專利名稱：：肽-免疫球蛋白綴合物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及肽-免疫球蛋白綴合物(peptide-immunoglobulin曙conjugate)，其中兩個或者兩個以上的肽凈皮分別綴合到免疫球蛋白的輕鏈或重鏈的一個末端。這些肽在氨基酸水平上可以是不同的、相似的或者相同的。與肽綴合的免疫球蛋白是非功能性的免疫球蛋白(notfunctionableimmunoglobulin)。
背景技術：
：人免疫缺陷病毒(HIV)對細胞的感染通過病毒膜與將被感染的細胞的細胞膜融合的過程而實現。對于此過程提出了一個一般性的模式病毒包膜糖蛋白復合物(gpl加/gp41)與位于將被感染的細胞的細胞膜上的細胞表面受體相互作用。gpl20與例如CD4受體以及諸如CCR-5或CXCR-4的共受體相結合，引起gpl20/gp41復合物的構象的改變。這種構象改變的結果是gp41蛋白能夠插入到靶細胞的膜中。這種插入是膜融合過程的開始。已知由于天然發生的多態性，不同HIV林之間的gp41蛋白的^J^酸序列不同。但是可以識別出相同的結構域構造，確切地，從N端到C端的方向為融合信號、兩個七肽重復序列結構域(HR1，HR2)和跨膜結構域。據稱該融合(fusion或fusogenic)結構域參與了插入細胞膜和細胞膜的解體。該HR區由多段包括7個氨基酸(七肽)的序列構成(例如參見Shu，W"etal"Biochemistry38(1999)5378-5385)。除了七肽，還有一個或多個類亮氨酸拉鏈基序。這個組成解釋了gp41蛋白以及同樣地衍生自這些結構域的肽的巻曲螺旋結構的形成。巻曲螺旋通常是由兩個或兩個以上相互作用的螺旋組成的寡聚物。具有自gp41的HR1或HR2結構域推導的^酸序列的肽在體外和體內是細胞攝取HIV的有效抑制劑(例如參見如US5，464，933、US5,656,480、US6,258,782、US6,348,568或US6,656,906中所述的肽)。例如，T20(也稱為DP178，Fuzeon,—種HR2肽)和T651(US6,479,055)是非常有效的HIV感染的抑制劑。采用例如氨基酸替代或化學交聯的方法，已經嘗試增強HR2衍生肽的效力(Sia，S.K.等，PNASUSA99(2002)14664-14669;Otaka，A.等Angew.Chem.Int.Ed.41(2002)2937-2940)。肽綴合到某些分子上可以改變其藥物代謝動力學性質，例如可以提高這種肽綴合物的血清半衰期。報道的綴合物例如為PEG化的白細胞介素6(EP0442724)、PEG化的促紅細胞生成素(WO01/02017)、包含內皮抑制素和免疫球蛋白的嵌合分子(US2005/008649)、基于分泌抗體的融合蛋白(US2002/147311)、包含白蛋白的融合多肽(US2005/0100991、Ajk清白蛋白US5,876,969)、PEG化的多肽(US2005/0114037)和干擾素融合物。這些方法的目的是融合例如多肽和免疫球蛋白以便組合免疫球蛋白的抗原決定特性和多肽的生物活性。因此綴合物的免疫球蛋白部分展示靼向功能，并且多肽部分提供生物活性。例如已經報道包括白樹毒素和抗體的免疫毒素(WO94/26910)、修飾的轉鐵蛋白-抗體融合蛋白(US2003/0226155)、抗體-細胞因子融合蛋白(US2003/0049227)和由具有免疫刺激的、膜轉運的或同嗜性的活性的肽和抗體組成的融合蛋白(US2003/0103984)。在WO2004/085505中報道了由化學連接到大分子上的生物活性化合物組成的長效的生物活性綴合物。
發明內容本發明的目的是提供肽-免疫球蛋白綴合物，其中多于一個的肽綴合到所述的免疫球蛋白上。本發明包括肽-免疫球蛋白綴合物，其中該免疫球蛋白由兩個重鏈或兩個重鏈和兩個輕鏈組成，其中該免疫球蛋白是非功能性的免疫球蛋白，其中通過肽鍵將免疫球蛋白鏈的g末端氨基酸綴合到肽的氨基末端氨基酸上，或者將肽的泉基末端氨基酸綴合到免疫球蛋白鏈的氨基末端氮基酸上，并且其中該綴合物具有下述的通式免疫球蛋白-[肽n其中n是從2至8的整數。在一個實施方案中，該肽是生物活性肽。i在另一個實施方案中，該肽由肽接頭和生物活性肽組成。在一個實施方案中，,合物的肽的氨基酸序列彼此間具有90%或者更高的同一性。在另外一個實施方案中，該免疫球蛋白或者是G類免疫球蛋白(IgG)或者是E類免疫球蛋白(IgE)。在另一個實施方案中，該生物活性多肽是抗融合(antifusogenic)肽。在再一實施方案中，該非功能性的免疫球蛋白是以l(T5mo1/1或者更高的Ko值結合人抗原的免疫球蛋白。在再一實施方案中，該非功能性的免疫球蛋白是如下的免疫球蛋白a)其重鏈和/或輕鏈缺少一個或者多個構架區或/和高變區的部分或者全部，或者b)其重鏈和/或輕鏈無可變區，或者c)其對人抗原具有l(T5mo1/1或者更高的結合親和性，或者d)其對人抗原具有10-5mo1/1或者更高的結合親和性，并且對非人類抗原具有1(T"mol/l或者更低的結合親和性。本發明進一步包括用于制備本發明的綴合物的方法，由此該方法包括在適于表達該綴合物的條件下培養含有包含一個或者多個編碼本發明的綴合物的核酸分子的一種或者多種表達載體的細胞，以及從細胞或者培養基中回收該綴合物。本發明還包括含有本發明的綴合物或其藥學上可接受的鹽以及藥學上可接受的賦形劑或載體的藥物組合物。本發明進一步包括本發明的綴合物在制備用于治療病毒感染的藥物中的用途。在一個實施方案中，該病毒感染是HIV感染。本發明還包括使用本發明的綴合物治療需要抗病毒治療的患者的方法。發明詳述本發明包括肽-免疫球蛋白綴合物，其中該免疫球蛋白由兩個重鏈或者兩個重鏈和兩個輕鏈組成，其中該免疫球蛋白是非功能性的免疫球蛋白，其中肽鍵將免疫球蛋白鏈的羧基末端氨基酸綴合到肽的氨基末端氨基酸上，或者將肽的氛基末端氨基酸綴合到免疫球蛋白鏈的氨基末端氨基酸上，并且其中該綴合物具有下逸的通式，其中該[肽]部分在此通式中的位置不表示該肽連接到免疫球蛋白上的綴合位置，即，M酸位置，免疫球蛋白-[肽n其中n是從2至8的整數。在本發明的范圍中，一些使用的術語具有如下定義"基因"指表達肽、多肽或者蛋白質所必需的，例如在染色體上或者在質粒上的片段。除編碼區之外，基因還含有其他功能性元件，包括啟動子、內含子和終止子。"結構基因"指不帶信號序列的基因編碼區。"抗融合肽"是抑制與膜融合相關的事件或者膜融合事件本身的肽，包括例如，抑制由膜融合導致的、病毒對未感染細胞的感染。這些抗融合肽優選是線性肽。例如，其可以衍生自gp41的胞外域，例如，DP107或DP178。這些肽的實例可以見于US5,464,933、US5，656，480、US6,013,263、US6,017,536、US6，020，459、US6,093,794、US6,060,065、US6,258,782、US6,348,568、US6,479,055、US6，656，卯6、WO1996/19495、WO1996/40191、WO1999/59615、WO2000/69卯2和WO2005/067960。例如，這些肽的氨基酸序列包含或者可以選擇自US5,464,933的SEQIDNO:1至10;US5,656,480的SEQIDNO:1至15;US6,013,263的SEQIDNO:1至10和16至83的群體；US6，017，536的SEQIDNO:1至10，20至83和139至149;US6,093,794的SEQIDNO:1至10,17至83和210至214;US6,060,065的SEQIDNO:1至10，16至83和210至211;US6,258,782的SEQIDNO:1286和1310;US6,348,568的SEQIDNO:1129，1278-1309，1311和1433;US6,479,055的SEQIDNO:1至10和210至238;US6,656,906的SEQIDNO:1至171，173至216，218至219，222至228，231，233至366，372至398，400至456，458至498,500至570，572至620，622至651，653至736，739至785，787至811，813至815，816至823，825，827至863，865至875，877至883，885，887至8卯，892至981，986至999,1001至1003，1006至1018，1022至1024，1026至1028，1030至1032，1037至1076，1078至1079，1082至1117，1120至1176,1179至1213，1218至1223,1227至1237，1244至1245，1256至1268，1271至1275，1277，1345至1348，1350至1362，1364，1366，1368，1370，1372，1374至1376，1378至1379，1381至1385，1412至1417,1421至1426，1428至1430，1432，1439至1542，1670至1682,1684至1709,1712至1719，1721至1753,1755至1757，或者WO2005/067960的SEQIDNO:5至95。