改良的色素上皮衍生因子變體及其用途的制作方法

專利名稱：改良的色素上皮衍生因子變體及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor, PEDF )的抗血管生成變體及其用途，其中所述變體包含多個被改變的磷酸 化位點、編碼所述位點的多核苷酸。尤其，包含多個被改變的磷酸化位點 的PEDF變體4是供優良的抗血管生成活性和高神經營養活性，可用于治療 與新血管形成和神經變性病狀關聯的疾病。
背景技術：
色素上皮衍生因子(PEDF)是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的成員，但 是到目前為止，沒有發現其呈現出對任何蛋白酶的抑制活性。最初，基于 它把分裂的眼癌細胞轉化成分化型神經元的能力而把它離析出來，因此將 它鑒定為神經營養因子。后來發現，除了其神經營養功能之外，PEDF還 是眼睛中血管生成的有效天然抑制劑，在眼睛中它抑制幾種強的促血管生 成因子的刺激活性。這一抗血管生成的潛能也已經在一些動物才莫型中表現 出來，其中例證了 PEDF為負責減少眼睛中血管生長的因子。盡管最初在 從胎兒的人類視網膜獲得的色素上皮細胞的培養基中發現PEDF,但目前 清楚，PEDF不只在視網膜中也在成人眼睛的多個位點以及成年人類的腦、 脊髓和人類血漿中祐束達。因此，PEDF可能具有抑制全身血管生成的潛 能。
已經確定，蛋白質磷酸化在大部分細胞內過程的調節中扮演主要角 色。然而，越來越明顯，蛋白質激酶也可調節細胞外過程，因為它們在細 胞外作為外部蛋白質(ecto-protein)激酶或外蛋白質(exo-protein)激酶存 在。外部蛋白質激酶是膜結合酶，其催化活性位于多種細胞的胞外細胞表
8面。外蛋白質激酶是分泌的可溶酶，其催化活性存在于胞外環境中，與細 胞無直接關聯。這些蛋白質激錄被示出為磷酸化細胞外可溶底物和細胞表 面蛋白質，因此在包括細胞-細胞的相互作用、分化、增殖和離子流在內的 許多生理學過程中起調節作用。
本發明的諸發明人在他們的最近研究中已經顯示，從人類血漿
(plPEDF)提純而來的PEDF是一種磷蛋白質，該磷蛋白質在循環中被酪 蛋白激酶CK2 ( CK2 )和蛋白質激酶A (PKA)磷酸化(Maik-Rachline G., 等.Blood. 105:670-678， 2005 )。還顯示，CK2在兩個主要殘基Ser24和 Serll4上磷酸化PEDF，而PKA在Ser227上磷酸化PEDF。使用幾種模擬 磷酸(Ser到Glu)或非磷酸(Ser到Ala)形式的PEDF的磷酸化位點突 變體，發現PEDF的CK2和PKA磷酸化各自顯著地影響它的生理機能。 CK2磷酸化的PEDF具有降低了的神經營養活性，而其抗血管生成活性顯 著地增加。另一方面，PKA磷酸化P爭低了 PEDF抗血管生成活性，但對它 的神經營養活性幾乎沒有影響(Maik-Rachline G.,等.Blood. 2005, 105:670-678 )。
在本發明申請人的國際申請公布第WO 2006/054278號中，揭示了 一 種PEDF變體以及另 一種PEDF變體，其中第一種PEDF變體把在PEDF 的CK2磷酸化位點上的兩個絲氨酸殘基即絲氨酸24和絲氨酸114置換成 帶負電荷的氨基酸，它與重組野生型PEDF相比較具有更高的抗血管生成 活性而具有更低的神經營養活性，第二種PEDF變體把在PKA磷酸化位點 上的絲氨酸殘基即絲氨酸227置換成帶負電荷的氨基酸，它與重組野生型 PEDF的相比較表現出更低的抗血管生成活性而表現出相似的神經營養活 性。WO 2006/054278要求保護包含至少一個被改變的磷酸化位點的抗血管 生成PEDF變體。WO 2006/054278進一步要求保護編碼抗血管生成PEDF 變體的離析多核苷酸及其使用方法。
美國專利第5,840,686號揭示了編碼PEDF、被截斷的PEDF及等效 蛋白質的核酸，用于產生重組PEDF、 一皮截斷的PEDF和等效蛋白質的重 組方法，以及這些蛋白質在神經元分化、神經元生存和神經膠質抑制中的 用途。美國專利第6,319,687號要求保護重組PEDF蛋白質和具有PEDF生
9物活性的PEDF截斷形式。
國際申請公布第WO 03/059248號揭示了呈現有效的抗血管生成和神 經營養活性的人類血漿PEDF。
國際申請公布第WO 2004/028559號揭示了基本由PEDF的5到50個 鄰接tt酸組成的PEDF片段、包含所述PEDF片段的藥物組合物及其用 于治療癌癥或眼科疾病的用途。
美國專利申請第2005/0222031號揭示了用于預防或治療惡性黑色素 瘤的方法，該方法包括為有相應需要的患者施用PEDF或具有功能上與 PEDF等效特性的PEDF變體。根據美國專利申請第2005/0222031號，PEDF 變體包含改變人類PEDF的氨基酸序列中的一個或多個氨基酸殘基，并具
有功能上與人類PEDF等效特性的tt酸序列。然而，在美國專利申請第 2005/0222031號中，既沒有揭示被改變的氨基酸殘基的位點和數量，也沒 有揭示氨基酸改變對PEDF生物活性的影響。
美國專利第6,821,775號揭示了一種復制缺陷型腺病毒載體，它含有 編碼PEDF或其治療性片段的核酸序列。盡管包含置換、缺失或添加并編 碼功能性PEDF肽或其治療性片段的核酸序列適宜插入病毒載體中，但是 美國專利第6,821,775號并沒有揭示能夠發揮出比PEDF更優活性的具體 PEDF變體。
美國專利申請公開第2003/0158112號揭示了一種治療脈絡膜新血管 形成的方法，包含直接對眼睛施用治療性因子或編碼治療性因子的核酸序 列，以選擇性地誘導與脈絡膜新血管形成相關聯的內皮細胞的凋亡，從而 治療脈絡膜新血管形成。所列出的治療性因子包括PEDF或其片段。在美 國專利申請公開第2003/0158112號中，對于在特定位點有氨基酸置換的 PEDF變體，沒有指出這些變體可用于治療脈絡膜新血管形成。
國際申請公布第WO 05/041887號揭示了用于治療涉及增加的血管通 透性的病狀的方法，該方法包括施用PEDF或PEDF44氨基酸肽或其同系 物，其中分別在位點IOI、 103、 112和115的氨基酸殘基谷氨酰胺、異亮 氨酸、亮氨酸和絲氨酸不被改變。在國際公布申請第WO 05/041887號中沒有揭示包含在位點24、 114和227被置換的絲氨酸殘基的PEDF變體 可用于治療涉及增加的血管通透性或增加的血管生成的病狀。
仍然存在對表現出神經營養活性的PEDF的有效抗血管生成變體的、 沒有得到滿足的需求。
發明概述
本發明提供了新穎的抗血管生成PEDF變體，它包含相對于人類PEDF 氨基酸序列SEQIDNO:l被改變的氨基酸序列，其中該被改變的氨基酸序 列包含多個被改變的磷酸化位點。尤其，本發明提供了新穎的抗血管生成 PEDF變體，它包含相對于人類PEDF氨基酸序列SEQ ID NO:l被改變的 tt酸序列，其中該被改變的氨基酸序列包含在絲氨酸24、絲氨酸114和 絲氨酸227處的三個被改變的磷酸化位點。本發明進一步提供編碼該新穎 PEDF變體的離析多核苷酸、含有所述變體的藥物組合物及其使用方法。 本發明進一步提供針對所述PEDF變體的離析抗體。
出乎意料的是，現在揭示，在位點24、 114和227包含三個帶負電荷 的氨基酸殘基、替換在這些位置自然存在的絲氨酸殘基并因此模仿CK2 和PKA磷酸化的PEDF變體表現出優良的抗血管生成活性。相對于僅在位 置24和114包含兩個帶負電荷的氨基酸殘基的PEDF變體(它僅模仿由 CK2進行的磷酸化)，在下文被稱為EEE變體的該三重變體顯示為更有效 的抗血管生成因子，并且遠比重組野生型PEDF更有效。令人驚訝的是， EEE變體表現出高的神經營養活性。由EEE變體獲得的神經營養活性類似 于重組野生型PEDF的神經營養活性，但顯著高于在絲氨酸24和絲氨酸 114處具有兩個帶負電荷的氨基酸殘基的PEDF變體的神經營養活性，后 者表現出可以忽略不計的神經營養活性。因此，出乎意料的是，該新穎 PEDF EEE變體表現出較高的抗血管生成活性，同時保留了重組野生型 PEDF的神經營養活性。
進一步揭示，包括絲氨酸24、 114和227的三個氨基酸置換的PEDF 變體表現出有效的抗血管生成活性，所述氨基酸置換中僅絲氨酸24和114被帶負電荷的氨基酸殘基置換。這一抗血管生成活性低于包含模仿CK2 和PKA磷酸化的三個帶負電荷的tt酸殘基的EEE變體所表現出的抗血 管生成活性，但類似于包含僅模仿CK2磷酸化的兩個帶負電荷的氨基酸殘 基的PEDF變體所表現出的抗血管生成活性。包含在絲氨酸24、 114和227 的三個氨基酸置換的PEDF變體具有可以忽略不計的神經營養活性，所述 氨基酸置換中僅絲氨酸24和114被帶負電荷的氨基酸殘基置換。
根據第一方面，本發明提供一種抗血管生成的色素上皮衍生因子 (PEDF )變體或其類似物或融合蛋白，它包含源自人類PEDF ( SEQ ID NO:l)或其片段的改性tt酸序列，其中該改性M酸序列包含多個被改 變的磷酸化位點，它不同于一種包含僅由在絲氨酸24和絲氨酸114處的兩 個被改變的磷酸化位點組成的PEDF變體或其類似物、片段或融合蛋白。
應該明白，本發明包含其他哺乳動物如小鼠、牛、豬等等的PEDF變體。
根據一些實施方案，本發明提供一種抗血管生成的PEDF變體，它包 含源自人類PEDF ( SEQ ID NO: 1)的改性氨基酸序列，其中該改性氨基酸 序列包含多個被改變的磷酸化位點，它不同于一種僅由在絲氨酸24和絲 氨酸114處的兩個被改變的磷酸化位點組成的PEDF變體或類似物、其片 段或融合蛋白。應該理解，PEDF變體的類似物、片段和融合蛋白在本發 明的范圍之內。
才艮據另外的實施方案，本發明提供一種抗血管生成的PEDF變體，它 包含人類PEDF氨基酸序列SEQ ID NO: 1的變體，其中該變體包含多個被 改變的磷酸化位點，條件是該變體不同于僅由在絲氨酸24和絲氨酸114 處的兩個被改變的磷酸化位點組成的PEDF變體或其類似物、片段或融合 蛋白。
根據一些實施方案，抗血管生成的PEDF變體、其類似物、融合蛋白 或片段包含兩個被改變的磷酸化位點，該磷酸化位點從由絲氨酸24和絲 氨酸227;以及絲氨酸114和絲氨酸227組成的組中選擇。
才艮據一些優選實施方案，抗血管生成的PEDF變體、其類似物、融合
12蛋白或片段包含在絲氨酸24、絲氨酸114和絲氨酸227處的三個被改變的 磷酸化位點。
根據進一步的實施方案，包含三個被改變的磷酸化位點的抗血管生成 的PEDF變體、其類似物、融合蛋白或片段具有神經營養活性。根據另外 的實施方案，抗血管生成的PEDF變體、其類似物、融合蛋白或片,更的三 個被改變的磷酸化位點被帶負電荷的氨基酸殘基置換。根據一個示例性實 施方案，抗血管生成的PEDF變體、其類似物或融合蛋白包含SEQ ID NO:2 所示的氨基酸序列或其片段。根據一個特定的示例性的實施方案，PEDF 變體包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
才艮據另外的實施方案，具有神經營養活性的抗血管生成的PEDF變體、 其類似物、融合蛋白或片段包含三個被改變的磷酸化位點，其中絲氨酸24 和絲氨酸114被非極性的氨基酸殘基置換，且絲氨酸227被選自帶負電荷 的氨基酸和非極性氨基酸殘基的氨基酸殘基置換。根據一些示例性實施方 案，抗血管生成的PEDF變體、其類似物或融合蛋白包含選自SEQ ID NO:3 和SEQ ID NO:4或其片段的氨基酸序列。根據特定的示例性實施方案， PEDF變體包含選自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
根據進一步的實施方案，包含三個被改變的磷酸化位點的抗血管生成 PEDF變體、其類似物、融合蛋白或片段基本上缺乏神經營養活性。根據 一些實施方案，抗血管生成的PEDF變體、其類似物、融合蛋白或片段的 絲氨酸24和絲氨酸114被帶負電荷的氨基酸殘基置換，且絲氨酸227被非 極性的氨基酸殘基置換。根據一個示例性的實施方案，抗血管生成PEDF 變體、其類似物或融合蛋白包含SEQEDNO:5所示的氨基酸序列或其片段。 根據一個特定的示例性實施方案，PEDF變體包含SEQ ID NO:5所示的氨 基酸序列。
應該理解，本發明進一步包含人類PEDF的變體、其類似物、片段和 融合蛋白，其中三個被改變的磷酸化位點從由以下各項所組成的組中選 擇帶負電荷的氨基酸殘基置換絲氨酸24和絲氨酸227，且非極性的tt 酸殘基置換絲氨酸114;帶負電荷的氨基酸殘基置換絲氨酸114和絲氨酸 227，且非極性的氨基酸殘基置換絲氨酸24。根據另外的實施方案，所述被改變的磷酸化位點通過化學改性獲得。
根據一些實施方案，化學改性選自糖基化、氧化、永久磷酸化、還原、 十四烷基化、硫酸鹽化、酰化、乙酰化、ADP核糖基化、酰胺化、羥基化、 硤化、曱基化和封閉基團衍生化。
根據另一方面，本發明提供一種編碼抗血管生成的PEDF變體或其類 似物或融合蛋白的離析多核苷酸序列，它包含具有人類PEDF核苷酸序列 SEQEDNO:6的變體或其片段，該變體或其片斷編碼包含多個被改變的磷 酸化位點的PEDF變體、其類似物、片段或融合蛋白，條件是所述PEDF 變體不同于僅由在絲氨酸24和絲氨酸114處的兩個被改變的磷酸化位點組 成的變體。
