專利名稱：骨形態發生蛋白2活性肽及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于臨床醫學領域，更具體地說它涉及一種骨形態發生蛋白2活性多肽及這種 活性多肽的制備方法及其在醫學上促進骨再生、骨缺損修復上的應用。
技術背景據統計，我國每年因各類交通事故、生產安全事故、骨科疾病等因素，造成骨缺損或 骨損傷的患者有300萬人，而且有逐年增多的趨勢，急需大量骨修復材料，市場巨大。隨 著科技的進歩，臨床上通過實施自體或異體組織移植、使用人工合成骨組織代用品，使得 上述疾病的治療取得了很大進展。但其缺點是均存在犧牲個體正常組織、供體來源不足、 價格昂貴、產生排異反應和繼發感染等問題，不能滿足臨床治療的要求。目前，如何從根 本上解決骨缺損的修復已成為國際醫學前沿課題。近年來，用組織工程學技術，即用人工細胞外基質材料、生長因子與種子細胞復合移 植或單獨植入修復骨缺損，引起各國高度重視。但目前國內外骨相關研究尚處于起歩階段， 有許多問題亟待解決，其中如何研制出具有顯著修復骨缺損效果的藥物或材料是亟待解決 的關鍵問題之一。骨形態發生蛋白(Bone morphogenetic proteins,簡稱BMPs)是一種存在于骨基質中的糖 蛋白多肽，含有二硫鍵結構，相對分子質量18000-30000，除骨形態發生蛋白l外構成了 一個結構和功能相似的多肽因子家族。到目前為止，已發現的骨形態發生蛋白家族成員有 43種。骨形態發生蛋白是目前唯一能夠單獨誘導骨組織形成的局部生長因子，能在生物體 內誘導未分化的間質細胞分化成為軟骨和骨。骨形態發生蛋白各成員的誘導成骨能力不 同，其中以骨形態發生蛋白2的成骨能力最強，因此目前被廣泛研究。然而，BMP-2是一種量微高效的粉末狀物質，既不能均勻地分布于骨缺損處，又無支 撐作用。同時，由于骨形態發生蛋白2在體內半衰期短，局部應用時代謝較快，要求相對 大的劑量才能刺激足量骨形成而持續的發揮治療作用，從而增加臨床治療的成本并可能導 致毒性作用的產生。如何大規模的生產BMP-2并使其在臨床上更加廣泛地發揮作用一直是 當前研究的一個難點。H前國內外多采用分子生物學和基因工程學等技術生產基因重組人骨形態發生蛋白 2(rilBMP-2)。但由于其生產設備和制備工藝非常復雜，生產周期長，產率低，價格亦非常 品貴，難以大規模生產，同時亦存在基因工程產品安全性的問題(Wozney J, Seeherman H. Protein-based tissue engineering in bone and cartilage repair. Curr Opin Biotechnol, 2004, 15(5): 392-398.)。臨床上，人們運用無機材料、高分子多聚體、生物性材料、復合材料等作為BMP-2 或rhBMP-2載體應用于治療。但由于各種材料在生物相容性、力學性能、骨傳導性、骨誘 導性、可塑性。可降解性等方面各有差異，目前還沒有一種完全具備理想骨缺損修復材料 要求的骨組織代用品。這樣就限制了外源性BMP2或rhBMP-2在骨折治療中的應用。另外， 大分子蛋白質吸附在材料表面后會隨機折迭，活性位點暴露不充分導致其生物活性不高。另一種方法是運用轉基因技術將BMP-2基因轉入骨髓間充質干細胞，通過轉基因細胞 表達BMP-2。目甜報道的骨形態發生蛋白2基因載體多為腺病毒，病毒類載體有持續增殖 對宿主造成危害的可能，同時外源性基因的介入也使宿主基因存在突變的危險；非病毒載 體轉入的外源性基因不會整合入宿主細胞的染色體中，不會使插入位點的基因過度表達和 失活，也汜插入突變的危險，但其表達效率較低。此外，基因在體內的表達時間和表達數 量還不能人為控制。然而亦存在轉染效率低、表達時間較短及病毒載體的潛在致癌性等缺 /,',((Chadderdon R, Shimer A， Gilbertson L. Advances in gene therapy for intervertebral disc degeneration. Spine J. 2004， 4(6Suppl): 341S-34.)