抗融合肽具有由5至100個氨基酸，優選地10至75個氨基酸，并且更優選地15至50個M酸組成的M酸序列。本文4吏用的術語"生物活性分子"指有機分子，例如諸如肽、蛋白、核蛋白、粘蛋白、脂蛋白、合成的多肽或者蛋白質的生物大分子，當施用于人工生物系統諸如使用細胞系和病毒的生物試驗中時，或者當體內給予動物包括但不限于鳥類和包括人類在內的哺乳動物時，生物活性分子引起生物效應。該生物效應可以是，但不限于酶的抑制、激活或者別構修飾、受體的結合(在結合位點或者在周圍)、受體的阻斷或激活或者信號的觸發。"表達載體"是編碼待在宿主細胞中表達的蛋白質的核酸分子。典型地，表達栽體包括原核質粒擴增單位，例如對于大腸桿菌，包括復制起點，以及選擇標記、真核選擇標記，以及一個或多個用于表達目的基因的表達盒，每個表達盒包括啟動子、結構基因和轉錄終止子，包括多聚腺苷酸化信號。基因表達通常被置于啟動子的控制下，并且這樣的核酸被稱為"可操作地連接"(operablylinked)在啟動子上。相似地，如果調控元件調節核心啟動子的活性，則該調控元件與核心啟動子可操作地連接。"多順反子轉錄單位"是其中有多于一個的結構基因處于相同的啟動子控制下的轉錄單位。"分離的肽"是基本上沒有污染性細胞組分的多肽，該細胞組分例如是碳水化合物、脂類或者天然與該及bf目關的其他的蛋白質雜質。典型地，分離的肽的制品含有高度純化形式的肽，即至少大約80%的純度，至少大約90%的純度，至少大約95%的純度，大于95%的純度或者大于99%的純度。一種證實某蛋白制品含有分離的肽的方法是在該蛋白制品經過十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳和考馬斯亮藍染色凝膠后出現單一的條帶。然而，術語"分離的"不排除存在相同肽的可選物理形式諸如二聚體或者糖基化或者衍生化的形式。如本文使用的，術語"免疫球蛋白"指由一個或多個基本上由免疫球蛋白基因編碼的多肽組成的蛋白質和其衍生物或者片段。組成免疫球蛋白的不同的多肽基于其重量被稱為輕鏈和重鏈。公認的免疫球蛋白基因包括不同的恒定區基因以及無數的免疫球蛋白可變區基因。免疫球蛋白可以以多種形式存在。每個重鏈和輕鏈都包含可變結構域(區)(通常是該多肽鏈的M端部分)。免疫球蛋白的輕鏈或者重鏈的可變結構域包含不同的片段，即4個構架區(FR)和三個高變區(CDR)。每個重鏈和輕鏈多肽鏈都包括恒定區(通常為該多肽鏈的羧基端部分)。重鏈的恒定結構域/區介導抗體結合至i)攜帶Fc-y受體(FcYR)的細胞，例如吞噬細胞，或者ii)攜帶新生兒Fc受體(FcRn)，也稱為Brambell受體的細胞。其還介導與一些因子，包括諸如組分(Clq)的經典補體系統的因子，的結合。根據本發明的免疫球蛋:白包括至少兩個重鏈多肽。任選地，兩個輕鏈多肽可以存在。根據本發明的免疫球蛋白是非功能性的免疫球蛋白。本發明中使用的術語"非功能性的免疫球蛋白"指以如下KD值結合人抗原的免疫球蛋白，所述KD值(結合親和性)為l(T5mol/1或者更高(例如1(T311101/1)，優選KD值為10"mol/1或者更高。用諸如表面等離子體共振技術(Biacore)等標準的結合試驗可以測定結合親和性。不必將此結合親和性看作一個確切的值，其僅僅是一個參考點。其用于確定和/或選擇對人耙標/抗原顯示出不具有免疫球蛋白典型的特異性靶結合并且因此無人類治療活性的免疫球蛋白，即例如，非功能性的免疫球蛋白是不發生序列特異性抗原/表位結合的免疫球蛋白。同時，例如基于離子相互作用的非特異性相互作用，完全可能存在。這不排除該免疫球蛋白顯示出對非人類靼標/抗原的特異性耙結合。此非人抗原的特異耙結合與10-7mol/1或更低的(例如1(T1Gmol/1)KD值相關，優選與10—8mol/1或更低的KD值相關。用于本申請的術語"接頭"或者"肽接頭"指天然和/或合成來源的肽接頭。其由線性M酸鏈構成，其中20種天然存在的M酸是單體構件。該鏈具有1至50個氨基酸的長度，優選介于3和25個氨基酸之間的長度。接頭可以包含重復的氨基酸序列或者天然多肽的序列，例如具有鉸鏈功能的多肽。接頭具有通過允許綴合到免疫球蛋白上的肽正確折疊并且恰當呈現從而確保其能夠實施其生物學活性的功能。優選的接頭是被設計為富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或絲氨酸殘基的"合成的肽接頭"。這些殘基以例如最多5個氨基酸的小的重復單元的方式排列，例如GGGGS，QQQQG或SSSSG。這種小的重復單元可以重復二至五次以形成多聚體單元。在該多聚體單元的氨基末端和/或氛基末端可以添加最多六個額外的任意天然氨基酸。其他合成的肽接頭由重復次數在10至20次之間的單一氨基酸組成，例如在接頭SSSSSSSSSSSSSSS中的絲氨酸。在氨基末端和/或羧基末端各可以存在最多六個額外的任意天然氨基酸。本申請中使用的術語"氨基酸"指天然的羧基a-M酸，其包括丙氨酸(三字母代碼ala，單字母代碼A)，精氨酸Urg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸、(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln,Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、組氨酸(his,H)、異亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、賴氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met,M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、絲氨酸(ser，S)、蘇氨酸(thr,T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和纈氨酸(val，V)。本領域技術人員已知的、可用于實施本發明的方法和技術公開在例如Ausubel，F.M.編輯的CurrentProtocolsinMolecularBiology,VolumesItoIII(1997)，Wiley和Sons;Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)。本發明包括免疫球蛋白綴合物，其中該免疫球蛋白的末端中的至少兩個與肽綴合。免疫球蛋白被劃分為五種不同的類別IgA(A類免疫球蛋白)、IgD、IgE、IgG和IgM。在這些類別之間，免疫球蛋白在其整體結構上不同。可以發現構件上的相似性。所有的免疫球蛋白由成對的多肽鏈構成，該對包含所謂的免疫球蛋白輕鏈多肽(簡稱輕鏈)和所謂的免疫球蛋白重鏈多肽(簡稱重鏈)。IgG類的免疫球蛋白的共同結構在圖1中顯示。在諸如免疫球蛋白等由不同的亞基組成的復雜蛋白質中，由于模塊化的結構而可獲得多于一個的氨基端和多于一個的氛基端。例如，G類或者E類免疫球蛋白，各擁有兩:對的重鏈和輕鏈。由于這種組成，在這些免疫球蛋白中，即在一個免疫球蛋白分子中，存在4個氨基端和4個羧基端。