專利名稱：：修飾的蜘蛛絲蛋白的制作方法修飾的蜘蛛絲蛋白本發明涉及修飾蜘蛛絲蛋白的方法和可通過所述方法獲得的蜘蛛絲蛋白。本發明還涉及編碼修飾的蜘蛛絲蛋白的核酸序列，包含所述序列的載體，和轉化所述載體的宿主細胞。此外，本發明涉及含有本文定義的修飾的蜘蛛絲蛋白的藥物或化妝品組合物，以及所述修飾的序列在各種領域10中的應用，特別是在醫藥、化妝品和技術應用領域中的應用。蜘蛛絲是顯示優越物理性質的蛋白聚合物。在不同類型的蜘蛛絲中，拖絲是被最集中研究的。拖絲的絲被圓網蜘蛛(orbweavingspiders)用于構建它們的網的框架和半徑并作為總是拖在后面的生命線。為了這些目的，需要高的拉伸強度和彈性。這些性質的組合導致比大多數其它已知材料的15韌性更高的韌性。拖絲的絲通常由兩種主要的蛋白組成，其主要結構具有共同的重復結構。一種圓網捕獲螺線，部分由鞭形腺體形成的粘絲組成，因此其叫作鞭形絲，是可延伸的，并且在斷裂前可以在長度上延伸3倍，但是僅僅提供拖絲的絲的一半的拉伸強度。20可以包含多到60個氨基酸的單重復單位的變化被重復數次來表示蜘蛛絲序列的最大部分。這些重復單位表示有限組的獨特的氨基酸基序。在所有的拖絲的絲重復單位中發現的一個基序是典型地6-9個丙氨酸殘基的結構單元。在絲線中，數種聚丙氨酸基序形成晶態的e-折疊堆積，產生拉伸強度。25富含甘氨酸的基序諸如GGX或GPGXX采用柔性的螺旋狀結構，其連接晶態區域并給線提供彈性。絲的體內裝配是引人注意的過程。蜘蛛的拖絲絲蛋白在所謂的主要的壺腹腺中以多到50。/。(w/v)的濃度貯存。盡管已經提出在主要的壺腹腺中關于這些蛋白質的"動態松散螺旋結構"，但是更近的數據提示對于所述30蛋白質的所謂A-區的隨機巻曲構象，其代表所述腺體的最大部分。高度濃縮的蛋白質溶液形成絲粘稠物(紡絲溶液(spinningsolution)),其顯示液態晶體的性質。線的裝配在粘稠物通過紡織導管的通道中開始，伴隨水、鈉和氯化物的提取。同時，易溶離子鉀(morelyotropicionspotassium)和磷酸鹽的濃5度增加，pH從6.9降到6.3。裝配最終由機械壓力引發，其由線被推出蜘蛛的腹部而引起。出于一些目的，天然絲線不能直接使用，而必須溶解并且再裝配成其它形態，諸如薄膜、泡沫、球體、納米纖維、水凝膠等。盡管蜘蛛絲蛋白的某些結構方面己經清楚，但是關于個體絲蛋白和它io們的主要結構元件對于裝配過程的貢獻則知道的很少。關于花園蜘蛛十字園蛛04ra"船^^emato)的兩種主要的拖絲絲蛋白，ADF-3和ADF-4的比較研究揭示，盡管它們的氨基酸序列非常相似，但是它們顯示顯著不同的溶解度和裝配特性:盡管ADF-3甚至在高濃度仍是可溶的，但是ADF-4實際上是不可溶的，并且在特定條件下自裝配為纖絲狀結構(未公開的結15果)。科學和商業利益促進了蜘蛛絲的工業規模生產的研究。由于蜘蛛的同種相殘，天然的蜘蛛絲生產是不切實際的，而人工生產在獲得足夠的蛋白質產量和出眾的線-裝配中遇到問題。細菌的表達產生低蛋白水平，這可能是由于在細菌和蜘蛛中不同的密碼子選用導致的。具有適應于表達宿主20的密碼子選用的合成基因導致更高的產量，但是其合成的蛋白質顯示與天然蜘蛛絲不同的性質。部分拖絲的絲cDNAs在哺乳動物細胞系中的表達確實產生了絲蛋白(例如ADF-3)，其可以以人工方式紡絲(spin)成"絲樣"的線，盡管在品質上仍舊很差。本發明人早期開發了用于在大腸桿菌(五.co/O中重組生產蜘蛛絲蛋25白的系統。例如，參考WO2006/008163(其要求美國臨時申請號60/590,196的優先權)。在這種表達系統中，單個結構單元(=組件)可以自由變化，因此可以適合特別情形的需要。這種類型的組件還在Hiimmerich,D.,Hdsen,C.W.,Oschmann，J.,Rudolph,R.禾口Scheibel,T.(2004):"Primarystructureelementsofdraglinesilksandtheircontributiontoproteinsolubility30andassembly(拖絲的絲的主要結構元件和它們對蛋白質溶解和裝配的貢獻),腸c/z簡勿(生物化學)43,13604-13612"中公開。特別關于蜘蛛絲蛋白在醫藥領域的應用的高度相關性的一個目的是藥物、蛋白、化學制品等與這些蜘蛛絲蛋白的共價偶聯。