(因此，以BMP-2為基礎的基因治療還遠 遠不能運用于臨床。 發明內容本發明的目的在于克服上述現有技術的不足之處，而提供一種骨形態發生蛋白2活性肽。本發明的另一個目的是提供一種制備上述骨形態發生蛋白2活性肽的方法。 本發明的再一個目的是將本發明骨形態發生蛋白2活性肽在臨床上應用于促進骨再 生、骨缺損的修復。本發明的目的是通過如下措施來達到一種骨形態發生蛋白2活性肽，其結構為S(P04JKIPKASSVPTELSAISTLYLDDDCt形態發生蛋白2活性肽1);或CCCCDDDS'pwKIPKASS VPTELS AISTLYL(骨形態發生蛋白2活性多肽2);或C, 6H3,0-N H-CCCCGGGS 1P04]-KIPKASS VPTELS AISTLYL(骨形態發生蛋白2活性肽3)。制備上述骨形態發生蛋白2活性肽的方法為BMP-2氨基酸序列中的BMP-2II型受體具有很多抗原表位，其特征性的"指節抗原表 位:"(Kirsch T, Sebald W, Dreyer MK. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat Struct Biol, 2000, 7(6): 492-496.)中具有誘導成骨的核心功能區，其核心功能區中氨基酸 序列為"KIPKASSVPTELSAISTLYL" (Saitoa A, Suzuki Y, Ogataa S， et al. Activation of osteo-progenitor cells by a novel synthetic peptide derived from the bone morphogenetic protein-2 knuckle epitope. Biochimica et Biophysica Acta, 2003, 1651: 60—67.)在其一端加上一個磷酸化的絲氨酸，另外一端加上三個天冬氨酸，形成的骨形態發生 蛋白2活性肽l(Sfro4]KIPKASSVPTELSA[STLYLDDD);或在其 -端加上四個半胱氨酸，三個天冬氨酸以及一個磷酸化的絲氨酸，形成的骨形 態發生蛋白2活性肽2(CCCCDDDS[P04JKIPKASSVPTELSAISTLYL)。或在其一端加上四個半胱氨酸，三個甘氨酸以及一個磷酸化的絲氨酸，其中位于多肽 鏈的端側的一個半胱氨酸用軟脂酸酯((^H^O-)加以修飾，形成骨形態發生蛋白2活性肽 3(Cl6H3iO- NH- CCCCGGGS[P04-KIPKASSVPTELSAISTLYL)。H條多肽均通過常規的FMOC/tBu固相多肽合成法合成(Barany Q Merrifield RB. 1979. Solid phase peptide synthesis. In: Gross E, Meienhofer J. eds. The peptides uol2. New York AcademiPc ress. pp l-284.):采用對堿不穩定的9-芴甲基羰基(Fmoc)保護氨基酸的a-氨基， 釆用對酸不穩定的叔丁基型或其它保護基團保護氨基酸的側鏈官能團，用聚酰胺樹脂作為 多肽合成的固相載體。所得粗肽經過凝膠層析初步純化，最后經過高效液相色譜法分析其 純度，冷凍而得。這三條多肽能夠極好的模擬天然骨基質的促發及指導生物礦化的功能，在局部形成偏 酸的環境，促進局部的鈣、磷自組裝沉積到體內局部組織中膠原纖維表面，生長成按同一 方向排列的、堅硬的羥基磷灰石微型晶體結構，形成與天然骨極為相似的結構，從而發揮 與天然BMP-2類似的功能。與常規的骨形態發生蛋白藥品相比，該活性多肽具有如下的優點(l)該活性多肽可發 揮與其蛋白質類似的作用，同時短鏈多肽活性位點能充分暴露并與細胞表面相應的受體結合，達到其較好生物活性，實驗結果表明其異位成骨能力較強(參見說明書中動物體內異位 成骨的實驗研究)；(2)此活性多肽兩端的序列中含有磷酸化的絲氨酸、半胱氨酸(兩種氨 基酸為極性中性氨基酸)及天冬氨酸(它為酸性氨基酸)，多肽在與相關基質材料結合后， 在模擬體液中其兩端的這些氨基酸能在材料表面形成磷酸基、羧基等陰離子活性基團。