具有新世界靈長類構架區的經改造的抗體的制作方法

專利名稱：：具有新世界靈長類構架區的經改造的抗體的制作方法
技術領域：
：本發明涉及抗體或其抗原結合部分，其具有可變區，所述可變區包含至少2個互補決定區(CDRs)和至少3個構架區。所述構架區是新世界靈長類構架區或衍生自新世界靈長類構架區，并且至少一個所述CDRs是經修飾的新世界靈長類CDR或非新世界靈長類CDR。
背景技術：
：抗體(免疫球蛋白)在哺乳動物的免疫系統中起重要作用。它們由漿細胞生產，所述漿細胞由前體B細胞發育而成。抗體由通過二硫橋連接的2個相同的多肽輕鏈和2個相同的多肽重鏈組成。輕鏈被稱為K或A輕鏈，和重鏈被稱為v、ju、5、cx或s。每條鏈由恒定區和可變區組成。可變區給予抗體以特異性。在每個可變區內是具有高可變性的區域或互補決定區(CDRs)，其側翼是被稱為構架區的更保守的區域。在每個可變區內是3個CDRs和4個構架區。抗體是雙功能分子，來自重和輕鏈的N-末端可變區段以特異性方式結合在一起，從而產生對抗原表面上的特定表位具有親和力的三維結構。恒定區區段負責延長抗體的血清半衰期和效應物功能，并且涉及補體結合、刺激吞噬作用、抗體依賴性細胞毒性和觸發粒細胞的顆粒釋放。雜交瘤技術的開發促進了具有特定特異性的單克隆抗體的生產。通常，此類雜交瘤是鼠類雜交瘤。已產生了人/小鼠嵌合抗體，其中將來自小鼠基因組的抗體可變區序列與來自人基因組的抗體恒定區序列相組合。該嵌合抗體顯示出親本小鼠抗體的結合特征，以及與人恒定區相關的效應物功能。通過在宿主細胞中表達來產生抗體，所述宿主細胞包括例如中國倉鼠卵巢細胞(CH0)、NSO骨髓瘤細胞、C0S細胞和SP2細胞。此類嵌合抗體已用于人治療中，然而，由人受者產生了針對這些嵌合抗體的抗體。此類抗嵌合抗體對使用嵌合抗體的持續治療是有害的。已提出，人單克隆抗體預期是用于體內人治療的超過小鼠單克隆抗體的改進。根據使用來自舊世界靈長類(恒河猴和黑猩猩)的抗體進行的工作，假定這些非人靈長類抗體在人中將是耐受的，因為它們在結構上類似于人抗體(EhrlichPH等人，Humanandprimatemonoclonalantibodiesfor/'力f/fotherapy.ClinChem.34:9第1681-1688頁(1988))。此外，因為人抗體是在恒河猴中是非免疫原性的(EhrlichPH等人，Hybridoma，1987，6:151-60)，所以可能反過來也是可行的，并且靈長類抗體在人中將是非免疫原性的。這些單克隆抗體由雜交瘤分泌，所述雜交瘤通過使淋巴細胞與人x小鼠異骨髓瘤(heteromyeloma)相融合來構建。EP0605442公開了結合人抗原的嵌合抗體。這些抗體包含來自舊世界猴的完整可變區和人或黑猩猩抗體的恒定區。在這個參考文獻中提出的關于這些構建體的優點之一是在舊世界猴中產生針對人抗原的抗體的能力，與在小鼠宿主中產生的抗體相比較，所述抗體在人中的免疫原性更低。新世界靈長類(廣鼻猴下目(戶/fl0^r力//7/))包含至少53個種，其通常分成2個科狨科(和懸猴科(CeW&e)。狨科由狨和糈組成。懸猴科包括松鼠猴、青猴、蜘蛛猴、絨毛猴、懸猴、禿猴、狐尾猴、夜或梟猴和吼猴。進化上遙遠的靈長類，例如新世界靈長類，不僅足夠不同于人以允許產生針對人抗原的抗體，還足以類似于人以具有類似于人抗體的抗體，從而使得當衍生自此類靈長類的抗體被引入人中時，宿主不產生抗抗體免疫應答。先前的研究已表征了表達的普通狨(的免疫球蛋白重鏈儲庫(雨BudingenH-C等人，Immunogenetics，2001，53:557-563)。鑒定了6個IGHV亞群，其顯示了與它們的人IGHV對應物的高度序列相似性。當與互補決定區(CDRs)相比較時，構架區是更保守的。普通狨與人IGHV序列之間的相似性程度小于非人舊世界靈長類與人之間的相似性程度。結構域抗體結構域抗體(dAb)是功能性結合單元，其可以使用抗體構架來制備，并且相應于抗體的重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區(VJ。結構域抗體具有約13kDa的分子量，或小于完整抗體大小的十分之一。免疫球蛋白輕鏈被稱為k或A輕鏈，和重鏈被稱為Y、iu、5、oc或s。可變區給予抗體以特異性。在每個可變區內是具有高可變性的區域，或者被稱為互補決定區(CDRs)，其側翼是被稱為構架區的更保守的區域。在每個輕鏈和重鏈可變區內是3個CDRs和4個構架區。與常規抗體不同，結構域抗體在細菌、酵母和哺乳動物系統中良好表達。它們的小尺寸允許更高的摩爾量/克產物，從而提供了效力的顯著增加。此外，結構域抗體可以用作構建部件，以制備治療產物例如多重耙向性dAbs，其中包含2個或更多個可變結構域的構建體結合至2個或更多個治療靶，或靶向肺或口服施用的dAbs。發明概述本發明人發現，新世界靈長類提供了抗體序列的來源，所述抗體序列預期在人中具有低免疫原性。選擇新世界靈長類作為存在于新世界和舊世界靈長類的分支點上的免疫球蛋白序列的儲庫。關鍵想法是，這種儲庫因此可能產生對于在舊世界靈長類中發現的免疫球蛋白序列中的后來趨異來說原始的免疫球蛋白序列。此類原始序列將與T細胞儲庫共存，因為它隨后在向人的道路上進化，時間為估計是舊世界和新世界靈長類的分支點的3千5百萬年前(MYA)(SchneiderH等人，MolPhylogenetEvol.,1993Sep;2(3):225-42)。這代表了延長的關于免疫耐受性的選擇期，因此本發明人預期此類原始序列不含最近進化的某些輔助性T細胞表位。因此，在第一個方面，本發明提供了抗體或其抗原結合部分，其具有可變區，所述可變區包含至少2個互補決定區(CDRs)和至少3個構架區，其中所述構架區是新世界靈長類構架區或衍生自新世界靈長類構架區，并且其中至少一個所述CDRs是非新世界靈長類CDR。在第二個方面，本發明提供了藥物組合物，其包含有效量的根據本發明的抗體或其抗原結合部分，以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑或稀釋劑。在第三個方面，本發明提供了本發明的抗體或其抗原結合部分在診斷應用中的用途，所述診斷應用用于檢測與特定疾病或病癥有關的抗原。在第四個方面，本發明提供了用于在人受試者中治療特征在于人TNF-ot活性的疾病或病癥的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用有效量的如本文所述的抗體或其抗原結合部分(或其藥物組合物)，其中所述抗體或其抗原結合部分結合TNF-oc。在本發明的一個進一步方面，提供了如本文所述的抗體及其抗原結合部分，以及其藥物組合物在制備藥物中的用途。特別地，用于制備在治療或診斷如本文所述的疾病或病癥中使用的藥物。在本發明的一個進一步方面，提供了經設計的新世界靈長類抗體或其抗原結合部分，其結合細胞表面抗原或細胞因子，其中所述抗體或其抗原結合部分包含可變區，所述可變區包含至少2個互補決定區(CDRs)和至少3個構架區，其中對所述CDRs進行選擇，從而使得所述抗體或抗原結合部分與所述細胞表面抗原或所述細胞因子結合。除非另有說明或上下文明確指出，預期可以使用如本文所述的抗體及其抗原結合部分，而不限制于本文所述的藥物組合物，并且摻入本文所述的試劑盒中。并且進一步地，除非另有說明或上下文明確指出，如本文所述的抗體及其抗原結合部分，以及藥物組合物和試劑盒，可以用于本文公開的治療和診斷方法。附圖簡述圖l證實了AB138與大鼠脊髄裂解物(泳道2)中存在的大鼠MOG結合而不與CH0K1SV裂解物(泳道3)結合。泳道1包含分子量標記。圖2證實了抗TNFot單克隆抗體缺乏與大鼠脊髓裂解物(泳道2)和CH0K1SV裂解物(泳道3)中存在的大鼠MOG的相同樣品的非特異性結合。泳道1包含分子量標記。圖3是供體和接納體(acceptor)VH氨基酸序列的比對。圖4是供體和接納體VL氨基酸序列的比對。圖5:通過ELISA測量的抗體AB164、AB103和AB197與TNF-ct的結合。圖6:通過AB164、AB197、AB103來中和TNF-a誘導的L-929細胞細胞毒性。發明詳述在第一個方面，本發明提供了抗體或其抗原結合部分，其具有可變區，所述可變區包含至少2個互補決定區(CDRs)和至少3個構架區，其中所述構架區是新世界靈長類構架區或衍生自新世界靈長類構架區，并且其中至少一個所述CDRs是非新世界靈長類CDR。在第二個方面，本發明提供了藥物組合物，其包含有效量的根據本發明的抗體或其抗原結合部分，以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑或稀釋劑。在第三個方面，本發明提供了本發明的抗體或其抗原結合部分在診斷應用中的用途，所述診斷應用用于檢測與特定疾病或病癥有關的抗原。在第四個方面，本發明提供了用于治療特征在于在人受試者中的人TNF-oc活性的疾病或病癥的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用有效量的如本文所述的抗體或其抗原結合部分(或其藥物組合物)，其中所述抗體或其抗原結合部分結合TNF-oc。在本發明的某些實施方案中，可變區包含3個CDRs和4個構架區。還優選的是，該抗體在人中具有低的預測的免疫原性。所述抗體或其抗原結合部分的可變區可以包含來自不同來源的CDRs的組合。在某些實施方案中，可變區包含選自下列的CDRs:至少一個鼠類CDR序列(優選地小鼠或大鼠)，至少一個人CDR序列，至少一個合成的CDR序列，至少一個兔CDR序列，至少一個經修飾的新世界靈長類CDR序列，以及前述CDR序列中的2個或更多個的組合，至少一個人CDR和至少一個鼠類CDR，至少一個人CDR和至少一個合成的CDR，至少一個人CDR和至少一個兔CDR，至少一個人CDR和至少一個新世界靈長類CDR，至少一個鼠類CDR和至少一個合成的CDR，至少一個鼠類CDR和至少一個兔CDR，至少一個鼠類CDR和至少一個新世界靈長類CDR，至少一個合成的CDR和至少一個兔CDR，至少一個合成的CDR和至少一個新世界靈長類CDR，和至少一個兔CDR和至少一個新世界靈長類CDR。在優選形式中，可變區包含3個鼠類CDR序列，特別是3個小鼠CDR序列。在一個備選實施方案中，可變區包含3個人CDR序列在一個進一步的優選實施方案中，可變區包含4個新世界靈長類構架區，或4個其中所述區域衍生自新世界靈長類構架區的構架區。在一些實施方案中，抗原結合部分是結構域抗體。在具體實施方案中，所述抗體或抗原結合部分進一步包含人或非人舊世界靈長類恒定區序列或其組合。非人舊世界靈長類的例子包括但不限于，黑猩猩、狒狒、猩猩、短尾猴和大猩猩。在本發明的一個進一步的實施方案中，dAb可以是多聚化的，如例如異或同二聚體(例如，VH/VH、VJVl或Vh/Vl)，異或同三聚體(例如，VH/VH/VH、VL/VL/VL、Vh/Vh/Vl或vh/vl/vl)，異或同四聚體(例如，VH/VH/VH/VH、Vl/Vl/Vl/Vl、Vh/Vh/Vh,Vl、Vh/Vh/Vl/Vl或Vh/Vl/Vl/Vl)，或更高次的異或同多聚體。多聚化可以增加抗原結合的強度，其中結合的強度與多個結合位點的結合親和力總和有關。例如，本發明提供了結構域抗體，其中所述結構域抗體與至少一個其他結構域抗體連接。每個dAb可以與相同或不同的抗原結合。dAb多聚體可以進一步包含一個或多個dAbs，所述dAbs是連接的并且其中每個dAb與不同的抗原結合，多特異性配體，包括所謂的"雙重特異性配體"。例如，雙重特異性配體可以包含一對Vh結枸域或一對V^結構域。此類雙重特異性配體在DomantisLtd的W020(M/003019(PCT/GB2003/002804)中描述，所述專利整體引入本文作為參考。