用于工業生產檸檬酸的基因的制作方法

專利名稱：：用于工業生產檸檬酸的基因的制作方法用于工業生產檸檬酸的基因本發明涉及新鑒定出的基因，其編碼檸檬酸(生物)合成中涉及的蛋白質。本發明還涉及包含所述新穎基因的全長多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸編碼的新穎的多肽及其片段，以及它們的功能等同物。本發明還涉及所述多核苷酸和多肽作為生物技術工具在從微生物生產檸檬酸中的用途，其中對所述多核苷酸和/或被編碼的多肽的修飾對在所述微生物中生產所述發酵產物的產率、產量和/或效率有著直接或間接的影響。本發明還包括使用所述多核苷酸和經修飾的多核苷酸序列轉化宿主微生物的方法/工藝。本發明還涉及經過遺傳工程改造的微生物及其用于生產檸檬酸的用途。發明背景檸檬酸(2-羥基-丙烷-l，2，3-三羧酸)是已知的工業上重要的有機酸，其可用作為，例如，食物添加劑、防腐劑或油或脂肪的穩定性，因為其具有絡合重金屬離子，例如銅和鐵的能力。最初，從柑橘類植物中分離出檸檬酸。對檸檬酸的化學合成也是可能的，但是，這根本不適合進行工業生產，因為原材料昂貴，工藝復雜，產率低下。因此，在過去數十年來，人們在研究使用微生物轉化制造檸檬酸的其它手段，這將更經濟更環保。使用不同培養方法從多種底物(包括葡萄糖或蔗糖)生產檸檬酸已被報道于若干種微生物中，例如真菌，包括酵母。能直接生產檸檬酸的已知真菌的例子包括，例如，來自J^e^7/^屬的菌株，特別是Am'ger，或酵母，例如y"/rcw/"，特另!j是yia;rcw/fl/ir》o/jricfl。底物(例如，碳水化合物)向檸檬酸的轉化可能涉及很多不同的代謝途徑，并且牽涉到很多酶促步驟，以產生檸檬酸。此外，轉運蛋白可能在底物向擰檬酸的高效轉化中發揮重要作用。在將物質，例如碳水化合物(例如葡萄糖或糖醇)、羧酸鹽/酯、礦物質、毒性化合物(例如反應活性氧)以及相關化合物在膜上轉運的過程中具有活性的蛋白質(特別是轉運蛋白)，在本文中被認為涉及轉運系統(TS)。這種轉運可以是運進胞質，運進/出線粒體、液泡、內質網、過氧化物酶體或運經另外的膜屏障。此類蛋白在本文中被縮寫為TS蛋白，其在檸檬酸合成中具有功能，或在細胞內合成檸檬酸的過程中具有功能。一般而言，TS蛋白是膜結合的，或者與膜結合的結構相關，它們作為單種蛋白質或作為蛋白質復合物(例如透性酶或活性轉運蛋白)中的亞基發揮功能。TS蛋白已知負責選擇性促進、協助或使得化合物(例如，糖、糖醇、羧酸鹽/酯、礦物質、毒性化合物)能夠被轉運經過細胞膜、周質膜或線粒體的液泡膜、內質網膜或過氧化物酶體膜。可基于其機制將TS蛋白質分為若干類。第一組轉運蛋白也被稱為離子通道，其使用來自質子運動力的能量，逆濃度梯度轉運分子。同向轉運和反向轉運系統將兩種不同分子經過膜的移動偶聯起來(通過針對兩種不同分子具有兩個單獨結合位點的透性酶)；在同向轉運中，兩種分子以同樣的方向被轉運；而在反向轉運中，一種分子運進而另一種運出。還有一類被稱為"次級轉運蛋白"的轉運蛋白一一磷酸轉移酶系統(PTS)通過高能量磷酸基團從磷酸烯醇丙酮酸經由多種蛋白組分向底物的轉移獲得能量，底物在運入時被磷酸化為磷酸酯形式。該組的離子轉運蛋白協助在膜上的擴散，例如，陽離子擴散協助蛋白(CDF)家族，或協助交換陰離子，例如陰離子交換蛋白(AE)家族。該組主要易化超家族(MajorFacilitatorSuperfamily，MFS)含有多種重要的糖轉運蛋白。另一組轉運蛋白將ATP的水解與底物易位偶聯起來。這些系統被稱為ATP結合盒(ABC)型轉運蛋白。ABC轉運系統由底物特異性結合蛋白(在革蘭氏陰性細菌中位于周質中，或者，在革蘭氏陽性細菌中與膜相關)、整合膜結構域和面向胞質的ATP水解結構域構成。對膜轉運系統的更詳細描述可在Bamberg,E.etal(1993)"Chargetransportofionpumpsonlipidbilayermembranes",Q.Rev.Biophys.26:1-25;Findlay，J.B.C.(1991)"Structureandfunctionofmembranetransportsystems",Curr.Opin.Struct.Biol.丄:804-810;Higgins,C.F.(1992)"ABCtransportersfrommicroorganismtoman"Ann.Rev.CellBiol.3:67-113;Gennis，R.B.(1989)"Pores,channelsandtransporters"in:Biomembranes,MolecularStructureandFunction,Springer,Heidelberg,p.270-322;Nikaido，H.&SaierH.(1992)"Transportproteinsinbacteria:commonthemesintheirdesign"Science258:936-942中找到。優選地，TS蛋白或此類蛋白的具有針對從碳水化合物合成擰檬酸的活性或涉及所述合成的亞基選自由己糖轉運蛋白、離子轉運蛋白、激酶、透性酶、同向轉運蛋白、反向轉運動蛋白、線粒體運載體(例如檸檬酸鹽轉運蛋白)或三羧酸鹽運載體、線粒體組蛋白的遏制子(suppresor)和金屬轉運蛋白(例如，錳轉運蛋白或錳抗性蛋白或鐵轉運蛋白)構成的組。在參與檸檬酸鹽/酯合成的蛋白質，特別是酶，例如參與TCA的酶，例如，催化乙酰CoA與草酰乙酸鹽/酯縮合形成檸檬酸的酶，在本文中被稱為涉及檸檬酸鹽/酯合成系統，并被縮寫為CS蛋白，其在檸檬酸合成中發揮功能。優選地，CS蛋白或者此類蛋白的具有針對檸檬酸鹽/酯合成的活性或參與檸檬酸鹽/酯合成的亞基選自由檸檬酸鹽合酶、乙醛酸循環體檸檬酸鹽合酶、烏頭酸酶、烏頭酸鹽水合酶或水解酶以及6-磷酸果糖激酶。參與側支反應的蛋白質，特別是酶，例如，Mn依賴性線粒體超氧化物歧化酶(MnSOD)，參與所謂的檸檬酸合成途徑"旁路"的基因，例如，草酰乙酸水解酶、葡糖氧化酶和/或乙醇酸鹽(氧化)還原酶，可能對檸檬酸合成的細胞內過程造成影響。此類酶在本文中被縮寫為BS蛋白或BS酶。以前已報道過用Aspergillus的菌株來生產檸檬酸(見，例如，KaraffaandKubicek,ApplMicrobiolBiotechnol，61:169-196,2003)。然而，如現有技術所知，檸檬酸生產的產率和/或生產能力仍可被提高，這正是本發明的目的之一。圖1:BS08基因置換型載體pGBDEL-SODA的質粒圖譜。該質粒用于打斷BS08基因。標出了相對于amdS標記而言的5'BS08側翼區域(示為5，sodA)和3，BS08側翼區域(示為3，sodA)。BS083，片段的序列在序列上覆蓋至少數百bp。通過在轉化A.niger菌株之前用限制性酶^出I和Xwal消化來除去E.coliDNA。圖2:BS08基因缺失的示意圖。通過雙交叉同源重組(X)，將包含側翼有BS08基因同源區域(5'和3，)的amdS選擇標記的線性DNA構建體pGBDEL-SODA(1)整合進基因組的BS08基因座(2)，并且替換基因組BS08基因拷貝(3)。隨后，正向重復上的重組(U)除去了amdS標記，導致了對BS08基因的精確切割(4)。圖3:表達載體pGBFIN-23的質粒圖譜。這是基于pGBFIN的表達載體的例子，例如，pGBFIN-23。標出了相對于g/flA啟動子而言的glaA側翼區域和克隆位點(針對目標基因)。可通過在轉化Am'gw菌株之前用限制性酶7VwI消化來除去Eco〃DNA。圖4:表達載體pGBTOPGLA-l的質粒圖譜。這是基于pGBTOP的表達載體的例子。標出了pBTOPGLA-l的質粒圖譜，這是整合型表達載體，其含有與目標基因編碼序列可操作相關的啟動子。圖5:過量表達載體pGBFINMNR-l的質粒圖譜。該質粒包含TS08基因，其示為mnrl。標出了相對于g/aA啟動子而言的glaA側翼區域以及編碼本發明錳抗性蛋白的插入(在///mffll-loI克隆位點中)。可通過在轉化Am'gw菌株之前用限制性酶A^I消化來除去五.DNA。圖6:過量表達菌株在表面發酵中的表現。示出了表2的菌株，按照實施例4所述進行發酵。多種菌株的表現被示出為較之WT3菌株產率(被設定為100%)而言的檸檬酸生產產率。圖7:BS08打斷背景的過量表達菌株在表面發酵中的表現。示出了表2的菌株，按照實施例4所述進行發酵。多種菌株的表現被示出為較之WT3菌株產率(被設定為100%)而言的檸檬酸生產產率。圖8:過量表達菌株在深浸發酵中的表現。示出了表2的菌株，按照實施例5所述進行發酵。多種菌株的表現被示出為較之WT3菌株產率(被設定為100%)而言的檸檬酸生產產率。圖9:BS08打斷背景的過量表達菌株在深浸發酵中的表現。示出了表2的菌株，按照實施例5所述進行發酵。多種菌株的表現被示出為較之WT3菌株產率(被設定為100%)而言的檸檬酸生產產率。發明詳述令人吃驚地，我們發現，具有下述核苷酸序列的多核苷酸編碼的蛋白在對檸檬酸的生物技術生產中具有重要作用，所述核苷酸序列優選在高度嚴謹條件下分別與選自SEQIDNOs:1、6、11和16的組的TS08、TS09、CS07和BS08核苷酸序列雜交。現還已發現，通過在能直接生產檸檬酸的微生物(例如Aspergillus)中對根據本發明的核苷酸的表達水平進行遺傳改變，可很大程度地提高所述微生物中檸檬酸生產的效率，導致，例如，更高的檸檬酸產量和/或產率。因此，本發明涉及選自下述組的TS08、TS09、CS07禾卩/或BS08多核苷酸或此類多核苷酸的互補鏈，所述組由(a)編碼分別包含選自SEQIDNOs:2、7、12和17的組的氨基酸序列的TS08、TS09、CS07或BS08多肽的多核苷酸；(b)包含選自SEQIDNOs:1、6、11和16的組的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來自微生物的基因組DNA作為模板，并分別使用選自SEQIDNO:3和SEQIDNO:4、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14或SEQIDNO:18和SEQIDNO:19的引物組，通過核酸擴增(例如聚合酶鏈式反應)來獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(c)中任一項的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個或多個氨基酸殘基較之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有TS08、TS09、CS07或BS08多肽的活性;(e)編碼TS08、TS09、CS07或BS08多肽的多核苷酸，且其互補鏈能在嚴謹條件下與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸雜交；以及(f)編碼TS08、TS09、CS07或BS08多肽的多核苷酸，且其與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸至少70%同源，例如75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同源；構成。在本發明的一種優選實施方式中，本發明涉及選自下述組的TS08和/或TS09多核苷酸或此類多核苷酸的互補鏈，所述組由(a)編碼分別包含選自SEQIDNO:2或SEQIDNO:7的氨基酸序列的TS08或TS09多肽的多核苷酸；(b)包含根據SEQIDNO:l或SEQIDNO:6的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來自微生物的基因組DNA作為模板，并分別使用根據SEQIDNO:3和SEQIDNO:4或SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的引物組，通過核酸擴增(例如聚合酶鏈式反應)來獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(c)中任一項的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個或多個氨基酸殘基較之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有TS08或TS09多肽的活性；(e)編碼TS08或TS09多肽的多核苷酸，且其互補鏈能在嚴謹條件下與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸雜交；以及(f)編碼TS08或TS09的多核苷酸，且其與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸至少70%同源，例如75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同源;構成。我們發現，本文中描述的SEQIDNOs:2、7、12和17示出的從A^wgz7/wsm'gwCBS513.88分離的TS、CS和BS蛋白是特別有用的TS蛋白，因為看起來其在微生物(特別是真菌，例如^^wg///^)中的檸檬酸生產中發揮關鍵作用。因此，本發明涉及編碼選自SEQIDNOs:2、7、12和17的多肽的多核苷酸。所述蛋白可由分別選自SEQIDNOs:1、6、11和16的組的核苷酸序列編碼。本發明因此還涉及包含選自SEQIDNOs:1、6、ll和16的組的核苷酸序列的多核苷酸。對應的cDNA's分別示于SEQIDNOs:5、10、15和20中。上文確定的核苷酸序列和氨基酸序列被用作為"查詢序列"，以用來自NationalCenterforBiotechnology[NCBI]的BLAST或Blast2程序(版本2)針對數據庫PROSW-SwissProt(完全發布版本加上增加的更新)進行搜索。由這些搜索中，將根據SEQIDNO:1的TS08多核苷酸標注為編碼具有錳抗性蛋白1活性的蛋白。將根據SEQIDNO:6的TS09多核苷酸標注為編碼具有對鐵和錳的轉運活性的蛋白。將根據SEQIDNO:11的CS07多核苷酸標注為編碼具有檸檬酸鹽合酶活性的蛋白。可從CS和/或TS基因表達的增強和TS和/或CS多肽活性的增加或提高預計到擰檬酸產量的提高。將根據SEQIDNO:16的BS08多核苷酸標注為編碼具有線粒體超氧化物歧化酶MnSOD活性的蛋白。可從編碼錳依賴性線粒體超氧化物歧化酶的MnSOD基因的打斷/下調，預計到檸檬酸產量的提高。對MnSOD的打斷可能導致形成的超氧化物離子基降解受損。超氧化物導致的對蛋白質、脂類和核酸的"損傷"可解釋A.niger中Mn缺陷導致檸檬酸積累的很多多效性影響。可使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板，使用合適的寡核苷酸引物(例如分別根據SEQIDNO:3禾卩SEQIDNO:4、SEQIDNO:8禾口SEQIDNO:9、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14或SEQIDNO:18和SEQIDNO:19的核苷酸引物組)，按照標準PCR擴增技術，通過核酸擴增來獲得編碼分別根據SEQIDNOs:2、7、12和17的TS08、TS09、CS07或BS08多肽的核酸。優選地，根據SEQIDNO:3和SEQIDNO:4或SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的引物組被用于獲得編碼TS多肽(優選地，分別根掘SEQIDNOs:2禾P7的TS08或TS09多肽)的核酸。由此擴增出的核酸可被克隆進合適的載體，并通過DNA序列分析對其進行表征。此外，可通過對核酸的合成構建來獲得核酸。表1顯示了對本發明的DNA、多肽、編碼序列和核苷酸引物的SEQIDNOs的總覽。本文中使用的術語"多核苷酸"和"核酸"意欲描述DNA或編碼序列。