根據一些實施方案，本發明提供一種編碼抗血管生成PEDF變體的離 析多核苷酸序列，它包含具有人類PEDF核苷酸序列SEQ ID N0:6的變體， 該變體編碼包含多個被改變的磷酸化位點的PEDF變體，條件是所述PEDF 變體不同于僅由在絲氨酸24和絲氨酸114處的兩個被改變的磷酸化位點組 成的變體。
根據一些實施方案，所述離析多核苷酸序列編碼抗血管生成的PEDF 變體或其類似物、片段或融合蛋白，其中所述PEDF包含選自下述組的兩 個被改變的磷酸化位點絲氨酸24和絲氨酸227;以及絲氨酸114和絲氨 酸227。
根據一些優選實施方案，該離析多核苷酸序列編碼抗血管生成的 PEDF變體或其類似物、片段或融合蛋白，其中所述PEDF包含在絲氨酸 24、絲氨酸114和絲氨酸227的三個被改變的磷酸化位點。
根據一些實施方案，由離析多核苷酸序列編碼的包含三個被改變的磷 酸化位點的抗血管生成的PEDF變體、其類似物、片段或融合蛋白具有神 經營養活性。才艮據另外的實施方案，由離析多核香酸序列編碼的抗血管生 成的PEDF變體、其類似物、片段或融合蛋白的三個被改變的磷酸化位點 被帶負電荷的氨基酸殘基置換。根據一個示例性實施方案，編碼包含被帶 負電荷的氨基酸殘基置換的三個被改變的磷酸化位點的抗血管生成的 PEDF變體或其類似物或融合蛋白的離析多核苷酸序列包含SEQ ID NO:7或其片段。根據一個特定的示例性實施方案，編碼PEDF變體的離析多核 苷酸序列包含SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。
根據另外的實施方案，離析多核苷酸序列編碼包含三個被改變的磷酸 化位點的抗血管生成的PEDF變體或其類似物、片段或融合蛋白，其中抗 血管生成的PEDF變體、其類似物、片段或融合蛋白的絲氨酸24和絲氨酸 114被非極性的氨基酸殘基置換，且絲氨酸227被選自下述組的氨基酸殘 基置換帶負電荷的氨基酸殘基和非極性的氨基酸殘基。根據一些示例性 實施方案，編碼抗血管生成的PEDF變體或其類似物或融合蛋白的離析多
選擇的核苷酸序列。根據特定的示例性實施方案，編碼PEDF變體的離析 多核苷酸序列包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的核香酸序列。
根據進一步的實施方案，由離析多核苷酸序列編碼的包含三個被改變 的磷酸化位點的抗血管生成的PEDF變體、其類似物、片段或融合蛋白基 本上缺乏神經營養活性。根據一些實施方案，離析多核苷酸序列編碼抗血 管生成的PEDF變體、其類似物、片段或融合蛋白，其中該抗血管生成的 PEDF變體、其類似物、片段或融合蛋白的絲氨酸24和絲氨酸114被帶負 電荷的氨基酸殘基置換，且絲氨酸227被非極性的氨基酸殘基置換。根據 一個示例性實施方案，編碼抗血管生成的PEDF變體、其類似物或融合蛋 白的離析多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 10所示的核苦酸序列或其片段。 根據特定的示例性實施方案，編碼PEDF變體的離析多核苷酸序列包含 SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列。
根據進一步的方面，本發明提供一種表達載體，該表達載體包含編碼 根據本發明原理的抗血管生成的PEDF變體、其類似物、片段或融合蛋白 的離析多核苷酸序列。
根據更進一步的方面，本發明提供一種包含表達載體的宿主細胞，所 述表達載體包含編碼根據本發明原理的抗血管生成的PEDF變體、其類似 物、片段或融合蛋白的離析多核苷酸序列。
根據另一方面，本發明提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含作 為活性成分的根據本發明原理的抗血管生成的PEDF變體、其類似物、融合蛋白或片段；以及藥學上可接受的載體。
根據進一步的方面，本發明提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含 作為活性成分的根據本發明原理的編碼抗血管生成的PEDF變體或其類似 物、融合蛋白或片段的離析多核香酸序列；以及藥學上可接受的載體。
根據更進一步的方面，本發明提供一種藥物組合物，該藥物組合物包 含作為活性成分包含離析多核苷酸序列的表達載體，其中所述離析多核 苷酸序列編碼根據本發明原理的抗血管生成PEDF變體或其類似物、融合 蛋白或片段；以及藥學上可接受的載體。
根據更進一步方面，本發明提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含 作為活性成分的包含表達載體的宿主細胞，所述表達載體包含編碼根據本 發明原理的抗血管生成PEDF變體或其類似物、融合蛋白或片段的離析多 核苷酸序列；以及藥學上可接受的載體。
根據另 一 方面，本發明提供 一 種用于治療患者與新血管形成相關的疾 病或病癥的方法，該方法包括為有相應需要的患者施用治療有效量的根據 本發明原理的藥物組合物。
才艮據一些實施方案，與新血管形成相關的疾病或病癥/人由癌癥、眼疾 和用抗血管生成因子治療的病癥所組成的組中選擇。
才艮據另外的實施方案，與新血管形成相關的疾病或病癥是選自下迷組 的癌癥肉瘤、癌瘤、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原 性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、 滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳 腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌汗腺癌、皮脂 腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、嚢腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、 肝細胞瘤導管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎細胞癌、維爾姆斯氏瘤子 宮頸癌、睪丸瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星 形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果體瘤、 成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤(menangioma )、黑 色素瘤和神經母細胞瘤。
16根據另外的實施方案，用本發明的方法治療的眼疾從由以下所組成的
組中選擇新生血管性青光眼、糖尿病性視網膜病變、視網膜母細胞瘤、
晶體后纖維組織增生、葡萄膜炎、早熟性視網膜病、黃斑變性、角膜移植 片新血管形成、視網膜腫瘤和脈絡膜腫瘤。根據進一步的實施方案，用抗
血管生成因子治療的病癥從由以下所組成的組中選擇血管瘤、關節炎、 牛皮癬、血管纖維瘤、動脈粥樣硬化斑、血友病性關節病和肥厚性瘢痕。
根據進一步的方面，本發明提供一種用于治療患者神經變性病狀的方 法，該方法包括為有相應需要的患者施用治療有效量的根據本發明原理的 藥物組合物。
根據一些實施方案，神經變性病狀從由以下所組成的組中選擇多發 性硬化癥、阿爾茨海默病、帕金森病、重癥肌無力、運動原神經病、格-巴二氏綜合癥、自身免疫神經病、Lambert-Eaton類重癥肌無力綜合征、腎 上腺炎神經疾病、腎上腺炎小腦萎縮、非腎上腺炎僵人綜合癥、漸進性小 腦萎縮、Rasmussen氏腦炎、肌萎縮側索硬化、Sydeham舞蹈病、Tourette 綜合癥、自身免疫性多內分泌病、免疫異常性神經病、獲得性神經性肌強 直、多關節彎曲癥、視神經炎和全身肌強直綜合癥。
才艮據另外的方面，本發明才是供與選自下述組的多肽特異性結合的離析 抗體或其片段(a)包含源自人類PEDF ( SEQ ID NO: 1 )的改性氨基酸序 列的抗血管生成PEDF變體，該變體包含至少一個帶負電荷的被改變的磷 酸化位點；(b) (a)的片段；(c) (a)或(b)的類似物，其中所迷離析抗 體不結合具有非磷酸化絲氨酸或不帶負電荷的被改變的磷酸化位點的相 應人類PEDF tt酸序列SEQ ID NO:l 。
根據一些實施方案，本發明提供了特異性結合人類PEDF氨基酸序列 SEQIDNO:l的變體的離析抗體或其片段，該變體或其片段包含至少一個 帶負電荷的被改變的磷酸化位點，其中所述離析抗體不結合具有一個非磷 酸化絲氨酸或一個不帶負電荷的被改變的磷酸化位點的相應的人類PEDF 絲酸序列SEQ ID NO: 1 。
根據另外的實施方案，該離析抗體或其片段特異性結合到包含一個在 絲氨酸24處的被改變的磷酸化位點的PEDF變體或其片段或類似物。根據示例性的實施方案，所述離析抗體或其片段特異性結合到包含選自SEQ ID NO: 2、 5、 11和12的氨基酸序列的PEDF變體。
根據進一步的實施方案，所述離析抗體或其片段特異性結合到包含一 個在絲氨酸227處的被改變的磷酸化位點的PEDF變體或其片段或類似物。 根據示例性的實施方案，該離析抗體或其片段特異性結合到包含選自SEQ ID NO: 2、 3和13的氨基酸序列的PEDF變體。
根據另外的實施方案，所述離析抗體或其片段特異性結合到包含一個 在絲氨酸114處的被改變的磷酸化位點的PEDF變體或其片段或類似物。 根據示例性的實施方案，該離析抗體或其片段特異性結合到包含選自SEQ ID NO: 2、 5、 12和14的氨基酸序列的PEDF變體。
根據進一步的實施方案，所述離析抗體或其片段特異性結合到包含在 絲氨酸24和絲氨酸114處的兩個被改變的磷酸化位點的PEDF變體或片段 或其類似物。根據示例性的實施方案，該離析抗體或其片段特異性結合到 包含選自SEQ ID NO: 2、 5和12的氨基酸序列的PEDF變體。
根據更進一步的實施方案，所述離析抗體或其片段特異性結合到包含 在絲氨酸24和絲氨酸114和絲氨酸227處的三個被改變的磷酸化位點的 PEDF變體或片段或其類似物。根據示例性的實施方案，該離析抗體或其 片段特異性結合到包含SEQIDNO:2的tt酸序列的PEDF變體。
根據另外的實施方案，所述離析抗體或其片段選自多克隆抗體、單克 隆抗體、Fab、 F (ab) 2、嵌合抗體和單鏈抗體。
根據進一步的方面，本發明提供一種產生本發明的PEDF變體的方法， 該方法包括在促進PEDF變體或其片段或類似物的表達的條件下，培養 含有編碼本發明的PEDF變體、其片段或類似物的多核苷酸的原核和/或真 核宿主細胞，以及隨后回收該變體或其片段或類似物。
結合附圖、說明書、實施例和所附權利要求，可以更好地理解本發明 的這些和其他實施方案。
附圖簡述

圖1A-D示出PEDF的CK2和PKA磷酸化之間的相互影響。圖1A， 在不同pH的緩沖液(已指出)中預透析的重組PEDF (rPEDF)和S24、 114E變體(EE)被PKA磷酸化。SDS凝膠用考馬斯藍染色(下圖)，并 經過放射自顯影(上圖)。圖1B，用在磷酸化之前經過熱處理的rPEDF和 S24、 114E變體(EE)進行圖1A的實驗。圖1C，在不同pH的緩沖液(已 指出)中預透析的rPEDF和S24、 114A變體(AA)由PKA磷酸化，在磷 酸化之前經過或沒有經過熱處理。磷酸化的產物通過SDS-PAGE和放射自 顯影(上圖)或通過用抗PEDF抗體進行免疫印跡(下圖)來分析。圖1D, 血漿PEDF (plPEDF)、 rPEDF、 S227A和S227E變體由CK2磷酸化，在 磷酸化之前經過或沒有經過熱處理。如在圖1A的圖中所描述的來分析磷 酸化的產物。
圖2A-C示出體外PEDF的CK2和PKA磷酸化。圖2A示出PEDF變 體的圖示，其中Ser24、 Serl14和/或Ser227被置換為Ala或Glu。圖2B 和2C, rPEDF和rPEDF變體由CK2 (圖2B )或由PKA (圖2C)磷酸化， 且磷酸化的產物通過SDS-PAGE后放射自顯影(上圖)并用抗PEDF抗體 進行免疫印跡(下圖)來分析。
圖3A-C示出在人類臍帶血管內皮細胞(human umbilical vascular endothelial cell, HUVEC)中rPEDF變體對ERK活化和增殖的影響。圖 3A，用指示的rPEDF變體刺激HUVEC。胞漿提取物用抗磷酸ERK抗體 (叩ERK,上圖)或抗普通ERK抗體(agERK，下圖)進行免疫印跡。 指示ERK2和ERK1的位置。圖3B，圖1A中的結果的定量分析，表示為 ERK1和ERK2兩者的ERK活化。圖3C，用血漿(pi) PEDF、 rPEDF或 PEDF變體培養HUVEC。在48個小時后，用亞曱藍法測定細胞數量。
