分子綴合物的制作方法

專利名稱：分子綴合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子綴合物，用于制備這些綴合物的連接劑，制備該綴合物和連接劑的方法，和使用該綴合物的方法。更具體地說，本發明涉及Fc-特異性抗體綴合物，用于制備Fc-特異性抗體綴合物的酰肼硫醇連接劑，制備Fc-特異性綴合物的方法，以及使用Fc-特異性抗體綴合物的方法。

背景技術：
已經發展了各式各樣用來將分子連接在一起形成綴合物的方法。特別重要的是生物分子綴合物，它們通常被制備成將參與分子的官能團結合成一個構筑物。一類生物分子綴合物將一個與另一種分子(例如核酸、抗體、凝集素或親和素)特異結合的生物分子與一種可檢測的標記物(例如熒光標記物、熒光納米粒子或酶)結合。
抗體和可檢測標記物的綴合物(抗體綴合物)可用于檢測生物樣品中特定的靶分子的免疫分析。這種綴合物的抗體部分與樣品中的靶物特異結合，而可檢測標記物則被用來提供指示該靶物的存在和/或定位的可測信號。一類已被廣泛使用的，尤其是用于免疫組織化學分析的綴合物是抗體和酶的綴合物(抗體-酶綴合物)。通過向樣品中加入底物產生可檢測的信號，加入的條件應使抗體-酶綴合物的酶部分在抗體部分與其靶物的結合部位將底物轉化成可檢測的產物(例如有色的、不同顏色的或熒光產物)。
抗體綴合物通常利用偶聯劑制備，偶聯劑的特點是至少有兩個活性基團，其中之一與抗體上的官能基反應，另一個與可檢測的標記物上的官能基反應。但是，偶聯會導致抗體和可檢測標記物之一或二者失活。特別是，偶聯可能通過空間位阻作用或者因為偶聯劑與位于抗體和/或酶部分上的對其特異性和/或催化活性起關鍵作用的官能團反應，使抗體-酶綴合物失活。另外，一些偶聯方案會導致綴合物的水溶性減小。
希望偶聯方案能提供抗體特異性和/或酶活性受損較小的抗體-酶綴合物，并且能在免疫化學分析例如免疫組織化學分析中達到更高的靈敏度。高靈敏度對于不希望有額外的擴增步驟的自動化方法特別重要。
發明概要 公開了一種包含酰肼硫醇連接體的分子綴合物。在一項實施方案中，提供了一種抗體-可檢測標記物綴合物，其中包含一個與該抗體的Fc部分共價鍵合的酰肼硫醇連接體。該實施方案的Fc-特異性綴合物具有改進的檢測靈敏度，從而使靶分子的免疫組織化學檢測更適合自動化和高流動量應用。
還公開了一種使用酰肼硫醇連接劑制備綴合物的方法。在一項實施方案中，該連接劑的一個硫醇基不需要保護基團，因為該連接劑是在硫醇基基本上以其中性酸的形式存在、從而基本上無反應活性的條件下與第一種分子反應。在這樣的條件下，連接劑化合物的酰肼基團與第一種分子之間可以形成共價鍵，同時基本上保留了硫醇基團用于第二種分子的硫醇活性基團進行后繼反應。
還公開了酰肼硫醇連接劑和制備酰肼硫醇連接劑的方法。此外，還描述了使用所公開的綴合物檢測諸如組織切片或細胞學樣品等樣本中的靶分子的方法。由于所公開的綴合物顯示出提高的靈敏度，檢測靶分子的方法容易實現自動化。在某些實施方案中，提供了使用所公開的綴合物的多重分析法，例如，使用所公開的具有熒光分子或熒光納米粒子作為檢測標記物的抗體綴合物的多重分析。
附圖簡述

