抗25-羥基維生素d的抗體的制作方法

專利名稱：抗25-羥基維生素d的抗體的制作方法
抗25-羥基維生素D的抗體5背景技術(shù)本發(fā)明涉及生產(chǎn)抗25-羥基維生素D的抗體的方法，根據(jù)本發(fā)明 的方法生產(chǎn)出的抗體以及用其4全測(cè)2-羥基維生素D的方法。術(shù)語"維生素"中暗示了充足的維生素D供給是生命攸關(guān)的。維生 素D的匱乏會(huì)導(dǎo)致例如佝僂病或骨質(zhì)疏;^癥等嚴(yán)重疾病。雖然在上 io 個(gè)世紀(jì)初，維生素D仍然被看作是一個(gè)單獨(dú)的物質(zhì)，在過去30年中， 維生素D體系已經(jīng)發(fā)展為一個(gè)復(fù)雜和多樣的維生素D代謝物系統(tǒng)。 現(xiàn)在已知的維生素D代謝產(chǎn)物已經(jīng)超過40種(Zercrkh,J.E.， Ann. Clin. Biochem. 41 (2004) 272-281 )。人體只能通過太陽光照射在皮膚上時(shí)，由紫外線作用產(chǎn)生維生素15 D3或鈣化醇。在皮膚中產(chǎn)生的維生素D3與所謂維生素D結(jié)合蛋白相結(jié)合并被運(yùn)送到肝臟，在那里通過25-羥基化作用轉(zhuǎn)化為25-羥基維 生素D3。除了以上被提及的皮膚和肝臟兩個(gè)器官外，現(xiàn)今大量的其 他組織也被證實(shí)參與了維生素D的代謝(查閱Schmidt-Gayk，H.等， (eds. )， "Calcium regulating hormones, vitamin D metabolites and cyclic20 AMP(可調(diào)節(jié)激素、維生素D代謝物和環(huán)腺普酸的4丐)"，Springer Verlag, Heidelberg (1990), pp. 24-27 )。在總量上來說，25-羥基維生素 D,確切地說是25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3是人體內(nèi)儲(chǔ)存 維生素D的主要形式。當(dāng)需要時(shí)，這些前體可在腎臟中被轉(zhuǎn)化為生 物體內(nèi)活性的la,25-二羥基維生素D,即所謂的激素D。 生物體內(nèi)25 活性的維生素D不僅調(diào)節(jié)鈣攝取，其中有自腸和骨礦化作用中的4丐 攝取，它還影響著其他大量的代謝途徑，如胰島素系統(tǒng)。測(cè)量維生素水平本身對(duì)于測(cè)定病人的維生素D狀況并沒有什么 幫助，因?yàn)榫S生素D (維生素D2和維生素D3)的濃度會(huì)沖艮據(jù)食物的吸收大幅波動(dòng)。另外循環(huán)中的(24小時(shí))維生素D的生物半衰期相 對(duì)較短，這也是它不能作為測(cè)定病人維生素D狀況合適參數(shù)的另一 原因。這同樣也適用于生理學(xué)活性形式的維生素D(l,25-二羥基維生 素D)上。相比于25-羥基維生素D，這些生物活性形式的濃度也相對(duì) 5 較小及波動(dòng)極大。綜上所述，對(duì)于綜合分析病人總的維生素D狀況， 量化25-羥基維生素D是一種適當(dāng)?shù)氖侄巍Ｓ捎?5-羥基維生素D高度的臨床價(jià)值，文獻(xiàn)中提及了大量的多 少有些可靠性的測(cè)定25-羥基維生素D的方法。例如在Haddad, J. G.等，J. Clin. Endocrinol. Metab. 33 (1971) 10992-995和Eisman， J, A.等，Anal. Biochem. 80 (1977) 298-305中描 述了利用高效液相色譜法(HPLC )來測(cè)定血液樣品中25-羥基維生素 D的濃度。測(cè)定25-輕基維生素D的其他途徑之一利用例如存在于牛奶中的 維生素D結(jié)合蛋白。Holick, M. F.和Ray, R. (US 5,981,779)和15DeLuca等.(EP 0 583 945)中描述了 一種維生素D檢測(cè)法，該方法基 于利用維生素D結(jié)合蛋白與羥基維生素D和二羥基維生素D結(jié)合， 并通過一種竟?fàn)幮詼y(cè)試程序來測(cè)定他們的濃度。然而，這種方法的首 要條件是被測(cè)定的維生素D代謝物必須是從原血液或血清樣品中有 機(jī)萃取分離出的形式，以及必須經(jīng)過如層析柱等的純化。20 Armbruster, F. P.