然而，迄今為止，尚未知令人滿意的技術，所述技術一方面允許這些物質與蜘蛛絲蛋白以預5先確定的量偶聯，并且另一方面，在所述蜘蛛絲蛋白內預先確定的位置偶聯。因此，本發明的一個潛在的目的是提供一種制備修飾的蜘蛛絲蛋白的方法，所述方法可以用于將物質如藥物、金屬、多肽、多糖、標記分子、量子點(quantumdots)、核酸、脂質等與這些蜘蛛絲蛋白靶向偶聯。本發10明的另一個目的是提供這樣修飾的蜘蛛絲序列，其可以用于攜帶并且遞送精確量的這些物質，并且其中所述的這些物質在所述蜘蛛絲蛋白序列內預先確定的位置偶聯。這一目的通過獨立權利要求的主題而得以實現。優選的實施方案包含在從屬權利要求中。15在這方面的主要興趣是在蜘蛛絲分子中結合氨基酸，所述氨基酸具有化學上特殊的氨基酸側鏈，在這種情形中為半胱氨酸的硫醇基或賴氨酸的氨基。迄今為止已經描述的蜘蛛絲蛋白的上文提及的組件中沒有一種包含半胱氨酸或賴氨酸，因此，個別核酸序列的特異性誘變允許將需要的氨基酸以可控方式結合到所述組件序列中。以這種方式修飾的組件可以裝配成20新的構建體，因此，通過組合單一的組件，還可以將多于一種的化學活性劑或藥物組合在一種單一的構建體中。因此，試劑與重組蜘蛛絲蛋白的特異性多次偶聯首次可行。除了基本組件的修飾之外，另外存在通過TAGs方式將化學反應性氨基酸與現有的構建體偶聯以活化或修飾其的機會。25如上文提及，本發明人自己產生與蜘蛛絲蛋白類似并且具有這樣的特性的蛋白的有效生產方法，所述特性可以特異性地受到允許將單一DNA序列組件以可控方式裝配到合成基因中的克隆策略的影響(Hiimmerich等,2004)。所述單一組件不被外來DNA序列間隔，如同在現有技術克隆系統中的情形。在目前所用的克隆系統中，例如，可以使用克隆載體pAZL(由30本發明人研發)，其包含確定的克隆盒(圖1)。這一克隆盒最重要的元件是兩種限制性核酸內切酶(BseRI和Bsgl)的識別序列，所述其限制性位點分別位于遠離各自的識別序列8和14個核苷酸處。這允許翻譯起點和終止密碼子的排列以及在合成基因之前或之后直接結合其它限制性位點。在BseRI和BsgI限制性位點之間，在克隆盒中存在間隔區，其將在5后續步驟中先被單一序列組件取代，并且而后被合成的基因取代。在所述后續步驟中將保持所述單一元件的排列(參見圖1)。形成本發明起點的單體序列組件的基礎是蜘蛛十字園蛛的基因ADF3和ADF4以及蜘蛛棒絡新婦蛛(A^fe7ac/"v^^)的基因FLAG。所用ADF3和ADF4序列的變化公眾可用(在登記號U47855和U47856下可用)。前io兩種基因(ADF3和ADF4)編碼形成蜘蛛的拖絲線的蛋白，第三種編碼鞭形絲的蛋白。基于這些蛋白的氨基酸序列，設計幾種組件20從這些氨基酸組件裝配合成的蜘蛛絲蛋白構建體。其中這些組件和由其衍生的蜘蛛絲蛋白特別在本發明修飾蜘蛛絲蛋白的方法中形成原材料。所述克隆盒的結構允許兩種組件或組件多聚體在每種情形中的任意裝配。這種情況參見圖2，其顯示DNA-組件多聚化的實例。在本發明中，提供一種一些試劑與蜘蛛絲蛋白的偶聯系統，這使得可25以同時進行不同的偶聯反應并且沒有高昂的工作支出。這是偶聯的蜘蛛絲蛋白的潛在工業應用和生產的極其重要的需要。為了實現這一目的，修飾所選擇的蜘蛛絲蛋白組件，以在選擇的氨基酸位置引入具有化學上不同的側鏈的氨基酸。最近引入的氨基酸是賴氨酸和半胱氨酸。30本發明特別涉及下面的方面和實施方案組件A:組件C:組件Q:組件K:組件sp:組件X:組件Y:GPYGPGASAAAAAAGGYGPGSGQQ(SEQIDNO:1)GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGP(SEQIDNO:3)GPGQQGPGQQGPGQQGPGQQ(SEQIDNO:2)GPGGAGGPYGPGGAGGPYGPGGAGGPY(SEQIDNO:4)GGTTIIEDLDITIDGADGPIT1SEELTI(SEQIDNO:5)GGAGGAGGAGGSGGAGGS(SEQIDNO:6)GPGGAGPGGYGPGGSGPGGYGPGGSGPGGY(SEQIDNO:7)9按照第一個方面，提供修飾蜘蛛絲蛋白的方法，其包括下列步驟a)提供編碼不包含賴氨酸或半胱氨酸殘基的蜘蛛絲蛋白或其片段的核酸；b)用編碼賴氨酸或半胱氨酸的核酸序列取代編碼所述蜘蛛絲蛋白5中一個或多個氨基酸的核酸，和/或為所述序列加入含有編碼賴氨酸和/或半胱氨酸的核酸的核酸序列；c)在適當的宿主中表達在b)中獲得的修飾的核酸序列，和d)回收所表達的修飾的蜘蛛絲蛋白。