圖1是顯示使用所公開的Fc-特異性抗體-堿性磷酸酶綴合物和使用鏈霉親和素-堿性磷酸酶綴合物檢測扁桃體組織內的κ鏈的染色圖案的一系列圖像。
圖2是顯示使用所公開的Fc-特異性抗體-堿性磷酸酶綴合物和使用鏈霉親和素-堿性磷酸酶綴合物檢測扁桃體組織內λ鏈的染色圖案的一系列圖像。
圖3是顯示使用所公開的Fc-特異性抗體-堿性磷酸酶綴合物和使用鏈霉親和素-堿性磷酸酶綴合物檢測肺組織內CMV的染色圖案的一系列圖像。
圖4是顯示使用所公開的Fc-特異性抗體-堿性磷酸酶綴合物和使用鏈霉親和素-堿性磷酸酶綴合物檢測脾組織內EBER的染色圖案的一系列圖像。
圖5是顯示使用所公開的Fc-特異性抗體-堿性磷酸酶綴合物和使用鏈霉親和素-堿性磷酸酶綴合物檢測CaSki異種移植組織內HPV(人乳頭瘤病毒)的染色圖案的一系列圖像。
圖6是顯示使用所公開的Fc-特異性抗體-堿性磷酸酶綴合物和使用鏈霉親和素-堿性磷酸酶綴合物檢測HeLa異種移植組織內HPV的染色圖案的一系列圖像。
圖7是顯示使用所公開的Fc-特異性抗體-堿性磷酸酶綴合物和使用鏈霉親和素-堿性磷酸酶綴合物檢測SiHa異種移植組織內HPV的染色圖案的一對圖像。
圖8是顯示使用所公開的Fc-特異性抗體-堿性磷酸酶綴合物和使用鏈霉親和素-堿性磷酸酶綴合物檢測細胞學樣品中HPV的染色圖案的一系列圖像。
圖9是顯示使用所公開的Fc-特異性抗體-堿性磷酸酶綴合物和使用鏈霉親和素-堿性磷酸酶綴合物檢測肌肉組織中肌動蛋白的染色圖案的一對圖像。
圖10是顯示所公開的抗體-酶綴合物彼此間和與用其它方法制備的抗體-酶綴合物之間靈敏度比較的一系列圖像。
幾個示例性實施方案的詳述 本發明的其它方面通過以下非限制性的說明和實施例進行示例說明，從以下的縮寫和術語著手。
I.縮寫 Ab-抗體 (Ab-Ap)-抗體-堿性磷酸酶綴合物 Ap-堿性磷酸酶 BSA-牛血清白蛋白 CMV-巨細胞病毒 EBER-愛-巴病毒早期RNA DL-可檢測標記物 Fc-可結晶段 HRP-辣根過氧化物酶 IHC-免疫組織化學 ISH-厚位雜交 MAL-馬來酰亞胺 MBCH-巰基丁酰卡巴肼 MBH-巰基丁酰肼 NHS-N-羥基丁二酰亞胺 PEG-聚乙二醇 SBM-特異結合分子 II.術語 術語“一”和“該”，除非上下文另外清楚地表明，包括單個和多個所述對象。
術語“氨基化”在本文中指醛或酮的羰基與胺基的反應，其中一個含胺的化合物，例如胺或酰肼，與醛或酮反應，先形成一個席夫堿，它隨后能可逆地重排成更穩定的形式，或是任選地被還原以防止反應逆轉。“還原性氨基化”條件包括加入還原劑，更常見的是加入一種溫和的還原劑例如氰基硼氫化鈉或其同類物之一，例如三乙酰氧基硼氫化鈉。可以使用的其它溫和的還原劑包括各種胺合硼烷絡合物。
術語“抗體”統指免疫球蛋白或免疫球蛋白樣分子(包括IgA、IgD、IgE和IgM，以及在任何有機體例如哺乳動物(如人、山羊、兔和小鼠)中的免疫響應期間產生的類似分子)，或其片段，它與一種靶物(或一組高度相似的靶物)特異結合到基本上排除與其它分子結合的程度。在一些實施方案中，抗體與靶物特異結合，結合常數比對樣品中其它分子的結合常數至少高103M-1，104M-1或105M-1。在其它實施方案中，抗體與抗原決定簇(例如半抗原或抗原表位)結合的Kd值處在10-6M數量級或更低，例如10-9M或更低，甚至10-12M或更低。Kd值可以用例如競爭性ELISA(酶聯免疫吸附測定法)或者用表面等離子體共振裝置，例如可由Biacore，Inc.，Piscataway，NJ得到的Biacore T100，測定得到。抗體片段包括蛋白酶解抗體片斷[例如本領域已知的F(ab’)2片段，Fab’片段，Fab’-SH片段和Fab片段]，重組抗體片段(例如本領域已知的sFv片段，dsFv片段，雙特異性sFv片段，雙特異性dsFv片段，雙鏈抗體和三鏈抗體)，和駱駝抗體(例如見，美國專利No.6,015,695；6,005,079；5,874,541；5,840,526；5,800,988和5,759,808)。抗體包括單克隆和多克隆抗體制品。雖然所公開的綴合物的抗體能與任何特定分子或高度類似分子的任何特定基團特異結合，但在特定的實施方案中，該抗體包含一個抗半抗原抗體(例如，它能用來檢測一個以所關心的核酸序列為目標的半抗原標記的探針序列)。在特定的實施方案中，抗體中包含一個能用來在免疫分析中作為第二抗體的抗抗體抗體。例如，該抗體可以含一個抗-IgG抗體，例如抗鼠IgG抗體，抗兔IgG抗體或抗山羊IgG抗體。
短語“酰肼硫醇連接劑的硫醇基團基本上以其中性酸形式存在的條件”是指這樣的條件，例如pH條件，其中該連接劑的硫醇基團(-SH，質子化的中性酸形式)以其共軛堿形式(S-；非質子化的帶負電形式)存在的少于約1％。例如，在這樣的條件下，少于約0.1％，少于約0.01％，甚至少于約0.001％的連接劑能處在共軛堿形式。酰肼硫醇連接劑化合物的硫醇基團基本上以其中性酸形式存在的條件包括pH小于約7，例如pH小于約6，例如pH小于約5.5。在特定的實施方案中，這些條件包括一個pH范圍，例如pH從約3至約7，pH從約4到約7，pH從約4到約6，pH從約4.5到約5.5，或上述各范圍的任何子范圍。在另一些實施方案中，特定連接劑的硫醇基團基本上以其中性酸形式存在(少于1％的硫醇基團以共軛堿形式存在)的pH范圍的上限可以超過7，例如pH8。本領域普通技術人員利用Hender son-Hasselbach公式和該連接劑的硫醇基團的pKa值容易確定給定的硫醇基團基本上以中性酸形式存在的pH范圍的上限。在另一些實施方案中，特定的連接劑的硫醇基團在溶劑體系中能基本上以其中性酸形式存在的準確的pH值不能測定，本領域普通技術人員會認識到，極性比水小的溶劑體系會有利于硫醇基團在較高的表觀pH下保持其中性酸形式。或者是，在特定條件下，連接劑的硫醇基團是否基本上以其中性酸形式存在可以通過測定該硫醇是否會將另一分子中的二硫鍵還原來實驗確定。例如，通過在特定的pH(對于非水體系為估計的pH)條件下接觸該連接劑可以測定被引入到有二硫鍵的分子(如免疫球蛋白)中的自由硫醇基團的數目(例如，用Ellman試劑)。在一段時間內(例如一小時或更長)加入過量的酰肼硫醇連接劑(例如50倍超量或更多)，然后可測定引入到分子中的自由硫醇的平均數。如果生成的自由硫醇很多(例如每個免疫球蛋白分子引入的硫醇平均數超過2)，則表明該連接體的硫醇在所試驗的條件下不是基本上以中性酸的形式存在。例如，在pH約為7時，相對于免疫球蛋白過量100倍的連接劑MBH將產生每個免疫球蛋白分子平均約2個硫醇。在較低的pH5，1000倍過量的MBK連接劑在24小時內產生平均大大少于每個免疫球蛋白分子1個硫醇。這些結果證實，對于連接劑MBH，硫醇基團在pH約為7或更低的條件下基本上以其中性酸形式存在，因為隨著pH降低，中性酸形式和其共軛堿之間的平衡更朝向中性酸形式移動。
“綴合物”是指共價連接成一個更大構筑物的兩個或多個分子(和/或材料，如納米粒子)。在一些實施方案中，綴合物包含一個或多個生物分子(例如肽，核酸，蛋白質，酶，糖，多糖，脂質，糖蛋白和脂蛋白)，它們與一個或多個其它分子，例如一個或多個其它的生物分子，共價連接。在另一些實施方案中，綴合物包含與一個或多個可檢測的標記物(例如熒光分子，熒光納米粒子，半抗原，酶及其組合物)共價連接的一個或多個特異結合分子(例如抗體和核酸序列)。
“可檢測標記物”是一種能產生指示該標記物在樣品中的存在和/或濃度的可檢測(例如可目測或電子學方法測定)信號的分子或材料。當與特異結合分子綴合時，可檢測標記物可以用來對特異結合分子指向的靶物定位和/或定量測定。藉此，靶物在樣品中的存在和/或濃度可以通過檢測該可檢測標記物產生的信號來測定。可檢測標記物可以直接或間接檢測，而且幾個與不同的特異結合分子綴合的不同的可檢測標記物可以組合使用以便檢測一個或多個靶物。例如，第一種可檢測標記物，例如與對靶物特異的核酸探針或抗體綴合的半抗原，可以通過使用與和第一種可檢測標記物特異結合的分子綴合的第二種可檢測標記物間接檢測。能夠被分別檢測的多重可檢測標記物可以與不同的特異結合分子綴合，它們與不同的靶物特異結合，提供了能夠同時檢測一個樣品內的多個靶物的多重測定法。可檢測信號可以用任何已知的或尚待發現的機制產生，包括光子(包括射頻、微波頻率、紅外頻率、可見頻率和紫外頻率的光子)的吸收、發射和/或散射。可檢測標記物包括彩色、熒光、磷光和發光分子及材料，將一種物質轉化成另一物質以提供可檢測的差別(例如將無色物質轉化成有色物質或者反過來，或產生沉淀或提高樣品濁度)的催化劑(例如酶)，能利用另外的以可檢測方式標記的抗體綴合物通過抗體-半抗原鍵合相互作用檢測的半抗原，以及順磁和磁性分子或材料。可檢測標記物的具體實例包括酶，例如辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，酸性磷酸酶，葡糖氧化酶，β-半乳糖苷酶，β-葡糖醛酸酶或β-內酰胺酯；熒光分子，例如熒光素、香豆素、BODIPY染料、試鹵靈和羅丹明(在The Hand book-A Guide to Fluorescent Probes and LabelingTechnologies，Molecular Probe，Eugene，OR中可以找到很多其它的熒光分子的實例)；納米粒子，例如量子點(例如由Quantum Dot Corp，Invitrogen Nanocrystal Technologies，Hayward，CA得到的；還參見美國專利No.6,815,064，6,682,596和6,649,138，各專利均并入本文作為參考)；金屬螯合物，例如放射性或順磁金屬離子如Gd3+的DOTA和DPTA螯合物；以及脂質體，例如含有包藏的熒光分子的脂質體。在可檢測標記物包括酶的情形，可以與該酶組合使用一種可檢測的底物，例如色原、熒光化合物或發光化合物，以便產生可檢測的信號(各式各樣的此類化合物可由市場購得，例如由Invitrogen Corporation，Eugene OR得到)。生色化合物的具體實例包括二氨基聯苯胺(DAB)、4-硝基苯磷酸(pNPP)、固紅、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)、氮藍四唑(NBT)、BCIP/NBT、固紅、AP橙、AP藍、四甲基聯苯胺(TMB)、2，2’-連氮基二[3-乙基苯并噻唑啉硫酸鹽](ABTS)、鄰聯茴香胺、4-氯萘酚(4-CN)、硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、鄰苯二胺(OPD)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷(X-GaL)、甲基傘形酮-β-D吡喃半乳糖苷(MU-GaL)、對硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(PNP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷(X-Gluc)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、堿性品紅、碘硝基四唑鎓(INT)、四唑藍和四唑紫。或者是，在金相學檢測方案中可以使用酶。金相學檢測方法包括將一種酶，例如堿性磷酸酶，與一種水溶性金屬離子和一種無氧化還原活性的該酶的底物組合使用。該底物被酶轉化成氧化-還原活性劑，該氧化-還原活性劑將金屬離子還原，使其形成可檢測的沉淀(例如見，2004年12月20日提交的共同未決的美國專利申請No.11/015,646，PCT公開號No.2005/003777和美國專利申請公開號2004/0265922；它們均并入本文作為參考)。金相檢測方法包括與一種水溶性金屬離子、一種氧化劑和一種還原劑一起使用一種氧化還原酶(例如辣根過氧化物酶)，同樣是形成可檢測的沉淀(例如見，美國專利No.6,670,113，其被并入本文作為參考)。半抗原是被抗體特異結合的小分子，但它們本身不會在動物中產生免疫響應，必須首先附著在更大的載體分子例如蛋白質或者聚核酸上以產生免疫響應。半抗原的實例包括二硝基苯酚、生物素、洋地黃毒苷和熒光素。噁唑、吡唑、噻唑、硝基芳基、苯并呋喃、三萜、尿素、硫脲、魚藤酮類生物堿、香豆素和環木脂體半抗原公開在共同未決的美國臨時專利申請No.60/856133(2006年11月1日提交)中，該申請并入本文作為參考。
這里使用的術語“Fc-特異性綴合物”是指一種免疫球蛋白(或其片段)的綴合物，其中第二分子(例如可檢測標記物)與該免疫球蛋白的糖基化部分(或免疫球蛋白的保留糖基化部分的片段)共價結合。免疫球蛋白的糖基化部分在Fc區域被發現，該區域位于免疫球蛋白的重鏈上，處在免疫球蛋白中決定該免疫球蛋白的特異結合活性的那部分的外面。
術語“酰肼基團”指酰肼基(-CO-NH-NH2)，卡巴肼基(-NH-NH-CO-NH-NH2)，氨基脲基(-NH-CO-NH-NH2)，氨基硫脲基(-NH-CS-NH-NH2)，硫代卡巴肼基(-NH-NH-CS-NH-NH2)，碳酰二肼(-NH-CO-NH-NH-CO-NH-NH2)或其含硫的衍生物，或者羧酸肼基團(-O-CO-NH-NH2)或其含硫的衍生物。
術語“酰肼活性基團”是指能與酰肼基團反應并形成共價鍵的原子團。醛基和酮基是酰肼活性基團的實例。酰肼活性基團可以是分子的固有部分，或者被引入到分子中。將醛基(一種酰肼活性基團)引入到多糖和糖蛋白(包括抗體)中的一種方法是利用氧化，例如高碘酸鹽介導的連位二醇的氧化。此外，不飽和脂肪酸和神經酰胺中的雙鍵可以用四氧化鋨轉化成二醇，然后用高碘酸鹽氧化成醛。再者，肽和蛋白質的N-端絲氨酸和蘇氨酸殘基可以被高碘酸鹽選擇性氧化成醛基，從而可以對某些蛋白例如促腎上腺皮質素和β-內酰胺酶進行選擇性改性。高碘酸鹽氧化的抗體的改性通常不使抗體失活。在氧化反應期間改變高碘酸鈉的濃度產生對所改性的糖基類型的某些特異性。例如，1mM濃度的高碘酸鈉在0℃通常只在唾液酸殘基的第7、8和9個碳原子之間的相鄰羥基處裂解。用10mM或更高濃度的高碘酸鈉氧化多糖造成糖基而非唾液酸的氧化，從而在給定的多糖上形成很多醛。Hermanson，“Bioconjugate Techniques”，Academic Press，San Diego，1996，ISBN0-12-342336-8中描述了一種合適的通用方案，該文獻并入本文作為參考。向生物分子中引入醛的另一方法是通過使用特異性糖氧化酶，例如，半乳糖氧化酶，該酶將末端的半乳糖基氧化成醛，特別是在糖蛋白中。當半乳糖基是唾液酸在后的倒數第二位時，可以用神經酰胺酶除去唾液酸基，使半乳糖基暴露成端基。一種使用神經酰胺酶和半乳糖氧化酶的組合物氧化半乳糖基以得到活性醛基的方案描述在Hermanson，“Bioconjugate Techniques”，Academic Press，San Diego，1996，ISBN0-12-342336-8，該文并入本申請作為參考。還可以通過分子的氨基與NHS-醛(例如丁二酰亞胺基對甲酰苯甲酸酯(SFB)或丁二酰亞胺基對甲酰苯氧基乙酸酯(SFPA)(Invitrogen Corp.，Eugene，OR)反應，將醛引入到分子中。或者是，可以使用二醛化合物，例如戊二醛，將胺基改性以得到醛基。同樣，在Hermanson，“Bioconjugate Techniques”，Academic Press，San Diego，1996，ISBN 0-12-342336-8中提供了合適的方案，該文獻并入本申請作為參考。
術語“酰肼硫醇連接劑”是指含有通過一個或多個連接原子共價結合的一個或多個酰肼基團和一個或多個硫醇基團(-SH)的分子。酰肼硫醇連接劑的酰肼基團和硫醇基團可以通過一個或多個各種原子團連接，包括亞甲基(-CH2-)、支化的亞烷基、另外的酰肼基團、芳族基團、雜芳族基團、脂環基團、聚亞烷基二醇基團(例如氧乙烯基團-O-CH2-CH2-)、酰胺基團(-CONH)、胺基(-NH-)、醚基(-O-)，及它們的組合。“基于PEG的酰肼硫醇連接劑”指包含一個或多個乙二醇基團作為其結構的一部分的一種連接。“多官能酰肼硫醇連接劑”是指一種支化的連接劑，它含有至少一個酰肼基，至少一個硫醇基，和至少另一個活性基團，例如另外一個酰肼基、另一個硫醇基，或可用于制備分子綴合物的任何其它基團。在某些實施方案中，基于PEG的酰肼硫醇連接劑含有一個分離的PEG(dPEG)連接劑，它可以由dPEG起始物(如美國專利申請公布號No.20060020134中所公開的)制備，并可由Quanta Biodesign(Powell，OH)購得。可以包括在多官能酰肼-硫醇連接劑中的另外的活性基團的實例包括馬來酰亞胺基團和活性酯類，例如N-羥基丁二酰亞胺酯和羥基(-OH)。另外的活性基團的實例可以在Hermanson，“Bioconjugate Technigues”，Academic Press，San Diego，1996，ISBN 0-12-342336-8中找到。
“樣品”一詞是指靶物能在其中或其上存在的任何液體、半固體或固體物質(或材料)。特別是，樣品可以是生物樣品或是從生物材料中得到的樣品。生物樣品的實例包括組織樣品和細胞學樣品。
術語“特異結合分子”指與第二種分子特異結合的一種分子。“特異結合”意味著該特異結合分子與第二分子結合到基本上排除樣品中存在的其它分子的程度(例如，特異結合分子的結合常數比對樣品中其它分子的結合常數至少大102M-1，大103M-1，大104M-1或者10-5M)。特異結合分子的實例包括核酸、受體、抗體、酶、凝集素和親和素。特異結合分子能參與其中的特異結合相互作用的實例包括核酸序列雙鏈體和三鏈體的形成，受體-配體相互作用(例如葉酸-葉酸受體相互作用)、抗體-抗原相互作用，酶-底物相互作用，凝集素-糖反應和親和素-生物素相互作用(例如鏈霉親和素-生物素相互作用)。
術語“靶物”指其存在、位置和/或濃度被測定或能被測定的任何分子。靶分子的實例包括蛋白質、核酸序列，以及半抗原，例如與核酸序列或蛋白質共價結合的半抗原。靶分子通常用一種或多種由特異結合分子和可檢測的標記物構成的綴合物檢測。
術語“硫醇活性基團”指能與硫醇基團反應并形成共價鍵的一個或多個原子。硫醇活性基團可以是分子的固有部分，或者是通過與一個或多個其它分子反應而被引入到該分子中。硫醇活性基團的實例包括不可聚合的Michael受體。鹵乙酰基(例如溴乙酰和碘乙酰基團)，烷基鹵化物，馬來酰亞胺，氮雜環丙烷，丙烯酰基團，乙烯基砜，苯醌，能進行親核取代反應的芳族基團，例如氟苯基(例如四氟和五氟苯基)，以及二硫基團，例如二吡啶基二硫基團和用Ellman試劑活化的硫醇。這些類型的各個基團的其它實例對于本領域技術人員將是顯而易見的。在Hermanson，“Bioconjugate Techniques”，Academic Press，San Diego，1996，ISBN 0-12-342336-8中提供了關于用來將一類活性基團與另一類交換以便加入硫醇活性基團的反應條件和方法的進一步實例和信息，該文獻被并入本文作為參考。在一項特定的實施方案中，一個雜雙官能連接劑分子被連接在一個分子上以引入硫醇活性基團。例如，可以將具有馬來酰亞胺基團和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)基團的連接劑通過該NHS基團連接在分子上的胺基上，從而形成具有硫醇活性馬來酰亞胺基團的分子，它能與另一分子上的硫醇基團(例如通過酰肼硫醇連接劑和所公開的方法引入的)反應，形成綴合物。
III.概述 本領域普通技術人員會認識到，所公開的方法能被用來連接具有能與酰肼硫醇連接劑反應的官能基的任何分子組合。下面的非限制性說明將集中描述抗體綴合物，更具體地說，抗體-酶綴合物，但不應認為是對本發明的范圍的限制。雖然具體公開的綴合物是抗體-酶綴合物，但在其它生物分子(例如核酸序列)和其它可檢測標記物(例如半抗原、熒光標記物、熒光納米粒子和熒光蛋白質，例如綠色熒光蛋白)之間的綴合物都被考慮并屬于本發明的范圍。
因此，一方面，公開了一種形成兩種或多種分子的綴合物的方法。該方法包括酰肼硫醇連接劑與有酰肼活性基團(例如醛)的第一分子(例如抗體)反應，形成硫醇化的第一分子。該反應在酰肼硫醇連接劑的硫醇基團基本上以其中性酸(質子化的)形式存在的條件下進行。該硫醇化的第一分子隨后可以與有硫醇活性基團(例如引入到第二分子中的馬來酰亞胺基團)的第二分子反應，形成綴合物。在一項具體的實施方案中，第一分子與連接劑的反應在pH從約4至約7的條件下進行。在其它的具體實施方案中，酰肼硫醇連接劑可以是基于PEG的酰肼硫醇連接劑，多官能的酰肼硫醇連接劑，或基于PEG的多官能酰肼硫醇連接劑。
在另一實施方案中，此方法可用于將特異結合分子連接到可檢測標記物上。在更具體的實施方案中，此方法可用于將有糖基化部分的第一分子連接到另一分子上。在此實施方案中，糖基化部分先被氧化，形成可以與酰肼硫醇連接劑反應的醛基。在一項更具體的實施方案中，糖基化的第一分子可以是具有糖基化Fc區域的抗體。Fc特異性硫醇化抗體是通過與酰肼硫醇連接劑反應來形成，該Fc-特異性硫醇化抗體可以與具有硫醇活性基團的可檢測標記物反應。
在另一方面，提供了各式各樣的酰肼硫醇連接劑及其制備方法，如后面的“合成概述”和具體的“實施例”中所述。再一方面是用所公開的連接劑制備的綴合物。在又一方面，公開了一種試劑盒，其中包含所公開的連接劑和關于進行所公開的制備綴合物的方法的說明。還公開了使用所公開的綴合物檢測樣品中的靶物的方法。
IV.合成概述 A.酰肼硫醇連接劑的制備 雖然在所公開的制備綴合物的方法中可以使用任何酰肼硫醇連接劑，但在一項實施方案中，酰肼硫醇連接劑可以通過硫代內酯與酰肼、卡巴肼或二酰肼按照下面的方案1反應來形成，方案1中n＝1、2或3，R1是H、-CONHNH2或-CO-A-CONHNH2，其中A是一個有1-100個碳原子的二價基團，它可以被一個或多個雜原子間斷(例如O、N或S)，并可被例如一個或多個烷基、羥基、烷氧基、酰基、羧基、鹵素、磺酸基、氧基、磷酸基和/或胺基取代。在更具體的實施方案中，A是一個由1-10個亞甲基(-CH2-)和/或1-24個氧乙烯基(-CH2-CH2-O-)組成的二價基團。在更為具體的實施方案中，A是一個由1-6個亞甲基或4-12個氧乙烯基組成的二價基團。

