專利名稱：：用于修飾非天然氨基酸和非天然氨基酸多肽的促進劑的制作方法
技術領域：
：本發明涉及用于修飾含有羰基部分的分子(包括非天然氨基酸和含有非天然氨基酸的試劑)的促進劑。
背景技術：
：將非遺傳性編碼氨基酸(即，"非天然氨基酸")并入蛋白質中的能力允許引入化學官能團，其可提供天然存在官能團(例如賴氨酸的s-NH2、半胱氨酸的巰基-SH、組氨酸的亞氨基等)的有價值替代物。已知某些化學官能團對可見于20種常見遺傳性編碼氨基酸中的官能團呈惰性，但與可并入到非天然氨基酸上的官能團清潔且有效地反應以形成穩定鍵聯。如今可用方法來選擇性地引入未見于蛋白質中的化學官能團，其對可見于20種常見遺傳性編碼氨基酸中的所有官能團呈化學惰性且其可用于與包括某些官能團的試劑有效且選擇性地反應以形成穩定共價鍵。
發明內容本文中描述包含用于含羥胺化合物與含羰基化合物反應的促進劑的方法、組合物、技術和策略。所述促進劑適用于合成含肟化合物。在一些實施例中，促進劑與含羰基化合物形成鍵，且同樣，這些新穎化合物與含羥胺化合物反應性更強。本文中描述可調節含羥胺化合物與含羰基化合物的反應的化合物。本文中也描述可降低含羥胺化合物與含羰基化合物的反應的活化障壁的化合物。本文中也描述當包括于包含含羥胺化合物和含羰基化合物的反應中時增大含肟化合物形成速率的化合物。含羥胺化合物、含羰基化合物和含肟化合物可包括非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾非天然氨基酸多肽。含羰基化合物包括包含芳香族酮部分的化合物。包含芳香族酮部分的這些化合物包括氨基酸和多肽。僅舉例來說，對乙酰基苯丙氨酸或pAcF為包含芳香族酮部分的氨基酸。一個方面為加快含羥胺化合物與含羰基化合物形成含肟化合物的反應速率的化合物(在本文中稱作促進劑)。在一個實施例中，含羥胺化合物為非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或經修飾非天然氨基酸多肽，且含羰基化合物包含所需官能團。在另一個實施例中，所得含肟化合物包含前述所需基團(即所需官能團)中的一種。一個相關方面為這些化合物用于加快非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或經修飾非天然氨基酸多肽上的含羥胺部分與包含所需基團(即所需官能團)的含羰基化合物形成包含所需基團的含肟非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或經修飾非天然氨基酸多肽的反應速率的用途。另一個相關方面為含有促進劑、含羥胺非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或經修飾非天然氨基酸多肽和包含所需基團的含羰基化合物的反應混合物。另一個相關方面為包含所需基團的含肟非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或經修飾非天然氨基酸多肽，其中這些含肟化合物是在存在促進劑的情況下由含羥胺非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或經修飾非天然氨基酸多肽與包含所需基團的含羰基化合物反應形成。在一個實施例中，羰基不為醛。在另一個實施例中，羰基為芳香族酮。在另一個實施例中，含羰基化合物為非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或經修飾非天然氨基酸多肽，且含羥胺化合物包含所需官能團。在另一個實施例中，含肟化合物包含前述基團中的一種。一個相關方面為這些化合物用于加快非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或經修飾非天然氨基酸多肽上的含羰基部分與包含所需基團的含羥胺化合物形成包含所需基團的含后非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或經修飾非天然氨基酸多肽的反應速率的用途。另一個相關方面為含有促進劑、含羰基非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或經修飾非天然氨基酸多肽和包含所需基團的含羥胺化合物的反應混合物。另一個相關方面為包含所需基團的含肟非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或經修飾非天然氨基酸多肽，其中這些含肟化合物是在存在促進劑的情況下由含羰基非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽或經修飾非天然氨基酸多肽與包含所需基團的含羥胺化合物反應形成。在一個實施例中，羰基不為醛。在另一個實施例中，羰基為芳香族酮。另一個方面為通過選擇至少一種適當促進劑來最優化含羰基化合物與含羥胺化合物形成含肟化合物的反應的方法。在一個實施例中，此最優化包含比較在存在不同促進劑、不同摩爾比率的促進劑或前述組合的情況下含肟化合物的產率。在另一個實施例中，通過色譜法來監控含肟化合物的產率。在另一個實施例中，此最優化包含比較在存在不同促進劑、不同摩爾比率的促進劑或前述組合的情況下所產生的副產物的量。在另一個實施例中，通過色譜法來監控副產物的量。在其它實施例中，此最優化包括改變其它反應條件(僅舉例來說，包括pH值和溫度)。在一個實施例中，羰基不為醛。在另一個實施例中，羰基為芳香族酮。一個方面為基于肟鍵的非天然氨基酸，其中所述肟鍵是在存在本文中所述的促進劑的情況下形成。在其它或額外實施例中，將非天然氨基酸并入多肽中，也就是說，這些實施例為非天然氨基酸多肽。在其它或額外實施例中，非天然氨基酸在其側鏈上經官能化以使得其與衍生分子反應產生在存在本文中所述的促進劑的情況下形成的肟鍵。在其它或額外實施例中為非天然氨基酸多肽，其可與在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)形成的衍生分子反應，產生含肟非天然氨基酸多肽。在其它或額外實施例中，非天然氨基酸選自具有羰基、二羰基或羥胺側鏈的氨基酸。在其它或額外實施例中，非天然氨基酸包含羰基或二羰基側鏈，其中羰基或二羰基選自酮或醛。在另一個實施例中為含有在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)用適當官能化共反應物處理后能夠形成肟的官能團的非天然氨基酸。在另一個或又一實施例中，非天然氨基酸在結構上與天然氨基酸類似，但含有前述官能團中的一種。在另一或又一實施例中，非天然氨基酸與苯丙氨酸或酪氨酸(芳香族氨基酸)類似；而在另一個實施例中，非天然氨基酸與丙氨酸和亮氯酸(疏水性氨基酸)類似。在一個實施例中，非天然氨基酸具有與天然氨基酸的性質不同的性質。在一個實施例中，這些不同性質為側鏈的化學反應性，在另一個實施例中，此不同化學反應性允許非天然氨基酸的側鏈經歷反應而成為多肽的單元，但同一多肽中天然存在氨基酸單元的側鏈不經歷前述反應。在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈具有與天然存在氨基酸的側鏈正交的化學。在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈包含含親電子試劑部分；在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈上的含親電子試劑部分可在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)經歷親核進攻而產生肟衍生蛋白。在此段落中的任何前述實施例中，非天然氨基酸可以單獨分子形式存在或可并入任何長度的多肽中；如果為后者，那么多肽可進一步合并天然存在或非天然氨基酸。在一個實施例中，羰基不為醛。在另一個實施例中，羰基為芳香族酮。另一個方面為在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)用于產生基于肟鍵的衍生非天然氨基酸多肽的羥胺取代分子。在另一個實施例中為用于通過在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)在衍生分子與含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽之間形成肟鍵而衍生含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽的羥胺取代分子。在其它實施例中，前述含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽為含酮基非天然氨基酸多肽。在其它或額外實施例中，含羰基或二羰基的非天然氨基酸包含選自酮或醛的側鏈。在其它或額外實施例中，羥胺取代分子包含所需官能團。在其它或額外實施例中，羥胺取代分子為羥胺取代聚乙二醇(PEG)分子。在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈具有與天然存在氨基酸的側鏈正交的化學，其允許非天然氨基酸在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)與羥胺取代分子選擇性反應。在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈包含含親電子試劑部分，其在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)與含羥胺分子選擇性反應；在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈上的含親電子試劑部分可在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)經歷親核進攻以產生肟衍生蛋白質。與此段落中所述的實施例相關的另一個方面為在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)由衍生分子與非天然氨基酸多肽反應產生的經修飾非天然氨基酸多肽。其它實施例包括經修飾非天然氨基酸多肽的任何進一步修飾。在一個實施例中，羰基不為醛。在另一個實施例中，羰基為芳香族酮。另一個方面為用于產生基于肟鍵的衍生非天然氨基酸多肽的經羰基或二羰基取代分子，其中所述肟鍵是在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)形成。在另一個實施例中為用于通過在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)形成肟鍵而衍生含羥胺非天然氨基酸多肽的經羰基或二羰基取代分子。在另一個實施例中，經羰基或二羰基取代分子為醛取代分子或酮取代部分。在其它實施例中，經羰基或二羰基取代分子包含所需官能團。在其它或額外實施例中，醛取代分子為醛取代聚乙二醇(PEG)分子。在其它或額外實施例中，酮取代分子為酮取代聚乙二醇(PEG)分子。在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈具有與天然存在氨基酸的側鏈正交的化學，其允許非天然氨基酸在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)與經羰基或二羰基取代分子選擇性反應。在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈包含在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)與含羰基或二羰基的分子選擇性反應的部分(例如羥胺基)；在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈上的親核部分可在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)經歷親電子進攻以產生肟衍生蛋白質。與此段落中所述的實施例相關的另一個方面為在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)由衍生分子與非天然氨基酸多肽反應產生的經修飾非天然氨基酸多肽。其它實施例包括已經修飾非天然氨基酸多肽的任何進一步修飾。在一個實施例中，羰基不為醛。在另一個實施例中，羰基為芳香族酮。另一個方面為用于產生基于肟鍵的衍生非天然氨基酸多肽的單官能、雙官能和多官能連接子，其中所述肟鍵是在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)形成。在一個實施例中為可用于在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)將含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽與其它分子連接的分子連接子(雙官能和多官能)。在另一個實施例中為可用于在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)將含羥胺非天然氨基酸多肽與其它分子連接的分子連接子(雙官能和多官能)。在另一個實施例中，含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽包含酮和/或醛側鏈。在使用含羥胺非天然氨基酸多肽的一個實施例中，分子連接子在其一個末端含有羰基或二羰基；在其它實施例中，羰基或二羰基選自醛基或酮基。在其它或額外實施例中，羥胺取代連接分子為羥胺取代聚乙二醇(PEG)連接分子。在其它或額外實施例中，經羰基或二羰基取代連接分子為經撥基或二羰基取代聚乙二醇(PEG)連接分子。在全文中，短語"其它分子"包括(僅舉例來說)蛋白質、其它聚合物(分枝和未分枝)、小分子和也稱為"所需官能團"的基團。在其它或額外實施例中，含羥胺分子連接子在所有末端上包含相同或等效基團，以便在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)與含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽反應后，所得產物為含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽的同多聚化物。在其它實施例中，同多聚化為同二聚化。在其它或額外實施例中，含羰基或二羰基的分子連接子在所有末端上包含相同或等效基團，以便在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)與含羥胺非天然氨基酸多肽反應后，所得產物為含羥胺非天然氨基酸多肽的同多聚化物。在其它實施例中，同多聚化為同二聚化。在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈具有與天然存在氨基酸的側鏈正交的化學，其允許非天然氨基酸在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)與羥胺取代連接分子選擇性反應。在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈具有與天然存在氨基酸的側鏈正交的化學，其允許非天然氨基酸在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)與經羰基或二羰基取代的連接分子選擇性反應。在另一個實施例中，非天然氨基酸的側鏈包含含親電子試劑部分，其在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)與含羥胺連接分子選擇性反應；在另一個實施例中，非天然氨基酸側鏈上的含親電子試劑部分可在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)經歷含羥胺連接分子的親核進攻以產生肟衍生蛋白質。與此段落中描述的實施例相關的另一個方面為由連接分子與非天然氨基酸多肽反應產生的鍵聯(修飾)非天然氨基酸多肽。其它實施例包括對已鍵聯(修飾)非天然氨基酸多肽的任何進一步修飾。在一個實施例中，羰基不為醛。在另一個實施例中，羰基為芳香族酮。一個方面為通過在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)縮合羰基或二羰基與羥胺反應物產生肟基產物來衍生蛋白質的方法。此方面中包括根據縮合含羰基或二羰基的反應物與含羥胺的反應物產生肟衍生蛋白加合物來衍生蛋白質的方法。在額外或其它實施例中為用羥胺官能化聚乙二醇(PEG)分子衍生含酮基蛋白質的方法。在額外或其它方面中，羥胺取代分子可包括蛋白質、其它聚合物(分枝和未分枝)、小分子和也稱為"所需官能團"的基團。在一個實施例中，羰基不為醛。在另一個實施例中，羰基為芳香族酮。另一個方面為在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)化學合成用于衍生酮基取代蛋白質的羥胺取代分子的方法。在一個實施例中，羥胺取代分子可包含肽、其它聚合物(未分枝和分枝)和小分子。在一個實施例中為在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)制備適于衍生含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽(僅舉例來說，包括含酮基非天然氨基酸多肽)的羥胺取代分子的方法。在另一個或又一個實施例中，非天然氨基酸在蛋白質的活體內翻譯期間位點特異性并入。在另一個或又一個實施例中，羥胺取代分子通過羰基或二羰基的親核進攻允許此含羰基或二羰基的非天然氨基酸的位點特異性衍生而以位點特異性方式形成肟衍生多肽，其中所述肟衍生多肽是在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)形成。在另一個或又一個實施例中，制備羥胺取代分子的方法提供得到多種位點特異性衍生多肽的方法。在另一個或又一個實施例中為合成羥胺官能化聚乙二醇(PEG)分子的方法。另一個方面為使用含羥胺雙官能連接子在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)化學衍生經羰基或二羰基取代的非天然氨基酸多肽的方法。在一個實施例中為在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)通過縮合反應將羥胺取代連接子與經羰基或二羰基取代的蛋白質連接產生肟鍵的方法。在其它或額外實施例中，經羰基或二羰基取代的非天然氨基酸為酮基取代非天然氨基酸。在其它或額外實施例中，使用含羥胺雙官能連接子，非天然氨基酸多肽經位點特異性衍生和/或通過三維結構的精確控制而衍生。在一個實施例中，這些方法用于將分子連接子(單官能、雙官能和多官能)連接到含羰基或二羰基(僅舉例來說包括含酮基)的非天然氨基酸多肽上，其中至少一個連接子末端含有羥胺基，其可在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)通過肟鍵鍵聯到含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽上。在另一個或又一個實施例中，這些連接子用于將含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽與其它分子連接，所述其它分子包括(例如)蛋白質、其它聚合物(分枝和未分枝)、小分子和也稱為"所需官能團"的基團。在一個實施例中，羰基不為醛。在另一個實施例中，羰基為芳香族酮。在一些實施例中，非天然氨基酸多肽鍵聯到水溶性聚合物上。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些實施例中，聚乙二醇分子為雙官能聚合物。在一些實施例中，雙官能聚合物鍵聯到第二多肽上。在一些實施例中，第二多肽與第一多肽相同，在其它實施例中，第二多肽為不同的多肽。在一些實施例中，非天然氨基酸多肽包含至少兩種鍵聯到水溶性聚合物(包含聚乙二醇部分)上的氨基酸。在一些實施例中，非天然氨基酸多肽包含增加非天然氨基酸多肽對受體的親和性的取代、添加或缺失。在一些實施例中，非天然氨基酸多肽包含增加非天然氨基酸多肽的穩定性的取代、添加或缺失。在一些實施例中，非天然氨基酸多肽包含增大非天然氨基酸多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一些實施例中，非天然氨基酸多肽包含增大所產生的非天然氦基酸多肽在宿主細胞中的溶解性的取代、添加或缺失。在一些實施例中，相對于不具有取代、添加或缺失的氨基酸多肽來說，非天然氨基酸多肽包含調節蛋白酶抗性、血清半衰期、免疫原性和/或表達的取代、添加或缺失。在一些實施例中，非天然氨基酸多肽為激動劑、部分激動劑、拮抗劑、部分拮抗劑或反向激動劑。在一些實施例中，激動劑、部分激動劑、拮抗劑、部分拮抗劑或反向激動劑包含與水溶性聚合物鍵聯的非天然氨基酸。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些實施例中，包含與水溶性聚合物鍵聯的非天然氨基酸的多肽防止相應受體的二聚化。在一些實施例中，包含與水溶性聚合物鍵聯的非天然氨基酸的多肽調節多肽與結合搭配物的結合。在一些實施例中，包含與水溶性聚合物鍵聯的非天然氨基酸的多肽調節多肽的一種或一種以上的性質或活性。本文中也描述制造與水溶性聚合物鍵聯的非天然氨基酸多肽的方法。在一些實施例中，所述方法包含在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)使包含非天然氨基酸的分離多肽與包含與非天然氨基酸反應的部分的水溶性聚合物接觸。在一些實施例中，經并入的非天然氨基酸對與20種常見氨基酸中的任一種不反應的水溶性聚合物有反應性。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。聚合物的分子量可在寬泛范圍內，其包括(但不限于)介于約100Da與約100,000Da或更高之間的范圍。聚合物的分子量可介于約100Da與約100,000Da之間，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65，000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8，000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約100Da與約50,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約100Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約1,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約5,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約10,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚乙二醇分子為分枝聚合物。支鏈PEG的分子量可介于約1,000Da與約100,000Da之間，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量介于約l，OOODa與約50,000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量介于約1,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量介于約5,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量介于約5,000Da與約20,000Da之間。本文中也描述包含包括至少一種本文中所述的非天然氨基酸的多肽和醫藥學上可接受的載劑的組合物。在一些實施例中，非天然氨基酸鍵聯到水溶性聚合物上。本文中也描述包含醫藥學上可接受的載劑和多肽的醫藥組合物，其中至少一個氨基酸經非天然氨基酸取代。在一些實施例中，非天然氨基酸包含糖部分。在一些實施例中，水溶性聚合物通過糖部分鍵聯到多肽上。本文中也描述非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾非天然氨基酸多肽的前藥；本文中進一步描述包含這些前藥和醫藥學上可接受的載劑的組合物。本文中也描述非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾非天然氨基酸多肽的代謝物；這些代謝物可具有補充或協同加強非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾非天然氨基酸多肽的活性的所需活性。本文中也描述本文中所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和經修飾非天然氨基酸多肽向生物體(包括需要此代謝物的患者)提供所需代謝物的用途。本文中也描述本文中所述的非天然氨基酸的文庫或本文中所述的非天然氨基酸多肽的文庫，或本文中所述的經修飾非天然氨基酸多肽的文庫，或其組合文庫，其中文庫的成員包含在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)形成的肟鍵。本文中也描述篩檢本文中所述的文庫的所需活性的方法，或使用陣列來篩檢本文中所述的文庫或篩檢化合物和/或多肽和/或聚核苷酸的其它文庫的所需活性的方法。本文中也描述來自文庫篩檢的此活性數據用于開發和發現新穎治療劑的用途，以及治療劑本身。本文中也描述用于加速小分子的接合(其例如包括一種試劑上的羥胺基與另一種試劑上的羰基的接合)的方法，其中兩種試劑都不為非天然氨基酸。換句話說，本文中所述的促進劑的用途并不限于非天然氨基酸和非天然氨基酸多肽的進一步官能化，但也可用于促進任何兩種試劑之間肟鍵的形成。僅舉例來說，此實施例包括促進劑用于由含羥胺試劑和含羰基試劑形成/建立動態文庫的用途。當然，這些動態文庫可包括非天然氨基酸，但這些動態文庫并不限于包括非天然氨基酸。本文中也描述增加多肽的治療半衰期、血清半衰期或循環時間的方法，其包含用非天然氨基酸取代天然存在多肽中的任何一個或一個以上氨基酸，和/或將非天然氨基酸添加到天然存在多肽中，和/或通過在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)形成的肟鍵將多肽鍵聯到水溶性聚合物上。本文中也描述用有效量的醫藥組合物治療需要此治療的患者的方法，所述醫藥組合物包含包括非天然氨基酸的多肽和醫藥學上可接受的載劑，所述非天然氨基酸包含在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)形成的肟鍵。在一些實施例中，非天然氨基酸與水溶性聚合物鍵聯。在任何前述方面或實施例中，促進劑的使用包括使用單一促進劑或多種促進劑。此外，在任何前述方面或實施例中，促進劑與含羰基化合物的摩爾比率包括介于約0.5:1與5000:1之間的值，其包括(僅舉例來說)4000:1、3000:1、2000:1、1000:1、500:1、400:1、300:1、200:1、100:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1和0.5:1。此外，在任何前述方面或實施例中，促進劑與含羥胺化合物的摩爾比率包括介于約0.5:1與5000:1之間的值，其包括(僅舉例來說)4000:1、3000:1、2000:1、1000:1、500:1、400:1、300:1、200:1、100:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1和0.5:1。此外，在任何前述方面或實施例中，促進劑包括可在真空中從所得含肟化合物中實質上去除的化合物。此外，在任何前述方面或實施例中，促進劑包括含有胺部分、氨基脲部分、肼或酰肼部分的化合物。此外，在任何前述方面或實施例中，促進劑選自由雙官能芳香族胺、氧代胺衍生物和具有以下結構的化合物組成的群組<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>其中Rx、Ry和Rz選自由以下各基團組成的群組Lx-H、u-烷基、u-芳基、Lx-雜芳基、Lx-烯基、u-炔基、Lx-烷氧基和Lx-垸基胺，其中Lx為鍵、C(=0)、C(=NH)、C(:NH)-NH和SO、S02。在另一個實施例中，促進劑為雙官能芳香族胺。在另一個實施例中，芳香族胺選自以下群組雙官能芳香族胺在另一個實施例中，促進劑為氧代胺衍生物。在另一個實施例中，氧代胺衍生物選自以下群組氧代胺衍生物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>在另一個實施例中，促進劑包括選自由以下各物組成的群組的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>其中Rx、Ry和Rz選自由以下各基團組成的群組Lx-H、Lx-烷基、Lx-芳基、U-雜芳基、Lx-烯基、Lx-炔基、U-烷氧基和U-烷基胺，其中Lx為鍵、C(=0)、C^NH)和C(=NH)-NH。此外，在任何前述方面或實施例中，促進劑選自圖5、圖9或圖10中所呈示的化合物，其例如包括圖5的化合物6、8、10、7和20中的任一種。在任何前述方面或實施例中，促進劑包括在與含羰基反應后可形成腙的試劑。此外，在任何前述方面中，促進劑活性視與酮部分的反應速率和所得中間體的穩定性而定。此外，在任何前述方面或實施例中，包含促進劑、含羰基化合物和含羥胺化合物的反應混合物的pH值在約2.0與10之間；在約2.0與9.0之間；在約2.0與8.0之間；在約3.0與7.0之間；在約4.0與6.0之間；在約3.0與10.0之間；在約4.0與10.0之間；在約3.0與9.0之間；在約3.0與8.0之間；在約2.0與7.0之間；在約3.0與6.0之間；在約4.0與9.0之間；在約4.0與8.0之間；在約4.0與7.0之間；在約4.0與6.5之間；在約4.5與6.5之間；約4.0;約4.5;約5.0;約5.5;約6.0;約6.5;和約7.0。然而，對于本文中所述的任何pH值范圍來說，注意到關于低和高pH值的短語"在……之間"表示"約"應用于低pH值與高pH值兩者；僅舉例來說，"在約3.0與10.0之間"等同于"在約3.0與約10.0之間"。此外，除非另外說明，否則對于"約"在下限前出現且未在上限前出現(或在"約"位于上限前且未位于下限前的情況下)的本文中呈示的任何范圍來說，應理解為表示"約"字出現于范圍的上限與下限之前。