和至 少一個第二結構域，第二結構域包含如上(2)或(3)中所定義的作為轉 錄調節物和/或作為亞細胞靶向的信號的蛋白質或肽；和
(15) 編碼如上(14)中所定義的融合蛋白的核苦酸序列。
附圖簡述


圖1:細胞系NC5T11的歷史。A:生長在無血清條件下的原代 細胞的神經干細胞球(neurosphere) 。 B : 生長在含5% FCS的 DMEM/F12中的原代細胞單層。C:用p79轉染后2周的原發灶。箭 頭表示原代細胞和無限增殖細胞之間的交界。D:在含5°/。 FCS的 DMEM/F12中的無限增殖化細胞的均一貼壁培養物。E:在振蕩試管 內EXcell VPRO中的NC5T11懸浮培養物。
圖2: NC5T11中檢測E1A和E1B的免疫熒光。在用曱醇固定后， 分別用針對E1A和EIB 55k的大鼠抗體處理細胞，接著用綴合了得克 薩斯紅的抗大鼠抗體處理細胞。如圖2中所示，樣品中的所有細胞皆 顯示出典型的E1A核染色和E1B細胞質染色。在用曱醇固定后，分 別用針對E1A和EIB 55k的大鼠抗體處理細胞，接著用綴合了得克薩
斯紅的抗大鼠抗體處理細胞。如此處所示，樣品中的所有細胞皆顯示
出典型的E1A核染色和E1B細胞質染色。
圖3:所選aat克隆的比產出率。在12孔板中以7 x 104個細胞接 種用C55轉染并用噪呤霉素(puromycin)選擇的NC5T11細胞克隆，在 接種后第1天、第2天和第3天測定細胞數目和aat滴度，計算每曰 最大細胞比產出率。
圖4: NC5Tllpuro弁8在分批振蕩培養物中的表達分析。在50 ml 聚丙烯振蕩管(TPP， Switzerland)中將細胞以6x 1(^個細胞/ml接種于 12 ml的EXCELL VPRO，使其以1 cm半徑和160 rpm速度旋轉。在 第4天、第7天、第9天、第11天、第15天、第18天和第21天取 200 jal樣品。用錐蟲藍染色后用血細胞計數器測定細胞密度和存活率。
圖5:在克隆混合物中通過PCR檢測pIX-RARA cDNA。通過用 F67轉染和潮霉素(hygromycin)選擇，從NC5Tllpuro#8產生攜帶 pIXRARA基因的克隆混合物。用RNA提取試劑盒(Machery Nagel， Germany)提取RNA,用AMV逆轉錄酶(Invitrogen)合成cDNA。分別 用引物1和1和164擴增單獨的pIX片段的cDNA或全pIXRARA基 因。
圖6:通過PCR在NC5Tllpuro弁8和NC5T11的潮霉素抗性亞克 隆(#34、 35、 36、 37、 38)中4企測作為融合蛋白一部分的pIX序列。 通過SDS裂解接著用苯酚提取和沉淀，從6孔板中生長的細胞克隆中 分離DNA。用引物1和2經28個循環擴增DNA。
圖7:測定相對于E1B而言pIXRARA和pIX基因在穩定轉染的 NC5T11中的穩定性E1A+E1B和pIXRARA在分開的轉染和El基 因中導入，并在無選擇的情況下保持超過2年，因此，被認為是穩 定整合。在2個時間點從所選擇的細胞克隆分離基因組DNA:在hyg 選擇停止后立即(早期)；在無選擇壓力下2個月后(晚期)。同時實時 PCR測定PIX和E1B DNA水平。
圖8:在NC5T11和NC5T1 lpuro#8的pIXRARA重組克隆中通過 RA處理誘導的生長阻滯。在存在或不存在6 ng/ml視黃酸(retinoic acid) 時以2 x 105在6孔板接種細胞。在接種后4天以4 x放大率用相襯成 像攝取到在經RA處理的克隆#12和#34中顯示出生長阻滯但在 NC5T11中未顯示出生長阻滯的照片。
圖9: PIXRARA防止千擾素對病毒復制的抑制。用EMCV這種 干擾素敏感型病毒，在經(3干擾素處理的細胞中以0.004的MOI感染 NC5T11和NC5T11#34細胞。通過在A549細胞上形成蝕斑來進行細 胞裂解物的滴度測定。
圖10:表達來自載體C55的a-l-抗胰蛋白酶的細胞系 NC5Tllpuro弁8和其亞克隆W0、 #12、 #14的表達分析，所述亞克隆除 攜帶C55之外，還攜帶載體F67(pEFpIX-RARA)。在50ml聚丙烯振 蕩管(TPP, Switzerland)中以6xl(^個細胞/ml將細胞接種于EXCELL VPRO(JRH Biosciences)中，總體積為12 ml，使其以1 cm半徑和160 rpm速度旋轉。
圖11:鴨視網膜CR細胞中PIX的表達。左圖在pIX細胞的基 因組DNA中針對PIX基因的PCR反應。凝膠上樣從左到右1 kb-標記(Invitrogen);來自CRpIX的基因組DNA的PCR;非模板對照； CRpIX轉染所用的質粒的陽性對照。右圖用于在CRpIX細胞中檢 測pIX蛋白的蛋白質印跡。第l道293細胞；第2道CRpIX細胞 中的pIX蛋白。
圖12:鴨視網膜細胞中PIX轉基因的穩定保持。左上圖MCX 和DXS為平行培養超過3個月并且未經選擇的CRpIX克隆的獨立等 份樣。3個月后，用TaqMan PCR計數MCX和DXS中E1B和PIX轉 基因的拷貝量。由于E1B轉基因獨立于PIX而保持，所以這兩種基因 的比率指示PIX轉基因的保持情況。在MCX和DXS之間該比率不變。 此外，PIXmRNA與ElBmRNA之比也未改變，PIXmRNA超過ElB mRNA則表示PIX表達。右圖在有或無潮霉素選擇壓力下培養MCX
和親代(PIX陰性)CR.HS細胞2周(在x軸上用黑條表示)。在各個時 間點分離基因組DNA(由"A"、 "B"和"C"表示)，進行TaqMan定量(左 下)。MCX細胞存活，而親代細胞被潮霉素殺滅。轉基因的比率保持 不變，再次表明PIX轉基因在存在選擇壓力下也穩定保持。親代細胞 的倍增時間大約為32小時，但MCX細胞的倍增時間僅為41小時。
圖13: PIX對CS細胞中MVA復制的影響。用MVA感染CS和 CSpIX細胞，分析感染后48h和72h的MVA復制。在PIX陽性CS 細胞中MVA產量顯著更高。在相襯顯微圖像中，也很明顯CSpIX細 胞在48h的細胞病變效應似乎延遲了。然而，在感染后72h，兩種培 養物都對病毒易感，其程度相似，因為明顯完全裂解。
圖14: PIX對CR細胞中MVA復制的影響。用各種感染復數以 各種細胞密度感染懸液中的CR和CRpIX細胞。感染后48 h分析MVA 產量，該產量在y軸上表示。泡的大小顯示接種細胞密度。實心泡表 示CRpIX細胞的值，空心泡表示親代細胞的值。在所有構形中，PIX 都使得MVA的擴增率明顯增加。