等(WO 99/67211)中講授了需要通過乙醇沉淀法制備血清或血漿的樣品來進(jìn)行維生素D測(cè)定。在這個(gè)方法中，蛋 白質(zhì)沉淀物通過離心被移除，剩下包含可溶性維生素D代謝物的乙 醇上清液。這些可以通過竟?fàn)幮越Y(jié)合分析法測(cè)定。另夕卜，EP 0 753 743講授了利用高碘酸鹽將蛋白質(zhì)從血液或血清25 樣品中分離出來。在這個(gè)案例中，用高碘酸鹽處理樣品，測(cè)定樣品的 無蛋白上清液中維生素D化合物。在某些商業(yè)檢測(cè)中，推薦了利用 乙腈作為從血清或血漿樣品中萃取的介質(zhì)(例如，DioSorin的放射免 疫測(cè)定或者"Immundiagnostik，，公司的維生素D斥全測(cè))。近年來計(jì)劃發(fā)布大量不同的釋放試劑，原則上均適合用來從樣品 中的結(jié)合蛋白上釋放維生素D化合物。然而，這種釋放或分離應(yīng)該 在相對(duì)溫和的條件下進(jìn)行，從而可以在結(jié)合測(cè)試中可直接使用已被釋放試劑處理過的樣品。(參見例如WO 02/57797和 US 5 2004/0132104)。盡管近年來巨大的成果，所有現(xiàn)有維生素D的檢測(cè) 方法都有一些缺點(diǎn)，如樣品制備費(fèi)人力，標(biāo)準(zhǔn)化的匱乏，測(cè)試程序之 間缺乏一致性或摻加(spiked )維生素D收率低。(特別見Zerwekh, J. E.， supra)。特別是在先技術(shù)中沒有提及能生產(chǎn)出測(cè)定25-羥基維生素D的可 io靠方法。因此本發(fā)明的目的是找到一種能生產(chǎn)出適合用來做25-羥基 維生素D測(cè)定的抗體的可靠方法。下面描述的方法，既有生產(chǎn)抗體 的方法，也包括用這些抗體測(cè)定維生素D的方法和試劑盒。 發(fā)明概述本發(fā)明涉及生產(chǎn)能抗25-羥基維生素D的抗體的方法，包含以下 15 步驟a) 將含25-羥基維生素A或25-羥基維生素02作為半抗原的 綴合物，免疫接種到一種實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物體內(nèi)，b) 分離上述實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物的血清或血漿，以及c) 通過免疫吸附到分別包含25-羥基維生素D2或25-羥基維生 20 素D3的互補(bǔ)基質(zhì)上，從而將血清或血漿中的抗體提純出來。此外，本發(fā)明涉及的抗25-羥基維生素D3的抗體可與10%至 1000%的數(shù)量級(jí)的25-羥基維生素D2交叉反應(yīng)。本申請(qǐng)還描述了如何利用本發(fā)明生產(chǎn)出的抗體在自動(dòng)化測(cè)試中 25檢測(cè)25-羥基維生素D。另外，公開了一種可用來檢測(cè)25-羥基維生素D的測(cè)試盒，包括 測(cè)試程序中所需試劑組合物以及本發(fā)明中所包含的抗25-羥基維生素 D的抗體。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及生產(chǎn)能抗25-羥基維生素D的抗體的方法，包含以下 步驟a) 將含25-羥基維生素03或25-羥基維生素02作為半抗原的 5 綴合物，免疫接種到一種實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物體內(nèi)，b) 分離上述實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物的血清或血漿，以及c) 通過免疫吸附到分別包含25-羥基維生素D2或25-羥基維生 素D3的互補(bǔ)基質(zhì)上，從而將血清或血漿中的抗體提純出 來。io 如無另外聲明，根據(jù)下列結(jié)構(gòu)式i和n,術(shù)語"維生素D"應(yīng)理解為包括維生素D2和維生素D3兩種形式。式I<formula>formula see original document page 6</formula>式II依照類固醇命名法標(biāo)明了結(jié)構(gòu)式I和II中維生素D的各個(gè)位置。25-羥基維生素D表示結(jié)構(gòu)式I和II中C-25位置被羥基化的維生素D代 謝物，即25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3。如上所述，25-羥 5基維生素D2和25羥基維生素D3是診斷學(xué)上顯著相關(guān)的維生素D形 式。