這允許最多8個肽綴合到一個IgG或IgE上，即，M端(N端)和M端(C端)的數目總和。本發明的免疫球蛋白是非功能性的免疫球蛋白。即使其結合人類抗原，由于缺乏針對人類抗原的功能性可變結構域，而將具有UK5mol/l或更高的Ku值。這不排除非人類抗原以l(T7mol/1或更低的KD值被特異地結合。免疫球蛋白提供一個支架，肽通過遺傳學方式與其連接。因此，具有非功能性可變結構域或者缺少一個或者多個可變結構域區域的全部或者部分并因此不具有任何抗原結合能力的免疫球蛋白也可以作為非功能性的免疫球蛋白而用于本發明。在免疫球蛋白鏈的末端引入的肽與整個的免疫球蛋白相比較，其大小是小的。例如，最小的免疫球蛋白，即，G類免疫球蛋白，具有大約150kDa的分子量；修飾物具有小于12.5kDa的大小，等價于大約100個氨基酸，通常小于7.5kDa，等價于大約60個氨基酸。通過分子生物學技術在核酸水平上將肽引入免疫球蛋白。綴合到免疫球蛋白上的,肽具有5至100個M酸殘基的M酸序列，優選具有10至75個氨基鹺殘基，更優選具有15至50個氨基酸殘基。綴合到免疫球蛋白的多肽可以選自生物活性分子/肽。當將這些分子施用于人工生物系統、活細胞或者諸如鳥類或包括人類的哺乳動物的活的生物體時，其引起生物學效應。這些生物活性化合物包括，但不限于酶、受體、免疫球蛋白等等的激動劑以及拮抗劑、表現細胞毒性的、抗病毒的、抗細菌的或者抗癌的活性的耙向試劑以及抗原。優選的生物活性肽選自抗融合肽。本發明的免疫球蛋白綴合物可以用于制藥、治療或者診斷應用。生物活性肽可以選自但不限于例如hedgehog蛋白、骨形成蛋白、生長因子、促紅細胞生成素、血小板生成素、G-CSF、白細胞介素和干擾素、蛋白質激素、抗病毒肽、抗融合肽、抗血管生成肽及細胞毒素肽等等。當多于一個的肽與免疫j求蛋白末端綴合時，存在不同的分布。可以綴合到免疫球蛋白上的肽的數目從一個至免疫球蛋白多肽鏈的氨基和羧基末端的總數。如果單一個肽綴合到免疫球蛋白上，該肽可以占據免疫球蛋白的任何一個末端。同樣的，如果最大可能數目的肽綴合到免疫球蛋白上，則所有的末端都將被單一一個肽占據。如果綴合到免疫球蛋白上的肽的數目大于一但是小于最大可能數目，肽在免疫球蛋白末端可以有不同的分布。例如，如果四個肽綴合到G或者E類免疫球蛋白上，可以存在五種不同的組合(參見表1)。在兩個組合中，屬于一個類型的所有末端(即免疫球蛋白鏈的所有的四個氨基末端或者所有的四個羧基末端)每個各綴合一個肽。其他末端則沒有被綴合。這導致將〗，務飾/綴合分配到免疫球蛋白的一個區域中的一種實施方案。在其他情況中，多肽綴合到多個兩種不同的末端上。在這些組合中，綴合的肽被分配到免疫球蛋白的不同區域。在任一種情況中，發生綴合的末端的總數是4。表1:四個肽綴合到由四個多肽鏈組成的免疫球蛋白的末端的可能組合<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>本發明包括其中至少兩個末端綴合有肽的免疫球蛋白。該綴合的肽本身不衍生自免疫球蛋白。綴合的肽的氨基^列可以是不同的、相似的或者相同的。通常，M酸序列是不同的，即具有小于90%的氛基酸同一性。在一個實施方案中，^J^酸序列的同一性為90%至小于100%;這些^J^酸序列以及相應的肽被定義為是相似的。在劣一個實施方案中，肽具有100%的^#列同一性，這使得它們是相同的。盡管綴合的肽可以顯示一定程度的同源性或者同一性，但是它們還可以具有不同的M酸序列總長。肽和免疫球蛋白之間的綴合在核酸水平上實施。因此兩個氨基酸之間的肽鍵使該肽和該免疫球蛋白綴合在一起。因此或者是肽的羧基末端的氨基酸綴合到免疫球蛋白鏈的氨基末端的氨基酸上，或者是免疫球蛋白鏈的g末端的氨基酸綴合到肽的^J^末端的氨基酸上。本發明的肽-免疫球蛋白綴合物的再一特征是可以由一個或者多個核酸分子，優選地由兩個至八個核酸分子編碼完整的綴合物。這使得免疫球蛋白綴合物能夠重組產生。對于本發明的肽-免疫球蛋白綴合物的重組制備，需要兩個或者兩個以上編碼不同多肽的核酸分子，優選需要兩個至八個核酸分子。這些核酸分子編碼綴合物的不同的免疫球蛋白多肽鏈，并且在下文中被稱為結構基因。它們可以是同一個表達盒中的部分或者可以位于不同的表達盒中。綴合物的組裝優選在其分泌之前并因此在表達細胞中發生。因此，優選編碼綴合物的多肽鏈的核酸分子在相同的宿主細胞中表達。通常而言，對于未綴合的免疫球蛋白的制備，需要兩個結構基因，一個編碼輕鏈以及另一個編碼重鏈。對于肽-免疫球蛋白綴合物的制備，需要另外的編碼綴合的免疫球蛋白輕鏈和/或重鏈的結構基因。圖12中顯示一個示例，其中顯示了一個免疫球蛋白和兩個不同的肽的所有肽-免疫球蛋白綴合物。本發明的由綴合相同的肽的兩個重鏈組成的免疫球蛋白，由一個或者兩個結構基因編碼。在兩個肽都綴合到重鏈的相同末端氨基酸上時，使用一個結構基因。在一個肽綴合到笫一重鏈的氨基末端的氨基酸上而且另一個肽綴合到第二重鏈的皿末端的氨基酸上時，使用兩個結構基因。再一示例是這樣的綴合物，其中輕鏈的兩個氨基末端綴合了不同或相似的肽。在這種情況中，不得不使用三個結構基因(圖ll)。一個結構基因編碼未綴合的重鏈(結構基因2)，一個結構基因編碼綴合肽1的第一輕鏈(結構基因1)，以及一個結構基因編碼綴合肽2的第二輕鏈(結構基因3)。對于這些緒構基因，可以設計位于一個或者多個表達載體(質粒)上的一個或者多個表ii盒。當在前述實例中綴合的肽是相同的時，僅僅需要兩個結構基因，即一個編碼未綴合的重鏈和另一個編碼氨基端發生綴合的輕鏈(參見圖11:結構基因1和3是相同的)。優選該肽-免疫球蛋白綴合物的所有三個構件在相同的細胞中表達。假設免疫球蛋白鏈進行統計學組裝，可以實現四種不同的免疫球蛋白綴合物。在這些中，免疫球蛋白2和免疫球蛋白2a是相同的，并且因此三種不同的免疫球蛋白綴合物被分泌到培養基中。如果所有三個結構基因以化學計量方式表達，則免疫球蛋白1、免疫球蛋白2和免疫球蛋白3之間的比例是1:2:1。通過增強或者降低這些結構基因中的一+或者多個的表達，可以使所組裝的綴合物的比例向優選的綴合物(1、2或者3)移動。方法是本領域技術人員已知的，例如使用具有不同的啟動子強度的啟動子。在肽相同的情況中，僅僅有一種免疫球蛋白綴合物形成并且分泌到培養基中。可以通過本領域技術人員已知的方法分離和純化獲得的免疫球蛋白綴合物的混合物。這些方法已經良好建立并廣泛應用于免疫球蛋白純化，并且這些方法可以單獨使用或者聯合使用。這些方法例如有使用微生物衍生的蛋白的親和層析法(例如蛋白A或者蛋白G親和層析)、離子交換層析法(例如陽離子交換(羧甲M脂)、陰離子交換(M乙基樹脂)和混合模式的交換層析)、親硫吸附(例如使用P巰基乙醇和其它的SH配體)、疏水相互作用或者芳族基因吸附層析(例如使用苯基-瓊脂糖、aza-arenophilic樹脂或者間氨基苯硼酸)、金屬螯合親和層析(例如使用Ni(II)-和Cu(II)-親和材料)、分子大小排阻層析和制備型電泳方法(例:i口凝膠電;^、毛細管電^0(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。圖13和14顯示不同的綴合物，其可以通過使用綴合到輕鏈的氨基末端的第一肽以及綴合到重鏈的氯基末端的第二肽獲得。在這種情況中，從四種不同的結構基因開始可以產生十種不同的免疫球蛋白綴合物。與未綴合的應M目比較，肽-免疫球蛋白綴合物顯示出改進的藥物動力學特性，例如半衰期(即最初量的肽的一半從血流中被清除掉和/或代謝掉所需要的時間)。同時，因為綴合的肽通過其綴合的免疫球蛋白被呈遞和固定在彼此鄰近的區域，故使用本發明的肽-免疫球蛋白綴合物可以增加綴合的肽的局部濃度。也可以提供綴合到相同的免疫球蛋白上的多于一種(即兩種或者兩種以上)的不同的肽。之前概述的本發明的免疫球蛋白綴合物的特性取決于綴合的肽的生物活性。因此該肽必需采取其天然的三維結構以^便能夠與其靶標相互作用，并且該肽應該以恰當的方式呈現并不受限制地^皮接近。為了防止空間干擾，綴合的肽可以由肽接頭和生物活性肽組成(關于肽接頭參見表2)。表2肽接頭<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>所有的肽接頭可以由核酸分子編碼并因此可以重組表達。由于接頭本身是肽，生物活性肽通過在兩個氨基酸之間形成的肽鍵而與接頭連接。