這 些陰離子基團是體內促發并指導礦化的重要的功能位點，它們對鈣磷離子具有很強的親和 力，能促進鈣磷離子的沉積、晶體的成核生長和自組裝礦化，起到調控機體內生物自組裝 礦化的作用。這兒種中性及酸性氨基酸的存在使此活性多肽具有了更好的骨誘導活性，促 進了共成骨的效能。我們的研究表明憐酸基等陰離子活性基團能更好的促進基質材料的礦 化(參見說明書中材料生物礦化方面的實驗研究h (3)通常由少于100個氨基酸組成的稱 為小分子多肽，而由100個以上氨基酸組成的稱為蛋白質。少于50個氨基酸組成的小分 子多肽人工合成比較容易，合成較難、大于50個氨基酸組成的多肽或蛋白質才用基因工 程表達。此小分子多肽較之骨形態發生蛋白分子結構小，更易大規模人工合成，費用更低， 大大減輕了骨缺損病人的經濟負擔；(4)由于多肽的分子量小，生產出的劑型更加豐富。 一方面.，"T將多肽配成溶液，直接在骨缺損或骨不連的部位注射；第二，可采用微球包覆 技術，運用高分子材料微球將多肽包裹，以達到植入體內后緩釋的效果；第三，可將水溶 性的肽引入到PLA或PCL鏈段中，合成出一種新型的具有生物功能、可降解的共聚物，植入病變部位治療；(5)研究表明，小分y-多肽激素可以引起肌體不同時效的iE性或負性生理活動和生化反應調節，活性極高，非常微量的劑量(l/百萬克)即可引起肌體明顯反應。 多肽在與相關基質材料復合過程中穩定性更好，且復合后隨著材料本體的逐漸降解而釋 放，持續時問更長，達到了緩釋的效果，將更好更快的促進骨缺損的修復。
圖1為磷酸化絲氨酸的化學結構。圖2為骨形態發生蛋白2活性多肽1在Wistar大鼠體內異位成骨的CT照片。 圖3為骨形態發生蛋白2活性多肽2在Wistar大鼠體內異位成骨的CT照片。 圖4為骨形態發生蛋白2活性多肽3在Wistar大鼠體內異位成骨的CT照片。 圖5為光鏡下(x10倍)8周時骨形態發生蛋白2活性多肽1異位成骨的HE染色切片閣。圖6為光鏡下(xl0倍)8周時骨形態發生蛋白2活性多肽2異位成骨的HE染色切片圖。閣7為光鏡下(xlO倍)8周時骨形態發生蛋白2活性多肽3異位成骨的HE染色切片圖。圖8為光鏡下(xl0倍)8周時置入單純膠原海綿材料部位的HE染色切片圖。 圖9為鈣離子吸附質量分析結果。閣10掃描電鏡顯示的是PLGA-(PEG-ASP)n支架材料(x50倍)。圖11掃描電鏡顯示的是第8天時PLGA-(PEG-ASP)n支架材料在模擬體液中(x2000倍)。圖12掃描電鏡顯示的是第16天時PLGA-(PEG-ASP)n支架材料在模擬體液中(><3000倍)。圖13掃描電鏡顯示的是第16天時PLGA-PEG支架材料在模擬體液中(x3000倍)。 圖14為PLGA-(PEG-ASP)n材料及PLGA-PEG支架材料在各個時間點質量檢測結果。
具體實施方式
卜'面結合附圖詳細說明本發明的實施情況其中圖2， 3, 4， 5， 6， 7， 8為動物實驗 的結果，即骨形態發生蛋白2活性肽1， 2， 3置入Wistar大鼠體內后異位成骨的影像學及 組織學檢驗圖。其中圖9， 10， 11, 12， 13， 14為基質材料生物礦化實驗研究的結果圖。 (1)動物體內異位成骨的實驗研究① 材料的準備通過FM0C7tBu固相多肽合成法分別合成骨形態發生蛋白2活性肽1 (SiPU4]KIPKASSVPTELSAISTLYLDDD )，骨形態發生蛋白 2 活性肽2 (C'CCCDDDS[P04]KIPKASSVPTELSAISTLYL)及骨形態發生蛋白2活性肽3(d6H3！0- NH-CCCCGGGS網-KIPKASSVPTELSAISTLYL)。所用的膠原海綿為武漢博士德公司產品。以5x5x5mnr;大小的膠原海綿為支架材料，將三種骨形態發生蛋白2活性多肽以生理 鹽水溶解，按照0.4mg劑量分別滴加于膠原海綿上，同時將等量的生理鹽水滴加于對照的 單純膠原海綿上，待其充分吸收后凍干備用。② 分組將36只Wistar大鼠隨機平均分為三個實驗組，即0.4mg骨形態發生蛋白2活 性多肽1/膠原海綿組、0.4mg骨形態發生蛋白2活性多肽2/膠原海綿組、0.4mg骨形態發生蛋fl 2活性多肽3滑交原海綿組，對照采用單純膠原海綿。 ③植入多肽/膠原海綿及單純膠原海綿
