FcRn受體的用途的制作方法

            文檔序號:3558364閱讀:1786來源:國知局

            專利名稱::FcRn受體的用途的制作方法
            技術領域
            :本發明涉及生物化學和分子生物學領域,更具體地說,本發明涉及(例如,單克隆)抗體及其書f生物的生成,甚至更具體地,涉及治療性和診斷性抗體及其衍生物的生成。
            背景技術
            :利用單克隆抗體(mAb)的免疫治療已經開始成為一種重要的用于癌癥、免疫缺陷、免疫調節和自身免疫的治療方法(綜述見L2)。抗體治療的一個重要優勢是極具選擇性地靶向引起疾病的致病因子的能力。此外,治療性抗體可與免疫細月包相互作用并激活補體,而補體顯著促進它們的治療效果。Drs.K6hkr和Milstein3在1975年開發了生成單克隆抗體的4支術,并由于該發現而一皮4受予1984年的諾貝爾獎。1986年美國食品與藥品管理局(FDA)批準了第一個治療性單克隆抗體(OKT3),用來逆轉(reverse)急性腎移才直氺卜斥。該抗體來源于小鼠,在人體內i秀導強烈的免疫反應,這限制了該藥的^f吏用,因為它只能在短期內安全應用。為了避免這個問題,生產了嵌合的(70%人源)和人源化(~80-95%人源)抗體。后期的技術可利用噬菌體展示纟支術而實現合成性人源抗體的生成,這種抗體更加適于在人體內應用。隨著基因工程性人免疫球蛋白轉基因小鼠的開發出現,現在已可能生成全人源抗體,因此能夠重復給藥而實現人體內更加有效的治療L2。FDA批準用于腫瘤治療的第一個US抗體是嵌合抗體利妥昔單抗(Rituximab),它針對B細胞上的CD20靶標,已證實在非霍奇金'淋巴瘤的治療中非常有效,還證實了抗體治療可成功抵御實體瘤,如曲妥單抗(Trastuzumab)i正明的,該藥物刮-對Her-2/neu(c-erbB2),而Her-2/neu(c-erbB2)在~30%的乳腺癌中過量表達。抗體治療在臨床上還用于抵抗傳染性病原體(帕利珠單抗(Synagis),針對呼吸道合胞病毒)、抑制器官移植后的排斥反應(賽尼哌(Zenapax)和舒萊(Simulect))以及4十只t自身免疫性疾病如克隆氏病(Crohn'sdisease)和類風濕性關節炎(TNF-oc特異的抗體英利昔單抗(Remicade))L2。目前,USFDA已批準了18種抗體用于臨床應用(表l)4,超過400種用于臨床應用的抗體正在被開發。該頗具前途的新型療法的一個缺點是每個患者必須反復給予大量抗體(每個患者達到克級)以及高額生產費用(相對于小分子)。高額治療費用限制了治療性抗體的廣泛應用,且引發了其在選4奪性患者群中應用的〗侖理問題。我們預期,新沖支術和方法可縮4豆生產時間和/或增加產量,將使抗體藥物更加節約成本且對于臨床應用更加方便可獲得。
            發明內容本發明的目的是提供提高產量和/或質量以及/或者縮短生產時間和/或降<氐生產成本的方法和方式。其中,本發明4皮露了FcRn受體蛋白和/或其表達增加可促進抗體生成細胞周圍的液體中形成更高的抗體濃度,不受理i侖的限制,我們i人為這至少部分是由于抗體生成細胞所分泌的抗體增加所致。因此,在第一個實施例中,本發明提供了一種用于在細胞內生成抗體或者其功能性部分、衍生物和/或類似物的方法,包括提供能夠利用FcRn受體蛋白生成所述抗體的細胞以及培養所述細胞,以實現所述抗體的生成。關于術語"生成",應注意上述步驟不<又<又用于抗體生成,所述步艱《還可用于增加抗體產量的方法中。在后一種情況下,所述細胞已能生成(小量)抗體,通過誘導或增加所述細胞表達的FcRn受體蛋白的量可增加產量。通常,抗體(或免疫5求蛋白;本文中所述術語可互換應用)被描述成一種其單體為"Y"形分子的蛋白,該分子由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈組成,鏈之間通過二硫鍵連接。每一條重鏈均具有一個恒定區(其在同一類的所有免疫球蛋白中是相同的)以及一個可變區(其在不同B細胞的免疫球蛋白之間是不同的,但在相同B細胞的全部免疫球蛋白中則是相同的)。根據特異的抗體同種型,所述重《連具有由三個或四個結構i或組成的恒定區。4壬4可重《連的可變部分區域都是由一個結構域組成。每一條輕《連均具有兩個結構i戈一個恒定區和一個可變區。抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈組成,所述抗體可分成兩個Fab(抗原結合片段)段和一個Fc(可結晶片段)段。該Fc段是"Y"的莖,由兩條重鏈組成,其中,隨抗體類別不同每條重鏈貢獻兩個或三個恒定區。其中,盡管根據本發明所述的方法是基于FcRn可促進IgG生成細胞分泌IgG的發現,本發明并不限于(天然)IgG抗體,因為本領域的當前發展水平已經達到了嵌合抗體、抗體衍生物、抗體等價物、抗體類似物和抗體片段的生產。所述嵌合物、衍生物、等價物、類似物和片段的實例將在下文詳細討論。