新世界靈長類構架區序列優選來自新世界靈長類，其選自狨、糈、松鼠猴、青猴(titimonkey)、蜘蛛猴、絨毛猴(woollymonkey)、懸猴、禿猴、狐尾猴、夜或梟猴和吼猴，最優選是狨。優選地，嵌合抗體或其抗原結合部分所結合的抗原在性質上是肽、蛋白質、碳水化合物、糖蛋白、脂質或糖脂，選自腫瘤相關抗原，包括癌胚抗原、EpCAM、Lewis-Y、Lewis—Y/b、PMSA、CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、CD154、EGF-R、Her-2、TRAIL和VEGF受體，涉及免疫或炎性疾病或病癥的抗原，包括CD3、CD4、CD25、CD40、CD49d、MHCI類、MHCII類、GM-CSF、干擾素-Y、IL-1、IL-12、IL-13、IL-23、TNF-oc和IgE，在宿主細胞上表達的抗原，包括糖蛋白1Ib/IIIa、P-糖蛋白、嘌呤能受體和粘附受體，包括CDlla、CDllb、CDllc、CD18、CD56、CD58、CD62或CD144,包含細胞因子、趨化因子、生長因子或其他可溶性生理學調節劑或其受體的抗原，包括嗜酸性粒細胞趨化因子(eotaxin)、IL-6、IL-8、TGF-p、C3a、C5a、VEGF、NGF及其受體，涉及中樞神經系統疾病或病癥的抗原，包括P-淀粉樣蛋白和感染性蛋白質，非人源的抗原例如微生物、納米生物(nanobial)或病毒抗原，或者毒素，包括呼吸道合胞病毒蛋白F、炭疽毒素、響尾蛇毒和地高辛；其中所述嵌合抗體充當激動劑或拮抗劑，或者對于通過與補體或殺傷細胞(例如NK細胞)一起作用來消除(殺死或去除)不希望的細胞(例如，抗CD4)來說是有活性的，或者對于作為細胞毒劑或引起吞噬細胞對Fc受體的結合來說是有活性的，或者中和其靶的生物活性。還優選的是，至少一個構架區的序列被修飾，以增加結合或效力或者減少預測的在人中的免疫原性。本發明抗體或抗原結合部分的結合或效力增加或者預測的在人中的免疫原性減少是相對于其中構架區未修飾的抗體或其抗原結合部分而言的。在其他實施方案中，一個或多個CDRs的序列被修飾，以增加結合或效力或者減少預測的在人中的免疫原性。本發明抗體或抗原結合部分的結合或效力增加或者預測的在人中的免疫原性減少是相對于其中構架區未修飾的抗體或其抗原結合部分而言的。結合的增加通過抗體或其抗原結合部分的KD(UK。,)的減少而得到證實。效力的增加在生物學測'定法中得到證實。例如，可以用于測量抗體或其抗原結合部分的效力的測定法包括TNFoc誘導的L929細胞毒性中和測定法，IL-12誘導的人PHA活化的外周血單核細胞(PBMC)增殖測定法，和RAML介導的小鼠脾細胞的破骨細胞分化(Stern，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6808-6812(1990);Kong，Y-Y.等人，Nature397:315-323(1990);Matthews,N.和M.L.Neale，4F27p力oir!'/7esa/i///7ter尸ero/2s，a戶rac〃c"J/7prosc力,1987，M.J.Clemens,A.G.Morris和A.J.H,Gearing,編輯，IRLPress,第221頁)。如本文所使用的，術語"抗體"意指免疫球蛋白分子，其由通過二硫鍵鏈間連接的4條多肽鏈組成2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈。每條重鏈由重鏈可變區(HCVR或VH)和重鏈恒定區組成。重鏈恒定區包含3個結構域CH1、Ch2和CH3。每條輕鏈由輕鏈可變區(LCVR或VJ和輕鏈恒定區組成。輕鏈恒定區由1個結構域組成Vh和Vl區可以進一步再分成稱為互補決定區(CDR)的具有高可變性的區域，其中散布著稱為構架區(FR)的更保守的區域。每個Vh和VL由3個CDRs和4個FRs組成，從氨基末端到羧基末端以下列順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。如本文所使用的，術語抗體的"抗原結合部分"指免疫球蛋白的一個或多個組分或衍生物，其顯示出與抗原結合的能力。已顯示，抗體的抗原結合功能可以由全長抗體的片段來執行。包含在術語抗體的"抗原結合部分"內的結合片段的例子包括(i)Fab片段，由Vl、Vh、C^和Ch1結構域組成的單價片段；(ii)F(aV)2片段，包含在鉸鏈區通過二疏橋連接的2個Fab片段的二價片段；(iii)由Vh和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單個臂的Vl和VH結構域組成的Fv片段；(v)由單個VH結構域或VL結構域(vandenBeukenT等人，2001，J.Mol.Biol，310，591)組成的dAb片段(Ward等人，1989，Nature341:544-546);和(vi)分離的互補決定區(CDR)。此外，盡管Fv片段的2個結構域W和VH由分開的基因編碼，但它們可以使用重組方法通過合成的連接體來進行連接，所述合成的連接體使得它們能夠制備為單條蛋白質鏈，其中Vl和VH區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv);(參見例如Bird等人，1988，Science242:423-426和Huston等人，1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。此類單鏈Fvs也希望包含在術語抗體的"抗原結合部分"內。還包含其他形式的單鏈Fvs和相關分子，例如雙抗體或三抗體。雙抗體是二價抗體，其中Vh和l結構域在單條多肽鏈上表達，但使用太短而不允許同一鏈上的所述2個結構域之間配對的連接體，從而迫使所述結構域與另一條鏈的互補結構域配對并形成2個抗原結合位點(參見例如，Holliger，P.，等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448;Poljak，R.J,，等人，1994，Structure,2:1121-1123)。生產根據本發明的抗體的方法將是本領域技術人員熟悉的。參見例如，美國專利號4,816,567、美國專利號5,585,089和US20030039649，所述專利整體引入本文作為參考。此類方法需要使用標準重組技術。優選地，根據本發明的抗體或其抗原結合部分在人宿主中具有預測的^[氐免疫原性。"低免疫原性，，意指抗體在接受該抗體的至少大多數個體中不產生這樣的抗體應答，即所述抗體應答的量級足以減少以達到治療效果來說足夠的時間連續施用所述抗體的功效。在人中的免疫原性水平可以使用MHCII類結合預測程序Propred(http://www.imtech.res.in/raghava/propred)來預測，使用所有等位基因的1%閾值分析。可以使用的其他程序包括Rankpep(hup://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html)Epibase(Algonomics專有軟件algonofflics.com)。相對于起始供體分子，免疫原性減少的分子將不包含或包含數目減少的被預測與MHCII類等位基因結合的肽，所述匪CII類等位基因在靼群體中是高度表達的(FlowerDR，DoytchinovaIA.(2004)Immunoinformaticsandthepredictionofimmunogenicity，DrugDiscovToday,9(2):82-90)。MHCII類結合的功能分析可以通過下述方法來進行產生相應于目的蛋白質的重疊肽，并就其引起T細胞活化(T細胞增殖測定法)或替換報道肽——已知的MHCII類結合肽(HammerJ等人，1994,J.Exp.Med.，180:2353)的能力來測試這些肽。在本文中關于新世界靈長類構架區所使用的術語"衍生自"意指，新世界靈長類構架區的序列由天然序列而改變。通常，將進行改變以增加結合，例如在美國專利號5，585，089和US20030039649中描述的，或減少預測的在人中的免疫原性。術語"衍生自"不包括導致可變區中存在的構架區的整個序列等同于人構架序列的改變。可以用于比較的一個數據庫是hup://www.ncbi.nlm.nih.gov/。在一個進一步的方面，本發明提供了經設計的新世界靈長類抗體或其抗原結合部分，其結合細胞表面抗原或細胞因子，其中所述抗體或其抗原結合部分包含可變區，所述可變區包含至少2個互補決定區(CDRs)和至少3個構架區，其中對所述CDRs進行選擇，從而使得所述抗體或抗原結合部分與所述細胞表面抗原或所述細胞因子結合。如本文所使用的，術語"經設計的"意指，已使用在下述參考文獻中描述的表位印記方法來選擇新世界靈長類CDRs:Hoogenboom等人，PCT公開號W093/06213和Jespers等人，BI0/TEC誦L0GY,第12巻，1994，第899-903頁，所述參考文獻在此整體引入。在這種方法中使用的抗體文庫優選是如下述參考文獻中所描述的進行制備并篩選的scFv文庫McCafferty等人，PCTV/Hf號WO92/01047，McCafferty等人，1990，Nature,348:552-554;和Griffiths等人，1993，EMBOJ，12:725-734，所述參考文獻在此整體引入作為參考。例如，選擇了最初的人l和Vh區段后，執行"混合和匹配"實驗以選擇優選的VJVH配對組合，在所述混合和匹配實驗中，就hTNF-oc結合來篩選最初選擇的1和1片區段的不同對。此外，為了進一步改善hTNF-cc結合的親和力和/或降低hTNF-a結合的解離速率常數，可以使優選的V7VH對的Vl和VH區段隨機突變，優選在Vh和/或Vl的CDR3區域內，其過程類似于在天然免疫應答過程中負責抗體的親和力成熟的體內體細胞突變過程。這種體外親和力成熟可以通過使用分別與VHCDR3或VlCDR3互補的PCR引物擴增Vh和Vl區來完成，所述引物在某些位置處用4種核苷酸堿基的隨機混合物"刺入(spiked)"，從而使得所得到的PCR產物編碼其中已將隨機突變引入Vh和/或lCDR3區域內的Vh和l區段。可以就與抗原的結合來重新篩選這些隨機突變的Vh和Vl區段，并且可以選擇顯示出抗原結合的高親和力和低解離速率的序列。在篩選并分離與來自重組免疫球蛋白展示文庫的目的抗原結合的抗體或其抗原結合部分后，可以從展示包中(例如，從噬菌體基因組中)回收編碼所選抗體的核酸，并通過標準重組DNA技術亞克隆到其他表達載體內。需要時，可以進一步處理所述核酸以產生本發明的其他抗體形式(例如，與編碼另外的免疫球蛋白結構域例如另外的恒定區的核酸相連接)。為了表達通過篩選組合文庫而分離的重組人抗體，將編碼該抗體的DNA克隆到重組表達載體中，并引入哺乳動物宿主細胞中。