圖4A-B示出rPEDF及其變體對PEDF誘導的神經營養活性的影響。 圖4A，用rPEDF或rPEDF變體培養視網膜母細胞瘤Y-79細胞。在細胞附 著到聚-D-賴氨酸涂布的平板上7天之后，通過倒置顯微鏡觀察細胞形態。 圖4B,在圖4A圖中呈現結果的定量分析。*尸<0.01; **尸<0.05表示用rPEDF 處理的細胞與用各種PEDF變體處理的細胞之間的比專交。
圖5A-B示出PEDF變體對中等的bFGF誘導的新血管形成的抗血管生成活性。圖5A,在存在或沒有bFGF (300 ng/ml)的情況下，給CD-1 棵鼠皮下注射0.5 ml包含rPEDF、 plPEDF和PEDF變體的基質膠 (Matrigel)。對照塞(plug)僅用PBS或bFGF處理。7天之后，宰殺小 鼠，塞經過H&E染色并且在光學顯微鏡(x40放大)下拍照。圖5B,通 過計數3個不同橫截面面積的血管的數目/視野(field)來量化血管生成。 *尸<0.01表示在用bFGF處理的塞和用bFGF和PEDF變體處理的塞之間的 差異的統計顯著性。
圖6A-B示出PEDF變體對大范圍的bFGF誘導的新血管形成的抗血 管生成活性。圖6A，在存在或沒有bFGF ( 500ng/ml)的情況下，給CD-1 棵鼠皮下注射0.5 ml包含PEDF變體的基質膠。對照塞僅用PBS或bFGF 處理。7天之后，宰殺小鼠，塞經過H&E染色并且在光學顯微鏡(x40放 大)下拍照。圖6B,通過計數3個不同截面面積的血管的數目/視野來量 化血管生成。**尸<0.05表示在用bFGF和EEE變體處理的塞和用bFGF和 EEA或S24、 114E變體處理的塞之間的差異的統計顯著性。
圖7示出PEDF的差別磷酸化狀態和它們對PEDF功能的影響的圖示。
圖8A-B示出EEE三重變體對無胸腺小鼠中DU145異種移植物生長 的影響。圖8A，用EEE變體處理植入DU145細胞的CD-1棵鼠。用PBS 處理對照組。腫瘤體積相比較于其初始大小呈現倍增。圖8B,第36天的 腫瘤照片。左邊，從PBS處理的組切離的腫瘤。右邊，從EEE變體處理 的組切離的腫瘤。
圖9A-C示出通過抗CK2或抗PKA磷酸化PEDF多克隆抗體識別 PEDF變體。圖9A,重組PEDF( r )或血漿PEDF( pl )經過叩Ser24、邵Ser227 或aPEDF抗體免疫印跡。圖9B， rPEDF或plPEDF用馬鈴薯酸性石壽酸酶 (PAP)處理，然后用叩Ser24、邵Ser227或aPEDF抗體進行免疫印跡。 對照試樣不進行處理。圖9C， rPEDF、 EEA、 AAE、 EEE或AAA變體用 apSer24、叩Ser227或aPEDF抗體進行免疫印跡。
發明詳述本發明提供包含多個被改變的磷酸化位點的PEDF變體、其片段、類 似物和融合蛋白。本發明也提供了編碼PEDF變體、其片段、類似物和融 合蛋白的離析核酸，該PEDF變體、其片段、類似物和融合蛋白包含多個 被改變的磷酸化位點并具有抗血管生成活性。
根據本發明，自然存在的人類PEDF ( SEQ ID NO:l)包含兩個CK2 磷酸化位點和一個PKA磷酸化位點。CK2磷酸化位點位于絲氨酸殘基24 和114，而PKA磷酸化位點位于位點227的絲氨酸殘基。
根據一個方面，本發明提供一種離析的抗血管生成的PEDF變體、其 類似物或融合蛋白，它包含SEQIDNO:l或其片段的氨基酸序列，該SEQ IDNO:l或其片段包含多個被改變的磷酸化位點。
術語"PEDF變體"在這里是指相對于自然存在的PEDF而包含改性的 或被改變的氨基酸序列的PEDF蛋白質，其中至少兩個、優選至少三個磷 酸化位點被改變，該變體保留抗血管生成活性。應該理解，本發明尤其涉 及人類PEDF ( SEQ ID NO:l )，但是由于人類PEDF和源自其他哺乳動物 的PEDF之間具有高度同源性，所以本發明涵蓋其他哺乳動物如小鼠、牛、 豬等等的PEDF。
通常以離析形式提供PEDF變體。術語"離析，，指變體從自然地伴隨天 然序列的其他生物組分中分離出來，所述其他生物組分例如蛋白質、多核 苷酸等。優選地，PEDF變體^皮提純至同質性的。
術語"多個"被改變的磷酸化位點指至少兩個被改變的磷酸化位點、優 選地至少三個被改變的磷酸化位點。
才艮據一些實施方案，抗血管生成的PEDF變體、其類似物或融合蛋白 包含兩個選自下述組的磷酸化位點絲氨酸24和絲氨酸227;以及絲氨酸 114和絲氨酸227。在絲氨酸24和絲氨酸114處均包含被改變的磷酸化位 點的PEDF變體被排除在本發明之外。
才艮據一些優選的實施方案，抗血管生成的PEDF變體、其類似物、片 段或融合蛋白包含在絲氨酸24、絲氨酸114和絲氨酸227處的三個被改變 的磷酸化位點。
21根據一些實施方案，本發明提供一種與野生型重組PEDF相比較具有 減少的神經營養活性的PEDF變體、其片段、類似物或融合蛋白。優選地， PEDF變體、其片段或類似物具有神經營養活性。
在這里使用的術語"片段"指PEDF的全長氛基酸序列的任何一部分， 該部分具有比PEDF的全長氨基酸序列少的氣基酸，例如少于人類PEDF (SEQ ID NO:l )的418個氨基酸，該部分仍然包含多個被改變的磷酸化 位點并且仍然保有抗血管生成活性。通常，全長蛋白質的一部分是肽、多 肽或蛋白質。"肽，，表示由不超過50個氨基酸組成的氨基酸序列。"多肽" 表示通常由超過50個氨基酸殘基組成的UJ菱序列。"蛋白質"表示一個或 多個共價鍵合的多狀鏈。術語肽、多肽和蛋白質在本說明書中可互換使用。
在這里使用的術語"抗血管生成的"活性被用來定義PEDF變體減少或 抑制內皮細胞增殖和/或減少或抑制內皮細胞遷移和/或誘導內皮細胞凋亡 和/或減少或抑制新血管形成的能力。抗血管生成活性可以用本領域中已知 的各種方法檢測。用于測定血管生成的或抗血管生成的活性的體外試驗或 體內試驗的例子包括小鼠角膜新血管形成、雞絨毛尿膠嚢膜試驗、兔角膜 嚢袋試驗、主動脈環試驗和基質膠塞中新血管形成的試驗(還參見下文實 施例)。
在這里使用的術語"類似物"指相比較于自然存在的PEDF (優選地是 SEQ ID NO:l的人類PEDF )具有改性氨基酸序列的PEDF肽、多肽或蛋 白質，它包含多個被改變的磷酸化位點和至少一種氨基酸置換、添加、缺 失和/或化學改性。對于使用"氨基酸置換"，意思就是功能上等效的氨基酸 殘基置換該序列中的殘基，導致靜態改變(Silent change )。例如，在序列 里的一個或多個氨基酸殘基可被另一相似極性的氨基酸置換，該相似極性 的氨基酸充當功能等效物，這就獲得靜態改變。在序列內氨基酸的置換物 可以從該氨基酸所屬類別的其他成員中選擇。例如，非極性(疏水的)氨 基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨 酸和蛋氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、 酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷(堿性的)氨基酸包括精氨酸、 賴氨酸和組氨酸。帶負電荷(酸性的)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。此類置換被認為是保守置換。另外，本發明包含非保守置換。可以進行非保
守置換以使得PEDF變體、其類似物或片段的生物活性(例如，抗血管生 成活性)被保留或者被提高。應該明白，本發明包含PEDF類似物，其中 至少兩個氨基酸殘基被其他氨基酸置換以產生PEDF變體的抗血管生成類 似物，相比較于自然存在的PEDF或野生型重組PEDF,該類似物具有增 加的穩定性或更長的半衰期。
本發明的類似物包括與人類PEDF ( SEQ IDNO:l)或其片段至少具有 70%相似性的肽、多肽或蛋白質，優選地與人類PEDF ( SEQ IDNO:l )或 其片段至少具有80%同源性，更優選地與人類PEDF (SEQIDNO:l)或其 片段至少具有90%同源性，最優選地與人類PEDF ( SEQ ID NO:l)或其片 段至少具有95%同源性。通過比較一種多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸 置換物和另 一種多肽的序列，確定兩種多肽之間的術語"相似性"。
在這里使用的術語"被改變的磷酸化位點"指通過氨基酸置換和/或化 學改性而改變磷酸化位點。應該明白，在一個磷酸化位點中絲氨酸或蘇氨 酸殘基的置換意思是指保守的、但優選地是指非保守的置換。因此，位于 CK2或PKA的磷酸化位點的絲氨酸殘基置換包括置換成非極性的氨基酸、 置換成帶負電荷的氨基酸或置換成帶正電荷的氨基酸、優選地置換成帶負 電荷的氨基酸。在這里使用的術語"改性tt酸"指通過氨基酸置換和/或化 學改性的氨基酸改變。術語改變和改性在說明書和權利要求中可互換地使 用。
由于在蛋白質中的一個絲氨酸殘基的磷酸化與一個帶負電荷的磷酸 基團添加到該絲氨酸相關聯，所以，帶負電荷的氨基酸對絲氨酸的置換模 仿磷酸化的絲氨酸并因此用于表征該磷酸化的生物學意義。重要的是，盡 管磷酸化的蛋白質通過體內磷酸酶活性而被去磷酸化，但是帶負電荷的氨 基酸對絲氨酸的置換產生了在那個位點有永久帶負電荷的氨基酸的蛋白 質。
如下文所示，由谷氨酸殘基對在重組人類PEDF的24、 114和227位 點的絲氨酸殘基進行置換，得到具有高抗血管生成和神經營養活性的 PEDF變體。把在位點24和114的絲氨酸殘基置換成谷氨酸，同時把在位
23點227的絲氨酸殘基置換成丙氨酸，得到具有抗血管生成活性但幾乎無神 經營養活性的PEDF變體。把在位點24和114的絲氨酸殘基置換成丙氨酸 而把在位點227的絲氨酸殘基置換成谷氨酸，得到的PEDF變體具有低于 重組野生型PEDF的神經營養活性但類似于重組野生型PEDF的抗血管生 成活性。把所有三個絲氨酸殘基置換成丙氨酸，得到具有類似于重組野生 型PEDF的神經營養活性和抗血管生成活性的PEDF變體。
術語"神經營養，，活性在此定義為誘導神經細胞表型分化的能力。例如， PEDF誘導所培養的視網膜母細胞瘤細胞分化的能力被認為是神經營養活 性。PEDF變體、其片段、類似物或融合蛋白可以基本上缺乏神經營養活 性。談及基本上缺乏神經營養活性，意思是指PEDF變體、其片段、類似 物或融合蛋白具有不超過20%的重組野生型PEDF神經營養活性，優選地 不超過重組野生型PEDF神經營養活性的10%，更優選地不超過5%。
本發明包含含有化學改性氨基酸殘基的PEDF變體、其類似物、片段 或融合蛋白。氨基酸殘基的改性包括但不限于糖基化、氧化、永久磷酸化、 還原、十四烷基化、硫酸化、酰化、乙酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、環 化、二硫鍵形成、羥基化、碘化、曱基化、保護/封閉基團衍生化或在本領 域中已知的任何其他衍生化方法。這樣的改性可以在PEDF變體、其類似 物或片段的序列的任何位置發生，包括肽主鏈、氨基酸支鏈、氨基或羧基 末端。
包含多個被改變的磷酸化位點的PEDF變體、片段及其類似物可通過 在本領域中已知的各種方法產生，包括重組產生或合成產生。重組產生可 通過使用編碼PEDF變體、其片段或類似物的離析多核苦酸實現，該離析 多核苷酸可操作連接到用于多核苷酸表達的啟動子。任選地，增加該啟動 子的調節子、核糖體結合位點、翻譯起始和轉錄終止子。包含編碼PEDF 變體、其片段或類似物的多核苷酸、啟動子和任選地調節子、核糖體結合 位點、翻譯起始和轉錄終止子的構建體可置于載體中，如質粒、病毒或嗜 菌體載體。載體可用于轉染或轉化宿主細胞，例如細菌、酵母菌、昆蟲或 哺乳動物細月包。
本發明也包含通過使所述PEDF變體或其類似物經過至少一種裂解劑處理而產生的PEDF片段。裂解劑可以是化學裂解劑如溴化氰，或者可以 是酶，優選地可以是內切蛋白酶。可用于切割PEDF變體或其類似物的內 切蛋白酶包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶或在本領 域中已知的產生蛋白水解片段的任何其他酶。
合成的肽、多肽或蛋白質是本領域公知的，且可以商業途徑獲自多個 公司。包含多個被改變的磷酸化位點的PEDF變體、片段或其類似物可使 用標準直接肽合成法合成(參見Bodanszky, 1984, Principles of Peptide Synthesis(肽合成原理)，Springer-Verlag， Heidelberg),例如通過固相合成 法(例如，參見Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 )。固相肽 合成方法的例子包括把叔丁基氧化羰基用作a氨基保護基團的BOC方法 以及利用9-亞藥基曱基氧化羰基保護氨基酸殘基的a-氨基的FMOC方法， 這兩種方法在本領域中廣為人知。此外，如果需要，非經典的氨基酸或化 學氨基酸類似物可作為置換物或添加物引入PEDF變體、其片段或類似物 中。非經典的氨基酸包括但不限于oc-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、羥基脯 氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯 基甘氨酸、環己基丙氨酸等等。