此外，在任何前述方面或實施例中，術語"促進劑"包括具有至少一種以下性質的化合物(a)增大含羰基化合物與含羥胺化合物形成含肟化合物的反應速率，其中速率增大是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(b)降低含羰基化合物與含羥胺化合物形成含肟化合物的反應的活化能，其中活化能降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(C)增加含羰基化合物與含羥胺化合物的反應生成含肟化合物的產率，其中產率增加是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(d)降低含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物的溫度，其中溫度降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(e)減少含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物所需的時間，其中時間減少是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(f)降低形成含肟化合物所需的試劑量，其中試劑量降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(g)減少由含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物所產生的副產物，其中副產物的減少是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(h)不會不可逆地破壞在存在促進劑的情況下經歷肟形成反應的多肽的三級結構(當然，除了反應目的在于破壞此三級結構之外)；(i)可在真空中與含肟化合物分離；和(j)調節含羰基化合物與含羥胺化合物的反應。在另一個實施例中，促進劑具有至少兩種前述性質、三種前述性質、四種前述性質、五種前述性質、六種前述性質、七種前述性質、八種前述性質、九種前述性質或所有前述性質。在另一個實施例中，促進劑不具有任何一種前述性質。應了解本文中所述的方法和組合物不限于本文中所述的具體方法、方案、細胞株、構筑體和試劑且因而可改變。也應了解本文中所用的術語僅為了描述具體實施例的目的，且并不打算限制本文中所述的方法和組合物的范圍，其將僅由隨附權利要求來限制。除非上下文另外明確指出，否則如本文中和隨附權利要求中所用，單數形式"一"和"所述"包括復數提及物。除非另外定義，否則本文中所用的所有技術術語和科學術語具有與本文中所述的本發明所屬領域的一般技術人員通常所了解相同的含義。盡管與本文中所述的那些類似或等效的任何方法、設備和材料可用于實施或測試本文中所述的本發明，但現在描述優選方法、設備和材料。術語"烷氧基"、"烷氨基"和"烷硫基"(或硫基烷氧基)是以其常規意義使用，且指的是分別通過氧原子、氨基或硫原子與分子的其余部分連接的烷基。除非另外說明，否則術語"垸基"(自身或作為另一取代基的部分)表示直鏈或支鏈，或環狀烴基，或其組合，其可完全飽和、單不飽和或多不飽和且可包括具有指定碳原子數(即d-do表示1到IO個碳)的二價基團和多價基團。飽和烴基的實例包括(但不限于)例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環己基、(環己基)甲基、環丙基甲基的基團，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等等的同系物和異構體。不飽和烷基為具有一個或一個以上雙鍵或三鍵的垸基。不飽和烷基的實例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(l,4-戊二烯基)、乙炔基、l-丙炔基和3-丙塊基、3-丁炔基和更高級的同系物和異構體。除非另外說明，否則術語"垸基"也打算包括下文中更詳細定義的烷基衍生物，例如"雜烷基"。限于烴基的垸基稱作"均垸基(homoalkyl)"。術語"亞垸基"(自身或作為另一取代基的部分)表示由垸烴衍生的二價基團，如由(但不限于)結構-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-示范，且進一步包括下文描述為"雜亞垸基"的基團。通常，烷基(或亞垸基)將具有1到24個碳原子，其中具有10個或更少碳原子的基團為本文中所述的方法和組合物的具體實施例。"低級烷基"或"低級亞垸基"為通常具有8個或更少碳原子的較短鏈垸基或亞垸基。術語"氨基酸"指的是天然存在氨基酸和非天然氨基酸，以及以類似于天然存在氨基酸的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然編碼氨基酸為20種常見氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸)以及焦賴氨酸和硒半胱氨酸。氨基酸類似物指的是具有與天然存在氨基酸相同的基本化學結構(即，與氫、羧基、氨基和R基團結合的a-碳)的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸硫氧化物、甲硫氨酸甲基锍。這些類似物具有經修飾R基團(例如正亮氨酸)或經修飾肽主鏈，而仍保留與天然存在氨基酸相同的基本化學結構。氨基酸在本文中可由其通常己知的三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名委員會(IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission)推薦的單字母符號提及。同樣，核苷酸可由其通常接受的單字母代碼提及。"氨基末端修飾基"指的是可與多肽的氨基末端連接的任何分子。類似地，"羧基末端修飾基"指的是可與多肽的羧基末端連接的任何分子。末端修飾基包括(但不限于)各種水溶性聚合物、肽或蛋白質，例如血清白蛋白或增加肽的血清半衰期的其它部分。"抗體片段"表示除全長形式之外的任何抗體形式。本文中的抗體片段包括存在于全長抗體中的較小組分的抗體，和已經工程化的抗體。抗體片段包括(但不限于)Fv、Fc、Fab和(Fab')2、單鏈Fv(scFv)、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、雙功能雜交抗體、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的組合、可變區、骨架區、恒定區、重鏈、輕鏈和可變區，以及替代性骨架非抗體分子、雙特異性抗體等等(Maynard和Georgiou,2000,iev.5/owed2:339-76;Hudson,1998，O/rrCp/".祝Wec/mo/.9:395-402)。另一種功能性亞結構為單鏈Fv(scFv)，其包含通過肽連接子共價連接的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區(S-zHu等人，1996,amcw及e"wc/2,56，3055-3061)。這些小(Mr25，000)蛋白質通常保持對單一多肽中的抗原的特異性和親和性且可為較大的抗原特異性分子提供適宜構建單元。除非另外特定說明，否則使用術語"抗體"的陳述和權利要求明確包括"抗體片段"。除非另外說明，否則術語"芳基"表示可為單環或稠合在一起或共價鍵聯的多個環(包括(但不限于)1到3個環)的多不飽和、芳香族烴取代基。術語"雜芳基"指的是含有1到4個選自N、O和S的雜原子的芳基(或環)，其中氮和硫原子視情況經氧化，且氮原子視情況經季銨化。雜芳基可通過雜原子與分子的其余部分連接。芳基和雜芳基的非限制性實例包括苯基、l-萘基、2-萘基、4-聯苯基、l-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、l-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。各上述芳基和雜芳基環系統的取代基選自下述可接受的取代基的群組。為了簡便起見，當與其它術語組合使用(包括(但不限于)芳氧基、芳基硫氧基、芳烷基)時，術語"芳基"包括如上文所定義的芳基環與雜芳基環兩者。因此，術語"芳垸基"或"烷芳基"打算包括芳基連接到垸基上的基團(包括(但不限于)芐基、苯乙基、吡啶基甲基等等)，其中所述垸基包括碳原子(包括(但不限于)亞甲基)已由(例如)氧原子置換的烷基(所述基團包括(但不限于)苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(l-萘基氧基)丙基等等)。"雙官能聚合物"指的是包含兩個能夠與其它部分(包括但不限于氨基酸側基)特異性反應以形成共價鍵或非共價鍵的不連續官能團的聚合物。具有一個可與特定生物活性組分上的基團反應的官能團和另一個可與第二生物組分上的基團反應的基團的雙官能連接子可用于形成包括第一生物活性組分、雙官能連接子和第二生物活性組分的接合物。已知用于連接各種化合物與肽的眾多程序和連接分子。例如參看歐洲專利申請案第188,256號；美國專利第4,671,958號、第4,659,839號、第4,414,148號、第4,699,784號、第4,680,338號和第4,569,789號；其全部是以引用的方式并入本文中。"多官能聚合物"指的是包含兩個或兩個以上能夠與其它部分(包括但不限于氨基酸側基)特異性反應以形成共價鍵或非共價鍵的不連續官能團的聚合物。雙官能聚合物或多官能聚合物可為任何所需長度或分子量，且可經選定以在鍵聯到化合物上的一個或一個以上分子與其所結合的分子或化合物之間提供特定所需間隔或構象。當在本文中使用時，術語"生物活性分子"、"生物活性部分"或"生物活性劑"表示可影響生物系統、路徑、分子的任何物理或生物化學性質或與生物體相關的相互作用的任何物質，所述生物體包括(但不限于)病毒、細菌、噬菌體、轉座子、朊病毒、昆蟲、真菌、植物、動物和人類。具體來說，如本文中所用，生物活性分子包括(但不限于)打算用于診斷、治愈、緩解、治療或預防人類或其它動物的疾病，或另外用于增強人類或動物的身體或精神健康的任何物質。生物活性分子的實例包括(但不限于)肽、蛋白質、酶、小分子藥物、硬性毒品、軟性毒品、碳水化合物、無機原子或分子、染料、脂質、核苷、放射性核素、寡核苷酸、毒素、細胞、病毒、脂質體、微粒和膠團。適于本文中所述的方法和組合物使用的生物活性劑的種類包括(但不限于)藥物、前藥、放射性核素、顯像劑、聚合物、抗生素、殺真菌劑、抗病毒劑、消炎劑、抗腫瘤劑、心血管劑、抗焦慮劑、激素、生長因子、甾族劑、微生物源毒素等等。如本文中所使用，共折疊具體指的是使用至少兩個彼此相互作用的多肽且使得未折疊或不當折疊的多肽轉化為天然的適當折疊多肽的再折疊過程、反應或方法。如本文中所用，"比較窗口"包括參考選自由20到600、通常約50到約200、更通常約100到約150組成的群組的連續位置數中的任一者的區段，其中在兩個序列經最佳比對之后，序列可與具有相同數目的連續位置的參考序列進行比較。所屬
技術領域：
中眾所周知用于比較的序列比對方法。可通過以下方法進行用于比較的最佳序列比對，這些方法包含但不限于Smith和Waterman(1970)Ma仇2:482c的局部同源算法；Needleman和Wunsch(1970)J:Mo/.別o/.48:443的同源比對算法；Pearson和Lipman(1988)Prac.iVW/.JcadSc/.85:2444的相似性搜索方法；這些算法的計算機化實施(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA);或手工比對和目測檢査(例如參看Ausubel等人，C釘eW/Woco/sMo/ecw/ar5z'o/ogy(1995年增干[j))。適用于測定序列一致性百分比和序列相似性百分比的算法的一個實例為BLAST和BLAST2.0算法，其分別描述于Altschul等人，(1977)Nuc.AcidsRes25:3389-3402和Altschul等人，(1990)乂Mo/.5/o/.215:403-410中。用于進行BLAST分析的軟件可通過國家生物技術信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公開獲得。BLAST算法參數W、T和X決定比對的靈敏性和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列來說)使用字長(W)11、期望值(E)10、M=5、N:-4和兩條鏈的比較作為默認值。對于氨基酸序列來說，BLASTP程序使用字長3和期望值(E)10作為默認值，且BLOSUM62得分矩陣(參看Henikoff和Henikoff(1992)/Voc.Ato/.Jcac.Sc/.89:10915)使用比對數(B)50、期望值(E)10、M=5、N二-4和兩條鏈的比較作為默認值。通常在"低復雜性"過濾器關閉的情況下進行BLAST算法。BLAST算法也進行兩個序列之間相似性的統計學分析(例如參看Karlin和Altschul(1993)/Voc.A^/.Xcad90:5873-5787)。由BLAST算法提供的相似性的一個量度為最小和概率(smallestsumprobability,P(N)),其提供關于兩個核苷酸或氨基酸序列之間偶然會發生匹配的概率的指標。舉例來說，如果在測試核酸與參考核酸的比較中最小和概率小于約0.2、小于約0.01且在另一個實施例中小于約0.001，那么認為核酸類似于參考序列。術語"保守性修飾變體"適用于氨基酸與核酸序列。對于特定核酸序列來說，"保守性修飾變體"指的是編碼一致或基本上一致氨基酸序列的核酸，或其中核酸不將氨基酸序列編碼成基本上一致序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能相同的核酸編碼任何給定蛋白質。舉例來說，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在由密碼子表示丙氨酸的每一位置處，密碼子可改變為所述相應密碼子中的任一個而不會改變所編碼多肽。這些核酸變化為"寂靜變化(silentvariation)",其為保守性修飾變化的一種。編碼多肽的本文中的每一核酸序列也描述核酸的每一個可能寂靜變化。所屬領域的一般技術人員將認識到核酸中的每一密碼子(除AUG和TGG之外，AUG通常為甲硫氨酸的唯一密碼子，且TGG通常為色氨酸的唯一密碼子)可經修飾以產生功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每一寂靜變化在各所述序列中為隱含的。至于氨基酸序列，所屬領域的一般技術人員將認識到改變、添加或缺失所編碼序列中的單一氨基酸或小百分比氨基酸的對核酸、肽、多肽或蛋白質序列的個別取代、缺失或添加為"保守性修飾變體"，其中所述改變造成氨基酸的缺失、氨基酸的添加，或氨基酸經化學上類似的氨基酸的取代。所屬
技術領域：
中眾所周知提供功能類似氨基酸的保守性取代列表。這些保守性修飾變體不同于本文中所述的方法和組合物的多態變體、種間同源物和等位基因且不將其排除在外。以下八組各自含有作為彼此的保守性取代的氨基酸-1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(例如參看Creighton,7VoWiS"""wesawdMo/ecw/o7"尸rape"/es(WHFreeman&Co.;第2版(1993年12月))除非另外說明，否則術語"環烷基"和"雜環垸基"(自身或與其它術語組合)分別表示"烷基"和"雜烷基"的環狀形式。因此，環烷基或雜環烷基包括飽和、部分不飽和以及完全不飽和環鍵。另外，對于雜環烷基來說，雜原子可占據雜環與分子的其余部分連接的位置。環垸基的實例包括(但不限于)環戊基、環己基、l-環己烯基、3-環己烯基、環庚基等等。雜環烷基的實例包括(但不限于)l-(l,2,5,6-四氫吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、l-哌嗪基、2-哌嗪基等等。另外，所述術語涵蓋雙環和三環環結構。類似地，術語"亞雜環烷基"(自身或作為另一取代基的部分)表示衍生自雜環垸基的二價基團，且術語"亞環垸基"(自身或作為另一取代基的部分)表示衍生自環垸基的二價基團。如本文中所用，"變性劑"經定義為會造成蛋白質可逆性伸展的任何化合物或物質。變性劑的濃度將會由特定變性劑的性質和濃度決定。適合變性劑可為離液劑(chaotrope)、清潔劑、有機溶劑、水可混溶性溶劑、磷脂或兩種或兩種以上這些試劑的組合。適合離液劑包括(但不限于)尿素、胍和硫氰酸鈉。有用清潔劑可包括(但不限于)強清潔劑，例如十二烷基硫酸鈉或聚氧乙烯醚(例如Tween或Triton清潔劑)、Sarkosyl;溫和非離子型清潔劑(例如，毛地黃皂苷(digitonin));溫和陽離子型清潔劑，例如N-》,3-(二油烯基氧基)-丙基-N,N,N-三甲基銨；溫和離子型清潔劑(例如膽酸鈉或脫氧膽酸鈉)；或兩性離子型清潔劑，其包括(但不限于)硫代甜菜堿(Zwittergent)、3-(3-氯酰胺基丙基)二甲基氨基-l-丙垸硫酸鹽(CHAPS)和3-(3-氯酰胺基丙基)二甲基氨基-2-羥基-l-丙垸磺酸鹽(CHAPSO)。例如乙腈、低級垸醇(尤其C2-C4垸醇，例如乙醇或異丙醇)或低級垸二醇(尤其C2-C4烷二醇，例如乙二醇)的有機、水可混溶性溶劑可用作變性劑。適用于本文中所述的方法和組合物中的磷脂可為天然存在磷脂，例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇；或合成磷脂衍生物或變體，例如二己酰基磷脂酰膽堿或二庚酰基磷脂酰膽堿。如本文中所用的術語"所需官能團"指的是以下群組中的任何一種或全部標記；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交聯劑；細胞毒性化合物；藥物；親和性標記；放射性核素；生物素的衍生物；量子點；納米傳遞素；放射性傳遞素；光親和性標記；反應性化合物；樹脂；第二蛋白質或多肽或多肽類似物；抗體或抗體片段；金屬螯合劑；輔因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA;RNA;反義聚核苷酸；糖類、水溶性樹枝狀聚合物、環糊精、生物材料；納米粒子；自旋標記；熒光團、含金屬的部分；放射性部分；新穎官能團；與其它分子共價或非共價相互作用的基團；光籠蔽部分；可光化輻射激發的部分；配體；可光異構化部分；生物素；生物素類似物；結合有重原子的部分；可化學裂解的基團；可光裂解的基團；延長的側鏈；碳鍵聯的糖；氧化還原活性劑；氨基硫代酸；毒性部分；經同位素標記的部分；生物物理探針；磷光基團；化學發光基團；電子致密基團；磁性基團；插入基團；發色團；能量轉移劑；生物活性劑；可檢測標記；小分子；抑制性核糖核酸，和上述物質的任何組合。如本文中所用的術語"二羰基"指的是含有至少兩個選自由-C(O)-、-S(O)-、-S(0)2-和-C(S)-組成的群組的部分的基團，其包括(但不限于)1,2-二羰基、1,3-二羰基和1,4-二羰基，以及含有至少一個酮基和/或至少一個醛基和/或至少一個酯基和/或至少一個羧酸基團和/或至少一個硫酯基的基團。這些二羰基包括二酮、酮醛、酮酸、酮酯和酮硫酯。另外，這些基團可為線性、分枝或環狀分子的部分。二羰基中的兩個部分可相同或不同，且可包括會在兩個部分的任一個處產生(僅舉例來說)酯、酮、醛、硫酯或酰胺的取代基。如本文中所用的術語"有效量"指的是所投與的(經修飾)非天然氨基酸多肽的量，所述量將在一定程度上減輕欲治療的疾病、病狀或病癥的一種或一種以上癥狀。可投與含有本文中所述的(經修飾)非天然氨基酸多肽的組合物來進行預防性、增強性和/或治療性治療。術語"增強"表示所需效應的程度、量、效力或持續時間增加或延長。因此，對于增強治療劑的效應來說，術語"增強"指的是增加或延長其它治療劑對系統的效應的效力或持續時間的能力。如本文中所用，"增強有效量"指的是足以增強另一治療劑在所需系統中的效應的量。當用于患者中時，對于此用途有效的量將視以下因素而定疾病、病癥或病狀的嚴重性和病程、先前療法、患者的健康狀況和對藥物的反應和主治醫師的判斷。如本文中所用，術語"真核生物"指的是屬于種系發生學真核域(domainEucarya)的生物體，例如動物(包括(但不限于)哺乳動物、昆蟲、爬行動物、鳥類等)、纖毛蟲、植物(包括(但不限于)單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母、鞭毛蟲、微孢子蟲、原生生物等。術語"官能團"、"活性部分"、"活化基團"、"離去基"、"反應性位點"、"化學反應性基團"和"化學反應性部分"用于所屬
技術領域：
中和本文中是指分子的獨特的可定義部分或單元。這些術語在化學技術中有些同義且用在本文中來指示實施一些功能或活性且可與其它分子反應的分子部分。術語"鹵素"包括氟、氯、碘和溴。除非另外說明，否則術語"雜垸基"(自身或與另一術語組合)表示由指定數目的碳原子和至少一個選自由O、N、Si和S組成的群組的雜原子組成的穩定直鏈或支鏈或環狀烴基或其組合，且其中氮和硫原子可視情況經氧化且氮雜原子可視情況經季銨化。雜原子0、N和S和Si可位于雜烷基的任何內部位置或烷基與分子的其余部分連接的位置處。實例包括(但不限于)-CH2-CH2-0-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(0)-CH3、-CH2-CH2-S(0)2-CH3、-CH=CH-0-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3和-CH=CH-N(CH3)-CH3。至多兩個雜原子可為連續的，例如，-CH2-NH-OCH3和-CH2-0-Si(CH3)3。類似地，術語"亞雜垸基"(自身或作為另一取代基的部分)表示由雜垸基衍生的二價基團，例如(但不限于)-(3112-(:112-3《112-(:112-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。對于亞雜烷基來說，相同或不同雜原子也可占據鏈末端的一端或兩端(包括(但不限于)亞垸基氧基、亞垸基二氧基、亞烷基氨基、亞烷基二氨基、氨氧基亞烷基等等)。此外，對于亞烷基和亞雜烷基鍵聯基團來說，由鍵聯基團的化學式書寫的方向來暗示鍵聯基團的無方向性。舉例來說，式-C(0)2R'-表示-C(0)2R'-與-R'C(0)2-。在兩個或兩個以上核酸或多肽序列的上下文中，術語"一致"或"一致性"百分比指的是相同的兩個或兩個以上序列或子序列。當經比較窗口比較且比對最大符合或如使用以下序列比較算法(或所屬領域的一般技術人員可用的其它算法)中的一種或通過手工比對且目測檢査所測量指定區域時，如果其具有相同(即，在指定區域上約60%—致性、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%—致性)的氨基酸殘基或核苷酸百分比，那么序列為"實質上一致"。此定義也指測試序列的補體。一致性可存在于長度為至少約50個氨基酸或核苷酸的區域上，或長度為75-100個氨基酸或核苷酸的區域上，或(在未指定時)在聚核苷酸或多肽的整個序列上。對于序列比較來說，通常一個序列充當與測試序列相比較的參考序列。在使用序列比較算法時，將測試序列與參考序列輸入計算機中，必要時指定子序列坐標，且指定序列算法程序參數。可使用默認程序參數，或可指定替代參數。隨后序列比較算法根據程序參數計算測試序列相對于參考序列的序列一致性百分比。當應用于核酸或蛋白質時，術語"經分離"表示核酸或蛋白質不含至少一些在天然狀態下與其相締合的細胞組分，或核酸或蛋白質己經濃縮到大于其活體內或活體外制備濃度的程度。其可為均質狀態。經分離物質可為干燥或半干燥狀態，或為溶液(包括(但不限于)水溶液)形式。其可為包含額外醫藥學上可接受的載劑和/或賦形劑的醫藥組合物的組分。通常使用例如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜的分析化學技術來測定純度和均質性。作為制劑中存在的主要物質的蛋白質實質上經純化。具體來說，經分離基因是與側接基因且編碼除所關注基因之外的蛋白質的開放閱讀框分離。術語"經純化"表示核酸或蛋白質在電泳凝膠中產生實質上一個條帶。具體來說，其可表示核酸或蛋白質為至少85%純、至少90%純、至少95%純、至少99%純或更純。術語"鍵"或"連接子"用在本文中是指通常由于化學反應形成且通常為共價鍵的基團或鍵(產生此鍵或連接子的過程在本文中稱作鍵聯或偶合，以及所屬領域的技術人員認可的其它同義詞)。水解穩定鍵表示鍵在水中實質上穩定且在有用pH值下(包括(但不限于)在生理條件下)長時期地、或許甚至無限期地不與水反應。水解不穩定或可降解鍵表示鍵可在水或水溶液(例如包括血液)中降解。酶促不穩定或可降解鍵表示鍵可由一種或一種以上酶降解。如在所屬
技術領域：
中所了解，PEG和相關聚合物在聚合物主鏈中或在聚合物主鏈與聚合物分子的一個或一個以上末端官能團之間的連接子基團中可包括可降解鍵。舉例來說，由PEG羧酸或活化PEG羧酸與生物活性劑上的醇基反應所形成的酯鍵在生理條件下通常水解以釋放藥劑。其它可水解降解鍵包括(但不限于)碳酸酯鍵；由胺與醛反應所產生的亞胺鍵；由醇與磷酸酯基反應所形成的磷酸酯鍵；作為酰肼與醛的反應產物的腙鍵；作為醛與醇的反應產物的縮醛鍵；作為甲酸酯與醇的反應產物的原酸酯鍵；由胺基(包括(但不限于)例如PEG的聚合物末端處的胺基)與肽的羧基形成的肽鍵；和由亞磷酰胺基(包括(但不限于)聚合物末端處的亞磷酰胺基)與寡核苷酸的5'羥基形成的寡核苷酸鍵。如本文中所用，術語"培養基"包括可支撐或含有任何宿主細胞(包括細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞、植物宿主細胞、真核宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、CHO細胞、原核宿主細胞、大腸桿菌(￡.co//)或假單胞菌(Ae"&mo"w)宿主細胞)和細胞內含物的任何培養基、溶液、固體、半固體或剛性支撐物。因此，所述術語可涵蓋宿主細胞已生長于其中的培養基，例如多肽己分泌入其中的培養基，其包括在增殖步驟之前或之后的培養基。所述術語也可涵蓋含有宿主細胞溶菌液的緩沖液或試劑，例如在多肽在細胞內產生且宿主細胞溶解或破裂以釋放多肽的情況下。本文中揭示的(經修飾)非天然氨基酸多肽的"代謝物"為當(經修飾)非天然氨基酸多肽代謝時所形成的所述(經修飾)非天然氨基酸多肽的衍生物。術語"活性代謝物"指的是當(經修飾)非天然氨基酸多肽代謝時所形成的所述(經修飾)非天然氨基酸多肽的生物活性衍生物。術語"代謝"指的是特定物質由生物體改變的過程的和(包括(但不限于)水解反應和由酶催化的反應)。關于代謝的其它信息可獲自ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,第9版，McGraw-Hill(1996)。可通過向宿主投與(經修飾)非天然氨基酸多肽且分析來自所述宿主的組織樣品，或通過在活體外用肝細胞培養(經修飾)非天然氨基酸多肽且分析所得化合物來鑒別本文中揭示的(經修飾)非天然氨基酸多肽的代謝物。如本文中所用的術語"經修飾"指的是在多肽上存在翻譯后修飾。形式"(經修飾)"術語表示所述多肽視情況經修飾，也就是說，所討論多肽可經修飾或未經修飾。如本文中所用，術語"經調節的血清半衰期"表示經修飾多肽相對于其未經修飾形式的循環半衰期的陽性或陰性變化。通過在投與多肽后多個時間點取血樣且測定各樣品中所述分子的濃度來測量血清半衰期。血清濃度與時間的相互關系使得可計算血清半衰期。希望增加的血清半衰期具有至少約兩倍的增加，但較小增加也可為有用的，例如在其能夠促成令人滿意的給藥方案或避免毒性作用的情況下。在一些實施例中，增加為至少約3倍、至少約5倍或至少約IO倍。如本文中所用的術語"經調節的治療半衰期"表示治療有效量的經修飾多肽相對于其未經修飾形式的半衰期的陽性或陰性變化。通過在投與后多個時間點測量多肽的藥物動力學和/或藥效性質從而來測量治療半衰期。希望增加的治療半衰期能夠促成特定有益給藥方案、特定有益總劑量或避免不良效應。在一些實施例中，增加的治療半衰期是由效力增加、經修飾分子與其標耙的結合增加或降低、分子由酶(例如蛋白酶)分解增加或降低、或未經修飾分子的另一參數或作用機制的增加或降低而產生。如本文中所用，術語"非真核生物"指的是非真核生物體。舉例來說，非真核生物體可屬于種系發生學真細菌域(包括(但不限于)大腸桿菌(&c/^n'c/^co/0、極端嗜熱菌(77zermz^1/7ze/7wo//u7z^)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(5a"7/wsAer附op/n7t^)、熒光假單胞菌(/^ewfitomowosywo^escew50、纟錄胺桿菌(尸sewcfomon(XSaen^giwosaO、惡臭假單胞菌(尸w"由mo"wpW^)等)或種系發生學古菌域(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌(M"/jflwococc^ya朋oscW)、嗜熱自養甲烷桿菌(M"/awo6fl"e"'簡Aerwocmfo^op/z/cww)、嗜鹽菌(i7a/o6fl"en'ww)(例如沃氏富饒鹽菌(//ia/o/emxvo/ca/z')和嗜鹽菌種iV及C-/)、閃爍古生球菌(Ac/zfleog/o6M/M/gWM)、超高溫古生菌強烈熾熱球菌(/V。cocciw/w〃'o愿)、超嗜熱古菌(尸戸coc麵/zo"'A:o^7)、超嗜熱菌敏捷氣熱菌"非天然氨基酸"指的是并非20種常見氨基酸或焦賴氨酸或硒半胱氨酸中的一種的氨基酸，可與術語"非天然氨基酸"同義使用的其它術語為"非天然編碼氨基酸"、"非天然氨基酸"、"非天然存在氨基酸"和其各種帶連字符和不帶連字符形式。術語"非天然氨基酸"包括(但不限于)通過修飾天然編碼氨基酸(包括(但不限于)20種常見氨基酸或焦賴氨酸和硒半胱氨酸)天然存在，但其自身并不通過翻譯復合物并入生長多肽鏈中的氨基酸。非天然編碼的天然存在氨基酸的實例包括(但不限于)N-乙酰基葡糖胺基-L-絲氨酸、N-乙酰基葡糖胺基-L-蘇氨酸和O-磷酸酪氨酸。術語"核酸"指的是單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸和其聚合物。除非特定限制，否則所述術語涵蓋含有天然核苷酸的己知類似物的核酸，所述核酸具有與參考核酸相似的結合性質且以類似于天然存在核苷酸的方式代謝。除非另外具體限制，否則所述術語也指寡核苷酸類似物，其包括PNA(肽核酸)、反義技術中使用的DNA類似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等等)。除非另外說明，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守性修飾變體(包括(但不限于)簡并密碼子取代)和互補序列和明確指示的序列。具體來說，通過產生一種或一種以上經選定(或所有)密碼子的第三位置是經混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現簡并密碼子取代(Batzer等人，A^c/e/ci仏19:5081(1991);Ohtsuka等人，/5/。/.CAem.260:2605-2608(1985);和Rossolini等人，Mo/.Ce〃.Pra6es8:91-98(1994))。如本文中關于蛋白質再折疊所用的"氧化劑"經定義為能夠從所氧化化合物去除電子的任何化合物或物質。適合氧化劑包括(但不限于)氧化谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化二硫蘇糖醇、氧化赤蘚糖醇和氧。多種氧化劑適用于本文中所述的方法和組合物中。如本文中所用，術語"聚烷撐二醇"指的是聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。術語"聚烷撐二醇"涵蓋線性聚合物與分枝聚合物且平均分子量介于O.lkDa與100kDa之間。其它示范性實施例列于(例如)商業供應商目錄中，例如ShearwaterCorporation的目錄"PolyethyleneGlycolandDerivativesforBiomedicalApplications"(2001)。術語"多肽"、"肽"和"蛋白質"可在本文中互換使用來指示氨基酸殘基的聚合物。也就是說，針對多肽的描述同樣適用于對肽的描述和對蛋白質的描述，且反之亦然。所述術語適用于天然存在氨基酸聚合物以及一個或一個以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所用，所述術語涵蓋任何長度的氨基酸鏈(包括全長蛋白質)，其中氨基酸殘基是通過共價肽鍵鍵聯。術語"經翻譯后修飾"指的是在天然或非天然氨基酸已并入多肽鏈中之后，對所述氨基酸發生的天然或非天然氨基酸的任何修飾。僅舉例來說，所述術語涵蓋共翻譯活體內修飾、共翻譯活體外修飾(例如在不含細胞的翻譯系統中)、翻譯后活體內修飾和翻譯后活體外修飾。"前藥"指的是在活體內轉變為母體藥物的藥劑。前藥通常為有用的，因為在一些情況下，其可比母體藥物更易于投與。舉例來說，其可通過口服投藥生物利用，而母體藥物不可以。前藥也可具有優于母體藥物的改良的于醫藥組合物中的溶解性。前藥包括活性藥物的藥理學非活性或活性降低的衍生物。前藥可經設計用于調節藥物或生物活性分子的量，其通過操縱藥物的性質(例如物理化學性質、生物醫藥性質或藥物動力學性質)到達所需作用部位。前藥通過酶促或非酶促反應在體內轉變為活性藥物。前藥可提供改良的物理化學性質(例如更好溶解性)、增強的傳遞特性(例如特異性靶向特定細胞、組織、器官或配體)和改良的藥物治療值。在預防性應用中，將含有(經修飾)非天然氨基酸多肽的組合物投與易患上特定疾病、病癥或病狀或以其它方式處于特定疾病、病癥或病狀的風險中的患者。所述量經定義為"預防有效量"。在此使用中，精確量也視患者的健康狀況、體重等等而定。認為通過常規實驗(例如，劑量遞增臨床試驗)確定所述預防有效量在所屬領域的技能范圍內。術語"經保護"指的是存在防止化學反應性官能團在特定反應條件下發生反應的"保護基"或部分。保護基將會視欲保護的化學反應性基團的類型而改變。舉例來說，如果化學反應性基團為胺或酰肼，那么保護基可選自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群組。如果化學反應性基團為硫醇，那么保護基可為鄰吡啶基二硫化物。如果化學反應性基團為羧酸(例如丁酸或丙酸)或羥基，那么保護基可為芐基或例如甲基、乙基或叔丁基的烷基。所屬