提到維生素D的活性形式1,25-二羥基維生素D (所謂的激素 D)，是由結(jié)構(gòu)式I和II中C-l和C-25位置被羥基化形成的。另外所知的維生素b代謝物有24-二羥基維生素D2、 25-二羥基 io維生素D2、 24-二羥基維生素D3和25-二羥基維生素D3。所有已知的維生素D代謝物本身都不能產(chǎn)生免疫反應(yīng)。將維生是件容易的事情。因此，為了使免疫成功，必備條件是制備一種如包 含25-羥基維生素D作為半抗原的綴合物。這里術(shù)語半抗原被本領(lǐng)域 15 技術(shù)人員看作是一種本身不產(chǎn)生免疫性的物質(zhì)，但是經(jīng)過與一種較大 載體分子結(jié)合后，表現(xiàn)出抗原性從而可以促使針對(duì)其的抗體產(chǎn)生。本 領(lǐng)域技術(shù)人員知道能產(chǎn)生半抗原綴合物的適宜載體材料。通常用來作 為載體材料的有牛血清白蛋白、(3-半乳糖苷酶或者所謂的匙孔蜮血藍(lán)蛋白(KLH)。KLH被證實(shí)尤其適合在本發(fā)明所提供的方法中作載體。因此，25-羥基維生素D與KLH的綴合物優(yōu)選的用于免疫。如式I和II中所示，該結(jié)構(gòu)的各位置原則上都適合用于活化和與 載體材料偶合。例如現(xiàn)已證實(shí)經(jīng)25-羥基維生素D2或25-羥基維生素 5 D3的3位偶合有利于與25-羥基維生素D以合適方式相結(jié)合的抗體的 產(chǎn)生。因此在優(yōu)選實(shí)施方式中，依據(jù)本發(fā)明中用于免疫的綴合物，均 包含經(jīng)主鏈的3位偶合的25-羥基維生素D3或25-羥基維生素D2(比 4交式I和II )。作為本發(fā)明的 一 部分工作所做的 一 系列實(shí)驗(yàn)中，嘗試將 一 個(gè)用io25-羥基維生素D3免疫原免疫吸附到一個(gè)25-羥基維生素D3基質(zhì)上所 產(chǎn)生的抗體提純，并且用到相應(yīng)的測(cè)試中去。雖然這些實(shí)驗(yàn)并沒有成 功，但是令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過免疫吸附到25-輕基維生素D2基質(zhì)上 可以從同樣的血清中獲得適合的抗體?，F(xiàn)已證實(shí)這種方法是可靠的， 并且重現(xiàn)性良好。因此本發(fā)明的方法包含了一種可將抗25-羥基維生15 素Dx (這里x=2或3 )的抗體利用免疫吸附到一個(gè)包含25-羥基維生 素D的各自互補(bǔ)形式的綴合物的基質(zhì)上進(jìn)行^提純的步驟。在這個(gè)意 義上，25-羥基維生素D3與25-羥基維生素Dz互補(bǔ)，反過來25-羥基 維生素D2也與25-羥基維生素D3互補(bǔ)。這說明當(dāng)用25-羥基維生素 D3免疫時(shí)，進(jìn)行與25-羥基維生素02的免疫吸附；當(dāng)用25-羥基維生20素D2免疫時(shí)，進(jìn)行與25-羥基維生素D3的免疫吸附。此外，已證實(shí)利用維生素D主鏈上同一位置進(jìn)行化學(xué)偶合是有 利的，不論是在用作免疫作用的25-羥基維生素D綴合物中還是在用 作免疫吸附的基質(zhì)中。在免疫作用中25-羥基維生素D3綴合物優(yōu)選地 結(jié)合在25-羥基維生素D3的3位上，同樣的，25-羥基維生素02也優(yōu)25選地結(jié)合在基質(zhì)的3位上。逆向程序也可行，即，利用25-羥基維生素D2綴合物免疫，利用 偶合25-羥基維生素D3的基質(zhì)免疫吸附。本發(fā)明中另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施 方案中，25-羥基維生素D2綴合物用作免疫原綴合物，將用這種免疫原產(chǎn)生的抗體免疫吸附到25-羥基維生素D3基質(zhì)上去。EAH-瓊脂糖凝膠(Sepharose)被證明尤其適合作免疫吸附的基 質(zhì)材料。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，由免疫作用在血清或血漿中產(chǎn)生抗 25-羥基維生素03或者25-羥基維生素D2的抗體，通過利用包含25-5羥基維生素D2或25-羥基維生素D3的基質(zhì)進(jìn)行免疫吸附進(jìn)而提純。 EAH-瓊脂糖凝膠是一種優(yōu)選的柱填料。