從而，例如，術語"TS08多核苷酸"等包括根據SEQIDNO:1的TS08DNA和SEQIDNO:5的TS08編碼序列，但不包括根據SEQIDNOs:3和3的TS08正向/反向引物。類似地，本文中使用的術語"多肽"或"蛋白"意欲描述蛋白或多肽序列。從而，例如，術語"TS08多肽"等包括根據SEQIDNO:2的TS08多肽。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表1:本發明的DNA、多肽、編碼序列和核苷酸引物的SEQIDNOs的總覽本文中使用的術語"基因"指可從染色體DNA分離的多核苷酸。從而，例如，術語"TS08基因"等包括根據SEQIDNO:1的TS08多核苷酸。用于反應的模板可以是通過對從已知包含或懷疑包含根據本發明的多核苷酸的菌株制備的mRNA進行逆轉錄獲得的cDNA。PCR產物可被亞克隆和測序，以確保擴增出的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。然后可通過多種已知方法，用PCR片段分離全長CDNA克隆。例如，可標記擴增出的片段，用其篩選噬菌體或粘粒(cosmid)cDNA文庫。或者，經標記的片段可用于篩選基因組文庫。因此，本發明涉及包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來自微生物的基因組DNA作為模板，并分別使用選自SEQIDNO:3禾口SEQIDNO:4、SEQIDNO:8禾卩SEQIDNO:9、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14或SEQIDNO:18和SEQIDNO:19的引物組，通過核酸擴增(例如聚合酶鏈式反應)來獲得。優選地，根據SEQIDNO:3和SEQIDNO:4或SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的引物組被用于分別獲得本發明的TS08或TS09多核苷酸。本發明還涉及下述多核苷酸，其包含編碼被編碼的CS07、BS08、TS08或TS09多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個或多個氨基酸殘基較之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有TS、CS或BS多肽(優選地，CS07、BS08、TS08或TS09多肽)的活性。本發明還涉及下述多核苷酸，其編碼TS、CS或BS多肽(優選地，CS07、BS08、TS08或TS09多肽)，其互補鏈能在嚴謹條件下與本文定義的多核苷酸雜交。本發明還涉及下述多核苷酸，其與本文定義的多核苷酸至少70%同源，并且其編碼CS07、BS08、TS08或TS09多肽；本發明還涉及是上文定義的多核苷酸的互補鏈的多核苷酸。本發明還涉及可用于擴增或探測根據本發明的TS、CS和/或BS多核苷酸，以及可用于鑒定也攜帶有此類基因的微生物的種或科的引物、探針和片段。本發明還涉及包括本發明的多核苷酸的載體。因此，本發明涉及包含本發明的TS08、TS09、CS07禾口/或BS08多核苷酸(優選地，TS08禾口/或TS09多核苷酸)的載體以及含有本發明的TS08、TS09、CS07禾卩/或BS08多核苷酸(優選地，TS08和/或TS09多核苷酸)的載體，其中，所述多核苷酸與表達控制序列可操作地相連，以允許在原核和真核細胞中表達。本發明還涉及用本發明的TS08、TS09和/或CS07多核苷酸和/或上文剛描述的載體遺傳工程改造過的微生物。這些經工程改造的微生物被命名為TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07和TS08/TS09/CS07微生物。在另一實施方式中，上述微生物還經過包含下述多核苷酸的多核苷酸的額外遺傳工程改造，所述多核苷酸用于打斷或下調BS08多核苷酸。這些經工程改造的微生物可被命名為TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、deltaBS08曙TS08、deltaBS08-TS09、deltaBS08-CS07、deltaBS08-TS08/TS09、deltaBS08-TS08/CS07、deltaBS08-TS09/CS07禾卩deltaBS08陽TS08/TS09/CS07微生物。在另一實施方式中，在上述微生物中，通過對細胞中存在的、對于BS08多核苷酸的表達來說必要的核酸序列的修飾或失活來獲得BS08多肽產量或活性的降低。本發明還涉及經遺傳工程改造的微生物TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、deltaBS08-TS08、deltaBS08-TS09、deltaBS08-CS07、deltaBS08-TS08/TS09、deltaBS08-TS08/CS07、deltaBS08-TS09/CS07和deltaBS08-TS08/TS09/CS07，其中，通過對細胞中存在的、對于BS08多核苷酸的表達來說必要的核酸序列的修飾或失活獲得了可選被降低的BS08多肽產量或活性，所述微生物能以100g/l或更多的量從蔗糖生產檸檬酸。本發明還涉及生產能表達上文定義的多核苷酸編碼的的多肽的微生物和上文定義的多核苷酸編碼的多肽的工藝。因此，本發明涉及生產能表達TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多肽的細胞的工藝，所述工藝包括用本發明的TS08、TS09和/或CS07多核苷酸或包含本發明的TS08、TS09和/或CS07多核苷酸的載體對細胞進行遺傳工程改造。優選地，所述工藝包括用編碼TS08、TS09禾P/或CS07多肽的多核苷酸對細胞進行遺傳工程改造，其中，所述多核苷酸可被包含于載體中。在另一實施方式中，用于生產能表達上文所述的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多肽的細胞的工藝額外包含用包含下述多核苷酸的多核苷酸進行的額外遺傳工程改造，所述多核苷酸用于打斷或下調BS08多核苷酸。本發明還涉及上文定義的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多核苷酸用于從碳水化合物生產檸檬酸的用途。在一種優選實施方式中，上文所述的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多核苷酸用于從碳水化合物生產檸檬酸的用途與包含下述多核苷酸的多核苷酸用途組合，所述多核苷酸用于打斷或下調BS08多核苷酸。在另一實施方式中，TS08、TS09或CS07多核苷酸與表達控制序列可操作地相連，并被轉入微生物中。更優選地，所述表達控制序列包含調控序列和/或啟動子序列和/或終止子序列，其中，這些序列中的至少一種被改變，所述改變以使得所述微生物從碳水化合物生產檸檬酸的產率和/或效率提高的方式進行。進一步更優選地，所述表達控制序列被改變，所述改變以使得分別編碼TS08、TS09禾n/或CS07多肽的活性增加和/或提高的方式進行。優選地，用于生產檸檬酸的碳水化合物優選是選自葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、淀粉、玉米、木薯和多元醇構成的組的碳水化合物。本發明還涉及下述微生物，其中，TS和/或CS多肽的活性，優選地，TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多肽的活性，例如，分別根據SEQIDNOs:2、7和12的多肽的活性被增強和/或提高，使得從碳水化合物生產的檸檬酸的產率增加。優選地，上文所述的包含具有增強和/或提高的活性的多肽的微生物生產的檸檬酸的產率較之親本微生物生產的檸檬酸的量增加至少1%、2%、3%、4%、8%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、100%、200%、500%或者更高。這可例如通過將根據本發明的多核苷酸轉入重組或非重組微生物來實現，所述微生物可以含有CS07、BS08、TS08禾口/或TS09基因的內源等同物，或者可以不含。本發明還涉及下述微生物，其中，TS和/或CS多肽的活性，優選地，TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多肽的活性，例如，分別根據SEQIDNOs:2、7和12的多肽的活性被增強和/或提高，并且，BS08蛋白，例如根據SEQIDNO:17的多肽的活性被減少或消失，使得從碳水化合物生產的擰檬酸的產率增加。優選地，上文所述的包含具有增強和/或提高的活性的多肽的微生物生產的檸檬酸的產率較之親本微生物生產的檸檬酸的量增加至少1%、2%、3%、4%、8%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、100%、200%、500%或者更高。因此，本發明涉及在微生物中生產增強的內源TS08、TS09或TS08/TS08基因的工藝，所述微生物包含編碼TS08或TS09多肽的多核苷酸，例如，分別根據SEQIDNOs:2和7的TS08或TS09多肽，所述工藝包括對所述多核苷酸進行改變的步驟，所述改變以使得所述微生物對從碳水化合物生產的檸檬酸的生產的產率和/或效率提高的方式來進行。在另一實施方式中，額外地，在上文所述具有增強的內源TS08、TS09或TS08/TS09基因的微生物中，通過對所述微生物中含有的、包含編碼CS07多肽(例如，根據SEQIDNO:12的CS07多肽)的多核苷酸的多核苷酸進行改變來增強CS07基因。在另一實施方式中，額外地，在上文所述具有增強的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因的微生物中，內源BS08基因被打斷和/或下調，這通過改變所述微生物中含有的、編碼BS08多肽(例如，根據SEQIDNO:17的多肽)的多核苷酸來實現。在另一實施方式中，在上文所述具有增強的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因，或具有增強的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因以及打斷或下調的BS08基因的組合的微生物中，通過修飾或失活BS08基因表達所需的多核苷酸序列(優選地，控制序列)來獲得對內源BS08基因的降低的表達。在另一實施方式中，本發明涉及在微生物中生產TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多肽的工藝，所述工藝包括改變所述微生物的步驟，使得所述微生物生產具有增加和/或提高的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07活性的所述多肽，可選地，組合有減少的或消失的BS08活性，使得所述微生物對從碳水化合物生產的檸檬酸的生產產率和/或效率提咼°在另一實施方式中，本發明涉及生產能生產檸檬酸的微生物的工藝，所述工藝包括改變所述微生物的步驟，使得所述微生物生產具有增加和/或提高的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07活性的多肽，可選地，組合有減少的或消失的BS08活性，使得所述微生物對從碳水化合物生產的檸檬酸的生產產率和/或效率提咼。在另一實施方式中，本發明涉及生產含有至少一種包含本發明的多核苷酸(優選地，編碼TS08、TS09)的內源基因的微生物的工藝，所述工藝包括改變所述微生物的步驟，使得所述至少一種內源基因過量表達，導致所述微生物對從碳水化合物生產的檸檬酸的產率和/或效率提高。在一種優選的實施方式中，所述工藝額外包括下述改變微生物的步驟，使得包含編碼BS08多肽的多核苷酸的內源基因被下調或打斷。技術人員將知道如何增強和/或提高TS禾口/或CS蛋白(優選地，TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白)的活性。這些可以例通過對宿主生物進行遺傳修飾來完成，所述遺傳修飾以較之野生型生物產生更多或更穩定的TS和/或CS蛋白(優選地，TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白)的拷貝的方式來進行。技術人員將理解，重組和經典遺傳技術都可用于突變、修飾、增強或過量表達TS和/或CS基因，以使得基因或多個基因的活性提高和/或表達增加。類似地，技術人員將知道如何使BS蛋白(優選地，BS08蛋白)的活性降低或消失。這例如可以通過對宿主生物進行遺傳修飾來完成，所述遺傳修飾以較之野生型生物產生更少或不產生BS蛋白(優選地，BS08蛋白)的拷貝的方式來進行。類似地，技術人員將理解，重組和經典遺傳技術都可用于使BS蛋白的比活性減少或消失。此外，技術人員將理解，重組和經典遺傳技術都可用于使基因(優選地，BS08基因)突變、打斷、缺失、修飾或失活，從而使得基因或多個基因的表達減少。此外，例如可通過重組和經典誘變技術的組合，來獲得包含多種被上調和下調基因的組合的微生物。例如，可通過重組方法獲得TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多肽的過量表達；隨后，可使用經典誘變來下調BS08多核苷酸。根據另一實施例，可通過經典誘變來下調或打斷內源BS08多核苷酸，接著重組過量表達TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多核苷酸。經典和重組技術的其它組合也是本發明所包括的。在下述說明書中，將對通過增加TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白的活性，增加對從碳水化合物生產的檸檬酸的產率和/或產量的流程進行詳細描述。在進行必要修正后，這些方案可應用于其它TS和/或CS蛋白。為獲得產生更多拷貝的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因和/或蛋白的生物進行的修飾可包括使用強啟動子，或者對TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因(的部分)或其調控元件加以突變(例如，插入、缺失或點突變)。這還可包括將多個拷貝的基因插入到合適的微生物中。TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白比活性的增加也可通過本領域已知的方法來完成。此類方法可包括對TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因(的部分)的突變(例如，插入、缺失或點突變)。適合經典誘變的物理或化學誘變劑的例子包括Y射線或紫外(UV)照射、羥胺、N-甲基-N，-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、甲基磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、蟻酸和核苷酸類似物。使用此類試劑時，典型地，通過下述方法來進行誘變在存在選用的誘變劑的情況下，在合適條件下培養待誘變的親本細胞，以及選出展示出基因的表達降低的突變體細胞。本領域中還已知可以通過將TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白與特定增強子相接觸或與能與TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白發生特異性相互作用的其它物質相接觸，來增強給定蛋白質活性的方法。為鑒定出此類特定增強子，可表達TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白，并對存在懷疑能增強各TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白活性的化合物時的活性加以測試。