因此,本發明還提供了用于生成抗體的功能性部分、衍生物和/或類似物的方法或者增加其產量的方法。本文中,"功能性"是指能夠以刺激IgG-FcRn結合性能的方式結合于FcRn受體蛋白。根據目前的^口"i只,IgG的Fc(以及白蛋白)結合于FcRn受體蛋白。而且,已知Fc的CH2和CH3之間的界面與FcRn受體蛋白相互作用5-7。因此,包含IgG的Fc或包含至少Fc的CH2-CH3界面的抗體嵌合物、衍生物、等價物、類似物以及片段也包括于本發明中。抗體功能性部分的實例是基本上包括至少一個抗原結合位點以及FcRn結合部分的IgG分子,即基本上已經去除了全部非抗原結合部分以及全部非FcRn結合部分。抗體書f生物的一個實例是由受體的配體結合結構域(即CD40配體)和IgG抗體的FcRn結合部分(CD40L-Fc)組成的嵌合分子,即所謂的IgG半分子。類似物的實例如某種人IgG抗體(或者其一部分或衍生物)的鼠源類似物或另一種以刺激IgG的方式結合FcRn的分子在pH6.5和更低時為高/中度親和結合,但在生理pH7.4時不結合或低結合(即白蛋白)。其所有部分、書亍生物和/或類^f以物必須至少包4舌一個FcRn結合部分例如IgG抗體的全長Fc片段或其功能性部分即能夠結合FcRn的部分(種類上是,lt量上不一定),例如Fc的CH2-CH3界面。因此,5見在申i青的發明不4又在例如單克隆4元體的生成中有用,而且還可用于雙特異性抗體、小分子免疫藥物(SMIPs)的生成、單克隆坤支術3。細月包雜交瘤和/或寡克隆(oligoclonics)^支術的所有變形以及所有具有與IgG類似的FcRn結合特性的所有分子(低pH時結合,在高于7的生理性pH下不結合或低結合)的生成。還可以通過交4奐iU奮飾FcRn的細月包外結合區但J呆留FcRn的細月包內尾巴和功能而應用,以適于提高新型分子的產量。根據目前用于這些分子的生成方法,人們可以例如處理可產生所述分子的細月包,-使其還能生成FcRn或者生成更多/其他FcRn。隨后所述FcRn的存在可促進所述分子的生成。一類IgG受體是新生兒FcyR(FcRn)受體,由獨特的a鏈和P2-孩i5求蛋白((32M)組成,^f戈表主要組織相容性I類(MHC-I)同系物8,已發現其存在于上皮細胞、胎盤合胞體滋養層以及內皮細胞中。在這些細胞中,已表明FcRn分別與IgG^爭粘膜細胞8'9轉運(從母體至胎兒1。)以及IgG半衰期的調節"—14有關。在這些組織中,FcRn結合并轉運IgG,為新生兒提供體液免疫并延長IgG的壽命。最近,我們鑒定FcRn在吞噬細胞上表達,其中,它與"經典"白細胞FcYR—起發揮作用,介導IgG包裹的耙標的內化(吞噬)15。最近的研究結果表明FcRn在白蛋白轉運中起作用16,并介導IgG至粘膜表面的轉運以及粘膜抗原攝取9。本發明不僅包括FcRn受體蛋白的用途還包括其功能性部分、衍生物和/或類似物的用途。在本文中,術語"功能性"是指所述部分、衍生物和/或類似物必須還能夠結合IgG分子的Fc段(或白蛋白),優選具有相同或可比擬/類似的pH依賴性。甚至更優選地,所述FcRn的功能部分、衍生物和/或類似物還包括溶酶體與細胞膜間運輸所有必需的元件,例如恰當的信號序列和重新環化信號。FcRn的晶體結構是已知的5'17,18,且有報道稱人和大鼠FcRn的晶體結構類似5,7。此外,Fc結合位點也極具同源性5,7,18,因此熟練才支術人員具有開發FcRn功能部分、書f生物和/或類似、物所必需的全部4言息,而無過度負擔。檢測FcRn受體蛋白功能部分、衍生物和/或類似物的功能性的一種非限定性方式是通過在pH6.5和7.4時測定其與例如Fc或白蛋白的結合能力。在pH6.5左右,所述功能部分、書f生物和/或類似物與其所述Fc或白蛋白應該發生結合,而在pH7.4左右則不結合。允許本發明所述方法中的細胞在細胞培養基中生長或存活足夠長的時間(即所述細胞在適宜條件下培養或孵育,該條件可隨采用的特殊細胞而異),以實現抗體的生成。FcRn受體蛋白的存在促進抗體生成細胞分泌抗體,因此可提供和/或增強抗體生成。可選地,所生成的抗體通過本領域、技術人員已知的4支術例如可4安照廠家的"i兌明書(Amersham,Uppsala,Sweden)通過蛋白A或蛋白G親和純化而收集和/或純化。才艮據所需抗體的量,4艮據本發明所述的方法可從'J、規模成比例擴大至中或大規模。不同規模涉及不同的培養系統,從T培養瓶(小)、4爭弁瓦、細月包系(CellLine)(IntegraBiosciences,Chur,Switzerland)埃倫邁爾燒并瓦(中)至更大(定制)的發酵罐系統(大)。本發明所述方法中采用的細月包即能夠產生抗體的細月包可以是多種方式獲得/來源的。例如人們可以采用其本身即能產生抗體的細胞例如B細胞或B細胞來源的細胞(NS-O,SP2/0)或雜交瘤細胞。然而,人們還可采用在天然條件下不產生抗體^f旦經(遺傳性)處理可產生抗體的細胞,例如中華倉鼠卵巢細胞(CHO)、幼年倉鼠腎細胞、293細胞及其衍生物或者其他表達腺病毒El的細胞系如PER,C6。要求這種細胞是能夠提供FcRn功能環境的真核細胞。"