肽接頭被引入到生物活性肽^生物活性肽待綴合的免疫球蛋白鏈之間。因此從氨基末端到氛基末端的方向上而言存在不同的可能序列a)生物活性肽-肽接頭-免疫球蛋白多肽鏈，或者b)免疫球蛋白多肽鏈-肽接頭-生物活性肽，或者c)生物活性肽-肽接頭-免疫球蛋白多肽鏈-肽接頭-生物活性肽，其中該生物活性肽可以是相同的或者不同的，并且其中該肽接頭可以存在或者不存在，即在C端至N端的方向上可能的序列包括d)生物活性肽-免疫球蛋白多肽鏈，或e)免疫球蛋白多肽鏈-生物活性肽，或者f)生物活性肽-免疫球蛋白多肽鏈-生物活性肽。使用本領域技術人員已知的重組工程方法，免疫球蛋白綴合物可以在核l基因水平上進行特制。編碼免疫球蛋白的核酸序列是已知的并且可以例如從基因組數據庫中獲得。同樣地，生物活性肽的核酸序列也是已知的體密碼而從其M^列推導出。用于表達本發明的綴合物的表達載體(質粒)，其構建所需要的元件為天然的和/或修飾的和/或綴合形式的免疫球蛋白輕鏈的表達盒、天然的和/或修飾的和/或綴合形式的免疫球蛋白重鏈的表達盒、選擇標記、大腸桿菌(E.coli.)復制以及選擇單元。這些表達盒包括啟動子、結構基因、編碼分泌信號序列的DNA片段和終止子。這些元件以可操作連接的方式組裝在一個編碼免疫球蛋白綴合物的所有鏈的表達載體(質粒)上，或者組裝在兩個或者兩個以上分別編碼免疫球蛋白綴合物的一個或者多個鏈的表達載體(質粒)上。為了表達編碼的多肽，將表達載體(質粒)導入合適的宿主細胞。優選在諸如CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、HEK細胞、K562細胞、BHK細胞、PER.C6細胞等的哺乳動物細胞中制^"白。載體的調控元件必須按其在選定的宿主細胞中可以發揮功能的方式來選擇。為了表達，可以將含有編碼免疫球蛋白綴合物的一個或多個鏈的(一種或多種)載體(質粒)的宿主細胞，培養在適于表達該鏈的條件下。所表達的免疫球蛋白鏈進行功能性組裝。完全加工后的肽-免疫球蛋白綴合物分泌到培養基中。綴合物的免疫球蛋白部分提供肽附著的支架。該免疫球蛋白是非功能性的免疫J求蛋白，即其以10-5mo1/1或更高的(例如l(T3mol/l)Ko值(結合親和性)結合人類抗原。屬于此定義的免疫球蛋白例如是重鏈和/或輕鏈缺少一個或者多個構架區或/和高變區的一部分或者全部的免疫球蛋白、重鏈和/或輕鏈沒有可變結構域(區)的免疫球蛋白、對于非人類抗原具有io-7mol/l或者更低的(例如10_1<)11101/1)Ko值的免疫球蛋白。提供下述實施例、序列表和附圖用于幫助理解本發明，本發明的真正保護范圍由后附權利要求說明。可以理解在不偏離本發明的精神的情況下，可以對列出的方法進行修改。圖1:IgG類免疫球蛋白的共同結構。圖2:抗IGF-lRyl重^Ji載體4818的質粒圖i普。圖3:抗IGF-1Rk輕鏈表達載體4802的質粒圖i普。圖4:重鏈恒定區基因載體4962的質粒圖譜。圖5:修飾的抗IGF-1Ry1重^^達載體4961的質粒圖i普。圖6:修飾的抗IGF-1Rk輕^^達載體4964的質粒圖i普。圖7:修飾的抗IGF-1R輕鏈表達栽體4963的質粒圖鐠。圖8:親和純化的免疫球蛋白綴合物的SDS-PAGE凝膠的考馬斯藍染色圖；根據表6進行樣品排列。圖9:在HEK293EBNA細胞中瞬時表達之后對細胞培養物上清液中的輕鏈的免疫檢測；根據表6進行樣品排列。圖10:在HEK293EBNA細胞中瞬時表達之后對細胞培養物上清液中的重鏈的免疫檢測；根據表6進行樣品排列。圖11:輕鏈的兩個氨基末端綴合了不同或者相似的肽的肽-免疫球蛋白綴合物。圖12:由一個免疫球蛋白和兩個不同的肽組成的肽-免疫球蛋白綴合物。圖13和14:第一肽綴合到免疫球蛋白的輕鏈的M末端，并且第二肽綴合到免疫球蛋白的重鏈的g末端的肽-免疫球蛋白綴合物。實施例材料和方法關于人免疫球蛋白輕鏈和重鏈的核苷酸序列的一般信息在Kabat，E.A.等，(1991)SequencesofProteinsofIm加nologicalInterest,FifthEd.,NIHPublicationNo91-3242中給出。根據EU編號對抗體鏈的氨基酸進行編號(Edelman，G.M.等，PNAS63(1969)78-85;Kabat，E.A.等，(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEd.，NIHPublicationNo91-3242。重組DNA4支術使用如Sambrook，J.等，Molecularcloning:Alaboratorymanual;ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989中描述的標準方法操作DNA。根據廠商的說明使用分子生物學試劑。蛋白質測定使用在氨基酸序列的基礎上計算的摩爾消光系數，通過在280nm測定光密度(OD)而確定肽-免疫球蛋白綴合物的蛋白質濃度。DNA序列測定通過在MediGenomixGmbH(Martinsried，德國)上實施的雙鏈測序而測定DNA序列。DNA和蛋白質序列分析和序列數據管理寸吏用10.2版本的GCG，s(GeneticsComputerGroup,Madison,Wisconsin)軟件包和8.0版本的Infomax，sVectorNTIAdvancesuit進行序列的創建、作圖、分析、注解和說明。基因合成通過MedigenomixGmbH(Martinsried，德國)從化學合成的寡核苷酸制備需要的基因片段。邊側帶有限制性內切酶單酶切位點的100-600bp長度的基因片段通過寡核苷酸退火和連接，包括PCR擴增而組裝，并且隨后通過A突出端克隆入pCR2.1-TOPO-TA克隆載體(Invitrogen)。通過DNA測序對亞克隆的基因片段的DNA序列進行確i人。免疫球蛋白綴合物的親和純化才艮據已知的方法寸吏用蛋白A-SepharoseCL-4B(AmershamBioscience)通過親和層析純化已表達和分泌的肽-免疫球蛋白綴合物。簡而言之，離心(10,000xg，10分鐘)和通過0.45pm濾器過濾后，含有免疫球蛋白綴合物的澄清的培養物上清液施加到用PBS緩沖液(10mMNa2HP04，1mMKH2P04，137mMNaCl和2.7mMKCl，pH7.4)平衡的蛋白A-SepharoseTMCL-4B柱上。使用PBS平衡緩沖液和pH5.5的0.1M檸檬酸鹽緩沖液洗去未結合的蛋白質。使用pH3.0的0.1M的檸檬酸鹽緩沖液洗脫免疫球蛋白綴合物，并且使用lMTris堿中和含有免疫球蛋白綴合物的級分。然后，4°C，免疫球蛋白綴合物在PBS緩沖液中進行充分透析，使用配備有Biomax-SK膜(Millipore)的ultrafree離心過濾裝置進行濃縮，然后儲存在0。C的冰水浴中。實施例1制備表達質粒連接編碼胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)抗體(在下文也稱為抗IGF-IR或IR)輕鏈可變區(VL)和人K輕鏈恒定區(CL)(序列參見US2005/0008642)的基因片段，對編碼抗IGF-IR重鏈可變區(VH)和人yl重鏈恒定區(CHl-鉸鏈區-CH2-CH3)的基因片段也進行連接。a)載體4818載體4818是用于在HEK293EBNA細胞中瞬時表達抗IGF-IR抗體重鏈(以基因組方式組織的表達盒；外顯子-內含子的組織方式)的表達質粒，其包括下述功能元件除了抗IGF-1R-重鏈表達盒之外，此載體還含有-作為選擇標記的潮霉素抗性基因，-EB病毒(EBV)的復制起點oriP,-來自pUC18載體的復制起點，其允許本質粒在大腸桿菌中復制，和-賦予大腸桿菌氨節青霉素抗性的p-內酰胺酶基因。