運(yùn)用之前描述的詳細(xì)程序，即用25-羥基維生素D3綴合物進(jìn)行免 疫，利用25-羥基維生素D2綴合物進(jìn)行免疫吸附，可能重復(fù)生產(chǎn)出能 夠與25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3兩種25-羥基維生素D形io 式均能反應(yīng)的抗體。這種方法所獲得的抗體的交叉反應(yīng)的數(shù)量級(jí)為 10%至1000%之間。因此在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，涉及例如 抗25-羥基維生素D3的抗體，與25-羥基維生素02有10%至1000% 的交叉反應(yīng)。與互補(bǔ)的25-羥基維生素D形式優(yōu)選有20%至500%范 圍內(nèi)的交叉反應(yīng)。交叉反應(yīng)的范圍是在一種利用本發(fā)明生產(chǎn)的抗體所15 做的免疫學(xué)測(cè)試法中測(cè)定的。如果用相同分析物濃度的25-羥基維生 素D2或25-輕基維生素D3時(shí)，在用25-羥基維生素D3繪制的校準(zhǔn)曲 線上僅讀出了十分之一的25-羥基維生素D3，則抗作為半抗原的25-羥基維生素D3產(chǎn)生的抗體對(duì)25-羥基維生素D2的交叉反應(yīng)性為10 % 。20 25-羥基維生素D的自動(dòng)化測(cè)試。因此本發(fā)明優(yōu)選涉及在檢測(cè)25-羥基 維生素D的免疫學(xué)測(cè)試中抗25-羥基維生素D的抗體的用途。25-羥 基維生素D的測(cè)試優(yōu)選是完全自動(dòng)化的。本發(fā)明生產(chǎn)出的抗體尤其 優(yōu)選地用于可在羅氏診斷公司出品的自動(dòng)化Elecsys 分析4義中進(jìn)行 的一種測(cè)試中。25 根據(jù)本發(fā)明的講授，可以令本領(lǐng)域技術(shù)人員將包含所有需要用來做25-羥基維生素D檢測(cè)的組件組合成一個(gè)測(cè)試盒。優(yōu)選的25-羥基 維生素D測(cè)試盒的特征在于，這種測(cè)試盒包含了抗25-羥基維生素D 且可以識(shí)別出兩種25-羥基維生素D形式的抗體，即，與每種互補(bǔ)形式的25-羥基維生素D有10%至1000%的交叉反應(yīng)。優(yōu)選作為竟?fàn)幮悦庖邷y(cè)定進(jìn)行測(cè)試，其中本發(fā)明生產(chǎn)的抗25-羥 基維生素D的抗體被優(yōu)選用作檢測(cè)試劑。在這種竟?fàn)幮詼y(cè)試中，加 入一定量的25-羥基維生素D"胞壁抗原"與樣品中的25-羥基維生素D 5竟?fàn)帣z測(cè)抗體的結(jié)合位點(diǎn)。樣品中的25-羥基維生素D越多，檢測(cè)信 號(hào)越少。另外已經(jīng)被證實(shí)以胞壁抗原的形式出現(xiàn)在竟?fàn)幮詼y(cè)試中的25-羥基維生素D的形式與用于免疫吸附的形式相一致是有利的。如果其中一種免疫用包含25-羥基維生素D3的免疫原，則在25-羥基維生素 io D2基質(zhì)上進(jìn)行免疫吸附，而25-羥基維生素Dz的衍生物優(yōu)選作為胞壁抗原用于測(cè)試中。胞壁抗原的修飾位置優(yōu)選與免疫原以及用在免疫吸附的基質(zhì)上的25-羥基維生素D的環(huán)位置相同。本發(fā)明的另 一種優(yōu)選實(shí)施方案涉及一種免疫學(xué)檢測(cè)25-羥基維生素D的方法，此方法中用到的多克隆抗體是用25-羥基維生素D綴合 15物免疫，并免疫吸附于互補(bǔ)的25-羥基維生素D綴合物上獲得的，其中在一個(gè)竟?fàn)幮詼y(cè)試中，互補(bǔ)于免疫原的25-羥基維生素D衍生物被用作胞壁抗原。下列實(shí)施例及附圖進(jìn)一步闡明了本發(fā)明。本發(fā)明的準(zhǔn)確保護(hù)范圍 限定于本發(fā)明所附的權(quán)利要求書中。附圖簡述