功能環境"是指FcRn在該細胞內是有功能的(能夠轉運),即該細胞必須表達必要的分子結構。優選地,這種細胞具有編碼抗體或者其功能部分、衍生物和/或類似物的核酸。甚至更優選地,將所述核酸功能性地連"^妻于調節性序列如啟動子序列和增強子序列。在一個優選的實施例中,所述細胞是一種細胞系的部分,優選永生化或不死性細胞系。在另一個優選的實施例中,這種細胞具有FcRn。如下文將更加詳細闡述的,在另一個優選實施例中,本發明提供(例如人)細胞的內源性FcRn啟動子被強(組成性)啟動子或可誘導性啟動子取4戈,或者細月包的內源性FcRn啟動子已經祐j秀導。所述FcRn蛋白受體分子可以蛋白形式或以編石馬所述FcRn受體蛋白(或者其功能部分、衍生物和/或類似物)的核酸的形式提供。如果FcRn受體蛋白以蛋白形式提供,優選其通過蛋白轉染試劑(例如Chariot,ActiveMotif,Carlsbad,CA)而遞送,或偶聯于轉運基團/蛋白轉導肽(其能夠使所述基團/肽與所述FcRn的融合體進入細胞內)。這種基團/肽的實例是HIV-TAT蛋白。然而,為了建立更加穩定的情形,優選所述FcRn受體蛋白以核酸形式^是供。在一個優選實施例中,本發明提供一種用于在細胞內生成抗體或者其功能部分、衍生物和/或類似物的方法,包括提供能夠利用FcRn受體蛋白生成所述抗體的細力包以及培養或孵育所述細月包,以實現所述抗體的生成,其中所述細胞具有編碼所述FcRn受體蛋白的核酸。盡管可能將所述編碼FcRn蛋白受體的核酸維持為染色體外物質,但優選將所述核酸整合入該細胞的基因組中。這一點通過例如編碼FcRn的核酸與所采用細胞(系)染色體之間的同源重組而實現。優選地,以革巴向方式進行重組,以確保將編碼FcRn的核酸整合入染色體的轉錄活性部分中。顯然,對本領域的熟練4支術人員來說,可將所述編碼FcRn的核酸功能性連接于調節序列例如啟動子,以及可選地連接于增強子序列。在一個優選實施例中,FcRn受體蛋白在所采用的細胞內過量生成。過量表達可通過例如提供功能性偶聯于調節序列的多拷貝FcRn和/或通過纟是供連接于強調節性啟動子(例如巨細胞病毒(CMV)啟動子或其變體)的有限拷貝(例如一個或兩個拷貝)或其纟且合而實5見。1顯然,對本領域的熟練技術人員來說,除了提供具有FcRn受體蛋白(以蛋白形式或以編碼所述FcRn受體蛋白(或者其功能部分、衍生物和/或類似物)的核酸的形式)的細胞,還可能例如誘導或增加已包含涉及FcRn遺傳信息的細胞內FcRn受體蛋白表達。這可通過例如向所述細胞中加入"i秀導劑、FcRn(oc鏈)基因前的啟動子和/或(32微球蛋白基因前的啟動子而實現。在另一個實施例中,FcRn受體蛋白通過例如用強啟動子或可誘導性啟動子取代a鏈前的內源性啟動子而提供。如果技術人員愿意在人FcRn受體蛋白的存在下在人細胞內生成人抗體或增加其產量,則可利用標準的(以及為人熟知的)分子生物學4支術而實現內源性FcRn啟動子的i秀導或者用強或可i秀導性啟動子取^R內源性啟動子。在另一個優選實施例中,本發明提供一種用于在細胞內生成抗體或者其功能性部分、衍生物和/或類似物的方法,包括提供能夠利用FcRn受體蛋白生成所述抗體的細胞以及培養所述細胞,以實現所述抗體的生成,其中所述抗體來自一個物種,所述細月包來自相同或不同物種。后面一種情形的實例是在小鼠體內或鼠細胞內產生人類抗體。顯然,對熟練才支術人員來i兌,可以制備導入的FcRna《連以及FcRnP2微球蛋白與可選性已存在于所述細胞內的FcRn鏈的多種組合。在一個優選實施例中,本發明提供一種用于在細胞內生成抗體或者其功能性部分、衍生物和/或類似物的方法,包括提供能夠利用FcRn受體蛋白生成所述抗體的細胞以及培養所述細胞,以實現所述抗體的生成,其中至少提供或過量生成FcRn受體蛋白的a鏈。如果該細胞的(32微球蛋白表達對于所述細胞不是一種限制性因素,則這種方法特別有用。在另一個實施例中,所述方法進一步包括提供或過量生成(32微球蛋白,其中(32微球蛋白(質/量)是限制性的。顯然,導入FcRn的哪個特定部分,很大程度上依賴于所采用的細胞類型。通常細胞將包括足夠的P2M,因此不需要導入p2M。如果細月包不包括(32M或不包括足夠量P2M,則也必須導入P2M。在一個優選實施例中,所述cc鏈和/或所述(32孩O求蛋白來自相同物種。在甚至更優選的實施例中,所采用的細胞也來自相同物種,即如果所述細胞是人源,則所述細胞優選具有或過量生成人FcRn的cc鏈,可選地,以及(32微球蛋白。在另一個甚至更優選的實施例中,本發明才是供一種用于生成抗體的方法,其中所述細胞生成的抗體來自與所述FcRn受體a鏈相同的物種,或者來自所述物種的功能性類似物。在所闡述的實例中,這將意味著所述抗體也是人源的。所述物種的功能類似物的實例是來自相同種屬的抗體。在另一個優選實施例中,所述ot鏈和/或|32M以及所述抗體來自相同物種,而所述細胞來自另一個物種。在一個優選實例中,所述a鏈和/或P2M以及所述抗體均來自人,所采用的細力包是嚙齒類動物細胞,優選中華倉鼠或鼠細胞。