抗IGF-lRyl重鏈基因的轉錄單位由下述元件組成-來自人巨細胞病毒(HCMV)的立即早期增強子和啟動子，-合成的5，-非翻譯區(UT)，-包括信號序列內含子(信號序列1、內含子、信號序列2[Ll-內含子-L2])的鼠免疫球蛋白重鏈信號序列；誦克隆的抗IGF-1R可變重鏈編碼片段，在5，末端(L2信號序列)安排有Bsml限制性內切酶單酶切位點，以及在3'末端安排有剪切供體位點和Notl限制性內切酶單酶切位點，-包括小鼠重鏈增強子元件(部分JH3，JH4)的小鼠/人重鏈雜合內含子2(Neuberger，M.S.,EMBOJ.2(1983)1373-1378),-基因組人yl重鏈基因恒定區，-人yl免疫球蛋白多聚腺苷酸化("polyA")信號序列，和-分別在5，-和3，-末端的AscI和SgrAI限制性內切酶單酶切位點。圖2顯示抗IGF-lRyl重鏈表達載體4818的質粒圖語。b)載體4802鏈(cDNA)的表達質粒，其包括下述功能元件除了抗IGF-1Rk輕^^達盒之外，此載體還含有:-作為選擇標記的潮霉素抗性基因，-EB病毒(EBV)的復制起點oriP，-來自pUC18載體的復制起點，其允許本質粒在大腸桿菌中復制，和-賦予大腸桿菌氨爺青霉素抗性的P-內酰胺酶基因。抗IGF-1Rk輕鏈基因的轉錄單位由下述元件組成-來自人巨細胞病毒(HCMV)的立即早期增強子和啟動子，-克隆的抗IGF-lR可變輕鏈cDNA，包括-天然5，-UT，和-在5，-末端安排有BglII限制性內切酶單酶切位點的人免疫球蛋白種系基因的天然輕鏈信號序列，-人k輕鏈基因恒定區，-人免疫球蛋白k多聚腺苷酸化信號("polyA")序列，-分別在5，-和3，-末端的Ascl和Fsel限制性內切酶單酶切位點。圖3顯示了抗IGF-1RK輕鏈表達栽體4802的質粒圖鐠。c)質粒4962載體4962作為用于組^JJi質粒4965、4966和4967的基礎結構。這些質粒使得修飾的抗體重鏈(沒有可變結構域的N末端綴合，cDNA組織方式)能夠在HEK293EBNA細胞中瞬時表達。質粒4962包括下述功能元件除了Yl重鏈恒定區的表達盒之外，本載體還含有-作為選擇標記的潮霉素抗性基因，-EB病毒(EBV)的復制起點oriP,-來自pUC18載體的復制起點，其允許本質粒在大腸桿菌中復制，-賦予大腸桿菌氨千青霉素抗性的(5-內酰胺酶基因。yl重鏈恒定區基因(CHl-鉸鏈區-CH2-CH3)的轉錄單位由下述元件組成-來自人巨細胞病毒(HCMV)的立即早期增強子和啟動子，-包括在5，末端的BglII限制性內切酶單酶切位點和在3'末端的Nhel限制性內切酶單酶切位點(Nhel位點在CH1N末端內)的合成接頭(SEQ<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>-人重鏈基因恒定區(CHl-4^^-CH2-CH3，cDNA組織方式)，-人免疫球蛋白多聚腺苷酸化信號("polyA")序列，畫分別在5，-和3，-末端的Ascl和Fsel限制性內切酶單酶切位點。重鏈恒定區基因載體4962的質粒圖鐠在圖4中顯示。d)質粒4961載體4961作為用于組裝表達質粒4970至4975的基礎結構。這些質粒使得修飾的抗體重鏈(C末端綴合)可以在HEK293EBNA細胞中瞬時表達。基礎載體4961是用于在HEK293EBNA細胞中瞬時表達抗IGF-1R抗體重鏈(以基因組方式組織的表達盒)的表達質粒。其包括下述功能元件除了抗IGF-1Ry1重鏈^表達盒之外，本載體還含有-作為選擇標記的潮霉素抗性基因，-EB病毒(EBV)的復制起點oriP，-來自pUC18載體的復制起點，其允許本質粒在大腸桿菌中復制，-賦予大腸桿菌氨千青霉素抗性的p-內酰胺酶基因。抗IGF-lRyl重鏈基因的轉錄單位由下述元件組成-來自人巨細胞病毒(HCMV)的立即早期增強子和啟動子，-合成的5，-UT，-包括信號序列內含子(Ll、內含子、L2)的鼠免疫球蛋白重鏈信號序列；-克隆的抗IGF-1R可變重鏈編碼片段，在5，末端(L2信號序列)安排有Bsml限制性內切酶單酶切位點，以及在3，末端安排有剪切供體位點和的Notl限制性內切酶單酶切位點，-包括小鼠重鏈增強子元件(部分犯3,JH4)的小鼠/人重鏈雜合內含子2(Neuberger,M.S.,EMBOJ.2(1983)1373-1378)，-基因組人Yl重鏈基因恒定區和輕孩i修飾的CH3-IgG,多聚腺苷酸化(pA)連接區(SEQIDNO:14，插入HindIII和Nhel限制性內切酶單酶切位點)CH3工gGlpA...ctaagcttgtccccgggcaaaTGAgtgctagcgccggcaagcc......LeuSerLeuSerProGlyLiysHind工工INhe工-人免疫球蛋白多聚腺苷酸化("polyA")信號序列，-分別在5，-和3，-末端的AscI和FseI限制性內切酶單酶切位點圖5顯示修飾的抗IGF-lRyl重鏈表達載體4961的質粒圖i普。e)質粒4964載體4964作為組^^達質粒4976和4977的基礎結構。這些質粒^f吏得修飾的抗IGF-1R抗體輕鏈(N末端綴合)能夠在HEK293EBNA細胞中瞬時表達。質粒4964是表達質粒4802的變體。抗IGF-lRK-輕鏈基因的轉錄單位如下所示進行修飾天然的輕鏈信號序列由5，末端安有BglII限制性內切酶單酶切位點、3，末端安有Nhel限制性內切酶單酶切位點的合成接頭代替，該接頭直接連接在VL區(SEQIDNO:15)上。I-VL-IGF-IR...3g3tctatatatat5Lt3tgct3gcgaaattgtgttg3c3..AlaSerGlu工leVal:LeuThr...BglIINhe工圖6顯示修飾的抗IGF-1Rk輕鏈表達載體4964的質粒圖語。f)質粒4969表達質粒4968和4969f汙生自抗IGF-1R抗體輕鏈的表達質粒4802。該質粒編碼修飾的抗體輕鏈片段(沒有可變區的N端綴合；多肽-接頭-k鏈的恒定區)。為了構建質粒4968和4969，將BglII限制性內切酶單酶切位點引入CMV啟動子的3'末端，并且將Bbsl限制性內切酶單酶切位點引入到抗IGF-1R抗體輕鏈恒定區(SEQIDNO:16)的內部。卜-C-kBbs工cgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttc...ArgThrValAlaAlaProSerValPhe工lePhe...g)質粒4963載體4963作為組^達載體4978和4979的基礎結構。這些質粒使得修飾的抗IGF-1R抗體輕鏈(C末端綴合)能夠在HEK293EBNA細胞中瞬時表達。質粒4963是表達質粒4802的變體。抗IGF-1Rk輕鏈基因的轉錄單位如下進行修飾曙在C畫k-Ig-kpA連結區對人k輕鏈恒定區基因進行輕微修飾(插入HindIII和Kasl限制性內切酶單酶切位點，SEQIDNO:17)。.C-kIg-k-pA...AaaagcttcaacaggggagagtgtTGAagggagaggcgccccca...LysSerPheAsnArgGlyGluCysHind工IIKasl圖7顯示修飾的抗IGF-1R輕^^達載體4963的質粒圖鐠。實施例2制備最終的表達質粒使用已知的重組方法和技術，通過連接相應的核酸片段，已組裝免疫球蛋白融合基因(重鏈和輕鏈)，其包含免疫球蛋白基因片段、任選的接頭基因片段和多肽基因片段。編碼肽接頭和多肽的核酸序列分別通過化學合成方法合成，并且然后連接入大腸桿菌質粒。通過DNA測序對該亞克隆核酸序列進行驗證。所使用的免疫球蛋白多肽鏈(全長重鏈或輕鏈)，或者，免疫球蛋白多肽鏈片段(抗體輕鏈或重鏈的恒定區)、多肽綴合的位置(N或C末端)、所使用的接頭和所使用的多肽在表2(第3頁)、表3和表3a中列出。表3:所使用的蛋白質和多肽；M^列以及位置的編號如BH8參照林中的一樣(Ratner，L.等，Nature313(1985)277-284;基因座HIVH3BH8;來自法國的HIV-1分離林LAI/IIIB克隆BH8)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表3a:用于免疫球蛋白綴合物基因構建的化學制備的基因片段<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表4中列出了用于構建瞬時表達修飾的免疫球蛋白多肽輕鏈和重鏈(表達盒)的最終表達質粒的組分，以及對應的所使用的基礎質粒、克隆位點、編碼綴合的免疫球蛋白多肽的插入核酸序列。