方案1 可用于所公開的方法中的各式各樣的酰肼硫醇連接劑還可以按照下面的方案2形成。在該方案中，Z是一個有1-100個碳原子的二價基團，該二價基團可以被一個或多個雜原子(例如O、N或S)間斷，并可被例如一個或多個羥基、烷氧基、酰基、羧基、鹵素、磺酸基、氧基、磷酸基和/或胺基取代。在更具體的實施方案中，Z是一個由0-10個亞甲基(-CH2-)和/或1-24個氧乙烯(-CH-CH2-O-)基團組成的二價基團。在更為具體的實施方案中，Z是一個由1-6個亞甲基或4-12個氧乙烯基團組成的二價基團。R2是H，-CONHNH2或-CO-A-CONHNH2，其中A是一個有1-100個碳原子的二價基團，它可以被一個或多個雜原子(例如O、N或S)間斷，并可以被例如一個或多個烷基、羥基、烷氧基、酰基、羧基、鹵素、磺酸基、氧、磷酸基和/或胺基取代。

方案2 在一些實施方案中，可用于所公開的方法中的基于PEG的酰肼硫醇連接按照方案3制備和提供。在方案3中，m＝2至50；R3是H，-CONHNH2或-CO-A-CONHNH2，其中A是一個有1-100個碳原子的二價基團，它可以被一個或多個雜原子(例如O、N或S)間斷，并可以被例如一個或多個烷基、羥基、烷氧基、酰基、羧基、鹵素、磺酸基、氧、磷酸基和/或胺基取代；X和Y獨立地是一個鍵或是1-20個碳原子的二價基團。在更具體的實施方案中，A是一個由1-10個亞甲基(-CH2-)和/或1-24個氧乙烯(-CH-CH2-O-)基團組成的二價基團。在更為具體的實施方案中，A是由1-6個亞甲基或4-12個氧乙烯基團組成的二價基團。X和Y二價基團可以被一個或多個雜原子(例如O，N或S)間斷，并可被例如一個或多個烷基、羥基、烷氧基、酰基、羧基、鹵素、磺酸基、氧、磷酸基和/或胺基取代。在更具體的實施方案中，X和Y獨立地是一個鍵或是-(CH2)p-，其中p＝1至3。在偶聯反應中使用的碳化二亞胺可以是能按照方案提供所希望的偶聯反應的任何碳化二亞胺。合適的碳化二亞胺的實例包括DCC(N，N’-二環己基碳化二亞胺)和DIC(N，N’-二異丙基碳化二亞胺)。在下面討論的一項工作實施方案中，使用DCC實現偶聯。

方案3 在其它實施方案中，提供了可用于所公開的方法中的多官能酰肼硫醇連接劑。下面的方案4a、4b、4c和4d說明了分別從高半胱氨酸、賴氨酸、谷氨酸和高絲氨酸制備多官能連接劑的通用方法。在方案4a、4b、4c和4d中，D是一個有1-100個碳原子的二價基團，它可以被一個或多個雜原子(例如O、N或S)間斷，并可以被例如一個或多個烷基、羥基、烷氧基、酰基、羧基、鹵素、磺酸基、氧、磷酸基和/或胺基取代。在更具體的實施方案中，D是一個由1-10個亞甲基(-CH2-)和/或1-24個氧乙烯(-CH-CH2-O-)基團組成的二價基團。在更為具體的實施方案中，D是由1-6個亞甲基或4-12個氧乙烯基團組成的二價基團。另外，在方案4a、4b、4c和4d中，R4是H、-CONHNH2或-CO-A-CONHNH2，其中A是一個有1-100個碳原子的二價基團，它可以被一個或多個雜原子(例如O、N或S)間斷，并可以被例如一個或多個烷基、羥基、烷氧基、酰基、羧基、鹵素、磺酸基、氧、磷酸基和/或胺基取代。在更具體的實施方案中，A是一個由1-10個亞甲基(-CH2-)和/或1-24個氧乙烯(-CH-CH2-O-)基團組成的二價基團。在更為具體的實施方案中，A是由1-6個亞甲基或4-12個氧乙烯基團組成的二價基團。

方案4a
方案4b
方案4c
方案4d 在其它具體實施方案中，提供了可用于所公開的方法的基于PEG的多官能酰肼硫醇連接劑。方案5a、5b和5c示例說明了能用來形成這些連接劑的通用合成方案。在這些方案中，p＝2至50，R5是H、-CONHNH2或-CO-A-CONHNH2，其中A是一個有1-100個碳原子的二價基團，它可以被一個或多個雜原子(例如O、N或S)間斷，并可以被例如一個或多個烷基、羥基、烷氧基、酰基、羧基、鹵素、磺酸基、氧、磷酸基和/或胺基取代。在更具體的實施方案中，A是一個由1-10個亞甲基(-CH2-)和/或1-24個氧乙烯(-CH-CH2-O-)基團組成的二價基團。在更為具體的實施方案中，A是由1-6個亞甲基或4-12個氧乙烯基團組成的二價基團。R7可以是H、烷基或一個保護基團。

方案5a
方案5b
方案5c B.Fc-特異性抗體綴合物的制備 在一項實施方案中，含酰肼硫醇連接體的綴合物包括一種由抗體和可檢測標記物構成的綴合物。在更具體的實施方案中，該綴合物包括一種由抗體和可檢測標記物構成的Fc特異性綴合物。在更為具體的實施方案中，該綴合物包括抗體和酶(例如堿性磷酸酶)的Fc-特異性綴合物。方案6示例說明了將酰肼硫醇連接劑以Fc-特異性方式加到一種抗體上的方法。

方案6 在方案6中，具有糖基化的Fc部分的抗體被位點特異性地氧化，在該糖基化的Fc部分的糖部分形成一個或多個醛基。該醛基隨后與酰肼硫醇連接劑在該酰肼硫醇連接劑的硫醇基團基本上被質子化的條件下(基本上處于其中性酸形式)反應。在這樣的條件下，連接劑的酰肼基團與抗體的Fc部分共價連接，留下硫醇基團基本上不反應(例如基本上不與抗體中的二硫鍵反應)，從而保留下來用于后面與具有硫醇活性基團的第二分子，例如具有硫醇活性基團的可檢測標記物，進行反應。此反應最好包括進一步與溫和的還原劑反應(還原性氨基化的一個實例)，形成更穩定的腙。硫醇化抗體與具有硫醇活性基團(例如馬來酰亞胺基團)的可檢測標記物的偶聯反應示例說明在方案7中。

方案7 V.實施例 提供以下的關于工作實施方案的非限制性實施例以便進一步說明本發明的某些方面。
實施例1-巰基丁酰肼(MBH)的合成 在一項具體的工作實施方案中，按照方案8從γ-硫代丁內酯制備酰肼硫醇連接劑。

方案8 具體地說，在攪拌下向一水合肼溶液(2.43ml，50mmol)中慢慢加入γ-硫代丁內酯(0.43ml，5mmol)。4小時后減壓除去多余的肼。粗產物用快速色譜法(SiO2，1:19 MeOH/MeCN)純化，得到無色油狀的目標產物。產率599mg(89％) 1H NMR(250MHz，CDCl3)δ 7.56(s，1H)，3.89(s，2H)，2.56-2.47(q，J＝6.9Hz，2H)，2.28-2.22(t，J＝7.0Hz，2H)，1.94-1.83(p，J＝7.0Hz，2H)，1.35-1.29(t，J＝8.0Hz，1H)；13C NMR(62.9MHz，CDCl3)δ 173.02，32.38，29.16，23.94；ESI-HRMS m/z 135.05955(M+H+，C4H11N2OS計算值135.05921). 實施例2-巰基丁酰卡巴肼(MBCH)的合成 在另一個具體的工作實施方案中，由γ-硫代丁內酯按照方案9制備卡巴肼硫醇連接劑。