還可通過對分別編碼TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白的信使RNA進行穩定化來增加TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白的活性。此類方法也是本領域己知的，見，例如Sambrooketal.,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.禾口Ausubeletal.(eds.),1995，CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)。在下述說明書中，將對通過使BS08蛋白的活性降低或消失，增加從碳水化合物生產的檸檬酸的產率和/或產量的流程進行詳細描述。在進行必要修正后，這些方案可應用于其它BS蛋白。為獲得產生更少拷貝的或不產生BS08基因和/或蛋白的生物所進行的修飾可包括使用弱啟動子，或者對BS08基因(的部分)或其調控元件加以突變(例如，插入、缺失或點突變)。使BS08蛋白比活性減少或消失也可通過本領域已知的方法來完成。此類方法可包括對BS08基因(的部分)的突變(例如，插入、缺失或點突變)。本領域中還已知可以通過將BS08蛋白與特定抑制劑相接觸或與能與BS08蛋白發生特異性相互作用的其它物質相接觸，來使給定蛋白質活性降低或消失。為鑒定出此類特定抑制劑，可表達BS08蛋白，并對存在懷疑能抑制BS08蛋白活性的化合物時的活性加以測試。可能的抑制用化合物可例如是針對BS08蛋白的單克隆抗體或多克隆抗體。此類抗體可通過對合適的實驗動物進行常規免疫方案來獲得。本發明可在攜帶有TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/Bs08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/Bs08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08基因或其同源物的任何微生物中進行。合適的微生物可選自真菌，特別是有絲真菌，或酵母，它們可作為野生型菌株存在，或者作為通過經典誘變和選擇方法獲得的突變體菌株存在，或者作為重組菌株存在。"有絲真菌"包括Eumycota和Oomycota亞門的所有有絲形式(如前文Hawksworthetal.，1995所定義的)。此類微生物的例子包括但不限于J5^erg7'〃us、^cremom.w附、v4wreo6os7.t//Mm、Ojptococci^、Fz加cwWww、Fws腦'謹、//簡/co/a、Magwa/oW/e、Mwcw、Afyce/z'op融ora、臉ocfl〃z7wos"'x、7Vewras^ora、i3aec//om_yc&s\尸em'"'〃z'wm、尸^om少ces、；Sc/n.zo//z_y〃wm、ra/aro附yces、TTzermooscws、77u'e/avi.a、7b/_y;oc/a&wm禾P7Wc/oAmra。本發明的優選的微生物選自有絲真菌的組，優選地，選自Aspergillus,更優選地，選自J.m'ger、Aa麗,n'、Aacw/e"加、i.y'opom'cws、Ao，ae、J.vflt/e腦's、J.car6ow腦'MS、A勵/"ge/w^、A/a"z'co,幽s、爿.Zra577/e聽、、J.n's、J.cost鎖'cae腦^或J./o幼V/ws，進一步更優選地，選自Aybe/油svarac油s或A/oe"V/ws，；"腿W5S進一步更優選地，選自爿.m'，var，謂on'，進一步更優選地，選自vlATCC1015,以及最優選地，選自Am'gwCBS513.88。本發明的微生物可在DNA水平或蛋白質水平上攜帶其它修飾(見上文所述)，只要此類修飾對生產檸檬酸的產率、產量和/或效率具有直接影響即可。由此，本發明的微生物可通過經典誘變和分子生物學的組合攜帶其它修飾，使得檸檬酸生產能力提高。此類其它修飾可例如影響編碼TS蛋白(例如，離子或糖轉運蛋白)的其它基因；涉及所謂"旁路"，例如，草酰乙酸鹽水解酶、葡糖氧化酶和/或乙醇酸鹽(氧化)還原酶的BS基因；編碼涉及檸檬酸鹽/酯生物合成的蛋白(例如，檸檬酸鹽合酶、烏頭酸酶)的CS基因；編碼涉及呼吸系統的蛋白(例如線粒體質子泵NADH:泛醌還原酶或氧化酶、6-磷酸果糖激酶pfkA，或細胞色素依賴性呼吸酶中的突變或替代性呼吸途徑)的基因。進行此類修飾的方法是本領域已知的，一些例子在本文中有進一步描述。在一種實施方式中，本發明涉及經修飾的微生物，其中，TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多肽的活性被增強和/或提高，BS蛋白，優選地，BS08蛋白的活性被減少或消失，使得從碳水化合物生產的檸檬酸的產率增加，同時組合上文定義的其它修飾，特別在可用于生產檸檬酸的編碼草酰乙酸鹽水解酶的基因中攜帶進一步的缺陷，例如，WO04/070022所述的。根據本發明的另一目的，提供了本文定義的多核苷酸或者已用此類多核苷酸進行過遺傳工程改造的微生物在生產檸檬酸中的用途。本發明還涉及在微生物中表達內源基因的工藝，涉及在微生物中生產上文定義的多肽的工藝，以及生產能產生檸檬酸的微生物的工藝。所有這些工藝都可包含改變微生物的步驟，其中，本文中使用的"改變"包括下述工藝，該工藝以使得發酵產物的產率和/或生產能力較之野生型生物有所提高的方式來進行"遺傳改變"或"改變細胞培養基的組成和/或改變用于培養的方法"。根據本發明的另一方面，提供了通過發酵生產檸檬酸的工藝。因此，本發明提供了從碳水化合物生產檸檬酸的工藝，其中，在允許從所述碳水化合物生產檸檬酸的條件下，在水性營養培養基中培養上文所述的微生物，并且，其中，檸檬酸作為發酵產物被分離。在一種優選的實施方式中，本發明提供了用可從本發明的方法之一獲得的微生物來生產檸檬酸的工藝，其中，在允許從碳水化合物生產檸檬酸的條件下，在水性營養培養基中培養所述微生物，并且，其中，檸檬酸作為發酵產物被分離。更優選地，碳水化合物選自由葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、淀粉、玉米、木薯和多元醇構成的組。本實施方式的微生物包含1)用本發明的TS08、TS09禾卩/或CS07多核苷酸和/或本文剛描述過的載體進行過遺傳工程改造的微生物。這些經工程改造的微生物被命名為TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07和TS08/TS09/CS07微生物。可選地，上述微生物經過了下述多核苷酸進行的額外遺傳工程改造，所述多核苷酸包含用于打斷或下調BS08多核苷酸的多核苷酸。這些經工程改造的微生物被命名為TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、deltaBS08-TS08、deltaBS08-TS09、deltaBS08-CS07、deltaBS08-TS08/TS09、deltaBS08-TS08/CS07、deltaBS08-TS09/CS07和deltaBS08-TS08/TS09/CS07微生物。可選地，在上述微生物中，通過對細胞中存在的、對于BS08多核苷酸表達來說必要的核酸序列進行修飾或失活來獲得BS08多肽活性或產量的降低。2)能以100g/l或更多的量從蔗糖生產檸檬酸的(1)的微生物。3)下述微生物，其中，TS和/或CS多肽的活性，優選地，TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多肽的活性，例如，分別根據SEQIDNOs:2、7和12的多肽的活性被增強和/或提高，使得從碳水化合物生產的檸檬酸的產率增加。優選地，上文所述的包含具有增強和/或提高的活性的多肽的微生物生產的檸檬酸的產率較之親本微生物生產的檸檬酸的量增加至少1%、2%、3%、4%、8%、10%、15°/。、20%、30%、40%、50%、100%、200%、500。/。或者更高。4)下述微生物，其中，TS和/或CS多肽的活性，優選地，TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多肽的活性，例如，分別根據SEQIDNOs:2、7和12的多肽的活性被增強和/或提高，并且，BS08蛋白，例如根據SEQIDNO:17的多肽的活性被減少或消失，使得從碳水化合物生產的檸檬酸的產率增加。優選地，上文所述的包含具有增強和/或提高的活性的多肽的微生物生產的檸檬酸的產率較之親本微生物生產的檸檬酸的量增加至少1%、2%、3%、4%、8%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、100%、200%、500%或者更高。5)如(1)至(4)中任意一項所述的微生物，其中，所述微生物選自有絲真菌的組，優選地，選自As^e^/〃ws，更優選地，選自Am'gw、Aa麗mon'、Aacw/e齒s、Aya/畫'ci^、Ao，ae、爿.vat/e腦、、J.carZwzan'ws、A勵z7zgms^、i./"Wco,齒5"、AZra威e/W7、、n、、爿.cost"r/cae腦^或爿./o"油s，進一步更優選地，選自爿.var或j./be"'fifi^var戸〃油s，進一步更優選地，選自Am'gwvar譜畫on'，進一步更優選地，選自A"/gwATCC1015，以及最優選地，選自Am'g^CBS513.88。可被轉化為檸檬酸的合適的碳水化合物可以例如是葡萄糖，或選自對其的吸收導致葡萄糖形成的碳源的組，例如，蔗糖、淀粉、玉米、糖蜜、木薯或多元醇。在糖蜜的情況下，可以使用甜菜或甘蔗糖蜜。碳水化合物可以是液化的形式，例如液化的玉米、淀粉或木薯，或者其可以是糖漿形式，例如葡萄糖、果糖、蔗糖或糖蜜的糖漿。所述底物的組合也是可行的。取決于發酵條件和所用的菌株，用作為底物的碳水化合物可變動。在深浸發酵的情況下，優選的碳水化合物選自，例如，葡萄糖、蔗糖糖漿或液化淀粉。在表面發酵的情況下，優選的碳水化合物選自，例如，糖蜜或蔗糖糖漿。深浸和表面發酵都是本發明所包括的。對檸檬酸工業生產的一個例子見US5081025所述。在使用微生物進行上述工藝的方面，將碳水化合物轉化為檸檬酸表示，碳水化合物轉化導致檸檬酸產生的過程是所述微生物進行的，即，底物可直接轉化為檸檬酸。在上文所述允許從碳水化合物進行此類轉化的條件下培養所述微生物。適合從給定碳水化合物生產檸檬酸的微生物能通過一個或多個生物轉化步驟將所述碳水化合物轉化為特定的產物，即，檸檬酸，而無須任何額外的化學轉化步驟。在本文中用于使用微生物進行的上述工藝的培養基可以是用于生產檸檬酸的任何合適的培養基。典型地，該培養基是包含例如鹽和(多種)底物，并具有一定pH的水性培養基。本文中使用的"發酵"或"生產"或"發酵工藝"可以是在適合于將合適的底物轉化為想要的產物(例如檸檬酸)的合適條件下，利用技術人員已知的培養基、條件和方案，使用生長中的細胞，或使用非生長中的所謂靜止細胞來進行，這在使用技術人員已知的培養基、條件和方案對所述靜止細胞進行培養之后進行。關于生產檸檬酸的此類工藝的一個例子見"CitricAcid",MaxRoehr，ChristianKubicek，JiriKominek,inBiotechnology2ndEd,WileyVCH,1997,pp308-345(通過引用并入本文)所述。典型地，發酵以分批、補料分批或連續模式進行。通過對從Ay/e^/〃wm'gerCBS513.88獲得的基因組克隆進行測序，來分別測定包含選自編碼TS08、TS09、CS07或BS08蛋白的SEQIDNOs:1、6、ll和16構成的組的核苷酸序列的基因的序列。本發明還涉及編碼分別根據SEQIDNOs:2、7、12和17的TS08、TS09、CS07或BS08多肽的至少一個生物活性片段或衍生物的多核苷酸。本文中使用的"生物活性片段或衍生物"表示保留有與選自SEQIDNOs:2、7、12和17的組的多肽基本相同的生物功能或活性的多肽。生物活性的例子可以例如是酶活、信號傳遞活性、轉運蛋白活性或抗體反應活性。術語"生物功能"或"功能等同物"在本文中使用時表示蛋白質與選自SEQIDNOs:2、7、12和17的組的多肽具有基本相同的生物活性，例如，酶活性、信號傳遞活性或者抗體反應活性。本發明的多肽和多核苷酸優選以經分離的形式提供，優選地，被純化至均質。術語"經分離的"表示物質被移出其原來的環境(例如，如果其天然存在的話，就是天然環境)。例如，活的微生物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是經分離的，但與天然系統中的一些或全部共存物質分開的同樣的多核苷酸或多肽就是經分離的。此類多核苷酸可以是載體的一部分和/或此類多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，但仍然是經分離的，因為此類載體或組合物并非其天然環境的一部分。本文中使用的經分離的多核苷酸或核酸可以是這樣的DNA或RNA，它們與從中獲得該多核苷酸或核酸的生物的天然存在的基因組中緊密相鄰的兩條編碼序列(5'末端一條，3，末端一條)并非緊密相鄰。因此，在一種實施方式中，核酸包括與編碼序列緊密相鄰的5'非編碼(例如，啟動子)序列的一些或全部。術語"經分離的多核苷酸"因此包括，例如，加入到載體中、加入到自主復制質粒或病毒中，或者加入到原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組DNA，或者作為獨立于其它序列的單獨分子(例如，通過PCR或限制性內切酶處理產生的cDNA或基因組DNA片段)存在的重組DNA。其還包括是雜合體基因的一部分的重組DNA，所述基因編碼基本不含細胞物質、病毒物質或培養基(當通過重組DNA技術生產時)或化學前體或其它化學物質(當通過化學方式合成時)的額外多肽。此外，"經分離的核酸片段"是這樣的核酸片段其天然并不作為片段存在，并且將不會在天然狀態被發現。本文中使用的術語"多核苷酸"、"基因"和"重組基因"指可與染色體DNA分離開的、包括編碼蛋白質(例如，ACBS513.88TS、CS或BS蛋白)的開放讀碼框的核酸分子。多核苷酸可包括，例如，選自SEQIDNOs:1、6、ll和16構成的組的多核苷酸序列或其片段以及基因序列上游或下游的區域，所述區域可包括，例如，對于由其獲得的多肽的適當表達和穩定來說重要的啟動子區域、調控子區域和終止子區域。基因可包括編碼序列、非編碼序列(例如，位于基因編碼區域3'末端和5'末端的非翻譯序列)和調控序列。此外，基因指本文定義的經分離的核酸分子。技術人員還將理解，導致TS、CS或BS蛋白氨基酸序列的變化的DNA序列多態性可存在于種群(population)中，例如，vi^erg/〃1^肌'ger種群中。CS07、BS08、TS08或TS09基因中的此類遺傳多態性可由于天然變異存在于種群的個體間，或者存在于不同種群的細胞中。典型地，此類天然變異可導致CS07、BS08、TS08或TS09基因核苷酸序列中1-5%的變化度。作為天然變異結果的、并且不會改變TS蛋白的功能活性的CS07、BS08、TS08或TS09中的任何以及全部此類核苷酸變異和由此得到的氨基酸多態性也包括在本發明的范圍內。本文中使用的術語"多核苷酸"或"核酸分子"或"核酸"可互換使用，它們意欲包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)禾nRNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸類似物產生的DNA或RNA的類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優選是雙鏈DNA。可使用寡核苷酸類似物或衍生物(例如，肌苷或磷硫酰核苷酸)來合成核酸。此類寡核苷酸可用于例如，制備具有改變的堿基配對能力或增加的對核酸酶的抗性的核酸。本發明的多核苷酸可以全部或部分地是合成多核苷酸。