圖15: PIX-GFP在鴨細胞中的亞細胞分布。GFP標記的PIX以 少數細胞質亮點和彌漫性細胞質染色出現，主要排除了細胞核。其它 克隆表現出更強的彌漫性細胞質染色和正好在細胞核外的更強烈的 積聚。
圖16: PIX-GFP變異體在CHO細胞中的亞細胞分布。為了研究 細胞內PIX分布的誘導變化，制備了融合變異體，包括插入核定位位 點(NLS)和與視黃酸受體a融合，視黃酸受體a是一種已經含有NLS 的胞內蛋白。顯示了用PIX-GFP變異體表達質粒瞬時轉染的CHO細 胞。
圖17:在PIX存在下干擾素誘導的作用。用polyl:polyC(已知的
較。與CS細胞相比，CSpIX細胞與polyl:poly C的反應更敏感。CRpIX 和CR細胞的反應相當，和CS細胞比較它們的反應程度較低。
圖18:在PIX-GFP存在下MVA感染和干擾素誘導的作用。 CSp9GFP和CRp9GFP細胞用poly I:poly C處理，用MVA按照指示 以0.1的M.O.I.感染。CS來源的細胞再次對干擾素誘導的反應更強烈。 出人意料的是，在這兩個細胞系中誘導或感染后，亮PIX體的數目似 乎減少了，然而，PIX-GFP的總信號強度增加了。此外，在處理后22 h仍有更多數量的CS細胞貼壁，這表明用MVA平行感染后poly I:poly C誘導的作用得到改善。
發明詳述
本發明實施方案(l)的方法使用表達細胞，該細胞在其基因組中整 合了編碼異源調節蛋白(即pIX或其功能變異體)的基因。所述調節蛋 白具有以下特性
1. 其調節轉錄，尤其是若與合適調節物(modulator或regulator) 連接，則其還影響細胞生長。
2. 其提高該細胞生產不含所述調節蛋白的病毒(即該調節蛋白不 是該病毒所缺失蛋白的替代物)和/或生產不同于所述調節蛋白或其功 能變異體的蛋白的生產率。
根據本發明，異源調節蛋白為腺病毒血清型5的pIX蛋白(例如具 有SEQ ID NO:2中所示aa序列的蛋白)、其突變異體(包括添加、置 換和/或缺失突變異體)、其變異體(例如自不同血清型腺病毒獲得的變 異體)等等。
本發明的"異源調節蛋白的功能變異體"包括來自血清型5以外的 腺病毒的同源物、相應野生型調節蛋白的特定氨基酸殘基的所有突 變型(添加、置換和/或缺失)、通過融合其它活性蛋白或肽序列的修飾 物等等。尤其優選融合蛋白，即包含至少一個包含如前所述的調節 蛋白的第一結構域和至少一個包含起轉錄調節物作用的蛋白或肽的 第二結構域的融合蛋白。在本發明的優選實施方案中，所述轉錄調 節物為包括視黃酸受體a在內的轉錄因子，其可以完全或不完全(即截短的)的形式存在。調節物還可是轉運肽，其包括NLF序列，例如 示于SEQ ID NO:21中的序列。本發明的第一和第二結構域彼此直接 連接，或通過肽接頭彼此共價連接。合適的肽接頭包括柔性和親水結 構，例如多聚gly-ser。
以下詳細描述中所用的術語"細胞，，和"細胞系，，指表達細胞/表達 細胞系和宿主細胞/宿主細胞系。
按照本發明，優選異源調節蛋白或其功能變異體在細胞中以至少 1 pg/pg胞內蛋白的量、優選以至少10pg/嗎胞內蛋白的量表達，以使 其表達可通過蛋白質印跡分析來測定。
在本發明細胞中，異源調節蛋白或其功能變異體優選在穩定的同 源或異源啟動子控制下。合適的啟動子為組成型細胞啟動子或其變異 體，例如人易位延伸因子2啟動子。在本發明內所用的人易位延伸因 子2啟動子的特定變異體具有示于SEQIDNO:12中的序列。所示序 列代表位于人染色體19: 3,935,325-3,936,638的啟動子的"短"形式 (human genome assembly 2004年5月)，其提供穩定的中等水平表達。 對于更強的表達，可使用位于染色體19: 3,935,349-3,938,957的啟動 子的"更長"形式(human genome assembly May 2004)。
按照本發明，所述細胞為脊推動物細胞，包括哺乳動物細胞、禽 類細胞等。合適的哺乳動物細胞為人細胞和嚙齒動物細胞，包括小鼠、 大鼠、倉鼠等。尤其優選的本發明哺乳動物細胞為來源于人腦尤其是 人胎腦的細胞、小鼠NSO或Sp2/0細胞、BHk或CHO細胞。合適的 禽類細胞為鴨、雞、鵪鵓和鵝的細胞。尤其優選的本發明禽類細胞為 來源于鴨^見網膜細胞或體節細胞的細胞。
另 一方面，本發明的細胞可來源于原代細胞或來源于以前的無限 增殖化細胞。此外，細胞可進一步攜帶無限增殖化(病毒)基因，包括 腺病毒的E1蛋白，例如哺乳動物腺病毒(mastadenovirus)C組5型的 El蛋白等等。本發明尤其優選的細胞為進一步攜帶SEQIDNO:5中 所示的腺病毒El A和/或E1B基因的細胞。
在本發明實施方案(l)的方法中使用的細胞可進一步攜帶功能序 列，例如其用作表達細胞所需的序列，例如選擇標記序列、剪接供體 /受體位點和/或4吏得待表達的靶核酸序列可以整合入細胞中的重組酶 識別序列。
在本發明實施方案(l)、 (10)和(12)的方法中實現的"感染"、"轉染" 和"轉化"，可根據技術人員已知的標準程序來實施。若需要，所述方 法可進一步包括合適的選擇、分離和擴增步驟。
在實施方案(l)的方法中，靶病毒包括來自野生型、突變型或缺失 型病毒、冷適應病毒或減毒病毒、疫苗抹、攜帶異源基因的病毒載體、
諸如慢病毒、痘病毒、腺伴隨病毒(aav)、皰滲病毒、黃病毒等病毒載 體。
另外，在實施方案(l)的方法中，所述一種或多種靶蛋白包括抗體、 重組蛋白(例如促紅細胞生成素、a-l-抗胰蛋白酶、凝血因子VIII和IX 和干擾素)、病毒抗原(例如流感HA和NA和M、 HBV-S、皰滲病毒 G蛋白和狂犬病毒G蛋白)、肽激素等等。盡管所述方法允許生產能 同時表達不止一種靶蛋白的細胞，但尤其優選其僅編碼一種靶蛋白。
本發明實施方案(l)方法中的培養和分離可根據技術人員易于得 到的標準方法來實施。所述方法可進一步包括靶病毒或靶蛋白的標準 純化步驟以及隨后的修飾步驟。
關于實施方案(9)和(11)各自的表達和宿主細胞系的優選實施方 案，以及實施方案(10)和(12)中所述細胞系的生產方法的優選實施方 案，可參考上文所提供的與實施方案(l)有關的詳細論述。
根據實施方案(14)和(15)，本發明分別提供融合蛋白和編碼所述融 合蛋白的核香酸序列，該融合蛋白包含至少 一個包含調節蛋白的第一 結構域，和至少一個包含如上文中所定義的起轉錄調節物作用的蛋白 或肽的第二結構域。本發明還分別涉及所述實施方案(14)和(15)的融合 蛋白(例如在"i會斷和制藥應用等中)和編碼其的核苦酸序列，在例如所 有類型的載體構建體、細胞系、組織培養、轉基因動物等中的應用。