方案9 具體地說，將γ-硫代丁內酯(0.43ml，5mmol)在乙腈(5ml)中稀釋，然后慢慢加到卡巴肼(2.25g，25mmol)在去離子水(5ml)中的溶液中。將反應混合物在40℃攪拌18小時，然后減壓濃縮。用過濾法得到含乙腈的粗產物，經快速層析法(SiO2，1:19 MeCN/MeOH)純化，得到白色固體產物。產率672mg(70％)1H NMR(250MHz，D2O)δ 2.62-2.56(t，J＝7.1Hz，2H)，2.47-2.41(t，J＝7.4Hz，2H)，1.98-1.87(m，2H)；13C NMR(62.9MHz，D2O)δ179.14，163.94，34.86，31.74，25.91；ESI-HRMS m/z 215.05818(M+Na+，C5H12N4NaO2S計算值215.25787). 實施例3-巰基-dPEG4-酰肼的合成 在另一項具體的工作實施方案中，根據方案10制備基于PEG的酰肼硫醇連接劑，得到巰基-dPEG酰肼。

方案10 向無水肼(10ml)中慢慢加入乙酰基-S-dPEG4TM-NHS酯(QuantaBiodesign，Powell，OH；580mg，1.38mmol)，在環境溫度下攪拌18小時。將反應混合物減壓濃縮，得到粗產物。快速層析法(SiO2，1991MeCN/AcOH)得到無色油狀產物。產率240mg(59％) 1H NMR(250MHz，CDCl3)δ 8.04(s，1H)，3.88(s，2H)，3.68-3.52(m，17H)，2.65-2，60(t，J＝6.3Hz，2H)，2.43-2.39(t，J＝5.8Hz，2H)；13C NMR(62.9MHz，CDCl3)δ 171.94，72.74，70.52，70.49，70.38，70.15，70.09，66.72，35.17，24.12；ESI-HRMSm/z 319.13073(M+Na+，C11H24N2NaO5S計算值319.13036). 一種乙酰基-S-dPEG8TM-NHS酯也是可由Quanta Biodesign(Powell，OH)得到的商品。通常，巰基-dPEG-酰肼具有化學式H2N-NH-CO-(CH2-CH2-O)t-CH2-CH2-SH，其中t＝2-50。
實施例4-IgG和堿性磷酸酶的綴合物的合成 一種Fc-特異硫醇化的免疫球蛋白按照方案11制備。

方案11 具體地說，向多克隆抗體的溶液(1.5ml，3.0mg/ml)加入高碘酸鈉(0.5ml，10mg/ml去離子水溶液)，使高碘酸鹽最終濃度為11.7mM。將反應液轉動2小時，然后流過一只PD-10脫鹽柱(0.1M NaOAc，1mMEDTA，pH＝5.0)，除去多余的高碘酸鹽。以相對于抗體1000倍摩爾過量加入酰肼硫醇連接劑(MBH，AMBH，MBCH或巰基-dPEG4-酰肼)，隨后加入氰基硼氫化鈉(3.14mg，50μmol)，將反應混合物轉動18小時，然后濃縮至最終體積1ml。利用尺寸排阻層析(Superdex 200；0.1MNaOAc，pH＝5.0)得到純化的硫醇化抗體。硫醇的數目用改良的Ellman法定量測定(例如參見，Hermanson，“Bioconjugate Techniques”，Academic Press，San Diego，1996，ISBN 0-12-342336-8，該文獻并入本文作為參考)。這一方面在每個抗體上產生平均3-5個硫醇基團。
酰肼硫醇連接劑與引入到免疫球蛋白的Fc區域中的醛基的反應最好是在溫和的酸性pH，例如pH4-6，如pH接近5的條件下進行。不希望受理論的約束，很可能在這樣的溫和pH下醛基由于醛氧原子的質子化而被親電子活化，同時，酰肼基團(pKa約為4)基本上不被質子化，保持高度的親核性，因此促進了醛基和酰肼基團之間的反應。因為這樣的溫和pH條件還代表了硫醇基團的硫基本上被質子化(基本上以其中性酸形式存在)，從而不能與免疫球蛋白的重鏈和輕鏈以二硫鍵連接的方式反應，所以反應很順利，而且不大會破壞免疫球蛋白結構。另外，自由硫醇基團被保留下來用于進一步反應形成綴合物。
按照方案12將硫醇活性的馬來酰亞胺基團引入到堿性磷酸酶上。

方案12 具體地說，以含有Tris的活性緩沖液的形式收到的堿性磷酸酶(Biozyme，San Diego，CA)流過一只PD-10柱，以便將AP交換到非活性緩沖液(0.1M磷酸鈉、0.1M氯化鈉、1mM氯化鎂，0.1mM氯化鋅，pH＝7.5)中。然后向堿性磷酸酶溶液(0.8ml，17.5mg/ml)中加入100倍過量的NES-dPEG12-MAL(Quanta Biodesign，Powell，OH)，將反應混合物旋轉1小時。尺寸排除層析(Superdex 200；0。1M Tris，1mMMgcl2，0.1mM ZnCl2，pH＝7.5)產生純化過的馬來酰亞胺基堿性磷酸酶。馬來酰亞胺的數目用入良的Ellman分析法(見，例如，Hermanson，“Bioconjugate Technigues”，Academic Press，San Diego，1996，ISBN0-12-342336-8，該文獻并入本申請作為參考)確定，平均每個堿性磷酸酶引入17-25個馬來酰亞胺基團。
硫醇化的Ab和活性AP的最終綴合隨后在7以上的pH下進行，這樣的條件使得能夠通過Ab上的硫醇(在較高的pH下會更大程度地在綴合物中以堿性硫醇化物形式存在)和引入到堿性磷酸酶中的硫醇活性馬來酰亞胺基團反應，快速地形成綴合物。下面的方案13說明了硫醇化Ab和硫醇活性AP的最終綴合。

方案13 具體地說，純化的馬來酰亞胺基堿性磷酸酶與純化的硫醇化抗體以1:1的摩爾比混合，旋轉18小時。尺寸排斥層析法(Superdex 200；0.1MTris，1mM MgCl2，0.1mM ZnCl2，pH＝7.5)得到純化的綴合物，將其用1:1稀釋的StabilzymeTM AP酶-穩定稀釋劑(Sur Modics，Eden Prairie，MN)稀釋至A280＝0.0087，按后面的實施例中所述在組織上分析。所形成的綴合物在各式各樣的組織上顯示出從未有過的染色靈敏度，如后面的實施例中所示。
按照這一程序合成Ab-AP綴合物產生中值分子量約為270kDa的1:1綴合物。不管用來制備綴合物的抗體如何(例如山羊抗鼠IgG，山羊抗兔IgG和兔抗-DNP抗體)，情形都是如此。綴合后得到的粗品層析譜顯示出產物和起始物(中值分子量145kDa)的重疊，這在純化過程中會加以考慮。
實施例5-扁桃體組織中的K鏈檢測 在此實施例中，評價按照實施例4的步驟用MBH制備的Ab-AP綴合物在原位雜交(ISH)試驗中的檢測靈敏度。所使用的步驟改編自

自動化載片染色儀(Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)配備的標準ISH方案。該自動化染色方案如下 將載片上的石蠟包埋的扁桃體組織在75℃加熱4分鐘，用EZPrepTM體積調節劑(Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)在75℃下4分鐘后，沖洗載片，與Liquid CoverslipTM一起加入EZPrepTM體積調節劑以便在76℃將組織脫蠟4分鐘。施加液體蓋玻片以蓋住EZPrep。然后將載片在90℃加熱4分鐘，沖洗，然后冷卻至37℃。加入ISH-蛋白酶1(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)，溫育2分鐘，沖洗，隨后加入熒光素標記的κ核酸探針(100μl，

Kappa，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)。溫育4小時后，將載片在85℃加熱12分鐘，然后冷卻至47℃，再溫育64分鐘。將載片沖洗4次，然后加入鼠抗熒光素第一抗體(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)，將其溫育20分鐘后沖洗2次。這時或是自動加入第二抗體(用于進一步擴增)，或是人工加入或者從分配器中自動加入Ab-AP綴合物。對于被擴增的載片，加入免抗鼠抗體(100μl，VentanaMedical Systems，Inc.，Tucson，AZ)，溫育8分鐘，然后將載片沖洗2次。在每種情形，一旦將AP-Ab綴合物(山羊抗鼠或兔抗鼠IgG綴合物，例如分別有或沒有第二抗體；100μl)施加到載片上，立即將載片溫育16分鐘并沖洗2次。施加iViewTM Blue Enhance增強劑(100μl，VentanaMedical Systems，Inc.，Tucson，AZ)，隨后溫育4分鐘，施加iViewTMBlue NBT(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)和iViewTMBlue BCIP(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)。BCIP是堿性磷酸酶的底物，它產生不溶的深藍/紫色沉淀，NBT則增強BCIP的顏色。然后將載片溫熱32分鐘，沖洗2次，加入對染劑NFR(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)。在用對染劑溫育6分鐘后，再次沖洗載片，從儀器上取下。將載片用洗滌劑洗，然后用乙醇、丙酮和二甲苯系列脫水。在載片上加上蓋玻片，用顯微鏡觀看載片并拍照。還用類似方式制備一個不用κ探針處理的負對照載片。
為了比較，一個參考的扁桃體組織樣品用類似的步驟染色，對于K探針的檢測使用SA-AP綴合物(該步驟包括加入與上相同的第二抗體，隨后是附加的擴增步驟，其中自動加入生物素化的抗-IgG抗體代替了施加Ab-AP綴合物，然后加入SA-AP綴合物)。生物素標記的抗體和SA-AP綴合物的使用是自動化ISH染色法中用于檢測的工業標準，在確定Ab-AP綴合物的相對性能方面起參照作用。還按照使用SA-AP檢測的類似方式制備了一個未用κ探針處理的負對照載片。向該載片上加蓋片，通過明場顯微鏡以40倍放大觀察該載片并拍照。
圖1是一組顯微照片，它們比較了使用抗體-堿性磷酸酶綴合物和SA-AP綴合物對于扁桃體組織內的κISH檢測觀察到的所要的染色和背景染色。在圖1A中顯示了使用所公開的抗體綴合物，但未經第二抗體提供的擴增得到的κ染色。圖1B表示用該綴合物處理的負對照載片。圖1C表示使用SA-AP的κ的染色，圖1D則表示同一樣品的負對照。圖1A和1C的比較顯示出使用抗體綴合物(即使采用較少的擴增步驟)得到更清楚的染色，圖1B和1D的比較證實，抗體綴合物形成的背景較弱。這些結果說明了由于抗體綴合物而變得可行的非生物素檢測方案的優越性。
實施例6-扁桃體組織內λ鏈的檢測 使用實施例5中描述的自動化染色法(不同之處是，使用的熒光素標記的核酸探針是對于λ鏈特異的；

Lamdba，Ventana MedicalSystems，Inc.，Tucson，AZ；并且ISH蛋白酶溫育4小時)，測定用來檢測扁桃體組織中的λ的Ab-AP綴合物的性能。該Ab-AP綴合物使用時沒有第二抗體護增步驟，并如實施例4中所述用MBH制備。為了比較，使用實施例4中所述的SA-AP綴合物檢測方案制備一個參照載片。
結果示于表2中。具體地說，圖2A和2B分別表示用加或不加(負對照)λ特異性核酸探針的Ab-AP綴合物得到的染色圖案。圖2C和2D分別表示用加或不加(負對照)λ探針的SA-AP綴合物得到的染色圖案。圖2A和2C的比較表明，用Ab-AP綴合物得到的染色圖案至少像用SA-AP綴合物看到的那樣強，盡管對于Ab-AP所用的方法少了一個擴增步驟。圖2B和2D的比較表明，使用Ab-AP綴合物時背景染色弱得多(由組織的整體染色更深證明)。同樣，這些結果證實在使用所公開的Ab-AP綴合物時看到的背景有利地減弱。
實施例7-肺組織中CMV的檢測 使用實施例5中所述的自動染色法(不同之處在于使用的熒光素標記的核酸探針是對CMV特異性的；