多核苷酸密碼子的使用可被改變，以增加在特定宿主中的表達。改變多核苷酸密碼子使用的一個例子見WO2006/077258所述。本文中提供的序列信息不應被狹義理解為需要包括進被錯誤鑒定的堿基。本文公開的特定序列可以很容易地用于從能將碳水化合物轉化為檸檬酸的重組或非重組微生物(特別是J^wgz7/wsw&er，優選地，^^wgz'〃Mm'g^CBS513.88)中分離出完整基因，隨后可容易地對該基因進行進一步的序列分析，由此鑒定出測序錯誤。除非特別指明，本文中通過對DNA分子進行測序來確定的所有核苷酸序列都是用自動DNA測序儀測定的，并且，本文測定的DNA分子編碼的多肽的所有氨基酸序列都是通過對按照上文所述測定的DNA序列進行翻譯來推測的。因此，如本領域所已知的，對由該自動方法所測定的任何DNA序列而言，本文所測定的任何核苷酸序列都可能含有一些錯誤。典型地，通過自動方法測出的核苷酸序列與被測序的DNA分子的實際核苷酸序列至少大約90%相同，更典型地，至少大約95%至至少大約99.9%相同。通過其它方法，包括本領域內公知的人工DNA測序方法，可對實際序列進行更為精確的測定。也如本領域所已知的，測得的核苷酸序列中較之實際序列的單個插入或缺失將會導致核苷酸序列翻譯中的讀碼框位移，使得從此類插入或缺失的點開始，測得的核苷酸序列編碼的預計氨基酸序列完全不同于被測序的DNA分子實際編碼的氨基酸序列。本領域技術人員能鑒定出此類被錯誤鑒定的堿基，并且知道如何改正此類錯誤。根據本發明的核酸分子可以僅包含本發明提供的核酸序列(例如，SEQIDNOs:1、6、11或16示出的序列)的一部分或片段，例如，可用作為探針或引物的片段(例如SEQIDNOs:3、4、8、9、13、14、18或19)或編碼根據本發明的蛋白的一部分的片段。從對TS08、TS09、CS07或BS08基因的克隆測定的核苷酸序列允許產生被設計來鑒定和/或克隆TS08、TS09、CS07或BS08家族其它成員以及來自其它物種的TS08、TS09、CS07或BS08同源體的探針和引物。典型地，所述探針/引物包含基本純化的寡核苷酸，其典型地包含與SEQIDNOs:1、6、11或16所示的核苷酸序列或其片段或衍生物的至少大約12或15個、優選大約18或20個、更優選大約22或25個、進一步更優選大約30、35、40、45、50、55、60、65或75個或更多個連續核苷酸雜交(優選地，在高度嚴謹條件下雜交)的核苷酸序列區域。還可通過聚合酶鏈式反應(PCR)，使用基于本文含有的序列信息設計的合成寡核苷酸引物，分離出包含選自SEQIDNOs:1、6、11或16的組的核酸序列的全部或一部分的核酸分子。此外，可通過基因合成產生核酸分子。可按照標準PCR擴增技術，用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，使用合適的寡核苷酸引物，來擴增本發明的核酸。由此擴增的核酸可被克隆進合適的載體，并通過DNA序列分析加以表征。根據本發明的多核苷酸的片段還可包含不編碼功能多肽的多核苷酸。此類多核苷酸可作為探針或引物用于PCR反應。不管其編碼功能或非功能多肽，根據本發明的核酸都可用作為雜交探針或聚合酶鏈式反應(PCR)引物。不編碼具有TS08、TS09、CS07或BS08活性的多肽的本發明核酸分子的用途包括(1)從cDNA文庫(例如來自除j^w^7/m外的其它生物)分離編碼本發明蛋白的基因或其等位變體，以及(2)用于探測特定細胞中所述蛋白的mRNA的表達的Northern印跡分析，或(3)用于增強和/或提高同源TS08、TS09、CS07或BS08基因在所述其它生物中的功能或活性。基于本文提供的核苷酸序列的探針可用于檢測編碼同樣或同源蛋白(例如，其它生物中的)的轉錄本或基因組序列。可基于其與本文公開的Am'gerTS08、TS09、CS07或BS08核酸的同源性，使用Am'gwDNA或其一部分作為雜交探針，按照標準雜交技術，優選在高度嚴謹雜交條件下，分離出對應于本發明的Am'gerTS08、TS09、CS07或BS08DNA的天然變體或非G.ox;^mw同源體的核酸分子，它們也包括在本發明內。在優選的實施方式中，探針還包含與其附著的標記基團，例如，標記基團可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶的輔助因子。例如，可使用基于本文教導的核苷酸序列設計的兩套簡并寡核苷酸引物庫，進行PCR來分離同源基因序列。用于反應的模板可以是通過對從已知能表達或懷疑能表達根據本發明的多核苷酸的菌株制備的mRNA進行逆轉錄獲得的cDNA。PCR產物可被亞克隆及測序，以確保擴增出的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。然后可通過多種已知方法，用PCR片段分離全長cDNA克隆。例如，可標記擴增出的片段，用其篩選噬菌體或粘粒cDNA文庫。或者，經標記的片段可用于篩選基因組文庫。PCR技術還可用于從其它生物分離全長cDNA。例如，可按照標準方案，從合適的細胞或組織來源分離RNA。可在RNA上進行逆轉錄反應，其中使用與擴增片段的5'最末端具有特異性的寡核苷酸引物，以引導第一鏈合成。然后可使用標準的末端轉移酶反應，對得到的RNA/DNA雜交體"加尾"(例如，用鳥嘌呤)，可用RNaseH消化雜交體，然后可(例如，用poly-C引物)引導第二鏈合成。由此，可容易地分離擴增的片段上游的cDNA序列。關于有用的克隆策略的綜述，參見，例如上文所述的Sambrooketal.和上文所述的Ausubeletal.。此外，編碼TS08、TS09、CS07或BS08家族其它成員、具有與根據SEQIDNOs:1、6、ll或16的各核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本發明的范圍內。此外，編碼來自其它物種的TS08、TS09、CS07或BS08蛋白、具有與SEQIDNOs:1、6、11或16示出的各核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本發明的范圍內。本發明還涉及經分離的多核苷酸，其可在嚴謹條件下(優選地，高度嚴謹條件下)與本發明的多核苷酸(例如，SEQIDNOs:1、6、11或16所示的多核苷酸)雜交。有利地，此類多核苷酸可從能將碳水化合物轉化為檸檬酸的微生物(特別是As^erg/〃Mm'ger，優選地，^s/ergz7/i^m'gerCBS513.88)中獲得。本文中用到的術語"雜交"被用來描述雜交和洗滌，在所述雜交和洗滌條件下，典型地，互相之間同源性為至少約50%、至少約60%、至少約70%、更優選為至少約80%、進一步優選為至少約85%到90%、最優選為至少95%的核苷酸序列保持相互雜交的狀態。在一種實施方式中，本發明的核酸與選自SEQIDNOs:1、6、11或16的組的核酸序列或其互補序列至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源或更同源。此類嚴謹雜交條件的一個優選的非限制的例子是在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，大約45。C下雜交，隨后在lxSSC、0.1。/。SDS中，50°C下進行一次或多次洗滌，洗滌優選在55。C下，更優選在60。C下，進一步更優選在65。C下進行。高度嚴謹條件包括在68°C，于6xSSC/5xDenhardt，s溶液/1.0%SDS中雜交，以及在0.2xSSC/0.1%SDS中于室溫下洗滌。或者，洗滌可在42°C、50°C、60°C、65。C或68。C下進行，以實現非常高的嚴謹度。雜交反應的"嚴謹度"是本領域普通技術人員易于確定的。關于雜交反應嚴謹度的其它細節和解釋，見Ausubeletal.，CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers,(1995)。優選地，與本發明的核苷酸序列雜交(優選在高度嚴謹條件下雜交)的本發明的經分離的核酸對應于天然存在的核酸分子。本文中使用的"天然存在的"核酸分子指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，編碼天然蛋白質)。在一種實施方式中，核酸編碼天然的A"/g^TS08、TS09、CS07或BS08蛋白。技術人員知道何種條件適合用于嚴謹雜交條件及高度嚴謹雜交條件。本領域中易于獲得關于此類條件的其它指導，例如，在Sambrooketal.,1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.;禾卩Ausubeletal.(eds.)，1995，CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)中。當然，僅與poly(A)序列(例如mRNA的3，末端poly(A)區)或僅與T(或U)殘基的互補性延伸區段(stretch)雜交的多核苷酸將不會被包括在用于與本發明核酸的一部分特異性雜交的本發明多核苷酸中，因為此類多核苷酸將與任何含有poly(A)延伸區段的核酸分子或其互補序列(例如，實際上是任何雙鏈的cDNA克隆)雜交。采用典型手段，可以對從其它生物，例如能將碳水化合物轉化為檸檬酸的微生物(特別是其它A/e^7/w物種)構建的基因組DNA或cDNA文庫進行篩選。例如，可以通過Southern禾口/或Northern印跡分析來對A;^gz'〃uy的菌株進行篩選。在探測到與本發明多核苷酸同源的轉錄本之后，可以利用本領域技術人員公知的標準技術，由分離自合適菌株的RNA來構建DNA文庫。或者，可以使用能與本發明多核苷酸雜交的探針來對全基因組DNA文庫進行篩選。可使用標準的分子生物學技術以及本文提供的序列信息，來分離本發明的核酸序列，例如選自SEQIDNOs:1、6、11或16的組的核酸分子或其片段或衍生物。例如，可使用標準雜交和克隆技術(例如，Sambrook,J.,Fritsh，E.F.，禾卩Maniatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd,ed.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989所述)，使用選自SEQIDNOs:1、6、11或16的組的核酸序列的全部或一部分作為雜交探針，分離根據本發明的核酸分子。此外，可通過標準合成技術(例如，使用自動DNA合成儀)來制備對應于本發明的核苷酸序列的寡核苷酸或可與本發明的核苷酸序列雜交的寡核苷酸。術語"同源性"或"相同性百分比"在本文中可互換使用。就本發明的目的而言，在此定義為確定兩條氨基酸序列或兩條核酸序列的相同性百分比，本著最優比較的目的(例如，可以在第一條氨基酸序列或核苷酸序列上引入缺口，以與第二條氨基酸序列或核苷酸序列達到最佳的比對)，對序列進行比對。然后對相應氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸進行比較。如果第一條序列上某位置的氨基酸殘基或核苷酸與第二條序列上相應位置的相同，那么這些分子在此位置就是相同的。兩條序列間的相同性百分比是所述序列共有的相同位置的數量的函數(即，%相同性=相同位置的數量/位置(即重疊位置)總數X100)。優選地，這兩條序列長度相同。技術人員會知道有若干計算機程序可被用于確定兩條序列間的同源性。例如，可以使用數學算法來完成對序列的比對和對兩條序列間相同性百分比的確定。在一種優選的實施方式中，使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法來確定兩條氨基酸序列間的相同性百分比，所述算法已被合并到GCG軟件包(可從h加:〃www.accelrvs.com獲得)的GAP程序中，其中使用Blossom62矩陣或PAM250矩陣，缺口權重為16、14、12、10、8、6或4，長度權重為1、2、3、4、5或6。技術人員會意識到上述的所有不同參數將導致有細微區別的結果，但是使用不同算法時兩條序列的總體百分比相同性不會有顯著改變。在又一種實施方式中，使用GCG軟件包(可從http:〃www.accelrvs.com獲得)的GAP程序來確定兩條核苷酸序列間的相同性百分比，其中使用NWSgapdna.CMP矩陣，缺口權重為40、50、60、70或80，長度權重為1、2、3、4、5或6。在另一種實施方式中，使用E.Meyers禾nW.Miller(CABIOS，4:11-17(1989))的算法來確定兩條氨基酸序列或核苷酸序列的相同性百分比，所述算法已被合并到ALIGN程序(2.0版)(可從http:〃vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi獲得)中，其中使用PAM120權重殘基表，缺口長度懲罰(penalty)為12，缺口懲罰為4。在又一種實施方式中，使用CDA程序(Huang,1994，AContextDependentMethodforComparingSequences,Proceedingsofthe5thSymposiumonCombinatorialPatternMatching,LectureNotesinComputerScience807,Springer-Verlag,54-63)來確定兩條核苷酸序列間的相同性，其中參數如下設置(i)對于(多)肽比對而言錯配-2，缺口出現11，缺口延伸1，上下文長度(ContextLength):10，匹配獎勵1，以及(ii)對核苷酸序列對比而言，錯配-15，缺口出現5，缺口延伸2，上下文長度10，匹配獎勵1。用于比對和確定同源性的其它程序的例子是Clustal方法(Higgins,1989，CABIOS5:151-153)或ClustalW(ThompsonJD,HigginsDG，andGibsonTJ(1994)-CLUSTALW:improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,positions-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice.NucleicAcidsResearch22:4673-4680)。本發明的核酸和蛋白質序列可以進一步地被用作"查詢序列"來進行針對公眾數據庫的搜索，例如，去鑒定相關序列或家族中其它成員。可以使用Altschul,etal.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN和BLASTX程序(2.0版)來進行此類搜索。可以用BLASTN程序，以分數=100，字長(wordlength)=11來進行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序，以分數=50，字長=3來進行BLAST蛋白質搜索，以獲得與本發明的蛋白質分子同源的氨基酸序列。本著比較的目的，為獲得有缺口的比對，可以利用Altschuletal.,(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402中描述的GappedBLAST。當利用BLAST禾nGappedBLAST程序時，可以使用各個程序(例如BLASTX禾口BLASTN)的缺省參數。見http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov。在另一種優選的實施方式中，本發明的經分離的核酸分子包含是本發明的核苷酸序列(例如，選自SEQIDNOs:1、6、11或16的組的序列)的互補序列的核酸分子。與本文公開的核苷酸序列互補的核酸分子是這樣的序列其與選自SEQIDNOs:1、6、11或16的組的核苷酸序列足夠互補，從而其可與所述核苷酸序列雜交，由此形成穩定的雙鏈體(duplex)。在另一種優選的實施方式中，選自SEQIDNOs:1、6、11或16的組的本發明的核酸或其互補序列含有至少一處突變，所述突變導致基因產物具有經修飾的功能/活性。