細胞系NC5T11#34于2005年11月4日保藏于德意志微生物和 細胞培養物保藏中心(the DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb， 38124 Braunschweig, Germany),保藏號為DSM ACC2744。細胞系CR.PIX (17allb)于2005年11月24日保藏號為DSM ACC2749保藏于德意志 微生物和細胞培養物保藏中心(the DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb， 38124 Braunschweig, Germany)。
借助以下實施例將更詳細地說明本發明，然而，這些實施例不能 解釋為限制本發明。
實施例
實施例1:細胞系NC5T11的開發
該細胞系由胎腦細胞混合物通過用腺病毒5E1A和B基因經非病 毒轉染進行無限增殖化發展而來。
由人工流產后的胎兒腦室周區采集組織樣品。用剪刀剪碎，在基 于含有20 ng/ml hFGF (Invitrogen， Carlsbad, CA 92008, USA)、 20 ng/ml hEGF (Invitrogen) 、 lx N2補充物(Invitrogen)和8 (ig/ml肝素(Sigma Aldrich， St. Louis, USA)的DEMEM/F12的神經細胞培養基中，用組織 培養吸管通過吹打勻漿。以200g離心3分鐘來沉降細胞。用錐蟲藍 和石典化丙咬(propidium jodide)并用流式細胞計凄t器(BD Biosciences, Jose， CA 95131， USA)來評估細胞的存活率。該存活率為75%。將 0.5xl(^個細胞接種到T25細胞瓶中。細胞在37。C和5% C02中孵育。 在培養的第5天細胞形成神經干細胞球。神經干細胞球示于圖1A中。 在第8天將細胞轉移到補充5%FCS的DMEM/F12中，以使其貼壁并 刺激增殖。細胞形成均一單層，如圖IB中所示，每周以l:5傳代一次。 將該原代神經細胞培養物命名為NC5。
2周后，按照制造商說明在分會合6孔板中用Effectene (Qiagen, 40724 Hilden，Germany)作為轉染試劑，在含血清培養基中用載體p79
轉染細胞。質粒p79含有以下元件pBluescript (Stratagene, USA)作為 質粒骨架，其中氨芐青霉素(ampicimn)抗性標記被由細菌啟動子驅動 的卡那霉素(kanamycin)抗性基因取代，使得可在大腸桿菌(￡.co//)中生 長和選擇。載體包含來自野生型腺病毒5型的片段(SEQIDNO:5),其 含有E1A(分別含或不含CR3結構域的剪接變異體13S和12S)和E1B 55k和19k的可讀框以及ElA上游的序列。磷酸甘油酸激酶啟動子(小 鼠)位于E1A基因之前。腺病毒序列之后接來自單純皰滲(Herpes simplex)胸苷激酶基因的聚腺苦酸化信號，其取代E1B的聚腺苷酸化 信號。從相應的生物體或從供體質粒通過PCR獲得元件，用常規重組 DNA技術克隆，通過序列分析進行驗證。轉染2天后用胰蛋白酶處理 細胞，并轉移到10 cm的培養皿中。2周以后，在轉染細胞中形成具 有高核/質比和清晰可辨邊界的小細胞灶(圖1C),但在經模擬處理的細 胞中沒有此細胞灶。從第11次轉染(the llthtransfection)開始，用胰蛋 白酶和克隆缸(cloning cylinders)(Coming， USA)分離出8個獨立的細胞 灶，將其接種到24孔板的孔中，經12孔板、6孔板到T25培養瓶進 行擴大培養。所有分離的細胞灶皆含有兩類細胞具有明顯邊界的小 細胞和伸長的成纖維細胞樣細胞。
在轉染后3周，在轉染Tll中肉眼可見15個另外的克隆，它們 中的某些可能起源于已經分離的原代克隆的殘留細胞。
克隆Tlla.l和111^6顯示出最快速的生長，在轉染后8周低溫 保存在DMEM/F12、 10%DMSO、 25%血清中。這時所有克隆仍然含 有一部分具有類似原代表型的增大的細胞質的細胞。然而，Tlla.l和 Tlla,6用1:5的分傳比時過度生長，在轉染后大約3個月被消除了 。 實施免疫熒光實^r以^使形態改變與El A和E1B的表達相耳關系。在用 曱醇固定后，用分別針對ElA和ElB55k的大鼠抗體處理細胞，接著 用得克薩斯紅綴合抗大鼠抗體處理細胞。如圖2中所示，樣品中的所 有細胞都顯示出典型的E1A細胞核染色，E1B細胞質染色。
轉染后3個月，在胰蛋白酶處理后通過接種1.6xl(^個細胞將克 隆Tl la. 1和Tl la.6轉移到無血清培養基ProPER (Cambrex, Belgium)。 通過離心收獲細胞，每周一次通過離心更換培養基。細胞群存活下來， 但即使在轉染后6個月，細胞仍表現出存活率低，以60-80小時的高 培增時間來生長。
當在ProPER培養基中3個月后將細胞轉移回含5°/。 FCS的 DMEM/F12中時，兩個克隆都形成了倍增時間為40小時的均一和高 活力的培養物。選擇Tlla.l作為更為有活力的細胞克隆用于進一步的 實驗，命名為NC5T11(圖1D)。
實施例2: NC5Tllpuro克隆#8的建立
細胞系中的蛋白生產取決于有效轉染和選擇方法。尚不知曉常用 的選擇標記G418、噪呤霉素、潮霉素、殺稻瘟素(blasticidin)、 MTX、 組胺醇(histidinol)對于NC5TU的適合性。在第一個評估步驟中，按照 制造商說明試驗不同市購轉染試劑Lipofectamine (Invitrogene)、Fugene (Roche， Germany) 、 Polyfect (Qiagen)和Effectene。用表達來自人CMV 啟動子的gfp的質粒pEGFP-Nl (Clonetech， USA)來測定瞬時轉染效 率。用Effectene (Qiagen)得到最高轉染效率，當用于生長于DMEM/F12 10%FCS中的貼壁細胞時視細胞密度轉染效率可達到20-50%。
為了測試選擇標記基因，構建了含有人a-1 -抗胰蛋白酶(aat)基因 的表達載體，所述基因在人CMV啟動子控制下，后接牛生長激素 PolyA信號和由弱啟動子控制的各個選擇標記。更具體而言，為了測 試嘌呤霉素選擇，用載體C55,其含有由人PGK啟動子驅動的嘌呤霉 素抗性基因，后接SV40早期聚腺香酸化信號。