CMV，Ventana MedicalSystem，Inc.，Tucson，AZ；并且ISH蛋白酶I被溫育4分鐘)，測定Ab-AP綴合物對于肺組織中CMV檢測的性能。使用該Ab-AP綴合物時沒有第二抗體擴增步驟，并且如實施例4中所述，用MBH制備。為了比較，使用實施例4中所述的SA-AP綴合物檢測方案制備一個參照的載片。
結果示于圖3中。具體地說，圖3A表示用Ab-AP綴合物在該探針存在下得到的染色圖案，圖3B表示在無探針存在下用Ab-AP綴合物得到的染色圖案，圖3C表示在探針存在下用SA-AP綴合物得到的染色圖案，圖3D表示在無探針存在下用SA-AP綴合物得到的染色圖案。圖3A和3C的比較表明，用Ab-AP綴合物染色比用SA-AP綴合物得到的染色更清楚，并且強度至少相同(盡管少一個擴增步驟)。另外，對于Ab-AP染色體，背景染色較淺。由圖3B和3D的比較也顯然可見用Ab-AP綴合物形成的背景減弱。
實施例8-脾組織中EBER的檢測 使用實施例5中所述的自動染色法(不同之處在于，所用的熒光標記核酸探針是對EBER特異的；

EBER，Ventana MedicalSystem，Inc.，Tucson，AZ；并且ISH蛋白酶1被溫育4分鐘)測定Ab-AP綴合物時，沒有第二抗體擴增步驟，并且是如實施例4中所述用MBH制備。為了比較，利用實施例4中所述的SA-AP綴合物檢測方案制備一個參照載片。
結果示于圖4。具體地說，圖4A表示在探針存在下使用Ab-AP綴合物得到的染色圖案，圖4B表示在沒有探針的情況下使用Ab-AP綴合物得到的染色圖案，圖4C表示在探針存在下用SA-AP綴合物得到的染色圖案，圖4D表示在沒有探針的情況下用SA-AP綴合物得到的染色圖案。圖4A和4C的比較表明，用Ab-AP綴合物染色比用SA-AP綴合物得到的染色更清楚，并且強度至少相同(盡管少一個擴增步驟)。另外，對于Ab-AP綴合物，背景染色較弱。比較圖3B和3D也顯然可見，Ab-AP綴合物形成的背景減弱。
實施例9-組織異種移植物中HPV的檢測 在此實施例中，部分評價了根據實施例4的步驟用MBH制備的Ab-AP綴合物的性能，以確定它是否具有足夠的靈敏度，以便能進一步減少用ISH檢測HPV序列所需的步驟數目。結果表明，可以實現檢測所需步驟數目的減少，從而使得所公開的Ab-AP綴合物很適用于通過減少步驟數目顯著減少操作時間并同時降低試驗成本的一種自動方法。
下面作為方案14-16列出的三種檢測方案是以自動化或半自動化方式進行。在每種方案中，先向樣品中加入與至少一部分HPV核酸序列特異結合的一種DNP標記的核酸探針。這些方案中敘述的后繼步驟是用來檢測與HPV核酸結合的探針的存在的步驟。

方案14
方案15
方案16 在方案14中，一種抗DNP抗體先與探針結合。然后加入抗-IgG抗體(第一擴增步驟)。在第二擴增步驟中，加入一種生物素化的抗-IgG抗體。加入SA-AP綴合物，它與該生物素化抗體結合，通過加入一種與AP起作用的生色底物完成染色。在方案15中，去掉了第二擴增步驟，在染色之前加入一種與AP綴合的抗-IgG抗體，而不是SA-AP綴合物。在方案16中，兩個擴增步驟均被去掉，DNP標記的探針直接用與AP綴合的抗-DNP抗體檢測。
按照改編自

自動染色儀(Ventana Medical System，Inc.，Tucson，AZ)的標準ISH方案的以下程序，對于在SCID小鼠中異種移植物內生長的多種細胞系進行HPV檢測。將載片上的石蠟包埋的組織在75℃加熱4分鐘，用EZPrepTM體積調節劑(Ventana Medical System，Inc.，Tucson，AZ)在75℃處理2次，然后施加含EZPrepTM體積調節劑的LiquidCoverslipTM(Ventana Medical System，Inc.，Tucson，AZ)。在75℃下4分鐘后，沖洗載片，加入EZPrepTM體積調節劑，在76℃將組織脫蠟4分鐘。施用Liquid Coverslip將EZPrepTM蓋住。加入細胞調節溶液CellConditioner #2(Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)將載片溫熱至90℃并溫育8分鐘。隨后再施加Cell Conditionev #2，在90℃溫育12分鐘。用反應緩沖液(Ventana Medical System，Inc.，Tucson，AZ)沖洗載片，冷卻至37℃，加入ISH-蛋白酶3(100μl，Ventana Medical System，Inc.，Tucson，AZ)。溫育4分鐘后，將載片沖洗3次，然后加入雜交緩沖液(iVewTM Plus HybReadyTM溶液，100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson AZ)，溫育4分鐘。加入DNP標記的HPV核酸探針(HPVHR probe，200μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson AZ)，隨后在37℃溫育4分鐘，95℃溫育12分鐘，52℃下124分鐘。然后將載片沖洗2次，溫熱至72℃。最后這一步驟再重復2次，然后將載片冷卻至37℃，根據所遵循的檢測方案，將載片按3種方式之一以自動或半自動方式處理。
在一種情形，如方案14中所示，施加iViewTM+抗-DNP(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson AZ)第一抗體，溫育20分鐘。然后將載片沖洗2次，接著加入iViewTM+Amp(100μl，Ventana MedicalSystems，Inc.，Tucson AZ)第二抗體。溫育該綴合物8分鐘，然后沖洗載片。加入iViewTM+Biotin-Ig(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson AZ)，隨后溫育12分鐘，加入iViewTM+SA-AP(100μl，VentanaMedical Systems，Inc.，Tucson AZ)。將載片沖洗3次，然后施加iViewTM+增強劑(100μl，VMSI)，接著溫育4分鐘，加入iViewTM+增強劑(100μl，VMSI)，接著溫育4分鐘，加入iViewTM+NBT(100μl，Ventana MedicalSystems，Inc.，Tucson AZ)和iViewTM+BCIP(100μl，Ventana MedicalSystems，Inc.，Tucson AZ)。將載片溫育24分鐘，沖洗3次，加入對染劑NFR(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson AZ)。在用對染劑溫育4分鐘后，將載片再沖洗3次，從儀器中取出。將載片用洗滌劑洗，然后用乙醇、丙酮和二甲苯系列脫水。在載片上加上蓋片，然后通過明場顯微鏡觀看載片和拍照。
在另一情形，如方案15中所述，加入免抗DNP第一抗體(iViewTM+抗DNP第一抗體，100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson AZ)。將該第一抗體溫育20分，然后沖洗載片2次，接著手工加入(此步驟也可以自動化以使程序全部自動化)與堿性磷酸酶綴合的抗免IgG抗體(100μl)。將該綴合物溫育16分，然后沖洗載片4次。施加iViewTM+增強劑(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson AZ)，溫育4分鐘，加入NBT和BCIP以便顯色(iViewTM+NBT和iViewTM+BCIT，100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson AZ)。將載片溫育24分鐘，沖洗3次，加入對染劑NFR(100μl，Ventana Medical System，Inc.，Tucson AZ)。在用對染劑溫育4分鐘后，將載片沖洗3次，從儀器中取出。用洗滌劑處理載片，然后用乙醇、丙酮和二甲苯脫水。加上蓋片后，使用明場顯微鏡在40倍放大下觀看載片并拍照。
在又一情形，如方案16中所述，載片直接用堿性磷酸酶免抗DNP綴合物(100μl)處理。將載片溫育20分鐘，沖洗2次，然后施加iViewTM+增強劑(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson AZ)。隨后溫育4分鐘，同時加入iViewTM+NBT(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson AZ)和iViewTM+BCIP(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson AZ)。然后將載片溫育24分鐘，沖洗3次，加入對染劑NFR(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson AZ)。在用對染劑溫育4分鐘后，將載片再沖洗3次，自儀器中取出。用洗滌劑處理載片，然后用乙醇、丙酮和二甲苯系列脫水，加上蓋片，用明場顯微鏡在40倍放大下觀看載片并拍照。
圖5-7顯示了在三種不同類型異種移植物組織內的HPV檢測結果。在圖5A、5B和5C中，分別顯示了按照方案14、15和16檢測CaSKi異種移植物組織中HPV的染色圖案。在圖6A、6B和6C中，分別顯示了按照方案14、15和16檢測HeLa異種移植物組織中HPV的染色圖案。在圖7A和7B中，分別顯示了按照方案14和15檢測SiHa異種移植物組織中單拷貝HPV(箭頭指示)的染色圖案。
圖5A和5B的比較表明，按照方案15檢測得到的染色強度比按照方案14的大，即使方案15少2個擴增步驟。圖5C表明，HPV檢測可以利用按照實施例4制備的Ab-AP綴合物不經擴增而直接完成(方案16)。圖6A和6B的比較也證實，按照方案15檢測得到的染色強度大于按照方案14得到的，雖然方案15包含的擴增步驟少2個。圖6C表明，HPV的檢測可以利用按照實施例4制備的Ab-AP綴合物不經擴增而直接完成(方案16)。圖7A和7B的比較表明，即使單拷貝的HPV核酸序列也可以用方案15的檢測方法檢測。總之，這些結果證實，所公開的Fc特異性Ab-AP綴合物顯示的優越的靈敏度，通過減少了為檢測組織樣品中HPV所需的步驟數目，便利了自動化檢測。方案14和15之間步驟數目的減少，可以將總的自動化染色操作時間減少15％(從6.5小時至5.5小時)。通過使用方案16可以實現操作時間的進一步減少。
雖然在此實施例中描述的是一種DNP標記探針和特殊類型的抗體，但本領域普通技術人員會理解到，可以使用很多其它的半抗原(例如熒光素、洋地黃毒苷和生物素)來標記核酸序列，并且可以使用針對不對靶物、各具不同的半抗原標記物的多個核酸探針以實現多重檢測(例如使用與發射各種不同波長光的不同熒光納米粒子綴合的不同的檢測抗體)。另外，本領域普通技術人員會認識到，在類似的測定中可以使用與所述抗體不同類型和來自不同物種的其它抗體、其它的可檢測標記物和用來產生可檢測信號的其它試劑，來檢測其它的靶物。
實施例10-液體基制劑中的HPV的檢測 供液體基制劑HPV測定用的載片使用

2000 System載片制備系統(Cytyc Corporation，Marlborough，MA)制備。將通過陰道刮擦得到的細胞置于甲醇基的緩沖保存液(

Preserv Cyt Solution，Cytyc Corporation，Marlborough，MA)中，然后用儀器鋪放在玻璃載片上。
以下是改編自Ventana

儀器的步驟將液體基制劑載片在65℃加熱12分鐘，然后在75℃再加熱4分鐘，用反應緩沖液(Ventana Medical Systems，Inc.，Tuscon，AZ；1.2ml)在75℃沖洗2次，然后施加液體蓋片(Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson AZ)。將載片用0.9ml沖洗緩沖液(Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)沖洗，隨后施加細胞調節液Cell Conditioner #2(Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)，將載片溫熱至90℃，溫育16分鐘。將載片用反應緩沖液沖洗，冷卻至37℃，加入ISH-蛋白酶3(100μl，Ventana MedicalSystems，Inc.，Tucson，AZ)。溫育4分鐘后，沖洗載片3次，然后施加iViewTM+HybReady(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)，溫育4分鐘。加入HPV HR探針(200μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)，在37℃溫育4分鐘，95℃ 12分鐘，52℃ 124分鐘。然后沖洗載片2次，溫熱至72℃。最后這一步再重復二次，然后將載片冷卻至37℃，加入iViewTM+Anti-DNP(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)。
對于標準的SA-AP檢測(按照以上方案14)，將第一抗體溫育20分鐘，將載片沖洗2次，然后加入iViewTM+Amp第二抗體(VentanaMedical Systems，Inc.，Tucson，AZ，100μl)，將抗體溫育8分鐘后，沖洗，加入iViewTM+生物素-IgG抗體綴合物(Ventana Medical System，Inc.，Tucson，AZ，100μl)，隨后溫育12分鐘，沖洗。最后，加入iViewTM+SA-AP綴合物(Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ，100μl)，溫育8分鐘后，用反應緩沖液沖洗載片3次。對于用Ab-AP綴合物作為第二抗體檢測(按照以上方案15)，將第一抗體溫育20分鐘，沖洗載片2次，然后加入AP-IgG綴合物(100μl)。將其溫育8分鐘，然后用反應緩沖液沖洗3次。對于用Ab-AP綴合物直接檢測標記的探針，將綴合物溫育20分鐘，然后用反應緩沖液沖洗載片3次。
在所有三種情形中，在以上步驟后均加入iView+增強劑(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)，隨后溫熱4分鐘，加入iViewTM+NBT(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)和iView+BCIP(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)。然后將載片溫能24分鐘，沖洗3次，加入對染劑NFR(100μl，VentanaMedical Systems，Inc.，Tucson，AZ)。用對染劑溫育4分鐘后，再沖洗載片3次，自儀器中取出。將載片用洗滌劑處理，然后用乙醇、丙酮和二甲苯脫水，隨后向載片上加蓋片，用顯微鏡觀察。
圖8A和8B的比較表明，按照方案15(見實施例9)使用按實施例4的步驟用MBH制備的Ab-AP綴合物，得到的染色比按照方案14(見實施例9)用SA-AP檢測得到的染色強度大。圖8B和8C的比較證實，按照方案16(見實施例9)使用抗DNP Ab-AP綴合物直接檢測，得到的信號與按照方案14用SA-AP綴合物得到的信號相近。這些結果再次證實，由按照實施例4的Fc特異的Ab-AP綴合物所提供的檢測靈敏度，能減少為提供適當的信號所需的步驟數，從而便利了自動化。
實施例11-肌組織中肌動蛋白的檢測 在此實施例中，使用按實施例4中所述用MBH連接劑制備的Ab-AP綴合物對蛋白質靶物(肌動蛋白)進行免疫組織化學檢測，并與SA-AP綴合物的性能比較。
以下是改編自Ventana