表4:用于構建所使用的表達質粒的組分<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表5中列出使用的具有HIV-1抑制特性的多肽(T-651,T-2635和HlV-lgp41胞外域變體)、使用的用于連接免疫球蛋白輕鏈或重鏈與生物活性肽的肽接頭、從編碼的氨基酸序列推導出的推導的修飾抗體鏈的分子表5:使用的多肽以及修飾的免疫球蛋白多肽鏈的推導的分子量的一覽表<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>實施例3在HEK293EBNA細胞中瞬時表達免疫球蛋白變體通過瞬時轉染在DMEM培養基(Dulbecco，smodifiedEagle'smedium,Gibco)中貼壁生長的HEK293-EBNA細胞(表達EB病毒核抗原的人胚胎腎細胞系293，美國典型培養物保藏中心保藏號ATCC#CRL-10852)而產生重組免疫球蛋白變體，該DMEM培養基補充有10%超低IgG的FCS(胎牛血清，Gibco)，2mM谷氨酰胺(Gibco)，1%體積比(v/v)的非必需氨基酸(Gibco)和250pg/mlG418(RocheMolecularBiochemicals)。為了轉染，4吏用轉染試劑FugeneTM6(RocheMolecularBiochemicals)，使用比例為試劑(jal)與DNA(jag)的比為3:1至6:1。從兩種不同的質粒表達免疫球蛋白的輕鏈和重鏈，使用的輕鏈與重鏈編碼質粒的摩爾比從1:2至2:1。在轉染后的第4至11天收集含有免疫球蛋白變體的細胞培養物上清液。純化前將上清液儲存在0°C的水水浴中。Meissner，P.等，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中給出了關于例如在HEK293細胞中重組表iiA免疫球蛋白的一般信息。實施例4通過SDSPAGE、Western印跡轉移和4吏用免疫球蛋白特異性抗體綴合物進行的檢測，實施表達分析通過十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)處理表達并分泌的肽-免疫球蛋白綴合物，并且將分離的免疫球蛋白綴合物鏈從凝膠轉移至膜上，并隨后通過免疫學方法進行檢測。SDS-PAGELDS樣品緩沖液，四倍濃度Ux):4g甘油，0.682gTris堿，0.666gTris-鹽酸，0.8gLDS(十二烷J^危酸鋰)，0.006gEDTA(乙二胺四乙酸)，0.75ml的1%重量比(w/w)ServaBlueG250水溶液，0.75ml的1%重量比(w/w)苯酚紅溶液，補加水至總體積10ml。離心含有分泌的肽-免疫球蛋白綴合物的培養液以除去細胞和細胞碎片。等分的澄清上清液與1/4體積(v/v)的4xLDS樣品緩沖液以及1/10體積(v/v)的0.5M1，4-二硫蘇糖醇(DTT)混合。然后將樣品在70°C孵育10min并通過SDS-PAGE分離蛋白質。根據廠商的說明使用NuPAGE預制膠系統(Invitrogen)。具體地，使用10%NuPAGENovexBis-Tris預制膠(pH6.4)和NuPAQEMOPS電泳緩沖液。Western印跡轉移緩沖液39mM甘氨酸，48mMTris-鹽酸，0.04%重量比(w/w)SDS和20%體積比甲醇(v/v)。SDS-PAGE電泳后，才艮據Burnette的Semidry畫Blotting-Method方法，將分離的免疫球蛋白綴合物多肽鏈電泳轉移到硝酸纖維素濾膜上(孔徑大小:0.45|nm)(Burnette,W.N"Anal.Biochem.112(1981)195-203)。免疫學檢測TBS緩沖液50mMTris-鹽酸，150mMNaCl，調整至pH7.5。封閉溶液TBS緩沖液中1%(w/v)的Western封閉試劑(RocheMolecularBiochemicals)。TBST緩沖液含有0.05%體積比(v/v)的Tween-20的lxTBS緩沖液。為了進行免疫學檢測，western印跡膜在室溫TBS緩沖液中振蕩孵育兩次5分鐘，以及在封閉溶液中振蕩孵育一次90分鐘。免疫球蛋白綴合物多肽鏈的檢測重鏈為了檢測肽-免疫球蛋白綴合物的重鏈，使用純化的綴合過氧化物酶的兔抗人IgG抗體(DAKO，CodeNo.P0214)。輕鏈使用純化的綴合了過氧化物酶的兔抗人k輕鏈抗體(DAKO，CodeNo.P0129)檢測肽-免疫球蛋白綴合物的輕鏈。為了可視化抗體輕鏈和重鏈，首先將洗滌和封閉后的Western印跡膜與1:10，000稀釋的、純化的綴合了過氧化物酶的兔抗人IgG抗體(對于重鏈)或者純化的綴合了過氧化物酶的兔抗人K輕鏈抗體(對于輕鏈)，在lOml封閉溶液中，在4。C振蕩孵育過夜。室溫使用TBTS緩沖液洗涂膜三次和用TBS緩沖液洗滌一次IO分鐘之后，使用可以產生化學發光的M苯二酰肼/過氧化物溶液(Lumi-LightPLUSWesternBlotting底物，RocheMolecularBiochemicals)對Western-印跡膜進行顯影。因此，在10ml氨基苯二酰肼/過氧化物溶液中孵育膜10秒至5分鐘，然后使用Lumi-ImagerFl分析儀(RocheMolecularBiochemicals)檢測發射的光和/或用X光片記錄。使用LumiAnalyst軟件(3.1版本)定量斑點的強度。免疫印跡的多重染色通過將膜在含有100mMP-巰基乙醇和20%(w/v)SDS的1MTris-鹽酸緩沖液(pH6.7)中70。C孵育1小時，可以從染色的印跡上除去用于檢測的過氧化物酶標記的二抗偶聯物。經過這個處理之后，該印跡可以用不同的二抗第二次進行染色。在第二次檢測之前，印跡用TBS緩沖液室溫振蕩洗滌三次，每次10分鐘。表6a至6c列出樣品的排列。表6a:SDSPAGE凝^/Western印跡-^i^1的樣品排列<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表6b:SDSPAGE凝M7Western印跡省膠2的樣品排列<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表6c:SDSPAGE凝膠/Western印跡一凝膠3的樣品排列<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>實施例5組裝的免疫球蛋白綴合物的檢測通過親和結合到蛋白人SepharoseCL-4B上純化和濃縮免疫球蛋白綴合物多肽含有一種或者多種質粒的HEK293EBNA細胞在適于瞬時表達位于質粒上的免疫球蛋白多肽鏈結構基因的條件下培養6至10天。向1.8mlEppendorf管中1ml的澄清的培養物上清液，加入0.1ml蛋白A-SepharoseTMCL-4B(AmershamBiosciences)懸浮液(1:1(v/v)的蛋白A-SepharoseTM在PBS緩沖液中的懸浮液，(PBS緩沖液為10mMNa2HP04,1mMKH2P04，137mMNaCl和2.7mMKCl，pH7.4))。該懸浮液在室溫振蕩孵育1至16個小時。之后，通過離心沉淀Sepharose珠(30s，5000rpm)并且棄掉上清液。隨后Sepharose沉淀物用1.6mlPBS緩沖液，1.6ml0.1M檸檬酸鹽緩沖液pH5.0和1.6ml蒸餾水分別洗滌。使用0.1mllxLDS-PAGE樣品緩沖液在70。C從Sepharose珠上提取蛋白A結合的免疫球蛋白5至10min。如實施例4所描述的，通過SDS-PAGE分離和考馬斯亮藍染色進行分析。結果瞬時表達后的重鏈和輕鏈的表達/分泌分析圖8a-c:親和純化的免疫球蛋白綴合物的SDS-PAGE凝膠的考馬斯亮藍染色，根據表6進行樣品的排列。免疫球蛋白多肽鏈的檢測圖9a-c:在HEK293EBNA細胞中瞬時表達后免疫檢測細胞培養物上清液中的輕鏈。圖lOa-c:在HEK293EBNA細胞中瞬時表達后免疫檢測細胞培養物上清液中的重鏈。從圖8a-c，9a-c和lOa-c可以推導出免疫球蛋白輕鏈和重鏈瞬時表達并分泌到培養基中。在免疫球蛋白鏈含有一個或者幾個糖基化位點的情況中，最終的肽-免疫球蛋白綴合物和相應地單個的免疫球蛋白綴合物鏈沒有確切的分子量，而是具有取決于糖基化程度的一個分子量分布。