可以被把向的細胞表面抗原和可以在印記法中使用的抗體的例子包括但不限于抗原抗體(參考文獻)CD30KT3(VanWauwe-JP等人(1980)JournalofImmunology124:2708-13)CD201F5(Press-0W等人(1987)Blood69:584)Y2B8(White-CA等人(1991)Pharm.Sci.Technol.Today2:95-101)CD33P67.6(Koller-U和Peschel-CH.InKnapp-W等人EdsLeukocyteTypinIV:WhiteCellDifferentiationAntigens，OxfordUniversityPress1989:812-813)CD52CAMPATH1(Hale-G等人(1983)Blood62:873-82)EGF-RmAb225(Bruell-D等人(2005)IntJMolMed15:303-313)糖蛋白1Ib/IIIa10E5和7E3(Coller-BS(1985)JournalofClinicalInvestigation76:101-108)Her-24D5(Kumar-R等人(1991)Mol.CellBiol11:979-86)CD25Mab:RFT5(Engert-A等人(1991)IntJCancer49:450-456)可以被乾向的細胞因子和可以在印記法中使用的抗體的例子包括但不限于抗原抗體(參考文獻)TNF-ccmAbl95(Moller-A等人(1990)Cytokine2:162-169)mAbl、11、12、20、21、25、31、32、37、42、47、53、54(RathjenDA等人(1991)MolecularImmunology28:79-86)VEGFmAbsA3.13.1、A4.6.1、B4.3.1和B2.6.2(Kim-KJ(1992)GrowthFactors7:53-64)本發明進一步基于用于擴增新世界靈長類免疫球蛋白基因的方法，例如使用對重和輕鏈可變區基因家族特異的引物通過聚合酶鏈式反應(PCR)從由新世界靈長類淋巴細胞中提取的核酸中進行擴增。隨后，將擴增的可變區克隆到包含人或靈長類恒定區基因的表達栽體內，用于產生新世界靈長類嵌合重組抗體。^吏用標準重組DNA方法來獲得抗體重和輕鏈基因，將這些基因合并入重組表達載體中并且將載體引入宿主細胞中，所述宿主細胞例如為在Sambrook，Fritsch和Maniatis(編輯)，MolecularCloning:alaboratorymanual,第2版，ColdSpringHarbor,N.Y(1989)中描述的那些。合適的表達載體將是本領域技術人員熟悉的。產生免疫球蛋白的新世界靈長類淋巴細胞通常通過與骨髓瘤細胞系融合以產生雜交瘤而變得永生。用于表達本發明的重組抗體的優選哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、NSO骨髓瘤細胞、C0S細胞和SP2細胞。除了哺乳動物表達系統外，本發明還考慮了非哺乳動物表達系統的使用，例如衍生自植物或原核生物(細菌)的那些表達系統。此類表達系統將是本領域技術人員熟悉的。VH、Vl和恒定區結構域儲庫可以是天然存在的免疫球蛋白序列儲庫或合成的儲庫。天然存在的儲庫是例如從表達免疫球蛋白的細胞制備的儲庫，所述表達免疫球蛋白的細胞從一種或多種靈長類中收獲。此類儲庫可以是原初的(naive)，即從新生的表達免疫球蛋白的細胞制備，或者是重排的，即從例如成年靈長類B細胞制備。需要時，隨后對從天然儲庫或任何儲庫中鑒定的結合靶抗原的克隆實施誘變并進一步進行篩選，以產生和選擇具有改善的結合特征的變體。免疫球蛋白可變結構域的合成儲庫通過將多樣性人工引入經克隆的可變結構域中來制備。此類親和力成熟技術將是本領域技術人員熟悉的，例如由R.A.Irving等人,2001，JournalofImmunologicalMethods,248，31-45描述的那些。新世界靈長類抗體基因的可變區或其CDR可以通過下述方法來克隆提供核酸例如cDNA，提供與編碼抗體基因的5'前導序列的cDNA序列互補的引物，使那種cDM與引物接觸以形成雜交復合物，并擴增cDM以產生編碼新世界靈長類抗體基因的可變區(或CDR區)的核酸。鑒于本發明的教導，本發明領域的技術人員將會意識到，新世界靈長類可變區序列可以用作接納體用于使用標準重組技術來嫁接非新世界靈長類序列，特別是CDR序列。例如，美國專利號5，585，089描述了用于制備低免疫原性的嵌合抗體的方法，所述嵌合抗體保留了非人親本抗體的高親和力，并且包含來自供體免疫球蛋白的一個或多個CDRs和來自人免疫球蛋白的構架區。美國公開號20030039649描述了用于制備低免疫原性的嵌合抗體(包含來自非人抗體的CDR序列和人抗體的構架序列)的人源化方法，基于使用規范CDR結構類型的非人抗體，相對于種系規范CDR結構類型的人抗體，其作為用于選擇用于人源化抗體的合適的人構架序列的基礎。因此，這些原則可以應用于將一個或多個非新世界靈長類CDRs嫁接到新世界靈長類接納體可變區內。CDR序列可以得自從抗體分離的基因組DNA，或得自數據庫中存在的序列，所述數據庫例如為國家生物寺支術信息中心(NationalCentreforBiotechnologyInformation)蛋白質和核普酸數據庫，KabatDatabaseofSequencesofProteinsofImmunologicalInterest,CDR序列可以是基因組DNA或cDNA。用于將替代CDR嫁接到接納體可變序列內的方法將是本發明領域的技術人員熟悉的。通常，對于每個可變輕鏈和可變重鏈或者在結構域抗體的情況下對于單條鏈，將CDRs嫁接到接納體可變區序列內。本發明的優選方法涉及經由引物指導的誘變來替換可變區序列中的CDR1，或更優選地CDR2。該方法由下述步驟組成使編碼所需突變的合成寡核苷酸與靶區域退火，其中它充當引物用于起始體外DNA合成；通過DNA聚合酶延伸寡核苷酸以產生攜帶所需突變的雙鏈DM;和將該序列連接并克隆到合適的表達栽體中(Sambrook,Joseph;和DavidW.Russell(2001).#o/ecw/a_rC/an//7f爿Zfl6or"CLry他"i/a厶第3版，ColdSpringHarbor,N.Y.:ColdSpringHarborLaboratoryPress)。更進一步地，抗體或其抗原結合部分可以是較大的免疫粘附分子的一部分，所述較大的免疫粘附分子通過使抗體或抗體部分與一種或多種其他蛋白質或肽共價或非共價結合來形成。此類免疫粘附分子的例子包括使用鏈霉抗生物素蛋白核心區來制備四聚scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等人，1995HumanAntibodiesandHybridomas,6:93-101)，以及使用半胱氨酸殘基、標記肽和C-末端多組氨酸標簽來制備二價和生物素化的scFv分子(Kipriyanov,S.M.,等人，1994Mol.Immunol.，31:1047-1058)。使用常規技術可以由完整抗體制備抗體部分例如Fab和F(ab')2片段，例如分別用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗體。此外，使用如本文所述的和技術人員已知的標準重組DM技術，可以獲得抗體、抗體部分和免疫粘附分子。恒定區序列(Fc部分)優選從人或靈長類免疫球蛋白序列獲得。靈長類序列可以是新世界靈長類或舊世界靈長類序列。合適的舊世界靈長類包括黑猩猩，或其他類人猿例如大猩猩或猩猩，它們由于其與人的緊密的系統發生接近性而與人恒定區序列共享高度的同源性。編碼人或靈長類恒定區的序列可從數據庫中獲得，所述數據庫包括例如國家生物技術信息中心蛋白質和核苷酸數據庫，KabatDatabaseofSequencesofProteinsofImmunologicalInterest,根據本發明的抗體或抗原結合部分能夠與人或非人抗原結合。優選地，嵌合抗體或其抗原結合部分所結合的抗原在性質上是肽、蛋白質、碳水化合物、糖蛋白、脂質或糖脂，選自腫瘤相關抗原，包括癌胚抗原、EpCAM、Lewis-Y、Lewis-Y/b、PMSA、CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、CD154、EGF-R、Her-2、TRAIL和VEGF受體，涉及免疫或炎性疾病或病癥的抗原，包括CD3、CD4、CD25、CD40、CD49d、MHCI類、MHCII類、GM-CSF、干擾素-Y、IL-1、IL-12、IL-13、IL-23、TNF-oc和IgE，在宿主細胞上表達的抗原，包括糖蛋白IIb/IIIa、P-糖蛋白、嘌呤能受體和粘附受體，包括CDlla、CDllb、CDllc、CD18、CD56、CD58、CD62或CD144,包含細胞因子、趨化因子、生長因子或其他可溶性生理學調節劑或其受體的抗原，包括嗜酸性粒細胞趨化因子、IL-6、IL-8、TGF-P、C3a、C5a、VEGF、NGF及其受體，涉及中樞神經系統疾病或病癥的抗原，包括p-淀粉樣蛋白和感染性蛋白質，非人源的抗原例如微生物、納米生物或病毒抗原，或者毒素，包括呼吸道合胞病毒蛋白F、炭疽毒素、響尾蛇毒和地高辛；其中所述嵌合抗體充當激動劑或拮抗劑，或者對于通過與補體或殺傷細胞(例如M細胞)一起作用來消除(殺死或去除)不希望的細胞(例如，抗CD4)來說是有活性的，或者對于作為細胞毒劑或引起吞噬細胞對Fc受體的結合來說是有活性的，或者中和其靶的生物活性。更優選地，抗原是TNFa，最優選地人TNFot。備選地，所述抗體或其抗原結合部分可以結合非人抗原。優選地，所述非人抗原選自呼吸道合胞病毒F蛋白、巨細胞病毒、蛇毒和地高辛。如本文所使用的，術語"與……結合"意指通過抗體的免疫球蛋白可變區以1UM或更低的離解常數(Kd)與抗原結合，如通過表面等離子共振分析所測量的，使用例如BIAcoreTM表面等離子共振系統和BIAcoreTM動力學評估軟件(例如，版本2.1)。關于特異性結合相互作用的親和力或離解常數(Kd)優選是約500nM-約50pM，更優選約500nM或更低，更優選約300nM或更低，和優選至少約300nM-約50pM，約200nM-約50pM，和更優選至少約100nM-約50pM，約75nM-約50pM,約10nM-約50pM。本發明的抗體在人治療中是有利的，因為誘導人抗抗體應答的可能性將被減少。通過篩選組合免疫球蛋白文庫(例如，噬菌體展示文庫)以分離顯示出所需結合特異性和功能行為(例如，TNFot的中和可以使用L929細胞進行測量)的文庫成員，可以鑒定并分離根據本發明產生的結合乾抗原的重組抗體。應當理解，其中使用抗原結合部分或抗體衍生物(例如Fabs、scFv和V結構域或結構域抗體)的所有方法都在本發明的范圍內。噬菌體展示技術在本領域中已廣泛地得到描述，并且用于產生并篩選此類文庫以及使其產物親和力成熟的方法和化合物的例子可以在下述參考文獻中找到例如，Barbas等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88:7978-7982;Clarkson等人，1991，Nature,352:624-628;Dower等人，PCT公開號WO91/17271，美國專利號5，427，908,美國專利號5，580，717和EP527，839;Fuchs等人，1991，Bio/Technology，9:1370-1372;Garrad等人，1991Bio/Technology,9:1373-1377;Garrard等人，PCT公開號W092/09690;Gram等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3576-3580;Griffiths等人，1993EMB0J，12:725-734;Griffiths等人，美國專利號5，885，793和EP589,877;Hawkins等人，1992，JMolBiol,226:889-896;Hay等人，1992，HumAntibodHybridomas,3:81-85;Hoogenboom等人，1991NucAcidRes，19:4133-4137;Huse等人，1989，Science,246:1275-1281;Knappik等人，2000，JMolBiol，296:57-86;Knappik等人，PCTWO97/08320;Ladner等人，美國專利號5,223,409，美國專利號5，403，484，美國專利號5，571，698，美國專利號5，837，500和EP436，597;McCafferty等人，1990，Nature,348:552-554;McCafferty等人，PCT公開號WO92/01047，美國專利號5,969,108和EP589,877;Salfeld等人，PCTWO97/29131，US臨時申請號60/126，603;和Winter等人，PCTWO92/20791和EP368,684。