如上文已經闡述的,才艮據本發明所述方法的其中一個重要應用是生成用作治療性化合物的人源抗體,因此在一個優選實施例中,所產生的抗體來自人。甚至更優選地,在人FcRn存在的情況下,所述人源抗體在人細胞內生成。在這種情況下,FcRn前面的內源性啟動子被誘導,或者FcRn前面的啟動子被強(組成性)啟動子取代或^皮可誘導性啟動子耳又代。另一個重要應用是在"^斷性抗體的領域,其中所生成的抗體優選是小鼠抗體,其中所述抗體在小鼠體內產生。顯然,對熟練技術人員來說,可以采用不同種類的細胞,例如來自不同物種(人、鼠等)的細胞。而且,所述細胞本身可能夠或不能夠生成抗體。顯然,得到大量生成IgG的細胞最便捷的途徑是通過為天然能夠生成抗體的細胞(例如B細胞來源的細胞)提供具有編碼一種抗體的核酸,因為這種細胞已經具有抗體生成所需的分子結構,而天然不生成抗體的細胞則不是這樣(或不足夠)的情況。在一個優選實施例中,本發明l是供一種用于在細胞內生成抗體或者其功能性部分、書于生物和/或類似物的方法,包括4是供能夠利用FcRn受體蛋白生成所述抗體的細胞以及培養所述細胞,以實現所述抗體的生成,其中所述細胞來自人或嚙齒類動物,優選嚙齒類動物是中華倉鼠或小鼠。恰當的小鼠細胞的實例是來源于可產生小鼠IgG的正常小鼠的雜交瘤細胞,或來自可產生人IgG的轉基因小鼠。用于一種方法中的細胞不^f又可存在于細月包收集物中(即存在于細月包培養物中),還可是非人動物的一部分。恰當的非人動物的實例是母牛、山羊、小鼠、大鼠、兔、豬或羊等。另外,雞及其卵也是合適的生成平臺。挑選一種特異性轉基因系統用于生產抗體(或者上述其衍生物中的一種)的選擇依賴于幾個因素,包括遺傳特征、動物大小、奶或血液的體積、傳代的難易度、組織特異性表達的可行性、所生成抗體的質量(穩定性、功能性、半衰期)。熟練技術人員可以根據關于這些因素的公開可得到的信息,很方便的選擇最恰當的非人動物。轉基因非人動物可以多種方式得到,其中包括通過前核顯樣i注射和核移植。獲得轉基因動物的方法優選以可實現位點特異性基因轉移的方式實施。轉染色體非人動物也包括在本發明中。優選這種非人動物具有編碼所需抗體(或者其功能性部分、衍生物和/或類合乂物)的核@吏,在更4尤選的實施例中,所述動物還具有編碼FcRn(或者其功能性部分、衍生物和/或類似物)的核酸。例如,如果小鼠A包括編碼抗體的核酸,小鼠B包括編碼FcRn的核酸,那么包括兩種核酸的小鼠可通過例如小鼠A和B的交配育種而得到。因此在另一個優選實施例中,本發明提供包括編碼FcRn(或者其功能性部分、書f生物和/或類似物)的核酸的非人動物。在一個優選實施例中,如果與所述動物中天然存在的核酸序列相比,所述核酸是異源性的,例如小鼠體內編碼人FcRn的a鏈的核酸序列。在另一個優選實施例中,本發明提供包括涉及FcRn啟動子取代的非人動物,例如,用強(組成性)啟動子或可"i秀導性啟動子取^內源性FcRn啟動子。在另一個優選實施例中,本發明提供包括誘導的內源性FcRn啟動子的非人動物。在另一個實施例中,本發明4是供一種包4舌編碼FcRn(或者其功能性部分、衍生物和/或類似物)的核酸的植物。優選地,這種轉基因植物包括編碼FcRn的cc鏈的核酸以及編碼P2M的核酸。甚至更優選地,這種4直物還具有編碼抗體(或者其上述衍生物中任何一種)的核酸。在另一個實施例中,產生不同抗體收集物的細胞用于才艮據本發明所述的方法中,因此可得到抗體混合物(多克隆混合物或全克隆混合物,即由單個純種細月包系生成的多種抗體)。在一個優選實施例中,才艮據本發明所述的方法采用產生單一類型抗體的細胞,因此該方法可產生單克隆抗體,例如鼠單克隆抗體或人單克隆抗體或者其功能性片段、衍生物和/或類似物。在另一個實施例中,人源類似物用于本發明所述的4壬4可一種方法中,例如來自靈長類的抗體或來自靈長類的oc鏈和/或(32微球蛋白。顯然,本發明可用于生成靈長類或靈長化抗體。在一個優選實施例中,所產生的抗體是IgG。如同(32M和FcRn的oc《連,免疫J求蛋白的重《連和輕《連均^皮合成并分泌入內質網,若是FcRn在內質網中組裝成完全功能性的異二聚體或者若是IgG組裝成異二聚體的二聚體(兩條重鏈和兩條輕鏈)。如上文已經概括論述的,IgG-半分子以及IgG衍生物和/或其類似物也包括在本發明中,雙特異性抗體、SMIP、細胞雜交瘤的抗體(全克隆系,輕鏈相同而重鏈不同)只要如上所述以pH依賴性方式結合FcRn或其變體(所述被改變的FcRn保留正常的FcRn胞內傳導機制)也包括在本發明中。現在將討論另外兩種常用細胞類型。在一個優選實施例中,本發明才是供一種用于在細胞內生成抗體或者其功能性部分、衍生物和/或類似物的方法,包括々是供能夠利用FcRn受體蛋白生成所述抗體的細胞以及培養所述細胞,以實現所述抗體的生成,其中所述細胞是雜交瘤細力包或4t染瘤細月包。雜交瘤細胞是B細胞與骨髓瘤細胞之間的融合體。這種雜交瘤細胞具有的優勢即所得到的細胞系是永生化的,因此可基本保證單克隆抗體的一直生成。產生IgG的雜交瘤細"包的生成涉及到體外和體內階^殳。首先用耙抗原免疫4妻種小鼠,隨后將B細胞(通常來自脾臟或淋巴結)與"融合伴倡,,(例如NS-1或SP2/0纟田月包)融合以永生化。