所述至少一處突變可通過本文所述的方法引入。在一個方面，所述至少一處突變導致產生這樣的各TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/BS08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/BS08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08蛋白其功能和/或活性較之野生型副本而言有所增強或提高。用于引入此類突變的方法是本領域公知的。本文中使用的術語_—活性的"增加"包括增加生產生物中一種或多種多肽的活性，所述多肽是本文所述的相應的多核苷酸編碼的。本領域中可獲得用于增加給定蛋白(在本文的情況下是TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/BS08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/BS08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08蛋白)活性的多種方法。通常，可增加蛋白質的比活性或者可以增加蛋白質的拷貝數。術語增加活性或者等同表達還包括下述情形其中，TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/BS08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/BS08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08蛋白活性被引入以前不含該活性的細胞，這例如通過將編碼TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/BS08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/BS08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08的基因引入以前不含該基因等同物的細胞或以前不能表達相應蛋白的活性形式的細胞來實現。為協助這種增加，對應于本文所述多核苷酸的基因的拷貝數可被增加。或者，可使用強啟動子來指導多核苷酸的表達。在另一種實施方式中，基因上游的啟動子、調控區域和/或核糖體結合位點可被改變，以增加表達。還可以通過增加信使RNA的相對半壽期來增強或加強表達。在另一種實施方式中，還可以通過利用多肽氨基酸序列中能增加活性的一處或多處突變來增加多肽自身的活性。例如，改變多肽與其相應底物的親和性可導致活性提高。類似地，可增加肽的相對半壽期。在基因表達增強或者比活性增加的情況下，可通過改變細胞培養基的組成和/或用于培養的方法來達成這種提高。本文中使用的"增強的表達"或"提高的活性"表示較之野生型蛋白、多核苷酸、基因、或多核苷酸或多肽被增強和/或提高之前存在的蛋白的活性和/或濃度而言，至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚至超過500%的增加。還可通過將蛋白與其活性的特異性或一般性增強劑相接觸來增加TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/BS08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/BS08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08蛋白的活性。在另一實施方式中，除了增強和/或提高TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白的活性之外，SEQIDNO:16所示的本發明的編碼BS08的核酸或其互補序列含有至少一處突變，所述突變導致基因產物具有經修飾的功能/活性，優選地，降低的活性。所述(至少一處)突變可通過本文所述的方法引入。在一個方面，所述(至少一處)突變導致產生這樣的BS08蛋白其功能和/或活性較之野生型副本而言被部分或全部破壞。用于引入此類突變的方法是本領域公知的。本文中使用的術語_一活性的"降低"包括減少生產生物中一種或多種多肽的活性，所述多肽是本文所述的相應的多核苷酸編碼的。本領域中可獲得用于降低給定蛋白(在本文的情況下是BS08蛋白)活性的多種方法。通常，可減少蛋白質的比活性或者可以減少蛋白質的拷貝數。為協助這種減少，對應于本文所述多核苷酸的基因的拷貝數可被減少。這種減少可包括打斷、修飾或失活對應于本文所述多核苷酸的基因。對基因的修飾或失活可以通過已經建立的反義技術來進行，這使用與所述基因的核酸序列互補的核苷酸序列來進行。更具體地，可通過引入與可在細胞中轉錄或能與細胞中產生的mRNA雜交的核酸序列互補的核苷酸序列，來降低或消除有絲真菌細胞對基因的表達。在允許互補的反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，翻譯的蛋白質的量由此減少或消失。表達反義RNA的例子如ApplEnvironMicrobiol.2000Feb;66(2):775-82.(Characterizationofafoldase,proteindisulfideisomeraseA，intheproteinsecretorypathwayofAspergillusniger.NgiamC,JeenesDJ，PuntPJ,VanDenHondelCA,ArcherDB)或(ZrennerR，WillmitzerL,SonnewaldU.Analysisoftheexpressionofpotatouridinediphosphate-glucosepyrophosphorylaseanditsinhibitionbyantisenseRNA.Planta.(1993);190(2):247-52.)所示。此外，可通過RNA干擾(RNAi)技術來獲得對基因的修飾、下調或失活(FEMSMicrob.Lett.237(2004):317-324)。WO05/05672Al禾口/或WO05/026356Al所述的RNA干擾技術可用于對基因的修飾、下調或失活。或者，可使用弱啟動子來指導多核苷酸的表達。在另一種實施方式中，基因上游的啟動子、調控區域和/或核糖體結合位點可被改變，以獲得對表達的下調。還可以通過減少信使RNA的相對半壽期來降低表達。在另一種實施方式中，還可以通過利用多肽氨基酸序列中能減少活性的一處或多處突變來減少多肽自身的活性。例如，改變多肽與其相應底物的親和性可導致活性降低。類似地，可減少肽的相對半壽期。在基因表達降低或者活性降低的情況下，可通過改變細胞培養基的組成和/或用于培養的方法來達成這種降低。本文中使用的"降低的表達"、"下調"或"降低的活性"表示較之野生型(BS08)蛋白、多核苷酸、基因、或多核苷酸或多肽被降低之前存在的蛋白的活性和/或濃度而言，至少5%、10%、25%、50%、75%、80%、90%、95%或甚至100%的減少。還可通過將蛋白與其活性的特異性或一般性抑制劑相接觸來降低BS08蛋白的活性。本發明的另一方面涉及載體，所述載體含有編碼本發明蛋白質的核酸或其功能等同物或一部分。在本文中使用的術語"載體"指能運送連接到其上的另一個核酸分子的核酸分子。一種載體類型是"質粒"，"質粒"指環狀的雙鏈DNA環，另外的DNA片斷可以連接到所述的環上。另一種載體的類型是病毒載體，其中，另外的DNA片斷可以連接到病毒基因組中。某些載體能在其被引入的宿主細胞中進行自主復制(例如，具有細菌的復制起點的細菌載體和游離體哺乳動物載體)。用于有絲真菌的自主保持克隆載體可包含AMA-1序列(見，例如，AleksenkoandClutterbuck(1997),FungalGenet.Biol.21:373-397)。其它載體(例如，非游離體哺乳動物載體)在被引入宿主細胞之后就被整合進宿主細胞的基因組中，因此它們與宿主基因組一同復制。此外，某些載體能指導可操作地連接到其上的基因的表達。此類載體在本文中被稱為"表達載體"。一般而言，在重組DNA技術中用到的表達載體通常是質粒的形式。在本文中術語"質粒"和"載體"可以互換使用，因為質粒是最常用到的載體形式。然而，本發明也將包括其它形式的表達載體，例如病毒載體(例如，復制缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，它們能提供等同的功能。關于表達載體的一般設計和表達載體用于基因過量表達的用途的例子可在WO99/32617、WO01/21779或WO05/100573中找到。本發明的重組表達載體包含本發明的核酸，所述核酸存在的形式適合于該核酸在宿主細胞中的表達，這意味著該重組表達載體包括一段或多段調控序列，所述調控序列是基于將用于表達的宿主細胞來選擇的，其被可操作地連接到將要表達的核酸序列上。在重組表達載體中，"可操作地連接"被用來表示人們感興趣的核苷酸序列被連接到調控序列上，所述的連接以允許該核苷酸序列表達(例如，在體外轉錄/翻譯系統中表達，或者當載體被引入宿主細胞中時，在該宿主細胞中的表達)的方式進行。術語"調控序列"將包括啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如，弱化子)。例如，在Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中對此類調控序列進行了描述。調控序列包括在很多種宿主細胞中指導核苷酸序列的組成型或誘導型表達的調控序列，也包括僅在某些宿主細胞中指導核苷酸序列表達的調控序列(例如，組織特異性調控序列)。本領域的技術人員將意識到，對表達載體的設計可能取決于以下因素例如對將被轉化的宿主細胞的選擇，期望獲得的蛋白質的表達水平等。本發明的表達載體可以被引入宿主細胞，由此生產本文所述的核酸編碼的蛋白質或肽，其包括但不限于本文所述的核酸編碼的突變體蛋白、其片段、其變體或功能等同物以及融合蛋白，例如，TS08、TS09、CS07禾口/或BS08蛋白、TS08、TS09、CS07和/或BS08蛋白的突變體形式，融合蛋白等。為了在合適的微生物中表達TS08、TS09、CS07禾口/或BS08蛋白，可對本發明的重組表達載體加以設計。例如，根據本發明的蛋白可在真菌細胞中表達，例如，在屬于^4s/ergf〃ws、爿cremom'wm、JwreoZjo^W/wm、尸em'cz7/z.wm、尸^o附yces1、ScA/zop/zj^/wm、、77ermoasci^、7Tn.e/av/a、Tb/j^oc/ad/wm禾口JWc/ocferma屬的菌株中表達。在本發明中有用的表達載體包括源自染色體、游離體和病毒的載體，例如源自細菌質粒、噬菌體、酵母游離體、酵母染色體元件、病毒(例如桿狀病毒、乳頭狀多瘤空泡病毒、痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病病毒和逆病毒)的載體和源自上述物質的組合的載體，例如源自質粒和噬菌體遺傳元件的載體，例如粘粒和噬菌粒(phagemid)。或者，載體可以是下述載體，當其被引入有絲真菌細胞時，其整合進基因組，與其已整合進的染色體一起復制。整合型克隆載體可在有絲真菌宿主的染色體中隨機整合或在預定目標位點整合。在本發明的一種優選的實施方式中，整合型克隆載體包含下述DNA片段，該片段與有絲真菌宿主細胞基因組中預定目標基因座中的、用于將克隆載體整合到預定基因座上的DNA序列同源。為促進靶向整合，優選在轉化宿主細胞之前對克隆載體進行線性化。線性化優選進行至如下程度使得克隆載體的至少一端，但優選地，任意一端側翼有與目標基因座同源的序列。目標基因座側翼的同源序列的長度優選為至少30bp，優選地，至少50bp，優選地，至少0.1kb，進一步優選地，至少0.2kb，更優選地，至少0.5kb，進一步更優選地，至少lkb，最優選地，至少2kb。優選地，靶向整合進宿主細胞基因組的效率，即，整合進預定靶基因座的效率可由宿主細胞的增加的同源重組能力來增加。細胞的此類表型包括ku70缺陷型，如WO2005/095624所述。WO2005/095624通過引用并入本文，其公開了獲得包含增加的靶向整合效率的有絲真菌細胞的優選方法。優選地，克隆載體中與目標基因座同源的DNA序列是從高度表達的基因座獲得的，這意味著，其是從能在有絲真菌宿主細胞中高水平表達的基因獲得的。能高水平表達的基因，即，能高度表達的基因在本文中被定義為其mRNA占細胞總mRNA的至少0.5"5/。(w/w)的基因，例如，在誘導條件下的，或者其基因產物占細胞總蛋白的至少1%(w/w)的基因，或者，在分泌出的基因產物的情況下，可分泌至至少O.lg/l的水平(如EP357127所述)。大量優選的高度表達的真菌基因的例子是來自A^wp7//或7WcAocfemz的淀粉酶、葡糖淀粉酶、醇脫氫酶、木聚糖酶、磷酸甘油醛脫氫酶或纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)(cbh)基因。用于這些目的的最優選的高度表達的基因是葡糖淀粉酶基因(優選A"/gw葡糖淀粉酶基因)、Ao，wTAKA-淀粉酶基因、爿.mV/w/aw5gp^4基因、JWcAcxiermareese/cM基因(優選地，。載體系統可以是單種載體或質粒，或者兩種或多種載體或質粒，它們一起含有將被引入有絲真菌細胞的總DNA或轉座子。可向宿主細胞中插入編碼多肽的核酸序列的超過一個拷貝，以增加基因產物的生產。這可以通過下述方法來進行，優選地，通過核苷酸序列整合進細胞染色體，更優選地，通過將核苷酸序列的整合靶向前文所列出的高度表達的基因座之一來進行。可通過重組酶來增強整合。或者，這可以通過將可擴增的選擇標記基因加入核苷酸序列來進行，其中可通過在合適的選擇試劑存在的情況下培養所述細胞來選出含有選擇標記基因的擴增拷貝、以及由此的核酸序列的額外拷貝的細胞。為進一步增多將被過量表達的DNA序列的拷貝數，可以使用W098/46772所述的基因轉化技術。或者，可在體外轉錄和翻譯重組表達載體，例如，使用T7啟動子調控序列和T7聚合酶來進行。DNA插入應當被可操作地連接到合適的啟動子上，啟動子可以是組成型啟動子或可誘導的啟動子，例如，噬菌體lambdaPL啟動子，E.colilac、tip和tac啟動子，SV40早期和晚期啟動子以及逆病毒LTRs的啟動子。技術人員知道如何選擇合適的啟動子。表達構建體可以含有用于轉錄起始、終止的位點，還可在轉錄區域含有核糖體結合位點，以用于翻譯。由構建體表達的成熟轉錄本的編碼部分可優選包括處于起點的起始密碼子，以及恰當地定位于待翻譯的多肽末尾的終止密碼子。優選地，啟動子可從高度表達的基因(在本文中被定義為mRNA濃度占總細胞mRNA的至少0.5。/。(w/w))獲得。在另一優選的實施方式中，啟動子可從中等表達的基因(在本文中被定義為mRNA濃度占總細胞mRNA的至少0.01%至0.5%(w/w))獲得。在另一優選的實施方式中，啟動子可從低表達的基因(在本文中被定義為mRNA濃度占總細胞mRNA的小于0.01%(w/w))獲得。更優選地，用微陣列數據來選擇具有一定轉錄水平和調控的基因，以及由此選擇這些基因的啟動子。以這種方式，我們可以針對其要發揮功能的條件對基因表達盒進行最優化改造。這些啟動子片段可從很多來源(即，不同物種)以PCR擴增、合成等手段獲得。控制序列還可包括合適的轉錄終止序列，這是能被真核細胞識別用來終止轉錄的序列。終止子序列與編碼多肽的核苷酸序列的3'末端可操作地相連。在細胞中具有功能的任何終止子可用于本發明。用于有絲真菌細胞的優選終止子從編碼^^er^7/woo^eTAKA-淀粉酉每；尸em'c/〃/wmc/^ywgewwmpc^45、j:c6C禾口pe"Z)五終止子；爿5/erg/〃ws葡半唐淀粉、酶；^sperg7'〃wmWw/a^鄰氨基苯甲酸鹽合酶；A/erg7'〃wsm'geralpha葡糖苷酶；A/erg7'〃wsw油/aws印C基因；胰蛋白酶類似蛋白酶的基因獲得。