轉染后，將細胞接種于含有0.75 pg/ml噪呤霉素的DMEM/F12 5% FCS,每周更換一次培養基，進行3周的選擇。得到克隆混合物，用 山羊多克隆抗a-l-抗胰蛋白酶抗體(Innogenetics, USA),然后用生物素
標記的第二兔抗山羊抗體和鏈霉抗生物素-得克薩斯紅綴合物，通過免 疫熒光來驗證表達。
為分離單個細胞克隆，將克隆混合物的10000個細胞4妻種于15 cm 培養jm中。4周后用克隆缸(Coming)分離克隆，分析#1、 2、 7、 8、 9、 10號克隆的aat表達。更具體而言，將細胞以7xl(^個細胞接種到12 孔板，測定細胞數目和aat表達。計算的細胞比產出率示于圖3中。 克隆NC5Tllpuro糾顯示出比產出率高于100pg/細胞，天，被選擇用于 進一步開發。
實施例3:將NC5T11和NC5Tllpuro#8轉移到生產培養基和在分批 振蕩培養物中的表達分析
與含血清培養基比較，在ProPER培養基(Cambrex)中NC5T11和 NC5T1 lpuro#8 二者的生長率大約降低至1/2。因此，測試Xcell VPRO (JRH Biosciences)作為替代品。通過直接在T25培養瓶中的5 ml EXcell VPRO中接種4.5x 106個細胞來進行適應。在2周后細胞重新開始生長， 確定每周一次分傳比為1:3。在下一步驟中讓兩個克隆適應在存在剪 應力下的生長。在50 ml聚丙烯振蕩管(TPP, Switzerland)中將細胞以 6xl04個細胞/ml接種于12 ml的EXCELL VPRO中，使其以1 cm半 徑和160 rpm速度旋轉。在重復傳代后，進行批料分析，以測定指凄t 生長期和穩定生長期的最高細胞密度和產物積聚。觀察到以下情況 克隆NC511puro表現出高存活率， 一直到第18天存活率保持在70% 以上。最高細胞密度不超過lx106。在穩定期期間繼續積聚產物(圖5)。 由此得出結論需要開發特定的培養基或進一步改進細胞，以達到與 從CHO細胞所得到的細胞密度相當的高細胞密度。這將很可能導致 產物滴度大幅度增長。
實施例4:融合蛋白pIX-RARA和用于pIX-RARA與p!X 二者的整
合載體的構建
分別用以下引物通過PCR從腺病毒5型和人基因組DNA得到腺 病毒PIX序列和-見黃酸受體a (RARA)序列 1，2.
用于PIX;和3.
4. AAGGAGCGCTGGCGAGGGCTGTGTCCAT (SEQ ID NO:9)用 于RARA。
分別擴增兩個片段。引物2和3之間的重疊使得用引物3和4通 過PCR可連接兩個片段。將融合基因克隆到載體pEFpromhyg,得到 pEFpIXRARA。該載體含有位于chrl9: 3,935,325-3,936,638的人延伸 因子2啟動子(human genome assembly May 2004; SEQ ID NO: 12)。其 含有上游元件和EF2基因的第一個內含子。通過誘變除去了位于第一 個內含子5，的EF2的天然起始密碼子。在pEFpromhyg載體中，EF2 序列后接用于插入pIX-RARA的獨特的限制性位點(AfeI)。 AF1位點 后的內部核糖體結合位點使得潮霉素抗性基因在所述連接的RNA中 作為第二可讀框與pIX-RARA —起表達。該構型支持pIX-RARA在所 有潮霉素抗性細胞中的表達。
用引物AACCAGCGCTACCATGAGCACCAACTCGT (SEQ ID NO:10)和ACCGAGCGCTTGTTTTAAACCGCATTGG (SEQ ID NO:l 1〕 擴增wt pIX基因，將其整合到pEFpromhyg的Afe位點代替 pIX-RARA,得到pEFpIX。
實施例5:含有PIX基因和PIX-視黃酸受體融合蛋白的細胞系 NC5T11和NC5Tll。uro#8的修飾
制備細胞克隆NC5Tll和NC5Tllpuro能，用于通過將細胞在 DMEM/F12, 5% FCS中以1.3乂106個細胞/孔接種，在6-孔板中進行轉 染。用限制性酶Asp700 (Roche)將質粒F67 (pEFpIXRARA)和質粒F76 (pEFpIX)線性化，在乙醇沉淀后用Effectene (Qiagen)轉染使DNA與
22
16 pi Enhancer (增強劑)和200 plEC緩沖液混合。在室溫2分鐘后，力口 入18plEffectene，室溫10分鐘形成脂質體。將轉染混合物加入到于前 一天在6孔板中接種至80%會合的細胞上，至培養物體積為lml。通過 pEGFP-Nl (Clontech, Palo Alto, CA 94303-4230， USA)的平行轉染確證 了高轉染效率。轉染后一天將培養基更換為含10。/。FCS的DMEM/F12， 并加入75或100 pg/ml (NC5T11)和50 jag/ml (NC5T1 lpuro弁8)潮霉素。 每周更換2次選擇培養基。在18天后，每孔中可見15-20個清晰的克隆。 用胰蛋白酶處理克隆混合物，再繼續選擇2周。通過RTPCR測試克隆 混合物的PIXRARA表達。在大部分克隆混合物中，用引物1和2檢測到 強信號，用引物l和4檢測到弱信號。為了分離單個的細胞克隆，將 克隆混合物的10000個和1000個細胞接種到15 cm培養皿中。4周后用 克隆缸(Corning)分離克隆。對于來自F76轉染的克隆，應用不同的策 略。用胰蛋白酶處理克隆混合物，轉移到50ml振蕩管內含有75 pg/ml 潮霉素的EXCEIX VPRO中，懸浮培養2周后，將2000個活細胞與12ml 克隆矩陣(Genetix,UK)混合，接種到6孔板(Greiner)(2 ml/孔)，進行自 動克隆挑選(clonepixFL， Genetics, UK)。將來源于NC5T1 lpurc^8的克 隆標記為#10-21。將來源于NC5T11的克隆標記為弁34-45。將用 pEF2PIX轉染的克隆命名為NC5T11PIXA-NC5T11PIXE。通過PCR測 試克隆是否存在各自載體。圖6提供了用引物l和2的初始測試。將所 有顯示陽性信號的克隆轉為在EXCELL VPRO中生長。通過直接在T25 培養瓶內的5 ml EXCELL VPRO中接種4.5xl(^個細胞來重新適應。