技術領域：
中已知的其它保護基(包括對光不穩定的基團，例如Nvoc和MeNvoc)也可用于本文中所述的方法和組合物中或由其使用。僅舉例來說，阻斷/保護基團可選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>其它保護基描述于Greene禾口Wuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,第3版,JohnWiley&Sons,NewYork,NY,1999中，其是以引用的方式全部并入本文中。"重組宿主細胞"或"宿主細胞"指的是不管何種方法用于插入(例如，直接攝取、轉導、f配對或所屬
技術領域：
中用于產生重組宿主細胞的其它方法)，包括外源聚核苷酸的細胞。外源聚核苷酸可保持為非整合載體(例如，質粒)或者可整合入宿主基因組中。如本文中關于蛋白質再折疊所用的"還原劑"經定義為將巰基保持在還原狀態且還原分子內或分子間二硫鍵的任何化合物或物質。適合還原劑包括(但不限于)二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和還原谷胱甘肽。多種還原劑適用于本文中所述的方法和組合物中。如本文中所用的"再折疊"描述將含有二硫鍵的多肽由不當折疊或展開狀態轉化為二硫鍵的天然或適當折疊構象的任何過程、反應或方法。短語"與……選擇性(或特異性)雜交"指的是當復雜混合物(包括(但不限于)總細胞DNA或RNA或文庫DNA或RNA)中存在特定核苷酸序列時，在嚴格雜交條件下分子僅與所述序列結合、二聯或雜交。短語"嚴格雜交條件"指的是在如所屬
技術領域：
中己知的低離子強度和高溫條件下DNA、RNA、PNA或其它核酸模擬物或其組合的序列的雜交。通常，在嚴格條件下，探針將與核酸的復雜混合物(包括(但不限于)總細胞DNA或RNA或文庫DNA或RNA)中的其靶子序列雜交，但不與復雜混合物中的其它序列雜交。嚴格條件具序列依賴性且在不同環境下會不同。較長序列在較高溫度下特異性雜交。對核酸雜交的廣泛指導見于Tijssen，Z/Of6oro^or_y7fec/w/《wes5z'oc/e/w/s^yawJA/o/ecw/ar—場6nWz'zfl/iowwzYA_W<c/eiciVo&es,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)中。對于在指定離子強度pH值下的特異性序列來說，嚴格條件通常經選定為低于熱熔點(Tm)約5°C-10'C。Tm為與標靶互補的探針的50%與靶序列雜交處于平衡(因為靶序列過量存在，所以在Tm下，在平衡時占據50%的探針)時的溫度(在指定離子強度、pH值和核酸濃度下)。嚴格條件可為在pH值7.0到8.3下鹽濃度小于約l.OM鈉離子、通常約0.01M到1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)且溫度對于短探針(包括(但不限于)10到50個核苷酸)來說為至少約30'C且對于長探針(包括(但不限于)大于50個核苷酸)來說為至少約6(TC的條件。也可通過添加諸如甲酰胺的去穩定劑來實現嚴格條件。對于選擇性或特異性雜交來說，正信號可為至少兩倍背景、視情況10倍背景雜交。示范性嚴格雜交條件可為如下50%甲酰胺、5xSSC和1%SDS，在42'C下培養；或5xSSC、1%SDS，在65'C下培養，其中在65。C下在0.2xSSC和0.1%SDS中洗滌。這些洗滌可進行5、15、30、60、120分鐘或更長時間。如本文中所用，術語"個體"指的是動物，在一些實施例中為哺乳動物，且在其它實施例中為人類，其為治療、觀察或實驗的對象。術語"實質上經純化"指的是可實質上或基本上不含通常伴隨可見于多肽天然存在環境(即天然細胞，或者在重組產生多肽的情況下為宿主細胞)中的蛋白質或與可見于多肽天然存在環境中的蛋白質相互作用的組分的多肽。可實質上不含細胞物質的多肽包括具有小于約30%、小于約25%、小于約20%、小于約15%、小于約10%、小于約5%、小于約4%、小于約3%、小于約2%或小于約1%(以干重計)的污染蛋白的蛋白制劑。當多肽或其變體是由宿主細胞重組產生時，蛋白質可以細胞干重的約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1%或更少存在。當多肽或其變體是由宿主細胞重組產生時，蛋白質可以細胞干重計約5g/L、約4g/L、約3g/L、約2g/L、約1g/L、約750mg/L、約500mg/L、約250mg/L、約100mg/L、約50mg/L、約10mg/L或約lmg/L或更小存在于培養基中。因此，如由本文中所述的的方法所產生的"實質上經純化"多肽可具有如由適當方法(例如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛細管電泳)所測定至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%的純度級別，具體來說至少約75%、80%、85%的純度級別，且更具體來說至少約90%的純度級別、至少約95%的純度級別、至少約99%或更大的純度級別。術語"取代基"包括(但不限于)"無干擾取代基"。"無干擾取代基"為產生穩定化合物的基團。適合的無干擾取代基或基團包括(但不限于)鹵基、d-do烷基、C2-C10烯基、C2-Cu)炔基、d-do烷氧基、CVd2芳烷基、C3-d2環烷基、C4-Cu環烯基、苯基、經取代苯基、甲苯酰基、二甲苯基、聯苯基、C2-d2垸氧基垸基、C5-d2垸氧基芳基、Cs-d2芳氧基垸基、C7-d2氧基芳基、d-C6烷基亞磺酰基、垸基磺酰基、-(<3112)1-0-((:1-0:1()烷基)(其中m為i到8)、芳基、經取代芳基、經取代烷氧基、氟烷基、雜環基、經取代雜環基、硝基垸基、-N02、-CN、-NRC(O)-(C廣do垸基)、-C(O)-(Ci-C10烷基)、C2-d。烷基硫烷基、-C(O)O-(d-do垸基)、-OH、-S02、=S、-COOH、-NR2、羰基、-C(O)-(d-d。垸基)-CF3、-C(0)-CF3、-C(0)NR2、-(C廣do芳基)-S-(CVCk)芳基)、-C(0)-(C6-do芳基)、-(CH2)m-0-(-(CH2VO-(C廣CK)烷基)(其中各m為1到8)、-C(0)NR2、-C(S)NR2、-S02NR2、-NRC(0)NR2、-NRC(S)NR2、其鹽等等。前述列表中的各R基團獨立地選自由H、垸基或經取代垸基、芳基或經取代芳基或垸芳基組成的群組。如果取代基是由從左向右書寫的其常規化學式指定，那么其同樣涵蓋從右向左書寫結構所得到的化學上相同的取代基，例如，《1120-等同于-0(:112-。垸基和雜垸基(包括通常被稱作亞垸基、烯基、亞雜烷基、雜烯基、炔基、環垸基、雜環烷基、環烯基和雜環烯基的基團)的取代基可為選自(但不限于)以下各基團的多種基團中的一種或一種以上-OR、=0、=NR、-N-OR、-NR2、-SR、-卣素、-SiR3、-OC(O)R、-C(O)R、-C02R、-CONR2、-OC(0)NR2、-NRC(O)R、-NR-C(0)NR2、-NR(0)2R、-NR-C(NR2)=NR、陽S(O)R、-S(0)2R、-S(0)2NR2、-NRS02R、-CN和-冊2，其數目在0到(2m'+l)的范圍內，其中m'為此基團中碳原子的總數。前述列表中的各R基團獨立地選自由氫、經取代或未經取代雜烷基、經取代或未經取代芳基(包括(但不限于)經1-3個鹵素取代的芳基)、經取代或未經取代烷基、烷氧基或硫烷氧基或芳烷基組成的群組。當兩個R基團與同一個氮原子連接時，其可與氮原子組合形成5元、6元或7元環。舉例來說，-NR2打算包括(但不限于)1-吡咯垸基和4-嗎啉基。根據對取代基的上述論述，所屬領域的一般技術人員將了解術語"垸基"打算包括包含與除氫基之外的基團結合的碳原子的基團，例如鹵烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(0)CH3、-C(0)CF3、-(3(0)<:1120013等等)。與關于垸基所述的取代基類似，芳基和雜芳基的取代基經改變且選自(但不限于)陽OR、=0、=NR、=N-OR、-NR2、-SR、-卣素、-SiR3、-OC(O)R、-C(O)R、-C02R、-CONR2、-OC(0)NR2、-NRC(O)R、-NR-C(0)NR2、-NR(0)2R、-NR-C(NR2)=NR、-S(O)R、-S(0)2R、-S(0)2NR2、-NRS02R、-CN、-N02、-R、-N3、-CH(Ph)2、氟(d-Q)烷氧基和氟(C廣C4)烷基，其數目在O到芳香族環系統上開放價態的總數的范圍內；且其中前述列表中的各R基團獨立地選自氫、烷基、雜烷基、芳基和雜芳基。在治療性應用中，將足以治愈或至少部分抑制疾病、病癥或病狀的癥狀的量的含有(經修飾)非天然氨基酸多肽的組合物投與巳罹患所述疾病、病狀或病癥的患者。所述量經定義為"治療有效量"，且將視以下因素而定疾病、病癥或病狀的嚴重性和病程、先前療法、患者的健康狀況和對藥物的反應以及主治醫師的判斷。認為通過由常規實驗(例如，劑量遞增臨床試驗)確定所述治療有效量在所屬領域的技能范圍內。術語"治療"用于指預防性和/或治療性治療。如本文中所用，術語"水溶性聚合物"指的是可溶于水性溶劑中的任何聚合物。水溶性聚合物與多肽的鍵聯可產生以下改變，其包括(但不限于)相對于未經修飾形式增加或經調節的血清半衰期或增加或經調節的治療半衰期、經調節的免疫原性、經調節的物理締合特性(例如聚集和多聚體形成)、改變的受體結合、改變的與一種或一種以上結合搭配物的結合和改變的受體二聚合或多聚。水溶性聚合物可具有或可不具有其自身生物活性。適合聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其單C!-Cn)烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美國專利第5,252,714號中，其是以引用的方式并入本文中)、單甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯醚馬來酸酐、AK2-羥基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纖維素和纖維素衍生物(包括(但不限于)甲基纖維素和羧甲基纖維素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚烷撐二醇和其衍生物、聚烷撐二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚以及a-p-聚[(2-羥基乙基)-DL-天冬酰胺等等或其混合物。這些水溶性聚合物的實例包括(但不限于)聚乙二醇和血清白蛋白。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。聚合物的分子量可為寬范圍，其包括(但不限于)介于約100Da與約100,000Da或更大之間。聚合物的分子量可介于約100Da與約100,000Da之間，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80，000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8，000Da、7，000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、卯0Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約100Da與約50,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約100Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約1,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約5,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約IO，OOODa與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚乙二醇分子為分枝聚合物。支鏈PEG的分子量可介于約1,000Da與約100,000Da之間，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和l，OOODa。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量介于約1,000Da與約50,000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量介于約1,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量介于約5,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量介于約5,000Da與約20,000Da之間。除非另外說明，否則使用在所屬
技術領域：
的技能范圍內的質譜、NMR、HPLC、蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術和藥理學的常規方法。在本文中呈示的化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、(經修飾)非天然氨基酸多肽和用于制備任何前述化合物的試劑)包括經同位素標記的化合物，其與以本文中呈示的各種式和結構中所述的化合物相同，但一個或一個以上原子經具有與通常可見于自然界中的原子質量或質量數不同的原子質量或質量數的原子置換。可并入本發明化合物中的同位素的實例包括氫、碳、氮、氧、氟和氯的同位素，分別為例如211、3H、13C、14C、15N、180、170、35S、8F、36C1。本文中所述的某些經同位素標記化合物(例如3H和"C的放射性同位素并入其中的化合物)可用于藥物和/或底物組織分布分析中。此外，經例如氘(即&)的同位素取代可得到由較高代謝穩定性產生的某些治療優點，例如活體內半衰期增加或劑量需求降低。本文中的一些化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、(經修飾)非天然氨基酸多肽和用于制備任何前述化合物的試劑)具有不對稱碳原子且因此可以對映異構體或非對映異構體形式存在。可根據其物理化學差異通過已知方法(例如，色譜和/或分級結晶)將非對映異構混合物分離為其個別非對映異構體。可通過與適當光學活性化合物(例如，醇)反應將對映異構混合物轉變為非對映異構混合物，分離出非對映異構體且將個別非對映異構體轉變(例如，水解)為相應純對映異構體而將對映異構體分離。包括非對映異構體、對映異構體和其混合物的所有這些異構體均被視作本文中所述的組合物的部分。在額外或其它實施例中，本文中所述的化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、(經修飾)非天然氨基酸多肽和用于制備任何前述化合物的試劑)是以前藥形式使用。在額外或其它實施例中，本文中所述的化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、(經修飾)非天然氨基酸多肽和用于制備任何前述化合物的試劑)在投與需要產生代謝物的生物體之后代謝，所述代謝物隨后用于產生所需效應，包括所需治療效應。在其它或額外實施例中為非天然氨基酸和(經修飾)非天然氨基酸多肽的活性代謝物。本文中所述的方法和調配物包括使用非天然氨基酸和(經修飾)非天然氨基酸多肽的N-氧化物、結晶形式(也被稱作多晶型物)或醫藥學上可接受的鹽。在一些情況下，非天然氨基酸和(經修飾)非天然氨基酸多肽可以互變異構體形式存在。所有互變異構體均包括于本文中呈示的非天然氨基酸和(經修飾)非天然氨基酸多肽的范圍內。另外，本文中所述的非天然氨基酸和(經修飾)非天然氨基酸多肽可以非溶劑化物形式以及與醫藥學上可接受的溶劑(例如水、乙醇等等)形成的溶劑化物形式存在。本文中呈示的非天然氨基酸和(經修飾)非天然氨基酸多肽的溶劑化物形式也視為揭示于本文中。所屬領域的一般技術人員將認識到本文中的一些化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、(經修飾)非天然氨基酸多肽和用于制備任何前述化合物的試劑)可以若干互變異構形式存在。所有這些互變異構形式均被視作本文中所述的組合物的部分。此外，例如本文中的任何化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、(經修飾)非天然氨基酸多肽和用于制備任何前述化合物的試劑)的所有烯醇-酮形式均被視作本文中所述的組合物的部分。本文中的一些化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、(經修飾)非天然氨基酸多肽和用于制備任何前述化合物的試劑)具有酸性且可與醫藥學上可接受的陽離子形成鹽。本文中的一些化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、(經修飾)非天然氨基酸多肽和用于制備任何前述化合物的試劑)可具有堿性且因此可與醫藥學上可接受的陰離子形成鹽。包括二鹽的所有這些鹽在本文中所述的組合物的范圍內且其可通過常規方法來制備。舉例來說，鹽可通過在水性、非水性或部分水性介質中使酸性實體與堿性實體接觸來制備。通過使用至少一種以下技術來回收鹽過濾；用非溶劑沉淀，接著過濾；蒸發溶劑；或(在水溶液的情況下)凍干。鹽(例如)包括(1)與無機酸或有機酸形成的酸加成鹽，所述無機酸為例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等；所述有機酸為例如乙酸、丙酸、己酸、環戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基雙環-[2.2.2]辛-2-烯-l-羧酸、葡庚糖酸、4,4'-亞甲基雙-(3-羥基-2-烯-l-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羥基萘酸、水楊酸、硬脂酸、粘糠酸等等；(2)當母體化合物中存在的酸性質子經金屬離子(例如堿金屬離子、堿土金屬離子或鋁離子)置換；或與有機堿配位時形成的鹽。可接受的有機堿包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、緩血酸胺、N-甲基葡糖胺等等。可接受的無機堿包括氫氧化鋁、氫氧化鈣、氫氧化鉀、碳酸鈉、氫氧化鈉等等。應了解，鹽的提及包括其溶劑加成形式或晶體形式，尤其為溶劑化物或多晶型物。溶劑化物含有化學計量或非化學計量量的溶劑，且通常在結晶過程中形成。當溶劑為水時形成水合物，或當溶劑為醇時形成醇化物。多晶型物包括相同元素組成的化合物的不同晶體填充排列。多晶型物通常具有不同X射線衍射圖案、紅外光譜、熔點、密度、硬度、晶體形狀、光學性質和電學性質、穩定性和溶解性。例如重結晶溶劑、結晶速率和存儲溫度的各種因素可使得單一晶體形式占優勢。本文中提及的所有公開案和專利都是出于描述和揭示(例如)公開案中所述的構想和方法的目的以引用的方式并入本文中，其可結合目前描述的發明一起使用。作為一個實例，以下專利申請案經全文揭示60/638,418;60/696,210;60/638,527;60/696,302;60/639,195;60/696,068;6(V755,338;60〃55,711;60/755,018;60簡,041;6(V743,040;60/734,589;11/313,956;11/313,306;和11/313,305。本文中所述的公開案僅在本申請案的申請日期之前提供其揭示內容。本文中任何事物都不應理解為承認本文中所述的發明人由于先前發明或出于任何其它原因而經授權提前本發明。通過參考提出說明性實施例的以下詳細描述可獲得對本發明的方法和組合物的特征和優點的更好理解，所述實施例中利用我們的方法、組合物、設備和裝置的原理，且附隨圖式為圖l呈示本文中所述的方法、組合物、策略和技術的某些方面的關系的示意性代表圖。圖2呈示在不同摩爾比率下使用2K同雙官能羥胺PEG連接子的scFv108的單步二聚合反應的SDS-PAGE分析的非限制性實例1)scFv:連接子=1.6:1，具有乙酰肼；2)scFv:連接子=2:1，具有乙酰肼；3)scFv:連接子=2.4:1，具有乙酰肼；4)scFv:連接子=2:1，不具有乙酰肼；5)scFv:連接子=2:1，具有乙酰肼，不具有PEG連接子。圖3呈示scFv-pAcF與30K單羥胺PEG接合的SDS-PAGE分析的非限制性實例1)100%起始scFv-pAcF的標準物；2)20%起始scFv-pAcF的標準物；3)10%起始scFv-pAcF的標準物；4)scFv:PEG=1:3，具有20mM乙酰肼；5)scFv:PEG=1:3，不具有乙酰肼；6)scFv:PEG=1:5，具有20mM乙酰肼；7)scFv:PEG=1:5，不具有乙酰肼。圖4呈示在不同濃度的乙酰肼下scFv-pAcF與30K單羥胺PEG接合的SDS-PAGE分析的非限制性實例。1)scFv-pAcF:PEG=1:2，5mM乙酰肼；2)scFv-pAcF:PEG=1:2，20mM乙酰肼；3)scFv-pAcF:PEG1:2，80mM乙酰肼；4)scFv-pAcF:PEG=1:5，無乙酰肼；5)10%scFv-pAcF的標準物；6)20%scFv-pAcF的標準物；7)100%)scFv-pAcF的標準物。圖5呈示可用于本文中所述的方法、反應和合成中的促進劑的非限制性實例。圖6呈示比較在存在不同促進劑的情況下肟的形成的SDS-PAGE分析的非限制性實例；色帶號對應于圖5中的促進劑號且最后一條色帶為不具有促進劑的對照反應。圖7呈示在具有促進劑7和促進劑20的情況下hGH-pAcF與30K單羥胺PEG接合的SDS-PAGE分析的非限制性實例l)hGH-pAcF:PEG=1:2，具有促進劑7;2)hGH-pAcFPEG=1:2，具有促進劑20;3)hGH-pAcF:PEG=1:2,無促進劑；4)hGH-pAcF:PEG=1:5，無促進劑。圖8呈示用不同濃度的促進劑乙酰肼培養的hGH的LCMS分析的非限制性實例A)整個LCMS跡線；B)不具有促進劑的hGH的質譜；C)具有200mM促進劑乙酰肼的hGH的質譜。圖9呈示可用于本文中所述的方法、反應和合成中的促進劑的非限制性實例。圖10a呈示在存在促進劑的情況下由典型酮與典型羥胺反應形成典型肟的非限制性反應；圖10b呈示可用于本文中所述的方法、反應和合成中的促進劑的非限制性實例。圖11呈示在不存在和存在本文中所述的各種促進劑的情況下進行的典型反應的肟產率的非限制性集合。具體實施方式J.與/0近年來，已報道蛋白質科學中的全新技術，其希望克服眾多與蛋白質的位點特異性修飾相關的限制。具體來說，已將新穎組分添加到原核生物大腸桿菌(例如，L.Wang等人，(2001),Science292:498-500)和真核細胞釀酒酵母(Sflcc/zramyc^ce"v/w'ae;S.ce"v/w'ae)(例如，J.Chin等人，Science301:964-7(2003))的蛋白質生物合成機制中，其已經能夠使得在活體內將非天然氨基酸并入蛋白質中。使用此方法，具有新穎化學、物理或生物性質的許多新氨基酸(包括光親和性標記和可光異構化氨基酸、光交聯氨基酸(例如參看Chin,J.W.等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:11020-11024;和Chin，J.W.等人，(2002)J.Am.Chem.Soc.124:9026-27):酮氨基酸和糖基化氨基酸)已回應琥珀密碼子TAG而有效且高保真性地并入大腸桿菌以及酵母中的蛋白質中。例如參看J.W.Chin等人，(2002),JournaloftheAmericanChemicalSociety124:9026-9027(以引用的方式全部并入)；J.W.Chin和P.G.Schultz,(2002),ChemBioChem301):1135-1137(以引用的方式全部并入)；J.W.Chin，等人，(2002),PNASUnitedStatesofAmerica99(17):11020-11024(以引用的方式全部并入)；和L.Wang和P.G.Schultz,(2002),Chem.Comm.,1:1-11(以引用的方式全部并入)。這些研究已證實有可能選擇性且常規地引入未見于蛋白質中的化學官能團，其對可見于20種常見遺傳性編碼氨基酸(即"天然"氨基酸)中的所有官能團呈化學惰性且其可用于有效且選擇性地反應以形成穩定共價鍵。未見于天然氨基酸中的化學官能團包括羰基(例如酮和醛)和羥胺基。羥胺部分與羰基(例如酮和醛)反應形成相對穩定的肟；此配對(羥胺與羰基)因此提供一種進一步官能化非天然氨基酸多肽的方法。此配對的一個非限制性實例展示于下舉例來說，當羥胺部分或羰基并入非天然氨基酸多肽中且與含有所述對的另一成員的試劑反應時，非天然氨基酸多肽可通過形成肟基而經所述試劑官能化。盡管可與蛋白質官能化反應一致，但可更有效進行標準肟形成反應，其將允許(例如)使用較低量的反應物且縮短反應完成時間。因此，極需要開發促進劑。II.概述圖1為本文中所述的組合物、方法和技術的一個實施例。含羰基化合物經選擇以與含羥胺化合物反應來形成含肟化合物。含羰基化合物包括非天然氨基酸、多肽、寡核苷酸、聚合物(包括(僅舉例來說)聚乙二醇)、試劑、連接子基團、包含其它官能團的蛋白質蛋白質基團和其組合；本發明提供眾多包含其它官能團的基團的實例。含羥胺化合物包括非天然氨基酸、多肽、寡核苷酸、聚合物(包括(僅舉例來說)聚乙二醇)、試劑、連接子基團、包含其它官能團的基團和其組合；本發明提供眾多包含其它官能團的基團的實例。含肟化合物包括非天然氨基酸、多肽、寡核苷酸、聚合物(包括(僅舉例來說)聚乙二醇)、試劑、連接子基團、包含其它官能團的基團和其組合；本發明提供眾多包含其它官能團的基團的實例。向含羥胺化合物和含羰基化合物的反應混合物中加入促進劑，其中所述促進劑具有至少一種以下性質(a)增大含羰基化合物與含羥胺化合物形成含肟化合物的反應速率，其中速率增大是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(b)降低含羰基化合物與含羥胺化合物形成含肟化合物的反應的活化能，其中活化能降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(C)增加含羰基化合物與含羥胺化合物反應生成含肟化合物的產率，其中產率增加是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(d)降低含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物的溫度，其中溫度降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(e)減少含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物所需的時間，其中時間減少是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(f)降低在非天然氨基酸多肽上形成肟基所需的試劑量，其中試劑量降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(g)減少由含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物所產生的副產物，其中副產物的減少是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(h)不會不可逆地破壞在存在促進劑的情況下經歷肟形成反應的多肽的三級結構(當然，除了反應目的在于破壞此三級結構之外)；(i)可在真空中與含肟化合物分離；和(j)調節含羰基化合物與含羥胺化合物的反應。在另一個實施例中，促進劑不具有任何一種前述性質。視情況，測試本文中所述的多種促進劑且根據其具有至少一種前述性質來選擇促進劑。視情況，可通過至少一種以下方法來進一步最優化反應特性(例如，含肟化合物的產率)(a)改變促進劑的量，(b)改變含羰基化合物的量，(C)改變含羥胺化合物的量，(d)改變反應溫度，(e)改變反應的pH值，和(f)改變反應混合物中的溶劑。視情況，在最優化反應條件下測試其它促進劑，或顛倒選擇與最優化步驟，或以反復方式重復選擇和最優化步驟。含羰基化合物與含羥胺化合物在存在促進劑的情況下反應形成含肟化合物。視情況通過檢測方法(包括(僅舉例來說)色譜法)來監控反應進程。含羰基化合物與含羥胺化合物在存在促進劑的情況下反應所產生的含肟化合物可視情況經分離、純化和表征。可通過多種方法將促進劑從含肟化合物中去除，所述方法包括(僅舉例來說)過濾、真空技術、色譜法、基于膜的生物分離、電泳、含肟化合物的沉淀、蒸餾或其組合。因此，在本文中所述的一個實施例中，可將促進劑在真空中從含肟物質中去除；然而，在本文中所述的其它實施例中，可使用任何前述方法(或前述方法的任何組合)來去除促進劑。