表達本發明的抗體的重組文庫可以在微生物例如酵母或細菌的表面上表達(參見PCT公開W099/36569和98/49286)。選擇的淋巴細胞抗體法(SelectedLymphocyteAntibodyMethod)或在現有技術中被稱為的SLAM，是快速產生高親和力抗體的另一種方法。與噬菌體展示方法不同，所有抗體全都是二價的。為了產生新世界靈長類抗體，用人抗原例如TNFot多肽免疫新世界靈長類。在免疫后，取出細胞并在獨個微量孔中進行選擇性增殖。從孔中取出上清液并就結合和功能進行測試。可以回收基因序列用于后續操作，例如人源化、Fab片段、scFv或dAb產生。因此，另一個例子是通過SLAM及其衍生形式(Babcook，J.S.等人，1996,Proc.Natl.Acad.Sci，USA93;7843-7848，美國專利5，627，052和PCT公開WO92/02551)來衍生本發明的配體。SLAM的調整形式，例如使用備選方法來測試上清液，例如淘選，也在本發明的范圍內。在一種表達系統中，在核糖體上展示重組肽/蛋白質文庫(例如參見Roberts,RW和Szostak，J.W.1997.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94:12297-123202以及PCT公開號WO98/31700)。因此，另一個例子涉及優選但不限于從經免疫的細胞制備的DM文庫(例如抗體和衍生物)的產生和體外轉錄，翻譯該文庫，從而使得蛋白質和"經免疫的"mRMs停留在核糖體上，親和力選擇(例如通過與RSP結合)，mRNA分離，反向翻譯和后續擴增(例如通過聚合酶鏈式反應或相關技術)。必要時可以偶聯另外的選擇和擴增循環，以通過在這種系統中引入體細胞突變或通過現有技術中已知的其他親和力成熟方法來進行親和力成熟(R.A.Irving等人，JournalofImmunologicalMethods,248，31-45(2001))。另一個例子考慮應用乳狀液區室化技術(emulsioncompartmentalisationtechnology)以產生本發明的抗體。在乳狀液區室化中，將體外和光學分選方法與在乳狀液的油滴內的水相中翻譯的蛋白質及其核苷酸編碼序列的共區室化相組合(參見PCT公開號W099026711和WO0040712)。用于生產和選擇抗體的主要要素基本上類似于核糖體展示的體外方法。根據本發明的抗體或其抗原結合部分可以與另一種功能分子衍生或連接。例如，抗體或抗原結合部分可以通過化學偶聯、基因融合、非共價結合或其他方式與一種或多種其他分子實體進行功能上連接，所述其他分子實體例如為另一種抗體、可檢測的試劑、細胞毒劑、藥物試劑和/或可以介導抗體或其抗原結合部分與另一種分子(例如鏈霉抗生物素蛋白核心區或多組氨酸標簽)結合的蛋白質或肽。常用于產生免疫毒素的細胞毒劑包括放射性同位素例如mIn或9°Y，硒，核糖核酸酶，刪除了結合結構域的截短的微生物毒素例如假單胞菌外毒素或白喉毒素，微管蛋白抑制劑例如加利車霉素(ozagamicin)，美登木素生物堿(包括DM-1)，auristatins和紅豆杉醇類(taxoids)，核糖體滅活蛋白例如蓖麻毒素，ebulinl,肥皂草毒蛋白和白樹毒蛋白，和前體藥物例如美法侖。抗體或其抗原結合部分可以與之衍生的有用的可檢測試劑包括熒光化合物。示例性的熒光可檢測試劑包括熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、5-二甲基胺-1-萘磺酰氯、藻紅蛋白等。抗體還可以用可檢測的酶進行衍生化，例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶等。當抗體用可檢測的酶進行衍生化時，它通過添加該酶用于產生可檢測的反應產物的另外試劑來檢測。抗體還可以用生物素進行衍生化，并通過間接測量抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白結合進行檢測。本發明還擴展至聚乙二醇化的抗體或抗原結合部分，其相對于非聚乙二醇化的抗體多肽而言提供了增加的半衰期和針對降解的抗性而無活性的損失(例如結合親和力的減少)。如本文所述的抗體或抗原結合部分可以使用本領域已知的方法與聚合物分子(優選PEG)偶聯，所述聚合物分子對于達到增加的半衰期和降解抗性性質是有用的。可以在本發明中使用的聚合物部分可以是合成或天然存在的，并且包括但不限于，直鏈或支化的聚亞烷基、聚亞烯基或聚氧化烯聚合物，或分支或未分支的多糖例如同或雜多糖。可以在本發明中使用的合成聚合物的優選例子包括直鏈或支化的聚(乙二醇)(PEG)、聚(丙二醇)或聚(乙烯醇)，及其衍生物或取代的形式。用于與本文所述的抗體連接的特別優選的取代的聚合物包括取代的PEG,包括甲氧基(聚乙二醇)。除PEG外可以使用的，或可以代替PEG使用的天然存在的聚合物部分包括乳糖、直鏈淀粉、葡聚糖或糖原，以及將由本領域技術人員認可的其衍生物。聚合物分子的衍生形式包括例如這樣的衍生物，其中存在另外的用。此類衍生物包括N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活性酯，琥珀酰亞胺基丙酸酯聚合物，和巰基-選擇性反應試劑例如馬來酰亞胺，乙烯砜和硫醇。特別優選的衍生化的聚合物包括但不限于具有下式的PEG聚合物PEG-0-CH2CH2CH2-C02-NHS;PEG-0-CH2-miS;PEG-0-CH2CH2-C02-NHS;PEG-S-CH2CH2-CO-NHS;PEG-02CNH-CH(R)-C02-NHS;PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS;和PEG-0-CH2-C02-NHS;其中R是(CH2)4)NHC02(mPEG)。PEG聚合物可以是線性分子，或可以是分支的，其中多個PEG部分存在于單個聚合物中。反應性基團(例如，MAL、NHS、SPA、VS或巰基)可以直接與PEG聚合物連接，或可以經由連接體分子與PEG連接。在本發明中可用的聚合物的大小可以為500Da-60kDa，例如，1000Da-60kDa,10kDa-60kDa，20kDa-60kDa，30kDa-60kDa，40kDa-60kDa,以及高達50kDa-60kDa。在本發明中使用的聚合物，特別是PEG，可以是直鏈聚合物或可以具有分支的構象。在本發明中可用的聚合物(PEG)分子可以使用本領域眾所周知的方法與抗體或其抗原結合部分附著。在PEG或其他聚合物部分與本發明的抗體多肽單體或多聚體附著中的第一個步驟是用包含親電子體的官能團替換PEG聚合物的羥基末端基團。特別地，將PEG聚合物與抗體多肽單體或多聚體中存在的半胱氨酸或賴氨酸殘基附著。所述半胱氨酸和賴氨酸殘基可以是天然存在的，或可以被改造到抗體多肽分子中。例如，半胱氨酸殘基可以在抗體多肽的C-末端上進行重組改造，或者在抗體多肽中特異的溶劑可接近位置處的殘基可以用半胱氨酸或賴氨酸置換。可以將抗體與能夠增加其體內半衰期的一種或多種分子連接。這些分子在抗體上除抗原結合位點外的位點處與抗體連接，從而它們不干擾/在空間上阻礙抗原結合位點。通常，此類分子是體內天然存在并且抵抗經由內源性機制的降解或去除的多肽。對于本領域技術人員顯而易見的是，可以使用此類天然存在的分子的片段或衍生物，并且某些可以不是多肽。增加半衰期的分子可以選自下述(a)來自細胞外基質的蛋白質，例如，膠原，層粘連蛋白，整聯蛋白和纖連蛋白；(b)在血液中發現的蛋白質，例如纖維蛋白，ot-2巨球蛋白，血清白蛋白，纖維蛋白原A,纖維蛋白原B，血清淀粉樣蛋白A，庚珠蛋白(heptaglobin)，蛋白質，泛蛋白，子宮球蛋白(uteroglobulin)，p-2微球蛋白，纖溶酶原，溶菌酶，半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，oc-l-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制劑；(c)免疫血清蛋白，例如IgE，IgG，IgM;(d)轉運蛋白，例如視黃醇結合蛋白，oc-l微球蛋白；(e)防衛素，例如P-防衛素1，嗜中性粒細胞防衛素1、2和3;(f)在血腦屏障處或在神經組織中發現的蛋白質，例如黑皮質素受體、髄磷脂、抗壞血酸轉運體；(g)轉鐵蛋白受體特異性配體-神經藥物試劑融合蛋白(參見US5977307);腦毛細管內皮細胞受體，轉鐵蛋白，轉鐵蛋白受體，胰島素，胰島素樣生長因子1(IGF1)受體，胰島素樣生長因子2(IGF2)受體，胰島素受體；(h)定位于腎的蛋白質，例如多囊蛋白，IV型膠原，有機陰離子運載體Kl，Heymann's抗原；(i)定位于肝的蛋白質，例如乙醇脫氫酶，G250;(j)凝血因子X;(k)oc-l抗胰蛋白酶；(1),1oc;(m)定位于肺的蛋白質，例如分泌組分(結合IgA);(n)定位于心臟的蛋白質，例如HSP27;(o)定位于皮膚的蛋白質，例如角蛋白；(P)骨特異性蛋白質，例如骨形態發生蛋白(BMPs)，例如BMP-2、-4、-5、-6、-7(也稱為成骨蛋白(0P-1))和-8(0P-2);(q)腫瘤特異性蛋白質，例如人滋養層抗原，赫賽汀(herceptin)受體，雌激素受體，組織蛋白酶例如組織蛋白酶B(在肝和脾中發現)；(r)疾病特異性蛋白質，例如僅在活化的T-細胞上表達的抗原包括LAG-3(淋巴細胞活化基因)；護骨蛋白配體(OPGL)，參見Nature402,304-309,1999;0X40(TNF受體家族的成員，在活化的T細胞上表達，以及為已知在產生人T細胞白血病病毒I型(HTLV-I)的細胞中特異性地上調的唯一共刺激T細胞分子——參見J.Immunol.2000Jull;16561:263-70);金屬蛋白酶(與關節炎/癌癥相關)，包括CG6512果蠅，人截癱蛋白，人FtsH，人AFG3L2，鼠類ftsH;血管生成生長因子，包括酸性成纖維細胞生長因子(FGF-1)，堿性成纖維細胞生長因子(FGF-2)，血管內皮生長因子/血管通透性因子(VEGF/VPF),轉化生長因子-a(TGF-oc)，腫瘤壞死因子-ot(TNF-ct),血管生成素，白介素-3(IL-3)，白介素-8(IL-8)，血小板衍生內皮生長因子(PD-ECGF)，胎盤生長因子(P1GF)，中期因子(midkine)血小板衍生生長因子-BB(PDGF)，CXXXC趨化分子(fractalkine)j(s)應激蛋白質(熱休克蛋白)；(t)參與Fc轉運的蛋白質；和(u)維生素，例如B12，生物素。在另一個方面，本發明提供了藥物組合物，其包含有效量的根據本發明的抗體或其抗原結合部分，以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑或稀釋劑。"