本發明進一步包含PEDF變體、其片段或類似物，它們可以包含PEDF 的氨基酸的一種或多種D-異構體形式。 一旦使用本發明，產生逆反D-氨 基酸的PEDF肽就是簡單的事情，其中該肽用所公布的相同氨基酸制備， 但至少一種氨基酸或也許所有的氨基酸是D-氨基酸。當在肽中的所有氨基 酸都是D-氨基酸且分子的N-和C-末端逆轉時，得到這樣一種分子該分 子與其L-氨基酸形式在相同的位點具有相同的結構基團。但是，在對抗蛋 白水解降解方面，這種分子更穩定，因此可用于在此敘述的許多應用中。
本發明的范圍包括含有PEDF變體、其片段或類似物的嵌合蛋白或融 合蛋白，該PEDF變體、片段或其類似物在其氨基或羰基末端或者在一個 支鏈處經由肽4建與不同蛋白質的氨基酸序列連接。這樣的嵌合蛋白可用蛋 白質合成法制備，例如，通過使用肽合成器，或通過使用在本領域中已知 的方法使編碼所需要的氨基酸序列的適當核酸序列以適當的編碼框架互 相連接，以及通過在本領域中眾所周知的方法表達嵌合蛋白。
25根據另一方面，本發明提供一種離析多核苷酸序列，它包含源于人類
PEDF核苷酸序列SEQ ID NO:6的改性核苷酸序列，該人類PEDF核苷酸 序列SEQ ID NO:6編碼包含源于包含多個被改變的磷酸化位點的SEQ ID NO:l的改性氨基酸序列的抗血管生成的PEDF變體或片段、其類似物或融 合蛋白，條件是相比于僅由兩個在絲氨酸24和絲氨酸114被改變的磷酸 化位點所組成的SEQ ID NO:l ，該離析多核苷酸序列不編碼包含一種改性 氨基酸序列的PEDF變體、其片段、類似物或融合蛋白。簡單起見，在下 文說明中使用的術語"PEDF變體"應該被解釋成包括PEDF變體的所有形 式，包括含有多個被改變的磷酸化位點的其類似物、片段及融合蛋白，并 具有抗血管生成活性。
應該理解，這里使用的術語"改性核苷酸序列"和"核苷酸序列變體"指 相對于人類PEDF的核苷酸序列SEQIDNO:6而改變的核苷酸序列，所述 改變優選地通過導致在磷酸化位點的不同氨基酸的核普酸置換。
術語"多核苷酸"意指脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的聚 合體，該聚合體可源自于任何源，可以是單鏈或雙鏈，并且可以任選包含 能夠摻入DNA或RNA聚合體的合成的、非天然的、或被改變的核苷酸。
"離析多核苷酸"指與自然存在狀態下在其側面的序列分離的多核香酸 區段或片段，例如，從通常毗鄰該片段的序列中移出的DNA片段，所述 序列例如在基因組中自然存在的與基因組片段毗鄰的序列。該術語也適用 于完全從天然伴隨核酸(例如RNA或DNA)的其他成分或在細胞中天然 與之伴隨的蛋白質提純而來的多核苷酸。因此該術語包括例如摻入載體、 自主復制的質粒或病毒或者原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組 DNA,或作為獨立于其他序列的單獨分子(例如，作為通過PCR或限制 酶消化產生的cDNA或基因組或cDNA片段)而存在的重組DNA。也包 括重組DNA和RNA如mRNA，其中該重組DNA是編碼另外的多肽序列 的雜合基因的部分。
術語"編碼"指在離析多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中的特定 核苷酸序列的固有性質，用作生物過程中其他聚合體和大分子的合成模 板，其中所述聚合體和大分子具有確定的核苷酸序列(即，rRNA, tRNA
26和mRNA)或確定的氨基酸序列以及由此產生的生物特性。因此，如果對 應于所述一種基因的轉錄和mRNA的翻譯在細胞或其他生物系統內產生 一種多肽或蛋白質，則該基因就編碼該多肽或蛋白質。其核苷酸序列與 mRNA序列相同并通常在序列表中提供的編碼鏈以及被用作基因或cDNA 的轉錄模板的非編碼鏈，可以說是編碼該基因或cDNA的多肽或蛋白質或 其他產物。
本領域的技術人員應明白，正如所謂的"Wobble規則，，所給出的那樣， 考慮到遺傳密碼的筒并以及允許把在密碼子的第三個位點上的經典堿基 配對排除在外，多種核酸可以編碼任何給定的多肽或蛋白質。此外，包括 或多或少的核苷酸的多核苷酸可產生相同的或等價的多肽或蛋白質。因 此，本發明預期包含編碼SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:5的絲酸序列及其 類似物、片段或融合蛋白的多核苷酸。
本發明的多核苷酸也具有在框架中^^皮融合到標記序列的編碼序列，這 允許本發明多肽的提純。對于細菌宿主的情況，標記序列可以是六聯組氨 酸標簽(six histidine tag),對于哺乳動物宿主的情況，標記序列可以是血 凝素(HA)標簽。
編碼野生型或自然PEDF蛋白質的多核苷酸序列是已知的(例如，參 見公布的國際專利申請第WO 95/33480和WO 93/24529號)，可從在此討 論的多肽序列推斷出其他多核苷酸序列。根據特定的實施方案，本發明提 供一種多核苷酸序列，它編碼從SEQ ID NO:7到SEQ ID NO: 10中選擇的 PEDF變體。
PEDF多核苷酸可以被表達成被轉運的蛋白質，其中PEDF變體從包 含多核苷酸的宿主細胞在其中生長的培養基中離析出來，或可以通過缺失 前導或其他肽而被表達成胞內蛋白質，此種情況下PEDF從宿主細胞離析 出來。然后，這樣離析出來的PEDF用在本領域中已知的蛋白質提純方法 提純。
通過把包含編碼PEDF變體、其片段或類似物的離析多核苷酸的表達 載體傳遞至與感興趣的組織相關的細胞，PEDF變體、類似物或其片段可 被提供給該感興趣的組織。所述細胞產生并分泌該PEDF多肽變體，以使得其被合適地提供給該組織里面的細胞以在感興趣的組織內發揮生物活
性，例如抗血管生成活性或神經營養活性。因此，包含PEDF變體的表達 載體通常包括與已知PEDF序列同源的離析多核苷酸序列，例如，它們將 會在至少低嚴緊條件下、更優選地在中嚴緊條件下、最優選地在高嚴緊條 件下與已知序列的至少一個片段雜交(釆用在Sambrook等.，1989,分子克 隆實驗室手冊，第二版，ColdSpringHarbor出版社中所提出的低、中、 高嚴緊性的定義)。
除了編碼PEDF變體多肽的離析多核苷酸序列之外，表達載體包含啟 動子。在本發明上下文中，啟動子必須能夠驅動PEDF多核苷酸在細胞內 的表達。許多病毒啟動子適合用于這樣的表達盒，例如逆轉錄病毒ITR、 LTR、即時早期病毒啟動子(IEp)如皰滲病毒IEp (例如ICP4-IEp和 ICP0-IEp)和巨細胞病毒(CMV) IEp、以及其他病毒啟動子(例如，晚 期病毒啟動子、潛伏活性啟動子(LAP)、勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子以 及鼠白血病病毒(MLV)啟動子)。其他合適的啟動子是真核啟動子，包 含增強子序列(例如兔(3-球蛋白調節元件)、組成活性啟動子(例如P-肌 動蛋白啟動子等)、信號和/或組織特異性啟動子(例如可誘導的和/或可抑 制的啟動子，如響應于TNF或RU486的啟動子、金屬硫蛋白啟動子等)、 以及腫瘤特異性啟動子。
在表達載體內，編碼PEDF變體或其類似物或片段的多核苷酸和啟動 子可操作地連接，以使得啟動子能夠驅動編碼PEDF變體、其類似物或片 段的多核苷酸表達。只要維持這一可操作的連接，則表達載體可包括超過 一個的基因，如通過內部核糖體進入位點(IRES)分隔的多個基因。此夕卜， 表達載體任選包括其他元件，如剪切位點、多腺苷酸化序列、轉錄調節元 件(例如增強子、沉默子等)或其他序列。
表達載體必須以使得它們能夠表達其中含有的編碼PEDF變體、其片 段或類似物的離析多核苷酸的方式被引厶到細胞內。可以這樣使用任何合 適的載體，這些載體中有許多在本領域中都是已知的。此類載體的例子包 括棵DNA載體(如寡核苷酸或質粒)、病毒載體如腺相關病毒載體(Berns 等.，1995, Ann. N.Y. Acad. Sci. 772:95-104)、腺病毒載體、皰滲病毒載體(Fink等.，1996, Ann. Rev. N畫sci. 19:265-287)、包裝擴增子(Federoff 等.，1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:1636-1640 )、乳頭狀瘤病毒載體、小 核糖核酸病毒載體、多瘤病毒載體、逆轉錄病毒載體、SV40病毒載體、 牛痘病毒載體和其他載體。除了感興趣的表達載體之外，載體也可包括其 他遺傳元件，例如編碼選擇性標記物的基因(例如，p-gal或賦予毒素抗性 的標記物)、藥理活性蛋白質、轉錄因子或其他生物活性物質。
用于操縱包含離析多核苷酸的載體的方法在本領域中廣為人知(例如 參見上文Sambrook等)，包括直接克隆、使用重組酶的位點特異性重組、 同源重組和其他合適的構建重組載體的方法。以此方式，可以將表達載體 構建為它可在任何需要的細胞中復制、在任何需要的細胞中被表達、甚至 可被整合入任何需要的細胞的基因組中。
通過任何適于將DNA轉移到細胞之內的方法，把PEDF變體表達載 體引入到細胞之內。許多這樣的方法在本領域中廣為人知(上文Sambrook 等.；同樣參見Watson等.，1992, Recombinant DNA (重組DNA),第12 章，第2版，Scientific American Books )。因此，對于原核細胞的情況，可 以例如通過電穿孔、轉化、轉導、接合或轉移來實現載體導入。對于真核 細胞，導入載體可以通過使用例如電穿孔、轉染、感染、DNA涂敷微轟擊 粒子或原生質體融合。
如果有必要，在可誘導啟動子的控制下PEDF變體多核苷酸已經被轉 移到其中的細胞，可用作瞬時轉化體。然后，這樣的細胞自身可以被轉移 到哺乳動物中以獲得其中的治療益處。通常，細胞^皮轉移到哺乳動物的一 個部位，以使得在其中表達并從其中分泌的PEDF變體接觸預期的細胞如 內皮細胞，以便發揮PEDF活性，例如抑制血管生成。或者，特別地，對 于在體外已經把載體加入到其中的細胞的情況，細胞可以首先經過幾輪克 隆選4奪(通常通過在載體中使用選擇性標記序列來幫助)以選擇穩定的轉 化體。然后，此類穩定轉化體^皮轉移到哺乳動物中以獲得其中的治療益處。
通過把包含編碼本發明PEDF變體的離析多核苷酸的載體轉染到其他 細胞群中，PEDF變體也可以被提供給細胞例如內皮細胞，由此PEDF變 體在所述其他細胞中表達并從中分泌。之后，這樣轉染的其他細胞群被轉移到哺乳動物的一個部位，其中這樣分泌的PEDF變體接觸這些細胞例如
內皮細胞并抑制血管生成。PEDF變體從所述其他細胞的表達和分泌有益 于感興趣的細胞。沒有必要把編碼PEDF變體的多核苷酸穩定整合入細胞。 在細胞里，可以從非整合或整合的多核苷酸表達和分泌PEDF變體。
在細胞里面，PEDF變體多核苷酸核束達成使得細胞表達和分泌PEDF 變體多肽。可使用標準的分子生物學技術(例如Northern雜交、Western 印跡、免疫沉淀反應、酶免疫測定等等)評估多核苷酸的成功表達。在本 領域中已知用于檢測來自轉染細胞的PEDF基因的表達和PEDF變體的分 泌的試劑(也參見下文中的實施例)。
通過重組技術產生的PEDF變體可以被提純，以使得當它被施用患者 時是大致純的。術語"大致純"指一種化合物(例如蛋白質或多肽)被從自 然伴隨它的成分中分離出來。通常，當試樣中至少50%、更優選地至少60%、 更優選地至少75%、更優選地至少90%、最優選地至少99%的總材料(按 體積，按濕重或千重，或按摩爾百分比或摩爾分數)是感興趣的化合物時， 該化合物就是大致純的。可用任何適當的方法測量純度，例如對于多肽或 蛋白質的情況用柱色譜、凝膠電泳或HPLC分析。當基本不受自然結合成 分影響或當從以天然狀態伴隨的自然雜質分離時，化合物如多肽或蛋白質 也是大致純的。
抗體
多種免疫原可用來產生可與包含多個被改變的磷酸化位點的PEDF變 體特異性反應的抗體。重組全長PEDF變體或其片段可用于產生抗體。由 在此描述的PEDF變體蛋白質序列獲得的合成肽也可作為免疫原用于產生 抗體(見下文的實施例8)。在真核細胞或原核細胞中，重組蛋白質可被表 達、提純并用作免疫原。如果合適，自然地倍增或變性的蛋白可用于產生 抗體。可以生成單克隆抗體或多克隆抗體。
應該明白，當術語"抗體"被使用時，其意思是包括完整抗體(例如多 克隆抗體或單克隆抗體(mAb ))及其蛋白水解的片段(例如Fab或F (ab') 2片段)。本發明的范圍進一步包含嵌合抗體、人類抗體和人源化抗體、重 組和工程抗體及其片段。此外，編碼抗體可變區的DNA可被插入編碼其
30他抗體的DNA中，以產生嵌合抗體(例如，見美國專利第4,816,567號)。 單鏈抗體落在本發明范圍內。
產生多克隆抗體的方法為本領域中的技術人員所知道。通常，免疫原， 優選為提純的蛋白質，與輔助劑混合，用該混合物免疫動物。通過進行試 驗釆血并測定對目標PEDF變體或片段的反應滴度，來監測動物對免疫原 制劑的免疫反應。當獲得適當高的針對免疫原的抗體滴度時，通常在重復 免疫之后，從該動物釆血并制備抗血清。如果需要，可進行抗血清的進一 步分級分離以富集對蛋白質有反應的抗體(例如，見Harlow和Lane( 1988 ) 抗體實驗室手冊，CSH出版社，其內容通過引用合并于此，如同在此完 整描述)。