6 周后，將穩定期培養物細胞以轉移到50 ml聚丙烯振蕩管(TPP, Switzerland)內的EXCELL VPRO中，接種密度為6xl()4個細胞/ml，且 總體積為12ml，使其經受l cm半徑和160rpm速度的旋轉。克隆#10、 #12、 #14 (NC5Tllpurotf8pIXRARA)和存34、 #43 (NC5T1 lpIXRARA) 和NC5T11PIXB、 NC5T11PIXC因其在剪應力下有最高存活率而被選 中。對克隆#34、 43和NC5T11PIXC重新克隆，分析所整合DNA的穩定 性。測定PIX和E1B之間的基因比率來評估穩定性，因為E1A+E1B和pIXRARA在分開的轉染和El基因中被導入，并且在缺乏選擇的情況下 保持超過2年，因此，被認為是穩定整合。在以下2個時間點從所選擇 的細胞克隆分離基因組DNA:在hyg選擇停止后立即(早)進行；在無 選擇壓力下2個月后(晚)進行。以2種DNA濃度通過實時PCR(ABI 7000， CYBR Green)測定PIX和ElB的DNA水平。該評估實例示于圖7中。載 體pEF2PIXRARA以每E1B大約0.4-0.6個PIXRARA拷貝穩定保持在 #34和#43亞克隆中。克隆NC5T11PIXC最初含有每E1B4個拷貝。在本 實驗過程中該數目降低至1/2。
實施例6: NC5TllpIX-RARA的視黃酸依賴性生長
視黃酸(RA)為細胞分化的誘導劑。分化通常與細胞生長降低相 關。對RA的應答有賴于視黃酸受體a這種由RA激活的轉錄因子的 表達。RA對PML (早幼粒細胞白血病)具有深遠的影響，其通過生長 阻滯轉化的表型回復。
如圖8所示，6嗎/ml濃度的RA處理對NC5T11或a-l-抗胰蛋白 酶表達克隆NC5Tllpuro#8的生長沒有任何影響。然而，通過用6 pg/ml RA對含5% FCS的DMEM/F12中的貼壁培養物處理5天，可 阻滯克隆#14 (NC5Tllpuro弁8pIXRARA)和弁34 (NC5TllpIXRARA)的 生長。
實施例7: PIXRARA防止干擾素對病毒復制的抑制
將NC5 Tll和NC5T11弁34細胞以8.0x105個細胞/孔接種到6孔 板內的DMEM/F12 5% FCS中。12 h后以1和8 IU/ml的濃度向各孔 中加入干擾素p (Serono的rebif 44)。 30分鐘后，用腦心肌炎病毒 (Encephalomyocarditis virus, EMCV)以0.004的感染復數(MOI)感染 NC5 Tl 1和NC5T11#34兩者的經干擾素處理的細胞和對照細胞。24 h 后，收獲培養物，在-80。C冷凍以^:細胞破裂。將該懸液解凍，并通 過800 x g離心10分鐘來澄清。通過在A549細胞上的蝕斑分析來進
行細胞裂解物的病毒滴度測定簡言之，將A549細胞接種到24孔板， 培養達到會合，與稀釋到2xl08倍的澄清裂解液一起孵育30分鐘， 用存于RPMI 10%FCS中的0.2。/。的低熔點瓊脂糖VII型覆蓋，在37。C 孵育24h。吸出瓊脂糖層，細胞在20。C用存于PBS的2%戊二醛固定 20分鐘，用水洗滌，在室溫用存于50%乙醇的1。/。Kristallviolett液孵 育30分鐘以計數病毒蝕斑。示于圖9的結果證明NC5T11細胞中的 EMCV復制效率相當低，其對感染前的干擾素處理高度敏感。在8 IU/ml下，從該培養物未能回收活病毒。與此相反，NC5TU弁34中的 病毒復制僅略微受干擾素處理的影響。此外，即使在缺乏外源IFN時， 對于NC5T11#34也可觀察到較高滴度。所顯示的現象模擬典型的疫 苗作用過程，因為很多疫苗抹在具完整IFN途徑的生產細胞中誘導 IFN應答，以生產過程中優選的低感染復數(MOI)的感染可導致IFN 分泌，進而導致阻斷最初未受感染的細胞的病毒復制。因此，PIX表 達可允許以低MOI開始進行病毒高滴度生產。
實施例8: pIX-RARA對蛋白生產的刺激
用搖瓶批料測定，將攜帶載體F67以及a-l-抗胰蛋白酶的 NC5T1 lpuro#8pIXRARA與起始克隆NC5T1 lpuro#8進行比較，比較 其產a-l-抗胰蛋白酶的能力。在50 ml聚丙烯振蕩管(TPP, Switzerland) 中以6xl04個細胞/ml將細胞接種于EXCELL VPRO (JRH Biosciences) 中，總體積為12ml，使其以1 cm半徑和160rpm速度旋轉。繼續培 養直到第22天。除了懸浮細胞外，還形成粘附在管壁上的細胞群環。 在整個過程中這些群中的細胞保持坑于70。/。的存活率。因為未能成功 地用胰蛋白酶或Acutase (PAA)使這些群脫離管壁，所以沒有測定生長 動力學和最高細胞密度。在第9、 13和22天采集樣品，用a-l-抗胰蛋 白酶ELISA測定滴度。結果示于圖10。
實施例9:表達pIX的鴨視網膜細胞的產生
在別處(專利申請說明書WO05042728,轉染了質粒60E的視網膜 細胞)闡述了來源于原代鴨視網膜細胞并按照規定的風險指南無限增 殖化的細胞系CR。將該細胞在39。C和7.5。/。C02中培養在補充5°/0胎 牛血清(Biochrom AG, 12213 Berlin, Germany)的DMEM:F12培養基 (Invitrogen， Carlsbad, CA 92008, USA)中。為了傳代，用TrypLE Express (Invitrogen)短暫處理細胞。用Ssp I和Xmn I限制性酶(二者皆來自New England Biolabs, Beverly, MA 01915-5599， USA)使質粒76F pEFPIXl 線性化，通過親和色語法(來自Qiagen的凝膠提取試劑盒，40724 Hilden， Germany)純化為400 ng/^L用Effectene試劑(Qiagen)使5 pi (2 iig)純 化的DNA轉染到CR細胞內使DNA與16 |il Enhancer (增強劑)和 200 pi EC緩沖液混合。室溫2分鐘后，加入18 jliI Effectene,室溫10 分鐘讓其形成脂質體。將轉染混合物加入到6孔板中在前一天接種至 80%會合的細胞上，至培養物體積達1 ml。用pEGFP-Nl (Clontech, Palo Alto, CA 94303-4230， USA)平行轉染確證了高轉染效率。