圖1: 25-羥基維生素D3免疫原的合成圖解。維生素D3經(jīng)式II主鏈上3位被激活，并與作為載體的匙孔蜮血 藍(lán)蛋白(KLH)偶合。 25 圖2， 25-羥基維生素D2免疫吸附劑的合成圖解。維生素D2經(jīng)式I主鏈上3位:帔激活，并與基質(zhì)材料EAH-瓊脂糖 凝膠偶合。圖3,生物素?；木S生素D2的合成圖解。圖示了可用作胞壁抗原的25-羥基維生素D2的合成步驟。圖4:用在先技術(shù)的抗體做免疫測(cè)定。25-羥基維生素D的含量是通過免疫測(cè)定法和HPLC法對(duì)總共32 個(gè)樣品的分析來確定。免疫測(cè)定的數(shù)值標(biāo)示在Y軸上而HPLC的數(shù) 5 值標(biāo)示在了X軸上。圖5:高效液相色譜法(HPLC)和LC-MS-MS的比較。25-羥基維生素D的含量是通過液相層析串聯(lián)質(zhì)譜儀LC-MS-MS 和高效液相色譜法(HPLC)對(duì)總共66個(gè)樣品的分析所確定的。 LC-MS-MS的數(shù)值標(biāo)示在Y軸上而HPLC的數(shù)值標(biāo)示在了 X軸上。 io 圖6:本發(fā)明中的抗體所做的免疫測(cè)定與LC-MS-MS的比較。25-羥基維生素D的含量是通過HPLC法和基于本發(fā)明中抗體所 做的免疫測(cè)定對(duì)總共66個(gè)樣品的分析所確定的。免疫測(cè)定的數(shù)值標(biāo) 示在了 Y軸上而HPLC的數(shù)值標(biāo)示在了 X軸上。 實(shí)施例11525-羥基維生素Dr3-半琥珀酸酉旨-KLH的合成這個(gè)合成中，化學(xué)活化25-羥基維生素D3的3位，并與作為免疫 原支持物的KLH耦合。這個(gè)合成經(jīng)過25-羥基維生素D3-3-半琥珀酸 酯和25-羥基維生素D3-3-半琥珀酸酯-N-輕基琥珀酰亞胺酯等中間步 驟，均被圖解在圖一中。 201.1 25-雍基維生素Dr3-半琥珀酸酯的制備取10 mg (25 |imol) 25-羥基維生素D3 ( Sigma-Aldrich， No. H-4014)溶解在lml無水吡咬中，將其與125 mg (1.25mmol)的琥 珀酸酐在室溫下暗室攪拌4天。將反應(yīng)混合物吸收入10 ml的乙酸乙 酯中，分別用2xl0ml的水，O.IM鹽酸洗滌，隨后再次用水洗滌。 25 用約lg無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，過濾并真空除去溶劑。用高真空干 燥剩余固體。獲得10.5mg (產(chǎn)率84%)的無色固體。 1.2 25-羥基維生素D3-3-半琥珀酸酯-N-羥基琥珀酰亞胺酯的制備取10.0 mg ( 20|iimol)的25-羥基維生素03-3-半琥珀酸酯溶解于7 ml的無水二氯曱烷中，并與2.76 mg ( 24|iimol)的N-羥基琥珀酰亞胺和3.72 mg (24)imol)的>^3-二甲基氨基丙基)^，-乙基-碳二亞胺 (EDC) —起混合。在氬氣下攪拌過夜，用lOml的水洗滌有機(jī)相兩次，用約lg無水硫酸鈉干燥并過濾。用真空除去溶劑，剩下的反應(yīng) 5產(chǎn)物在高真空中干燥3小時(shí)。獲得11.3mg(產(chǎn)率94%)無需進(jìn)一步提純并可用于綴合的N-羥基琥珀酰亞胺酯。1.3 25-羥基維生素Dr3-半琥珀酸酯-KLH的合成取150 mg的匙孔蜮血藍(lán)蛋白(KLH; Sigma-Aldrich No. H 8283 )溶解在25 ml 0.1 M的pH 8.0磷酸鉀緩沖液中，加入含有11.3 mg的 io N-羥基琥珀酰亞胺酯的2mlDMSO溶液。在室溫下過夜攪拌，隨后產(chǎn)物用凝膠柱法純化(AcA202，柱體體積0.5 L; 0.1 M的pH 7.0的磷酸鉀緩沖液)。用紫外吸收光譜法(X=256nm)檢測(cè)并收集含綴合蛋白的流分。加入10%的甘油并將這種灰乳白色的溶液用于免疫。實(shí)施例215生產(chǎn)和分離抗25-羥基維生素D3的抗體。 2.1免疫作用在綿羊體內(nèi)產(chǎn)生抗體。由實(shí)例一中獲得的25-羥基維生素Dr3-半琥珀酸酯-KLH的綴合物用于免疫。免疫劑量為每只動(dòng)物0.1 mg。 第一次在完全弗氏佐劑下進(jìn)行免疫。接下來每間隔4個(gè)星期，在不完 20全弗氏佐劑下進(jìn)行免疫，需時(shí)10個(gè)月。每次免疫間隔中間收集免疫 血清。2.2多克隆綿羊抗體的純化在Aerosil ( 1.5%)的幫助下，用25-羥基維生素03-3-半琥珀酸 酯-KLH綴合物從免疫的綿羊血清中移除含脂質(zhì)的成分。隨后用硫酸 25 銨(1.7 M)沉淀出免疫球蛋白。沉淀物在包含50 mM NaCl的15 mM 磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中透析，并用DEAE-瓊脂糖基質(zhì)層析提純。 從層析柱流穿液(flow-through)獲得IgG流分(=PAB< 25-羥基維生 素D3> S-IgG (DE))。