藥學上可接受的賦形劑或稀釋劑"包括生理學相容的任何和所有溶劑、分散介質、涂覆劑、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。藥學上可接受的栽體的例子包括水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其組合中的一種或多種。在許多情況下，優選地將是在組合物中包括等滲劑，例如糖，多元醇例如甘露醇、山梨糖醇，或氯化鈉。術語"有效量，，指足以治療或改善指定疾病或病癥或一種或多種其癥狀，和/或預防或減少所述疾病或病癥發生的抗體或其抗原結合部分(包括包含抗體或其抗原結合部分的藥物組合物)的量。術語"診斷有效量，，或"對于診斷來說有效的量"及其同源術語指足以診斷指定疾病或病癥和/或一種或多種其表現的抗體或其抗原結合部分(包括包含抗體或其抗原結合部分的藥物組合物)的量，其中診斷包括鑒定所述疾病或病癥的存在和/或檢測所述疾病或病癥的程度或嚴重度。通常，診斷將相對于在沒有所述疾病或病癥的個體中觀察到的基線或背景檢測水平來進行。超過背景或基線水平的檢測水平(升高的檢測水平)是存在的指示，并且在某些情況下是病狀嚴重度的指示。當相關于治療方法以及抗體或其抗原結合部分(包括包含抗體或其抗原結合部分的藥物組合物)的用途進行使用時，"有此需要的"個體可以是被診斷為患有待治療的疾病或病癥，或者先前對于待治療的疾病或病癥進行治療的個體。相關于診斷方法，"有此需要的"個體可以是懷疑患有疾病或病癥，處于疾病或病癥的風險中，或先前被診斷為具有所述疾病或病癥的個體(例如，診斷可以包括隨著時間過去和/或與治療一起地監控疾病或病癥的嚴重度(例如，進展/消退))。優選的是，抗體或其抗原結合部分阻斷或刺激受體功能或中和活性可溶性產物，例如一種或多種白介素，TNF或C5a。更優選地，活性可溶性產物是人TNF-oc。所述組合物可以是各種形式，包括液體、半固體或固體劑型，例如液體溶液(例如的可注射和可輸注的溶液)，分散液或懸浮液，片劑，丸劑，粉劑，脂質體或栓劑。優選地，所述組合物是用于免疫接種的可注射溶液的形式。施用可以是靜脈內、皮下、腹膜內、肌內、經皮、鞘內和動脈內。優選地，劑型為每天、每周、每二或三周或每月施用約0.001mg-約10mg/kg體重，更優選地每周約0.05-約5mg/kg體重。所述組合物還可以配制為用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末。在某些實施方案中，活性化合物可以用載體來制備，所述載體將保護化合物不被快速釋放，例如受控釋放制劑，包括植入物，透皮貼劑和微膠嚢化的遞送系統。可以使用相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，膠原，聚原酸酯或聚乳酸。所述組合物還可以配制用于口月艮施用。在這個實施方案中，抗體可以封裝在硬或軟殼明膠膠嚢中，壓縮成片劑，或直接摻入受試者的飲食內。所述組合物還可以配制用于直腸施用。可以施用所述抗體以便在體外和體內與所選擇的細胞結合并鑒定所選擇的細胞，在體內與所選擇的細胞結合并破壞所選擇的細胞，或者在體內滲透到所選擇的細胞內并破壞所選擇的細胞。備選地，所述抗體可以用作免疫毒素，以將細胞毒劑例如毒素或化學治療劑遞送至特定細胞類型例如腫瘤細胞。免疫毒素的產生將是本領域技術人員熟悉的。在優選實施方案中，所述組合物給人施用。本發明還提供了抗體或其抗原結合部分在診斷應用中的用途，所述診斷應用用于檢測與特定疾病或病癥有關的抗原。更具體而言，根據第三個方面，本發明提供了抗體或其抗原結合部分在用于診斷具有與特定疾病或病癥有關的抗原的受試者的方法中的用途，所述方法包括給所述受試者施用診斷有效量的如本文所述的抗體、其抗原結合部分或藥物組合物。優選地，受試者是人。抗體或其抗原結合部分(優選地經標記的)可以用于檢測生物樣品例如血清或血漿中抗原的存在，或升高的抗原(例如TNF-cx)水平，使用常規的免疫測定法，例如酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)或組織免疫組織化學。優選地，嵌合抗體或其抗原結合部分所結合的抗原在性質上是肽、蛋白質、碳水化合物、糖蛋白、脂質或糖脂，選自肺瘤相關抗原，包括癌胚抗原、EpCAM、Lewis-Y、Lewis-Y/b、PMSA、CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、CD154、EGF-R、Her-2、TRAIL和VEGF受體，涉及免疫或炎性疾病或病癥的抗原，包括CD3、CD4、CD25、CD40、CD49d、MHCI類、MHCII類、GM-CSF、千擾素-y、IL-1、IL-12、IL-13、IL-23、TNF-ot和IgE，在宿主細胞上表達的抗原，包括糖蛋白IIb/IIIa、P-糖蛋白、嘌呤能受體和粘附受體，包括CDlla、CDllb、CDllc、CD18、CD56、CD58、CD62或CD144，包含細胞因子、趨化因子、生長因子或其他可溶性生理學調節劑或其受體的抗原，包括嗜酸性粒細胞趨化因子、IL-6、IL-8、TGF-P、C3a、C5a、VEGF、NGF及其受體，涉及中樞神經系統疾病或病癥的抗原，包括p-淀粉樣蛋白和感染性蛋白質，非人源的抗原例如微生物、納米生物或病毒抗原，或者毒素，包括呼吸道合胞病毒蛋白F、炭疽毒素、響尾蛇毒和地高辛；其中所述嵌合抗體充當激動劑或拮抗劑，或者對于通過與補體或殺傷細胞(例如NK細胞)一起作用來消除(殺死或去除)不希望的細胞(例如，抗CD4)來說是有活性的，或者對于作為細胞毒劑或引起吞噬細胞對Fc受體的結合來說是有活性的，或者中和其靶的生物活性。根據本發明的抗人TNF-ot抗體或其抗原結合部分還可以在其中希望抑制TNF-oc活性的細胞培養應用中使用。本發明還提供了用于在人受試者中治療特征在于人TNF-oc活性的疾病或病癥的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用根據本發明的如本文所述的抗體、其抗原結合部分或藥物組合物，其中所述抗體或其抗原結合部分結合TNF-cx。如本文所使用的，術語"特征在于人TNF-a活性的疾病或病癥"意欲包括這樣的疾病或病癥，即其中在患有所述疾病或病癥的受試者中TNF-a的存在已顯示負責或參與或被懷疑負責或參與所述疾病或病癥的病理生理學，或者已顯示是或被懷疑是促成所述疾病或病癥惡化的因素。因此，其中TNF-ot活性有害的疾病或病癥是其中預期TNF-此類疾病或病癥可以由例如患有所述疾病或病癥的受試者中生物學液體中的TNF-oc濃度增加(例如，受試者的血清、血漿、滑膜液等中的TNF-oc濃度增加)而得到證明，這可以例如使用對于TNF-ot特異的本發明抗體來檢測。特征在于人TNF-ct活性的疾病或病癥意欲包括這樣的疾病或病癥，即其中在患有所述疾病或病癥的受試者中TNF-ot的存在已顯示負責或被懷疑負責所述疾病或病癥的病理生理學，或者已顯示是或被懷疑是促成所述疾病或病癥惡化的因素。優選地，特征在于人TNF-ot活性的疾病或病癥選自敗血癥，包括敗血癥性休克、內毒素性休克、革蘭氏陰性敗血癥和中毒性休克綜合征；自身免疫性疾病，包括類風濕性關節炎、類風濕性脊推炎、骨關節炎、牛皮癬和痛風性關節炎、過敏癥、多發性硬化癥、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎和腎病綜合征；傳染病，包括由于感染和感染后繼發的惡病質而引起的發熱和肌痛；移植物抗宿主病；腫瘤生長或轉移；肺部疾病，包括成人呼吸窘迫綜合征、休克肺、慢性肺部炎性疾病、肺結節病、肺纖維化和硅肺病；炎性腸病，包括克羅恩病和潰瘍性結腸炎；心臟病；炎性骨病，肝炎，凝血紊亂，燒傷，再灌注損傷，瘢痕瘤形成和瘢痕組織形成。還可以將補充的活性化合物摻入所述組合物中。抗體或抗原結合部分可以與一種或多種另外的治療劑共配制和/或與一種或多種另外的治療劑同時、分開或順次施用，所述另外的治療劑例如為與其他靶例如細胞因子或細胞表面分子結合的抗體，或者備選地為抑制人TNF-a產生或活性的一種或多種化學試劑。在另一個方面，本發明提供了試劑盒，其包含治療有效量的本發明的抗體或抗原結合部分，或者含有治療有效量的抗體或其抗原結合部分的藥物組合物，以及包裝和使用說明書。在某些實施方案中，使用說明書包括關于如何有效地施用治療量的本發明抗體或抗原結合部分的指導。在本說明書自始至終，單詞"包含"或者變化形式"包括"或"含有，，應當理解為暗示包括所述元素、整數或步驟，或者元素、整數或步驟的組，但不排除任何其他元素、整數或步驟，或者元素、整數或步驟的組。本說明書中提及的所有出版物引入本文作為參考。本說明書中包括的文件、行為、材料、裝置、物品等的任何討論僅用于提供本發明的背景的目的。它不應被視為承認任何或所有這些內容構成現有技術基礎的一部分或者是在與本發明相關的領域中的公知常識，當它在本申請的每項權利要求的優先權日期前存在于澳大利亞或其他地方時。為了能夠更清楚地理解本發明的本質，現在將參考下述非限制性實施例來描述其優選形式。實施例1狨可變區與人恒定區的融合材料和方法差西合4斧義發將MOG特異性狨衍生抗體的VH鏈(登記號AAM54057，SEQIDNO:l)與人恒定區(人IgGl重鏈CHl，鉸鏈，Ch2和Ch3結枸域)(例如NCBI登記號P01857)(SEQIDNO:2))—起表達。這通過將氨基酸序列回譯成DNA序列來完成，所述DNA序列通過〗吏用GeneOptimizer技術對于哺乳動物細胞表達進行優化，并通過裝配合成的寡核苷酸(GeneArt，Germany)而從新合成。在DM序列優化過程中，包括入特異性限制酶位點heI和7Y力1111以允許對Vh區迭行以后的操作。在基因合成后，將包括Kozak序列的完整序列克隆到pEE6.4GS附屬載體(LonzaBiologies)的多克隆位點內。將MOG特異性狨衍生抗體的W鏈(登記號AAM54058，SEQIDN0:3)與人k輕鏈的恒定區(例如NCBI登記號AAA58989)(SEQIDNO:4))—起表達。如上文對于重鏈所描述的，制備編碼輕鏈(Vl-k)氨基酸序列的DNA。在DM序列優化和合成過程中，包括入特異性限制酶位點&iWI/hrII以允許對Vl區迸行以后的操作。在基因合成后，將包括Kozak序列的完整序列克隆到PEE12.4GS表達載體(LonzaBiologies)的多克隆位點內。為了穩定的表達，將2個單基因栽體(pEE6.4-V「IgG！和pEE12.4-Vl-k)組合成雙基因載體。這通過使用#WI和&/bHI從pEE6.4主鏈中消化出重鏈表達盒(hCMV-MIE啟動子，Kozak序列，狨VH，人恒定區和SV40polyA位點)來完成。使用iVofI和AMII位點將所得到的片段于輕鏈表達盒(hCMV-MIE啟動子，Kozak序列，狨VL，人k恒定區和SV40polyA位點)的下游亞克隆到pEE12.4-Vl-k載體中，從而產生表達AB138的重鏈和輕鏈(SEQIDN0s:5和6)的載體。脊染對于每次轉染，將175julLipofectamine2000加入至6孑L平板的一個孔中的5mLOptimemI培養基(Invitrogen目錄號11668-027和31985-062)中。在第2個孔中，將70p1表達載體(70g)加入至5mLOptimemI培養基中。在5分鐘室溫孵育后，將所述2個孔的內容物混合在一起并進一步進行20分鐘孵育。這該第二次孵育后，將全部轉染混合物加入至包含CH0K1SV細胞的T175組織培養瓶中。將細胞孵育72-96小時并收獲上清液。使上清液在4,000xg下離心5分鐘以使細胞碎片形成粒狀沉淀，并通過0.22jam筒式過濾器進行過濾滅菌。