轉染后3天將pIX轉染培養物在T75培養瓶中擴大培養，用25 pg/ml潮霉素B (Invitrogen)開始選擇。每周換一次培養基，且將潮霉 素B提升到50 pg/ml。 3周后，總計四個大轉化灶存活，將其重新接 種到T25培養瓶中用TrypLE分離細胞，以100 x g離心10分鐘， 重新懸浮于新鮮培養基中，鋪種到T25培養瓶中。
轉染后4周，用TrypLE將來自T25培養瓶中的健康亞會合培養 物的細胞分離到5 ml DMEM:F12, 5% FCS中。使其中2 ml與培養基 #63032-1000M (JRH Biosciences, KS 66215， USA)混合，這是一種意名夂 用于維持懸浮培養物的不含動物來源成分的培養基。加入潮霉素B達 到50 ng/ml。從2 ml培養物分離基因組DNA ，用引物V293和V294 實施針對pIX轉基因的PCR。由不含DNA的平行反應提供陰性對照， 陽性對照由含質粒76F的平行反應提供。圖11中的所預期的PCR產
物(左圖)證明pIX轉基因穩定插入到CR細胞，該細胞現在稱作 "CRpIX"。
通過蛋白質印跡分析來確證PIX蛋白的表達通過在(20 mM Tris pH 7.4， 300 mM NaCl, 1%脫氧膽酸鈉，1°/。 Triton X誦100, 0.1% SDS) 中煮沸來破碎6xl()S個細胞，通過凝膠電泳分離蛋白，然后將蛋白轉 移到尼龍膜。PIX用pIX第一抗體(由W. Seidel博士惠贈， Ernst-Moritz-Arndt-Universitat Greifswald， Germany)檢觀'J, 然后與4十乂于 前述抗體并用堿性磷酸酶標記的第二抗體反應。
圖11中預期大小的信號(右圖)確證了 pIX在CRpIX細胞中表達。 在來自平行反應中制備的293細胞的陰性對照中不存在信號。
細胞在培養基弁63032-1000M中再傳代2次，然后轉移到培養基 弁14561-畫0M (也來自JRH Biosciences)中再傳代2次。所有JRH培 養基都補充1 xGlutamax I (Invitrogen)和100 pg/ml潮霉素B。
對于在培養基弁14561-1000M中的第二次傳代，將小部分(大約5 ml懸浮培養物的2°/。)完全重新懸浮到DMEM:F12，FCS培養基中，鋪 種到15 cm直徑的培養皿。6天后，將11個轉化灶轉移到12孔板的 單個孔中，保持在DMEM:F12,FCS培養基中。對于克隆轉移，吸出 培養基，用TrypLE浸泡克隆盤(Sigma, MO， USA),將其簡單地直接 應用于克隆，然后轉移到填充有培養基的孔中。將單個克隆擴大用于 進一 步實驗和測定生長特性。
為了分析PIX在穩定轉染的細胞中的保持，用QIAamp DNA血 液試劑盒(QIAamp DNA Blood kit, Qiagen)從1 x 106個細胞分離基因 組DNA，用ABI 7000 TaqMan反應與SYBR Green (ABI)檢測化學， 測定25 ng和50 ng基因組DNA中的E1B和PIX分子數目。用于定 量測定的引物對于EIB為gTggTTgCTTCATgCTAgTg (SEQ ID NO:13) 和TCTTCAgCAggTgACAgTTg (SEQ ID NO: 14),對于PIX為 ACCTACgAgACCgTgTCTg (SEQ ID NO: 15) 和 gAgCCgTCAACTTgTCATC (SEQ ID NO:16)。由于EIB獨立導入，必
須保留以使細胞存活，故該基因用作內部標記，以使PIX拷貝數量和 基因表達強度標準化。
圖12證明即使在缺乏選擇壓力時PIX轉基因在CR懸浮細胞中仍 穩定保持。該圖還證明PIX陽性細胞的生長率降低。我們始終觀察到 當用PIX表達質粒穩定轉染時，我們的所有細胞(禽類和人細胞)的增 殖皆降低，這證明了 PIX對宿主細胞生物化學有影響。此外，我們在 PIX陽性的貼壁CR細胞中觀察到避免生長為會合層(接觸抑制增加) 的趨向。
實施例10:表達DlX的鴨體節細胞的產生
細胞系CS來源于胚體節，這在專利申請WO05042728中也有闡 述。PIX陽性CS細胞的產生可用關于上述CR細胞系所述的類似方法 來實施。與CRpIX相反，對于CSpIX不建立懸浮培養物。嚴格的貼 壁屬性是CS細胞的特征。在懸液中不增殖的細胞可被認為具有較低 的致瘤性，因為轉移的潛力受到嚴重削弱。PIX蛋白并不改變CS細 胞的這種特性。因此，盡管該蛋白多效，但似乎其不影響轉化表型。 這一觀察結果支持我們關于PIX可安全地用于生物制藥方法的設想。
實施例11: PIX對CS細胞中MVA復制的影響
將穩定轉染用于PIX表達的cs細胞和作為參照物的親代cs細
胞以2xl()S個細胞/孔接種到6孔板，第二天用MVA以0.1的m.o丄 感染。感染后48h和72h拍攝了證明CPE進展有差異的照片。在微 轉化灶測定(microfocus assay)中，測定感染后48 h上清液中病毒的產 量和感染后72 h的全部產量(上清液和裂解的細胞沉淀)。結果示于圖 13:當與親代參照物比較時，CS細胞中PIX的存在似乎延遲感染后 48 h CPE的發作。感染后72 h,兩種培養物都完全裂解，^是示CPE 程度的差異并非由CS.PIX群體中MVA不應細胞和MVA易感細胞的 混合物造成。
就我們所知，尚未進行過PIX陽性細胞對除同源腺病毒以外的病 毒的試-驗。
實施例12: PIX對CR細胞中MVA復制的影響
也定量分析了 PIX蛋白對CR細胞的積極影響。與CS細胞相反， CR細胞適合懸液。對于很多工業應用優選懸浮培養物。因此，我們 測定PIX在與貼壁培養相反的這樣的系統中的作用。
對于CR細胞，PIX的支持作用并不如在CS細胞中的明顯，但我 們始終觀察到較高的MVA滴度。在一系列的實驗中使MVA產量優 化，發現以中等細胞密度在感染后48 h時最大。圖14顯示了懸浮克 隆CR.HS (從幾個克隆中選定為具最大MVA產量的細胞系)和PIX(+) 細胞系CR.MCX的比較。橫坐標表示m.o丄(分別為0.01 、0.05或0.1)， 縱坐標表示裂解量(burst)，泡的大小表示細胞密度(分別為8、 2或 0.8xl()S個細胞/ml)。裂解量為輸出病毒(或產量)與輸入病毒(隨細胞數 量和m.o丄而定的接種物)的比率，因此是對擴增效率的度量。在所有 構型中，PIX(+)細胞系的性能都超過PIX(-)細胞系。
實施例13: PIX的細胞核排除