分離和純化在將至少一些非含肟化合物從反應混合物中的物質中去除中具有重要作用。在一定程度上，本文中描述用于產生和使用包含至少一個具有在存在促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)形成的肟基的非天然氨基酸或經修飾非天然氨基酸的多肽的工具(方法、組合物、技術)。這些非天然氨基酸可含有其它官能團(包括(但不限于)所需官能團)。本文中也描述具有或可經修飾以含有在存在促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)形成的肟部分的非天然氨基酸。這個方面包括用于制備、純化、表征和使用這些非天然氨基酸的方法。本文中所述的另一個方面為將至少一個所述非天然氨基酸并入多肽中的方法、策略和技術。這個方面也包括用于制備、純化、表征和使用含有至少一個所述非天然氨基酸的這些多肽的方法。這個方面也包括用于制備、純化、表征和使用可用于制備(至少部分地)含有至少一個非天然氨基酸的多肽的聚核苷酸(包括DNA和RNA)的組合物和方法，所述多肽可在存在促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)反應形成含肟非天然氨基酸多肽(包括已經修飾的所述多肽)。這個方面也包括用于制備、純化、表征和使用可表達這些聚核苷酸的細胞的組合物和方法，所述聚核苷酸可用于制備(至少部分地)含有至少一個非天然氨基酸的多肽。本文中所述的方法、組合物、策略和技術的范圍內也包括用于使試劑與作為多肽的部分的非天然氨基酸(含有羰基或二羰基、羥胺基或其經保護形式)反應來產生任何前述翻譯后修飾的促進劑。一般來說，所得經翻譯后'修飾非天然氨基酸多肽將會含有至少一個肟基；所得經修飾含肟非天然氨基酸多肽可經歷隨后修飾反應。這個方面也包括選擇、制備、最優化、純化、表征和使用這些促進劑的方法，所述促進劑可用于所述非天然氨基酸的任何所述翻譯后修飾。含有非天然氨基酸的多肽可含有至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或十個或十個以上含有肟基(或其經保護或掩蔽形式)的非天然氨基酸，其中至少一個肟基是在存在本文中所述的促進劑的情況下產生，且此外，此含肟非天然氨基酸多肽可視情況含有具有一個羰基或二羰基、羥胺基或其經保護形式的至少非天然氨基酸多肽。非天然氨基酸可相同或不同，例如，在包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或20個以上不同非天然氨基酸的蛋白質中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或20個以上不同位點。在某些實施例中，以蛋白質的天然存在形式存在的特定氨基酸中的至少一個(但少于全部)經非天然氨基酸取代。本文中所述的非天然氨基酸方法和組合物提供具有多種官能團(只要至少一種接合物是通過在存在本文中所述的促進劑的情況下形成的肟基與非天然氨基酸化學鍵聯即可)、取代基或部分的物質的接合物，其中其它物質包括(但不限于)所需官能團。本文中所述的組合物、方法、技術和策略的另一個方面為研究或使用任何前述(經修飾)非天然氨基酸多肽的方法。這個方面中包括(僅舉例來說)將從包含(經修飾)非天然氨基酸多肽的多肽或蛋白質中獲益的治療、診斷、基于分析、工業、化妝品、植物生物學、環境、能量產生和/或軍事用途。III.在存在至少一種促進劑的情況下多肽的非天然氨基酸組分的翻譯后修飾已開發出用于在蛋白質的活體內翻譯期間位點特異性地并入非天然氨基酸的方法、組合物、技術和策略。通過并入具有與天然存在氨基酸的側鏈正交的側鏈化學的非天然氨基酸，此技術使得重組蛋白的位點特異性衍生成為可能。因此，本文中所述的方法、組合物、技術和策略的主要優點在于衍生蛋白如今可制備為指定的均質產物形式。然而，涉及促進劑的本文中所述的方法、組合物、反應混合物、技術和策略并不限于由活體內蛋白質翻譯技術所形成的非天然氨基酸多肽，其也包括由包括(僅舉例來說)表達蛋白連接、化學合成、基于核糖酶的技術的任何技術所形成的非天然氨基酸多肽(例如參看本文中標題為"在替代系統中的表達"的部分)。為方便起見，當針對使用促進劑以在非天然氨基酸多肽上形成肟鍵時，短語"翻譯后修飾"包括由包括活體內和活體外技術的任何技術(例如本文中所述和所屬領域的一般技術人員已知的技術)所形成的非天然氨基酸多肽。將非天然氨基酸并入重組蛋白中的能力極大地擴展可實施衍生的化學。更具體來說，蛋白質衍生以在多肽的非天然氨基酸部分上形成肟鍵提供若干優點。首先，天然存在氨基酸通常不形成肟鍵且因此經設計來形成肟鍵的試劑將與多肽的非天然氨基酸組分位點特異性地反應(當然假定非天然氨基酸和相應試劑已經設計來形成肟鍵)，因此與使用先前技術所制備的衍生蛋白質混合物相反，位點選擇性地衍生蛋白質能提供單一均質產物。其次，肟加合物在生物條件下是穩定的，暗示由肟交換所衍生的蛋白質為治療應用的有效候選物。第三，可根據肟鍵已形成于其上的非天然氨基酸的特性(即，官能團和/或結構)來操縱所得肟鍵的穩定性。因此，在一些實施例中，非天然氨基酸多肽的肟鍵具有小于l小時的分解半衰期，在其它實施例中小于l天，在其它實施例中小于2天，在其它實施例中小于1周且在其它實施例中大于1周。在其它實施例中，所得肟在弱酸性條件下穩定至少兩周，在其它實施例中，所得肟在弱酸性條件下穩定至少5天。在其它實施例中，非天然氨基酸多肽在介于約2與8之間的pH值下穩定至少l天；在其它實施例中，非天然氨基酸多肽在介于約2與6之間的pH值下穩定至少l天；在其它實施例中，非天然氨基酸多肽在介于約2與4之間的pH值下穩定至少1天。在其它實施例中，使用本文中所述的策略、方法、組合物和技術，所屬領域的一般技術人員將能夠合成具有根據熟練技術人員的需要(例如，用于治療用途(例如持續釋放)或診斷用途或工業用途或軍事用途)調節的分解半衰期的非天然氨基酸多肽的肟鍵。可通過向反應混合物中加入促進劑來增強由(a)含羰基非天然氨基酸或含羰基非天然氨基酸多肽與含羥胺試劑或(b)含羥胺非天然氨基酸或含羥胺非天然氨基酸多肽與含羰基試劑的反應形成含肟非天然氨基酸或非天然氨基酸多肽。促進劑為具有至少一種以下性質的化合物(a)增大含羰基化合物與含羥胺化合物形成含肟化合物的反應速率，其中速率增大是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(b)降低含羰基化合物與含羥胺化合物形成含肟化合物的反應的活化能，其中活化能降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(C)增加含羰基化合物與含羥胺化合物的反應生成含肟化合物的產率，其中產率增加是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(d)降低含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物的溫度，其中溫度降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(e)減少含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物所需的時間，其中時間減少是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(f)降低在非天然氨基酸多肽上形成肟基所需的試劑量，其中試劑量降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(g)減少由含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物所產生的副產物，其中副產物的減少是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(h)不會不可逆地破壞在存在促進劑的情況下經歷肟形成反應的多肽的三級結構(當然，除了反應目的在于破壞此三級結構之外)；(i)可在真空中與含肟化合物分離；和(j)調節含羰基化合物與含羥胺化合物的反應。在其它實施例中，促進劑具有至少兩種前述性質、三種前述性質、四種前述性質、五種前述性質、六種前述性質、七種前述性質、八種前述性質、九種前述性質或所有前述性質。在另一個實施例中，促進劑不具有任何一種前述性質。促進劑的使用包括使用單一促進劑或多種促進劑。另外，促進劑與含羰基化合物的摩爾比率包括介于約0.5:1與5000:1之間的值，其包括(僅舉例來說)4000:1、3000:1、2000:1、1000:1、500:1、400:1、300:1、200:1、100:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1和0.5:1。此夕卜，促進劑與含羥胺化合物的摩爾比率包括介于約0.5:1與5000:1之間的值，其包括(僅舉例來說)4000:1、3000:1、2000:1、1000:1、500:1、400:1、300:1、200:1、100:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1和0.5:1。此外，促進劑包括可在真空中從所得含肟化合物中實質上去除的化合物。此外，促進劑包括含有二胺部分、氨基脲部分、肼或酰肼部分的化合物。此外，在任何前述方面或實施例中，促進劑選自由雙官能芳香族胺、氧代胺衍生物和具有以下結構的化合物組成的群組<formula>formulaseeoriginaldocumentpage44</formula>其中Rx、Ry和Rz選自由以下各基團組成的群組Lx-H、Lx-垸基、Lx-芳基、Lx-雜芳基、U-烯基、Lx-炔基、Lx-垸氧基和Lx-垸基胺，其中Lx為鍵、C(-O)、C(=NH)、CtNH)-NH和SO、S02。在另一個實施例中，促進劑為雙官能芳香族胺。在另一個實施例中，芳香族胺選自以下群組雙官能芳香族胺<formula>formulaseeoriginaldocumentpage44</formula>在另一個實施例中，促進劑為氧代胺衍生物。在另一個實施例中，氧代胺衍生物選自以下群組氧代胺衍生物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage45</formula>此外，促進劑包括選自由以下各物組成的群組的化合物:r"nr2yH2tiyh!n、^N、其中Rx、Ry和Rz選自由以下各基團組成的群組Lx-H、Lr烷基、Lx-芳基、U-雜芳基、Lx-烯基、U-炔基、Lx-垸氧基和Lx-烷基胺，其中Lx為鍵、C(=0)、C(-NH)和C(=NH)-NH。此外，在任何前述方面或實施例中，促進劑選自圖5、圖9或圖10中所呈示的化合物，例如包括圖5的化合物6、8、10、7和20的任一種。在任何前述方面或實施例中，促進劑包括在與含羰基反應后可形成腙的試劑。此外，在任何前述方面中，促進劑活性視與酮部分的反應速率和所得中間體的穩定性而定。此外，在任何前述方面或實施例中，包含促進劑、含羰基化合物和含羥胺化合物的反應混合物的pH值在約2.0與10之間；在約2.0與9.0之間；在約2.0與8.0之間；在約3.0與7.0之間；在約4.0與6.0之間；在約3.0與10.0之間；在約4.0與10.0之間；在約3.0與9.0之間；在約3.0與8.0之間；在約2.0與7.0之間；在約3.0與6.0之間；在約4.0與9.0之間；在約4.0與8.0之間；在約4.0與7.0之間；在約4.0與6.5之間；在約4.5與6.5之間；約4.0;約4.5;約5.0;約5.5;約6.0;約6.5;和約7.0。上述非天然氨基酸多肽適用于(包括但不限于)新穎治療劑、診斷學、催化酶、工業酶、結合蛋白(包括(但不限于)抗體和抗體片段)和(包括但不限于)蛋白質結構禾口功會g的石開究中。例如參看Dougherty,(2000)C/wj加wra/^附/woJc/&<xyPro6eso/iVofd"S/rw"weFw""/o",CurrentOpinioninChemicalBiology,4:645-652。上述非天然氛基酸多肽的其它用途包括(僅舉例來說)基于分析、化妝品、植物生物學、環境、能量產生和/或軍事用途。然而，上述非天然氨基酸多肽可經歷進一步修飾以并入新穎或經修飾官能團，其包括操縱多肽的治療效力，改良多肽的安全性概況，調節多肽的藥物動力學、藥理學和/或藥效學(例如，增加水溶性、生物可用性，增大血清半衰期，增大治療半衰期，調節免疫原性，調節生物活性或延長循環時間)，向多肽提供其它官能團，向多肽中并入標簽、標記或可檢測信號，易化多肽的分離性質，和前述修飾的任何組合。本文中所述的方法、組合物、策略和技術不限于多肽或蛋白質的特定類型、種類或家族。確實，實質上任何多肽可包括至少一個本文中所述的非天然氨基酸。僅舉例來說，多肽可與選自由以下各物組成的群組的治療蛋白質同源(X-l抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗體、抗體片段、載脂蛋白、脫輔基蛋白、心房利鈉因子、心房利鈉多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-IO、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降鈣素、c-kit配體、細胞因子、CC趨化因子、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白-2、單核細胞趨化蛋白-3、單核細胞炎性蛋白-1a、單核細胞炎性蛋白-iP、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配體、c-kit配體、膠原蛋白、集落刺激因子(CSF)、補體因子5a、補體抑制劑、補體受體1、細胞因子、上皮中性粒細胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生長因子(EGF)、上皮中性粒細胞活化肽、促紅細胞生成素(EPO)、剝脫性毒素、因子IX、因子VII、因子Vin、因子X、成纖維細胞生長因子(FGF)、纖維蛋白原、纖維連接蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-l、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺激素、生長因子、生長因子受體、grf、刺猬蛋白(hedgehogprotein)、血紅蛋白、肝細胞生長因子(hGF)、水蛭素、人類生長激素(hGH)、人類血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受體、LFA-1、LFA-1受體、胰島素、類胰島素生長因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干擾素(IFN)、IFN-a、IFN-p、IFN-y、任何類干擾素分子或IFN家族成員、白細胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL國4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-ll、IL-12、角質化細胞生長因子(KGF)、乳鐵傳遞蛋白、白血病抑制因子、熒光素酶、神經營養因子(neurturin)、中性粒細胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、成骨蛋白、致癌基因產物、paracitonin、甲狀旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致熱外毒素A、致熱外毒素B、致熱外毒素C、pyy、松弛素、腎素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性補體受體I、可溶性I-CAM1、可溶性白細胞介素受體、可溶性TNF受體、生長調節素、生長抑素、生長激素、鏈激酶、超抗原、葡萄球菌腸毒素、FLT、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、類固醇激素受體、超氧化物歧化酶、中毒性休克綜合癥毒素、胸腺素al、組織型纖溶酶原活化因子、腫瘤生長因子(TGF)、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子a、腫瘤壞死因子卩、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管內皮生長因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受體、孕酮受體、睪酮受體、醛固酮受體、LDL受體和皮質酮。非天然氨基酸多肽也可與生長激素超基因家族的任何多肽成員同源。這些修飾包括將其它官能團(包括(但不限于)所需官能團)并入到多肽的非天然氨基酸組分上。因此，僅舉例來說，含有任何一種以下氨基酸的非天然氨基酸多肽可使用本文中所述的方法和組合物在存在本文中所述的促進劑的情況下經進一步修飾(a)其中A為視情況可選的，且當存在時為低級亞烷基、經取代低級亞垸基、低級亞環烷基、經取代低級亞環垸基、低級亞烯基、經取代低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜垸基、經取代亞雜垸基、低級亞雜環垸基、經取代低級亞雜環烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞垸芳基、亞芳垸基或經取代亞芳垸基；B為視情況可選的，且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子低級亞烷基、經取代低級亞垸基、低級亞烯基、經取代低級亞烯基、低級亞雜烷基、經取代低級亞雜烷基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(0)k-(其中k為l、2或3)、-S(O)k(亞垸基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亞烷基或經取代亞垸基)-、-N(R')CO-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-N(R')C(O)O-、-S(0)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(0)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N^tl-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'獨立地為H、烷基或經取代烷基；R為H、垸基、經取代垸基、環垸基或經取代環烷基；各R"獨立地為H、垸基、經取代垸基或保護基，或當存在一個以上R"基團時，兩個R"視情況形成雜環烷基；Ri為視情況可選的，且當存在時為H、氨基保護基、樹脂；且R2為視情況可選的，且當存在時為OH、酯保護基、樹脂；R3和R4各自獨立地為H、鹵素、低級垸基或經取代低級垸基，或R3與R4或兩個R3基團視情況形成環垸基或雜環垸基；或-A-B-J-R基團一起形成包含至少一個羰基(包括二羰基)、經保護羰基(包括經保護二羰基)或經掩蔽羰基(包括經掩蔽二羰基)的雙環或三環狀環垸基或雜環垸基；或-J-R基團一起形成包含至少一個羰基(包括二羰基)、經保護羰基(包括經保護二羰基)或經掩蔽羰基(包括經掩蔽二羰基)的單環或雙環狀環烷基或雜環垸基；(b)其中R垸基、經取代垸基、環烷基或經取代環垸基；Ri為視情況可選的，且當存在時為H、氨基保護基、樹脂；且R2為視情況可選的，且當存在時為OH、酯保護基、樹脂；且各Ra獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R')2、-C(0)kR'(其中k為1、2或3)、-C(0)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'組成的群組，其中各R'獨立地為H、垸基或經取代垸基。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage49</formula>其中A為視情況可選的，且當存在時為低級亞垸基、經取代低級亞垸基、低級亞環烷基、經取代低級亞環垸基、低級亞烯基、經取代低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜垸基、經取代亞雜烷基、低級亞雜環垸基、經取代低級亞雜環烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞垸芳基、經取代亞垸芳基、亞芳垸基或經取代亞芳垸基；B為視情況可選的，且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子低級亞垸基、經取代低級亞垸基、低級亞烯基、經取代低級亞烯基、低級亞雜垸基、經取代低級亞雜院基、-0-、-0-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(0)k-(其中k為l、2或3)、-S(O)k(亞垸基或經取代亞垸基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-N(R')-、-NR'-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亞烷基或經取代亞垸基)-、-N(R')CO-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(0)kN(R')-、-N(R')C(O)単')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(0)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N4B-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'獨立地為H、垸基或經取代烷基；K為-NR6R或-N-CR6R7;R為H、垸基、經取代垸基、環垸基或經取代環垸基；Ri為視情況可選的，且當存在時為H、氨基保護基、樹脂；且R2為視情況可選的，且當存在時為OH、酯保護基、樹脂；R3和R4各自獨立地為H、鹵素、低級烷基或經取代低級烷基，或R3與R4或兩個R3基團視情況形成環垸基或雜環垸基；R6和R7各自獨立地選自由以下各基團組成的群組H、烷基、經取代垸基、烯基、經取代烯基、烷氧基、經取代垸氧基、聚氧化烯、經取代聚氧化烯、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、烷芳基、經取代垸芳基、芳烷基和經取代芳垸基、-C(O)R"、-C(0)2R"、-C(0)N(R")2，其中各R"獨立地為氫、垸基、經取代垸基、烯基、經取代烯基、烷氧基、經取代垸氧基、芳基、經取代芳基、雜芳基、垸芳基、經取代垸芳基、芳垸基或經取代芳烷基；或R6或R7為L-X，其中X選自由所需官能團組成的群組；且L為視情況可選的，且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子亞垸基、經取代亞院基、亞烯基、經取代亞烯基、-O-、-O-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞垸基)-、-S(0)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞垸基或經取代亞垸基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R')CO-(亞烷基或經取代亞垸基)-、-N(R')C(O)O-、-S(0)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(0)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'獨立地為H、垸基或經取代垸基；(d)其中A為視情況可選的，且當存在時為低級亞烷基、經取代低級亞烷基、低級亞環垸基、經取代低級亞環垸基、低級亞烯基、經取代低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜烷基、經取代亞雜垸基、低級亞雜環垸基、經取代低級亞雜環垸基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞垸芳基、亞芳烷基或經取代亞芳烷基；R為H、烷基、經取代烷基、環垸基或經取代環烷基；Ri為視情況可選的，且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；R2為視情況可選的，且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；Xt為C、S或S(O);且L為亞烷基、經取代亞垸基、N(R')(亞烷基)或N(R')(經取代亞烷基)，其中各R'獨立地為H、垸基或經取代烷基；或(e)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage51</formula>其中A為視情況可選的，且當存在時為低級亞烷基、經取代低級亞烷基、低級亞環烷基、經取代低級亞環垸基、低級亞烯基、經取代低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜垸基、經取代亞雜垸基、低級亞雜環垸基、經取代低級亞雜環烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞垸芳基、經取代亞垸芳基、亞芳烷基或經取代亞芳垸基；(<formula>formulaseeoriginaldocumentpage51</formula>其中(a)指示與A基團鍵結且(b)指示與個別羰基鍵結，R3和R4獨立地選自H、鹵素、垸基、經取代垸基、環烷基或經取代環烷基，或R3與R4或兩個R3基團或兩個R4基團視情況形成環烷基或雜環垸基；R為H、鹵素、烷基、經取代烷基、環垸基或經取代環垸基；T3為鍵、C(R)(R)、O或S，且R為H、鹵素、烷基、經取代烷基、環垸基或經取代環烷基5Ri為視情況可選的，且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且R2為視情況可選的，且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。本文中所述的方法和組合物的一個方面為包括至少一種具有至少一個(包括(但不限于)至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或至少十個或十個以上)已經翻譯后修飾的非天然氨基酸的蛋白質的組合物。翻譯后修飾非天然氨基酸可相同或不同，其包括(但不限于)在包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或20個以上不同翻譯后修飾非天然氨基酸的蛋白質中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或20個以上不同位點。在另一個方面中，組合物包括其中蛋白質中存在的特定氨基酸中的至少一個(但少于全部)經翻譯后修飾非天然氨基酸取代的蛋白質。對于具有一個以上翻譯后修飾非天然氨基酸的特定蛋白質來說，翻譯后修飾非天然氨基酸可相同或不同(其包括(但不限于)蛋白質可包括兩個或兩個以上不同類型的翻譯后修飾非天然氨基酸，或可包括兩個相同的翻譯后修飾非天然氨基酸)。對于具有兩個以上翻譯后修飾非天然氨基酸的特定蛋白質來說，翻譯后修飾非天然氨基酸可相同、不同或為相同種類的多種翻譯后修飾非天然氨基酸與至少一種不同翻譯后修飾非天然氨基酸的組合。A在存在至少一神促逮剤的情況7翻譯后修飾非天然氮基酸多傲的方法含撰基非天然氨基酸與含羥胺試剤的及應天然存在氨基酸的側鏈缺乏強親電子位點。因此，非天然氨基酸與含親電子試劑的側鏈(包括(僅舉例來說)含有羰基或二羰基(例如酮)的氨基酸)的結合使得所述側鏈通過親核進攻羰基或二羰基而位點特異性衍生成為可能。在進攻親核試劑為羥胺的情況下，將產生肟衍生蛋白。可用在衍生步驟之前或在衍生步驟之后經純化的多肽進行衍生和/或進一步修飾的方法。此外，衍生步驟可在弱酸性到弱堿性條件(例如包括約2-8的pH值或約4-8的pH值)下發生。可通過向反應混合物中加入促進劑來增強由含羰基非天然氨基酸或含羰基非天然氨基酸多肽與含羥胺試劑反應形成含肟非天然氨基酸或非天然氨基酸多肽。促進劑為具有至少一種以下性質的化合物(a)增大含羰基化合物與含羥胺化合物形成含肟化合物的反應速率，其中速率增大是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(b)降低含羰基化合物與含羥胺化合物形成含肟化合物的反應的活化能，其中活化能降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(c)增加含羰基化合物與含羥胺化合物反應生成的含肟化合物的產率，其中產率增加是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(d)降低含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物的溫度，其中溫度降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(e)減少含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物所需的時間，其中時間減少是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(f)降低在非天然氨基酸多肽上形成肟基所需的試劑量，其中試劑量降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(g)減少由含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物所產生的副產物，其中副產物的減少是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(h)不會不可逆地破壞在存在促進劑的情況下經歷肟形成反應的多肽的三級結構(當然，除了反應目的在于破壞此三級結構之外)；(i)可在真空中與含肟化合物分離；和(j)調節含羰基化合物與含羥胺化合物的反應。在其它實施例中，促進劑具有至少兩種前述性質、三種前述性質、四種前述性質、五種前述性質、六種前述性質、七種前述性質、八種前述性質、九種前述性質或所有前述性質。在另一個實施例中，促進劑不具有任何一種前述性質。促進劑的使用包括使用單一促進劑或多種促進劑。另外，促進劑與含羰基化合物的摩爾比率包括介于約0.5:1與5000:1之間的值，其包括(僅舉例來說)4000:1、3000:1、2000:1、1000:1、500:1、400:1、300:1、200:1、100:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1和0.5:1。此夕卜，促進劑與含羥胺化合物的摩爾比率包括介于約0.5:1與5000:1之間的值，其包括(僅舉例來說)4000:1、3000:1、2000:1、1000:1、500:1、400:1、300:1、200:1、100:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1和0.5:1。