儀器的程序將石蠟涂覆的組織載片在75℃加熱4分鐘，用EZPrepTM體積調節劑(Ventana MedicalSystems，Inc.，Tucson，AZ)在75℃處理2次，然后施加含EZPrepTM體積調節劑的液體蓋片(Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)。在76℃下4分鐘后，沖洗載片，與液體蓋片一起加入Depar體積調節劑(Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)，將組織脫蠟。然后將載片冷卻至42℃ 2分鐘，再達到最終溫度37℃。加入第一抗體(100μl，抗肌動蛋白，Ventana Medical System，Inc.，Tucson，AZ)，將載片在37℃溫育16分鐘。隨后沖洗載片2次，加入堿性磷酸酶綴合的山羊抗鼠材料(100μl)，在37℃溫育16分鐘。將載片沖洗1次，然后同時加入增強的V-Red增強劑(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)和Enhance Naphthol(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)，將載片在37℃再溫育4分鐘，接著加入Enhance Fast Red A(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)，溫育8分鐘，加入入EnhanceFast Red B(100μl，Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)，最后溫育8分鐘。顯色后，將載片用洗滌劑處理，然后用乙醇、丙酮和二甲苯脫水，隨即在載片上加蓋片，然后用顯微鏡觀看載片。
結果示于圖9。具體地說，圖9A表明，用Ab-AP綴合物和單獨一個擴增步驟檢測，優于用SA-AP綴合物和兩個擴增步驟檢測(圖9B)。這些結果再次證實了根據本發明的Fc-特異性抗體所提供的優越的檢測靈敏度。
實施例12-抗體連接劑長度和類型的變化 在此實施例中，測定了連接劑長度和類型對綴合物成分和染色特性的影響。按照實施例4的方法，但是使用各種不同的酰肼硫醇連接劑，制備了幾種綴合物，特別是，用硫代-PEG4-酰肼連接劑、巰基丁酰肼(MBH)連接劑和巰基丁酰卡巴肼(MBCH)連接劑制備的綴合物。將這些綴合物彼此比較，并與通過免疫球蛋白二硫化物的還原產生硫醇制備的綴合物，特別是用共同未決的美國臨時專利申請NO.60/675759中所述方法制備的Ab-AP綴合物進行比較，上述申請涉及DTT還原產生硫醇，然后用基于PEG的馬來酰亞胺-NHS雙功能連接劑進行綴合。為了比較，還將一種市售的乙酰氨基巰基丁酰肼(AMBH，Invitrogen，Eugene，OR)連接劑用于實施例4的方法中，以生成Ab-AP綴合物。此外，還制備了一種按照制造商的說明用馬來酰亞胺基酰肼(EMCH；N[ε-馬來酰亞胺基己酸]酰肼，Pierce Biotechnology，Rockford，IL)制備的Ab-AP綴合物，并在染色方案中使用以供比較。另外，還使用在美國專利No.5,191,066中所述的使用胱胺的Fc-特異性綴合方法，以得到Fc-特異性Ab-AP綴合物用于比較。
Ellman測定結果表明，通過與MBH和基于PEG的酰肼硫醇連接劑加成，每個免疫球蛋白分子上加上3-5個硫醇/Ab，對于AMBH和MBCH連接劑為5-7硫醇/Ab，對于DTT還原方法為8-12個硫醇/Ab。在將免疫球蛋白中引入或產生的硫醇與馬來酰亞胺衍生的AP偶聯后，得到尺寸排阻層析圖。
尺寸排阻層析圖是用AKTA Purifier LC(GE Biosciences，Uppsala，Sweden)得到的，使用Superdex 10/300200GL柱和0.1M Tris，1mMMgCl2，0.1mM ZnCl2，pH＝7.5作為流動相。在所述情形流速均保持在1ml/min。由尺寸排阻層析圖確定，綴合物的最佳產率是用AMBH得到的。然而，當在2-8℃下貯存48小時時它開始從溶液中沉淀出來。其它的連接劑都產生具有類似的尺寸排阻圖型的綴合物。
圖10比較了實施例6中所述的使用綴合物作為第二抗體的扁桃體組織上κ鏈的染色。圖10A表示對于用EMCH制備的Ab-AP綴合物所看到的染色圖案。圖10B表示對于美國專利5,191,066的Fc-特異性胱氨酸法所看到的染色圖案。圖10C表示對于按照2006年4月27日提交的美國專利申請No.11/413,418的DTT還原法，使用dPEG基雙功能連接劑制備的Ab-AP綴合物看到染色圖案。圖10D表示對于用市售的AMBH連接劑，使用所公開的Fc特異性綴合法制備的Ab-AP綴合物看到的染色圖案。圖10E表示對于根據所公開的Fc-特異性綴合法，利用實施例1中公開的MBH連接劑制備的Ab-AP綴合物所看到的染色圖案。圖10F表示對于根據所公開的Fc特異性綴合法，用實施例3中公開的dPGE4酰肼連接劑制備的Ab-AP綴合物看到的染色圖案。圖10G表示對于按照所公開的Fc-特異性綴合法，使用實施例2中公開的MBCH酰肼硫醇連接劑制備的Ab-AP綴合物看到的染色圖案。將這些染色圖案相比較，揭示了由綴合物產生的染色強度的以下趨勢 EMCH<胱氨酸<AMBH<MBCH<PEG4＝DTT<MBH。
這些圖像表明了利用本發明公開的方法和各種所公開的以及市售的酰肼硫醇連接劑，通過Fc特異性綴合能夠獲得的優越的靈敏度。所公開的方法還產生比胱氨酸Fc-特異性方法和用EMCH偶聯的方法更優越的綴合物。只有DTT介導的綴合法得到的綴合物在特異性和靈敏度方面相近。
實施例13-MBH連接劑過量的變化 在此實施例中，測定了綴合物成分和染色特性對酰肼硫醇連接劑的過量的依賴性。用MBH連接劑按照實施例4的步驟合成AP-IgG綴合物，但是MBH連接劑的摩爾過量從5000倍過量到50倍過量變化。Ellman分析得到的結果顯示以下的硫醇/Ab數5000倍，9-15；1000倍，7-10；500倍，3-5；100倍，2-4；50倍，1-3。與馬來酰亞胺衍生的抗體反應后，對綴合物(5000×，1000×，500×，100×和50×)進行尺寸排阻層析，結果表明，用過量較大的連接劑合成的綴合物的總產率較高。但是，這些綴合物的組織染色(抗鼠-肌，肌動蛋白；抗兔-皮膚，S100)表明，500倍過量時染色強度最大，而背景最弱。
實施例14-堿性磷酸酶連接劑長度/類型的變化 在此實施例中，測定了綴合物成分和染色特點對用來將硫醇活性基團加到堿性磷酸酶上的連接劑的長度和類型的依賴性。用MBH連接劑合成AP-IgG綴合物是按照實施例4的步驟進行，但是使用以下連接劑來活化堿性磷酸酶與硫醇化抗體的反應LC-SMCC(Pierce，Rockford，IL)，MAL-dPEG8-NHS酯(Quanta Biodesign，Powell，OH)，MAL-dPEG4-NHS酯(Quanta Biodesign，powell，OH)和MAL-dPEG12-NHS酯(Quanta Biodesign，powell，OH)。這些連接劑均按照100倍過量在緩沖體系(0.1M磷酸鈉，0.1M NaCl，1mM MgCl2，0.1mM ZnCl2，pH＝7.5)中與AP反應1小時。LC-SMCC必須溶在二甲基甲酰胺(DMF)中，加到AP上，但DMF在緩沖液中的總體積不超過10％。Ellman分析表明，對于PEG12和LC-SMCC連接劑，馬來酰亞胺的結合數為20/AP，對于PEG8連接劑為27/AP，對于PEG4連接劑為30/AP。在偶聯在Fc-硫醇化抗體(用MBH制成)之后，純化時得到尺寸排阻層析譜。PEG12連接劑得到最高的綴合物產率，隨后是PEG8、LC-SMCC和PEG4連接劑。組織染色(抗鼠-肌肉，肌動蛋白；抗鼠-皮膚，S100)反映了綴合物產率，PEG12綴合物產生最強的染色。
實施例15-NHS-PEG12-MAL連接劑過量的變化 在此實施例中，測定了綴合物成分和染色特點對用來將硫醇活性基團加到堿性磷酸酶上的NHS-PEG12-MAL連接劑的過量程度的依賴性。AP-IgG綴合物按照實施例4的方法合成，其中MAL-dPEG12-NHS酯連接劑的摩爾過量從500倍到25倍過量變化。
Ellman分析結果表明，馬來酰亞胺的結合數為500倍時34，250倍時29，100倍時18-20，50倍時17，25倍時15。在與Fc-硫醇化的Ab反應后用尺寸排阻層析法對綴合物(500×，250×，100×，50×和25×)的分析表明，使用過量較多的連接劑合成的綴合物具有較高的產率，并且馬來酰亞胺的結合百分數較高。對于各個綴合物，組織染色(抗鼠-肌肉，肌動蛋白；抗兔-皮膚，S100)表明，使用100倍過量的馬來酰亞胺得到最尖銳和最強的染色。
實施例16-AP/Ab摩爾比的變化 在此實施例中，測定了綴合物成分和染色特點對最終反應中硫醇化抗體(用MBH連接劑制備)與馬來酰亞胺衍生的AP(NHS-PEG12-MAL連接劑)之比的依賴性。采用以下的比例(抗體/AP)2:1，1:1，1:2和1:3。尺寸排阻層析譜的圖案表明，在摩爾比為2AP1Ab時得到最大產率。但是，綴合物的組織染色(抗鼠-肌肉，肌動蛋白；抗免-皮膚，S100)表明，圖1:1綴合物觀察到最佳信噪比。
實施例17-交聯的AP的合成 堿性磷酸酶是一種二聚蛋白質，通過將該酶交聯可以提高其穩定性，以有助于防止二聚體解離。堿性磷酸酶是用以下步驟交聯的。將堿性磷酸酶(Biozyme，San Diego，CA；17.5mg，0.125μmol)交換到與其原裝不同的緩沖液(0.1M磷酸鈉、0.1M氯化鈉、1.0mM氯化鎂，0.1mM氯化鋅，pH＝7.5)中，并在氰基硼氫化鈉(1.6mg，25μmol)存在下加到重組、預氧化、醛活化的葡聚糖(平均分子量40,000；PierceBiotechnologies，Rockford，IL；5mg，0.125μmol)中。將反應混合物在室溫下轉動1小時。用乙醇胺(151μl，2.5mmol)猝滅過量的醛，然后加入更多的氰基硼氫化鈉(157.1mg，2.5mmol)。將反應混合物再轉動1小時。使用一臺裝有Superdex 200GL 10/300柱(GE Biosciences，Uppsala，Sweden)的AKta Purifier(GE Biosciences，Uppsala，Sweden)，利用尺寸排阻層析法，分離出交聯的AP。流速是1ml/min，流動的水相是0.1M磷酸鈉、0.1M氯化鈉、1.0mM氯化鎂、0.1mM氯化鋅，pH＝7.5。反應后保留的胺的數目用氟醛分析法(Protein Assay Technical Handbook，Pierce Biotechnology，Rockford，IL)定量測定，交聯后平均保留8-12個胺。將交聯的AP連接在MAL-dPEG12-NHS酯(它與保留的胺反應)上，并按實施例4中所述與Fc-硫醇化的抗體綴合，得到包含交聯的AP酶的綴合物。穩定性研究表明，交聯提高了綴合物在含親和素稀釋劑(VentanaMedical Systems，Inc.，Tucson，AZ；P/H 95/30)中的穩定性。具體地說，在45℃，對于含交聯的AP的綴合物，在第3天的染色強度總損失為50％，而在同一稀釋劑中和同一溫度，用未交聯的AP制備的綴合物在第一天就損失其染色強度的95％。
用于交聯AP以增強其穩定性的其它方法提供在Bieniarz et al.，Bioconj，Chem.，9390-398，1998，Bieniarz et al.，Bioconj，Chem，9399-402，1998，和美國專利No.5,789,219中。這些方法也能用來交聯堿性磷酸酶以供在本發明公開的綴合物中使用。
實施例18-堿性磷酸酶綴合物的分析SDS PAGE 在此實施例中，實施例4的綴合方法的Fc特異性由變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠電泳得到證實。分析了6個不同的綴合物制品，3個用抗鼠IgG抗體制備，3個用抗兔IgG抗體制備。簡言之，將各綴合物的100-200ng/μl溶液取5-20μl與4×LDS凝膠負載緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA)混合，加入2-巰基乙醇至最終濃度為1mM。將樣品混合物在48-50℃溫和地加熱5分鐘。選擇此溫度是為了將酶和抗體之間的共價連接的破壞降至最小，同時仍能通過2-巰基乙醇將綴合物的抗體部分的輕鏈和重鏈解離。然后將各樣品冷卻，加到聚丙烯酰胺凝膠(或是1.0mm厚、預成型的NuPAGETM 4-20％聚丙烯酰胺Bis Tris凝膠，或是NuPAGETM 3-8％聚丙烯酰胺Tris乙酸鹽凝膠，Invitro-gen，Carlsbad，CA)的不同孔中。使用的分子量標準是預染色的MultimarkTM和Mark 12寬范圍標準，它們均購自Invitrogen(Carlsbad，CA)。電泳在室溫下使用一臺Novex XCell II盒式系統(Invitrogen，Carlsbad，CA)在70mA下進行60-90分鐘。操作緩沖液是MES-SDS或Tris乙酸鹽-SDS緩沖液，分別用于3-8％凝膠和4-20％凝膠。從盒中取出凝膠，在去離子水中洗2次，每次5分鐘，以便去除SDS和緩沖劑。然后將SDS-PAGE凝膠在室溫下于乙醇/水/乙酸[40:50:10(v:v:v)]中固定1小時，用溶在甲醇/水/乙酸[50:40:10(v:v:v)，Sigma-Aldrich，St Louis，MO]中的考馬斯藍R-250染色。將凝膠在室溫下溫和地搖動染色，最短2小時，最長過夜。脫色按照與染色相同的方式進行。脫色液與去掉染料的染色液相同。將凝膠用Invitrogen凝膠干燥器(Invitrogen，Carlsbad，CA)干燥。凝膠的分析清楚地表明，對各綴合物均存在一個分子量與抗體的輕鏈對應的譜帶。另外，對于各綴合物，基本上不存在與堿性磷酸酶的重鏈分子量對應的帶。相反，一系列更高分子量的帶表明，對于各綴合物，堿性磷酸酶選擇性地與IgG的重鏈結合。因為免疫球蛋白的重鏈包括Fc區，結果表明了綴合物的Fc位點特異性本質。
實施例19-Fc特異性抗體-HRP綴合物的合成 在此實施例中，描述了一種包含一個基于PEG的酰肼硫醇連接體的Fc特異性抗體綴合物的制備方法。硫醇活性馬來酰亞胺基團如下所述地加到辣根過氧化物酶上。向一只4ml的琥珀色小瓶中加入7.8mg(15.2μmol，100當量)MAL-dPEG4TMNHS酯(Quanta Biodesign，Powell，OH)，隨后加辣根過氧化物酶(HRP；Pierce Biotechnology，Rockford，IL；0.25mL，25mg/ml在0.1M Na3PO4，0.15M NaCl中，pH＝7.5)。將小瓶在室溫下于暗處旋轉1小時，然后用裝有Superdex 200柱(GEBiosciences，Uppsala，Sweden)的AKta Purifier，利用尺寸排阻層析法純化，采用緩沖劑水溶液(0.1M Na3PO4，0.15M NaCl，pH＝7.5)。收集含HRP的級分，得到HRP-PEG4-馬來酰亞胺溶液。HRP濃度由溶液的A280測定(ε280＝0.652mlcm-1mg-1)，利用改良的Ellman分析法定量測定馬來酰亞胺的數目為每個酶6-8個馬來酰亞胺。
純化的馬來酰亞胺-辣根過氧化物酶與純化的巰醇化抗體(根據實施例4用MBH連接劑制備)按3:1摩爾比混合并轉動18小時。尺寸排阻層析法(Superdex 200；0.1M Na3PO4，0.15M NaCl，pH＝7.5)得到純化的綴合物，將其稀釋到含B5封阻劑的親和素稀釋劑(Ventana MedicalSystems，Inc.，Tucson，AZ)中，并在組織上分析。將利用本實施例的HRP綴合物對在前列腺組織上的前列腺特異性抗原的染色，與如美國臨時專利申請No.60/675,579中所述通過免疫球蛋白的DTT還原制備的HRP綴合物比較，表明本實施例的HRP綴合物比DTT-制備的HRP綴合物的背景稍淺，但染色強度也稍弱。
實施例20-衍生自氨基酸的多官能酰肼硫醇連接體 在一些實施方案中，可用在所公開的方法中的多官能酰肼硫醇連接劑按照以上的方案4a、4b、4c和4d由氨基酸和氨基酸類似物制備。在本實施例中，特異性連接劑的合成路徑概述于以下方案中。在具體方案17a、17b、17c和17d中，氨基酸或氨基酸類似物(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)首先在三乙胺(TEA)存在下與N-丁二酰亞胺基S-乙酰硫代乙酸酯(SATA，Pierce Biotechnology，Rockford，IL)反應。在方案17a中，該第一反應的產物與肼反應，得到具有一個酰肼基和兩個硫醇基的多官能酰肼硫醇連接劑。在方案17b中，利用碳化二亞胺介導的與DCC的偶聯，與第一反應產物的羧酸官能基形成一個NHS活性酯，隨后與肼反應形成另一種有一個酰肼基團和兩個硫醇基的多官能酰肼硫醇連接劑。在方案17c中，與17b中一樣，使用第一反應產物形成NHS酯，然后與肼反應生成有兩個酰肼基團和一個硫醇基團的多官能酰肼硫醇連接劑。在方案17d中，與肼的反應產生有一個酰肼基、一個硫醇基和一個羥基基團的多官能酰肼硫醇連接劑。