可以通過本領域技術人員熟悉的各種技術獲得單克隆抗體。通常，一 般通過和骨髓瘤細胞進行融合，使來自用所希望的抗原免疫的動物的脾細 月包無限增殖(見Kohler和Milstein ( 1976 ) Eur. J. Immunol. 6:511 519,通 過引用結合入本文)。無限增殖化的替代方法包括用Epstein Barr病毒、致 癌基因或逆轉錄病毒的轉化，或在本領域中已知的其他方法。篩選單個無 限增殖細胞產生的菌落，以產生具有所需要的抗原特異性和親合力的抗 體，并且可通過包括注射到脊推動物宿主的腹膜腔在內的各種技術提高由 這種細胞產生的單克隆抗體的產量。或者，例如，依照(Huse,等.(1989) Science, 246: 1275-1281 )中概述的一般方法，通過篩選來自人類B細胞的 DNA庫，可以把編碼單克隆抗體或其結合片段的DNA序列離析出來。
其它合適的技術包括在噬菌體或類似載體中選擇抗體庫。例如，見 Huse,等.(1989) Science, 246:1275 1281，和Ward,等.(1989 ) Nature, 341:544 546。可以在存在或沒有改性的情況下使用本發明的抗體。然而， 可以通過共價地或非共價地連接提供可檢測信號的物質來標記抗體。多種 標記物和扼合技術廣為人知，并且在科學文獻和專利文獻中都被廣泛地報 導。合適的標記物包括放射性試劑、酶類、底物、輔因子、抑制劑、熒光 部分、化學發光部分、磁性粒子等等。
藥物組合物和給藥途徑
本發明提供了藥物組合物，其包含治療有效量的具有抗血管生成活性的PEDF變體、其片段、類似物或融合蛋白以及藥學上可接受的載體， 該PEDF變體、其片段、類似物或融合蛋白包含多個被改變的磷酸化位點。
本發明藥物組合物可配制為本發明的蛋白質、多肽或肽的藥學上可接 受的鹽。術語"藥學上可接受的鹽"指從藥學上可4妻受的無毒堿或酸制備的
鹽，該無毒石威或酸包4舌無才幾堿或有才;u威以及無4幾酸或有才幾酸。由無才/u威獲
得的鹽包括鋁、銨、鈣、銅、鐵、亞鐵、鋰、鎂、錳鹽、錳、鉀、鈉、鋅 等等。由藥學上可接受的有機無毒堿獲得的鹽包括下述的鹽伯胺、仲胺 和叔胺的鹽；取代胺，包含天然取代胺；環胺；和陽離子交換樹脂，如精 氨酸、甜菜堿、咖啡因、膽堿、N'N-二千基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨 基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基嗎啉、N-乙基哌啶、 葡糖胺、葡萄糖胺、組氨酸、海蔥次苷(hydrabamine)、異丙胺、賴氨酸、 甲基葡糖胺、嗎啉、派溱、哌啶、聚胺樹脂、普魯卡因、嘌呤、可可堿、 三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨基丁三醇等等。
當本發明的蛋白質、多肽或肽是堿性時，可以從藥學上可接受的、包 括無機酸和有機酸在內的無毒酸制備鹽。這樣的酸包括乙酸、苯磺酸、安 息香酸、樟腦磺酸、檸檬酸、乙烷磺酸、反丁烯二酸、葡萄糖酸、谷氨酸、 氫溴酸、鹽酸、羥乙磺酸、乳酸、馬來酸、蘋果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、 翻酸、硝酸、樸酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸和鄰甲苯磺酸等 等。尤其優選的是檸檬酸、氫溴酸、鹽酸、馬來酸、磷酸、^ii酸和酒石酸。
術語"藥學上可接受的"指美國聯邦政府或州政府的管理機構批準的， 或在美國藥典或其他通常公認的藥典中列出用于動物的、特別是用于人類 的。術語"載體"指通過它們施用治療化合物的稀釋劑、輔助劑、賦形劑或 i某介物。上述藥物載體可以是無菌液體，例如水和油，其中油包括石油、 動物油、才直物油或合成來源的油，如花生油、豆油、礦物油、芝麻油等等、 聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑。當靜脈施用藥物組合物時，水 是優選的載體。鹽溶液和葡萄糖和甘油水溶液也可用作液體載體，尤其是 用作可注射溶液。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明 膠、麥芽、稻米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、甘油硬脂酸酯、滑石、 氯化鈉、脫脂乳粉、乙醇等等。如果需要，所述組合物也可包含較少量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑，如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽。也包括 諸如苯甲醇或羥苯曱酸甲酯的抗菌劑、諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉的抗氧 化劑、諸如乙二胺四乙酸的螯合劑、以及諸如氯化鈉或葡萄糖的張力調節劑。
所述組合物可采取如下形式溶液劑、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、
膠嚢、粉劑、持續釋放制劑等等。所述組合物可與傳統的粘合劑和載體如 甘油三酸酯、微晶纖維素、黃蓍樹膠或明膠制成栓劑。口服制劑可以包括 標準載體，如藥物級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、
碳酸鎂等等。在E.W. Martin的"Remington's Pharmaceutical Sciences"中描 述了合適的藥物載體的例子。所述組合物將包含治療有效量的抗血管生成 PEDF變體或其片段、類似物或融合蛋白(優選地以大致純的形式)，以及 適量的載體以便提供適合施用至患者的形式。
有效治療特定病癥或病狀的抗血管生成PEDF變體、其片段、類似物 或融合蛋白的量，取決于所述病癥或病狀的性質，并可用標準臨床技術來 測定。另外，可任選地使用體外檢驗以幫助確定最佳劑量范圍。在制劑中 應用的精確劑量還將取決于給藥途徑以及疾病或病癥的嚴重性，并且應該 依照醫師的判斷和每個患者的情況來決定。可以從由體外或動物模型試驗 生物測定或系統獲得的劑量響應曲線外推出有效劑量。
根據感興趣組織的位置，能夠以適于把PEDF變體供給感興趣組織里 的內皮細胞的任何方式提供PEDF變體、其類似物或片段。因此，例如， 可以把包含PEDF變體源(即上述的PEDF變體多肽、或編碼PEDF變體 的離析多核苷酸、或PEDF變體表達載體、或表達PEDF變體的細胞)的 組合物引入體循環，體循環把PEDF源分配到感興趣組織。或者，包含PEDF 變體源的組合物可被局部地應用到感興趣的組織(例如，注射，或者作為 連續輸液或腫瘤里的彈丸泵入，被應用到全部或部分皮膚表面，被滴在眼 晴表面上，等等)。
包含PEDF變體源的藥物組合物的引入方法包括但不限于局部的、 皮內的、肌肉內的、腹膜內的、靜脈內的、皮下的、鼻內的、硬膜外的、 眼的以及口H的途徑。以任何方i"更的途徑施用所述化合物，例如通過輸注或彈丸注射、經由上皮層(例如，口腔粘膜、直腸和腸粘膜等等)的吸收， 并且可以和其他治療活性劑一起給藥。給藥最好是局部性的，但也可以是 全身性的。另外，希望以包括腦內注射和鞘內注射在內的任何適當途徑把
本發明的藥物組合物引入中樞神經系統；可以通過例如連接至貯器的腦內 導管來幫助腦內注射。也可使用肺部給藥，例如，通過使用吸入器或霧化 器，并與霧化劑一起配制。
可能希望把本發明的藥物組合物局部施用至需要治療的區域；這可以 通過例如^a不限于下述方式實現在手術時局部輸注、局部應用，例如， 與手術后創傷敷料結合，通過注射、借助于導管、借助于栓劑、借助于藥 物貼片或借助植入物，其中所述植入物是多孔的、無孔的、或膠狀的材料。 才艮據一些優選的實施方案，可通過例如經由注射器在腫瘤或腫瘤組織或腫 瘤前期組織的位置直接注射給藥。
對于局部應用，基于需要的活性，抗血管生成PEDF變體、其類似物 或片段可與藥學上可接受的載體結合，以便遞送有效劑量(即，例如從l.O pM到1.0 mM的有效劑量范圍，以緩解或預防局部血管生成)。載體可以 是如下形式(作為例子而非限制)軟膏、乳油、凝膠、糊劑、泡沫、氣 溶膠、栓劑、襯墊(pad)或膠棒。
用于治療一些眼疾的局部組合物包含在如下眼科可接受的賦形劑中 的有效量的抗血管生成PEDF變體緩沖鹽水、礦物油、諸如玉米油或花 生油的植物油、石蠟油、以及Miglyo1182、醇溶液或脂質體或類脂質體產 品。這些組合物也可以包括防腐劑、抗氧化劑、抗生素、免疫抑制劑和其 他治療有效物質，它們對抗血管生成PEDF變體不產生有害作用。
對于定向的內部局部應用，藥物組合物可以是片劑或膠嚢的形式，它 可以包含任何下列成分或相似性質化合物粘合劑，如微晶纖維素、黃蓍 樹膠或明膠；賦形劑，如淀粉或乳糖；崩解劑，如海藻酸、羧甲基淀粉鈉 (Primogel)或玉米淀粉；潤滑劑，如硬脂酸鎂或Sterotes;或助流劑，如 膠體二氧化硅。當劑量單位形式是膠嚢時，除了上述類型的材料之外，還 可包含諸如脂肪油的液體載體。此外，劑量單位形式可包含改變所述劑量 單位的物理形式的各種其他原料，例如糖衣、蟲膠或其他腸內吸收劑。
34可以控制釋放系統遞送抗血管生成PEDF變體、其片段或類似物。在
一個實施方案中，輸液泵可用于施用抗血管生成PEDF變體、其片段或類 似物，例如，用于把力夷島素或化學療法遞送到特定器官或腫瘤的輸液泵。 在一種優選的形式中，抗血管生成PEDF變體、其類似物或片段與生物可 降解的、生物相容的聚合移植物結合給藥，該聚合移植物在所選擇的位置 在控制時段內釋放抗血管生成PEDF變體。優選的聚合材料的例子包括聚 酐、聚原酸酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙烯醋酸乙烯酯、共聚物及其混合 物(見，控制釋放的醫學應用，Langer和Wise (編輯)，1974, CRC出版 社，Boca Raton, Fla.)。然而，在另一個實施方案中，可以把控制釋放系統 置于治療靶附近，這樣僅需要全身性劑量的一部分。
PEDF變體的用途
本發明提供一種用于治療疾病或病癥特別是與新血管形成有關的疾 病或病癥的方法。該治療方法包括為有相應需要的患者施用藥物組合物， 該藥物組合物包括治療有效量的作為活性成分的PEDF源和藥學上可接受 的載體。按照本發明，PEDF源包括PEDF變體多肽，即，抗血管生成 PEDF變體、其片段、類似物或融合蛋白；編碼本發明的PEDF多肽變體 的離析多核苷酸序列；包含離析多核苷酸序列的表達載體，該離析多核苷 酸序列編碼本發明的PEDF多肽變體；以及用表達載體轉染的宿主細胞， 該表達載體包含離析多核苷酸序列，該離析多核香酸序列編碼本發明的 PEDF多肽變體。
血管生成的抑制通常被認為是阻止新血管形成，不管它們是通過抽芽 (sprouting)還是通過到達(arrival)而產生并隨后分化成循環千細胞的內 皮細胞。然而，由于已經表明PEDF誘導活化的內皮細胞的凋亡，因此在 本發明上下文中血管生成的抑制也應被解釋為包括PEDF變體殺傷細胞， 尤其是靠近腫瘤或在腫瘤里的現有血管中的細胞。因此，在本發明上下文 中，血管生成的抑制包括抑制新血管形成，該抑制作用可能伴隨著或不伴 隨著附近現有血管的破壞。術語"新血管形成，，和血管生成在本說明書和權 利要求書中可互換地使用。
"治療性"治療是對呈現病理學病征的患者給藥以減少或消除那些病征
35的治療。
PEDF源的"治療有效量"是足以為被施用PEDF源的患者提供有益作 用的PEDF源的量。
有相應需要的患者可能患有與新血管形成有關的一種或多種的疾病 或病癥，或者可能已^1判定更容易患有與新血管形成有關的疾病或病癥。 因此，根據本發明的治療方法包括治療和預防兩種效用。
可用抗血管生成PEDF源治療的新生血管性疾病是包括但不限于以下 實體瘤的癌癥肉瘤、癌瘤、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、 骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉 瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤平滑肌肉瘤、^黃紋月幾肉瘤、結腸癌、月夷腺癌、 乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌汗腺癌、皮 脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭腺癌、嚢腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、 肝細胞瘤導管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎細胞癌、維爾姆斯氏瘤子 宮頸癌、睪丸瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星 形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果體瘤、 成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、成神經 細胞瘤和視網膜母細胞瘤。