此外，促進劑包括可在真空中從所得含肟化合物中實質上去除的化合物。此外，促進劑包括含有二胺部分、氨基脲部分、肼或酰肼部分的化合物。此外，在任何前述方面或實施例中，促進劑選自由雙官能芳香族胺、氧代胺衍生物和具有以下結構的化合物組成的群組<formula>formulaseeoriginaldocumentpage54</formula>其中Rx、Ry和Rz選自由以下各基團組成的群組Lx-H、U-烷基、U-芳基、U-雜芳基、Lr烯基、Lx-炔基、Lx-垸氧基和Lx-垸基胺，其中U為鍵、C(=0)、C(=NH)、C(^NH)-NH和SO、S02。在另一個實施例中，促進劑為雙官能芳香族胺。在另一個實施例中，芳香族胺選自以下群組雙官能芳香族胺訓2"nh2"叫^nh2NH2在另一個實施例中，促進劑為氧代胺衍生物。在另一個實施例中，氧代胺衍生物選自以下群組氧代胺衍生物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage54</formula>此外，促進劑包括選自由以下各物組成的群組的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage54</formula>其中Rx、Ry和Rz選自由以下各基團組成的群組Lx-H、Lx-垸基、Lx-芳基、U-雜芳基、Lx-烯基、Lx-炔基、Lx-烷氧基和Lx-烷基胺，其中L為鍵、C(=0)、C(-NH)和C(=NH)-NH。此外，在任何前述方面或實施例中，促進劑選自圖5、圖9或圖IO中所呈示的化合物，例如包括圖5的化合物6、8、10、7和20中的任一種。在任何前述方面或實施例中，促進劑包括在與含羰基反應后可形成腙的試劑。此外，在任何前述方面中，促進劑活性視與酮部分的反應速率和所得中間體的穩定性而定。此外，在任何前述方面或實施例中，包含促進劑、含羰基化合物和含羥胺化合物的反應混合物的pH值在約2.0與10之間；在約2.0與9.0之間；在約2.0與8.0之間；在約3.0與7.0之間；在約4.0與6.0之間；在約3.0與10.0之間；在約4.0與10.0之間；在約3.0與9.0之間；在約3.0與8.0之間；在約2.0與7.0之間；在約3.0與6.0之間；在約4.0與9.0之間；在約4.0與8.0之間；在約4.0與7.0之間；在約4.0與6.5之間；在約4.5與6.5之間；約4.0;約4.5;約5.0;約5.5;約6.0;約6.5;和約7.0。基于含羰基或二羰基的蛋白質與羥胺取代分子的反應的蛋白質衍生方法具有明顯優點。首先，羥胺經歷在介于約2與8之間的pH值下(且在其它實施例中在介于約4與8之間的pH值下)與含羰基或二羰基的化合物的縮合產生肟加合物。在這些條件下，天然存在氨基酸的側鏈不反應。其次，此選擇性化學使得重組蛋白的位點特異性衍生成為可能，衍生蛋白質如今可制備為指定的均質產物形式。第三，實現本文中所述的羥胺與本文中所述的含羰基或二羰基的多肽的反應所需的適度條件通常不會不可逆地破壞多肽的三級結構(當然，除了反應目的在于破壞此三級結構之外)。最后，盡管羥胺基氨基似乎由大腸桿菌代謝，但羥胺與含羰基或二羰基的分子的縮合產生在生物條件下穩定的肟加合物。僅舉例來說，以下非天然氨基酸為可在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)與本文中所述的含羥胺試劑反應形成含肟非天然氨基酸或多肽的含羰基或二羰基的氨基酸類型其中-A為視情況可選的，且當存在時為低級亞烷基、經取代低級亞垸基、低級亞環垸基、經取代低級亞環烷基、低級亞烯基、經取代低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜烷基、經取代亞雜垸基、低級亞雜環烷基、經取代低級亞雜環烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞垸芳基、經取代亞烷芳基、亞芳垸基或經取代亞芳垸基；B為視情況可選的，且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子低級亞烷基、經取代低級亞垸基、低級亞烯基、經取代低級亞烯基、低級亞雜烷基、經取代低級亞雜烷基、-0-、-0-(亞烷基或經取代亞垸基)-、各、-3-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-8(0)1￡-(其中k為l、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞垸基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-N(R')CO-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(0)kN(R')-、匿N(R')C(O)N(R')陽、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(0)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N4n-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'獨立地為H、烷基或經取代垸基；R為H、烷基、經取代烷基、環垸基或經取代環垸基；各R"獨立地為H、烷基、經取代垸基或保護基，或當存在一個以上R"基團時，兩個R"視情況形成雜環烷基；Ri為視情況可選的，且當存在時為H、氨基保護基、樹脂；且R2為視情況可選的，且當存在時為OH、酯保護基、樹脂；R3和R4各自獨立地為H、鹵素、低級烷基或經取代低級烷基，或R3與FU或兩個R3基團視情況形成環垸基或雜環烷基；或-A-B-J-R基團一起形成包含至少一個羰基(包括二羰基)、經保護羰基(包括經保護二羰基)或經掩蔽羰基(包括經掩蔽二羰基)的雙環或三環狀環垸基或雜環烷基；或-J-R基團一起形成包含至少一個羰基(包括二羰基)、經保護羰基(包括經保護二羰基)或經掩蔽羰基(包括經掩蔽二羰基)的單環或雙環狀環垸基或雜環垸基。僅作為實例，就前述目的來說，式(I)化合物包括具有以下結構的化合物-其中R為院基、經取代烷基、環烷基或經取代環烷基；Ri為視情況可選的，且當存在時為H、氨基保護基、樹脂；且R2為視情況可選的，且當存在時為OH、酯保護基、樹脂；且各Ra獨立地選自由H、鹵素、垸基、經取代垸基、-N(R')2、-C(0)kR'(其中k為1、2或3)、-C(0)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'組成的群組，其中各R'獨立地為H、垸基或經取代烷基o僅作為實例，就前述目的來說，式(I)化合物包括具有以下結構的化合物其中A為視情況可選的，且當存在時為低級亞垸基、經取代低級亞烷基、低級亞環烷基、經取代低級亞環烷基、低級亞烯基、經取代低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜垸基、經取代亞雜烷基、低級亞雜環烷基、經取代低級亞雜環烷基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞烷芳基、亞芳烷基或經取代亞芳垸基；R為垸基、經取代垸基、環垸基或經取代環烷基；Ri為視情況可選的，且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；R2為視情況可選的，且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；Xi為C、S或S(O);且L為鍵、亞院基、經取代亞烷基、N(R')(亞垸基)或N(R')(經取代亞烷基)，其中各R'獨立地為H、烷基或經取代垸基。僅作為另一實例，就前述目的來說，式(I)化合物包括具有式(XXXX)的結構的化合物-<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>其中A為視情況可選的，且當存在時為低級亞垸基、經取代低級亞垸基、低級亞環烷基、經取代低級亞環烷基、低級亞烯基、經取代低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜垸基、經取代亞雜烷基、低級亞雜環垸基、經取代低級亞雜環垸基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞垸芳基、亞芳烷基或經取代亞芳垸基；M為-C(R3)-、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage58</formula>其中(a)指示與A基團鍵結且(b)指示與個別羰基鍵結，R3和R4獨立地選自H、鹵素、烷基、經取代垸基、環烷基或經取代環烷基，或R3與R4或兩個R3基團或兩個R4基團視情況形成環垸基或雜環烷基；r為烷基、經取代垸基、環烷基或經取代環烷基；L為鍵、c(r)(r)、o或s，且r為h、鹵素、烷基、經取代垸基、環垸基或經取代環烷基；Ri為視情況可選的，且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且R2為視情況可選的，且當存在時為oh、酯保護基、樹脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。包含所述含羰基或二羰基的非天然氨基酸的多肽的類型幾乎不受限制，只要含羰基或二羰基的非天然氨基酸位于多肽上以使得羥胺試劑可與羰基或二羰基反應且不產生破壞多肽的三級結構(當然，除此破壞為反應目的之外)的所得經修飾非天然氨基酸即可。僅舉例來說，以下含羥胺試劑為可在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)與本文中所述的含羰基或二羰基的非天然氨基酸反應形成含肟非天然氨基酸的含羥胺試劑類型<formula>formulaseeoriginaldocumentpage59</formula>其中各x獨立地為h、烷基、經取代垸基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、烷氧基、經取代烷氧基、烷基烷氧基、經取代烷基烷氧基、聚氧化烯、經取代聚氧化烯、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳垸基、經取代芳垸基、-(亞烷基或經取代亞烷基)-0^(11")2、-(亞垸基或經取代亞垸基)-c(o)sr"、-(亞垸基或經取代亞垸基)-s-s-(芳基或經取代芳基)、-c(o)r"、《(0)2『或-(:(0^(11")2,其中各r"獨立地為氫、垸基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、垸氧基、經取代垸氧基、芳基、經取代芳基、雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳垸基或經取代芳烷基；或各x獨立地選自由所需官能團組成的群組；各l獨立地選自由以下各基團組成的群組亞垸基、經取代亞垸基、亞烯基、經取代亞烯基、-o-、-o-(亞烷基或經取代亞垸基)-、-s-、-s-(亞烷基或經取代亞垸基)-、-s(o)k-(其中k為l、2或3)、-S(O)k(亞垸基或經取代亞垸基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亞烷基或經取代亞垸基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-(亞垸基或經取代亞垸基)NR'C(O)O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-O-CON(R')-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R')CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R')C(O)O-、-N(R')C(O)O-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-S(0)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)N(R')-(亞烷基或經取代亞垸基)-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(0)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-;L為視情況可選的，且當存在時為-C(R')p-NR'-C(O)O-(亞垸基或經取代亞垸基)-，其中p為0、l或2;各R'獨立地為H、垸基或經取代垸基；W為-N(Rs)2，其中各Rg獨立地為H或氨基保護基；且n為l到3;只要L-LrW—起提供至少一個能夠與非天然氨基酸或(經修飾)非天然氨基酸多肽上的羰基(包括二羰基)反應的羥胺基即可。在一個說明性實施例中，將羥胺衍生試劑加入到含羰基非天然氨基酸多肽和促進劑的緩沖溶液(pH2-8)中。通過HPLC、FPLC或尺寸排除色譜法來純化所得含肟非天然氨基酸多肽。在另一個或替代性說明性實施例中，式(I)化合物與式(XIX)化合物的摩爾比率為約1:2;1:1;1.5:1;1.5:2;2:1;1:1.5;2:1.5或1.5至lj2。在一個實施例中，多種連接子化學物質可在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)與經羰基或二羰基取代的非天然氨基酸多肽位點特異性地反應以形成肟鍵。在一個實施例中，本文中所述的連接子方法利用在至少一個連接子末端上含有羥胺官能團的連接子(單官能、雙官能或多官能)。羥胺衍生連接子與經酮基取代的蛋白質縮合產生穩定肟鍵。雙官能和/或多官能連接子(例如，具有一個或一個以上其它鍵聯化學的羥胺)允許不同分子(例如，其它蛋白質、聚合物或小分子)與非天然氨基酸多肽位點特異性連接，而單官能連接子(在所有末端上經羥胺取代)有助于非天然氨基酸多肽的位點特異性二聚合或寡聚。通過將此連接子策略與本文中所述的活體內翻譯技術組合，變得有可能指定化學制備蛋白質的三維結構。B.在存在至少一種促進劑的情況下翻譯后修飾非天然氨基酸多肽的方法含羥胺非天然氨基酸與含羰基試劑的反應上述翻譯后修飾技術和組合物也可用于在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)含羥胺非天然氨基酸與含羰基或二羰基的試劑反應產生經修飾含肟非天然氨基酸多肽。可通過向反應混合物中加入促進劑來增強含羥胺非天然氨基酸或含羥胺非天然氨基酸多肽與含羰基試劑反應形成含肟非天然氨基酸或非天然氨基酸多肽。促進劑為具有至少一種以下性質的化合物(a)增大含羰基化合物與含羥胺化合物形成含肟化合物的反應速率，其中速率增大是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(b)降低含羰基化合物與含羥胺化合物形成含肟化合物的反應的活化能，其中活化能降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(C)增加含羰基化合物與含羥胺化合物反應生成含肟化合物的產率，其中產率增加是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(d)降低含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物的溫度，其中溫度降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(e)減少含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物所需的時間，其中時間減少是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(f)降低在非天然氨基酸多肽上形成肟基所需的試劑量，其中試劑量降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(g)減少由含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物所產生的副產物，其中副產物的減少是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(h)不會不可逆地破壞在存在促進劑的情況下經歷肟形成反應的多肽的三級結構(當然，除了反應目的在于破壞此三級結構之外)；(i)可在真空中與含肟化合物分離；和(j)調節含羰基化合物與含羥胺化合物的反應。在其它實施例中，促進劑具有至少兩種前述性質、三種前述性質、四種前述性質、五種前述性質、六種前述性質、七種前述性質、八種前述性質、九種前述性質或所有前述性質。在另一個實施例中，促進劑不具有任何一種前述性質。促進劑的使用包括使用單一促進劑或多種促進劑。另外，促進劑與含羰基化合物的摩爾比率包括介于約0.5:1與5000:1之間的值，其包括(僅舉例來說)4000:1、3000:1、2000:1、1000:1、500:1、楊:l、300:1、200:1、100:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1和0.5:1。此夕卜，促進劑與含羥胺化合物的摩爾比率包括介于約0.5:1與5000:1之間的值，其包括(僅舉例來說)4000:1、3000:1、2000:1、1000:1、500:1、400:1、300:1、200:1、100:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1和0.5:1。此外，促進劑包括可在真空中從所得含肟化合物中實質上去除的化合物。此外，促進劑包括含有二胺部分、氨基脲部分、肼或酰肼部分的化合物。此外，在任何前述方面或實施例中，促進劑選自由雙官能芳香族胺、氧代胺衍生物和具有以下結構的化合物組成的群組-，其中Rx、Ry和Rz選自由以下各基團組成的群組Lx-H、Lx-烷基、Lx-芳基、U-雜芳基、Lx-烯基、Lx-炔基、U-垸氧基和Lx-垸基胺，其中Lx為鍵、C(=0)、C(=NH)、C(:NH)-NH和SO、S02。在另一個實施例中，促進劑為雙官能芳香族胺。在另一個實施例中，芳香族胺選自以下群組雙官能芳香族胺在另一個實施例中，促進劑為氧代胺衍生物。在另一個實施例中，氧代胺衍生物選自以下群組氧代胺衍生物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage62</formula>此外，促進劑包括選自由以下各物組成的群組的化合物:JfMV2H々"人A,WHU06其中Rx、Ry和Rz選自由以下各基團組成的群組Lx-H、Lx-垸基、Lx-芳基、U-雜芳基、Lx-烯基、U-炔基、Lx-垸氧基和Lx-烷基胺，其中Lx為鍵、C(=0)、C^NH)和C(=NH)-NH。此外，在任何前述方面或實施例中，促進劑選自圖5、圖9或圖IO中所呈示的化合物，其例如包括圖5的化合物6、8、10、7和20中的任一種。在任何前述方面或實施例中，促進劑包括在與含羰基反應后可形成腙的試劑。此外，在任何前述方面中，促進劑活性視與酮部分的反應速率和所得中間體的穩定性而定。此外，在任何前述方面或實施例中，包含促進劑、含羰基化合物和含羥胺化合物的反應混合物的pH值在約2.0與10之間；在約2.0與9.0之間；在約2.0與8.0之間；在約3.0與7.0之間；在約4.0與6.0之間；在約3.0與10.0之間；在約4.0與10.0之間；在約3.0與9.0之間；在約3.0與8.0之間；在約2.0與7.0之間；在約3.0與6.0之間；在約4.0與9.0之間；在約4.0與8.0之間；在約4.0與7.0之間；在約4.0與6.5之間；在約4.5與6.5之間；約4.0;約4.5;約5.0;約5.5;約6.0;約6.5;和約7.0。基于含羥胺蛋白質與經羰基或二羰基取代分子的反應的蛋白衍生方法具有明顯優點。首先，羥胺經歷在介于約2與8之間的pH值下(且在其它實施例中在介于約4與8之間的pH值下)與含羰基或二羰基的化合物縮合產生肟加合物。在這些條件下，天然存在氨基酸的側鏈不反應。其次，此選擇性化學使得重組蛋白的位點特異性衍生成為可能，衍生蛋白質如今可制備為指定的均質產物形式。第三，實現本文中所述的含羰基或二羰基的試劑與本文中所述的含羥胺多肽的反應所需的適度條件通常不會不可逆地破壞多肽的三級結構(當然，除了反應目的在于破壞此三級結構之外)。最后，盡管羥胺基氨基似乎由大腸桿菌代謝，但含羰基或二羰基的試劑與含羥胺氨基酸的縮合產生在生物條件下穩定的肟加合物。僅舉例來說，以下非天然氨基酸為可在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)與本文中所述的含羰基或二羰基的試劑反應形成含肟非天然氨基酸或多肽的含羥胺氨基酸類型<formula>formulaseeoriginaldocumentpage64</formula>(XIV),其中A為視情況可選的，且當存在時為低級亞烷基、經取代低級亞垸基、低級亞環垸基、經取代低級亞環烷基、低級亞烯基、經取代低級亞烯基、亞炔基、低級亞雜烷基、經取代亞雜烷基、低級亞雜環垸基、經取代低級亞雜環垸基、亞芳基、經取代亞芳基、亞雜芳基、經取代亞雜芳基、亞烷芳基、經取代亞垸芳基、亞芳烷基或經取代亞芳垸基；B為視情況可選的，且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子低級亞烷基、經取代低級亞垸基、低級亞烯基、經取代低級亞烯基、低級亞雜垸基、經取代低級亞雜垸基cOO-(亞烷基或經取代亞烷基K-SYS-(亞烷基或經取代亞垸基K-S(O)k-(其中k為l、2或3)、-S(O)k(亞垸基或經取代亞垸基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞垸基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞垸基)-、-N(R')-、-NR'-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R')CO-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-N(R')C(O)O-、-S(0)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-(3(11')2^=^和-(:(11')2^(11')^(11')國，其中各R'獨立地為H、垸基或經取代烷基；K為陽NH2;Rj為視情況可選的，且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且R2為視情況可選的，且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；R3和R4各自獨立地為H、鹵素、低級烷基或經取代低級烷基，或R3與R4或兩個R3基團視情況形成環垸基或雜環垸基。包含所述含羥胺非天然氨基酸的多肽的類型幾乎不受限制，只要含羥胺非天然氨基酸位于多肽上以使得含羰基或二羰基的試劑可與羥胺基反應且不會產生破壞多肽的三級結構(當然，除此破壞為反應目的之外)的所得經修飾非天然氨基酸即可。僅舉例來說，以下含羰基或二羰基的試劑為可在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)與本文中所述的含羥胺非天然氨基酸反應形成含肟非天然氨基酸或多肽的含羰基或二羰基的試劑類型x畫wpox)其中各X獨立地為H、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、烷氧基、經取代烷氧基、垸基烷氧基、經取代烷基垸氧基、聚氧化烯、經取代聚氧化烯、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、烷芳基、經取代垸芳基、芳烷基、經取代芳烷基、-(亞烷基或經取代亞垸基)-0>^(11")2、-(亞烷基或經取代亞烷基)-C(O)SR"、-(亞垸基或經取代亞烷基)-s-s-(芳基或經取代芳基)、-c(o)r"、-<:(0)2『或《(0^(11")2,其中各R"獨立地為氫、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、烷氧基、經取代烷氧基、芳基、經取代芳基、雜芳基、烷芳基、經取代烷芳基、芳垸基或經取代芳垸基；或各X獨立地選自由所需官能團組成的群組；各L獨立地選自由以下各基團組成的群組亞垸基、經取代亞垸基、亞烯基、經取代亞烯基、-O-、-O-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞垸基)-、-S(0)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞垸基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-N(R')-、-NR'-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-(亞垸基或經取代亞烷基)NR'C(O)O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-O-CON(R')-(亞烷基或經取代亞垸基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R')CO-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-N(R')C(O)O-、-N(R')C(O)O-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-S(0)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)N(R')-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(0)kN(R')-、-N(R')-N-、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-禾口-C(R')2-N(R')-N(R')-;L為視情況可選的，且當存在時為-C(R')p-NR'-C(O)O-(亞烷基或經取代亞垸基)-，其中p為0、l或2;各R'獨立地為H、烷基或經取代烷基；W為-J-R，其中R為H、垸基、經取代烷基、環垸基或經取代環烷基；各R"獨立地為H、垸基、經取代烷基或保護基，或當存在一個以上R"基團時，兩個R"視情況形成雜環垸基；且n為1到3;只要L-LrW—起提供至少一個能夠與非天然氨基酸或(經修飾)非天然氨基酸多肽上的羥胺基反應的羰基(包括二羰基)即可。在一個說明性實施例中，將羰基衍生試劑加入到含羥胺非天然氨基酸多肽和促進劑的緩沖溶液(pH2-8)中。通過HPLC、FPLC或尺寸排除色譜法來純化所得含肟非天然氨基酸多肽。在另一個或替代性說明性實施例中，式(XIV)化合物與式(XIX)化合物的摩爾比率為約1:2;1:1;1.5:1;1.5:2;2:1;1:1.5;2:1.5或1.5至U2。在一個實施例中，多種連接子化學物質可與經羥胺取代非天然氨基酸多肽位點特異性地反應。在一個實施例中，本文中所述的連接子方法利用在至少一個連接子末端上含有羰基或二羰基官能團的連接子(單官能、雙官能或多官能)。羰基或二羰基衍生連接子與經羥胺取代的蛋白質縮合產生穩定肟鍵。雙官能和/或多官能連接子(例如，具有一個或一個以上其它鍵聯化學的羰基或二羰基)允許不同分子(例如，其它蛋白質、聚合物或小分子)與非天然氨基酸多肽位點特異性連接，而單官能連接子(在所有末端上經羰基或二羰基取代)有助于非天然氨基酸多肽的位點特異性二聚合或寡聚。通過將此連接子策略與本文中所述的活體內翻譯技術組合，變得有可能指定化學制備的蛋白質的三維結構。C.在存在至少一種促進劑的情況下增添官能團的實例與非天然氨基酸多肽偶合的大分子聚合物可使用本文中所述的組合物、方法、技術和策略來實現對本文中所述的非天然氨基酸多肽的各種修飾。這些修飾包括通過在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)形成的肟鍵將其它官能團(包括(但不限于)所需官能團)并入到多肽的非天然氨基酸組分上。作為本文中所述組合物、方法、技術和策略的說明性、非限制性實例，以下描述將集中于將大分子聚合物增添到非天然氨基酸多肽上，同時應了解，對其所述的組合物、方法、技術和策略也適用于(必要時經適當更改且所屬領域的一般技術人員可用本文中的揭示內容進行)增添其它官能團(包括(但不限于)上文列出的那些官能團)。可通過向反應混合物中加入促進劑來增強由(a)含羥胺非天然氨基酸多肽與含羰基試劑反應或(b)含羰基非天然氨基酸多肽與含羥胺試劑反應通過肟鍵與非天然氨基酸多肽偶合的大分子聚合物的形成。所述促進劑為具有至少一種以下性質的化合物(a)增大含羰基化合物與含羥胺化合物形成含肟化合物的反應速率，其中速率增大是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(b)降低含羰基化合物與含羥胺化合物形成含肟化合物的反應的活化能，其中活化能降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(C)增加含羰基化合物與含羥胺化合物反應生成含肟化合物的產率，其中產率增加是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(d)降低含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物的溫度，其中溫度降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(e)減少含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物所需的時間，其中時間減少是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(f)降低在非天然氨基酸多肽上形成肟基所需的試劑量，其中試劑量降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(g)減少由含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物所產生的副產物，其中副產物的減少是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(h)不會不可逆地破壞在存在促進劑的情況下經歷肟形成反應的多肽的三級結構(當然，除了反應目的在于破壞此三級結構之外)；(i)可在真空中與含肟化合物分離；和(j)調節含羰基化合物與含羥胺化合物的反應。在其它實施例中，促進劑具有至少兩種前述性質、三種前述性質、四種前述性質、五種前述性質、六種前述性質、七種前述性質、八種前述性質、九種前述性質或所有前述性質。在另一個實施例中，促進劑不具有任何一種前述性質。促進劑的使用包括使用單一促進劑或多種促進劑。