產生PIX-GFP融合基因以顯現PIX蛋白在活細胞中的分布，并克 服可利用的抗體結合活性弱的缺陷用Acc I und Dra I限制性酶處理 質粒76F pEFPIXl，用Klenow聚合酶使末端平端化(所有酶皆來自 New England Biolabs, Beverly, MA 01915-5599, USA)。在復雜的帶型 中，通過瓊脂糖凝膠提取(來自Qiagen的凝膠提取試劑盒,40724 Hilden， Germany)分離所期需的含有PIX編碼序列的447 bp片段。Dral限制 性酶識別序列"ttTAAa",在最后一個胸苦殘基后切開，其中中心 "TAA，，三聯密碼子為PIX可讀框的終止密碼子。因此，447bp片段缺 乏終止密碼子。將該片段融合到用Smal(也來自New England Biolabs) 切開的質粒pEGFP-Nl中的EGFP基因，產生PIX之后接EGFP的連
續融合基因。在本文中將得到的質粒命名為p9GFP，所表達的融合蛋 白命名為PIX-GFP。
用p9GFP轉染CS和CR細胞，并用300 pg/mL遺傳霉素(genetidn) (Invitrogen)選擇PIX-GFP穩定表達的細胞。在2周內觀察到兩個不同 的PIX-GFP表達群體 一個群體通常在細胞質中有2-5個PIX-GFP 亮點，另一個群體在細胞質中有更均一的PIX-GFP表達，在鄰近細胞 核的區域有更為彌散的GFP信號積聚。在這兩種情況下，細胞核都表 現為暗區，提示沒有或幾乎沒有嵌合蛋白進入細胞核。這兩類 CRpIXGFP克隆的代表性例子示于圖15。
與該結果一致的是，通過對PIX —級序列施用搜索算法NetNES (Cour等，Protein Eng. Des. Sel. 17, 527-536 (2004)),我們在PIX可讀 框中找到了核輸出序列。用該程序鑒別的NES為 313-GCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTT-342 (SEQ ID NO:17)(翻譯為AQLDSLTREL; SEQIDNO:18)。就我們所知，這 是第 一次闡述PIX蛋白中的這樣的信號。相反，文獻中未曾闡述過PIX 的核定位序列(NLS)，并且我們不能檢測到這樣的信號(例如，用由 Columbia University 在
http:〃cubic.bioc.columbia.edu/cgi/var/nair/resonline.pl中j是供的算法)。
因此，在我們的鴨細胞中PIX-GFP的細胞質定位與PIX的一級序 列一致。
實施例14: PIX GFP融合變異體
用另外的PIX融合構建體研究PIX GFP的令人驚訝的細胞核排 除。通過插入合成寡核苷酸i185和U86，由上述p9GFP構建體得到 PIX-GFP-NLS表達質粒。讓這些寡核苷酸在8(TC變性5分鐘，使其 在10mMMgCl2中經逐漸冷卻到室溫來退火，產生
5'-GATGTACAAAGATCCGAAGAAGAACCGCAAAGGTTAAC GCGGCCGCAC-3' (SEQ ID NO: 19)3'-CTACATGTTTCTAGGCTTCTTCTTGGCGTTTCCAATTGCG CCGGCGTG-5' (SEQ ID NO:20)
用BsrG I和Not I消化該雙鏈寡核苦酸，將其插入到p9GFP的相 同位點。翻譯后，該插入將與猿猴病毒40 NLS相似的NLS序列 (PKKNRK; SEQ ID NO:21)加到PIX-GFP融合蛋白。用該插入片段導 入的新Hpa I位點用作診斷標記，以確證成功克隆。將得到的質粒稱 為p9 GFP NLS ，所表達的蛋白PIX-GFP-NLS和編碼蛋白 pIX-GFP-NLS的可讀框分別示于SEQ IDNO:23和22中。
用引物EBR 44A (5'-GGATCCTTCCTCCTCGGGCGGGTGT-3'; SEQ ID NO:24) 、 V293
(5'-AACCAGCGCTACCATGAGCACCAACTCGT 3'; SEQ ID NO:25) 和作為模板的質粒弁67F pEF PIX RARA NEO,經由PCR擴增含有 PIX-RARA的片段，產生GFP標記的PIX-RARA融合蛋白。用多核 苷酸激酶處理1926bp的擴增子，插入到用EcoRI線性化并用Klenow 酶平端化的pEGFP-C2 (Clontech)中(所有酶都來自New England Biolabs)。所產生的質粒稱作p9 GFP RARA,所表達的蛋白為pIX GFP RARA。
圖16所示為在瞬時轉染的CHO細胞中各種GFP標記的蛋白的 胞內分布。
實施例15: PIX和干擾素
很多病毒經由TLR-3 (toll樣受體3)誘導先天細胞免疫應答。 TLR-3識別雙鏈RNA這種病毒復制特征模式。TLR-3功能有活化 NFkB和I型干擾素(Alexopoulou等，Nature 413, 732-738 (2001))。干 擾素介導宿主細胞中的抗病毒狀態。經由人工雙鏈RNA poly I:poly C (聚次肌苷酸-聚胞苷酸，Sigma)檢查干擾素誘導的作用。出人意料地， CR和CRpIX細胞對poly I:poly C幾乎不敏感，而CS細胞明顯對該 誘導物有應答。出乎意津+的是，比起親代CS細胞，PIX陽性的CS細
胞應答更快，并且在較低的濃度下應答(圖17)。就我們所知，在現有
文獻中尚未闡述PIX和干擾素之間的關系。
在CS細胞中PIX對MVA的支持作用比在CR細胞中強，并且 所述CS細胞對雙鏈RNA替代物的應答好于CR細胞。已知MVA誘 導干擾素，并且該病毒還裝備減緩干擾素反應的蛋白。因此，測定了 poly I:poly C誘導物對CRp9GFP和CSp9GFP細胞中MVA的作用。 圖18提示，MVA感染的細胞比未被感染的對照受polyl:polyC損害 d、一些。這一觀察結果與MVA既誘導又干擾細胞先天免疫應答的事 實一致，并與我們關于來自禽類細胞中的人腺病毒的PIX與高度減毒 的痘病毒抗病毒蛋白合作以提高后一種病毒產量這一意料之外的觀 察結果相關聯。
序列表-自由文本
SEQIDNO
1，2
3,4
6- 11 12
13- 16 17-18 19一20 21
22-23 24 — 25
說明 腺病毒pIX蛋白 融合蛋白pIX-RARA; Ad5 E1A+E1B 引物
"短"人翻譯延伸因子2啟動子
引物 NES
編碼NLS的合成寡核香酸 NLS
融合蛋白pIX-GFP-NLS
引物
權利要求