2.3利用親和層析法純化25-羥基維生素D特異性抗體。制備了 一種包含了作為特異性決定子的綴合的25-羥基維生素D2 且可用作免疫層析純化多克隆抗體的免疫吸附劑。這種免疫吸附劑由 以下步驟獲得 5a)輕基維生素03-3-2，-氰乙基醚的合成在氬氣條件下，在內(nèi)有溫度計(jì)的一個(gè)25ml三頸圓底燒瓶中，將 20.6 mg (50|iimol)的25-羥基維生素D2 ( Fluka No. 17937 )溶解于10 ml干燥乙腈。將1.5 ml叔丁醇/乙腈(9:1)加入溶液中，并水浴冷卻 到6°C。隨后加入820 pl的丙烯腈溶液(86|il的丙烯腈溶于1.0 ml io 的乙腈中)并在6。C下攪拌15分鐘。然后加入205 (il的氫化鉀溶液 (25mgKH溶于0.5ml叔丁醇/乙腈(9:1)中)。產(chǎn)生短暫的絮凝后得 到清澈溶液。繼續(xù)在6。C下攪拌反應(yīng)溶液45分鐘隨后在4"C下攪拌 60分鐘。接著，反應(yīng)溶液用10ml的曱基叔丁基醚稀釋并用10ml的水洗 15滌兩遍。用約lg無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，通過G3玻璃過濾器過濾 后再用旋轉(zhuǎn)脫水器脫水。最后用高真空干燥，得到質(zhì)量約55mg清澈 的粘性剩余物。b)輕基維生素D2-3-3，-氨基丙基醚的合成將上面所獲得的全部腈溶解于15 ml的二乙醚中，并在攪拌下與20 7.5 mg氫化鋰在7.5ml 二乙醚中的懸浮液混合。在室溫下攪拌反應(yīng) 混合物一個(gè)小時(shí)，然后加入38.4 mg的氬化鋁鋰在6.6 ml的二乙醚中 的懸浮液，得到一個(gè)極度渾濁的混合物。室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)混合物 一個(gè)小時(shí)，然后冰浴反應(yīng)混合物冷卻到0-5。C并小心地加入35 ml的 水。最后加入6.6ml的10M氫氧化鉀溶液使混合物具強(qiáng)石威性。25 每次用65 ml的曱基叔丁基醚萃取三次，并用約5 g無水硫酸鈉干燥合并的有機(jī)相，過濾，在室溫下用旋轉(zhuǎn)脫水器脫水。剩余物用油 泵干燥直至質(zhì)量恒定。粗制的產(chǎn)物溶解于5mlDMSO和3.0ml的乙 腈中并用制備性HPLC法進(jìn)行純化。洗脫劑A = Millipore水+ 0.1%的三氟醋酸；
洗脫劑B = 95%的乙腈+ 50/。的Millipore水+ 0.1 %的TFA;
梯度100分鐘內(nèi)從50%的B到100%的B。
流速30 ml/分鐘 5溫度 室溫下
柱體尺寸半徑=5.0 cm;長度=25 cm;
柱體填料VydacC18/300A/15-20(^im
檢測(cè)波長226證
將分析HPLC ( Vydac C18/300A/5pm; 4.6x250 mm )測(cè)得的產(chǎn)物 io含量高于85°/。的流分收集到一個(gè)圓底燒瓶中并且凍干。最后獲得13.7
mg (產(chǎn)率58%)的無色凍干粉。
c )合成羥基維生素D2-3-3，-N-(半環(huán)庚基)氨基丙基醚-N-羥基琥珀酰 亞胺酯
11.7 mg ( 25|umol)的氨基衍生物溶解于5 ml新鮮蒸餾的DMF 15 并且加入92 mg ( 250pmo1)的軟木酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯。加入3.5 pi的三乙胺并在氬氣下攪拌過夜。粗制產(chǎn)品通過制備性HPLC法(條 件如上所述)純化，經(jīng)過凍干處理后獲得10.1 mg (產(chǎn)率56%)的 N-羥基琥珀酰亞胺酯。 d)合成羥基維生素D2免疫吸附劑 20 在一個(gè)G3 3皮璃過濾器上用200 ml 0.5 M的氯化鈉溶液洗滌20 ml
的EAH瓊脂糖凝膠(Amersham Biosciences, No. 17-0569-03 )。用200 mi0.03M的磷酸鐘緩沖液(pH7.1 )平衡。通過玻璃過濾器排掉多余 的液體后，將懸浮液加進(jìn)200ml的相同緩沖液中，并加入溶解了 1.7 mg (2.3jamol) N-羥基琥珀酰亞胺酯的10 ml DMSO。在室溫下用混 25 合器攪動(dòng)反應(yīng)混合物過夜。將混合物再次轉(zhuǎn)移到一個(gè)G3玻璃過濾器 中排干并用500 ml 0.05 M的磷酸鉀緩沖液/0.15 M的氯化鈉(pH 7.0 ) 洗滌。完全排出后，重懸于25ml的相同緩沖液并加入0.15ml濃度 為25%的疊氮化鈉保存?zhèn)溆谩)純化抗體