可用抗血管生成PEDF源治療的、與新血管形成有關的眼疾包括但不 限于新生血管性青光眼、糖尿病性視網膜病變、視網膜母細胞瘤、晶體 后纖維組織增生、葡萄膜炎、早熟性視網膜病、黃斑變性、角膜移植片新 血管形成、眼炎性疾病、諸如視網膜腫瘤和脈絡膜腫瘤的眼瘤、以及與視 網膜、脈絡膜或虹膜新血管形成有關的疾病。
可用抗血管生成PEDF源治療的其他病癥包括但不限于血管瘤、關 節炎、牛皮癬、血管纖維瘤、動脈粥樣硬化斑塊、血友病性關節病和肥厚 性瘢痕。
為了希望的治療或預防活性并確定治療有效劑量，可以在體內測定抗 血管生成PEDF變體。例如，在人體試驗之前，在適當的動物模型系統中 測試PEDF源，該動物才莫型系統包括但不限于大鼠、小鼠、雞、牛、猴、兔等等。對于體內試驗，在對人類給藥之前，可使用在本領域中已知的任 何動物^f莫型系統(見下文的實施例)。
根據另一方面，本發明提供一種用于治療患者的神經變性疾病或病癥 的方法，該方法包含為有相應需要的患者施用治療有效量的根據本發明原 理的藥物組合物和藥學上可接受的載體。
"神經營養"活性在此被解釋為具有誘導神經元細胞群分化的能力。例
如，PEDF誘導培養的視網膜母細胞瘤細胞分化的能力被認為是神經營養 活性。神經營養活性也包括神經細胞誘向活性和膠質抑制活性(Gliastatic activity )。"神經細胞誘向，，活性在此解釋為提高神經元細胞群的成活率的能 力。"膠質抑制"活性在此解釋為抑制神經膠質細胞生長和增殖的能力。
神經元死亡和由神經膠質(神經膠質增生)引起的群體過剩代表了許 多神經變性疾病以及對CNS (腦和視網膜)的其他損傷。PEDF可有效地 -故用于這些病狀以延長初級神經元的壽命和功能作用，避免神經膠質的增 加。例如，在阻斷響應于CNS損傷的小神經膠質細胞活化以及在延長/保 護神經元的壽命方面，PEDF源是有效的。在視網膜中，可以預測PEDF 抑制馬勒神經膠質細胞。由于馬勒細胞與星形神經膠質相似，在阻斷諸如 視網膜脫離、糖尿病、視網膜色素變性等等的神經膠質增生病狀以及保護 視網膜神經元的壽命方面，PEDF源同樣是有效的。
一般認為，移植神經元可治愈某些病變。例如，在帕金森氏癥中，把 特定胎兒腦細胞移植到病人體內可以減輕或治愈與該疾病有關的問題。盡 管要解決的主要問題之一是延長移植細胞的壽命并使它們保持分化，例 如，分泌適當的物質。用PEDF變體對細胞進行預處理可以在這兩個區域 中給予幫助。同樣地，在植入前用包含編碼PEDF變體的離析多核苷酸的 載體轉染神經元或星形神經膠質，這可以是在移植位置的PEDF變體的長 期來源。
在嘗試移植神經視網膜和光感受器細胞以幫助治愈失明方面有更多 的活動。由于非分化和移植物死亡，到目前為止，還沒有富有成效的嘗試。 PEDF源可在兩方面提供幫助。具體地，在手術前，待移植的光感受器神 經元可用PEDF源進行預處理。或者，能夠以高水平把包含編碼PEDF變體的離析多核苷酸的載體轉染到相鄰的視網膜色素上皮(RPE)細胞，其 中它們可用作蛋白質的超常來源。現在， 一些研究人員已經表明，培養的
RPE細胞在被移植入試驗動物的光感受器間空間中之后存活得很好。在體 外，用編碼PEDF基因的離析多核苷酸轉染人類RPE細胞，使得這些細胞 能夠在視網膜移植上使用。
對于自然產生的PEDF,它可存在為高達約250 nM的濃度。因為PEDF 變體是無毒的，它們能夠以高度濃縮的劑量供給組織。然而，由于PEDF 變體的潛能，它可以被用在非常低的濃度中，如大約10nM或更低的濃度 (例如，低至0.01nM)。根據包含PEDF源的組合物的劑型，它在足以延 緩血管生成和/或誘導神經營養活性的時程內被供給到所希望的組織中。
在一些方案中，重復應用可以提高PEDF變體的抗血管生成活性和/ 或神經營養活性，在一些應用中可能需要重復應用。對于PEDF源是PEDF 表達載體的情況，表達PEDF變體的細胞可以產生有效量的PEDF變體(也 就是說，足以發揮PEDF的一種或多種生物活性)。
可單獨或與其他治療模式聯合施用PEDF變體。把PEDF變體作為包 括諸如手術、藥物療法、光動力學療法和/或放射療法的其他療法的治療方 案的 一部分進行給藥是適當的。
實施例
材料及方法
試劑和抗體
重組人類CK2 (在大腸桿菌中表達)從Calbiochem (達姆 施塔特，德國)購買。釆用如(Beavo J. A.,等,酶學方法，38C: 299-308,1974) 描述的方法提純PKA的催化亞基。內皮促細胞分裂劑(ECGS)從生物醫 學技術公司(Biomedical Technologies Inc.)(斯托頓,馬薩諸塞州，美國) 購買。重組人類bFGF (在大腸桿菌中表達)、聚-L-賴氨酸(70-150kDa) 和豬腸肝素從西格瑪(Sigma)(圣路易斯，密歇根州)購買。基質膠從碧 迪生物科4支(BD Biosciences)(馬薩諸塞州，美國)購買。限制酶從羅氏 制藥公司(Roche) (Manhemin,德國)購買。PfiiDNA聚合酶從普洛麥格(Promega)(威斯康星州，美國)購買。對抗PEDF的多克隆抗體由魏茲 曼科學院(Weizmann Institute of Science)的抗體部門制備。全長人類 PEDFcDNA由N.Bouck博士 (西北大學，芝加哥，伊利諾伊州，美國)提 供。
細胞培養
人類Y-79視網膜母細胞瘤細胞在添加了 2 mM L-谷氨酰胺和15%胎牛 血清的MEM中生長。HEK-293T細胞在添加了 10%FCS的DMEMF-12中 培養。HUVEC在添加了 20%FCS、 25嗎/ml ECGS促細胞分裂劑和5 U/ml 肝素的M-199中生長。
重組PEDF ( rPEDF)變體的構建
將包含Ser24和Serl14及其突變的區域的F/wdll和f/ "I消化片段 (l畫362bp), ( Maik-Rachline, G.,等等，Blood: 299-308, 2005和WO 2006/054278,其內容通過參考合并于此)用含有各種突變的Ser227的質 粒中的相同片段替換，產生三重變體。所得到的三重變體如下
EEE變體，S24、 114E插入片段與經消化的pcDNA3-S227E載體連接。
AAE變體，S24、 114A插入片段與經消化的pcDNA3-S227E載體連接。
AAA變體，S24、 114A插入片段與經消化的pcDNA3-S227A載體連接。
EEA變體，S24、 114E插入片段與經消化的pcDNA3-S227A載體連接。 rPEDF的產生
如(Maik-Rachline,G.,等，Blood:299-308,2005 )中所述，使用 LipofectAMINE試劑把攜帶rPEDF或變體的各種質粒引入HEK-293T細胞 中，并在N產柱上提純所分泌的蛋白質。
在此揭示的各種PEDF的氨基酸和核苷酸序列的名稱和序列號(SEQ ID NO)如下所示
tt酸核普酸
氨基酸置換名稱
SEQ ID NO:SEQ ID NO:
3無rPEDF或plPEDF16
S24,114,227EEEE27
S24,114入227EAAE38
S24，114，227AAAA49
S24,114E,227AEEA510
S24ES24E11
S24,114ES24,114E12
S227ES227E13
S114ES114E14
從人類血漿提純PEDF
如先前所描述(Maik-Rachline, G.,等，Blood: 299-308, 2005 ),先通過 9-20% PEG切片，然后通過DEAE-Sephacel柱(2.9x40 cm)和肝素瓊脂糖 柱，從人類檸檬酸鹽血漿(IL)中提純plPEDF。
PEDF的體外磷酸化
磷酸化試驗(40 pi)包含rPEDF、 plPEDF或rPEDF變體(50 jig/ml )。 對于CK2:構成成分是CK2 (4[ig/ml)、甘油(2%)、 NaCl (20mM)、 巰基乙醇(O.lmM)、 MgCl2(20mM)、 [ 2P]-ATP (10 ,)、聚-L-賴氨酸 (200 nM)和Tris-HCl ( 50 mM pH7.4 )。對于PKA:純的PKA催化亞基 (2.5 pg/ml )、 MgCl2 (10 mM )、肝素(50 pg/ml )、 [ 2P]-ATP (10 ) 和Tris-HCl ( 50 mM, pH6.5 )。反應在30。C持續45分鐘。然后，加入煮沸 的樣品緩沖劑，使所述樣品經過10%SDS-PAGE處理。
ERK磷酸化的測定
血清饑餓的HUVEC用各種rPEDF變體(10 nM)處理15分鐘。在刺 激之后，收集細胞，用SDS-PAGE離析蛋白質，并通過蛋白質印跡法使用 如(Aebersold, D. M.,等.Mol. Cell. Biol. 24:10,000- 10,015, 2004 )中所描 述的適當抗體檢測磷酸ERK和普通ERK。
40內皮細胞增殖試驗如先前所描述(Oliver, M. H.,等.，J. Cell Sci. 92: 513-518, 1989 )，通過 亞曱藍試驗確定增殖。筒而言之，HUVEC被接種在明膠涂布的24孔組織 培養皿中的2.5°/。FCS的M-199 ( 0.5 ml/孔)中(20xl03個細胞/孔)。在一 式四份(均為10 nM)接種之后立即添加各種PEDF,并將培養亞在加濕 培養箱中培養48小時。然后，細胞在4%的緩沖曱醛溶液中固定2小時， 用pH8.5的0.1 M硼酸鈉緩沖液洗滌兩次，并用溶解在0.1 M硼酸鹽緩沖 溶液中的1%亞甲藍染色20分鐘。多余染料被洗掉，細胞結合的染料用200 pl/孔的0.1 MHC1洗脫。在Wallac 1420多標記計數器中讀取595 nm處的 光密度值。在Microsoft Excel中分析數據，使用2.5%FCS介質中的細胞增 殖作為對照。突起生長(neurite outgrowth)試驗如先前所描述(Bec固,S. P.,等等，J. Biol. Chem. 268: 23148-23156, 1993 )，試驗人類Y-79視網膜母細胞瘤細胞(從ATCC獲得)的突起生長。 lml的Y-79細胞混懸液(2.5xl()S個細胞/ml)在添加了 2 mM的L-谷氨酰 胺、抗生素和0.1% ITS的MEM中與rPEDF或者各種rPEDF變體(20 nM) 一起培養。7天之后，培養物中的細胞被轉移到聚D-賴氨酸涂布的平板， 在不同時間段用光學顯微鏡監測它們的突起生長。體內基質M血管生成試驗有或沒有PEDF ( 20nM),在水上保持的基質膠(0.5毫升/鼠)與指定 濃度的bFGF混合，而且如(Passaniti, A.,等.，Lab. Invest. 67: 519-528,1992 ) 所描述，皮下注射入8個星期大的棵鼠的腹側。在注射之后基質膠快速形 成一個塞。在第7天，宰殺小鼠，而且它們的皮膚被小心地后拉以暴露完 整的塞。塞被移出、固定(4%曱醛)、石蠟包埋并切片。切片用蘇木素和 曙紅(H&E)染色。通過Masson三色染色法確認浸潤基質膠的內皮細胞/ 微血管。實施例1PEDF的CK2磷酸化突變體不是PKA底物已經研究CK2和PKA磷酸化之間的互相作用。作為第一個步驟，檢 查每種磷酸化作用是否改變PEDF充當另一蛋白質激酶的底物的性能。為 達到這一目的，通過用帶負電荷的谷氨酸殘基替代，來模仿磷酸化絲氨酸 的負電荷，而絲氨酸的非磷酸化狀態通過丙氨酸來模仿，它不能夠充當磷 受體。因此，通過用PKA的純催化亞基和[i^P]-ATP來培養，CK2磷酸化 變體S24、 114E (EE)經過PKA磷酸化。由于PKA磷酸化通常依賴于pH 值，在不同的pH值進行本實驗。
如圖1A所示，盡管rPEDF充當PKA的良好底物，但在所使用的條 件下，磷酸化變體S24、 114E并不被PKA磷酸化(圖1A)。然而，用以 溫和消除S24、 114E變體的天然結構的筒單熱處理，恢復了其由PKA進 行的磷酸化(圖1B)。這一結果表明，缺乏磷酸化是由于磷酸化CK2位點 對PKA磷酸化位點的構象依賴性掩蔽，而且這與這兩個位點位于PEDF 分子的分離區域的這一事實無關。此外，在所試驗的不同反應條件下，根 本不能被CK2磷酸化的變體S24、 114A (AA)被PKA輕易地磷酸化(圖 1C),這表明缺乏磷酸化確實是由在Ser24和Serl14上的負電荷引起的。 與在CK2位點的負電荷對PKA磷酸化的妨礙相反，在PKA位點(Ser227 ) 的負電荷對CK2磷酸化沒有顯著影響。對PKA可磷酸化和不可磷酸化位 點變體(分別為S227E和S227A)來說都是這樣，兩者都被CK2輕易地 磷酸化(圖1D)。由CK2對變性PEDF的高度磷酸化先前已被報導 (Maik-Rachline , G.,等.，同上)，并指出PEDF變性暴露了其他CK2位點。 而且，如先前所示出，由CK2對plPEDF的磷酸化顯著低于rPEDF的CK2 磷酸化(圖1D),這可能是由于在這些位點上的循環蛋白質預磷酸化而發 生的。因此，Ser24和Serll4的CK2磷酸化誘導PEDF的構象改變，這使 得Ser227難以進行PKA磷酸化。然而，Ser227的PKA磷酸化不影響PEDF 被CK2磷酸化的性 負g。