1.用于制備非腺病毒靶病毒或一種或多種靶蛋白的方法，該方法包括(a)培養表達細胞，所述表達細胞可通過用所述病毒、或用攜帶編碼所述病毒的核酸序列的載體、或用攜帶編碼所述一種或多種靶蛋白的核酸序列的載體感染或轉染宿主細胞而得到，所述細胞在其基因組中穩定整合了編碼作為異源調節蛋白的腺病毒PIX或其功能變異體的基因，并穩定地表達所述調節蛋白或其功能變異體，和(b)分離所述靶病毒或所述靶蛋白。
2. 權利要求1的方法，其中(i) 所述異源調節蛋白調節轉錄和/或細胞生長，并且提高所述細 胞生產不含所述調節蛋白的病毒和生產不同于所述調節蛋白或其功 能變異體的蛋白質的生產率；和/或(ii) 所述異源調節蛋白的功能變異體為融合蛋白，優選所述融合 蛋白包含至少一個包含如前述所定義的腺病毒PIX調節蛋白的第一結 構域、和至少一個調節或擴大所述腺病毒pIX的活性或亞細胞分布的 第二結構域；和/或(iii) 以上(ii)中所述至少一個第二結構域包含用作轉錄調節物的蛋 白質或肽，優選所述轉錄調節物為轉錄因子，包括視黃酸受體a;為 標記蛋白，優選所述標記蛋白為熒光標記，包括GFP、 DsRed和其變 異體，或為酶，包括LacZ;或為轉運肽，包括NLS;和/或(iv) 上述(ii)和(iii)中的所述第一結構域和第二結構域直接或經由 肽接頭彼此共價連接；和/或(v) 所述異源調節蛋白或其功能變異體以至少1 pg g胞內蛋白的 量、優選以至少10pg/Vg胞內蛋白的量在所述宿主細胞和所述表達細 胞中表達；和/或 (Vi)所述異源調節蛋白或其功能變異體在穩定的同源或異源啟動 子的控制下，優選所述啟動子為組成型細胞啟動子，最優選為人易位延伸因子2啟動子。
3. 權利要求2的方法，其中所述異源調節蛋白(i) 為所述腺病毒PIX，優選為具有SEQIDNO:2中所示序列的蛋 白；或(ii) 為PIX和視黃酸受體a的融合蛋白，優選為具有SEQIDNO:4 中所示序列的融合蛋白；或(iii) 為PIX和GFP的融合蛋白，并含有NLS序列，優選為具有 SEQIDNO:23中所示序列的融合蛋白；或(iv) 為PIX和GFP的融合蛋白或PIX和分離的NLS序列的融合蛋白。
4. 權利要求1-3中任一項的方法，其中(i)所述宿主和表達細胞為脊推動物細胞，包括哺乳動物細胞和禽 類細胞，其中所述哺乳動物細胞優選為人細胞、嚙齒動物細胞，包括 小鼠、大鼠、倉鼠細胞等，最優選為來源于人腦的細胞、小鼠NSO 或Sp2/0細胞、BHK或CHO細胞，人腦細胞包括人胎腦細胞，例如 胎神經細胞和胎神經膠質細胞，所述禽類細胞優選為鴨、雞、鵪鵓或 鵝細胞，最優選為來源于鴨視網膜的細胞或來源于鴨體節的細胞；和 /或細胞；和/或(iii) 所述宿主和表達細胞攜帶另外的無限增殖化(病毒)基因，包括 腺病毒的El蛋白，優選哺乳動物腺病毒C群5型，最優選所述細胞 攜帶SEQIDNO:5中所示的腺病毒E1A和/或E1B基因；和/或(iv) 所述細胞進一步攜帶功能序列，例如選擇標記序列、剪接供體 /受體位點和/或允許待表達靶核酸序列在所述細胞中整合的重組酶識 別序列。
5. 權利要求1-4中任一項的方法，其中(i) 所述靶病毒選自野生型突變型或缺失型病毒、冷適應病毒或減 毒病毒、疫苗抹、攜帶異源基因的病毒載體、病毒載體諸如慢病毒、 痘病毒和腺相關病毒(aav),痘病毒包括諸如修飾的安卡拉痘苗的牛痘 病毒、禽痘病毒或金絲雀痘病毒；(ii) 所述一種或多種把蛋白選自抗體；重組蛋白，諸如促紅細胞 生成素、a-l-抗胰蛋白酶、凝血因子VIII和IX和干擾素；病毒抗原， 諸如流感HA和NA、 HBV-S、皰滲病毒G蛋白和狂犬病毒G蛋白； 和肽類激素。
6. 權利要求1-5中任一項的方法，其中所述宿主和表達細胞來源 于人腦，優選來源于人胎腦，最優選為NC5T11細胞，所述細胞攜帶 編碼作為異源調節蛋白的腺病毒PIX或其功能變異體的核酸序列，優 選所述異源調節蛋白由SEQ ID NO:l 、 SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:22 中所示的核酸編碼。
7. 權利要求6的方法，其中所述宿主細胞為NC5T11#34細胞， 所述表達細胞來源于NC5T11#34細胞，所述NC5Tlltf34細胞保藏于 DSMZ,保藏號為DSM ACC2744。
8. 權利要求1-5中任一項的方法，其中所述宿主和表達細胞為禽 類細胞，優選來源于鴨視網膜或鴨體節，所述細胞攜帶編碼作為異 源調節蛋白的腺病毒PIX或其功能變異體的核酸序列，優選所述異源 調節蛋白由SEQ ID NO:l、 SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:22中所示的 核酸編碼。
9. 權利要求8的方法，其中所述宿主細胞為CR.PIX (17allb)細 胞，所述表達細胞來源于CR.PIX (17allb)細胞，所述CR.PIX (17allb) 細胞保藏于DSMZ，保藏號為DSM ACC2749。
10. 權利要求1-9中任一項所定義的用于生產靶病毒或一種或多 種靶蛋白的表達細胞。
11. 權利要求10的表達細胞，所述細胞為如權利要求6-9所定義 的細月包。
12. 用于制備權利要求10或11的表達細胞的方法，所述方法包 括用病毒、或用攜帶編碼所述病毒的核酸序列的載體、或用攜帶編碼 所述一種或多種靶蛋白的核酸序列的載體來感染或轉染如權利要求 1 -9或6-9中任一項所定義的宿主細胞系。
13. 權利要求6-9中所定義的宿主細胞。
14. 用于制備權利要求13的宿主細胞的方法，所述方法包括用 攜帶所述調節蛋白或其功能變異體的載體來轉染合適的起始細胞。
15. 權利要求10或11的表達細胞用于制備靶病毒或一種或多種 靶蛋白的用途。
16. 權利要求2或3所述的融合蛋白，其包含至少一個第一結構 域和至少一個第二結構域，所述第一結構域包含腺病毒PIX調節蛋 白，所述第二結構域包含作為轉錄調節物和/或作為亞細胞耙向信號的 蛋白質或肽。
17. 核苦酸序列，其編碼權利要求16的融合蛋白。
18. 載體，其包含權利要求17的核苷酸序列。
全文摘要
本發明提供用其基因組中穩定地整合了編碼特定異源調節蛋白之基因的有效表達細胞系來制備非腺病毒靶病毒或靶蛋白的方法。
文檔編號C07K14/075GK101356265SQ200680050690
公開日2009年1月28日 申請日期2006年11月8日 優先權日2005年11月8日
發明者E·布倫克, I·喬丹, V·桑迪格 申請人:普羅拜奧根股份公司