使上清液以1mL/分鐘的流速3次流經HiTrapA蛋白柱(AmershamBiosciences,目錄號17-0402-01)。然后，用20mM磷酸鈉以lmL/分鐘洗滌柱。用0.1M檸檬酸pH3.5洗脫抗體，收集級分并立即用1MTris-HClpH9.0中和。抗體樣品隨后在PD-10柱(AmershamBiosciences,目錄號17-0851-01)上進行脫鹽。通過SDS-PAGE和大小排阻HPLC進行的抗體分析證實了正確的分子量、存在經裝配的抗體和抗體的濃度。f醋伊遊為、浙通過蛋白質印跡研究了AB138保留與M26，大鼠MOG(髓磷脂-少突膠質細胞糖蛋白)的抗原結合的能力。將130mg大鼠脊髓(IMVS，Australia)在1.8mlCelLyticMCel1LysisReagent(SIGMA,C2978)中進行勻漿，并于4C孵育30分鐘。經由通過27gl/2針幾次抽吸裂解液并隨后在4t:和13000g下離心30分鐘來進行進一步的勻漿。將粒狀沉淀和上清液稀釋到SDS-PAGE樣品緩沖液(I"mMTris-HClpH6.8，5°/。SDS,0.25%溴酚藍，25°/。甘油)中。連同這200ju1—起，將處于1X1()6存活細胞/ml的CHOKISV細胞在13000xg和4匸下旋轉1分鐘，并且重懸浮于200piCelLyticMCellLysisReagent(SIGMA)中。在4C和13000xg下離心30分鐘后，使上清液與合適量的SDS-PAGE樣品緩沖液混合。所有樣品連同分子量標記樣品一起于120V在4-20%Novex預制凝膠(Invitrogen，Australia)上電泳2小時。然后，使用蛋白質印跡裝置在具有20%甲醇的1XTris-甘氨酸緩沖液(BioRad，目錄161+-0771)中將蛋白質轉移至PVDF(BioRad，Australia),于4"C和250mA下進行2小時。然后，通過與5。/。脫脂奶粉一起在PBS中于室溫孵育1小時來封閉該膜。然后，用1XPBS將該膜洗滌3次，隨后于4匸與10ug/mL在PBS中的AB138一起孵育過夜。洗滌后，將該膜與在1XPBS中1:5000稀釋的山羊抗人IgG(H+L)HRP綴合物(Sigma,Australia)—起于室溫孵育1小時。洗涂后，使用ECLWesternBlottingAnalysisSystem(AmershamBiosciences目錄RPN2109)來檢測結合的抗體。進行平行實驗，其中AB138被同種型匹配的無關特異性陰性對照抗體(抗TNFoc單克隆抗體)替換，以便鑒定任何非特異性的結合事件。結果在成功的蛋白質表達和純化后，對AB138進行蛋白質印跡分析以確定它是否保留了對于大鼠MOG的結合親和力。AB138結合大鼠脊髄澄清裂解液中存在的大小約25kDa的蛋白質，這是CH0K1SV澄清裂解液中不存在的蛋白質(圖1)。陰性對照抗體不與在任一裂解液中存在的蛋白質結合，這表明AB138和大小25kDa的蛋白質之間的相互作用不是由于與人恒定區相關的人造或非特異性結合事件而引起的(圖2)。這種蛋白質與大鼠MOG減去信號序列的預期大小(24.9kDa)相匹配。這個結果表明AB138保留了對于在大鼠脊髄裂解液中存在的大鼠M0G的親和力，并且證實狨人融合抗體可以保留抗原結合能力。本領域技術人員會意識到，大鼠MOG可以使用重組DNA技術來產生，并且AB138結合大鼠M0G的能力可以在結合測定法例如ELISA或Biacore分析中進行觀'J定。實施例2單克隆抗體的改造1.術語"供體序列"被定義為衍生自除新世界靈長類外的物種的任何免疫球蛋白序列。"接納體序列"被定義為衍生自新世界靈長類的免疫球蛋白序列。"共同殘基"是當通過與對于物種來說可獲得的免疫球蛋白序列進行比較來測定時，在給定氨基酸位置處是共同的(例如〉30。yO殘基。"非共同殘基"是當通過與對于物種來說可獲得的免疫球蛋白序列進行比較來測定時，在給定氨基酸位置處不是共同的(例如<30%)殘基。"改造"是這樣的過程，即將供體序列的結構結合特征轉移到接納體序列中，從而使得所述結構結合特征維持其結合活性。"構架氨基酸"被定義為位于抗體可變區中但不位于CDR中的氨基酸。2.縮寫CDR，互補決定區；M0G，髓磷脂/少突膠質細胞糖蛋白；TNF-ot;腫瘤壞死因子-ot;VH，可變重鏈；V"可變輕鏈；BSA，牛血清白蛋白。3.改造過程A.產生單克隆抗體(除新世界靈長類單克隆抗體外)。B.基于高氨基酸序列同源性和預測的低免疫原性，選擇衍生自新世界靈長類的接納體免疫球蛋白序列。C.根據Kabat的編號系統(參見"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest"E.Kabat等人,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,1983)來鑒定供體和接納體免疫球蛋白序列的CDRs。D.通過比對供體和接納體序列來確定構架序列中的差異。E.通過三維建模來預測供體的免疫球蛋白結構，并測定相對于CDRs的構架序列差異的接近性。根據置換標準1和2(下文)用供體殘基任選置換接納體殘基。F.用整個供體CDR序列置換整個接納體CDR序列。G.通過使供體/接納體構架氨基酸序列與種系和可獲得的接納體免疫球蛋白構架序列相比較來測定共同殘基。根據置換標準3和4(下文)用供體殘基任選置換接納體殘基。H.產生具有接納體可變區和人恒定區的嵌合抗體。I.表達經改造的免疫球蛋白。J.對經改造的免疫球蛋白進行測定法分析。置換標準在基于構架序列中的差異來產生改造的抗體中，用相應的供體氨基酸置換接納體氨基酸可以在落入下述標準中的位置處進行(i)如果基于三維建模，供體殘基被預測能夠與抗原相互作用；(ii)如果基于三維建模，供體殘基被確定位于供體CDRs的3.2A內；(iii)如果供體殘基在接納體物種免疫球蛋白序列中是共同的；(iv)如果供體殘基在供體種系中是非共同的。通過基于與等價人序列的氨基酸序列同源性和預測的低免疫原性來選擇合適的接納體序列，經改造的抗體被預測在人中是非免疫原性的或具有低免疫原性。經改造的抗體將與供體免疫球蛋白的抗原結合，其結合親和力類似于供體免疫球蛋白。經改造的抗體的結合親和力可以通過親和力成熟方法而進一步得到增強(R.A.Irving等人，JournalofImmunologicalMethods,248，31-45(2001))。改造鼠類抗體AB164以產生抗體AB1974.供體免疫球蛋白序列使用雜交瘤技術產生分泌針對人TNF-cx的單克隆抗體AB164的鼠類雜交瘤，并且充當供體免疫球蛋白序列(SEQIDNO:7和8)。5.接納體免疫球蛋白序列的選擇針對大鼠M0G(髓磷脂/少突膠質細胞糖蛋白)的單克隆抗體的序列得自PubMed(http:〃謂.ncbi.nlm.nih.gov/)，并且用作接納體序列。這種單克隆抗體衍生自普通狨(白耳狨)，其為新世界靈長類。使用所有等位基因的10/。閾值分析，通過MHCII類結合預測程序Propred(http://www,imtech.res,in/raghava/propred)，就其經預測的在人中的免疫原性來檢查VH鏈(登記號AAM54057，SEQIDN0:l)和W鏈(登記號AAM54058，SEQIDNo:3)的構架區。排除MOG特異性抗體的l鏈(登記號AAM54057,SEQIDNO:1)和l鏈(登記號AAM54058,SEQIDNo:3)的CDRs的序列的BLAST分析，鑒定出了最接近的人同系物重鏈序列(登記號AAH19337.1;SEQIDNO:9)和輕鏈序列(登記號BAC53922.1;SEQIDNO:10)。值得注意的是，這種預測分析表明，所選擇的接納體重鏈可變構架區可能比其人等價物的免疫原性更少。接納體重鏈可變區在構架中具有一種肽LRPEDTAVY，這被預測結合由等位基因DRB1—0101,DRB1—0102,DRB1-0309編碼的MHCII類。然而，最接近的人同系物重鏈在構架中具有3種肽，所述肽被預測與MHCII類結合。這包括肽WVRQAPGQGL,它被預測結合由等位基因DRB1—0101,DRB1—0102和DRB1_0309編碼的MHCII類；肽VYMELTS,它被預測結合由等位基因DRB1一0401，DRB1一0408,DRB1一0421，DRB1-0426,DRBl一llOl，DRB1_1128，DRB1-1305編碼的MHCII類；和肽LRSEDTAVY，它被預測結合由等位基因DRB1一0401，DRB1一0421，DRB1-0426編碼的MHCII類。MOG特異性輕鏈可變構架區和最接近的人同系物被預測是非免疫原性的。6.供體/接納體可變區中的CDRs的鑒定^f吏用Kabat的規貝'J(參見"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest"E.Kabat等人，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,1983)，測定AB164的Vh和Vl鍵(分別為SEQIDNOs:7和8)以及狨MOG特異性免疫球蛋白的Vh和、鏈(分別為SEQIDNOs:1和3)的CDRs(表1)。表l:AB164的Vh和W鏈(SEQIDNO:7和8)以及MOG-特異性免疫球蛋白的VH和Vt鏈(SEQIDNO:l和3)的CDRs的氨基酸位置<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>7.供體和接納體序列的比對VH鏈比對使AB164和MOG特異性免疫球蛋白的VH鏈的氨基酸序列(SEQIDNO:7和1)進行比對(圖3)。殘基數目的不同在于位于MOG特異性免疫球蛋白L鏈的CDR3中的額外氨基酸。這兩條序列之間的序列同一性為63.6%。如所預期的，CDRs的氨基酸序列不同而產生供體和接納體抗體的不同抗原特異性。在構架區中所述序列之間存在22個氨基酸的差異。W鏈比對使AB164和MOG特異性免疫球蛋白的l鏈的氨基酸(SEQIDNO:8和3)進行比對(圖4)。殘基數目的不同在于位于AB164的CDR1中的4個另外氨基酸。這兩條序列之間的序列同一性為62.3%。如所預期的，CDRs的氨基酸序列不同而產生供體和接納體抗體的不同抗原特異性。在構架區中所述序列之間存在23個氨基酸差異。8.AB164的Vh和VL鏈的預測三維建模使用SWISS-PROT三維預測建模軟件和DeepView(http:〃swissmode1.expasy.org/),測定AB164的Vh和Vt鏈的三維模型。鑒定出CDRs。如通過先前描述的比對所測定的，鑒定構架區中于供體和接納體序列之間的氨基酸差異，并且關于其對CDRs的接近性進行預測(表3和4)9.用供體CDRs置換接納體CDRsM0G特異性免疫球蛋白的Vh和W鏈的CDRs用AB164的Vh和^鏈的CDRs替換(表2)。表2:用供體序列(AB164)的CDRs替換<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>10.測定鼠類種系和狨Ig序列中的共同殘基并選擇改造的構架序列VH鏈VH區的鼠類種系比對可以在http:〃蘭.ibt.unam.mx/vir/vh-mice一directory.html#GL處找到。通過搜索來自普通狨的所有VH氨基酸序列并比對這些序列，從http:〃麗，ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgidb-Protein&itool=toolbar可以獲得狨VH序列。