實施例2
PEDF三重變體的表征
本發明的發明人先前已經示出，從循環血液提純的PEDF (plPEDF) 在其CK2位點上并且在較小的程度上也在其PKA位點上包含磷酸
42(Maik-Rachline， G.等，同上；以及上文的圖l)。另外，上文結果示出， 三個PEDF位點可以同時(首先由PKA，然后由CK2 (圖1))磷酸化。 考慮到這些發現，表征這些激酶對PEDF的同時磷酸化的效果變得重要了 。 因此，通過用以下Ala或Glu替代CK2和PKA磷S臾化位點Ser24 、 114和 227，構建一組三重位點變體S24E114E227E (EEE)模仿在CK2和PKA 位點上的磷酸化，S24E114E227A (EEA)模仿在CK2而非PKA位點上的 磷酸化，S24A114A227E (AAE )模仿在PKA而非CK2位點上的磷酸化， 以及S24A114A227A (AAA)模仿非CK2或PKA磷酸化PEDF (圖2A )。 使用Glu突變體而非部分鱗酸化的plPEDF很重要，因為這提供了在相關 位點中具有負電荷的同質分子群，并由此使得可以準確檢出磷酸化效果。 磷酸化Ser到Ala殘基的突變也很重要，因為它們使得可以獲得非磷酸化 分子的同質群。這不同于在S24、 114E或S24、 114A中的PKA位點上以 及在S227E和S227A變體中的CK2位點上發生的少量磷酸化
(Maik-Rachline， G.,etal.,同上)，這些磷酸化可以部分影響這些分子的性 質。通過用全長人類PEDFcDNA或變體來轉染HEK293T細胞來表達這些 變體，并在N產柱上提純。
為表征這些變體并確定它們的生物化學完整性，它們中的每一個經過 由CK2或PKA進行的體外磷酸化。AAE和AAA變體幾乎完全消除了 CK2 磷酸化(圖2B )。另 一方面，三重變體EEE和EEA輕易地被CK2磷酸化， 表明這些變體表現出與先前所描述的S24、 114E (EE)突變體的高度磷酸 化(Maik-Rachline, G.,等，同上) 一致的附加磷酸化位點。因此，與單獨 的S24、 114E磷酸化相比較，S227A或S227E突變附加到CK2突變位點， 并不顯著影響其CK2的磷酸化水平(圖2B)。另外，三重突變體沒有被 PKA磷酸化(圖2C)，這表明三重突變體內CK2位點突變成Glu或Ala， 并不影響PKA位點的構象結構。
實施例3
PEDF變體對ERK活化的影響
盡管PEDF的受體還沒有被鑒定，但已表明這一因子能刺激各種細胞 內信號傳導過程，包括細胞外信號調控的激酶(extracellular signal-regulatedkinase , ERK) /促細胞分裂劑激活的蛋白質激酶(mitogen-activated protein kinase ， MAPK)級聯。為進一步表征PEDF的各種三重變體，檢驗了它 們對HUVEC中ERK活化的影響。因此，各種變體被添加到血清饑餓的 HUVEC ，并使用抗磷酸化ERK和抗普通ERK抗體來測定ERK的活性。
在本發明人前面的研究中，他們示出CK2對PEDF的磷酸化顯著提高 了 rPEDF對ERK活化的影響，而單獨的PKA磷酸化實質上沒有影響 (Maik-Rachline, G.,等.，同上)。這些發現表明S24、 114E誘導顯著的ERK 磷酸化(圖3A和3B),這高于由rPEDF誘導的磷酸化。然而，由三重磷 酸化變體EEE誘導的ERK磷酸化導致更強的磷酸化，是S24、 114E的磷 酸化的約1.5倍(圖3A-B )。 EEA和AAE變體誘導ERK磷酸化到稍微高 于S24、 114E變體的水平，而AAA變體顯著降低了 PEDF活化ERK的性 能。這些結果表明，PKA或CK2對PEDF的磷酸化對PEDF誘導的ERK 級聯活化來說是必要的，并且這些激酶的三個位點的累積磷酸化顯著提高 了這一誘導。
實施例4
PEDF變體對細胞增殖的影響
PEDF先前被示出為抑制子宮內膜癌細胞的細胞增殖，并誘導內皮細 胞的凋亡。這一實驗的目的是確定PEDF及其磷酸化變體對HUVEC增殖 的影響。為達到這一目的，在24孔組織培養m中接種HUVEC，在用有或 沒有各種PEDF的添加了 2.5%FCS的培養基中保持48小時，然后通過亞 甲藍試驗分析增殖速度(Oliver, M.H.,等.J. Cell Sci. 92:513-518, 1989 )。 在這些條件下，rPEDF把HUVEC增殖抑制在適當的范圍內(22%,圖3C )， 而從血漿提純的PEDF (plPEDF )的抑制影響更為顯著(33% )。當用S24、 114E處理細胞時，觀察到對HUVEC增殖的抑制作用，變體非常類似于 plPEDF的抑制作用，這再次表明循環血漿中的PEDF主要是在其CK2位 點上被磷酸化的(見上文)。有趣的是，當用EEE變體處理細胞時，抑制 作用的水平顯著提高(57%)，然而用EEA變體處理的細胞表現非常類似 于用S24、 114E處理的細胞(分別為27%和33%抑制作用)。另一方面， PKA磷酸化變體S227E和AAE對HUVEC增殖幾乎沒有影響。另外，用
44非磷酸化變體S24、 114A和S227A處理的細胞表現出與用rPEDF處理的 細胞相似的增殖水平，然而AAA突變體對HUVEC增殖只有小的影響。 因此，這些結果表示HUVEC增殖的抑制作用依賴于PEDF的磷酸化狀態。 尤其是，細胞增殖被在其CK2位點上磷酸化的PEDF抑制，而且這一抑制 作用在把PKA位點中的一個負電荷附加到CK2位點的負電荷之后顯著增 加。
實施例5
三重突變對PEDF誘導的神經營養活性的影響
發明人先前示出，CK2磷酸化顯著減少了 PEDF的神經營養效果，而 PEDF的PKA磷酸化對PEDF的神經營養效果則沒有或有非常小的影響 (Maik-Rachline,G.,等.，同上)。本研究目的是，檢查同時發生的到PEDF 的PKA和CK2位點的磷酸結合是否調節PEDF變體誘導培養物中人類視 網膜母細胞瘤Y-79細胞分化的性能。令人驚訝的是，用EEE變體處理的 細胞(圖4)呈現了突起生長并形成了聚合體，而EEA變體誘導小冠狀結 構的形成，這些冠狀結構非常緊密，沒有任何幼芽以與用S24、 114E變體 處理的細胞類似的方式從這些細胞伸出。用PKA磷酸化位點變體處理Y-79 細胞:S227E和AAE，得到不同的細胞表型，其中盡管清楚地觀察到它們 的過程，但菌落更小。這些發現表明，盡管CK2磷酸化顯著減少了 PEDF 神經營養效果，除了 CK2的磷酸化之外對PKA位點的磷酸附加，保持了 PEDF的神經營養活性。盡管僅在其PKA位點被磷酸化的PEDF的影響最 小，這仍然發生了。
實施例6
三重氨基酸置換對體內PEDF誘導的抗血管生成活性的影響
為了進一步探究CK2和PKA磷酸化兩者對PEDF功能的影響，使用 基質膠塞試驗，確定三重變體對PEDF的抗血管生成活性的影響。
用已檢驗因子補充的液體基質膠被皮下注射到CD-I棵鼠中。基質膠 聚合形成一個塞，該塞在一個星期之后^皮移出，并通過組織學染色法分析 血管的生長和浸潤。結合bFGF (300 ng/ml),用rPEDF、 plPEDF或各種
45變體處理基質膠塞。正如所期望的那樣，用PBS處理的對照塞顯示了非常
微小的血管生成響應，bFGF處理的塞顯示了強的血管生成活性，rPEDF、 plPEDF以及S24、 114E和S24、 114A突變體呈現系統中先前描述的抗血 管生成活性(圖5,也見Maik-Rachline, G.,等.，同上)。三重變體EEE 或EEA把bFGF誘導的血管生成減少到大致類似于S24、 114E的影響，而 AAA和AAE變體只有比大致類似于S24、 114A的影響更小的影響。有趣 的是，EEE變體的抗血管生成影響稍微高于其他變體，但是在當前實驗中 所使用的情況下，這并非是統計學上顯著的。值得注意，在所有結核的周 邊觀察到一些沒有形成血管的增殖細胞，與PEDF變體的類型無關，這表 明抗血管生成活性部分地由不包括增殖抑制的機理介導。
考慮到EEE變體對血管抽芽的抑制稍微好些，于是考察了這一變體相 比其他磷酸化變體確實是更好的抗血管生成因子的可能性。為達到這一目 的，確定這些變體對用更高水平bFGF (500 ng/ml)處理的基質膠塞的抑 制作用。總的來說，用500 ng/ml bFGF處理的塞比用300 ng/ml處理的塞 呈現更高的血管生成響應(圖6)。這由浸潤塞的細胞數量的顯著上升(圖 6)以及這些塞中實際血管的清晰染色所證明，而這在用較低濃度bFGF處 理的塞中并不明顯。在這些較高的bFGF水平下，EEE變體顯著增加了 PEDF抗血管生成活性，這是因為在塞中沒有觀察到血管(圖6)。與由S24、 114E或EEA突變體(分別為p=0.04和p=0.01)觀察到的抗血管生成活性 相比較，這一抑制活性顯然更為顯著。因此，這些結果表明，當和CK2 磷酸化結合時，PEDF的PKA磷酸化是強抗血管生成活性所必要的，但在 由其本身給出時并非如此。這些結果進一步指出，CK2和PKA對PEDF 的同時磷酸化得到具有最高水平抗血管生成活性的PEDF變體，超過單獨 由CK2進行磷酸化的PEDF變體所呈現的抗血管生成活性。
因此，PEDF的磷酸化在其生理學活性測定中扮演重要角色。在發明 人(Maik-Rachline, G.,等.，同上)的以上研究中，示出CK2對PEDF的 細胞外磷酸化消除了 PEDF神經營養活性，但增強了其抗血管生成活性， PKA磷酸化減少PEDF抗血管生成活性而不影響其神經營養活性。在本發 明中，在PKA和CK2磷酸化位點的絲氨酸對Glu的組合替換把PEDF轉變成其最有效的抗血管生成形式，而仍保持其神經營養活性。考慮所有這
些發現，可以得出結論PKA、 CK2或這兩種激酶一起對PEDF的細胞外 磷酸化，可以調節PEDF活性。因此，非磷S吏化的蛋白質具有弱的抗血管 生成和神經營養活性；PKA磷酸化的蛋白質呈現強的神經營養活性但不呈 現抗血管生成活性；在這兩個CK2位點上^皮磷酸化的PEDF呈現抗血管生 成活性而不具有任何神經營養效果；最后，三重磷酸化的蛋白質恢復這兩 種活性。此外，三重磷酸化的蛋白質的抗血管生成活性要比非磷酸化或單 一 PKA磷酸化PEDF的抗血管生成活性高很多，而且也高于雙重CK2磷 酸化的蛋白質的抗血管生成活性(圖7)。
實施例7
EEE三重變體抑制DU145移植瘤的生長
由于EEE變體在基質膠塞試驗中呈現最高水平的抗血管生成活性，接 下來檢驗其對活體內移植瘤模型的效果。為達到這一目的，DU145人類前 列腺癌細胞混懸液(100 pl鹽水中的5xl()S個細胞)被皮下注射到5星期 大的雌性無胸腺棵鼠的腹側(CD-1)。腫瘤被允許生長大約1星期，之后 根據腫瘤體積把小鼠隨機分成2組。其中一組用EEE變體靜脈注射，每次 注射8昭(n=3 )。另 一組被用作對照組，用PBS (n=2 )靜脈注射。使用測 徑器，通過對長x寬x深進行相乘，計算肺瘤體積。所有處理一個星期進行 3次，腫瘤體積一個星期檢測兩次。結果給出為每一組腫瘤體積相對于其 初始大小的倍增均值。使用學生t-檢驗來分析處理組和對照組之間腫瘤體 積的倍增均值的統計顯著性差異(*P^).05)。如圖8A-B所示，用EEE變 體處理DU145異種移植物，顯著減小了腫瘤體積。
實施例8
抗CK2和抗PKA磷酸化PEDF多克隆抗體的產生
針對對應于人類PEDF的氨基酸14-29的合成16mer肽，在兔中產生 抗磷酸Ser24 ( a-pSer24; CK2位點)PEDF多克隆抗體，其中人類PEDF 的氛基酸14-29的合成16mer肽具有以下氨基酸序列:SEQ ID N0:15中所 示的LGHSSCQNPAS (磷酸)PPEEG。針對對應于人類PEDF的氨基酸的合成15mer肽，產生抗磷酸Ser227( a-pSer227; PKA位點)PEDF 多克隆抗體，其中人類PEDF的氨基酸219-233的合成15mer肽具有以下 氨基酸序列:SEQ ID NO: 16中所示的TKFDSRKTS (磷酸)LEDFYL。此 外，針對對應于人類PEDF的氨基酸327-343的17mer肽，產生抗PEDF
(a-PEDF )多克隆抗體，其中人類PEDF的氨基酸327-343的17mer肽具 有以下氨基酸序列在SEQIDNO:17中所示的KSLQEMKLQSLFDSPDF。 用于制備多克隆抗體的方法正如本領域中所公知的那樣(見Harlow和Lane
(1988)抗體:實驗室手冊，CSH出版社，其內容通過引用結合，如同完整 描述于此)。
為確定多克隆抗體識別PEDF，用各種抗磷酸PEDF抗體對rPEDF和 plPEDF進行免疫印跡。如圖9A所示，兩種蛋白質都被叩Ser24和叩Ser227 識別，然而與rPEDF相比較，兩種抗體都把plPEDF識別到更高的程度， 且用叩Ser24對plPEDF的識別更顯著。這些結果證實本文以上所揭示的 發現，即人類血漿中的PEDF在循環中作為磷酸化蛋白質存在，它主要在 其CK2位點上被磷酸化。