實驗大鼠采用氯胺酮腹腔注射麻醉。在背部骶棘肌切口 1 cm,兩個實驗組分別植入 ().4mg骨形態發生蛋白2活性多肽l服原海綿、0.4mg骨形態發生蛋白2活性多肽2/膠原 海綿、0.4mg骨形態發生蛋白2活性多肽3/膠原海綿組于一側骶棘肌肌肉間隙內，對側骶 棘肌肌肉間隙內植入同樣大小的單純的膠原海綿。三組小鼠分別在植入后3、 6、 8周行CT 攝片檢査，然后各組在每個時間點各處死4只，并對植入材料的局部組織進行取材，甲醛 間定后，經石蠟包埋切片，HE染色，進行組織學觀察。
實驗結果中影像學CT檢査顯示分別置入了骨形態發生蛋白2活性多肽1、 2、 3的動 物體內均有明顯的異位成骨(圖2、圖3、圖4);組織學檢驗(圖5)顯示8周時骨形態發 生蛋白2活性多肽l/膠原海綿組可見明顯新骨形成，且發育很充分，多數新骨連續存在。 組織學檢驗(圖6)顯示8周時骨形態發生蛋白2活性多肽2/膠原海綿組可見明顯新骨形 成，骨小梁較為寬粗，其表面可見成排的活躍的骨細胞。組織學檢驗(圖7)顯示8周時 骨形態發生蛋白2活性多肽3/膠原海綿組可見明顯的新骨形成，發育較充分。單純膠原海 綿材料組僅見纖維組織形成，未見類骨質形成，到8周時已被完全降解吸收(圖8)。
實驗結果說明骨形態發生蛋白2活性多肽1、骨形態發生蛋白2活性多肽2及骨形態 發生蛋白2活性肽3均具有良好的異位成骨能力，和骨形態發生蛋白2具有類似的成骨活 性，在骨組織工程領域具有前景廣闊的應用價值。
(2)基質材料生物礦化的實驗研究
① 材料的準備
高分子材料丙交酯/乙交酯/天冬氨酸一聚乙二醇(英文名稱PLGA-(PEG-ASP)n)多元 共聚物的合成:由丙交酯(DLLA)、乙交酯(GA)及天冬氨酸一聚乙烯預聚物開環共聚合成。 材料制成直徑為5mm的圓片狀，厚度為2mm。
高分于材料聚(丙交酯-co-乙交酯)—聚乙二醇(英文名稱PLGA—PEG)制成直徑為 5mm的圓片狀，厚度為2mm。
② 鈣離子吸附質量分析40片兩種多聚物材料共分5組，分別放入含有不同鈣離子濃度的NaCl緩沖液(PH =7.4， 150mM)的24孔板中，37度條件下放置。各組中鈣離子的濃度分別為0.05， 0.1， 1， 5及10mM。 48小時后，通過測定溶液中殘留的鈣離子的量，得出吸附于每份支架材料上 的鈣離子含量。溶液中的鈣離子濃度運用比色分析法測定。
③ 生物礦化
將PLGA-(PEG-ASP)n及PLGA—PEG支架材料放置于24孔組織培養皿中，在各孔中均 加入15ml的改良后的模擬體液。分別放置0，4，8， 12, 16天。每天更換新鮮的模擬體液以保 正足夠的離子濃度。改良后的模擬體液的組成為H20: 141mMNaCI，4.0mMKCl,0.5mM MgS()4, 1 .OmM MgCl2,4.2mM NaHC03, 5.0mM CaCl2, and 2.0mm KH2P04.合成后的溶液用 Tris-HCl溶液進行緩沖至pH = 6.8。每份材料在每個培養期處理前及處理后均凍干后進行掃 描電鏡觀察及質量檢測。
④ 實驗結果及分析
鈣離子吸附質量分析結果表明PLGA — PEG材料上的鈣離子吸附質量明顯少于 PLGA-(PEG-ASP)n材料上鈣離子吸附質量。另外，兩種材料上鈣離子吸附量均隨溶液中的 鈣離子濃度增加而增加(圖9)。