另外，促進劑與含羰基化合物的摩爾比率包括介于約0.5:1與5000:1之間的值，其包括(僅舉例來說)4000:1、3000:1、2000:1、1000:1、500:1、400:1、300:1、200:1、100:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1和0.5:1。此夕卜，促進劑與含羥胺化合物的摩爾比率包括介于約0.5:1與5000:1之間的值，其包括(僅舉例來說)4000:1、3000:1、2000:1、1000:1、500:1、400:1、300:1、200:1、100:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1和0.5:1。此外，促進劑包括可在真空中從所得含肟化合物中實質上去除的化合物。此外，促進劑包括含有二胺部分、氨基脲部分、肼或酰肼部分的化合物。此外，在任何前述方面或實施例中，促進劑選自由雙官能芳香族胺、氧代胺衍生物和具有以下結構的化合物組成的群組-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage68</formula>其中Rx、Ry和Rz選自由以下各基團組成的群組Lx-H、U-垸基、U-芳基、Lx-雜芳基、Lx-烯基、U-炔基、Lx-烷氧基和Lx-烷基胺，其中Lx為鍵、C(=0)、C(=NH)、C(:NH)-NH禾口SO、S02。在另一個實施例中，促進劑為雙官能芳香族胺。在另一個實施例中，芳香族胺選自以下群組雙官能芳香族胺在另一個實施例中，促進劑為氧代胺衍生物。在另一個實施例中，氧代胺衍生物選自以下群組氧代胺衍生物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage69</formula>此外，促進劑包括選自由以下各物組成的群組的化合物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage69</formula>其中Rx、Ry和Rz選自由以下各基團組成的群組Lx-H、U-烷基、Lx-芳基、U-雜芳基、Lx-烯基、U-炔基、Lx-烷氧基和Lx-垸基胺，其中U為鍵、C(=0)、C^NH)和C(=NH)-NH。此外，在任何前述方面或實施例中，促進劑選自圖5、圖9或圖10中所呈示的化合物，例如包括圖5的化合物6、8、10、7和20中的任一種。在任何前述方面或實施例中，促進劑包括在與含羰基反應后可形成腙的試劑。此外，在任何前述方面中，促進劑活性視與酮部分的反應速率和所得中間體的穩定性而定。此外，在任何前述方面或實施例中，包含促進劑、含羰基化合物和含羥胺化合物的反應混合物的pH值在約2.0與10之間；在約2.0與9.0之間；在約2.0與8.0之間；在約3.0與7.0之間；在約4.0與6.0之間；在約3.0與10.0之間；在約4.0與10.0之間；在約3.0與9.0之間；在約3.0與8.0之間；在約2.0與7.0之間；在約3.0與6.0之間；在約4.0與9.0之間；在約4.0與8.0之間；在約4.0與7.0之間；在約4.0與6.5之間；在約4.5與6.5之間；約4.0;約4.5;約5.0;約5.5;約6.0;約6.5;和約7.0。多種大分子聚合物和其它分子可與本文中所述的非天然氨基酸多肽偶合以調節非天然氨基酸多肽(或相應天然氨基酸多肽)的生物性質，和/或向非天然氨基酸多肽(或相應天然氨基酸多肽)提供新穎生物性質。這些大分子聚合物可通過非天然氨基酸上的肟鍵與非天然氨基酸多肽偶合。水溶性聚合物可與本文中所述的非天然氨基酸多肽偶合。水溶性聚合物可通過肟鍵與非天然氨基酸偶合。在一些情況下，本文中所述的非天然氨基酸多肽包含一個或一個以上與水溶性聚合物鍵聯的非天然氨基酸和一個或一個以上與水溶性聚合物鍵聯的天然存在氨基酸。共價連接親水性聚合物與生物活性分子表示一種增加生物活性分子(包括蛋白質、肽和尤其疏水性分子)水溶性(例如在生理環境中)、生物可用性、增加血清半衰期、增加治療半衰期、調節免疫原性、調節生物活性或延長循環時間的方法。這些親水性聚合物的其它重要特征包括生物相容性、無毒性和無免疫原性。對于最終產品制劑的治療性用途來說，優選聚合物將為醫藥學上可接受的。適合的親水性聚合物的實例包括聚烷基醚和其烷氧基封端類似物(例如，聚氧乙二醇(polyoxyethyleneglycol)、聚乙二醇/丙二醇和其甲氧基或乙氧基封端類似物，尤其聚氧乙二醇，后者也被稱作聚乙二醇(polyethyleneglycol)或PEG);聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯基烷基醚；聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉和聚羥基烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚垸基丙烯酰胺和聚羥基垸基丙烯酰胺(例如，聚羥基丙基甲基丙烯酰胺和其衍生物)；聚丙烯酸羥垸酯；聚唾液酸和其類似物；親水性肽序列；聚糖和其衍生物，其包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如，羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖；纖維素和其衍生物，例如羧甲基纖維素、羥基烷基纖維素；甲殼質和其衍生物，例如，殼聚糖、琥珀酰基殼聚糖、羧甲基甲殼質、羧甲基殼聚糖；透明質酸和其衍生物；淀粉；藻酸鹽；硫酸軟骨素；白蛋白；支鏈淀粉和羧甲基支鏈淀粉；聚氨基酸和其衍生物，例如聚谷氨酸、聚賴氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺；馬來酸酐共聚物，例如苯乙烯馬來酸酐共聚物、二乙烯基乙醚馬來酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三聚物；其混合物；和前述物質的衍生物。水溶性聚合物可為包括(但不限于)線性、分叉或分枝的任何結構形式。在一些實施例中，具有2到約300個末端的水溶性聚合物主鏈尤其有用。多官能聚合物衍生物包括(但不限于)具有兩個末端的線性聚合物，各末端與可相同或不同的官能團鍵結。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。聚合物的分子量可在寬泛范圍內，其包括(但不限于)介于約100Da與約100,000Da或更高之間的范圍。聚合物的分子量可介于約100Da與約100,000Da之間，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約100Da與約50,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約100Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約1,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約5,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約10,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚乙二醇分子為分枝聚合物。支鏈PEG的分子量可介于約1，000Da與約100,000Da之間，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量介于約l，OOODa與約50,000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量介于約l，OOODa與約40,000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量介于約5,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量介于約5,000Da與約20,000Da之間。所屬領域的一般技術人員將認識到，實質上水溶性主鏈的上述列表絕非詳盡的且僅為說明性的，且預期具有上述性質的所有聚合物材料都適用于本文中所述的方法和組合物中。如上所述，親水性聚合物的一個實例為聚乙二醇(縮寫為PEG),其已廣泛用于藥物、人造植入物和生物相容性、無毒性和無免疫原性至關重要的其它應用中。本文中所述的聚合物:多肽實施例將使用PEG作為親水性聚合物的實例，其中應了解其它親水性聚合物可類似地用于這些實施例中。PEG為眾所周知的水溶性聚合物，其在市面上有售或可根據所屬領域中眾所周知的方法(Sandler和Karo,PolymerSynthesis,AcademicPress,NewYork,第3巻，第138-161頁)通過乙二醇的開環聚合來制備。PEG通常為透明、無色無味的，可溶于水中，熱穩定，對許多化學劑呈惰性，不水解或變質，且通常無毒。認為聚乙二醇為生物相容性的，也就是說PEG能夠與活組織或生物體共存而不造成傷害。更具體來說，PEG實質上為非免疫原性的，也就是說PEG不傾向于在體內產生免疫反應。當與在體內具有一些所需功能的分子(例如生物活性劑)連接時，PEG傾向于掩蔽所述藥劑且可減少或消除任何免疫反應以使得生物體可耐受所述藥劑的存在。PEG接合物傾向于不產生實質免疫反應或造成凝血或其它不良效應。術語"PEG"廣泛用于涵蓋任何聚乙二醇分子(不考慮大小或在PEG末端的修飾)，且可由下式表示與非天然氨基酸多肽鍵聯XO-(CH2CH20)n-CH2CH2-Y其中n為2到10,000且X為H或末端修飾，其包括(但不限于)d—4烷基、保護基或末端官能團。術語PEG包括(但不限于)其任何形式的聚乙二醇，其包括雙官能PEG、多臂PEG、衍生PEG、分叉PEG、分枝PEG(其中各鏈具有約1kDa到約100kDa、約1kDa到約50kDa或約1kDa到約20kDa的分子量)、側接PEG(即具有一個或一個以上與聚合物主鏈側接的官能團的PEG或相關聚合物)或其中具有可降解鍵的PEG。在一個實施例中，n為約20到約2000的PEG適用于本文中所述的方法和組合物中。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。聚合物的分子量可為寬范圍，其包括(但不限于)介于約100Da與約100,000Da或更大之間。聚合物的分子量可介于約100Da與約100,000Da之間，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6，000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約100Da與約50,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約100Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約1,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約5,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約10,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚乙二醇分子為分枝聚合物。支鏈PEG的分子量可介于約1,000Da與約IOO，OOODa之間，其包括(但不限于)IOO，OOODa、95,000Da、卯,OOODa、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8，000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da禾卩1,000Da。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量介于約1,000Da與約50,000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量介于約1,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量介于約5,000Da與約40，000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量介于約5,000Da與約20,000Da之間。多種PEG分子描述于(包括il不限于)ShearwaterPolymers,Inc.目錄、NektarTherapeutics目錄中，所述目錄是以引用的方式并入本文中。文獻中末端官能團的特定實例包括(但不限于)N-琥珀酰亞胺基碳酸酯(例如參看美國專利第5,281，698號、第5,468,478號)、胺(例如參看Buckmann等人，Makromol.Chem.182:1379(1981);Zalipsky等人，Eur.Polym.J.19:1177(1983))、酰肼(例如參看Andresz等人，Makromol.Chem.179:301(1978))、琥珀酰亞胺基丙酸酯和琥珀酰亞胺基丁酸酯(例如參看Olson等人，Poly(ethyleneglycol)Chemistry&BiologicalApplications,第170-181頁，Harris和Zalipsky編，ACS,Washington,D.C.,1997;也參看美國專利第5,672,662號)、琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(例如參看Abuchowski等人，CancerBiochem.Biophys.7:175(1984)和Joppich等人,Makromol.Chem.180:1381(1979))、琥珀酰亞胺酯(例如參看美國專利第4,670,417號)、苯并三唑碳酸酯(例如參看美國專利第5,650,234號)、縮水甘油醚(例如參看Pitha等人，Eur.JBiochem.94:11(1979);Elling等人，Biotech.Appl.Biochem.13:354(1991))、氧基羰基咪唑(例如參看Beauchamp等人，Anal.Biochem.131:25(1983);Tondelli等人，J.ControlledRelease1:251(1985))、碳酸對硝基苯酯(例如參看Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.,11:141(1985);和Sartore等人，Appl.Biochem.Biotech"27:45(1991))、醛(例如參看Harris等人,J.Polym.Sci.Chem.Ed.22:341(1984);美國專利第5,824,784號、美國專利第5,252,714號)、馬來酰亞胺(例如參看Goodson等人，Bio/Technology8:343(1990);Romani等人，ChemistryofPeptidesandProteins2:29(1984));和Kogan,SyntheticComm.22:2417(1992))、鄰吡啶基-二硫化物(例如參看Woghiren等人，Bioconj.Chem.4:314(1993))、丙烯醇(例如參看Sawhney等人，Macromolecules,26:581(1993))、乙烯基砜(例如參看美國專利第5,900,461號)。所有上述參考文獻和專利都是以引用的方式并入本文中。在一些情況下，PEG在一個末端上經羥基或甲氧基封端，g卩，X為H或CH3("甲氧基PEG")。或者，PEG可經反應性基團封端，從而形成雙官能聚合物。典型反應性基團可包括通常用于與可見于20種常見氨基酸中的官能團反應的那些反應性基團(包括(但不限于)馬來酰亞胺基、活化碳酸酯(包括但不限于對硝基苯酯)、活化酯(包括但不限于N-羥基琥珀酰亞胺、對硝基苯酯)和醛)以及對20種常見氨基酸呈惰性、但在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)與非天然氨基酸中存在的互補官能團特異性反應形成肟基的官能團；后者的實例包括(但不限于)羰基或二羰基和羥胺基。應注意，PEG的另一末端(其在上式中由Y表示)將通過非天然氨基酸與多肽直接或間接連接。如果Y為羥胺基，那么含羥胺的PEG試劑可在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)與多肽中含羰基或二羰基的非天然氨基酸反應，形成通過肟鍵與所述多肽偶合的PEG基團。如果Y為羰基或二羰基，那么含羰基或二羰基的PEG試劑可在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)與多肽中的含羥胺非天然氨基酸反應，形成通過肟鍵與所述多肽偶合的PEG基團。當需要將不同分子與聚合物的每一末端連接時，異雙官能衍生物也尤其有用。舉例來說，co-N-氨基-N-疊氮基PEG會允許具有活化親電子基團(例如醛、酮、活化酯、活化碳酸酯等等)的分子與PEG的一個末端連接且具有乙炔基的分子與PEG的另一個末端連接。在一些實施例中，強親核試劑(包括但不限于羥胺)可在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)與非天然氨基酸中存在的羰基(包括酮基)反應形成肟；在一些情況下，隨后肟基可通過用適當還原劑處理而進一步還原。或者，強親核試劑可通過非天然氨基酸并入多肽中且用于在存在本文中所述的促進劑的情況下(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)與水溶性聚合物中存在的羰基(包括酮基)優先反應形成肟。通常，PEG分子的至少一個末端可用于與非天然氨基酸反應。聚合物主鏈可為線性或分枝。所屬
技術領域：
中通常己知分枝聚合物主鏈。通常，分枝聚合物具有中心分枝核心部分和多個與中心分枝核心鍵聯的線性聚合物鏈。PEG是以分枝形式使用，其可通過向各種多元醇(例如甘油、甘油寡聚物、季戊四醇以及山梨糖醇)上增添環氧乙垸來制備。中心分枝部分也可衍生自若干種氨基酸(例如賴氨酸)。分枝聚乙二醇的通式可表示為R(-PEG-OH)m，其中R衍生自例如甘油、甘油寡聚物或季戊四醇的核心部分，且m表示臂數目。多臂PEG分子(例如美國專利第5,932,462號；第5,643,575號；第5,229,490號；第4，289，872號；美國專利申請案2003/0143596;WO96/21469;和WO93/21259中所述的多臂PEG分子，各所述文獻都是以引用的方式全部并入本文中)也可用作聚合物主鏈。分枝PEG也可為由PEG(-YCHZ2)n表示的分叉PEG的形式，其中Y為鍵聯基團，n為100-1,000(即，平均分子量介于約5kDa到約40kDa之間)，且Z為通過規定長度的原子鏈與CH鍵聯的活化末端基團。另一分枝形式(側接PEG)沿PEG主鏈而不是在PEG鏈的末端上具有反應性基團(例如羧基)。為最大化PEG的所需性質，一種或一種以上與生物活性分子連接的PEG聚合物的總分子量和水合狀態應足夠高以賦予通常與PEG聚合物連接相關的有利特性(例如水溶性和循環半衰期增加)，而不會不利地影響母體分子的生物活性。本文中所述的方法和組合物可用于制備實質上均質的聚合物:蛋白質接合物制劑。如本文中所用的"實質上均質"表示觀察到聚合物:蛋白質接合物分子大于總蛋白質的一半。所述聚合物:蛋白質接合物具有生物活性且本文中提供的本發明的"實質上均質"聚乙二醇化多肽制劑為足夠均質以顯示均質制劑的優點(例如，在批次之間藥物動力學的可預測性方面臨床應用的簡易性)的制劑。如本文中所用，且當涵蓋親水性聚合物:多肽/蛋白質接合物時，術語"治療有效量"指的是得到向患者提供益處的量。所述量將在不同個體之間改變且將視多種因素而定，其包括患者的整體身體狀況和疾病或病狀的潛在病因。所屬領域的一般技術人員使用公開可用的材料和程序可容易地確定本發明組合物的治療有效量。僅舉例來說，治療有效量可為使貧血患者血細胞容量增加的量；其可為減小癌癥患者腫瘤尺寸的量；其可為增加糖尿病患者胰島素水平的量；或其可為減少罹患慢性疼痛的患者的疼痛的量。與本文中所述的(經修飾)非天然氨基酸多肽鍵聯的水溶性聚合物的數目(即，聚乙二醇化或糖基化程度)可經調節以提供改變(包括但不限于增加或降低)的藥理學、藥物動力學或藥效特性，例如活體內半衰期。在一些實施例中，多肽的半衰期比未經修飾多肽增加至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70。/。、80%、90%、2倍、5倍、10倍、50倍或至少約100倍。在一個實施例中，包含含羰基或二羰基的非天然氨基酸的多肽在存在促進劑的情況下經含有與PEG主鏈直接鍵聯的末端羥胺部分的PEG衍生物修飾，從而形成肟鍵(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)。在一些實施例中，羥胺末端PEG衍生物將具有以下結構RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-0-NH2其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000(即，平均分子量介于約5kDa到約40kDa之間)。聚合物的分子量可為寬范圍，其包括(但不限于)介于約100Da與約100，000Da或更大之間。聚合物的分子量可介于約100Da與約100,000Da之間，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4，000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約100Da與約50,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約100Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約1,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約5,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物的分子量介于約10,000Da與約40,000Da之間。在另一個實施例中，包含含羰基或二羰基的氨基酸的多肽經含有通過酰胺鍵與PEG主鏈偶合的末端羥胺部分的PEG衍生物修飾，從而形成通過酰胺鍵與PEG主鏈進一步偶合的肟鍵(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)。在一些實施例中，羥胺末端PEG衍生物具有以下結構RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)m-0-NH2其中R為簡單垸基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000(即，平均分子量介于約5kDa到約40kDa之間)。在另一個實施例中，包含含羰基或二羰基的氨基酸的多肽經含有末端羥胺部分的分枝PEG衍生物修飾，從而形成肟鍵(但在不存在本文中所述的促進劑的情況下此反應效率可更低)，其中分枝PEG的各鏈具有在約10kDa到約40kDa的范圍內的平均分子量，且在其它實施例中，具有約5kDa到約20kDa的范圍內的平均分子量。在一些實施例中，含有羥胺基的PEG衍生物將具有以下結構[RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-C(0)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-0-NH2其中R為簡單垸基(甲基、乙基、丙基等)，X視情況為NH、O、S、C(O)或不存在，m為2-10且n為100-1,000。支鏈PEG的分子量可介于約1,000Da與約100,000Da之間，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70，000Da、65,000Da、60,000Da、55，000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量介于約1,000Da與約50,000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量介于約1,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量介于約5,000Da與約40,000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的分子量介于約5,000Da與約20,000Da之間。可獲得關于PEG的官能化和接合的若干概述和專論。例如參看Harris,ikfacromo/.C/z綴戶一.C25:325-373(1985);Scouten,逾/zocfe￡"，o/ogy135:30-65(1987);Wong等人，Mzcro6.Tec/mo/14:866-874(1992);Delgado等人，Cn"c"/iev/面z'w77zera/eM//cZ)rwgCarn'erS>\stew9:249-304(1992);Zalipsky,5z'oco_/Mgo^eCTew.6:150-165(1995)。用于活化聚合物的方法也可見于WO94/17039、美國專利第5,324,844號、WO94/18247、WO94/04193、美國專利第5,219,564號、美國專利第5,122,614號、WO90/13540、美國專利第5,281,698號和更多WO93/15189中，以及使活化聚合物與包括(但不限于)凝血因子VIII(WO94/15625)、血紅蛋白(WO94/0卯27)、攜氧分子(美國專利第4,412,989號)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，々少.B/orecA.11:141-52(1985))的酶接合的方法。必要時，可由一種或一種以上所屬領域的一般技術人員已知的程序進一步純化獲自疏水性色譜的本文中所述的聚乙二醇化非天然氨基酸多肽，這些程序包括(但不限于)親和色譜；陰離子或陽離子交換色譜(使用(包括但不限于)DEAESEPHAROSE);二氧化硅色譜；反相HPLC;凝膠過濾(使用(包括但不限于)SEPHADEXG-75);疏水相互作用色譜；尺寸排除色譜；金屬螯合物色譜；超濾/透濾；乙醇沉淀；硫酸銨沉淀；色譜聚焦；置換色譜；電泳程序(包括但不限于制備型等電聚焦)；差示溶解度(包括但不限于硫酸銨沉淀)；或萃取。可通過與球狀蛋白標準物(Preneta,AZ,PROTEINPURIFICATIONMETHODS,APRACTICALAPPROACH(Harris和Angal編)IRLPress1989,293-306)進行比較由GPC來估計表觀分子量。可通過蛋白水解降解(包括但不限于胰蛋白酶裂解)，接著質譜分析來評估非天然氨基酸多肽:PEG接合物的純度。PepinskyRB.等人，,尸/arwco/.在Ex/.7Tza297(3):1059-66(2001)。D.鍵聯基團的使用和應用，包括多肽二聚體和多聚體除向非天然氨基酸多肽上直接增添所需官能團之外，多肽的非天然氨基酸部分可首先經多官能(例如，雙官能、三官能、四官能)連接分子修飾，其隨后經進一步修飾。也就是說，多官能連接分子的至少一個末端與多肽中的至少一個非天然氨基酸反應且所述多官能連接子的至少另一個末端可用于進一步官能化。如果多官能連接子的所有末端都相同，那么可形成非天然氨基酸多肽的同多聚體(視化學計量條件而定)。如果多官能連接子的末端具有不同化學反應性，那么多官能連接子基團的至少一個末端可反應以與非天然氨基酸多肽結合且另一末端可隨后與不同官能團(包括(僅舉例來說)所需官能團)反應。多官能連接子基團具有以下一般結構<formula>formulaseeoriginaldocumentpage77</formula>其中各X獨立地為NH2、-C(=0)R9、-SR'或-J-R，其中R9為H或OR'，其中J為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage77</formula>R為H、烷基、經取代烷基、環垸基或經取代環垸基；各R"獨立地為H、烷基、經取代垸基或保護基，或當存在一個以上R"基團時，兩個R"視情況形成雜環垸基；各R'獨立地為H、垸基或經取代垸基；各L獨立地選自由以下各基團組成的群組亞垸基、經取代亞烷基、亞烯基、經取代亞烯基、-o-、-o-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-s-、-s-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-s(o)k-(其中k為l、2或3)、-S(O)k(亞垸基或經取代亞垸基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞垸基)-、-N(R')-、-NR'-(亞烷基或經取代亞垸基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-(亞烷基或經取代亞烷基)NR'C(O)O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-O-CON(R')-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-N(R')CO-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-N(R')C(O)O-、-N(R')C(O)O-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-S(0)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)N(R')-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(0)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-;Lj為視情況可選的，且當存在時為-C(R')p-NR'-C(O)O-(亞烷基或經取代亞烷基)-,其中p為0、1或2;W為NH2、-C(=0)R9、-SR'或-J-R;且n為1至lj3，只要X和L-LrW—起獨立地各自提供至少一個以下基團即可(a)羥胺基，其能夠與非天然氨基酸或(經修飾)非天然氨基酸多肽上的羰基(包括二羰基)反應；(b)羰基(包括二羰基)，其能夠與非天然氨基酸或(經修飾)非天然氨基酸多肽上的羥胺基反應；或(c)羰基(包括二羰基)，其能夠經歷與非天然氨基酸或(經修飾)非天然氨基酸多肽上的肟基的交換反應。在另一個或替代性說明性實施例中，式(I)化合物或式(XIV)化合物與式(XIX)的多官能連接子的摩爾比率為約1:2;1:1;1.5:1;1.5:2;2:1;1:1.5;2:1.5或1.5至lj2。連接子具有兩個相同末端(即羥胺基)的雙官能同連接子可用于通過形成肟鍵來形成偶合多肽，其中所述偶合多肽的形成是在存在至少一種促進劑的情況下(但在不存在促進劑的情況下肟鍵也可以較低反應速率出現)進行。希望在多肽二聚體和多聚體的形成中使用本文中所述的促進劑以提供顯著益處，因為連接子與第一多肽的化學計量比率或連接子-(第一多肽)復合物與第二多肽的比率在存在促進劑的情況下將比在不存在促進劑的情況下更接近化學計量(或者，此外，隨著促進劑的摩爾比率增大，前述反應物的比率將更接近化學計量)。