使用比對工具，于在供體和接納體序列之間在構架序列中的氨基酸存在差異的每個氨基酸位置處測定鼠類種系和可獲得的普通狨序列中的共同殘基(表3)。表3:供體/接納體序列中的VH構架差異，它們與CDRs的接近性以及在供體/接納體物種中它們的相關的共同殘基。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>進行在分別的鼠類種系和可獲得的狨Vh序列中每個位置處的共同殘基的測定。在滿足特定標準的所選擇的位置處，接納體氨基酸用供體氨基酸替換，并且那種標準的編號在下面給出1.如果基于三維建模，供體殘基被預測能夠與抗原相互作用；2.如果基于三維建模，供體殘基被確定位于供體CDRs的3.2A內；3.如果供體殘基在接納體物種免疫球蛋白序列中是共同殘基；4.如果供體殘基在供體種系中是非共同的。在不滿足所述標準的位置處，使用接納體序列并且將標準列為無。注非共同殘基為灰色陰影，并且置換為斜體。*鼠類種系在第113位處不包含序列數據，并且照此在此使用狨序列。總之，存在8個構架氨基酸置換，其中接納體序列用供體序列替換。存在4個氨基酸，其中接納體序列用供體序列替換，因為基于三維建模，供體殘基被測定為位于供體CDRs的3.2A內。制備2個氨基酸置換，因為供體殘基被預測能夠與位于環的轉彎處的抗原相互作用，所述環與CDR-2緊密接近(盡管不小于3.2A)。此外，制備2個氨基酸置換，因為供體殘基被發現在可獲得的接納體物種免疫球蛋白序列中是共同的。還可以在第97位處進行進一步的改變。、鏈VL區的鼠類種系比對可以在http:〃www.ibt.u畫.mx/vir/vk—mice-directory.html#GLvk處找到。通過搜索來自普通狨的所有氨基酸序列并比對這些序列，從http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgidb=Protein&itool=toolbar可以獲得狨VL序列。使用比對工具，于與在供體和接納體序列之間在構架序列中的氨基酸差異相關的每個氨基酸位置處測定鼠類種系和可獲得的狨免疫球蛋白序列中的共同殘基(表4)。表4:供體/接納體序列中的、構架差異，它們與CDRs的接近性以及在供體/接納體物種中它們的相關的共同殘基。<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>進行在分別的鼠類種系序列和可獲得的狨VL序列中每個位置處的共同殘基的測定。在每個位置處應用上文給出的關于選擇構架序列中的差異的標準。在滿足特定標準的所選擇的位置處，接納體氨基酸用供體氨基酸替換，并且那種標準的編號在下面給出1.如果基于三維建模，供體殘基被預測能夠與抗原相互作用；2.如果基于三維建模，供體殘基被確定位于供體CDRs的3.2A內；3.如果供體殘基在接納體物種免疫球蛋白序列中是共同殘基；4.如果供體殘基在供體種系中是非共同的。在不滿足所述標準的位置處，使用接納體序列并且將標準列為無。注非共同殘基為灰色陰影，并且置換為斜體。*鼠類種系在第104位處及以后不包含序列數據，并且照此在此使用狨序列。總之，存在l個構架氨基酸置換，其中接納體序列用供體序列替換，因為基于三維建模，供體殘基被測定為位于供體CDRs的3.2A內。材料和方法采用標準方法通過使來自用人TNF-oc免疫的小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞系SP2/0-Ag14融合來產生AB164雜交瘤(FazekasdeSt.Groth，S.等人，JournalofImmunologicalMethods35:1-21(1980);Sugasawara，R.,JournalofTissueCultureMethods12:93-95(1989))。11.單克隆抗體AB164的測序使用RNeasyMini或Midi柱(QIAgen)并才艮據制造商的說明書從1x107-1x108存活細胞中提取總RNA(tRNA)。定量后，將tRNA用作模板以用于第一鏈cDNA合成，其中使用oligo(dT)引物和SuperscriptII逆轉錄酶(Invitrogen)并根據制造商的說明書。最終，使用RM酶H來降解tRNA,并且通過使用末端轉移酶和dGTP(Roche)用poly-G尾來給剩余的單鏈cDNA加上標簽。使用Herculase(Stratagene)(高保真度聚合酶的混合物)來進行PCR反應。在每種情況下，oligo(dC)用作正向引物，使用IgG重鏈特異性或K輕鏈特異性反向引物。30個循環后，將PCR反應體系在Taq聚合酶存在下進行孵育以添加突出A堿基。然后，將所得到的PCR產物克隆到pGemT-Easy(Promega)中，并且轉化到感受態Top10大腸桿菌細胞(Invitrogen)中。使用QIAquickMiniprep柱(QIAgen)從單個菌落的過夜培養物中提取質粒并進行定量。將100—500ng—式兩份地與6.4pmolpUC3正向或pUC3反向引物混合，并且提交用于使用BigDyev3，1化學(AppliedBiosystems)的循環測序。在ABIPRISM3700DNA分析儀上解析電泳圖，并且進行隨后的衍生序列的比對，異常堿基調入(calling)的人工校正。一旦獲得4個匹配序列(2個正向和2個反向)，就確認了抗體可變區的序列。然后，將這些序列翻譯成AB164的重和輕鏈的氨基酸序列(SEQIDNO:7和8)。12.AB138(MOG特異性狨衍生可變區-人恒定區嵌合體)和AB103(抗TNFcc鼠類可變區-人恒定區嵌合體)的形成使接納體序列的Vh區(登記號AAM54057,SEQIDNo:1)與人恒定區(人IgGl重鏈CHl、鉸鏈、ch2和ch3結構域)(例如NCBI登記號P01857)(SEQIDNo:2)—起表達。使接納體序列的Vl區(登記號AAM54058，SEQIDNo:3)與人k輕鏈恒定結構域(例如NCBI登記號AAA58989)(SEQIDNo:4)—起表達。所得到的嵌合抗體被命名為AB138(SEQIDNO:5和6)。將這種抗體用作模板，在其中制造Vh和VL鏈的改變。使來自完整鼠類AB164的Vh和VL區(SEQIDNo:7和8)與如上所述的相同人恒定區一起表達。這種嵌合抗體被命名為AB103。AB103的克隆將來自完整鼠類AB164的Vh和Vl區(SEQIDNo:7和8)回譯成DNA序列，所述DNA序列通過4吏用GeneOptimizer才支術對于哺乳動物細胞表達進行優化，并通過裝配合成的寡核苷酸(GeneArt，Germany)而從新合成。對于Vh基因，在5，末端，每個序列的側翼為^cl位點、Kozak序列(GCCACC)和人IgGy前導序列(氨基酸序列MEWSWVFLFFLSVTTGVHS)。在3，末端，對DNA序列進行操作以引入TY力1111限制酶位點而不損害所需氨基酸序列。對于VL基因，在5，末端，每個序列的側翼為萬s/WI位點、Kozak序列(GCCACC)和人k前導序列(氨基酸序列MSVPTQVLGLLLLWLTDARC)。在3，末端，對DNA序列進行操作以引入hrll限制酶位點而不損害所需氨基酸序列。在從新基因合成后，將可變區克隆到pCRScript載體(Stratagene)內，并且對于Vh和VL序列分別通過J"I/7YA1111和WI/"rII消化而釋放出來。將釋放出的序列連接到衍生自被形成用于表達經由1/7Y力111I(對于pEE6.4-VIgG!)和^/Wl/^rll(對于pEE12.4-V「k)消化而制備的AB138的載體的單基因載體主鏈中。使用來自Promega的LigaFastRapidDNALigationSystem(目錄號M8221)將每個基因連接到所制備的主鏈內。然后，將連接物轉化到OneShotTop10(化學感受態細胞(Invtrogen目錄號C4040-03))中，并且通過標準技術鑒定陽性菌落。用于穩定表達的雙基因載體如上所述(實施例1)進行制備。使用QIAfilter中等制備(midiprep)柱(QIAgen目錄號l"43)通過過夜培養物的中等制備來制備大量所產生的載體。通過在含有1/10體積的3M乙酸鈉(pH5，2)的100%乙醇(Sigma目錄號分別為S2889和E7023-500ML)中沉淀20iag來制備載體以用于轉染。在70%乙醇中洗滌后，以0.5ILXg/pl的工作濃度將載體重懸浮于40plT.E.pH8.0(Sigma目錄號T9285-10亂)中。13.經改造的單克隆抗體AB197的制備使用MOG特異性免疫球蛋白作為接納體序列以及通過將構架中的CDRs和指定殘基替換為供體序列(AB164)的那些，確定了經改造的VH和Vl抗體序列。使這些可變區蛋白質序列與人恒定區一起表達(SEQIDNO:2和4)。所得到的經改造的抗體被命名為AB197(SEQIDNO:11和12)。表5描述了關于每種抗體的CDRs、VH/VL構架和恒定區的物種來源。表5:關于AB138、AB164、AB197、AB103的CDRs、VH/^構架和恒定區的物種來源<table>tableseeoriginaldocumentpage45</table通過將接納體序列的構架中的CDRs和指定殘基替換為供體序列的那些，確定了經改造的Vh和W抗體序列(SEQIDNo:11和12)。將抗體序列回譯成DNA序列，并通過裝配合成的寡核苷酸(GeneArt,Germany)而從新合成。在合成過程中，如前所述(實施例1)，將相關的限制酶位點摻入該序列中以允許克隆和產生表達AB197的雙基因栽體。14.AB103、AB197和AB164的表達AB103和AB197的轉染對于每次轉染，將175jilLipofectamine2000加入至6孔平板的一個孑L中的5mLOptimemI培養基(Invitrogen目錄號11668-027和31985-062)中。在第2個孔中，將70m1表達栽體(70pg)加入至5mLOptimemI培養基中。在5分鐘室溫孵育后，將所述2個孔的內容物混合在一起并進一步進行20分鐘孵育。這該第二次孵育后，將全部轉染混合物加入至包含CH0K1SV細胞的T175組織培養瓶中。將細胞孵育72-96小時并收獲上清液。使上清液在4,000xg下離心5分鐘以使細胞碎片形成粒狀沉淀，并通過0.22jum筒式過濾器進行過濾滅菌。鼠類單克隆抗體AB164的產生使用標準組織培養方法培養來表達AB164的雜交瘤細胞，并且收獲上清液并在4，000xg下離心5分鐘，以使細胞碎片形成粒狀沉淀，隨后通過O.22jum筒式過濾器進行過濾滅菌。AB103、AB197和AB164的抗體純化使上清液以1mL/分鐘的流速3次流經HiTrapA蛋白柱(AmershamBiosciences,目錄號17-0402-01)。然后，用20mM磷酸鈉以1mL/分鐘將柱洗滌40分鐘。用0.1M檸檬酸pH3.5洗脫抗體，收集級分并立即用1MTris-HClpH9.0中和。抗體樣品隨后在PD-10柱(AmershamBiosciences,目錄號17-0851-01)上進行脫鹽。通過SDS-PAGE和大小排阻HPLC對抗體進行的分析證實了正確的分子量、經裝配的抗體的存在和抗體的濃度。15.親和力結合測定法方法ELISA方法在碳酸鹽包被緩沖液(10mM磷酸二鈉，MmM磷酸氫二鈉pH9.6)中將TNF-oc(Peprotech目錄號:300-01A)稀釋至1ng/mL。將100juL這種溶液加入至96孔平板的每個孔中并在增濕的容器中于4匸孵育過夜。平板隨后用洗滌緩沖液(0.01MPBSpH7.2，0.05°/。Tween-20)洗滌3次，然后用0.01MPBSpH7.2洗滌3次。