控制序列還可以是合適的引導序列，這是mRNA的非翻譯區域，其對于通過細胞的翻譯來說是重要的。引導序列與編碼多肽的核苷酸序列的5'末端可操作地相連。在細胞中具有功能的任何引導序列都可用于本發明。用于有絲真核細胞的優選引導序列從編碼A^wg///^TAKA-淀粉酶和j^erg/〃wsmV/w/朋s丙糖磷酸酉旨異構酶禾卩^^ergz'〃z^m'gerg/aA的基因獲得。控制序列還可以是聚腺苷化序列，這是與核苷酸序列3'末端可操作地相連，并且當被轉錄時能被有絲真菌細胞作為信號識別以向經轉錄mRNA加上聚腺苷殘基的序列。在細胞中具有功能的任何聚腺苷化序列都可用于本發明。用于有絲真菌細胞的優選聚腺苷化序列從編碼J^wgz7/wTAKA-淀粉酉每、y^erg7'〃wsw'ger葡糖淀粉酶、Apergz'〃t^w油/a似令卩氨基苯甲酸鹽合酶、Fwran'ww7ox"porwm胰蛋白酶類4以蛋白酶禾卩^sperg/〃wsalpha葡糖苷酶的基因獲得。控制序列可以是Kozak序列、編碼翻譯起始序列和終止序列，例如WO2006/077258所述。可通過傳統的轉化或轉染技術將載體DNA引入合適的宿主細胞。本文中使用的術語"轉化"、"轉橋聯(transconjugation)"和"轉染"意指本領域內己知的、用于將外源核酸(例如DNA)引入到宿主細胞中的多種技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉染、轉導、感染、脂質轉染、陽離子脂介導的轉染或電穿孔。用于對宿主細胞進行轉化和轉染的合適方法可在Sambrook,etal.(上文所述的)，Davisetal.,BasicMethodsinMolecularBiology(1986)及其它實驗手冊中找到。對A.niger的轉化方法是技術人員已知的(BiotechnologyofFilamentousfungi:TechnologyandProducts.(1992)ReedPublishing(USA);Chapter6:Transformationpages113-156)。技術人員將認識到，對A.niger的成功轉化不限于使用本文示例出的載體、選擇標記系統、啟動子和轉化方案。關于A.niger的特別的轉化方案見，例如WO99/32617或WO98/46772所述。載體優選含有一種或多種選擇標記，其允許對經轉化的細胞進行容易的選擇。選擇標記是其產物提供殺生物性或病毒抗性、對重金屬的抗性、針對營養缺陷型的原營養型等的基因。用于有絲真菌細胞的選擇標記可選自下述組，所述組包括但不限于畫JS(乙酰胺酶)、wgB(鳥氨酸氨甲酰基轉移酶)、(草丁膦轉移酶)、WeA(脈霉素結合)、—gB(潮霉素磷酸轉移酶)、"&D(硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶)、(硫酸腺苷轉移酶)和frpC(鄰氨基苯甲酸鹽/酯合酶)以及來自其它物種的等同物。用于^^wgz'〃M和尸em'c/肌wn細胞的優選者是AmWwAms或Aoo^ae的amofS(EP635574Bl、WO97/06261)和pyrG基因，以及S&印tom少c^/y;gra"c^ci^的基因。更優選i也，使用awJS基因，進一步更優選地，使用來自AmVMa"s或A的ww/S基因。最優選的選擇標記基因是與A"/t/w/awsgpt/A啟云力子融合的AamofS編碼序列(見EP635574所公開的，其通過引用并入本文)。來自其它真菌的^w/S基因也可使用，例如WO97/06261所公開的那些。編碼選擇標記的核酸優選在與編碼根據本發明的蛋白的載體相同的載體上引入宿主細胞，或者其可在單獨的載體上引入，該載體例如是自殺性載體，其不能在宿主細胞中復制。可通過藥物選擇鑒定出經過引入的核酸穩定轉染的細胞(例如，已合并有選擇標記基因的細胞將存活，而其它細胞會死亡)。本發明還提供了經分離的多肽，其具有分別根據SEQIDNOs:2或7的氨基酸序列或可通過在合適的宿主中表達本發明的多核苷酸(例如，分別根據SEQIDNOs:l或6的多核苷酸序列)獲得的氨基酸序列。在另一實施方式中，本發明提供了具有TS08或TS09蛋白活性的多肽，其中，所述多肽是具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列分別與SEQIDNO:2或SEQIDNO:7的氨基酸序列具有至少70%，例如，75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.5%的同源性。根據本發明的多肽(術語"多肽"和"蛋白"在本文中可互換使用)可僅含對SEQIDNOs:2、7、11或17所示的氨基酸序列中一個或多個氨基酸的保守取代，或對非關鍵氨基酸的取代、插入或缺失。因此，非關鍵氨基酸是SEQIDNOs:2、7、11或17所示的氨基酸序列中可被改變、且不會對生物功能造成實質性影響的殘基。例如，在本發明的蛋白質之間保守的氨基酸殘基被預計為對改變特別不敏感。此外，在根據本發明的蛋白質和其它TS08、TS09、CS07禾口/或BS08蛋白之間保守的氨基酸也對改變不太敏感。術語"保守取代"用于表示下述取代，其中，氨基酸殘基被具有相似側鏈的氨基酸殘基所取代。這些家族是本領域已知的，其包括具有堿性側鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側鏈(例如，天冬氨酸和谷氨酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、帶beta支鏈側鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。如上所述，本發明的多核苷酸可用于對合適的宿主細胞進行遺傳工程改造，使其在發酵中更好且更有效，例如，在對檸檬酸的發酵工藝中更好且更有效。根據本發明，提供了經遺傳工程改造/重組產生的宿主細胞(也被稱為重組細胞或經轉化細胞)，其攜帶有此類經修飾的多核苷酸，其中，相連的蛋白的功能較之野生型細胞而言被顯著修飾，使得對一種或多種發酵產物(例如檸檬酸)的生產的產率、產量和/或效率被提高。宿主細胞可選自能從碳水化合物生產一種或多種發酵產物(例如檸檬酸)的微生物，例如有絲真菌，特別是v^/wg/〃M，優選地，^y/erg/〃wsm'ger，更優選地，Am'，CBS513.88。"經轉化細胞"或"重組細胞"是已通過重組DNA技術向其(或其祖先細胞)中引入了根據本發明的核酸的細胞，或者是其中TS08、TS09、CS07蛋白的活性已被增加和/或增強和/或BS08蛋白的活性已被減少或消失的細胞。合適的宿主細胞包括能生產給定發酵產物(例如，能將碳水化合物轉化為檸檬酸)的微生物的細胞。特別地，其包括來自有絲真菌的組的菌株，優選地，選自J^ergz7/^，更優選地，選自Am'gw、Aa麗附o"'、Aacw/eato、A乂opom'CM、A、爿.va^ms7、、」.carZ)o打,'ws、A勵z'wgms7's、A/ac&co,ato、AZms77/ms7、、爿，》m、、爿.cost鎖'cams7^或AybeZ油s，進一步更優選地，選自爿./be,油svar鎖V/ws或A/be/油swar/a〃油s，進一步更優選地，選自爿.m'gervara麗脂n'，進一步更優選地，選自AATCC1015，以及最優選地，選自ACBS513.88。還可通過修飾TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因獲得提高的基因表達，例如，通過將一處或多處突變引入TS08、TS09和/或CS07基因來實現，其中，所述突變導致較之野生型蛋白而言功能顯著提高的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白。因此，在另一種實施方式中，選自SEQIDNOs:1、6禾卩/或11的組的多核苷酸或其等同物獲得攜帶至少一處突變的多核苷酸。本文中使用的突變可以是導致功能更強或更穩定的多肽(例如，功能更強或更穩定的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因產物)的任何突變。這可包括，例如，在微生物基因組中的下述改變其提高了TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白的合成，或者導致TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白以改變的氨基酸序列表達，該改變使得所述蛋白的功能較之具有未被改變的氨基酸序列的野生型副本而言被提高和/或增強。提高可在轉錄水平、翻譯水平或翻譯后水平上發生。微生物基因組中的改變可例如通過單交叉重組或多交叉重組用含有改變的DNA序列替換野生型DNA序列來進行。為了能方便地選擇出基因組被改變的微生物轉化子，該改變可以例如是編碼抗生素抗性基因的DNA序列，或者編碼補足微生物可能的營養缺陷型的基因的DNA序列。突變可包括但不限于缺失-插入突變。還可通過下述方法獲得微生物基因組中導致功能更強的多肽的改變使用例如化學誘變劑、輻射或轉座子對微生物基因組進行隨機誘變，以及選擇或篩選出是一種或多種發酵產物的更好的或更有效的生產菌株的突變體。用于篩選和選擇的標準方法是技術人員已知的。在一種特定實施方式中，人們需要敲除或遏制本發明TS08、TS09和/或CS07基因的阻遏子(repressor)，即，其中，當引入合適的宿主細胞時，其阻遏子基因的表達被人工遏制，以提高對發酵產物生產的產率、生產能力和/或效率。用于提供敲除的方法以及提供攜帶此類被遏制基因的微生物的方法是本領域公知的。可通過缺失掉阻遏子基因或其調控區域的至少一部分，來誘導對阻遏子基因的遏制。本文中使用的"對基因表達的遏制"包括完全和部分遏制，以及在特定條件下的遏制，還包括對兩個等位基因中任何一個的表達的遏制。為提高其中TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07活性被增強或提高的重組宿主細胞對檸檬酸的產生，可在該生物中抑制BS08基因的表達，這例如通過靶向與BS08核苷酸序列的調控區域(例如，BS08啟動子和/或增強子)互補的核苷酸序列，以形成三螺旋結構，阻止靶細胞中BS08基因的轉錄來實現。一般而言，見Helene,C.(1991)AnticancerDrugDes.6(6):569-84;Helene，C.etal.(1992)Ann.N.YAcadSci.660:27-36和Maher,L.J.(1992)Bioassays14(12):807-15。還可通過對BS08編碼基因加以修飾來抑制或阻止基因表達，例如，通過向BS08編碼基因中引入一處或多處突變來實現，其中所述突變導致產生較之野生型蛋白而言功能顯著降低的BS08蛋白。因此，在另一種實施方式中，從編碼BS08多肽的多核苷酸，例如，SEQIDNO:16所示的多核苷酸或其等同物獲得攜帶至少一處突變的多核苷酸。本文中使用的突變可以是導致功能更弱或更不穩定的多肽(例如，功能更弱或更不穩定的BS08基因產物)的任何突變。這可包括，例如，在微生物基因組中的下述改變其干擾了BS08的合成，或者導致BS08蛋白以改變的氨基酸序列表達，該改變使得該蛋白的功能較之具有未被改變的氨基酸序列的野生型副本而言被完全或部分破壞。干擾可在轉錄水平、翻譯水平或翻譯后水平上發生。微生物基因組中的改變可例如通過單交叉重組或多交叉重組用含有改變的DNA序列替換野生型DNA序列來進行。為了能方便地選擇出基因組被改變的微生物轉化子，該改變可以例如是編碼抗生素抗性基因的DNA序列，或者編碼補足微生物可能的營養缺陷型的基因的DNA序列。突變可包括但不限于缺失-插入突變。還可通過下述方法獲得微生物基因組中導致功能更弱或沒有功能的多肽的改變使用例如化學誘變劑、輻射或轉座子對微生物基因組進行隨機誘變，以及選擇或篩選出是一種或多種發酵產物的更好的或更有效的生產菌株的突變體。用于篩選和選擇的標準方法是技術人員已知的。在一種特定實施方式中，需要敲除本發明的BS08基因，即，其中，當引入合適的宿主細胞時，其基因表達被人工遏制，以提高對發酵產物生產的產率、生產能力和/或效率。用于提供敲除的方法以及提供攜帶此類被遏制基因的微生物的方法是本領域公知的。可通過缺失掉基因或其調控區域的至少一部分，來誘導對內源BS08基因的遏制。本文中使用的"對基因表達的遏制"包括完全遏制和部分遏制，以及在特定條件下的遏制，還包括對兩個等位基因中任何一個的表達的遏制。為制造其中BS08基因的表達被人工遏制的敲除微生物，首先可克隆BS08基因，然后可使用該基因來構建用于同源重組的載體，以在靶標微生物中失活內源BS08基因。用于同源重組的載體含有設計來使靶標微生物中內源BS08基因失活的核酸序列。此核酸序列可以是例如，含有至少部分缺失突變的BS08基因或其調控區域(例如，將被失活的基因側翼存在的區域(順式情況下)或單獨存在的(反式情況下))的核酸序列，或者其可以是含有其它基因的BS08基因或其調控區域。打斷和基因置換公開于EP635574和WO98/46772和WO05/095624中。優選地，選擇還可用作為標記發揮作用的基因作為將被插入進BS08基因或其調控區域的基因。將使用的插入基因包括，例如，前文定義的藥物抗性基因。對于基因可插入到BS08基因中的位置沒有特別限制，只要在該位置的插入能導致對靶標中內源BS08基因表達的遏制即可。為避免插入的極性作用，可通過使用例如sacB系統，或通過長側翼同源性PCR，來引入同框沉默缺失。這些技術是本領域技術人員公知的。用于BS08蛋白的上述誘變策略可導致想要的化合物(特別是檸檬酸)的產率增加。這些策略的列出并不意味著限制；對這些誘變策略的變化對于本領域普通技術人員來說將是顯而易見的。可通過這些機制，用本發明的核酸和蛋白質分子產生出微生物，例如表達經突變BS08核酸和蛋白分子的^^^&//^^^或真菌的相關菌株，使得對想要的化合物(例如檸檬酸)的生產的產率、生產能力和/或產量被提高。用于TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/BS08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/BS08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08蛋白的上述誘變策略可導致想要的化合物(特別是檸檬酸)的產率增加。這些策略的列出并不意味著限制；對這些誘變策略的變化對于本領域普通技術人員來說將是顯而易見的。可通過這些機制，用本發明的核酸和蛋白質分子產生出微生物，例如表達經突變TS08、TS09、CS07和/或BS08核酸和蛋白分子的As^^'〃m或真菌的相關菌株，使得對想要的化合物(例如檸檬酸)的生產的產率、生產能力和/或產量被提咼°在本發明的一個方面，提供了能從合適的碳水化合物(例如，葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、淀粉、玉米、木薯和多元醇)生產檸檬酸的微生物(特別是有絲真菌，例如」^wg///^)。對檸檬酸的測量通過簡單的酸堿滴定來進行，其中用NaOH來進行，這種方式對所有酸進行測量。為在存在其它酸的情況下測量檸檬酸，使用HPLC(例如，使用Dionex的IonPacAS-ll陰離子交換柱，如其可公開獲得的使用指導Dec.1998"Thedeterminationofinorganicanionsandorganicacidsinfermentationbroths"，DionexCorp.,Sunnyvale,California中n。123所述)。當例如通過HPLC或滴定進行測量時，我們發現，這些生物分別能從蔗糖以高達100g/l的水平來生產檸檬酸。在本發明的另一方面，提供了下述微生物，當從蔗糖開始深浸發酵生產時，所述微生物能以300g/l的量生產檸檬酸。這可通過增加TS禾口/或CS多肽，優選地，TS08、TS09禾口/或CS07多肽的活性來實現。從例如蔗糖生產的檸檬酸的產率甚至可高至1.5、2、4、10、20、50g/l，或者甚至超過400、600、1000g/l。