隨后,在單細力包水平上篩選所得到的細胞,并通過其分泌抗把抗原的抗體的能力進行鑒定。FcRn可以在所述融合之前或之后提供。已經建立的雜交瘤細胞系在所述細胞融合之后具有FcRn,但尚未融合的細胞在與骨髓瘤細胞融合時可以已經具有FcRn(例如,所述融合伴倡已經具有FcRn)。在本文中,轉染瘤細胞是一種已經具有編碼抗體或者其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸的細胞。這種轉染瘤細胞的實例是CHO、BHK或NS-0細胞,其已經具有編碼抗體或者其功能性部分、書亍生物和/或類似、物的核酸。FcRn可在用編;馬所述抗體或者其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸轉染該細胞之前、轉染時或轉染后提供。在一個優選實施例中,將編碼所述抗體或者其功能性部分、書f生物和/或類似物的核酸偶聯于調節序列如啟動子以及可選的還有增強子序列。才元體生成系鄉充可以基于體外或體內系纟克。顯然,體外方法比專交容易生存和繁殖。然而,體內系統的優勢在于其可誘導而增加所收集的IgG的產量。因此本發明提供一種用于生成抗體或用于增加抗體產量的方法,所述方法是體內系統(例如小鼠體內產生的腹水)或體外系統(例如永生化細胞系)。如上文已經討i侖的,體內系統優選借助于轉基因非人動物(其包含編碼FcRn的(其他)(異源性)核酸)而實施。恰當的非人動物的實例是母牛、小鼠、大鼠、豬、雞、兔或羊。本發明進一步提供能夠生成抗體的細胞,該細胞具有FcRn或具有至少一個額外拷貝的編碼FcRn的核酸。這種FcRn分子(或其核酸)的存在,〗昔助于標準的生物化學和/或分子生物學4支術可以4艮輕易確定。甚至更優選地,本發明4是供一種具有至少一個編碼FcRn的(額外)拷貝的核酸的非人動物。這種動物的實例是小鼠或倉鼠。這種小鼠可通過例如將包含編碼人IgG的核酸的小鼠與oc鏈FcRn敲除的小鼠(以及優選地,雙敲除小鼠,還缺乏功能性小鼠(32微球蛋白)雜交而得到,所述oc鏈FcRn敲除小鼠具有編碼人FcRn的核酸。得到的小鼠包括編碼人IgG的核酸以及編碼人FcRn的核酸,可以i人為其為高人IgG表達動物。在一個優選實施例中,所述FcRn受體蛋白和所述抗體來源于一個物種以及相同物種(例如人),所述動物來源于另一個物種(例如小鼠)。在另一個優選實施例中,所述FcRn受體蛋白包括來自一個物種的變體,其更適合與另一物種(例如人)的IgG共同發揮作用,所述動物來自與FcRn相同的物種(例如小鼠)。本發明還提供FcRn受體蛋白(或者其功能性部分、衍生物和/或類似物)用于提供在細胞內表達(或增加表達)抗體(或者其功能性部分、書f生物和/或類似物)的用途。FcRn受體蛋白(或者其功能性部分、衍生物和/或類似物)可以蛋白或編碼所述受體蛋白的核酸的形式4是供。如果所討i侖的細月包的確已經包含用于生成所需抗體(或者其功能性部分、衍生物和/或類似物)的信息,則不需要再提供編碼所述抗體的核酸。如果該細胞不含有所述信息,則還需要提供編碼所述抗體的核酸給所述細胞。抗體生成細胞(例如B細胞),同其他細胞一樣,通過胞々大作用吸收液相組分。在內皮細胞(以及其他表達FcRn的細胞)中,利用該方法吸收的多數蛋白被降解。然而,由于FcRn,IgG分子不被溶酶體降解,并循環回周圍介質中n'12。FcRn介導的IgG循環在體內是可.飽和的4'12,因此不僅IgG生成細胞的IgG分泌可能依賴于FcRn,其循環可能也依賴于FcRn。為了實驗性驗證該觀點,我們進行了竟爭性研究,其中在無外源性多克隆人IgG或其含量遞增的情況下,我們分別培養數量相等的人293細胞(其表達內源性FcRn)。已i正實外源添加的IgG可抑制這些細力包的IgG分泌,與通過FcRn的IgG循環的可飽和性是一致的。這些數據表明細胞的IgG生成受負反饋機制的調節。從所生成的IgG上清中連續吸收,增加了細力包IgG的生成水平,乂人而增加了產量。因此在另一個實施例中,本發明提供一種用于在細胞內生成抗體的方法,包括培養所述細胞以及從所述培養物的培養基中(半連續性)收集抗體。在一個優選實施例中,通過所述連續性收集將所述培養基中的抗體濃度保持在低于FcRn所介導的循環的功能性飽和水平。熟練技術人員通過及時確定所分泌抗體(IgG)的量并對19這兩個變量作圖,可以4艮輕易確定細月包的々包和水平。如果分泌4元體的量達到了一個平臺^直,即可確定々包和7K平。例如,^f于包含天然FcRn的細胞以及已經具有至少一個額外拷貝的FcRn的(相同種類)細月包,均可確定該々包和水平。一旦確定了所述々包和7K平,即可實施上述方法,以4更不會達到々包和水平。因此,可增加所生成抗體的量。這種方法的效果可通過例如在封閉于孩史孔力莫(Transwell-system,Corning,0.1-12juM濾膜)的后方的結合IgG的瓊脂糖-蛋白A珠子(AmershamBiosciences,直4圣45-165jum)存在的十青況下,比4交IgG的體外產量,所述方法適合所分泌的IgG滲透該濾膜,此時IgG將-波蛋白A阻留。