10 ml d)中的親和基質(zhì)被填入柱體內(nèi)，并用包含50 mM磷酸鉀和 150mMNaCl的緩沖液(pH7.5) (PBS)平衡。將3.6 g的PAB< 25-羥基維生素D3> S-IgG (DE)加載進(jìn)柱體中。分別用PBS緩沖液和包 5 含0.05% Tween 20和30 mM氯化鈉的0.5 M NaCl溶液洗滌柱體。 用3 mM HC1溶液將特異性結(jié)合的免疫球蛋白從親和基質(zhì)上分離下 來。用lmM的乙酸乙酯透析HCl洗脫液，隨后將其凍干。將凍干粉 溶解于PBS中，并用Superdex200⑧層析移除聚集體，由此方法得到 的免疫吸附的多克隆抗體將被用在接下來的步驟里。用1 M的丙酸再 io 生免疫親和基質(zhì)并保存在含有0.9%疊氮化鈉的PBS溶液中。 實(shí)施例3
-險(xiǎn)測(cè)25-羥基維生素D的測(cè)定
商業(yè)測(cè)定根據(jù)制造商的使用說明進(jìn)行使用。文獻(xiàn)中記述了通過 HPLC法(測(cè)試25(OH)維生素D3,來自"Immundiagnostik，，公司， 15Bensheim,訂單號(hào).KC 3400 )或LC-MS-MS法(Vogeser， M.等，Clin. Chem. 50 (2004) 1415-1417 )來完成25-羥基維生素D的測(cè)定。
在依照本發(fā)明生產(chǎn)出的抗體的基礎(chǔ)上，成分的制備以及一種新免 疫學(xué)測(cè)試的通用程序描述如下
3.1合成羥基維生素D2-3-3，-N-(半環(huán)庚基)氨基丙基醚-生物素
20 -(卩-Ala)-Glu-Glu-Lys(s)綴合物(=Ag-Bi)
將13.7 mg ( 25)iimol)的羥基維生素02-3-3，-氨丙基醚溶解于3.5 ml DMSO溶液中，并混入28.7 mg ( 30|amol )的生物素-((3-Ala)-Glu-Glu-Lys(s)-半辛二酸-N-幾基琥珀酰亞胺酯(Roche Applied Science, No. 11866656)和12.5|al的三乙胺，在室溫下攪拌過
25夜。反應(yīng)溶液用4.5 ml的DMSO溶液稀釋，并以0.45pm的孩史過濾 Millipore器濾出，隨后用制備性HPLC法提純(條件見實(shí)例2.3b )。 收集分析性HPLC檢測(cè)出的產(chǎn)物含量超過85%的流分并將其凍干。最 后獲得9.8mg (產(chǎn)率30%)的已純化生物素綴合物。3.2用親和層析法提純釕化的可抗25-羥基維生素D的多克隆抗體 (=PAB-Ru)
按照實(shí)施例2.3 e)的方法將親和純化的抗體轉(zhuǎn)移到100mM的磷 酸鉀緩沖液中(pH 8.5)并將蛋白濃度調(diào)至l mg/ml。釕化試劑(釕
5 (II)三(聯(lián)吡咬)-N-羥基琥珀酰亞胺酯)溶解于DMSO中，并以 摩爾比為7.5: 1的比例加到抗體溶液中。反應(yīng)持續(xù)60分鐘后，加入 L-賴氨酸使反應(yīng)停止，多余的標(biāo)記試劑在Sephadex G25上用凝膠滲 透層析法分離出去。 3.3免疫測(cè)定的檢測(cè)過程。
io 利用羅氏診斷公司的Elecsys 系統(tǒng)測(cè)量樣品。25(^1的樣品與
30(al的釋放試劑混合，同時(shí)或先后加入15^1的釕化檢測(cè)抗體并且溫 育9分鐘。接下來，加入生物素酰化的胞壁抗原(50jxl)并通過加入 釋放試劑(50)id)保持pH值在一定的期望范圍內(nèi)。繼續(xù)溫育9分鐘 后，加入包被了鏈霉親和素(SA) (30|ul)的可磁化聚苯乙烯顆粒，
15再經(jīng)過9分鐘溫育后，結(jié)合的釕化抗體的量按照常規(guī)測(cè)定。 包含釕化《5-OH-維生素D〉抗體綴合物的溶液中含有
20 mM 磷酸緩沖液，pH6.5
0.1% oxypyrion
0.1% MIT(N-甲基異瘞唑酮-HCl)
2010% DMSO ( 二曱基亞砜)
1% EtOH (乙醇)
0.1% 表面麻醉劑
1% 兔子免疫球蛋白G ( DET )
2.0 pg/ml PAB-Ru (見實(shí)例3.2 ) 25釋》文試劑包含
220 mM醋酸鹽緩沖劑，pH4.0
0.1% oxypyrion
0.1% MIT10% DMSO
1% EtOH
0.1% 表面麻醉劑
0.2% 兔子免疫球蛋白G
5 含有生物素?；陌诳乖娜芤喊?