這可通過增強或提高TS和/或CS多肽，優選地，TS08、TS09、CS07TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09禾nCS07多肽的活性，可選地，組合BS蛋白(優選地，BS08蛋白)活性的減少或消失來實現。從例如蔗糖生產的檸檬酸的產率甚至可高至1.5、2、4、10、20、50g/l，或者甚至超過400、600、1000g/l。使用攜帶有上文所述的經修飾的基因的微生物生產的檸檬酸的產率，較之野生型菌株，例如，Am'g^CBS513.88生產的檸檬酸的量而言，可增加至少1%、2%、3%、4%、8%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、100%、200%、500%或更高。可在合適條件下，補充有合適營養物的水性培養基中，培養攜帶有，例如，經修飾的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/BS08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/BS08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08基因，且能以顯著更高的產率、生產能力和/或效率生產發酵產物的重組微生物。檸檬酸的生產可通過深浸發酵或表面發酵，從不同碳水化合物和/或原材料起始來進行。在一種實施方式中，通過深浸發酵，從碳水化合物原材料，例如木薯和/或玉米(其可被磨碎且與水混合)起始來生產檸檬酸。種子發酵可在單獨的發酵罐中制備。對淀粉的液化可在淀粉分解酶，例如淀粉酶、纖維素酶、乳糖酶或麥芽糖酶的存在下進行，在發酵前或發酵期間可加入添加劑和營養物，例如消泡劑。就主發酵而言，混合物中，碳水化合物(例如淀粉)的濃度可以在150至200g/l的范圍內，優選地，大約180g/1。在另一實施方式中，通過表面發酵，從碳水化合物原材料，例如甜菜和甘蔗糖蜜的混合物或蔗糖起始來生產檸檬酸。本文所述的核酸分子、多肽、載體、引物和重組微生物可用于下述方法中的一種或多種鑒定J^wg///^m'gw以及相關的生物；繪制與As^erp7/1^m'gw相關的生物的基因組圖譜；對感興趣的As;e/^7/Ry"/ger序列進行鑒定和定位；進化研究；測定功能所需的TS08、TS09、CS07禾口/或BS08蛋白區域；調節TS08、TS09、CS07禾口/或BS08蛋白活性或功能；調節TS途徑的活性；以及調節對想要的化合物(例如，檸檬酸)的細胞內生產。本發明提供了篩選能調節TS08、TS09和/或CS07蛋白活性的分子的方法，這種調節或者通過與蛋白本身或底物或和/或蛋白的結合伴侶的相互作用來實現或者通過調節本發明的TS08、TS09、CS07和/或BS08核酸分子的轉錄或翻譯來實現。在此類方法中，將表達本發明的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/BS08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/BS08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08蛋白的微生物與一種或多種測試化合物接觸，并評估每種測試化合物對于TS08、TS09、CS07和/或BS08蛋白表達水平或活性的影響。可通過技術人員公知的方法來測定TS、CS和/或BS蛋白的生物活性、酶活性或其它活性，所述方法例如將含有TS08、TS09、CS07和/或BS08蛋白的膜級分與經放射性標記的、可被TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/BS08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/BS08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08蛋白主動轉運的糖、糖醇或羧酸鹽/酯一起溫育。包括進細胞物質的放射性與轉運蛋白的活性直接成正比。因此，例如，可在下述試驗中測量轉運蛋白的活性，所述試驗中，在存在pH6的磷酸鹽緩沖液以及經放射標記的碳源(例如葡萄糖)的情況下，溫育含有特定轉運蛋白的完整細胞。可通過技術人員己知的方法來測量放射性碳源(例如葡萄糖)被細胞吸收的速率，其與膜級分中存在的TS、CS和/或BS蛋白活性直接成正比。在一種備選試驗中，可通過技術人員公知的方法來測量TS、CS和/或BS蛋白的生物活性、酶活性或其它活性，所述方法例如用編碼本發明的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/BS08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/BS08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08蛋白的AcDNA克隆補足針對相應(直向同源)轉運蛋白基因的^cc/^ra，c^打斷突變體。對轉運蛋白(-)的表型的陽性補足是對轉運蛋白活性的指示。從上述描述中可顯而易見根據本發明的方法的發酵產物可不僅限于檸檬酸本身。本文中使用的"想要的化合物"或"發酵產物"可以是^wergi7/wsm'ger的任何天然或異源產物，其包括生物合成途徑的終產物和中間產物，例如，初級和次級代謝產物，例如beta內酰胺、蛋白質或酶，特別是檸檬酸生物合成生產中的。因此，本發明涉及本文所述的多核苷酸、多肽、載體、引物和重組微生物在生產檸檬酸(即將碳源轉化為檸檬酸)中的用途。在一種優選的實施方式中，本文所述的經修飾的多核苷酸、多肽、載體和重組微生物用于提高對檸檬酸生產的產率、生產能力和/或效率。術語"產量"或"生產能力"是本領域已知的，其包括給定的時間和給定的發酵體積中形成的發酵產物(例如檸檬酸)的濃度(例如，每升每小時的kg產物)。術語"生產效率"包括獲得的特定水平的生產所需要的時間(例如，細胞達到發酵產物的特定速率輸出所需時間有多長)。術語"產率"是本領域已知的，其包括碳源向產物(即檸檬酸)轉化的效率。這通常寫作，例如，kg產物/kg碳源。"增加"化合物的"產率和/或產量"或增加化合物的"生產表現"表示，給定的時間中給定量的培養物中回收的該化合物分子或回收的該化合物有用分子的量增加。術語"生物合成"或"生物合成途徑"是本領域已知的，其包括通過細胞，以可能是多步驟且被高度調控的過程，從中間產物化合物對化合物(優選地，有機化合物)的合成。措辭"代謝"是本領域已知的，其包括對生物中發生的生化反應的總稱。然后，特定化合物的代謝(例如，氨基酸(例如甘氨酸)的代謝)包含細胞中與該化合物相關的總的生物合成、修飾和降解途徑。措辭"轉運"或"運入"是本領域已知的，其包括一種或多種分子在協助下移動經過該分子本來不能經過或不能高效經過的細胞膜。本文中使用的檸檬酸可以是水溶液中發現的檸檬酸的任何化學形式，例如未離解的、以其游離酸形式存在的或離解為陰離子的。檸檬酸的溶解的鹽形式的特征為在通常發現于發酵上清液中的任何種類的陽離子(例如，鉀、鈉、銨或鈣)存在時的陰離子。還包括在內的可以有檸檬酸的游離酸形式的經過分離的晶體。另一方面，用其相應的鹽的名稱來命名檸檬酸的鹽形式的經過分離的晶體，即檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、檸檬酸鈣等。在一種優選的實施方式中，本發明涉及生產檸檬酸的方法，其中，將根據本發明的核苷酸或上文所述的經修飾多核苷酸序列引入合適的微生物，在允許以高生產能力、產率和/或效率生產檸檬酸的條件下培養重組微生物，從培養基中分離產生的發酵產物，以及可選地，進一步純化。在另一個方面，本發明的工藝可組合有將產生的檸檬酸與發酵培養液中含有的其它組分分離和/或純化的額外步驟，即，所謂的下游加工步驟。這些步驟可包括技術人員己知的任何手段，例如，濃縮、結晶、沉淀、吸附、離子交換、電滲析、兩極膜電滲析和/或反滲透。檸檬酸可作為游離酸形式或其已知的任何鹽的形式被進一步純化，這是通過下述操作手段來進行的，例如，用活性炭進行處理、離子交換、吸附和洗脫、濃縮、結晶、過濾和干燥。上述步驟的組合也可使用，例如，將電滲析和兩極膜電滲析組合為一個步驟，以及使用模擬移動床色譜方法的多個離子交換步驟的組合。上述任何方案單獨或組合就構成了用于分離和純化產物(即檸檬酸)的方便的手段。由此獲得的產物還可被進一步分離(例如，通過濃縮、結晶、沉淀、對晶體的洗滌和干燥的方式來進行)和/或進一步純化(用活性炭處理、離子交換和/或重結晶)。下游加工方案可以包括，例如，通過用石灰沉淀、層析或溶劑萃取來分離檸檬酸。純化可包括用活性炭處理、離子交換、結晶和/或過濾步驟。終產物形式是通過濃縮和結晶獲得的，或者，對于鹽形式而言，通過用想要的堿(例如NaOH、KOH、NH3等)中和檸檬酸獲得的。這些晶體可被分離、洗滌和干燥。如果必要的話，晶體還可被重新溶解于水中，用活性炭和/或離子交換樹脂對其進行處理，并重結晶。然后可對上述晶體進行分離、洗滌和干燥。檸檬酸可被轉化為檸檬酸單鈉、檸檬酸三鈉、檸檬酸三鈣、檸檬酸三鈉二水合物、擰檬酸三鉀、無水檸檬酸單鈉或者結晶為檸檬酸酐或擰檬酸單水合物。通過本發明的方法生產的檸檬酸及其鹽可進一步用作為例如食品(例如，烘焙制品、嬰兒食品、脂肪和油、糖、奶酪制品、乳制品)、飲料(例如，碳酸軟飲、糖漿、果汁和果飲、葡萄酒、即飲茶)、藥物(例如，片劑、漿劑、懸浮液/溶液)、清潔劑和去垢劑(例如，除臭皂、餐洗液/粉)、個人護理產品(例如，洗發露、護膚霜和爽膚水、保健產品、牙膏)或其它工業應用(例如粘合劑、動物飼料、光化學產品等)的成分或添加劑。因此，在一種實施方式中，本發明涉及包含本文所述的工藝生產的檸檬酸的食品、飼料、飲料、藥物、清潔劑、去垢劑或個人護理產品。將通過下述實施例進一步闡述本發明，所述實施例不應被理解為起限制作用。本文提到的所有參考文獻、專利申請、專利和公開的專利申請的內容都通過引用并入本文。實施例菌株WT1:該A菌株被用作為野生型菌株。該菌株被保藏于CBSInstitute,保藏號為CBS513.88。WT2:該Am'gw菌株是包含編碼葡糖淀粉酶的基因(g/flA)缺失的WT1菌株。WT2是通過使用EP0635574Bl所述的"MARKER-GENEFREE"方案構建的，在該專利中描述了如何在CBS513.88基因組中缺失g/aA特定DNA序列的方法。該方案產生了不含標記基因的Ag/aA重組Am'gerCBS513.88菌株，該菌株不具有任何外源DNA序列。WT3:該Am'gw菌株是包含導致草酸鹽/酯缺陷型Am'gw菌株的突變的WT2菌株。WT3是使用EP1590444所述的方法構建的。該專利申請公開了如何篩選草酸鹽/酯缺陷型Am'gw菌株。菌株WT3是按照EP1590444中實施例1和2所述的方法構建的，WT3是EP1590444的突變體菌株22(在EP1590444中命名為FINAL)。實施例1制備染色體DNA以及通過PCR擴增DNA片段從具有100ml發酵培養液(MM-G)的500ml帶擋板燒瓶中于30°C和150rpm培養了16-20小時的細胞制備A^w^7/mm'gerCBS513.88染色體DNA。MM-G培養基每升含有20gD-葡萄糖、6gNaN03、0.25gKC1、1.5gKH2P04、1.13ml4MKOH、0.5gMgS04.7H20、1ml痕量元素貯液(每升痕量元素貯液22gZnS(V7H20、11gH3B03、5gFeS047H20、1.7gCoCl2.6H20、1.6gCuS04.5H20、5gMnCl24H20、1.5gNa2Mo04'2H20、50gEDTA，用4MKOH將pH調節至6.5，過濾滅菌，并于4°Cfc藏于暗處)。搖瓶發酵和染色體DNA分離在WO98/46772中有更詳細的描述。使用按照上文所述制備的染色體DNA以及一組引物——Pf(分別是SEQIDNOs:3、8、13和18)和Pr(分別是SEQIDNOs:4、9、14和19)，通過PCR來制備DNA片段。按照廠商說明書，用Platinum尸/x聚合酶(Invitrogen)禾B50ng染色體DNA以50/il的總體積來進行反應，獲得了含有各DNA序列(SEQIDNOs:1、6、11禾B16)的PCR產物。從反應體系中回收PCR產物，并驗證了其正確序列。構建過量表達載體和敲除載體按照已知原則和常規質粒分離技術(Sambrook，J.etal.,1989)來進行克隆技術和質粒DNA分離。用于打斷的候選序列包含開放讀碼框(ORF)(具有內含子)和基因的大約1500bp的5，和3，序列。按照已知的原則來設計用于SB08基因的基因置換型載體，按照常規克隆流程來構建所述載體(見圖l)。簡言之，這些載體包含大約1500bp的SB08ORF側翼區域，用于在預定的基因組SB08基因座處進行同源重組。此外，它們含有AmWM/a似雙向amdS選擇標記，處于正向重復之間。對這些缺失載體的一般性設計以前在EP635574B和WO98/46772中描述過。按照已知原則來設計針對TS08、TS09和CS07基因的過量表達載體，按照常規克隆流程來構建。對表達載體進行一般性設計以及使用表達載體進行基因過量表達的例子參見W0199932617、WO200121779和WO2005100573。簡言之，表達載體至少包含啟動子和終止子，用于正確表達基因。用例如表1所列出的基因組TS08、TS09和CS07DNA或cDNA來克隆和過量表達提到的基因。用于轉化的選擇標記，例如，AmWw/a似雙向amdS選擇標記可在載體上，或者作為單獨的載體用于共轉化。基于pGBTOP或基于pGBFIN的表達載體的例子可在圖3或4中找到。所有的ATS08、TS09禾nCS07基因都被克隆于基于pGBFIN的過量表達載體中。pGBFINMNR-l載體是針對TS08蛋白的過量表達載體的基于pGBFIN的載體的例子(圖5)。實施例2在AWT3中打斷BS08基因用以前描述過的方法(BiotechnologyofFilamentousfungi:TechnologyandProducts.(1992)ReedPublishing(USA);Chapter6:Transformationpages113-156)，分離出經合適限制性酶消化過的缺失載體的線性DNA，例如pGBDEL-SODA(圖3)，用其轉化Am'gerWT3。該線性DNA可在同源基因座整合進基因組，由此用^m/S基因取代編碼BS08多肽的內源BS08基因。對該事件的描述見圖2所示。按照EP635574所述的標準流程，在乙酰胺培養基上選擇轉化子，純化菌落。在氟乙酰胺培養基上涂布孢子，選擇丟失了aw6/S標記的菌株。通過PCR來檢査生長中的菌落是否整合進同源基因座，通過Southern分析針對內源BS08基因的缺失來檢查候選菌株。可通過大約0.9kb大小的DNA片段(其覆蓋了整個基因座，并且與合適的側翼序列探針雜交)的減少來探測到BS08基因的缺失。大約100個最初轉化子的庫中，大約3個菌株顯示出基因組BS08基因的去除。菌株deltaBS08被選作為內源sw/A基因失活的代表性菌株。實施例3在AWT3和deltaBS08中過量表達TS08、TS09和CS07基因將實施例中獲得的TS08、TS09和CS07基因克隆進pGBFIN過量表達載體(W099/32617)。在用合適的限制性酶線性化之后，用線性DNA轉化AWT3和deltaSB08(關于轉化，見，例如，BiotechnologyofFilamentousfungi:TechnologyandProducts.(1992)ReedPublishing(USA);Chapter6:Transformationpages113-156)。線性DNA整合進基因組，按照EP635574所述的標準流程，在乙酰胺培養基上選擇過量表達TS08、TS09和CS07的Am'gw轉化子，純化菌落。轉化和隨后的轉化子選擇公開于WO98/46772中。