以這種方式,我們通過避免IgG生成細胞內的"FcRn飽和"而干擾負反饋機制。可選地,本發明的這個部分可與前述發明相結合,即本發明進一步4是供一種用于在細胞內生成抗體或者其功能性部分、衍生物和/或類似物的方法,包括提供能夠利用FcRn受體蛋白生成所述抗體的細胞以及培養所述細力包,以實現所述抗體的生成,其中抗體是乂人所述培養物的培養基中(半)連續性收集的。優選地,通過所述連續性收集的方法將所述培養基中的抗體濃度保持在低于FcRn所介導循環的功能性々包和水平。這可通過例如采用蛋白G/蛋白A-瓊脂糖過濾裝置而實現。既然本發明披露了FcRn在抗體分泌中發揮作用,則熟練才支術人員可容易地選l奪其他適于,人培養物中除去所生成4元體的系統。在另一個實施例中,本發明提供一種抗體制備物,可通過才艮據本發明所述的方法而獲得。在另一個實施例中,本發明提供一種包含這種抗體制備物的藥物組合物。此外,上述抗體制備物在治療諸如癌癥或者炎癥性或傳染性疾病或者免疫缺陷、自身免疫或免疫調節等疾病時非常有用。因此,癥、類風濕性關節炎、克隆氏病、啤喘、4艮屑病、病毒性呼吸疾病或多發性硬化等疾病的藥物中的應用。可治療癌癥的實例是非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病或直腸癌。既然我們已經證實FcRn在抗體分泌中發揮作用,該發現也可用來增加體內抗體產量,因此本發明進一步提供一種用于上調患者血液中抗體水平的方法,包括上調所述患者細胞內FcRn受體的表達。才艮據本發明所述的方法不限于抗體的生成,還可用來生成包含感興趣蛋白與Fc段的融合蛋白。因此本發明提供一種用于增強細胞內蛋白生成的方法,包括提供給所述細胞所述蛋白與Fc段的禹蟲合體以及提供給所述細胞FcRn受體蛋白,以及培養所述細胞以實現蛋白-Fc融合產物的生成。優選地,所述Fc,殳來自IgG。如上所述,Fc辜殳一個有用的功能部分是所述CH2-CH3界面(interface)。優選將所述融合蛋白以核酸形式提供給可選的已經具有FcRn受體蛋白(或者其功能性部分、衍生物和/或類似物)的細胞。所述融合產物生成后,FcRn受體蛋白將促進該融合產物分泌入培養基中,因此,所述融合產物將易于收集和純化。在一個優選實施例中,通過連4妻子將感興趣蛋白與Fc分開。為了某些應用,優選可用酶切除所述連接子,甚至更優選地,利用所述酶的切割使得無額外氨基酸殘基連接于感興趣的蛋白。融合體的實例是(合成的)感興趣蛋白與IgG的Fc或者IgA與IgG的Fc的嵌合體等(例如CD40與IgGFc的融合體2Q,肺瘤壞死因子受體(TNF-R)與Fc的融合體21)。在一個優選實施例中,所述感興趣蛋白是治療性分子。本發明還提供FcRn受體蛋白(或者其功能性部分、衍生物和/或類似物)在提供(或增加)細胞內的抗體(或者其功能性部分、書亍生物和/或類4以物)表達方面的應用。FcRn受體蛋白(或者其功能性部分、衍生物和/或類似物)可以蛋白或者編碼所述受體蛋白的核酸的形式才是供。如果所討論的細胞的確已經包含用于生成所需抗體(或者其功能性部分、衍生物和/或類似物)的信息,則不需要再提供編碼所述抗體的核酸。如果該細胞不含有所述信息,則可給所述細胞額外提供編碼所述抗體的核酸。在另一個實施例中,本發明提供一種用于增強細胞內蛋白生成的方法,包括4是供給所述細胞所述蛋白與白蛋白的融合體并4是供給所述細胞FcRn受體蛋白,以及培養所述細胞以實現蛋白-白蛋白融合產物的生成。如已討論的,白蛋白也與FcRn受體蛋白相互作用。在另一個實施例中,本發明進一步提供一種用于增強細胞內蛋白生成的方法,包括提供給所述細胞所述蛋白(或分子)與結合IgG—部分和白蛋白一部分的分子的融合體或者所述蛋白(或分子)與能夠結合FcRn的合成分子的融合體。在另一個實施例中,本發明提供一種用于增強細胞內蛋白生成的方法,包括提供給所述細胞白蛋白以及提供給所述細胞FcRn受體蛋白,以及培養所述細胞以實現白蛋白的生成。在下面的說明書中,將更詳細地闡述本發明,但它并不限制本發明。圖1FcRn表達與體外IgGl產量增加相關。BHK細胞用抗奈瑟腦膜炎球菌(7Ve/Men'awew/wg"/cfa)PorinA的IgGl(pNUT,金屬石克蛋白啟動子)22轉染,穩定表達IgGl的單克隆隨后用人FcRn(pcDNA3.1,CMV啟動子)轉染。在將同等量細胞接種入T培養瓶后第3天收集上清后,FcRn的表達通過FACS分析利用單克隆IgG3而確定,上清中的IgGl水平則利用PorA特異性ELISA而測定。每一個點均4戈表單個亞克隆的FcRn和IgGl的生成K平。IgG生成水平以初始空載體與轉染克隆(4.9jug/ml=100%)的生成%來表示。相關系數『=0.964,p(雙向)=0.036。圖2外源添力o的IgG抑制293細胞的IgG生成,表明這些細胞內由FcRn介導的IgG循環是可飽和的。將生成抗肺炎球菌23的人IgGl的293細胞在純化的多克隆IgG(靜脈內免疫^求蛋白,IVIG,Sanquinproducts,Amsterdam)存在的情況下進行孵育。