20 mM 磷酸緩沖劑，pH6.5
0.1% oxypyrion
10% DMSO
1% E認(rèn)
io 0.1% 表面麻醉劑
0.2% 兔子免疫球蛋白G
0.18|ug/mlAg-Bi (見實(shí)施例3.1 )
含有包被了 SA的乳膠顆粒的懸浮液包含 0.72 mg/ml 具有470 ng/ml結(jié)合能力的包被了鏈霉親和素(SA)
15 的可^t化聚苯乙烯顆粒
實(shí)施例4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
4.1利用被作為免疫原和免疫吸附劑的25-羥基維生素D3所獲得的抗 體
20 在許多(失敗的)實(shí)驗(yàn)中所使用的抗體是利用在先技術(shù)方法制造
出來的，如用25-輕基維生素D3進(jìn)行免疫及對(duì)其免疫吸附。圖4中顯 示了 一個(gè)不適合用來作為25-羥基維生素D的可靠性檢測(cè)的抗體的實(shí) 例。圖4中清楚的表明了用這些抗體的免疫測(cè)定所測(cè)得的25-羥基維 生素D數(shù)值與參考方法(HPLC)之間沒有相關(guān)性。
254.2比較HPLC和LC-MS-MS
如在Vogeser, M.等，Clin, Chem. 50 (2004) 1415-1417中所描述， 利用LC-MS-MS法檢測(cè)維生素D的代j射物被越來越多的作為測(cè)定維 生素D代謝物的參考方法。因此，研究了是否早先HPLC參考方法的結(jié)果可與較新的LC-MS-MS參考方法的結(jié)果相比較?？梢詮膱D5 看出，兩種參考方法均有可比性。利用線性回歸確定了相關(guān)系數(shù)為 0.94。4.3利用才艮據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的抗25-羥基維生素D的抗體作免疫測(cè)定 5 應(yīng)用新免疫學(xué)測(cè)試和LC-MS-MS法總共比較了 66個(gè)樣品中關(guān)于25-羥基維生素D的含量。由圖6可以看出，由兩種測(cè)定所得的結(jié)果非常相關(guān)。由線性回歸獲得相關(guān)系數(shù)為0.85。結(jié)果令人驚訝，因?yàn)檫@兩種分析方法是基于完全不同的原理。因此^^測(cè)25-羥基維生素D的測(cè)試，可以用根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的抗 io 體來建立起一種可靠的25-羥基維生素D的測(cè)定方法。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)抗25-羥基維生素D的抗體的方法，包含以下步驟a)用含25-羥基維生素D3或25-羥基維生素D2作為半抗原的綴合物，免疫接種到實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物體內(nèi)，b)分離上述實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物的血清或血漿，以及c)通過免疫吸附到分別包含25-羥基維生素D2或25-羥基維生素D3的互補(bǔ)的基質(zhì)上，從而將血清或血漿中的抗體提純出來。
2. 權(quán)利要求1中的方法，其特征在于25-羥基維生素D3綴合物 io的^t通過25-羥基維生素D3的3位。
3. 權(quán)利要求1中的方法，其特征在于25-羥基維生素D2綴合物 的鍵通過25-羥基維生素D2的3位。
4. 權(quán)利要求2中的方法，其特征在于25-羥基維生素D2通過25-羥基維生素D2的3位與免疫吸附中所用的基質(zhì)連接。
5.權(quán)利要求3中的方法，其特征在于25-羥基維生素03通過25-羥基維生素D3的3位與免疫吸附中所用的基質(zhì)連接。
6. —種抗25-羥基維生素D3的抗體，所述抗體與25-羥基維生素 02有10%至1000%的交叉反應(yīng)。
7. —種抗25-羥基維生素D3的抗體，所述抗體與25-羥基維生素 20 D2有20%至500%的交叉反應(yīng)。
8. 權(quán)利要求6或7的抗體在測(cè)定25-羥基維生素D3的測(cè)試中的 用途。
9. 一種測(cè)定25-羥基維生素D3的測(cè)試盒，其特征在于所述測(cè)試 盒包含權(quán)利要求6或7的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗25-羥基維生素D抗體的生產(chǎn)方法，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)出的抗體以及用這些抗體檢測(cè)25-羥基維生素D的方法。
文檔編號(hào)C07K16/26GK101273062SQ200680035451
公開日2008年9月24日 申請(qǐng)日期2006年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月29日
發(fā)明者A·基里亞特索利斯, E·休伯, J·貝克, N·霍恩, R·沃格爾, W·克勞斯 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司