由于試劑(包括多肽和用于接合的分子)的費用和純化的困難性，化學計量比率(或摩爾比率)為多肽修飾中的重要因素。因此，使用本文中提供的促進劑可用于降低成本和減少由非天然氨基酸多肽修飾(包括形成多肽二聚體或多聚體，或將任何所需基團或官能團與多肽鍵聯)產生的廢物。此連接子可用于形成含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽的同二聚體以形成兩個肟鍵，其中任一個或兩個是在存在至少一種促進劑的情況下(但在不存在促進劑的情況下肟鍵也可以較低反應速率出現)形成。或者，如果此連接子的一個末端經保護，那么此部分保護連接子可用于通過肟鍵與含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽的未經保護羥胺末端結合，留下另一個經保護末端，其在脫保護后可用于其它鍵聯反應。或者，小心操作試劑的化學計量可提供類似結果(異二聚體)，但結果為其中所需異二聚體將有可能會被一些同二聚體污染。此連接子也可用于形成含羥胺非天然氨基酸多肽的同二聚體以形成兩個肟鍵，其中任一個或兩個是在存在至少一種促進劑的情況下(但在不存在促進劑的情況下肟鍵也可以較低反應速率出現)形成。或者，如果此連接子的一個末端經保護，那么此部分保護連接子可用于通過肟鍵與含羥胺非天然氨基酸多肽的未經保護羰基末端結合，留下另一個經保護末端，其在脫保護后可用于其它鍵聯反應。或者，小心操作試劑的化學計量可提供類似結果(異二聚體)，但結果為其中所需異二聚體將有可能會被一些同二聚體污染。各連接子具有一種以上類型的末端反應性基團(即羥胺基、肟基和硫酯基)的多官能異連接子可用于通過形成至少一個肟鍵來形成偶合多肽，其中所述肟鍵的形成是在存在至少一種促進劑的情況下進行。使用在整個本說明書中論述的促進劑促進的肟基化學，此連接子可用于形成非天然氨基酸多肽的異二聚體。本文中所述的方法和組合物也提供多肽組合，例如同二聚體、異二聚體、同多聚體或異多聚體(即三聚體、四聚體等)。僅舉例來說，以下描述集中在GH超基因家族成員，但這個部分中所述的方法、技術和組合物可應用于可以二聚體和多聚體的形式提供益處的幾乎任何其它多肽，其包括(僅舉例來說)(X-l抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗體、抗體片段、載脂蛋白、脫輔基蛋白、心房利鈉因子、心房利鈉多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、T39765、NAP-2、ENA隱78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-IO、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降鐘素、c-kit配體、細胞因子、CC趨化因子、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白-2、單核細胞趨化蛋白-3、單核細胞炎性蛋白-lct、單核細胞炎性蛋白-i卩、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配體、c-kit配體、膠原蛋白、集落刺激因子(CSF)、補體因子5a、補體抑制劑、補體受體l、細胞因子、上皮中性粒細胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生長因子(EGF)、上皮中性粒細胞活化肽、促紅細胞生成素(EPO)、剝脫性毒素、因子ix、因子vn、因子vni、因子x、成纖維細胞生長因子(fgf)、纖維蛋白原、纖維連接蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-l、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺激素、生長因子、生長因子受體、grf、刺猬蛋白、血紅蛋白、肝細胞生長因子(hGF)、水蛭素、人類生長激素(hGH)、人類血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受體、LFA-1、LFA-1受體、胰島素、類胰島素生長因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干擾素(IFN)、IFN-a、IFN-p、IFN-y、任何類干擾素分子或IFN家族成員、白細胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-ll、IL-12、角質化細胞生長因子(KGF)、乳鐵傳遞蛋白、白血病抑制因子、熒光素酶、神經營養因子、中性粒細胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、成骨蛋白、致癌基因產物、paracitonin、甲狀旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致熱外毒素A、致熱外毒素B、致熱外毒素C、pyy、松弛素、腎素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性補體受體I、可溶性I-CAM1、可溶性白細胞介素受體、可溶性TNF受體、生長調節素、生長抑素、生長激素、鏈激酶、超抗原、葡萄球菌腸毒素、FLT、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、類固醇激素受體、超氧化物歧化酶、中毒性休克綜合癥毒素、胸腺素a1、組織型纖溶酶原活化因子、腫瘤生長因子(TGF)、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子a、腫瘤壞死因子卩、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管內皮生長因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受體、孕酮受體、睪酮受體、醛固酮受體、LDL受體和皮質酮。非天然氨基酸多肽也可與生長激素超基因家族的任何多肽成員同源。因此，本文中所述的方法、技術和組合物中涵蓋含有一個或一個以上直接與多肽主鏈或通過連接子與另一個GH超基因家族成員或其變體或非GH超基因家族成員的任何其它多肽或其變體結合的非天然氨基酸的GH超基因家族成員多肽。由于其與單體相比分子量增加，所以GH超基因家族成員二聚體或多聚體接合物相對于單體GH超基因家族成員可顯示新穎或所需性質，其包括(但不限于)不同的藥理學、藥物動力學、藥效，經調節的治療半衰期或經調節的血漿半衰期。在一些實施例中，本文中所述的GH超基因家族成員二聚體將調節GH超基因家族成員受體的二聚合。在其它實施例中，本文中所述的GH超基因家族成員二聚體或多聚體將充當GH超基因家族成員受體拮抗劑、激動劑或調節劑。在一些實施例中，本文中所述的方法和組合物提供通過與水溶性活化聚合物反應而形成的包含一種或一種以上GH超基因家族成員的多聚體，所述聚合物具有以下結構R-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-X其中n為約5到3，000，m為2-10，X可為含羥胺或羰基或二羰基的部分，且R為可與X相同或不同的封端基團、官能團或離去基。R可為(例如)選自由以下各基團組成的群組的官能團羥基、經保護羥基、垸氧基、N-羥基琥珀酰亞胺基酯、1-苯并三唑基酯、N-羥基琥珀酰亞胺基碳酸酯、1-苯并三唑基碳酸酯、乙縮醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨基氧基、經保護胺、酰肼、經保護酰肼、經保護硫醇、羧酸、經保護羧酸、異氰酸酯、異硫氰酸酯、馬來酰亞胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、環氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟乙磺酸酯、烯烴和酮。使用詳述于整個本說明書中的化學，所屬領域的一般技術人員可用非天然氨基酸多肽來設計一種連接子，其中至少一個官能團可在存在本文中所揭示的促進劑的情況下形成肟基；所述連接子上的其它官能團可利用其它已知化學，其包括有機化學技術中眾所周知的基于親核試劑/親電子試劑的化學。可通過向反應混合物中加入促進劑來增強由(a)含羥胺非天然氨基酸多肽與含羰基試劑的反應或(b)含羰基非天然氨基酸多肽與含羥胺試劑的反應通過至少一個肟基鍵聯在一起的多肽二聚體或多聚體的形成。所述促進劑為具有至少一種以下性質的化合物(a)增大含羰基化合物與含羥胺化合物形成含肟化合物的反應速率，其中速率增大是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(b)降低含羰基化合物與含羥胺化合物形成含肟化合物的反應的活化能，其中活化能降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(C)增加含羰基化合物與含羥胺化合物反應生成含肟化合物的產率，其中產率增加是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(d)降低含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物的溫度，其中溫度降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(e)減少含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物所需的時間，其中時間減少是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(f)降低在非天然氨基酸多肽上形成肟基所需的試劑量，其中試劑量降低是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(g)減少由含羰基化合物與含羥胺化合物反應形成含肟化合物所產生的副產物，其中副產物的減少是相對于不存在促進劑的情況下的反應來說；(h)不會不可逆地破壞在存在促進劑的情況下經歷肟形成反應的多肽的三級結構(當然，除了反應目的在于破壞此三級結構之外)；(i)可在真空中與含肟化合物分離；和(j)調節含羰基化合物與含羥胺化合物的反應。在其它實施例中，促進劑具有至少兩種前述性質、三種前述性質、四種前述性質、五種前述性質、六種前述性質、七種前述性質、八種前述性質、九種前述性質或所有前述性質。在另一個實施例中，促進劑不具有任何一種前述性質。促進劑的使用包括使用單一促進劑或多種促進劑。另外，促進劑與含羰基化合物的摩爾比率包括介于約0.5:1與5000:1之間的值，其包括(僅舉例來說)4000:1、3000:1、2000:1、1000:1、500:1、400:1、300:1、200:1、100:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1和0.5:1。此夕卜，促進劑與含羥胺化合物的摩爾比率包括介于約0.5:1與5000:1之間的值，其包括(僅舉例來說)4000:1、3000:1、2000:1、1000:1、500:1、400:1、300:1、200:1、100:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1和0.5:1。此外，促進劑包括可在真空中從所得含肟化合物中實質上去除的化合物。此外，促進劑包括含有二胺部分、氨基脲部分、肼或酰肼部分的化合物。此外，在任何前述方面或實施例中，促進劑選自由雙官能芳香族胺、氧代胺衍生物和具有以下結構的化合物組成的群組<formula>formulaseeoriginaldocumentpage82</formula>其中Rx、Ry和Rz選自由以下各基團組成的群組Lx-H、Lr烷基、U-芳基、U-雜芳基、Lx-烯基、Lx-炔基、Lx-烷氧基和Lx-烷基胺，其中Lx為鍵、C(=0)、C(=NH)、C(二NH)-NH和SO、S02。在另一個實施例中，促進劑為雙官能芳香族胺。在另一個實施例中，芳香族胺選自以下群組雙官能芳香族胺<formula>formulaseeoriginaldocumentpage82</formula>在另一個實施例中，促進劑為氧代胺衍生物。在另一個實施例中，氧代胺衍生物選自以下群組氧代胺衍生物M人"B1Me義0^N'此外，促進劑包括選自由以下各物組成的群組的化合物:H2N^W丫2々H々H"其中Rx、Ry和Rz選自由以下各基團組成的群組Lx-H、Lx-烷基、Lr芳基、U-雜芳基、Lx-烯基、U-炔基、Lx-垸氧基和Lr烷基胺，其中U為鍵、C(=0)、C^NH)和C(-NH)-NH。此外，在任何前述方面或實施例中，促進劑選自圖5、圖9或圖10中所呈示的化合物，例如包括圖5的化合物6、8、10、7和20中的任一種。在任何前述方面或實施例中，促進劑包括在與含羰基反應后可形成腙的試劑。此外，在任何前述方面中，促進劑活性視與酮部分的反應速率和所得中間體的穩定性而定。此外，在任何前述方面或實施例中，包含促進劑、含羰基化合物和含羥胺化合物的反應混合物的pH值在約2.0與10之間；在約2.0與9.0之間；在約2.0與8.0之間；在約3.0與7.0之間；在約4.0與6.0之間；在約3.0與10.0之間；在約4.0與10.0之間；在約3.0與9.0之間；在約3.0與8.0之間；在約2.0與7.0之間；在約3.0與6.0之間；在約4.0與9.0之間；在約4.0與8.0之間；在約4.0與7.0之間；在約4.0與6.5之間；在約4.5與6.5之間；約4.0;約4.5;約5.0;約5.5;約6.0;約6.5;禾口約7.0。在替代系統中的表達已使用若干種策略以在非重組宿主細胞、突變宿主細胞或不含細胞的系統中將非天然氨基酸引入蛋白質中。這些系統也適用于制造本文中所述的非天然氨基酸多肽。氨基酸經例如Lys、Cys和Tyr的反應性側鏈衍生使得賴氨酸轉化為N、乙酰基-賴氨酸。化學合成也提供并入非天然氨基酸的直接方法。通過肽片段的酶促連接和天然化學連接的新近發展，有可能制造較大蛋白質。例如參看P.E.Dawson和S.B.H.Kent,人nnu.R_cv.Biochem,69:923(2000)。化學肽連接和天然化學連接描述于美國專利第6,184,344號、美國專利公開案第2004/0138412號、美國專利公開案第2003/0208046號、WO02/098902和WO03/042235中，其是以引用的方式并入本文中。能夠支持蛋白質生物合成的將用所需非天然氨基酸化學酰化的抑制性tRNA加入到活體外提取物中的通用活體外生物合成方法已用于將100個以上非天然氨基酸位點特異性地并入幾乎任何尺寸的多種蛋白質中。例如參看V.W.Cornish,D.Mendel和P.G.Schultz,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995，34:621(1995);C丄Noren,S丄Anthony-Cahill,M.C.Griffith,P.G.Schultz,4geraem/附"/ioi/s"e-5/e"ycZwco;770ra"'owo/w朋o^m/aw/"oac她/"toj9TOf"'/w,Science244:182-188(1989);和J.D.Bain,C.G.Glabe，T.A.Dix,A.R.Chamberlin,E.S.Diala，B/osyw^Wc57'/"e邵ec折cZwcor/7ora^iowo/awwwWMra/aTm'woflc/t//wfoa/o/yj9ep/"/叔J.Am.Chem.Soc.111:8013-8014H989)。已經將多種官能團引入用于研究蛋白質穩定性、蛋白質折疊、酶機理和信號轉導的蛋白質中。已開發被稱作選擇性壓力并入的活體內方法來使用野生型合成酶的雜亂性。例如參看N.Budisa，C.Minks,S.Alefelder,W.Wenger，F.M.Dong,L.Moroder和R.Huber,F雄BJ.,13:41(1999)。向細胞供應特定天然氨基酸的相關代謝路徑關閉的營養缺陷型菌株生長于含有有限濃度的天然氨基酸的基本培養基中，而靶基因的轉錄受到抑制。在固定生長期開始時，天然氨基酸被耗盡且經非天然氨基酸類似物置換。誘導重組蛋白的表達使得含有非天然類似物的蛋白質積聚。舉例來說，已使用這種策略將鄰氟苯丙氨酸、間氟苯丙氨酸和對氟苯丙氨酸并入蛋白質中，且其在UV光譜中顯示兩個可容易地鑒別出的特征性肩，例如參看C.Minks,R.Huber,L.Moroder和N.Budisa,Anal.Biochem.,284:29(2000);三氟甲硫氨酸已用于置換噬菌體T4溶菌酶中的甲硫氨酸以通過19FNMR研究其與殼寡糖配體的相互作用，例如參看H.Duewel,E.Daub,V.Robinson和丄RHonek,Biochemistrv,36:3404H997、:且三氟亮氨酸已代替亮氨酸并入，使得亮氨酸-拉鏈蛋白的熱穩定性和化學穩定性增加。例如參看Y.Tang,G.Ghirlanda,W.A.Petka，T.Nakajima,W.F.DeGrado和D.A.Tirrell,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,40:1494(2001)。此外，硒代甲硫氨酸和碲代甲硫氨酸經并入各種重組蛋白中以促進X射線結晶學中的相溶解。例如參看W.A.Hendrickson,J.R.Horton和D.M.Lemaster，EMBOJ.,9:1665(1990);J.O.Boles,K.Lewinski,M.Kunkle,J.D.Odom,B.Dunlap,L.Lebioda和M.Hatada,Nat.Struct.Biol"1:283(1994);N.Budisa,B.Steipe,P.Demange,C.Eckerskorn，J.Kellermann和R.Huber，Eur.J.Biochem.,230:788(1995);和N.Budisa,W.Karnbrock,S.Steinbacher,A.Humm，L.Prade，T.Neuefeind，L.Moroder和R.Huber,J.Mol.Biol"270:616(1997)。具有烯或炔官能團的甲硫氨酸類似物也已有效并入，使得可通過化學方式對蛋白質進行其它修飾。例如參看J.C.vanHest和D.A.Tirrell,FEBSLett.,428:68(1998);J.C.vanHest，K.L.Kiick和D.A.Tirrell,J.Am.Chem.Soc.122:1282(2000);和K.L.Kiick和D.A.Tirrell,Tetrahedron,56:9487(2000);美國專利第6,586,207號；美國專利公開案第2002/0042097號，其是以引用的方式并入本文中。這種方法的成功取決于氨基酰基-tRNA合成酶對非天然氨基酸類似物的識別，所述合成酶通常需要高選擇性以確保蛋白質翻譯的保真度。擴展這種方法的范圍的一種方式在于放寬氨基酰基-tRNA合成酶的底物特異性，其己在有限數目的情況下實現。舉例來說，在大腸桿菌苯丙氨酰基-tRNA合成酶(PheRS)中由Gly置換Ala294增加底物結合口袋的尺寸，且導致對氯苯丙氨酸(p-Cl-Phe)對tRNAPhe的酰化。參看，M.Ibba,P.Kast和H.Hennecke,Biochemistry,33:7107(1994)。帶有這種突變PheRS的大腸桿菌株使得對氯苯丙氨酸或對溴苯丙氨酸可代替苯丙氨酸并入。例如參看M.Ibba和H.Hennecke,FEBSLett.,364:272(1995);和N.Sharma,R.Furter,P.Kast和D.A.Tirrell,FEBSLett..467:37(2000)。類似地，顯示接近大腸桿菌酪氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸結合位點的點突變Phel30Ser使得重氮酪氨酸可比酪氨酸更有效地并入。參看F.Hamano-Takaku,T.Iwama,S.Saito-Yano,K.Takaku,Y.Monden，M.Kitabatake,D.Soil禾口S.Nishimura,J.Biol.Chem.,275:40324(2000)。在活體內將非天然氨基酸并入蛋白質中的另一種策略為修飾具有校對機制的合成酶。這些合成酶不能區分在結構上與同源天然氨基酸類似的氨基酸且因此將其活化。此錯誤在單獨位點上得到修正，使來自tRNA的錯裝配氨基酸去酰基化以保持蛋白質翻譯的保真度。如果合成酶失去校對活性，那么錯活化的結構類似物可避開編輯功能且經并入。近來已用纈氨酰基-tRNA合成酶(ValRS)證實這種方法。參看V.Doring,H.D.Mootz,L.A.Nangle，T.L.Hendrickson,V.deCrecy-Lagard，P.Schimmel禾口P.Marliere,Scisnc6,292:501(2001)。ValRS可使具有Cys、Thr或氨基丁酸根(Abu)的tRNAVal錯氨基酰基化；隨后通過編輯域水解這些非同源氨基酸。在大腸桿菌染色體的隨機突變誘發之后，選擇在ValRS的編輯位點中具有突變的突變大腸桿菌株。這種編輯缺陷型ValRS錯誤地用Cys裝配tRNAVal。因為Abu與Cys在空間上類似(Cys的-SH基團是由Abu中的-CH3置換)，所以當這種突變大腸桿菌株在存在Abu的情況下生長時，突變ValRS也將Abu并入蛋白質中。質譜分析顯示在天然蛋白質中的各纈氨酸位置處約24%的纈氨酸由Abu置換。固相合成和半合成方法也已允許合成多種含有非天然氨基酸的蛋白質。舉例來說，參看以下公開案和其中引用的參考文獻，其為如下Crick,F.H.C.,Barrett,L.Brenner,S.Watts-Tobin,R.G^wenar/m^w"code/orpra^/ws.Nature,192:1227-1232(1961);Hofmann,K.,Bohn，H.Sh^e51j7—戸Wtfes1.XOT7.77^0//^razo/e-fw/t/azo/ere//flcewewAyiS-;rofe/wacrf/vahwg/ofewc少awiS-pepf/^fe/mg膨w/,J.AmChem,88(24):5914-5919(1966);Kaiser，E.T.S聲/^/c卿，c/^Zu'o/og/c"http://^a"/vepep^fey"wc//7ra^7xy/wc/wd/wgew^z膨s，AccChemRes,22:47-54(1989);Nakatsuka,T.,Sasaki，T.,Kaiser，E.T.尸eW^fesegmew/cowp//gcaf"/戸dye/w/^^/^/ze/Zce/727we/7z/ayw6/z7/57'"，JAmChemSoc,109:3808-3810(1987);Schnolzer，M.,Kent，SBH.Cows&wWwg/w"/wsdov"a///wgww/7ra&"eJsj;w^z"/c/ep"'^fes:6acA:6,-睥/騰m/i/化Science,256(5054):221-225(1992);Chaiken,I.M.5^脂'，/Z/"/c戸W^CRCCritRevBiochem,11(3):255-301(1981);Offord，R.E./Vofe/we"g7'weerz>7gc/ze/w/ca/ProteinEng.,1(3):151-157(1987);禾口Jackson,D.Y"Burnier,J.,Quan,C，Stanley,M.，Tom,J.,\Vells，J.A.爿DeWgwed戶^pnWeZigase/or7b^3/5[vw^^57s7z.6owwc/e(xye爿H77/zt/wwa/wra/C"fa(yf/c7es/(iwe51，Science,266(5183):243(1994)。化學修飾已用于在活體外向蛋白質中引入多種包括輔因子、自旋標記和寡核苷酸的非天然側鏈。例如參看Corey,D.R.,Schultz,P.GGewera"ow0/"/^6〃W,wewce-，czyc57>7g/e-Wmm/eddeo:c，7)owwc/eflM,Science,238(4832》1401-1403(1987》Kaiser,E.T.，LawrenceD.S.，Rokita,S.E.77^c/ze/w/ca/附o^^^cahowo/ew2y/waf/c^y/7eczyk:a乂AtinuRevBiochem,54:565-595(1985);Kaiser，E.T.，Lawrence,D.S.C7ze/w/ca/附wfadowew^yzmeG"z.veW/^y，Science,226(4674):505-511(1984);Neet,K.E.,NanciA，Koshland,D.E.0/麵/，雄我JBiol.Chem,243(24):6392隱6401(1968》Polgar,L.B.etM丄.Bender,爿wewco/to>n>7ga57w^/7ca〃少/onwet/ac"ve57Ye.TTuW-sw^'/^'w.J,AmChemSoc,88:3153-3154(1966);和Pollack,S丄，Nakayama,G.Schultz,P.G./"fradwc"owo/wwc/eop/n',esawd^e"mscop/c，06^fwfoaw"'6o辦comZ/m'wgs/to,Science,242(4881):1038-1040(1988)。或者，使用化學修飾氨基酰基-tRNA的生物合成方法已用于將若干種生物物理探針并入在活體外合成的蛋白質中。參看以下公開案和其中所引用的參考文獻Brmmer,J.iVewP/zofo/afte//^am/cm^/wA:/^m"/zo叔Ajinu.RevBiochem,62:483-514(1993》禾口Krieg,U.C.，AValter，P.,Hohnson,A.E./^o/ocrossZ/whwgo/f/2es/g7a/se《wewcewasce//F，o/a"/w0/f/ze54-A77oda/加戶/3^W(ie57gwfl/recogm"owpaWc/e，Proc.Natl.Acad.Sci,83(22):8604-8608(1986)。先前已顯示可通過向用含有所需琥珀無義突變的基因編程的蛋白質合成反應中加入化學氨基酰基化的抑制性tRNA而在活體外將非天然氨基酸位點特異性地并入蛋白質中。使用這些方法，我們可使用對特定氨基酸來說為營養缺陷型的菌株，用接近的結構同源物取代多種20種常見氨基酸，例如，用氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如參看Noren，C丄,Anthony-Cahill,Griffith,M.C.，Schultz,P.G.爿gewem//weAod/or57Ye-^c(/c/wcor/7on3"owo/M朋afMm/a附/wo/柳/ro/">w，Scisncs'244:182-188(1989);M.W.Nowak等人，Science268:439-42(1995);Bain,J.D.,Glabe,C.G"Dix,T.A.,Chamberlin，A.R.,Diala,E.S.5!'osyM^ie"'cs"e鄰ec!yc7ncor/o尸a"'owo/awow-wa^wm/acidiw/oa/oiy戸;"We，J.AmChemSoc,111:8013-8014(1989);N.Budisa等人，FASEBJ.13:41-51(1999);Ellman,J.A.,Mendel,D.,Anthony-Cahill,S.，Noren,C.J.,Schultz,P.G.所o5yw/Z^"c附"/zoi//orz'"加^"'"gM""fl/"wm/訓/"ootcz'fifesz'/"g-s/7eczyco^(y/"o/ra^z'w51,MethodsinEnz..301-336(1992);和Mendel,D.,Cornish,V.W.和Schultz，P.G.Sz7e-D/re"edJl/MMge"^^w故aw五x/aw;fec/Gew"/cCWe,AnnuRevBiophvs.BiomolStruct.24,435-62(1995)。關于將非天然氨基酸并入蛋白質和其它多肽中的活體內方法和制備適當的合成酶/tRNA的方法的以下專利是以引用的方式全部并入本文中美國專利第7,045,337號和第7,083,970號。舉例來說，制備識別終止密碼子UAG的抑制性tRNA且用非天然氨基酸使其化學氨基酰基化。常規定點突變誘發用于在蛋白質基因中的所關注位點處引入終止密碼子TAG。例如參看Sayers,J.R.，Schmidt,W.Eckstein,F.5'-3'五xo"KC〖ease//20印/o/"W/u'oo^e-6asedo//gwowc/eo"We-Wre"ed/wwtoge,XNucldcAcidsRss,16(3):791-802(1988)。當酰基化抑制性tRNA和突變基因組合于活體外轉錄/翻譯系統中時，回應UAG密碼子而并入非天然氨基酸，得到在指定位置處含有所述氨基酸的蛋白質。使用卩H]-Phe的實驗和使用a-羥基酸的實驗證實在由UAG密碼子指定的位置處僅并入所需氨基酸且此氨基酸未在蛋白質中的任何其它位點處并入。例如參看Noren等人，同上文；Kobayashi等人，(2003)NatureStructuralBiology10(6):425-432;和Ellman,J.A.,Mendel,D.,Schultz,P.G.幼e邵e"yc/wcorpom".owo/wove/6ac&Z)owe欲w"i^esz'wfo戸to'似，Science,255(5041):197-200(1992)。tRNA可通過任何方法或技術(包括但不限于化學或酶促氨基酰基化)經所需氨基酸氨基酰基化。可通過氨基酰基tRNA合成酶或其它酶促分子(包括但不限于核糖酶)來實現氨基酰基化。術語"核糖酶"可與"催化性RNA"互換。Cech和同事(Cech,1987,Science,236:1532-1539;McCorkle等人，1987，ConceptsBiochem.64:221-226)證實可充當催化劑的天然存在RNA(核糖酶)的存在。然而，盡管僅已展示這些天然RNA催化劑對核糖核酸底物起作用以進行裂解和剪接，但關于核糖酶的人工進化的新近發展已擴展對各種化學反應進行潛在催化。研究已鑒別出可在其自身(2')3'-末端上催化氨基酰基-RNA鍵的RNA分子(Illangakekare等人，1995Science267:643-647)，和可將氨基酸從一個RNA分子轉移到另一個RNA分子上的RNA分子(Lohse等人，1996，Nature381:442-444)。美國專利申請公開案2003/0228593(其是以引用的方式并入本文中)描述建構核糖酶的方法和其在用天然編碼氨基酸和非天然氨基酸氨基酰基化tRNA中的用途。可氨基酰基化tRNA的底物固定形式的酶性分子(包括但不限于核糖酶)使得能夠有效親和性純化氨基酰基化產物。適合底物的實例包括瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和磁性珠粒。用于氨基酰基化的底物固定形式的核糖酶的制備和用途描述于ChemistryandBiology2003，10:1077-1084和美國專利申請公開案2003/0228593中，所述文獻是以引用的方式并入本文中。