在所標明的時間點耳又上清樣品,并利用抗原特異性ELISA測定抗肺炎球菌6B抗體23(未公布數據,n=3)。圖3用于B細胞或轉染瘤內IgG生成的才莫型。la)編碼IgG輕《連和重《連的多肽鏈在內質網(ER)上翻譯,并在分子伴侶包括BiP的輔助下進4亍組裝。編碼FcRn的oc《連的多肽鏈以及(32M也在ER上翻i奪并通過單體和二聚體相變而組裝,隨后其與P2M纟且裝在一起。FcRn在與P2M組裝之前或之后均可結合IgG25,26。2)完全組裝后,在有或無負荷(IgG)的情況下,通過分選內涵體或溶酶體而轉運FcRn,3)從內涵體或溶酶體,FcRn可將IgG運送至表面,在pH>7.4時釋放。4)當FcRn飽和時,即不能再結合IgG,在所述溶酶體進一步成熟后其成為降解對象27'28。如果不能有效運出ER,新合成的IgG29,3G和FcRn25'26'31也將被降解。圖4液相IgG將被液相吞々欠,隨后被降解。1)細胞通過吞飲:懾取IgG,隨后在溶酶體pH(《6.5)時IgG可結合于FcRn。2)未結合IgG(無FcRn或FcRn凈皮々包和)在溶酶體內降解。3)結合于FcRn的IgG則循環回細胞表面,隨后在中性pH下釋放入漿膜/上清。4)循環的IgG可^皮細月包(其4也細月包或相同細月包)吞飲。5)所述循環過禾呈以及隨后的降解,可通過蛋白G/蛋白A-瓊脂糖過濾裝置而克服。圖5IgG"捕獲裝置"。設置該裝置是為了研究在體外利用蛋白A通過微孔膜捕獲由IgG生成細胞所分泌的IgG的可行性,該孩丈孔膜適于IgG通過^f旦細胞或蛋白A瓊脂糖J朱子不能通過。因此,上清中的IgG不太可能達到細胞內的飽和水平,且不太可能被IgG生成細胞吞飲攝取(否則其可能成為降解對象)。具體參見正文和圖5。圖6FcRn過表達或不過表達時,IgG分泌的預期動力學。如果A)FcRn僅與IgG循環相關,與分泌不相關B)如果FcRn僅與分泌相關。野生型細胞實線,過表達FcRn的細胞粗線。點線利用IgG捕獲裝置的系統的預期產量(見上文的圖5)。具體實施例方式材料和方法重逸拔沐。本研究中采用的人抗肺炎球菌血清型6A/BGDobl抗體和重組抗腦膜炎^求菌PorA抗體在體外和體內的生成和功能鑒定之前已經在參考文獻22,23中詳細描述過。」換照廠家的i兌明書,用整合所述特異性突變的CH3特異性引物,通過Quickchange定點_秀變試劑盒(Stratagene,CA)突變y1重鏈而得到突變的IgGlGDobl變異體。通過測序(ABI373Stretch自動化測序4義,AppliedBiosystems,FosterCity,CA)馬^S正突變石威基(i亥突變引起4354立纟且氨酸至纈氨酸的相應氨基酸變化)的正確整合后,所述重鏈與相應輕鏈一起轉染、生成并純化,如22,23中所述。抗體量通過夾心ELISA法(通過兔抗k抗血清捕獲所述重組抗體,采用石咸性-粦酸酶軛合的兔抗IgG(Fc特異性)抗血清檢測,如參考文獻22中所述)以及抗原特異性ELISA法(如在參考文獻23中詳細描述的)定量。—會測抗體。蛋白G分離的才元FcRn(MAb1G3)oc鏈的小鼠IgGl可乂人ATCC(Manassas,VA)4尋到24。通過用構成FcRnoc鏈纟田月包內尾巴的肽鏈免疫balb/c小鼠而提高小鼠的IgMMAb22H4C11。抗人FcRn的兔抗血清由Dr.NeilSimister(BrandeisUniversity,Waltham,MA)惠贈。利用Fitc標i己的羊抗鼠IgG的F(ab,)2-片段(Protos,Burlingame,CA)在FACS實驗中檢測小鼠IgGl。用生物素標記的豬抗兔IgGF(ab,)2-片,殳(DAKO,Glostrup,Denmark)以及隨后的抗生凈勿素蛋白《連菌素Alexa555,olecularProbes'Leide攻,TheNefcherfands)檢測兔抗血清。Fciw謬導表這。用IgGl(pNUT,金屬硫蛋白啟動子,DHFR/曱氨蝶呤選擇標記物)轉染且穩定表達抗奈瑟腦膜炎球菌PorinA的IgGl的單克隆BHK細胞,用人FcRn(pcDNA3.1,CMV啟動子/zeocin選擇標記物)進行轉染,并通過zeocin耐受性以及限制性稀釋而篩選既表達IgGl又表達FcR的單克隆。FcRn表達通過FACS分析利用單克隆IgG3確定,上清中的IgGl水平則利用PorA特異性ELISA而測定(如上文"重組抗體,,中所述,在將同等量細胞4妄種入T培養瓶后第3天收集上清)。/gG乂,/gG^成的^《錄^影詢293細胞用含或不含外源性添加的IgG多克隆IgG(IVIG,CLB)的GDoblIgG(如上所述)進行轉染。在標明的時間點取上清樣品,并通過抗原特異性ELISA如參考文獻23所述而測定抗肺炎5求菌6B抗體。統計分析利用GraphPadPrismversion4.00forWindows(GraphPadSoftware,SanDiegoCA,USA,http:〃www.graphpad.com)進行/>^^。"相關分析。