方案17a
方案17b
方案17c
方案17d 方案17a、17b、17c和17d的產物分別是2-巰基乙酰氨基巰基丁酰肼(MAMBH)，N，N’-(6-肼基-6-氧己烷-1，5-二基)二(2-巰基乙酰胺)(BTAL)，N-(1，5-二肼基-1，5-二氧戊-2-基)-2-巰基乙酰胺(TAGD)和N-(1-肼基-4-羥基-1-氧丁-2-基)-2-巰基乙酰胺。
在一項具體的實施方案中，MAMBH合成如下。首先，通過配制三乙胺(0.15ml，1.1mmol)在乙腈(10ml)中的溶液并向其中加入高半胱氨酸鹽酸鹽(150mg，1.0mmol)，制備乙酰硫代乙酰胺高半胱氨酸。將所形成的漿體攪拌5分鐘，然后加入S-乙酰基硫代乙酸酯(250mg，1.1mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌16小時，然后減壓濃縮。柱層析(SiO2，9:1 CH2Cl2/Et2O)分離出無色粉狀產物。產率174mg(75％) 1H NMR(250MHz，CDCl3)δ 6.66(bs，1H)，4.51-4.41(p，J＝6.7Hz，1H)，3.63-3.50(m，2H)，3.36-3.18(m，2H)，2.88-2.80(m，1H)，2.38(s，3H)，2.01-1.88(m，1H)；13C NMR(62.9MHz，CDCl3)δ 204.37，195.38，168.59，59.51，32.74，31.43，30.18，27.43；ESI-HRMS m/z 256.00693(M+Na+，C8H11NNaO3S2計算值256.00780). 2-巰基乙酰氨基巰基丁酰肼(MAMBH)然后制備如下向一水合肼(10ml)中加入S-乙酰硫代乙酰胺高半胱氨酸(300mg，1.3mmol)。將形成的漿體在室溫下攪拌16小時，此時溶液變均勻。減壓除去肼，粗產物用反相快速層析法(15％ C8 SiO2，160:39:1 H2O/MeOH/AcOH)純化，得到所要的產物，為無色油狀物。產率207mg(72％)。1H NMR(250MHz，CD3OD)δ4.52-4.46(m，1H)，3.23-3.21(m，2H)，2.59-2.52(m，2H)，2.10-2.01(m，2H)；13CNMR(62.9MHz，CD3OD)δ 172.82，172.43，52.49，37.72，21.42，20.49；ESI-HRMSm/z 246.03251(M+Na+，C6H13N3NaO2S2計算值246.03469). 用6-乙酰基硫代己酸NHS酯代替方案17a、17b和17c中的SATA，得到以下示出的相應化合物TMBH、BTHL和THGD。6-乙酰基硫代己酸NHS酯具有以下結構。6-乙酰基硫代己酸NHS酯能夠利用碳化二亞胺介導的6-乙酰基硫代己酸與N-羥基丁二酰亞胺的偶聯反應制備。

硫代己酰氨基巰基丁酰肼(THMBH)
雙硫代己酰氨基酰肼基賴氨酸(BTHL)
硫代己酰氨基谷氨酰二肼(THGD) 6-乙酰硫代己酸NHS酯具有以下結構
它通過碳化二亞胺介導的6-乙酰基硫代己酸與N-羥基丁二酰亞胺(二者均可自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO得到)的偶聯反應制備。
本領域普通技術人員還會認識到，在以上實施方案中可以用基于PEG的S-乙酰基硫代羧酸衍生物代替SATA，以得到在所公開的綴合方法中使用的多官能PEG基連接劑。例如，基于PEG的多官能酰肼硫醇連接劑可以通過在以上的方案17a-d中用具有下式結構的分子代替ASTA來制備
其中m＝2-50。此式化合物是可由Quanta Biodesign(Powell，OH)得到的商品，或是能夠由相應的羧酸制備。
實施例21-多官能的PEG基酰肼硫醇連接劑 在一些實施方案中，可以用在所公開的方法中的多官能的PEG基酰肼硫醇連接劑按照以上的方案5a、5b和5c制備。在此實施例中，合成特定連接劑的路徑概述于以下方案18a、18b和18c中。還展示了具體的反應方案。除非另外說明，試劑和溶劑都是常規的，可以從例如Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)得到。

方案18a 按照方案18a，向5.0g Tris在10ml水中的溶液加入碳酸鈉(1.3當量)，接著加入苯氧基乙酰氯(1.2當量)，將反應混合物在冰上于氮氣下攪拌16小時。沉淀出的氨基被保護的產物用水洗3次，真空干燥。通過在C18硅膠柱上層析，用乙腈/水(5-100％乙腈，30分鐘)洗脫，得到該第一反應產生的純化合物。然后通過在DMF中用三乙胺(4.0當量)和甲磺酰氯(5.0當量)處理，引入甲磺酸基。減壓除去DMF，殘留物置于無水DMF中，過濾除去鹽。減壓除去DMF，得到粗制的甲磺酸酯2，它在用前不作進一步純化。向該甲磺酸酯(0.3當量)在無水DMF中的溶液加入HO-dPEG4TM-SATA(1.0當量；Qanta Biodesign，Powell，OH)和K2CO3(1.5當量)，將反應混合物于氮氣下攪拌16小時。減壓除去DMF，殘留物溶在無水DCM中，過濾去除鹽。減壓除去DMF，隨后進行硅膠層析，得到PEG化的中間體。然后通過在EtAc/MeOH混合物中用Pd/C處理，除去Pac保護基。將形成的中間體先用羰基二咪唑(10當量)，再用肼(100當量)處理，得到氨基甲酰肼。