這導致在SDS-PAGE上，代表一種免疫球蛋白綴合逸的所有分子不一致地遷移，并因此使得條帶#>寬。由于免疫球蛋白與蛋白A的親和結合僅僅;L^于重鏈的Fc部分的相互作用，并且因為除了重鏈外在SDS-PAGE和考馬斯染料染色后還檢測到輕鏈，故可以作出免疫球蛋白綴合物已經正確組裝并且由輕鏈和重鏈組成的結論。實施例64吏用人IgGELISA定量表達的重鏈4吏用夾心ELISA測定在細胞培養物上清液中免疫球蛋白綴合物的重鏈多肽的濃度，該EUSA使用生物素酰化的抗人IgGF(ab，)2片段作為捕獲試劑并使用過氧化物物綴合的抗人IgGF(ab，)2抗體片段用于檢測。鏈霉親和素包被的96-孔板(PierceReacti-BindTMStreptavidinCoatedPolystyreneStripPlates,CodeNo.15121)用稀釋緩沖液(稀釋緩沖液含有0.5%重量體積比的牛血清白蛋白的PBS緩沖液)中的0.5照/ml生物素酰化的山羊多克隆抗人IgGF(ab，)2抗體片段(F(ab，)2<h-Fc>Bi;Dianova，CodeNo.109-066-098)捕獲抗體(0.1ml/孑L)，通過在室溫下(RT)振蕩孵育1小時而包被。之后，使用多于0.3ml洗滌緩沖液洗滌板三次(洗滌緩沖液含有1%重量體積比(w/v)的Tween20的PBS)。含有IgG免疫球蛋白綴合物的細胞培養物上清液(樣品)在稀釋緩沖液中系列稀釋(兩倍)至濃度為0.5-20ng/ml，加入板中并在室溫搖晃孵育1小時。稀釋緩沖液中的純化的抗IGF-IR標準抗體(0.5-20ng/ml)用于產生IgG蛋白標準曲線。用0.3ml/孔的洗滌緩沖液洗滌板三次之后，使用過氧化物酶綴合的、山羊多克隆抗人F(ab，)2特異性IgG的F(ab，)2片段[F(ab，)2<h-Fcr>POD;Dianova,CodeNo.109-036-098檢測與人Fey結合的復合物。用0.3ml/孔的洗滌緩沖液洗滌板三次，用ABTS(2，2，-連氮基-雙-(3-乙基苯并瘞唑啉-6-磺酸)過氧化物酶底物溶液(RocheMolecularBiochemicals,CodeNo.1684302)對板進行顯色。10-30分鐘之后，在TecanSpectrafluorplus板讀數機(TecanDeutschlandGmbH)上扣除試劑空白(孵育緩沖液+ABTS溶液)確定在405nm和4卯nm的吸光度。對于背景校正，根據公式I，從405nm的吸光度中減去490nm的吸光度。所有的樣品至少以一式兩份重復測試，并且將來自兩次或者三次吸光度測量的數值進行平均。樣品的IgG含量從標準曲線上計算。公式I:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>實施例7活病毒抗病毒實驗為了活NL-BaI病毒的生產，將質粒pNL-Bal(USNIHAidsReagentProgram)轉染到培養在Dulbecco氏改良的極限培養基(DMEM)中的HEK293FT細胞系中，該培養基含有10%胎牛血清(FCS),100U/mL青霉素，100ng/mL鏈霉素，2mML-谷氨酰胺和0.5mg/mLgeniticin(所有的培養基來自Invitrogen/Gibco)。在轉染后兩天收集含有病毒顆粒的上清液，采用通過0.45nm孔徑的PES(聚醚砜(polyethersulfon))過濾器(Nalgene)過濾除去細胞碎片，并等分儲存在-80。C。為了對實驗性能進行標化，使用病毒原種的等分樣品感染JC53-BL(USNIHAidsReagentProgram)細胞，產生大約每孔1.5x105RLU(相對光單位)。在96孔板中系列稀釋測試的肽-免疫球蛋白綴合物、包括抗CCR5單克隆抗體2D7(PharMingen;CCR5，趨化因子受體；HIV-1感染的共受體)的參考抗體和參考肽(T-651和T-2635)。該實驗一式四份實施。每個板含有細胞對照和病毒對照孔。等價于1.5x105RLU的病毒原種添加到每個孔中，然后2.5x104個JC53-BL細胞加入到每個孔中，使得每孔的最終實驗體積是200^1。在37。C,卯％相對濕度，5。/。C02的情況下孵育3天后，吸出培養基，將50^1的Steady-GloLuciferaseAssaySystem(縈光素酶檢測系統)(Promega)加入到每個孔中。在室溫孵育10分鐘后，在發光計(Luminoskan，ThermoElectronCorporation)上讀取實驗板。在減去背景之后，計算每個劑量點的螢光素酶活性的抑制百分數，通過使用用于Excel的XLfit曲線擬合軟件(3.0.5版本，Buildl2;Microsoft)測定IC50。表7:肽和肽-免疫球蛋白綴合物的抗病毒活性化合物抗病毒活，性在20ng/mL的抑制百分數或IC5。(ng/mL)參考抗體l(<IGF-1R>)無活性參考抗體2(無作用的)n.d.參考抗體3(無作用的)n.d.T-6510.4jig/mLT-26350.5ng/mL參考抗CCR52D72.3ing/mL4970/480220%4972/480243%4974/480212.5ng/mL4976/481838%4965/4968實施例8單周期抗病毒實驗為了產生假型NL-Bal病毒，質粒pNL4-3Aenv(在env基因中具有缺失的HIVpNL4-3基因組構建體)和pCDNA3.1/NL-BALenv[含有NL-Balenv基因的pcDNA3.1質粒(從NIBSCCentralizedFacilityforAIDSReagents獲得)共轉染到培養在Dulbecco，氏改良的極限培養基(DMEM)中的HEK293FT細胞系(Invitrogen)中，該培養基含有10%胎牛血清(FCS)，100U/mL青霉素，100ng/mL鏈霉素，2mML-谷氨酰胺和0.5mg/mLgenkicin(所有培養基來自Invitrogen/Gibco)。在轉染后兩天收集含有假型病毒的上清液，采用通過0.45nm孔徑的PES(聚醚砜)過濾器(Nalgene)過濾除去細胞碎片，并等分儲存在-80。C。為了對實驗性能進行標化，使用病毒原種的等分樣品感染JC53-BL(USNIHAidsReagentProgram)細胞，產生大約每孔1.5x10sRLU(相對光單位)。在96孔板中系列稀釋測試的肽-免疫球蛋白綴合物、參考抗體和參考肽(T-20,T-651和T-2635)。該實驗一式四份實施。每個板含有細胞對照和病毒對照孔。等價于1.5x10sRLU的病毒原種添加到每個孔中，然后2.5x104個JC53-BL細胞加入到每個孔中，使得每孔的最終實驗體積是200^1。在37。C，90%相對濕度，5%<:02的情況下孵育3天后，吸出上清液，將50nl的Steady-GloLuciferaseAssaySystem(螢光素酶檢測系統)(Promega)加入到每個孔中。在室溫孵育10分鐘后，在發光計(Luminoskan，ThermoElectronCorporation)上讀取實驗板。在減去背景之后，計算每個劑量點的螢光素酶活性的抑制百分數，通過使用用于Excel的XLfit曲線擬合軟件(3.0.5版本，Buildl2;Microsoft)測定ICso值。表8:肽和肽-免疫球蛋白綴合物的抗病毒活性<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>在外周血單核細胞(PBMC)中的抗病毒實驗才艮據生產廠商的i兌明書，通過Ficoll-Paque(Amersham，Piscataway，NewJersey,USA)密度梯度離心從血沉棕黃層(buffy-coats)(獲得自斯坦福血液中心(StanfordBloodCenter))中分離人PBMC。簡而言之，從血沉棕黃層中轉移血液到50ml錐形管中，并用無菌的Dulbecco，s磷酸緩沖鹽溶液(Invitrogen/Gibco)稀釋為50ml的終體積。25ml的稀釋血液轉移到兩個50ml錐形管中，將12.5ml的Ficoll-PaquePlus(AmershamBiosciences)小心地鋪在下面并且在室溫下450xg在不帶制動的情況下離心20分鐘。