上述方法是生產本發明修飾的蜘蛛絲蛋白的最有效的方法。然而，例10如，還可能通過提供不含賴氨酸或半胱氨酸殘基的蜘蛛絲蛋白或其片段(以蛋白形式)，并且將除其它氨基酸外含有賴氨酸和/或半胱氨酸的氨基酸TAG化學偶聯(或添加)到所述蜘蛛絲蛋白而生產所述修飾的蜘蛛絲蛋白。此外，上述方法還包括通過取代設計修飾的蜘蛛絲蛋白編碼序列和隨15后將含有編碼賴氨酸和/或半胱氨酸的核酸的核酸序列添加到所述序列的選擇。步驟a)中所用的蜘蛛絲蛋白的種類和來源不受限制，只要它滿足不含賴氨酸或半胱氨酸殘基的需要。它們是天然來源的還是人工序列不起任何作用。20當用于本文時，術語"片段"是指具有約5-50個氨基酸殘基優選10-40個，例如20-30個氨基酸殘基長度的蜘蛛絲蛋白(不管是人工的/合成的或天然來源的)部分。按照一個優選的實施方案，本發明還包括將其它物質偶聯到所述修飾的蜘蛛絲蛋白中所述賴氨酸和/或半胱氨酸分子上。如上文提及，這將導25致所述物質與蜘蛛絲蛋白可控的和靶向的偶聯模式。在步驟b)中取代的一個或多個氨基酸優選地選自由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和蘇氨酸組成的組。它們通常不會不適當地改變獲得的修飾的蜘蛛絲蛋白，關于裝配行為等。要偶聯到在所述修飾的蜘蛛絲蛋白中包含的所述賴氨酸和/或半胱氨30酸殘基上的物質優選地選自由多肽、多糖、標記分子、量子點、金屬、核酸、脂質和低分子藥物組成的組。例如，納米金顆粒可以通過化學接頭偶聯到半胱氨酸殘基上。在這種情形中，與半胱氨酸硫醇基的共價偶聯通過所述接頭的馬來酰亞胺或碘代乙酰胺基團實現。基本上，能夠共價結合賴氨酸的氨基或半胱氨酸的硫醇5基的所有物質都可以偶聯。優選地，所述低分子藥物選自含有羧基、羰基、亞氨基或硫醇基的藥物。藥物的非限制性選擇是雙氯芬酸，吲哚美辛(indomethacine),托美汀(tolmetine),布洛芬(ibuprofene)，氟比洛芬(flurbiprofene),非i若洛法芬(fenoprofene),萘普生(naproxene),酮洛芬(ketoprofene)，青io霉素類，或頭孢菌素類(cephalosporines)。優選地，在a)中提供的蜘蛛絲蛋白是基于拖絲和/或鞭形蛋白。例如，所述蜘蛛絲序列可以來源于圓網蜘蛛(園蛛科(Amneidae)和Amneoids)。更優選地，所述蜘蛛絲蛋白來源于一種或多種下列蜘蛛希氏尾園蛛(Arachnurahigginsi),Araneuscirculissparsus，十字園蟲朱，Argiopepicta,條15帶園蛛(BandedGardenSpider)(三帶金蛛(Argiopetrifasciata)),Batik花園網蛛(BatikGoldenWebSpider)(星絡新婦蛛(Nephilaantipodiana)),Beccari's帳篷蛛(Beccari'sTentSpider)(Cyrtophorabeccarii),鳥糞蛛(Bird-droppingSpider)(Celaeniaexcavata),黑白牽束蟲朱(Black-and-WhiteSpinySpider)(庫氏棘腹蛛(Gasteracanthakuhlii)),黑黃園蛛20(Black-and-yellowGardenSpider)(Argiopeaurantia),《荒星錘蛛(BolasSpider)(Ordgariusftircatus)，流星錘蛛-巨蜘蛛(BolasSpiders-MagnificentSpider)(Ordgariusmagnificus),棕色水手蛛(BrownSailorSpider)(嗜水親j園蛛(Neosconanautica)),棕腿蛛(Brown-LeggedSpider)(Neosconamfofemorata),帶帽黑頭蛛(CappedBlack-HeadedSpider)(帆楚蛛(Zygiella25calyptrata