方案18b 按照方案18b，向醇(HO-PEG4-SATA，Quanta Biodesign，Powell，OH，1.3當量)在DCM中的溶液加入1.5當量重氮二異丙基二羧酸酯，隨后加入1.8當量三丁膦，將反應混合物于干燥的氮氣下攪拌30分鐘。然后向形成的懸浮液中加入1.0當量的酚/DCM溶液，在干燥的氮氣下攪拌16小時。將硅膠層析后得到的酚醚置于純凈的肼中，將溶液微波加熱，得到多官能的PEG基酰肼硫醇連接劑。

方案18c 按照方案18c，向5.0g Tris在10ml水中的溶液依次加入碳酸鉀(1.3當量)和苯氧基乙酰氯(1.2當量)，將反應混合物在氮氣下于冰上攪拌16小時。沉淀出的氨基被保護的產物用水洗3次，真空干燥。然后通過用氫化鈉(3.0當量)和丙炔溴(10當量)在DMF中處理引入炔基，經硅膠層析后得到炔類中間體1。向HO-PEG4-SATA(Quanta Biodesign，Powell，OH)在DCM中的溶液依次加入甲磺酰氯(1.2當量)和三乙胺(1.4當量)，在氮氣下于冰上攪拌16小時。然后過濾除去該三乙胺鹽，將甲磺酸酯產物真空干燥。向該甲磺酸酯化的醇在DCM中的溶液加入疊氮化鈉(1.2當量)，在氮氣下攪拌16小時，經硅膠層析后得到疊氮化物中間體2。向含有硫酸銅(0.2當量)和抗壞血酸鈉(0.5當量)的叔丁醇/水(1:1)溶液中加入各1當量的中間體炔1和中間體疊氮化物2。然后將反應混合物在氮氣下攪拌16小時，經硅膠層析后得到具有被保護的氮的中間體。隨后通過用10％ Pd/C在1:1的乙酸乙酯/甲醇混合物中處理，除去氮保護基，利用酸-堿后處理得到游離胺。向該游離胺在DCM中的溶液加入羰基二咪唑(10當量)，在氮氣下攪拌4小時。然后將反應混合物減壓濃縮，殘留物溶于純凈的肼中。將該溶液在100℃微波加熱1小時，得到多官能PEG基酰肼硫醇連接劑。
本領域技術人員容易看出，在這些實施方案中可以用其它的SATA醇代替PEG基的分子，以得到其它多官能PEG基酰肼硫醇連接劑，而且還可以代之以不同長度的PEG SATA醇。
實施例22-聚丙烯酰胺酰肼硫醇連接劑的合成 在此實施例中，提供了一種聚合的多價酰肼硫醇連接劑，該連接劑可以按照以下的方案19制備。

方案19 在方案19中，X可以是例如100-500，Y可以是例如10-50。L代表用來將該酰肼基團的一部分轉化成硫醇基團的硫醇化試劑。聚丙烯酰胺酰肼(PAH)可以利用已公布的美國專利申請No.2005158770中提供的方法合成。簡言之，在一只裝有冷凝器的100ml圓底燒瓶中將20ml聚丙烯酰胺(1mmol，50％wt水溶液，Sigma-Aldrich，Milwaukee，Wis)與10ml蒸餾(DI)水和20ml-水合肼(420mmol，Sigma-Aldrich，Milwaukee，Wis)混合。將反應混合物微波加熱60分鐘。冷卻至室溫后，用等體積的甲醇使反應混合物沉淀，離心并傾析。殘留物置于50ml DI水中，重復沉淀總計3次。將最終的殘留物溶于DI水中，冷凍干燥成白色吸濕的細粉。在適當的溶劑中使所形成的PAH與硫醇化試劑，例如硫醇-dPEG-NHS酯(Quanta Biodesign，Powell，OH)或者Traut試劑，進行反應，使可利用的酰肼(Z＝5-40)的一部分(例如約50-75％)硫醇化，得到能用于所公開方法中的聚合的多官能酰肼硫醇連接劑。其它的硫醇化試劑可以在例如Hermanson，“Bioconjugate Technology”，AcademicPress，San Diago，1996，ISBN 0-12-342336-8中找到，該文獻并入本申請作為參考。
可以用兩種方式之一使用/制備該聚丙烯酰胺酰肼硫醇連接劑先合成它并使用所公開的綴合方法，或者先使PAH與一種分子反應以使該PAH硫醇化，然后使已經硫醇化的第一分子與第二分子反應。
雖然已經參照幾個示例性實施方案對本發明的原理作了描述，但是對于本領域普通技術人員，顯而易見的是可以在不偏離這些原理的情況下對實施方案的細節進行修改。例如，雖然詳細的說明是集中于抗體-酶綴合物，但是連接劑和方法可以用來制備任何類型的綴合物，包括抗體和其它可檢測標記物，例如和納米粒子(如，金屬和半導體納米粒子，例如金納米粒子和量子點)、熒光分子、生熒光分子、有色分子、生色分子和順磁性構建物(例如順磁離子的螯合物)的綴合物。用于所針對的治療的抗體綴合物(例如抗體與藥物分子、毒素和放射性構建物如放射性金屬離子的螯合物的綴合物)也在考慮之內，雖然提供的具體實例顯示的是具有酰肼和卡巴肼基團的酰肼硫醇連接劑的應用，但是可以用任何“酰肼基團”代替在所公開的方法和綴合物中到出的酰肼或卡巴肼基團。另外，應該清楚，雖然可以用一個或多個單一的酰肼硫醇連接劑形成綴合物，但也可以使用多種不同的酰肼連接劑形成綴合物。所公開的綴合物可以用在與可檢測標記物連接的特異性結合分子能夠使用的任何類型的測定中，例如，除示例說明的免疫組織化學分析之處，還可用于任何類型的免疫分析，或任何類型的雜交分析。檢測方案可以用手工方式或自動化方式完成。另外，所公開的連接劑也可以用來修飾用于將分子與底物結合的表面，而且這樣的表面修飾反應可以用本發明公開的方法進行。本發明包括屬于以下權利要求的范圍和精神之內的所有修改、變動和等價物。
權利要求
1.一種形成兩個或多個分子的綴合物的方法，包括
使酰肼硫醇連接劑與有酰肼活性基團的第一分子反應，形成硫醇化的第一分子，其中酰肼硫醇連接劑與第一分子在該酰肼硫醇連接劑的硫醇基團基本上以其中性酸形式存在的條件下反應；和
使硫醇化的第一分子與具有硫醇活性基團的第二分子反應，形成綴合物。
2.權利要求1的方法，其中第一分子含有一種特異結合分子，第二分子含有一種可檢測的標記物。
3.權利要求1的方法，其中在酰肼硫醇連接劑化合物的硫醇基團基本上以其中性酸形式存在的條件下反應包括在小于約7的pH下反應。
4.權利要求1的方法，其中在酰肼硫醇連接劑化合物的硫醇基團基本上以其中性酸形式存在的條件下反應包括在約為3-7的pH下反應。
5.權利要求1的方法，其中在酰肼硫醇連接劑化合物的硫醇基團基本上以其中性酸形式存在的條件下反應包括在約為4-6的pH下反應。
6.權利要求1的方法，其中第一分子的酰肼活性基團包括醛基。
7.權利要求6的方法，其中第一分子包括糖基化分子，醛基是通過第一分子的糖基化部分的氧化被引入到第一分子中。
8.權利要求7的方法，其中糖基化分子包括一種抗體，醛基被引入到抗體的Fc部分。
9.權利要求1的方法，其中第二分子的硫醇活性基團包括被引入到第二分子中的馬來酰亞胺基團。
10.權利要求9的方法，其中被引入到第二分子中的馬來酰亞胺基團是用NHS-PEG-馬來酰亞胺連接劑引入的。
11.權利要求9的方法，其中第二分子包含一種可檢測標記物。
12.權利要求1的方法，其中酰肼硫醇連接劑化合物是以下化合物中的一種或多種MBH，MBCH，MAMBH，THMBH，BTAL，BTHL，TAGD，THGD，PEG-基的酰肼硫醇連接劑，多官能酰肼硫醇連接劑，PEG基的多官能酰肼硫醇連接劑，和聚丙烯酰胺酰肼連接劑。
13.權利要求12的方法，其中該酰肼硫醇連接劑化合物是MBH、MBCH或巰基-dPEG-酰肼連接劑中的一種或多種。
14.權利要求1的方法，其中酰肼硫醇連接劑化合物具有以下化學式
其中n＝1、2或3；R1是H、-CONHNH2或-CO-A-CONHNH2，其中A是一個有1-100個碳原子的二價基團。
15.權利要求1的方法，其中該酰肼硫醇連接劑化合物具有以下化學式
其中m＝2-50，R2是H、-CONHNH2或-CO-A-CONHNH2，其中A是一個有1-100個碳原子的二價基團，X和Y獨立地是一個鍵或有1-20個碳原子的二價基團。
16.按照權利要求1的方法制備的綴合物。
17.一種綴合物，其中含有經由一種酰肼硫醇連接劑與可檢測標記物共價結合的抗體，其中該酰肼硫醇連接劑是以下化合物中的一種或多種MBH、MBCH、MAMBH、THMBH、BTAL、BTHL、TAGD、THGD、PEG基的酰肼硫醇連接劑、多官能酰肼硫醇連接劑、PEG基多官能酰肼硫醇連接劑和聚丙烯酰胺酰肼連接劑；其中該連接劑的一個酰肼基團與抗體的Fc部分共價結合。
18.權利要求17的綴合物，其中該酰肼硫醇連接劑包括PEG基的酰肼硫醇連接劑。
19.權利要求18的綴合物，其中該PEG基酰肼硫醇連接劑包括巰基-dPEG-酰肼連接劑。
20.權利要求17的綴合物，其中該酰肼硫醇連接劑包括MBH或MBCH。
21.權利要求17的綴合物，其中可檢測標記物包括酶、熒光分子、半抗原或熒光納米粒子。
22.權利要求21的綴合物，其中可檢測標記物包括酶。
23.權利要求22的綴合物，其中可檢測標記物包括選自堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶的一種酶。
24.權利要求23的綴合物，其中的可檢測標記物包括堿性磷酸酶。
25.權利要求24的綴合物，其中該堿性磷酸酶包括交聯的堿性磷酸酶。
26.權利要求17的方法，其中抗體包括抗半抗原抗體。
27.權利要求17的綴合物，其中抗體包括一種抗抗體抗體。
28.具有以下化學式的一種酰肼硫醇連接劑
其中R1是H或-CONHNH2，n＝1、2或3。
29.一種試劑盒，其中含有化學式如下的一種酰肼硫醇連接劑
其中R1是H或-CONHNH2，n＝1、2或3；和
用來實施權利要求1的方法的使用說明。
30.一種試劑盒，其中含有化學式如下的一種酰肼硫醇連接劑
H2N-NH-CO-(CH2-CH2-O)t-CH2-CH2-SH
其中t＝2至50；和
用來實施權利要求1的方法的使用說明。
全文摘要
公開了一種利用酰肼硫醇連接劑制備兩種分子的綴合物的方法。在一項具體的工作實施方案中，利用該方法制備了一種Fc-特異性抗體-酶綴合物，它在免疫組織化學分析和原位雜交分析中顯示出優越的染色靈敏度和特異性。
文檔編號C07C319/02GK101535244SQ200680043958
公開日2009年9月16日 申請日期2006年11月21日 優先權日2005年11月23日
發明者C·比尼爾茲, J·阿什沃思-夏普, C·A·凱納, J·W·科斯梅德, M·勒菲弗 申請人:文塔納醫療系統公司