生物礦化結果表明處理前PLGA-(PEG-ASP)n共聚物支架材料掃描電鏡如圖 (圖IO)。在不同的培養期，掃描電鏡顯示在PLGA-(PEG-ASP)n共聚物支架材料內部多孔結 構內，充滿二氧化碳的低晶狀的羥基磷灰石納米晶體持續的成核和生長。隨著培養期的延 長，材料內部多孔結構內生物礦物的析出范圍明顯增大。8天時，許多獨立的礦化晶體在 材料內部多孔結構內生長(圖ll)。 16天時，出現連續的礦化層，生物礦化晶體顯示出薄片 狀的結構形態(圖12)u PLGA — PEG支架材料表面在各個培養期均未見明顯的礦物生長(圖 13)。質量檢測結果顯示隨時間的增加PLGA- (PEG - ASP)n材料的質量有明顯的增加，PLGA 一PEG支架材料組的質量無明顯變化(圖14)。
目前普遍采用聚乙二醇(PEG)引發丙交酯和乙交酯共聚來改善PLGA材料的親水性。 然而，形成的嵌段共聚物中缺乏功能基團，難以進一步與生物活性分子復合，材料的細胞 親和性改善不明顯，且材料誘導鈣磷離子的沉積、晶體的成核生長和自組裝礦化的能力均 不強。我們在PLGA—PEG嵌段共聚物中引入含活性基團的氨基酸序列，以期改善以往報道的該類共聚物中缺乏功能基團的缺陷。
實驗結果表明，經含活性基團的氨基酸序列修飾后，產生了表面化學的差異性，對于 多聚物支架材料上鈣離子吸附量有明顯的影響。天冬氨酸一聚乙二醇預聚物修飾的PLGA 共聚物，具有豐富的陰離子基團功能。這些陰離子基團是體內促發并指導礦化的重要的功 能位點，它們對鈣磷離子具有很強的的親和力，能促進鈣磷離子的沉積、晶體的成核生長 和自組裝礦化，起到調控機體內生物自組裝礦化的作用。
權利要求
1. 一種骨形態發生蛋白2活性肽，其特征在于其結構為S[PO4]KIPKASSVPTELSAISTLYLDDD、或CCCCDDDS[PO4]KIPKASSVPTELSAISTLYL、或C16H31O-NH-CCCCGGGS[PO4]-KIPKASSVPTELSAISTLYL。
2、 制備權利要求1所述骨形態發生蛋白2活性肽的方法，它包括如下步驟BMP-2氨基 酸序列BMP-2n型受體具有很多抗原表位，其特征性的"指節抗原表位"中具有誘導成骨的 核心功能區，核心功能區中氨基酸序列的結構為KIPKASSVPTELSAISTLYL;其特征在于在所述KIPKASSVPTELSAISTLYL的一端加一個磷酸化的絲氨酸，另一 端加三個天冬氨酸，可得到骨形態發生蛋白2活性肽1 ，其結構為 S,KIPKASSVPTELSAISTLYLDDD;或在所述KIPKASSVPTELSAISTLYL的一端加四個半胱氨酸、三個天冬氨酸和一個磷 酸化的絲氨酸，可得到骨形態發生蛋白2活性肽2 ，其結構為 CCCCDDDS網KIPKASSVPTELSAISTLYL;或在所述KIPKASSVPTELSAISTLYL的一端加四個半胱氨酸，三個甘氨酸以及一個磷 酸化的絲氨酸，其中位于多肽鏈的端側的一個半胱氨酸用軟脂酸酯((:1611310-)加以修飾，可 得到骨形態發生蛋白2活性肽3 ，其結構為Ci6H310- NH- CCCCGGGS[P04-KIPKASS VPTELSAISTLYL 。
3、 骨形態發生蛋白2活性肽在藥物制備中的應用，所述的骨形態發生蛋白2活性肽為 骨形態發生蛋白2活性肽1或骨形態發生蛋白2活性肽2或骨形態發生蛋白2活性肽3:其特征 在于該藥物用于治療促進骨再生、骨缺損修復。
全文摘要
一種骨形態發生蛋白2活性肽，其特征在于其結構為C<sub>16</sub>H<sub>31</sub>O-NH-CCCCGGGS<sup>[PO4</sup>]-KIPKASSVPTELSAISTLYL。它克服了現有BMP-2半衰期短，難以持續的發揮作用以及生產設備、制備工藝非常復雜，生產周期長，產率低，價格亦非常昂貴，難以大規模生產等不足。具有活性位點能充分暴露、其異位成骨能力較強；較易大規模合成，費用更低，穩定性更好，持續時間長等優點。本發明還同時公開了這種骨形態發生蛋白2活性肽的制備方法和應用。
文檔編號C07K1/06GK101273057SQ200680035405
公開日2008年9月24日 申請日期2006年10月19日 優先權日2005年10月27日
發明者劉建湘, 段德宇, 段智霞, 泉 袁, 鄭啟新, 郭曉東 申請人:華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院