顯著性水平設為p<0.05。結果Fciw乂f強拔體^:威i恥敏力的/gG^:成。為了才企測FcRn是否影響IgG生成細月包的IgGl生成,我們將人FcRn轉染至一個穩定表達IgGl的BHK克隆。FcRn轉染后篩選克隆,并利用FACS分析比較克隆之間的FcRn表達。還研究了上清內IgGl的生成情況。我們觀察到高的FcRn水平與^R高的IgGl產量顯著相關(圖1)。因此,將高水平人FcRn導入生成人IgG的細月包內,可方侵J也增加抗體產量。/gG^成^T受^《^批斜諷蘆。FcRn介導的IgG循環在體內是可飽和的4'12,因此不僅在體外IgG生成細胞的IgG分泌可能依賴于FcRn,其循環可能也依賴于FcRn。為了實-驗-瞼^正該XC點,我們進行了竟爭性研究,其中在無外源性多克隆人IgG或其含量遞增的情況下,我們分別培養數量相等的人293細胞(其表達內源性FcRn)。已證實外源添力。的IgG可抑制這些細胞的IgG分泌(圖2),與通過FcRn的IgG循環的可飽和性一致。參考文獻1vanDijk,M.A,andVidarsson,G.(2002)Monoclonalantibody-basedPharmaceuticals.Ini%annaceiiicaZBiofec/inotogy:A/i7hiroduc^o;i/orjPharmocisfsandP/iarmacei^icaZScien《is《s(Crom邁elin,D.J.A,andSindelar,R.D.,eds.),pp.283-297'Taylor&Francis2vanDijk.,M.A.andvandeWinkel,J.G.(2001)Humanantibodiesasnextgenerationtherapeutics.CitrrQp"C%em胸Z5(4),368-374.3Kohler,G.andMilstein,C,(1975)Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.iVbfitre256(5517),495-4974Lobo,E.D.etal.(2004)Antibodypharmacokineticsandpharmacodynamics,<7Ptor肌Sci93(11),2645-26685West,A.P.,Jr.andBjorkman,P.J.(2000)CrystalstructureandimmunoglobulinGbindingpropertiesofthehuman邁ajorhistocompatibilitycomplex-relatedFcreceptor('),BiochewWry39(32),9698-97086Shields,R丄.etal.(2001)HighresolutionmappingofthebindingsiteonhumanIgGlforFcgammaRI,FcgammaRII,FcgammaRIII,andFcRnanddesignofIgGlvariantswithimprovedbindingtotheFcga邁maR,c/J5ioZC7iem276(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所述的抗體制備物。24.根據權利要求22所述的抗體制備物在制備用于治療癌癥、炎癥、傳染性疾病、免疫*夾陷、自身免疫或免疫調節的藥物中的應用。25.根據權利要求24所述的應用,其中所述癌癥是非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病或直腸癌。26.—種用于上調患者血液中抗體水平的方法,包括上調所述患者細月包內FcRn受體的表達。27.—種用于增強細胞內蛋白生成的方法,包括提供給所述細胞所述蛋白與Fc段的融合體和提供給所述細胞FcRn受體蛋白,以及培養所述細月包以實現蛋白-Fc融合產物的生成。28.—種用于增強細胞內蛋白生成的方法,包括提供給所述細胞所述蛋白與白蛋白的融合體和提供給所述細胞FcRn受體蛋白,以及培養所述細胞以實現蛋白-白蛋白融合產物的生成。29.—種用于增強細月包內白蛋白生成的方法,包4舌才是供能夠利用FcRn受體蛋白生成白蛋白的細胞,以及培養所述細胞以實現白蛋白的生成。全文摘要本發明涉及生物化學和分子生物學領域,更具體地說,本發明涉及(單克隆)抗體的生成,甚至更具體地,涉及治療性和診斷性抗體的生成。本發明提供一種用于在細胞內生成抗體或者其功能性部分、衍生物和/或類似物的方法,包括提供能夠利用FcRn受體蛋白生成所述抗體的細胞以及培養所述細胞以實現所述抗體的生成。文檔編號C07K14/705GK101316927SQ200680043714公開日2008年12月3日申請日期2006年11月23日優先權日2005年11月23日發明者格斯圖爾·維達爾松,約翰內斯·赫拉爾杜斯·約瑟夫·范德溫克爾申請人:Umc烏得勒支控股有限公司
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