通過向每個孔中加入200jiL封閉緩沖液(在0.01MPBSpH7.2中的1%w/vBSA)并使平板在增濕的容器中于25t!孵育1小時來封閉孔。將抗體在抗體稀釋劑(1%w/vBSA，0.05%Tween-20，在0.01MPBSpH7.2中)中充分稀釋以產生覆蓋6.00ng/mL至0.0578ng/mL的滴定曲線。使孔與抗體一起于251C孵育1小時。然后如前所述洗滌平板。使用在抗體稀釋劑中1:2000的100nL抗IgGH+L抗體HRP綴合物(Zymed，目錄號81-71200)來檢測結合的AB197和AB103。使用在抗體稀釋劑中l:2000的100jLiL抗鼠類免疫球蛋白抗體HRP綴合物(Dako，目錄號P0260)來檢測結合的AB164。只含抗體稀釋劑的孔用于測量本底吸光度。于25"C在增濕的容器中孵育1小時后，再次如前所述洗滌平板。向每個孔中加入100nLTMB底物溶液(Zymed，目錄號00-2023)并允許顯色4分鐘。加入100nL1MHC1以終止顯色反應并在450nm處測定吸光度(參照620nm)。ELISA結果使用ELISA來比較AB164、AB197和AB103與包被在固相中的TNF-oc的結合。根據這些結果，所有抗體顯示對于TNF-oc的強烈結合，其中所有EC50值小于或等于0.68|ig/ml(圖5，表6)。如通過使抗體AB164和AB103的結合特性圖鐠相比較而可見的，用人Igd恒定區(AB103)替換鼠類恒定區(AB164)不會顯著降低結合親和力。如通過使抗體AB164和AB197的結合特性圖譜相比較而可見的，改造AB164以產生AB197不會導致TNF-ot結合的任何顯著喪失。(圖5)表6<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>使用活細胞的TNF-cc細胞毒性中和測定法(L-929中和測定法)方法在RPMI1640(Invitrogen目錄號:21870-076)中培養L929細胞(ATCCNo:CCL-1)直至細胞達到70%水平的匯合，所述RPMI1640包含10%胎牛血清、50ng/mL青霉素/鏈霉素(Sigma目錄號P0781)、2mML-谷氨酰胺(Invitrogen目錄號25030-081)和10pM2-巰基乙醇(Invitrogen目錄號21985-023)。向96孔培養平板的每個孔內加入50jiL培養基。為了研究TNF-oc對L929細胞的細胞毒性，一式三份地向平板的第1列中加入50juLTNF-oc工作溶液/孔(30ng/mL)，經過平板進行系列半對數稀釋，達到9fg/mL的終濃度。還制備含50)LiL無TNF-cc的培養基的對照孔(V=100%)。以5X1(T細胞/mL向所有孔中加入50pLL929細胞。還制備包含100jiL無另外的細胞或TNF-ot的培養基的其他對照孔(本底)。向所有孔中以40pg/mL加入放線菌素D(Sigma目錄號A1410)。為了研究經改造的抗體針對TNF-a的中和作用，執行中和測定法。一式三份地向分開的平板的第1列中加入23nL10jug/mL的抗體，并且經過平板進行系列對數稀釋，達到30.4pg/mL的終濃度。以5X1(T5細胞/mL向這些孔中加入50mLL929細胞。向所有孔中加入另外的25pL放線菌素D。所有平板于37t!與5%c02—起孵育20小時。孵育后，向所有孔中力口入25uLMTS/PESCellTiter96AQue0USOneSolutionReagent(Promega目錄號G358B)，并且于37n孵育2小時。使用ELISA平板閱讀器在492nm處讀取吸光度(參照630nm)。從無細胞和無TNF的對照孔(本底)的平均吸光度中減去所有重復的處理的平均吸光度。由此，L-929細胞的生存力％計算為A492實驗孔%生存力=A492V-10o%存活的xl(H)使用活細胞的TNF-oc細胞毒性中和測定法(L-929中和測定法)結果AB164、AB197和AB103能夠中和TNF-ot誘導的細胞毒性(圖6，表7)。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>本領域技術人員將會意識到，可以對如具體實施方案中所示的本發明進行眾多改變和/或修飾，而不背離如廣泛描述的本發明的精神或范圍。因此，這些實施方案在所有方面被視為舉例說明性的而非限制性的。權利要求1.抗體或其抗原結合部分，其具有可變區，所述可變區包含至少2個互補決定區(CDRs)和至少3個構架區，其中所述構架區是新世界靈長類構架區或衍生自新世界靈長類構架區，并且其中至少一個所述CDRs是非新世界靈長類CDR。2.根據權利要求1的抗體或其抗原結合部分，其中所述可變區包含3個CDRs和4個構架區。3.根據權利要求1或權利要求2的抗體或其抗原結合部分，其中所述可變區包含至少一個鼠類CDR序列。4.根據權利要求1-3中任一項的抗體或其抗原結合部分，其中所述可變區包含至少一個小鼠CDR序列。5.根據權利要求1-4中任一項的抗體或其抗原結合部分，其中所述可變區包含至少一個大鼠CDR序歹'J。6.根據權利要求1-5中任一項的抗體或其抗原結合部分，其中所述可變區包含至少一個人CDR序列。7.根據權利要求1-6中任一項的抗體或其抗原結合部分，其中所述可變區包含至少一個合成的CDR序列。8.根據權利要求1-7中任一項的抗體或其抗原結合部分，其中所述可變區包含至少一個兔CDR序列。9.根據權利要求1-8中任一項的抗體或其抗原結合部分，其中所述可變區包含來自不同來源的CDRs的組合。10.根據權利要求1-3中任一項的抗體或其抗原結合部分，其中所述可變區包含3個鼠類CDR序列。11.根據權利要求10的抗體或其抗原結合部分，其中所述3個鼠類CDR序列是小鼠CDR序列。12.根據權利要求1-3中任一項的抗體或其抗原結合部分，其中所述可變區包含3個人CDR序列。13.根據權利要求1-12中任一項的抗體或其抗原結合部分，其中所述可變區包含4個新世界靈長類構架序列。14.根據權利要求1-12中任一項的抗體或其抗原結合部分，其中所述可變區包含4個構架區，其中所述構架區衍生自新世界靈長類構架區。15.根據權利要求1-14中任一項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗原結合部分是結構域抗體。16.根據權利要求1-15中任一項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或抗原結合部分進一步包含人或非人舊世界靈長類恒定區序列。17.根據權利要求1-16中任一項的抗體或其抗原結合部分，其中所述新世界靈長類構架區來自新世界靈長類，所述新世界靈長類選自狨、糈、松鼠猴、青猴、蜘蛛猴、絨毛猴、懸猴、禿猴、狐尾猴、夜或梟猴和吼猴。18.根據權利要求17的抗體或其抗原結合部分，其中所述新世界靈長類是狨。19.根據權利要求1-18中任一項的抗體或抗原結合部分，其中所述抗體或抗原結合部分與抗原結合，所述抗原在性質上是肽、蛋白質、碳水化合物、糖蛋白、脂質或糖脂，選自腫瘤相關抗原，包括癌胚抗原、EpCAM、Lewis-Y、Lewis-Y/b、PMSA、CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、CD154、EGF-R、Her-2、TRAIL和VEGF受體，涉及免疫或炎性疾病或病癥的抗原，包括CD3、CD4、CD25、CD40、CD49d、MHCI類、MHCII類、GM-CSF、千擾素-Y、IL-1、IL-12、IL-13、IL-23、TNF-oc和IgE,在宿主細胞上表達的抗原，包括糖蛋白IIb/IIIa、P-糖蛋白、嘌呤能受體和粘附受體，包括CDlla、CDllb、CDllc、CD18、CD56、CD58、CD62或CD144，包含細胞因子、趨化因子、生長因子或其他可溶性生理學調節劑或其受體的抗原，包括嗜酸性粒細胞趨化因子、IL-6、IL-8、TGF-P、C3a、C5a、VEGF、NGF及其受體，涉及中樞神經系統疾病或病癥的抗原，包括p-淀粉樣蛋白和感染性蛋白質，非人源的抗原例如微生物、納米生物或病毒抗原，或者毒素，包括呼吸道合胞病毒蛋白F、炭疽毒素、響尾蛇毒和地高辛；其中所述嵌合抗體充當激動劑或拮抗劑，或者對于通過與補體或殺傷細胞(例如NK細胞)一起作用來消除(殺死或去除)不希望的細胞(例如，抗CD4)來說是有活性的，或者對于作為細胞毒劑或引起吞噬細胞對Fc受體的結合來說是有活性的，或者中和其靶的生物活性。20.根據權利要求19的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗原是人TNFot。21.根據權利要求1-20中任一項的抗體或其抗原結合部分，其中至少一個構架區的序列被修飾以增加結合。22.根據權利要求1-20中任一項的抗體或其抗原結合部分，其中至少一個構架區的序列被修飾以減少預測的在人中的免疫原性。23.試劑盒，其包含根據權利要求1-22中任一項的抗體或其抗原結合部分，或其藥物組合物，包裝，和使用說明書。24.經設計的新世界靈長類抗體或其抗原結合部分，其結合細胞表面抗原或細胞因子，其中所述抗體或其抗原結合部分包含可變區，所述可變區包含至少2個互補決定區(CDRs)和至少3個構架區，其中對所述CDRs進行選擇，從而使得所述抗體或抗原結合部分與所述細胞表面抗原或所述細胞因子結合。25.權利要求24中所要求保護的經設計的新世界靈長類抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分與選自下述的細胞表面抗原結合CD3、CD20、CD33、EGF-R、Her-2和CD25。26.權利要求24中所要求保護的經設計的新世界靈長類抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分與TNFot或VEGF結合。27.根據權利要求24-26中任一項的經設計的新世界靈長類抗體或其抗原結合部分，其中所述抗原結合部分是結構域抗體。28.根據權利要求24-27中任一項的經設計的新世界靈長類抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或抗原結合部分進一步包含人或非人舊世界靈長類恒定區序列。29.根據權利要求24-28中任一項的經設計的新世界靈長類抗體或其抗原結合部分，其中所述新世界靈長類選自狨、糈、松鼠猴、青猴、蜘蛛猴、絨毛猴、懸猴、殼猴、狐尾猴、夜或梟猴和吼猴。30.根據權利要求29的經設計的新世界靈長類抗體或其抗原結合部分，其中所述新世界靈長類是狨。31.根據權利要求24-30中任一項的經設計的新世界靈長類抗體或其抗原結合部分，其中至少一個構架區的序列被修飾以增加結合。32.根據權利要求24-31中任一項的經設計的新世界靈長類抗體或其抗原結合部分，其中至少一個構架區的序列被修飾以減少預測的在人中的免疫原性。33.試劑盒，其包含根據權利要求24-32中任一項的經設計的新世界靈長類抗體或其抗原結合部分，或其藥物組合物，包裝，和使用說明書。全文摘要本發明提供了抗體或其抗原結合部分，其具有可變區，所述可變區包含至少2個互補決定區(CDRs)和至少3個構架區。所述構架區是新世界靈長類構架區或衍生自新世界靈長類構架區，并且至少一個所述CDRs是非新世界靈長類CDR。文檔編號C07K16/18GK101287762SQ200680038157公開日2008年10月15日申請日期2006年8月15日優先權日2005年8月15日發明者A·G·多伊爾,A·W·克拉克,P·A·詹寧斯,R·D·蓋伊申請人:阿拉納治療有限公司