化學氨基酰基化方法包括(但不限于)由Hecht和同事(Hecht,S.M.Ace.Chem.Res.1992,25,545;Heckler,T.G;Roesser,J.R.;Xu,C;Chang，P.;Hecht,S.M.Biochemistry1988，27,7254;Hecht,S.M.;Alford,B.L.;Kuroda,Y.;Kitano,S.J.Biol.Chem.1978，253,4517)和由Schultz、Chamberlin、Dougherty和其它人(Cornish，V.W.;Mendel,D.;Schultz，P.G.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995,34,621;Robertson,S.A.;Ellman,J.A.;Schultz,P.G.J.Am.Chem.Soc.1991,113,2722;Noren，C.J.;Anthony-Cahill,S.J.;Griffith,M.C;Schultz,P.G.Science1989,244,182;Bain,J.D.;Glabe,C.G.;Dix,T.A.;Chamberlin,A.R.J.Am.Chem.Soc.1989,111,8013;Bain,J.D.等人，Nature1992,356,537;Gallivan,J.P.;Lester,H.A.;Dougherty,D.A.Chem.Biol.1997,4,740;Turcatti等人，J.Biol.Chem.1996,271,19991;Nowak，M.W.等人，Science,1995,268,439;Saks，M.E.等人,J.Biol.Chem.1996,271,23169;Hohsaka，T.等人,J.Am.Chem.Soc.1999,121,34)介紹的方法，以避免在氨基酰基化中使用合成酶。這些方法或其它化學氨基酰基化方法可用于氨基酰基化本文中所述的tRNA分子。用于產生催化性RNA的方法可包括產生隨機化核糖酶序列的單獨集合，對集合進行定向進化，篩檢集合的所需氨基酰基化活性，且選擇顯示所需氨基酰基化活性的那些核糖酶的序列。核糖酶可包含促進酰化活性的基元和/或區域，例如GGU基元和富含U的區域。舉例來說，已報道富含U的區域可促進氨基酸底物的識別，且GGU基元可與tRNA的3'末端形成堿基對。GGU基元和富含U的區域組合起來同時促進氨基酸與tRNA的同時識別，且從而促進tRNA的3'末端的氨基酰基化。可通過使用與tRNAAsVccG接合的部分隨機化r24mini進行活體外選擇，接著系統性工程化可見于活性克隆中的一致序列來產生核糖酶。由這種方法獲得的示范性核糖酶被稱作"Fx3核糖酶"且描述于美國公開申請案第2003/0228593號(其內容是以引用的方式并入本文中)中，其充當用于合成各種裝配有同源非天然氨基酸的氨基酰基-tRNA的通用催化劑。可將氨基酰基化tRNA核糖酶固定于底物上以使得能夠有效親和性純化氨基酰基化tRNA。適合底物的實例包括(但不限于)瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和磁性珠粒。可利用RNA的化學結構將核糖酶固定于樹脂上，例如RNA的核糖上的3'-順式二醇可經高碘酸鹽氧化以產生相應二醛以促進RNA在樹脂上的固定。可使用各種類型的樹脂(包括廉價酰肼樹脂)，其中還原性胺化使樹脂與核糖酶之間的相互作用成為不可逆鍵聯。可由此柱上氨基酰基化技術(on-columnaminoacylationtechnique)顯著促進氨基酰基-tRNA的合成。Kourouklis等人，Methods2005;36:239-4描述基于柱的氨基酰基化系統。可用多種方式實現氨基酰基化tRNA的分離。一種適合方法為從具有緩沖液的柱洗提氨基酰基化tRNA，所述緩沖液為例如具有10mMEDTA的乙酸鈉溶液、含有50mMN-(2-羥基乙基)哌嗪-N'-(3-丙烷磺酸)、12.5mMKC1(pH7.0)、10mMEDTA的緩沖液或僅為經EDTA緩沖的水(pH7.0)。氨基酰基化tRNA可加入到翻譯反應中以并入氨基酸，tRNA在由翻譯反應產生的多肽中的所選位置處經其氨基酰基化。可使用本文中所述的氨基酰基化tRNA的翻譯系統的實例包括(但不限于)細胞溶菌液。細胞溶菌液提供從所輸入mRNA活體外翻譯多肽所必需的反應組分。這些反應組分的實例包括(但不限于)核糖體蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻譯起始和延伸因子以及與翻譯相關的其它因子。另外，翻譯系統可為分批翻譯或間隔翻譯。分批翻譯系統將反應組分組合于單一隔室中，而間隔翻譯系統將翻譯反應組分與可展示翻譯效率的反應產物隔開。這些翻—譯系統在市面上有售。此外，可使用偶合轉錄/翻譯系統。偶合轉錄/翻譯系統使得可將輸入DNA轉錄為相應mRNA,其轉而由反應組分進行翻譯。市售偶合轉錄/翻譯的實例為RapidTranslationSystem(RTS,RocheInc.)。所述系統包括含有大腸桿菌溶菌液以提供例如核糖體和翻譯因子的翻譯組分的混合物。另外，包括用于將輸入DNA轉錄為用于翻譯的mRNA模板的RNA聚合酶。RTS可通過反應隔室(包括供應/消耗隔室和轉錄/翻譯隔室)之間所插入的膜使用反應組分的分隔化。可由其它試劑(包括但不限于轉移酶、聚合酶、催化抗體、多官能蛋白質等等)進行tRNA的氨基酰基化。Stephan在Scientist2005年10月10日；第30-33頁中描述將非天然氨基酸并入蛋白質中的其它方法。Lu等人在MolCell.2001年10月；8(4):759-69中描述蛋白質與含有非天然氨基酸的合成肽化學連接(經表達蛋白質連接)的方法。微注射技術也己用于將非天然氨基酸并入蛋白質中。例如參看M.W.Nowak,P.C.Kearney,J.R.Sampson,M.E.Saks，C.G.Labarca，S.K.Silverman,W.G.Zhong,J.Thorson,J.N.Abelson,N.Davidson,P.G.Schultz，D.A.Dougherty和H.A.Lester,Sci6ncs,268:439(1995);和D.A.Dougherty,Curr.Opin.Chem.Biol.,4:645(2000)。將爪蟾卵母細胞(xenopusoocyte)與在活體外產生的以下兩種RNA物質共同注射在所關注氨基酸位置處用UAG終止密碼子編碼靶蛋白的mRNA和經所需非天然氨基酸所氨基酰基化的琥珀抑制性tRNA。卵母細胞的翻譯機構隨后在由UAG指定的位置處插入非天然氨基酸。這種方法已使得可活體內結構-功能研究通常不適用于活體外表達系統的整體膜蛋白。實例包括將熒光氨基酸并入速激肽神經激肽-2受體中以通過熒光共振能量轉移測量距離，例如參看G.Turcatti,K.Nemeth，MD.Edgerton,U.Meseth,RTalabot,M.Peitsch，J.Knowles,H.Vogel和A.Chollet，J.Biol.Chem.,271:19991(1996);并入生物素化氨基酸以鑒別離子通道中的表面暴露殘基，例如參看J.P.Gallivan，H.A.Lester和D.A.Dougherty,Chem.Biol.,4:739(1997);使用籠蔽酪氨酸類似物以實時監控離子通道中的構象變化，例如參看J.C.Miller,S.K.Silverman,P.M.England,D.A.Dougherty和H.A.Lester,Neuron,20:619(1998);以及使用a羥基氨基酸來改變用于探究其門控機制的離子通道主干。例如參看P.M.England,Y.Zhang,D.A.Dougherty和H.A.Lester,￡^1,96:89(1999);和T.Lu,A.Y.Ting,J.Mainland,L.Y.Jan,P.G.Schultz和J.Yang,Nat.Neurosci.,4:239(2001)。在活體內直接將非天然氨基酸并入蛋白質中的能力提供多種優點，其包括(僅舉例來說)突變蛋白的高產率、技術簡易性、在細胞中或可能在活有機體中研究突變蛋白的可能性以及這些突變蛋白在治療性治療和診斷性用途中的用途。將具有各種尺寸、酸度、親核性、疏水性和其它性質的非天然氨基酸納入蛋白質中的能力可極大地擴展我們理性且系統性地操縱蛋白質結構的能力，以探究蛋白質功能且產生具有新穎性質的新穎蛋白質或有機體。在位點特異性地并入對F-Phe的一次嘗試中，將酵母琥珀抑制性tRNAPheCUA/苯丙氨酰基-tRNA合成酶對用于對F-Phe抗性、Phe營養缺陷型大腸桿菌株中。例如參看R.Furter,ProteinSci..7:419(1998)。使用不含細胞的(活體外)翻譯系統也有可能獲得本文中所述的非天然氨基酸多肽的表達。翻譯系統可為細胞性或不含細胞系統，且可為原核或真核系統。細胞翻譯系統包括(但不限于)所需核酸序列被轉錄為mRNA且所述mRNA被翻譯的全細胞制劑，例如滲透細胞或細胞培養物。不含細胞的翻譯系統在市面上有售且眾所周知許多不同類型和系統。不含細胞的系統的實例包括(但不限于)原核溶菌液，例如大腸桿菌溶菌液；和真核溶菌液，例如麥芽提取物、昆蟲細胞溶菌液、兔網狀細胞溶菌液、兔卵母細胞溶菌液和人類細胞溶菌液。當所得蛋白質經糖基化、磷酸化或以其它方式經修飾時，可優選真核提取物或溶菌液，因為許多這些修飾只可能在真核系統中。一些所述提取物和溶菌液在市面上有售(Promega;Madison,Wis.;Stratagene;LaJolla,Calif.;Amersham;ArlingtonHeights,111.;GIBCO/BRL;GrandIsland,N.Y.)。也可用膜提取物(例如含有微粒體膜的犬胰腺提取物)，其適用于翻譯分泌蛋白。在可包括mRNA作為模板(活體外翻譯)或DNA作為模板(組合型活體外轉錄和翻譯)的這些系統中，由核糖體指導活體外合成。對于開發不含細胞的蛋白質表達系統已作出相當大的努力。例如參看Kim，D.M.和J.R.Swartz,am/5/oe"gz"eeWwg,74:309-316(2001);Kim,D.M.和J.R.Swartz,5zorec/mo/ogy22，1537-1542,(2000);Kim,D.M.和J.R.Swartz,/Vogmw,16，385-390,(2000);Kim，D.M.禾口J.R.Swartz,awe/所oe"g/匿〃'wg,66，180-188,(1999);和Patnaik,R.和J.R.Swartz,萬/o/ec/m々證24，862-868,(1998);美國專利第6,337,191號；美國專利公開案第2002/0081660號；WO00/55353;WO90/05785，其是以引用的方式并入本文中。可應用于非天然氨基酸多肽表達的另一種方法包括mRNA-肽融合技術。例如參看R.Roberts和J.Szostak,/Voc.A^/JcW.Sc/.(T/&4」94:12297-12302(1997);A.Frankel等人，C^w^fry在所o/ogy10:1043-1050(2003)。在這種方法中，在核糖體上將與嘌呤霉素(puromycin)鍵聯的mRNA模板翻譯為肽。如果一種或一種以上tRNA分子已經修飾，那么非天然氨基酸也可并入肽中。在已讀取最后一個mRNA密碼子之后，嘌呤霉素捕獲肽的C末端。如果發現所得mRNA-肽接合物在活體外分析中具有引人關注的性質，那么易于根據mRNA序列揭示其特性。用這種方式，可篩檢包含一個或一個以上非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽的文庫以鑒別具有所需性質的多肽。最近，已報道使用純化組分進行活體外核糖體翻譯，其可合成經非天然氨基酸取代的肽。例如參看A.Forster等人，iVoc.Sc/.(m4)100:6353(2003)。也可使用重建構翻譯系統。純化翻譯因子的混合物也已成功地用于將mRNA翻譯為蛋白質以及溶菌液或補充有純化翻譯因子(例如起始因子-l(IF-1)、IF-2、IF-3(a或卩)、延伸因子T(EF-Tu)或終止因子)的溶菌液的組合。不含細胞的系統也可為偶合轉錄/翻譯系統，其中DNA經引入系統中，轉錄為mRNA且所述mRNA經翻譯，如O/rreW尸rafoco/s/"JWo/ecw/arB/o/ogy(F.M.Ausubel等人編輯，WileyInterscience,1993)中所述，所述文獻是以引用的方式特定地并入本文中。轉錄于真核轉錄系統中的RNA可為異核RNA(hnRNA)或5'-端帽(7-甲基鳥苷)和3'-端polyA尾成熟mRNA的形式，其在某些翻譯系統中可為優點。舉例來說，封端mRNA在網狀細胞溶菌液系統中經高效翻譯。實例實例l:在存在促進劑的情況下改良肟形成含羰基化合物(非天然氨基酸多肽)展示于流程1A中。并入蛋白質中的氨基酸對乙酰基苯丙氨酸的酮基與含羥胺化合物反應形成相對穩定的肟。此反應具高特異性。在存在促進劑的情況下觀測到更快反應(流程1B)。實例2:使用30KPEGhGH-pAcF接合來篩檢潛在促進劑使用在35位處用對乙酰基苯丙氨酸取代酪氨酸的人類生長激素(hGH)來篩檢一組20種化合物(圖5)。使用PD10柱將hGH緩沖交換于hGH反應緩沖液(20mMNaOAc、20mg/ml甘氨酸、5mg/ml甘露糖醇、1mMEDTA，pH4.0)中，且使用Centrocon(10KMWCO)濃縮器濃縮到10mg/ml。將hGH(10pl)與3.6nl單羥胺30KPEG(2.5mM)、3pl潛在促進劑溶液(200mM，于hGH反應緩沖液中)和緩沖液混合，得到30pl最終體積。hGH:PEG的摩爾比率為1:2。將反應混合物在28'C下培養16小時和36小時且通過SDS-PAGE進行分析(圖6)。將圖6中展示的各凝膠色帶用圖5中所示的測試化合物進行標記。各凝膠的最后一條色帶為對照反應(無促進劑)。化合物6、7、8、10和20為促進劑。面板上的兩種化合物(化合物7和20)(乙酰肼)(展示于圖5中)為促進劑且在類似反應條件下在較高hGH蛋白質濃度(8mg/ml)下經進一步評估。將反應混合物在28'C下培養16小時，且SDS-PAGE分析結果展示于圖7中。色帶1為具有1:2的hGH:PEG摩爾比率和50mM促進劑化合物7的反應混合物。色帶2為具有1:2的hGH:PEG摩爾比率和50mM促進劑化合物20的反應混合物。色帶3為具有1:2的hGH:PEG摩爾比率、不具有促進劑的反應混合物。色帶4為具有1:5的hGH:PEG摩爾比率、不具有促進劑的反應混合物。16小時后，顯示兩種化合物都催化反應。實例3:用促進劑培養后hGH的LCMS分析在hGH反應緩沖液中，將野生型hGH(5.8mg/ml)在28'C下用各種濃度的促進劑乙酰肼(200mM、100mM、50mM、25mM、12.5mM、6.25mM和0mM)培養48小時。通過透析(10kMWCO)去除促進劑。用LCMS分析所得蛋白質溶液(圖8)。圖8A展示整個LCMS跡線。圖8B展示不具有促進劑的hGH的質譜。圖8C展示具有200mM促進劑乙酰肼的hGH的質譜。用于蛋白質接合的促進劑優選不對蛋白質施加任何變質影響，例如碎裂、沉淀和不良共價修飾。在scFv與hGH使用的所有條件下根據SDS-PAGE分析和蛋白質沉淀觀測到在使用促進劑7和20(展示于圖5中)時無碎裂。舉例來說，在用至多200mM促進劑20(乙酰肼)將野生型hGH培養48小時后，用LCMS未檢測到共價修飾。在所有條件下hGH測量到的分子量相同且與理論值22256匹配。實例4:scFv-pAcF的單步二聚合以下接合實驗使用在259位處具有經取代的對乙酰基苯丙氨酸的單鏈Fv(scFv)108蛋白(scFv108259-pAcF)。使用PD10柱將存儲緩沖液中的scFv108259-pAcF緩沖交換于反應緩沖液(150mMNaCl、20mMNaOAc、5mMEDTA，pH4.0)中。將蛋白質溶液濃縮到0.5mM，與羥胺同雙官能2KPEG連接子2.5mM儲備溶液混合且補充有作為促進劑的乙酰肼。最終反應混合物由147jiM同雙官能2KPEG連接子、相應濃度的經pAcF取代的scFv和47mM乙酰肼組成。將反應混合物在28"下培養且在不同時間點(6小時、20小時、44小時)通過SDS-PAGE進行分析(圖2)。為使與同雙官能2KPEG連接子的單步反應更有效且更實用，使用促進劑來促進二聚合過程。在不具有促進劑的情況下，在20小時后根據SDS-PAGE可檢測到極少二聚體產物。6小時、20小時和44小時凝膠的色帶4展示scFv:PEG連接子摩爾比率為2.0:1、不具有促進劑乙酰肼的反應混合物。另一方面，在存在47mM乙酰肼的情況下，在6小時后出現二聚體產物。如圖2中所示，測試不同的蛋白質與連接子的摩爾比率(1.6:1、2.0:1和2.4:1)來研究最佳接合條件。6小時、20小時和44小時凝膠的色帶1展示scFv:PEG連接子摩爾比率為1.6:1、具有乙酰肼的反應混合物。6小時、20小時和44小時凝膠的色帶2展示scFv謹接子摩爾比率為2.0:l、具有乙酰肼的反應混合物。6小時、20小時和44小時凝膠的色帶3展示scFv:連接子摩爾比率為2.4:1、具有乙酰肼的反應混合物。作為對照，在不存在同雙官能PEG連接子的情況下用47mM乙酰肼將scFv108培養44小時。未觀測到二聚體形成。6小時、20小時和44小時凝膠的色帶5展示scFv與促進劑乙酰肼的反應混合物，其中不具有PEG連接子。此結果指示促進劑乙酰肼不利于scFv中分子間二硫鍵的形成。在存在同雙官能PEG連接子的情況下，通過PEG連接子與蛋白質之間的肟形成產生二聚體。實例5:單羥胺30KPEG與scFv-pAcF接合將上述反應緩沖液(10^1)中的scFvl08259-pAcF0.5mM儲備溶液與各種量的單羥胺30KPEG2.5mM儲備溶液、2.2nl200mM乙酰肼儲備溶液和反應緩沖液混合。最終反應體積為22pl的反應混合物具有不同的scFv:PEG摩爾比率(1:3或1:5)。在具有和不具有促進劑的情況下在蛋白質與PEG的摩爾比率為1:3和1:5的情況下評估乙酰肼對單羥胺30KPEG與scFv接合的加速作用。在28°C下培養反應混合物且根據SDS-PAGE在不同時間點(20小時、44小時)進行分析(圖3)。色帶1、2和3分別展示100%、20%和10%的起始scFv-pAcF。20小時和44小時凝膠的色帶4展示scFv:PEG摩爾比率為1:3、具有20mM乙酰肼的反應混合物。20小時和44小時凝膠的色帶5展示scFv:PEG摩爾比率為1:3、不具有促進劑的反應混合物。20小時和44小時凝膠的色帶6展示scFv:PEG摩爾比率為1:5、具有20mM乙酰肼的反應混合物。20小時和44小時凝膠的色帶7展示scFv:PEG摩爾比率為1:5、不具有促進劑的反應混合物。接合結果證實乙酰肼加速接合反應。在蛋白質:PEG的摩爾比率為1:3、具有促進劑的情況下的反應比在蛋白質:PEG的比率為1:5、不具有促進劑的情況下的反應進行得更快。類似地評估在scFv:30KPEG單羥胺摩爾比率為1:2的情況下不同濃度的促進劑乙酰肼(5mM、20mM、80mM)的相對接合效率(圖4)。在28"C下培養反應混合物。色帶l展示具有5mM乙酰肼的反應混合物(scFv:30KPEG單羥胺摩爾比率為1:2)。色帶2展示具有20mM乙酰肼的反應混合物(scFv:30KPEG單羥胺摩爾比率為1:2)。色帶3展示具有80mM乙酰肼的反應混合物(scFv:30KPEG單羥胺摩爾比率為1:2)。色帶4展示不具有乙酰肼的反應混合物(scFv:30KPEG單羥胺摩爾比率為l:5)。色帶5、6和7分別展示10%、20%和100%的起始scFv-pAcF。SDS-PAGE分析展示促進劑濃度越高，接合越快。在存在80mM促進劑的情況下在scFv:PEG摩爾比率為1:2時的接合比在不具有促進劑的情況下scFv:PEG摩爾比率為1:5時的接合更快。實例6:加速肟形成的小分子研究將苯乙酮(0.5mM)與緩沖為約4.0的pH值的水溶液形式的乙基羥胺(lmM)反應；將一系列促進劑(20mM)加入到此反應混合物中來測定促進劑特性對肟形成的速率和產率的影響(參看圖10(a))。此典型反應中所測試的促進劑呈示于圖10(b)中。在2小時、5小時、9小時和24小時后從反應混合物中取等分試樣且通過高效液相色譜進行分析。另外，對于這些樣品中的每一個來說，將酮峰吸光率與使用UV/Vis光譜分析在260nm下的肟峰吸光率進行比較。圖11呈示反應2小時和9小時后的結果。如所見，所有促進劑增大肟形成的速率；然而，促進劑1和7(展示于圖10(b)中)提供最高產率，其中促進劑l在較長反應時間后提供最高產率。不限于特定理論，促進劑的活性似乎取決于與酮反應的速率和腙中間體的穩定性。應了解本文中所述的實例和實施例僅為說明性目的且對其進行的各種更改或變化將建議給所屬領域的一般技術人員且包括在本申請案的精神和范圍內以及隨附申請專利范圍的范圍內。本文中所引用的所有公開案、專利和專利申請案因此是出于所有目的以引用的方式全部并入本文中。權利要求1.一種反應混合物，其包括包含芳香族酮部分的化合物、包含羥胺部分的化合物和選自由雙官能芳香族胺、氧代胺衍生物和具有以下結構的化合物組成的群組的促進劑其中Rx、Ry和Rz選自由以下各基團組成的群組Lx-H、Lx-烷基、Lx-芳基、Lx-雜芳基、Lx-烯基、Lx-炔基、Lx-烷氧基和Lx-烷基胺，其中Lx為鍵、C(＝O)、C(＝NH)、C(＝NH)-NH、SO和SO2。2.根據權利要求1所述的反應混合物，其中所述包含芳香族酮部分的化合物為氨基酸或多肽。3.根據權利要求1所述的反應混合物，其中所述包含芳香族酮部分的化合物具有以下結構其中:R為垸基、經取代垸基環烷基或經取代環烷基;Ri為H、氨基保護基、樹脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且R2為OH、酯保護基、樹脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；其中各Ra獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代烷基、-N(R')2、-C(0)kR'(其中k為l、2或3)、-C(0)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'組成的群組。4.根據權利要求1所述的反應混合物，其中所述包含羥胺部分的化合物此外包含聚合物部分。5.根據權利要求1所述的反應混合物，其中所述包含羥胺部分的化合物具有以下結構<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(xxvn)其中各L為獨立地選自由以下各基團組成的群組的連接子亞烷基、經取代亞垸基、亞烯基、經取代亞烯基、-o-、-o-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-s-、-s-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-S(0)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-(亞垸基或經取代亞垸基)NR'C(O)O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-O-CON(R')-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R')CO-(亞烷基或經取代亞垸基)-、-N(R')C(O)O-、-N(R')C(O)O-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)N(R')-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(0)kN(R')-、-N(R')-N=-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N^-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'獨立地為H、烷基或經取代垸基。6.根據權利要求1所述的反應混合物，其中所述促進劑為雙官能芳香族胺。7.根據權利要求1所述的反應混合物，其中所述促進劑為氧代胺衍生物。8.—種衍生式(III)的氨基酸的方法，所述方法包含在存在促進劑的情況下使所述氨基酸與式(XXVII)的試劑接觸，其中式(III)對應于其中R為垸基、經取代垸基、環垸基或經取代環烷基；Ri為H、氨基保護基、樹脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且R2為OH、酯保護基、樹脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；其中各Ra獨立地選自由H、鹵素、垸基、經取代烷基、-N(R')2、-C(0)kR'(其中k為l、2或3)、-C(0)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'組成的群組，其中式(XXVII)對應于PEG-0~NH(xxvn)其中各L為獨立地選自由以下各基團組成的群組的連接子亞烷基、經取代亞烷基、亞烯基、經取代亞烯基、-O-、-O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(0)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烷基或經取代亞垸基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-(亞烷基或經取代亞垸基)NR'C(O)O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-O-CON(R')-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-N(R')CO-(亞烷基或經取代亞垸基)-、-N(R')C(O)O-、-N(R')C(O)O-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)N(R')-(亞烷基或經取代亞垸基)-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(0)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N^[]-C(R')2-N(R')-N(R')-,其中各R'獨立地為H、烷基或經取代垸基；且其中所述促進劑選自由雙官能芳香族胺、氧代胺衍生物和具有以下結構的化合物組成的群組<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中Rx、Ry和Rz選自由以下各基團組成的群組Lx-H、U-垸基、Lx-芳基、Lx-雜芳基、U-烯基、U-炔基、Lx-烷氧基和U-垸基胺，其中U為鍵、C(=0)、C(=NH)、C(=NH)-NH和SO、S02。9.根據權利要求8所述的方法，其中R為垸基。10.根據權利要求8所述的方法，其中R為CH3。11.根據權利要求8所述的方法，其中所述促進劑具有以下結構H2N-NH-C(0)-Rb，其中Rb為垸基、經取代垸基、NH-NH2、H或垸氧基。12.根據權利要求11所述的方法，其中Rb為垸基或烷氧基。13.根據權利要求8所述的方法，其中所述促進劑選自由稱為圖5的6、7、8、10和20的化合物組成的群組。14.根據權利要求8所述的方法，其中所述促進劑為雙官能芳香族胺。15.根據權利要求14所述的方法，其中所述雙官能芳香族胺選自由以下各物組成的群組雙官能芳香族胺<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>16.根據權利要求8所述的方法，其中所述促進劑為氧代胺衍生物。17.根據權利要求16所述的方法，其中所述氧代胺選自由以下各物組成的群組-氧代胺衍生物18.根據權利要求8所述的方法，其中PEG基團的分子量介于約1,000Da與約40,000Da之間。19.根據權利要求8所述的方法，其中所述氨基酸是在約室溫下與水溶液形式的式(XXVII)的試劑接觸。20.根據權利要求8所述的方法，其中所述氨基酸是在介于約4到約10之間的pH值下與水溶液形式的式(XXVII)的試劑接觸。21.根據權利要求8所述的方法，其中氨基酸與所述式(XXVII)試劑的摩爾比率選自約1:2;1:1;1.5:1;1.5:2;2:1;1:1.5;2:1.5;和1.5到2的群組。22.根據權利要求8所述的方法，其中所述式(III)氨基酸已在多肽的活體內翻譯期間位點特異性地并入。23.根據權利要求8所述的方法，其中衍生氨基酸包含至少一種具有式(XI-A)的結構的含肟氨基酸其中R為H、垸基、經取代垸基、環烷基或經取代環垸基;Ri為H、氨基保護基、樹脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且R2為OH、酯保護基、樹脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；其中各Ra獨立地選自由H、鹵素、烷基、經取代垸基、-N(R')2、-C(0)kR'(其中k為l、2或3)、-C(0)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'組成的群組，Rs為L-X，其中X為PEG;且L為可選的，且當存在時為選自由以下各基團組成的群組的連接子亞垸基、經取代亞垸基、亞烯基、經取代亞烯基、-O-、-O-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-S-、-S-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-S(0)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞垸基或經取代亞烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞垸基或經取代亞烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-N(R')-、-NR'-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亞垸基或經取代亞垸基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亞烷基或經取代亞垸基)-、-N(R')CO-(亞烷基或經取代亞烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(0)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(0)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'獨立地為H、烷基或經取代烷基。24.—種根據權利要求23所述的衍生氨基酸。25.根據權利要求24所述的衍生氨基酸，其中所述氨基酸經并入作為生長激素超基因家族成員的治療性蛋白質中。26.根據權利要求25所述的衍生氨基酸，其中所述治療性蛋白質為人類生長激素。全文摘要本發明公開了用于由含羰基化合物與含羥胺化合物反應來形成含肟化合物的促進劑。含肟化合物、含羰基化合物和含羥胺化合物可各自為非天然氨基酸或非天然氨基酸多肽。本發明還公開了這些促進劑用于形成含肟化合物的用途、所得含肟化合物和含有這些促進劑的反應混合物。文檔編號C07C249/00GK101400646SQ200680041547公開日2009年4月1日申請日期2006年11月8日優先權日2005年11月8日發明者鋒田,苗振偉申請人:Ambrx公司