菌株WT3-TS08、WT3-TS09、WT3-CS07、deltaBS08-TS08、deltaBS08-TS09和deltaBS08-CS07被選用為分別具有過量表達的指定基因和失活的內源BS08基因的代表性菌株。通過用全部三種pGBFIN過量表達構建體(TS08、TS09和CS07)進行共轉化，構建出具有多種過量表達構建體的菌株(deltaBS08-TS08/TS09、deltaBS08-TS08/CS07、deltaBS08-TS09/CS07和deltaBS08-TS08/TS09/CS07)。通過PCR，針對各感興趣的基因中一種或多種的整合，對這些菌株加以檢查和選擇。表2所示的具有遺傳補充的代表性菌株被選出來，用于進一步的實驗。<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>表2獲得的^s:pergz7/^m'ger克隆的遺傳補充實施例4使用打斷和過量表達Am'gw菌株通過表面發酵生產檸檬酸用去礦物質水稀釋甜菜和甘蔗糖蜜的混合物，以獲得每升240g蔗糖。向該混合物中加入3ml磷酸5c/。、0.5gNa4Fe(CN)6.10H2O、0.45g粉末活性炭和1.0mgZn。用硫酸將pH調節為6.15，將混合物放在10cm深的盤中。在70。C對該盤進行巴氏滅菌，令其冷卻到40°C。將實施例3中獲得的Aw/gw轉化菌株以及WT3和deltaBS08菌株加入到培養基中，在35。C的溫度和至少70。/o的相對濕度下，在人工氣候室對盤進行溫育。培養菌絲體，從而在液體表面形成層，將來自液體的蔗糖轉化為檸檬酸。當HPLC測量的蔗糖、葡萄糖和果糖濃度降低至低于4g/1時，停止發酵。巴氏滅菌終止酶活性之后，通過HPLC或滴定來測量液體中的檸檬酸濃度。多種菌株的生產表現被計算為較之WT3菌株產率(其被設定為100%)而言的檸檬酸生產產率。在同樣條件下培養時，過量表達CS07基因、TS08基因或TS09基因的Am'gw菌株和過量表達這些基因的組合的Am'ger菌株，較之用Am'gw菌株WT3獲得的檸檬酸而言，生產出的檸檬酸多至少大約3%至超過20%。這些結果示于圖6中。在相同條件下，較之用Am'gw菌株WT3獲得的擰檬酸而言，具有BS08打斷背景的菌株生產出的檸檬酸多至少大約5%。在同樣條件下培養時，在該BS08打斷背景中，過量表達CS07基因、TS08基因或TS09基因的Am'gw菌株和過量表達這些基因的組合的Am'gw菌株，較之用菌株A.nigerdeltaBS08獲得的檸檬酸而言，生產出的檸檬酸多至少大約1%至超過15%。這些結果示于圖7中。這些結果證實在檸檬酸生產細胞中，TS08禾口/或TS09禾口/或CS07的過量表達對于表面發酵檸檬酸生產具有正面效果，這可能與BS08打斷或降低的表達相組合。在較之野生型Am'gerCBS513.88而言具有提高的檸檬酸生產背景的菌株中發現了這種改進。使用打斷和過量表達Am'gw菌株通過深浸發酵生產檸檬酸將碳水化合物原材料(例如木薯和/或玉米)磨碎并與水混合。在單獨的發酵罐中開始種子發酵，其中含有玉米粉漿體作為碳水化合物，用淀粉分解酶在90°C的溫度對其進行液化。冷卻至37°C后，將Aw/ger菌株WT3、deltaSB08或按照實施例3構建的Am'gw轉化子菌株放進發酵罐，以0.1至0.2vvm的空氣流進行種子發酵，溫度控制為37。C。大約20小時后，將種子發酵罐的內容物轉移進主發酵罐。主發酵罐由玉米和/或木薯面粉混合物加入水、添加劑和營養物來準備，其中在混合物中碳水化合物的濃度優選為180g/l并且加入了淀粉分解酶和防沫劑。在加熱到90。C來液化淀粉餅隨后冷卻到35°C之后，將種子發酵罐的內容物轉移進主發酵罐。轉移之后，通過在0.1wm的空氣流速下冷卻來控制發酵，當碳水化合物被耗盡時停止發酵，典型地，這需要60-100小時。通過HPLC或滴定來測量液體中的檸檬酸濃度。多種菌株的生產表現被計算為較之WT3菌株產率(其被設定為100%)而言的檸檬酸生產產率。當在同樣條件下培養時，過量表達CS07基因、TS08基因或TS09基因的Am'gw菌株和過量表達這些基因的組合的Am'gw菌株較之用Am'gw菌株WT3獲得的產物而言，通過轉化葡萄糖獲得的檸檬酸單水合物的產率高至少大約1%至超過8%。這些結果示于圖8中。此外，在同樣條件下，較之用A"/gw菌株WT3獲得的檸檬酸而言，具有BS08打斷背景的菌株生產的檸檬酸多至少5n/。。在同樣條件下培養時，在該BS08打斷背景中，過量表達CS07基因、TS08基因或TS09基因的Am'gw菌株和過量表達這些基因的組合的Am'gw菌株，較之用菌株A.nigerdeltaBS08獲得的檸檬酸而言，多生產出的檸檬酸至少等于至超過15%。這些結果示于圖9中。這些結果證實在檸檬酸生產細胞中，TS08和/或TS09和/或CS07的過量表達對于深浸發酵檸檬酸生產具有正面效果，這可能與BS08打斷或降低的表達組合。在較之野生型ACBS513.88而言具有提高的檸檬酸生產背景的菌株中發現了這種改進。權利要求1.選自下述組的TS08和/或TS09多核苷酸或此類多核苷酸的互補鏈，所述組由(a)編碼分別包含選自SEQIDNO2或SEQIDNO7的氨基酸序列的TS08或TS09多肽的多核苷酸；(b)包含根據SEQIDNO1或SEQIDNO6的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來自微生物的基因組DNA作為模板，并分別使用根據SEQIDNO3和SEQIDNO4或SEQIDNO8和SEQIDNO9的引物組，通過核酸擴增，例如聚合酶鏈式反應，來獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(c)中任一項的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個或多個氨基酸殘基較之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有TS08或TS09多肽的活性；(e)編碼TS08或TS09多肽的多核苷酸，且其互補鏈能在嚴謹條件下與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸雜交；以及(f)編碼TS08或TS09的多核苷酸，且其與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸至少70％同源，例如75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同源；構成。2.含有權利要求1所述的TS08和/或TS09多核苷酸的載體。3.如權利要求2所述的載體，其中，所述TS08禾n/或TS09多核苷酸與允許在原核生物宿主細胞或真核生物宿主細胞中表達的表達控制序列可操作地相連。4.用權利要求1所述的TS08、TS09或TS08/TS09多核苷酸或用權利要求2或3所述的載體遺傳工程改造過的微生物。5.如權利要求4所述的TS08、TS09或TS08/TS09微生物，額外被包含編碼CS07多肽的多核苷酸遺傳工程改造過。6.如權利要求4至5中任意一項所述的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07微生物，額外被下述多核苷酸遺傳工程改造過，所述多核苷酸包含用于打斷或下調BS08多核苷酸的多核苷酸。7.如權利要求4至6中任意一項所述的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、deltaBS08陽TS08、deltaBS08-TS09、deltaBS08-CS07、deltaBS08-TS08/TS09、deltaBS08-TS08/CS07、deltaBS08-TS09/CS07或deltaBS08-TS08/TS09/CS07微生物，其中，額外地，通過對細胞中存在的、對于BS08多核苷酸的表達來說必要的核酸序列的修飾或失活來獲得BS08多肽產量或活性的降低。8.如權利要求4至7中任意一項所述的微生物，其能以100g/l或更多的量從蔗糖生產檸檬酸。9.如權利要求1所述的多核苷酸編碼的多肽。10.具有TS08或TS09蛋白活性的多肽，其中，所述多肽是具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列分別與SEQIDNO:2或SEQIDNO:7的氨基酸序列具有至少70%，例如，75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.5%的同源性。11.用于生產能表達TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多肽的細胞的工藝，其包括下述步驟用-權利要求2的載體和/或-權利要求3的載體和/或-權利要求1所述的多核苷酸和/或-多核苷酸，其包含用于打斷或下調BS08多核苷酸的多核苷酸-包含編碼CS07多肽的多核苷酸的多核苷酸對細胞進行遺傳工程改造。12.TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多核苷酸，優選地，權利要求1所述的多核苷酸，或用權利要求2和/或3所述的載體用于從碳水化合物生產檸檬酸的用途。13.如權利要求12所述的用途，其中額外使用下述多核苷酸，所述多核苷酸包含用于打斷或下調BS08多核苷酸的多核苷酸。14.如權利要求12至13中任意一項所述的用途，其中所述TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多核苷酸與表達控制序列可操作地連接，并被引入微生物。15.如權利要求14所述的用途，其中，所述表達控制序列包含調控序列和/或啟動子序列和/或終止子序列，并且，這些序列中的至少一種被改變，所述改變以使得所述微生物從碳水化合物生產對檸檬酸的生產的產率和/或效率提高的方式進行。16.如權利要求15所述的用途，其中，所述表達控制序列包含調控序列和/或啟動子序列和/或終止子序列，并且，這些序列中的至少一種被改變，所述改變以使得各被編碼的S08、TS08禾P/或CS07多肽的活性增加和/或提高和/或使得BS08多肽的活性減少和/或消失的方式進行。17.如權利要求12至16中任意一項所述的用途，其中所述碳水化合'物選自葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、淀粉、玉米、木薯和多元醇構成的組。18.在微生物中生產增強的內源TS08、TS09或TS08/TS09基因的工藝，所述微生物包含權利要求1的多核苷酸，所述工藝包括對所述多核苷酸進行改變的步驟，所述改變以使得所述微生物對從碳水化合物生產的檸檬酸的生產的產率和/或效率提高的方式來進行。19.如權利要求18所述的工藝，其中，額外地，在具有增強的內源TS08、TS09或TS08/TS09基因的所述微生物中，通過對所述微生物中含有的、包含編碼CS07多肽的多核苷酸的多核苷酸進行改變來增強CS07基因。20.如權利要求18至19中任意一項所述的工藝，其中，額外地，在具有增強的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因的所述微生物中，內源BS08基因被打斷和/或下調，這通過改變所述微生物中含有的、編碼BS08多肽的多核苷酸來實現。21.如權利要求18至20中任意一項所述的工藝，其中，額外地，在具有增強的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因，或具有增強的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因以及打斷或下調的BS08基因的組合的所述微生物中，通過修飾或失活BS08基因表達所需的多核苷酸序列，優選地，控制序列，來獲得對內源BS08基因的降低的表達。22.在微生物中生產權利要求9至10中任意一項所述多肽的工藝，所述工藝包括改變所述微生物的步驟，使得所述微生物生產具有增加和/或提高的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07活性的所述多肽，可選地，組合有減少的或消失的BS08活性，使得所述微生物對從碳水化合物生產的檸檬酸的生產產率和/或效率提咼°23.生產能生產檸檬酸的微生物的工藝，所述工藝包括改變所述微生物的步驟，使得所述微生物生產具有增加和/或提高的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07活性的多肽，可選地，組合有減少的或消失的BS08活性，使得所述微生物對從碳水化合物生產的檸檬酸的生產產率和/或效率提高。24.生產含有至少一種包含權利要求1的多核苷酸和/或編碼CS07多肽的多核苷酸的內源基因的微生物的工藝，所述工藝包括改變所述微生物的步驟，使得所述至少一種內源基因過量表達，導致所述微生物對從碳水化合物生產的檸檬酸的產率和/或效率提高。25.如權利要求24所述的工藝，所述工藝額外包括下述改變微生物的步驟，使得包含編碼BS08多肽的多核苷酸的內源基因被下調或打斷。26.能通過權利要求18至25中任意一項的工藝獲得的微生物。27.如權利要求26或權利要求4至8中任意一項所述的微生物，其選自有絲真菌的組，優選地，選自A^e^/〃w，更優選地，選自Aw/gw、Aa麗won.、Aacw/ea^s、A_/a/om'cw>s、A、j.vacfe願、、J.cw6owa"'w51、爿.勵z'wge腿、、爿./ac"co,"to、」.Zra-s77/e肌's、A/—n's、Amsto"'cams7's或爿.ybe油s，進一步更優選地，選自A/o&油svorac油s或J./o"油svar戸〃油s，進一步更優選地，選自爿."/gervarmv畫o"'，進一步更優選地，選自Am'gerATCC1015，以及最優選地，選自ACBS513.88。28.從碳水化合物生產檸檬酸的工藝，其中，在允許從所述碳水化合物生產檸檬酸的條件下，在水性營養培養基中培養如權利要求26、27或權利要求4至8中任意一項所述的微生物，并且，其中，檸檬酸作為發酵產物被分離。29.利用如權利要求26、27或權利要求4至8所述的微生物生產檸檬酸的工藝，其中，在允許從碳水化合物生產檸檬酸的條件下，在水性營養培養基中培養所述微生物，并且，其中，檸檬酸作為發酵產物被分離。30.如權利要求18至25或權利要求28或29中任意一項所述的工藝，其中，所述碳水化合物選自葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、淀粉、玉米、木薯和多元醇構成的組。31.通過權利要求28至30中任意一項所述的工藝生產的或通過權利要求26或27中任意一項所述的微生物生產的檸檬酸作為食品、詞料、飲料、藥物、清潔劑、去垢劑或個人護理產品成分的用途。32.食品、詞料、飲料、藥物、清潔劑、去垢劑或個人護理產品，其中包含通過權利要求28至30中任意一項所述的工藝生產的或通過權利要求26或27中任意一項所述的微生物生產的檸檬酸。全文摘要本發明涉及新鑒定出的基因，其編碼檸檬酸(生物)合成中涉及的蛋白質。本發明還涉及包含所述新穎基因的全長多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸編碼的新穎的多肽及其片段，以及它們的功能等同物。本發明還涉及所述多核苷酸和多肽作為生物技術工具在從微生物生產檸檬酸中的用途，其中對所述多核苷酸和/或被編碼的多肽的修飾對所述微生物中生產發酵產物的產率、產量和/或效率有著直接或間接的影響。本發明還包括使用多核苷酸和經修飾的多核苷酸序列轉化宿主微生物的方法/工藝。本發明還涉及經過遺傳工程改造的微生物及其用于生產檸檬酸的用途。文檔編號C07K14/38GK101400694SQ200680045375公開日2009年4月1日申請日期2006年12月1日優先權日2005年12月1日發明者多米尼奇·羅伯特·格洛森肯,胡戈·馬克·卡雷爾·鮑威利爾斯,諾爾·尼古拉斯·瑪麗亞·伊麗莎白·佩伊凡申請人:帝斯曼知識產權資產管理有限公司