為進一步驗證抗體確實是磷酸化PEDF抗體，rPEDF和plPEDF用馬 鈴薯酸性磷酸酶如下處理rPEDF (1嗎)或plPEDF (1嗎)用馬鈴薯酸 性磷酸酶(PAP， 0.5U)在37。C培養30分鐘。此后，試樣用各種抗磷酸 PEDF抗體進4亍免疫印跡。rPEDF的;奔酸酶處理完全消除了叩Ser24和 叩Ser227對其的識別，而plPEDF的相同處理顯著減少磷酸化抗體對其的 識別(圖9B)。最后，各種PEDF變體(EEA、 AAE、 EEE和AAA)用抗 磷酸PEDF抗體進行免疫印跡。如圖9C所示，有趣的是，叩Ser24抗體高 度識別了 CK2磷酸化突變體(EEA和EEE),而叩Ser227抗體高度識別 了 PKA磷酸化突變體(AAE和EEE )。
本領域內的技術人員應該明白，本發明不受上文具體示出并描述的內 容的限制。本發明的范圍由所附權利要求書限定。
權利要求
1. 一種抗血管生成色素上皮衍生因子(PEDF)變體或其類似物或融合蛋白，其包括具有多個被改變的磷酸化位點的人類PEDF氨基酸序列SEQ ID NO1的變體或其片段，條件是所述變體不同于僅由兩個在絲氨酸24和絲氨酸114處被改變的磷酸化位點組成的PEDF變體、其類似物、片段或融合蛋白。
2. 如權利要求2所述的抗血管生成PEDF變體、其類似物、融合蛋白 或片段，其包括選自絲氨酸24和絲氨酸227、絲氨酸114和絲氨酸227的 兩個被改變的磷酸化位點。
3. 如權利要求1所述的抗血管生成PEDF變體、其類似物、融合蛋白 或片段，其包括在絲氨酸24、絲氨酸114和絲氨酸227處的三個被改變的 磷酸化位點。
4. 如權利要求3所述的抗血管生成PEDF變體、其類似物、融合蛋白 或片段，其具有神經營養活性。
5. 如權利要求4所述的抗血管生成PEDF變體、其類似物、融合蛋白 或片段，其中所述三個被改變的磷酸化位點被帶負電荷的氨基酸殘基置 換。
6. 如權利要求5所述的抗血管生成PEDF變體、其類似物或融合蛋白， 其包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其片段。
7. 如權利要求4所述的抗血管生成PEDF變體、類似物、融合蛋白或 其片段，其中絲氨酸24和絲氨酸114被非極性的氨基酸殘基置換，并且其 中絲氨酸227被選自由帶負電荷的氨基酸殘基和非極性的氨基酸殘基所組 成的組的氨基酸殘基置換。
8. 如權利要求7所述的抗血管生成PEDF變體、其類似物或融合蛋白， 其包括選自由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4或其片段所組成的組的氨基酸 序列。
9. 如權利要求3所述的抗血管生成PEDF變體、其類似物、融合蛋白 或片段，其基本上缺乏神經營養活性。
10. 如權利要求9所述的抗血管生成PEDF變體、其類似物、融合蛋 白或片段，其中絲氨酸24和絲氨酸114被帶負電荷的氨基酸殘基置換，并 且其中絲氨酸227被非極性氨基酸殘基置換。
11. 如權利要求10所述的抗血管生成PEDF變體、其類似物或融合蛋 白，其包括SEQ ID NO:5所示的tt酸序列或其片段。
12. 如權利要求1所述的抗血管生成PEDF變體、其類似物、融合蛋 白或片段，其中磷酸化位點的改變通過化學改性來進行。
13. 如權利要求12所述的抗血管生成PEDF變體、其類似物、融合蛋 白或片段，其中所述化學改性選自糖基化、氧化、永久磷酸化、還原、 十四烷基化、石克酸化、酰化、乙酰化、腺苷二磷酸核糖基化、酰胺化、羥 基化、碘化、曱基化以及封閉基團衍生化。
14. 一種離析多核苦酸序列，其編碼抗血管生成的色素上皮衍生因子 (PEDF)變體或其類似物或融合蛋白，所述多核苷酸序列包括人類PEDF核苷酸序列SEQIDNO:6的變體或其片段，該變體或其片段編碼包括多個 被改變的磷酸化位點的PEDF變體、其類似物、片段或融合蛋白，條件是 所述PEDF變體不同于僅由在絲氨酸24和絲氨酸114處的兩個被改變的磷 酸化位點所組成的變體。
15. 如權利要求14所述的離析多核苷酸序列，其中所述PEDF變體、 其類似物、片段或融合蛋白包括選自下述組的兩個磷酸化位點絲氨酸24 和絲氨酸227;以及絲氨酸114和絲氨酸227。
16. 如權利要求14所迷的離析多核香酸序列，其中所述PEDF變體、 其類似物、片段或融合蛋白包括在絲氨酸24、絲氨酸114和絲氨酸227處 的三個被改變的磷酸化位點。
17. 如權利要求16所述的離析多核苷酸序列，其中所述抗血管生成 PEDF變體、其類似物、片段或融合蛋白具有神經營養活性。
18. 如權利要求17所述的離析多核香酸序列，其中所述三個被改變的磷酸化位點被帶負電荷的氨基酸殘基置換。
19. 如權利要求18所述的離析多核苷酸序列，其包括SEQIDNO:7或其片段。
20. 如權利要求17所述的離析多核苷酸序列，其中絲氨酸24和絲氨 酸114被非極性的氨基酸殘基置換，并且絲氨酸227被選自由帶負電荷的 氨基酸殘基和非極性的氨基酸殘基組成的組的氨基酸殘基置換。
21. 如權利要求20所述的離析多核苷酸序列，所述離析多核苷酸序 列選自由SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9或其片段所組成的組。
22. 如權利要求16所述的離析多核苷酸序列，其中所述抗血管生成 PEDF變體、其類似物、片段或融合蛋白基本上缺乏神經營養活性。
23. 如權利要求22所述的離析多核苷酸序列，其中絲氨酸24和絲氨 酸114被帶負電荷的氨基酸殘基置換，且絲氨酸227被非極性氨基酸殘基 置換。
24. 如權利要求23所述的離析多核苷酸序列，其包括SEQIDNO:IO或其片段。
25. —種表達載體，其包括如權利要求14至24任一項所述的編碼抗 血管生成PEDF變體、其類似物、片段或融合蛋白的離析多核苷酸序列。
26. —種宿主細胞，其包括如權利要求25所述的包括編碼抗血管生 成PEDF變體或其類似物、片段或融合蛋白的離析多核苷酸序列的表達載 體。
27. —種藥物組合物，其包含作為活性成分的、如權利要求1至13 任一項所述的抗血管生成PEDF變體或其類似物、融合蛋白或片段；以及 藥學上可接受的載體。
28. —種藥物組合物，其包含作為活性成分的、如權利要求14至 24任一項所述的編碼抗血管生成PEDF變體或其類似物、融合蛋白或片段 的離析多核苷酸序列；以及藥學上可接受的載體。
29. —種藥物組合物，其包含作為活性成分的、如權利要求25所述的表達載體以及藥物上可接受的載體，所述表達載體包括編碼抗血管生成PEDF變體或其類似物、融合蛋白或片段的離析多核苷酸序列。
30. —種藥物組合物，其包含作為活性成分的、如權利要求26所述 的包括表達載體的宿主細胞以及藥學上可接受的載體，所述表達載體包括 編碼抗血管生成PEDF變體或其類似物、融合蛋白或片段的離析多核苷酸 序列。
31. —種用于治療患者中與新血管形成關聯的疾病或病癥的方法，其 包括為有相應需要的患者施用治療有效量的如權利要求27至30任一項所 述的藥物組合物。
32. 如權利要求31所述的方法，其中所述與新血管形成關聯的疾病 或病癥選自癌癥、眼疾以及用抗血管生成因子治療的病癥。
33. 如權利要求32所述的方法，其中所述疾病或病癥是選自下述組 的癌癥肉瘤、癌瘤、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原 性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、 滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳 腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌汗腺癌、皮脂 腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、嚢腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、 肝細胞瘤導管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎細胞癌、維爾姆斯氏瘤子 宮頸癌、睪丸瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星 形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果體瘤、 成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、黑色素瘤和神經母 細月包瘤。
34. 如權利要求32所述的方法，其中所述眼疾選自新生血管性青 光眼、糖尿病性視網膜病變、視網膜母細胞瘤、晶體后纖維組織增生、葡 萄膜炎、早熟性視網膜病、黃斑變性、角膜移植片新血管形成、視網膜腫 瘤和樂K絡膜腫瘤。
35. 如權利要求32所述的方法，其中所述用抗血管生成因子治療的 病癥選自血管瘤、關節炎、牛皮癬、血管纖維瘤、動脈粥樣硬化斑、血友病性關節病和肥厚性瘢痕。
36. —種用于治療患者神經變性病狀的方法，其包括為有相應需要的患者施用治療有效量的如權利要求27至30任一項所述的藥物組合物。
37. 如權利要求36所述的方法，其中所述神經變性病狀選自多發 性硬化癥、阿爾茨海默病、帕金森病、重癥肌無力、運動原神經病、格-巴二氏綜合癥、自身免疫神經病、Lambert-Eaton類重癥肌無力綜合征、腎 上腺炎神經疾病、腎上腺炎小腦萎縮、非腎上腺炎僵人綜合癥、漸進性小 腦萎縮、Rasmussen氏腦炎、肌萎縮側索硬化、Sydeham舞蹈病、Tourette 綜合癥、自身免疫多內分泌腺病、異常免疫神經病、獲得性神經性肌強直、 多關節彎曲、視神經炎和全身肌強直綜合癥。
38. —種離析抗體或其片段，其特異性結合選自下述組的多肽(a) 人類PEDF氨基酸序列SEQ ID NO:l的變體，其包括至少一個帶負電荷的 被改變的磷酸化位點；(b ) ( a)的PEDF變體的類似物；(c)(a)的PEDF變體或(b)的類似物的片段，其中所述離析抗體不結合相應的具有非磷酸化絲氨酸或不帶負電荷 的被改變的磷酸化位點的人類PEDF序列SEQ ID NO: 1 。
39. 如權利要求38所述的離析抗體或片段，其中所述至少一個被改 變的磷酸化位點位于絲氨酸24,并且其中所述PEDF變體包括選自SEQ ID NO:2 、 SEQ ID NO:5 、 SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。
40. 如權利要求38所述的離析抗體或片段，其中所述至少一個被改 變的磷酸化位點位于絲氨酸227,并且其中所述PEDF變體包括選自SEQ ID NO:2 、 SEQ ID NO:3和SEQ ID NO: 13的^J^酸序列。
41. 如權利要求38所述的離析抗體或片段，其中所述PEDF變體包括 在絲氨酸24和絲氨酸114處的兩個被改變的磷酸化位點，并且所述PEDF 變體包括選自SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:5和SEQ ID NO: 12的氨基酸序 列。
42. 如權利要求38所述的離析抗體或片段，其中所述PEDF變體包括 在絲氨酸24、絲氨酸114和絲氨酸227處的三個被改變的磷酸化位點，并 且所述PEDF變體包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
43. 如權利要求38至42任一項所述的離析抗體或其片段，其是多克 隆抗體。
44. 如權利要求38至42任一項所述的離析抗體或其片段，其是單克 隆抗體。
45. 如權利要求38至42任一項所述的離析抗體或其片段，其選自(a) Fab;(b) F(ab)2;(c) 嵌合抗體；以及(d) 單鏈抗體。
46. —種用于產生抗血管生成PEDF變體的方法，其包括在j足進如 權利要求1至13任一項所述的抗血管生成PEDF變體或其片段或類似物的 表達的條件下，培養包括編碼所述變體、片段或類似物的離析多核苷酸的 宿主細胞，以及回收所述變體、片段或類似物。
47. 如權利要求46所述的方法，其中所述宿主細胞是真核細胞。
全文摘要
本發明涉及色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)的抗血管生成變體及其用途，其中所述變體包含多個被改變的磷酸化位點、編碼所述位點的多核苷酸。尤其，本發明的PEDF變體提供優良的抗血管生成活性和高神經營養活性，可用于治療與新血管形成和神經變性病狀關聯的疾病。
文檔編號C07K14/00GK101506226SQ200680042260
公開日2009年8月12日 申請日期2006年11月14日 優先權日2005年11月14日
發明者加利亞·麥克-瑞茨琳尼, 羅尼·塞格 申請人:維茲曼科學研究所耶達研究與發展有限公司