)),普通園蟲朱(CommonGardenSpider)(Parawixiadehaani),普通圓蛛(CommonOrbWeaver)(Neosconaoxancensis),蟹樣棘圓蛛(Crab-likeSpinyOrbWeaver)(Gasteracanthacancriformis(elipsoides)),彎曲棘蛛(CurvedSpinySpider)(Gasteracanthaarcuata),皿云斑蛛(Cyrtophoramoluccensis),Cyrtophoraparnasia,Dolophonesconifera,30Dolophonesturrigera，Doria's束束蛛(Doria'sSpinySpider)(Gasteracanthadoriae),雙點棘蛛(Double-SpottedSpinySpider)(Gasteracanthamammosa)，雙尾帳篷蛛(Double-TailedTentSpider)(方格云斑蛛(Cyrt叩horaexanthematica)),塞若尖腹蛛(Aculeperiaceropegia)，Eriophorapustulosa,FlatAnepsion(Anepsiondepressium),四棘寶石蛛(Four-spinedJewel5Spider)(Gasteracanthaquadrispinosa),花園圓網蛛(GardenOrbWebSpider)(Eriophoratransmarina)，巨大地衣網蛛(GiantLichenOrbweaver)(Araneusbicentenarius)，金色網蛛(GoldenWebSpider)(Nephilamaculata)，Hasselt's棘蛛(Hasselt'sSpinySpider)(Gasteracanthahasseltii),Tegenariaatrica，Heurodesturrita,IslandCyclosaSpider(島艾蛛(Cyclosainsulana))，io寶石或棘蛛(JewelorSpinySpider)(Astracanthaminax),腎形園蛛(KidneyGardenSpider)(麗園蛛(Araneusmitificus)),Laglaise's園蛛(Laglaise'sGardenSpider)(Eriovixialaglaisei),Long-BelliedCyclosaSpider(Cyclosabifida),MalabarSpider(Nephilengysmalabarensis),多色圣安德魯十字蛛(Multi-ColouredStAndrew'sCrossSpider)(多色金蛛(Argiopeversicolor)),15觀賞性樹干蛛(OrnamentalTree-TrunkSpider)(裂腹蛛(Herenniaornatissima)),卵形圣安德魯十字蛛(OvalSt.Andrew'sCrossSpider)(好勝金蛛(Argiopea函la)),紅帳篷蛛(RedTentSpider)(單色云斑蛛(Cyrtophoraunicolor)),俄羅斯帳篷蛛(RussianTentSpider)(Cyrtophorahirta),圣安德魯十字蛛(SaintAndrew'sCrossSpider)(凱氏金蛛(Argiope20keyserlingi)),猩紅阿秋蛛(ScarletAcusilas)(猩紅阿秋蛛(Acusilascoccineus))，銀色金蛛(SilverArgiope)(Argiopeargentata),棘背圓蛛(SpinybackedOrbweaver)(Gasteracanthacancriformis)，斑點圓蛛(SpottedOrbweaver)(Neosconadomiciliomm)，圣安德魯十字(St.Andrews)Cross(Argiopeaetheria),圣安《惠魯十字蛛(St.Andrew'sCrossSpider)(Argiope25Keyserlingi),樹干蛛(Tree-StumpSpider)(無鱗波蛛(Poltysillepidus)),三角蛛(TriangularSpider)(Arkysclavatus),三角蛛(Arkyslancearius)，雙棘蛛(Two-spinedSpider)(Poecilopachysaustralasia),絡新婦蛛屬(Nephila)物禾中，例如棒絡f婦跌(Nephilaclavipes)，Nephilasenegalensis,Nephilamadagascariensis和更多(對于另外的蜘蛛物種，還見下文)。