將白細胞層小心的轉移到新的50ml錐形管中并使用PBS洗滌兩次。為了移除剩余的紅細胞，在室溫使用ACK裂解緩沖液(Biosource)與細胞孵育5分鐘，并且用PBS再洗滌一次。計數PBMC并且以2-4x106細胞/ml的濃度在RPMI1640中37。C孵育24h，該RPMI1640含有10%FCS(Invitrogen/Gibco)，1%青霉素/鏈霉素，2mML-谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉和2ng/ml植物凝血素(Invitrogen)。在檢測前使細胞與5單位/ml人IL曙2(RocheMolecularBiochemicals)孵育最少48h。在96孔圓底板中，在存在系列稀釋的測試肽-免疫球蛋白綴合物、參考免疫球蛋白和參考肽(T-20,T-651和T-2635)的情況下，使用THIV-1JR-CSF病毒(Koyanagi，Y.，等，Science236(1987)819-822)感染1x105PBMC。使用的病毒的量等價于1.2ngHIV-1p24抗原/孔。一式四份進行感染。在37。C孵育板6天。在MicrosoftExcelFit(3.0.5版本Buildl2;equation205;Microsoft)中使用具有一個結合位點的S形劑量反應模型，通過p24ELISA(HIV-1p24ELISA#NEK050B)在感染結束時檢測病毒的產量。表9:肽和肽-免疫球蛋白綴合物的抗病毒活性<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>無作用的抗體對于不存在于該檢測系統中的抗原具有特異的結合活性(KD小于108mol/l)實施例10測定多肽的結合親合性通過使用BIAcore3000儀器(Pharmacia,Uppsala,Sweden)以等離子體表面共振(SPR)在25。C檢測基于HIV-1gp41蛋白的HR1-HR2相互作用(HR，七肽重復序列l和2區)的多肽的結合親合性。已經良好建立了BIAcore⑧系統用于分子相互作用的研究。其能夠連續地實時監測配體/分析物的結合，并因此可以測定結合速率常數(ka)、解離速率常數(kd)和平衡常數(KD)。SPR技術是基于測定接近于金涂覆的生物感受器芯片表面的折射率。折射率的改變表明由固定的配體與以溶液注射的分析物的相互作用所引起的表面上的質量改變。如果分子結合表面上固定的配體，則質量增加，在解離的情況中，質量降低。結合實驗通過三次連續的1分鐘注射含有1MNaCl的50mMNaOH預洗滌傳感器芯片SA(SensorChipSA(SA，鏈霉親合素))。然后將生物素酰化的HR1肽，生物素-T-2324(SEQIDNO:37)固定在SA包被的傳感器芯片上。為了避免質傳限制(masstransfer〖imitation),將溶解在HBS國P緩沖液(10mMHEPES，pH7.4，150mMNaCl，0.005%(v/v)表面活性劑P20)中的最低可能值的HR1肽(約200RU，共振單位)加載在SA芯片上。在開始測量之前，使用0.5%(w/v)十二烷^P危酸鈉(SDS)以50nL/min的流速務，沖一分鐘而第一次再生該芯片。將待分析的含有HR2HIV-1gp41的多肽首先以大約1mg/mL的濃度溶解在50mMNaHC03,pH9中，然后用HPS-P緩沖液稀釋以獲得范圍從25至1.95nM的多個濃度。;樣品的接觸時間是5分鐘(結合期)。然后用HBS-P洗滌芯片表面5分鐘(解離期)。所有的相互作用在精確的25°C(標準溫度)進行。在一個測量周期中樣品儲存在12。C。以每秒一個信號的檢測速率對信號進行檢測。樣品以50nL/min的流速以遞增的濃度注射在HR1綴合的生物感受器元件上。以50nL/min的流速用0.5%(w/v)SDS溶液洗滌1分鐘再生該表面。使用BIAevaluation4.1軟件包，通過分析使用多個不同的濃度獲得的傳感圖曲線而確定定義為ka/ka的平衡常數(KD)。通過從HR2-HR1相互作用的值中減去含有HR2的多肽與無鏈霉親合素的表面相互作用的反應值而校正非特異性結合。數據的擬合遵循1:1Langmuir結合模型。多肽的去糖基化含有HR2的多肽樣品以大約2mg/ml的濃度溶解在PBS緩沖液中，通過與肽-N4唐苦酶F(PNGaseF，Prozyme，SanLeandro，CA)在37。C孵育12-24小時而去糖基化(除去N-聚糖)，其中每毫克N糖基化的多肽使用50mUPNGaseF。表10a:示例性的含有HR2的多肽與HR1的結合常數<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表10b:含有HR2的多肽與HR1的示例性K『值<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>權利要求1.肽-免疫球蛋白綴合物，其特征在于a)所述的免疫球蛋白由兩條重鏈組成，或者由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，b)所述的免疫球蛋白是非功能性的免疫球蛋白，c)所述的綴合物具有下述通式免疫球蛋白-[肽]n其中n是從2至8的整數，d)肽鍵使肽的羧基末端氨基酸綴合到免疫球蛋白鏈的氨基末端氨基酸上，或者使免疫球蛋白鏈的羧基末端氨基酸綴合到肽的氨基末端氨基酸上。2.根據權利要求l的綴合物，其特征在于所述的肽是生物活性肽。3.根據權利要求l的綴合物，其特征在于所述的肽由肽接頭和生物活性肽組成。4.根據權利要求l-3任一項的綴合物，其特征在于所述肽彼此間具有90%或者更高的M酸序列同一性。5.根據權利要求l-4任一項的綴合物，其特征在于該免疫球蛋白是G類免疫球蛋白(IgG)或者是E類免疫球蛋白(IgE)。6.根據權利要求2-5任一項的綴合物，其特征在于所述的生物活性肽是抗融合肽。7.根據權利要求l-6任一項的綴合物，其特征在于所述的非功能性的免疫球蛋白是以10_5mol/l或者更高的Ko值(結合親和性)結合人類抗原的免疫球蛋白。8.根據權利要求l-6任一項的綴合物，其特征在于所述的非功能性的免疫球蛋白是a)其中重鏈和/或輕鏈缺少一個或多個構架區或/和高變區的一部分或者全部的免疫球蛋白，或者b)其中重鏈和/或輕鏈沒有可變區的免疫球蛋白，或者c)對于人類抗原具有l(T5mol/l或者更高的結合親和性的免疫球蛋白，或者d)對于人類抗原具有1(T5mol/l或者更高的結合親和性，并且對于非人類抗原具有10-7mo1/1或者更低的結合親和性的免疫球蛋白。9.用于生產根據權利要求l的綴合物的方法，其特征在于該方法包括a)在適于表達該綴合物的條件下培養含有一種或者多種質粒的細胞，其中所述質粒含有一個或者多個編碼根據權利要求1的綴合物的核酸分子，b)從細胞或者培養基中回收該綴合物。10.藥物組合物，其含有根據權利要求1至8之任一項的綴合物，或者其藥學上可接受的鹽以及藥學上可接受的賦形劑或者栽體。11.根據權利要求1至8任一項的綴合物在制備用于治療病毒感染的藥物中的用途。12.根據權利要求ll的用途，其特征在于該病毒感染是HIV感染。13.根據權利要求1至"8任一項的綴合物在治療需要抗病毒治療的患者中的用途。14.根據權利要求1至8任一項的綴合物，其特征在于所述的肽具有90%至小于100%的#^酸序列同一性。15.根據權利要求1至8和14之任一項的綴合物，其特征在于所述的非功能性的免疫球蛋白是其中重鏈和/或輕鏈缺少一個或者多個構架區或/和高變區的一部分或者全部的免疫球蛋白，和/或是其中重鏈和/或輕鏈無可變區的免疫球蛋白。全文摘要本發明涉及肽-免疫球蛋白綴合物，其中免疫球蛋白多肽鏈的末端中至少有兩個與肽綴合，由此所述肽可以是不同的、相似的或者相同的。該綴合在核酸水平上實現。文檔編號C07K19/00GK101291956SQ200680039224公開日2008年10月22日申請日期2006年10月19日優先權日2005年10月21日發明者E·科佩茨基,R·舒馬赫,S·桑庫拉特利,S·費舍爾申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司