30最優選地，拖絲蛋白衍生于十字園蛛，并且鞭形蛋白衍生于Nephilaclavipes。優選的拖絲序列是ADF-3和ADF-4。術語ADF-3/-4用于由十字園蛛產生的MaSp蛋白的情形中(十字園蛛絲心蛋白-3/-4)。這兩種蛋白質，ADF-3和4屬于MaSpII蛋白(主要壺腹狀spidroinII)種類。5按照另一個實施方案，所述片段是組件，其中所述組件包括一個或多個含有多聚丙氨酸的共有序列。這種含有多聚丙氨酸的共有序列優選地衍生于ADF-3，并且具有氨基酸序列SEQIDNO:1(組件A)或其變體。按照另一個實施方案，所述片段是衍生于ADF-3的組件，并且包括氨基酸序列SEQIDNO:2(組件Q)或其變體。還考慮上述組合的序列(和io本文提及的所有其它組件)。例如，在步驟a)中提供包含一個或多個(AQ)禾口/或(QAQ)的片段。優選地在這種情形的蜘蛛絲蛋白包含(AQ)n、(AQ)24、(QAQ)s或(QAQ),6。因此，用于本發明的具體的組件還可以彼此組合，即，本發明還包括組合A和Q、Q和C等的組件(重復單位)。盡管不限制要引入蜘蛛絲蛋15白的組件數目，但是優選地為每種重組蛋白應用許多合成的重復序列的組件，其數目優選地在5-50個組件，更優選地10-40個，和最優選地15-35個組件的范圍。另一種優選的組件衍生于ADF-4，并且包括氨基酸序列SEQIDNO:3(組件C)或其變體。可以在a)中提供的組合序列可以優選地包含C,6或C32。20優選的衍生于鞭形蛋白的組件是組件K(SEQIDNO:4)、組件sp(SEQIDNO:5)、組件X(SEQIDNO:6)、和組件Y(SEQIDNO:7)。優選的組合包括Y8,Y16,X8,X16，K8,K16或Y6X2sPlK2Y2。下列新組件通過本發明的方法的方式產生，并且是特別優選的實施方案25用于拖絲蜘蛛絲的組件組件Ac:GPYGPGASAAAAAAGGYGPGCGQQ(SEQIDNO:8)ggtccgtacggcccaggtgetagegecgcagcggcagcggetggtggctacggtccgggctgcggccagcag組件AK:GPYGPGASAAAAAAGGYGPGKGQQ(SEQIDNO:9)ggtccgtacggcccaggtgetagegecgcagcggcagcggetggtggctacggtccgggcaaaggccagcag組件Cc:GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPCGPGGYGPGGP(SEQIDNO:10)30cgttctagegcggetgcagecgcggcagetgcgtecggcccgggtggctacggtccggaaaaccagggtccttgcggcccgggcggctacggtccaggtggtcca101520組件CKI:GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPKGPGGYGPGGP(SEQIDNO:n)cgttctagegcggetgcagccgcggcagctgcgtccggcccgggtggctacggtccggaaaaccagggJcca咖ggcccgggtggctacggtcctggcggtccg組件CK2:GSSAAAAAAAASGPGGYGPKNQGPSGPGGYGPGGP(SEQIDNO:12)cgttctagegcggctgcagccgcggcagctgcglccggcccgggtggctacggtCCgaaaaaccagggtccatctggcccgggtggctacggtcctggcggtccg組件CKC:GSSAAAAAAAASGPGGYGPKNQGPCGPGGYGPGGP(SEQIDNO:13)cgtletagegcggctgcagccgcggcagctgcgtccggcccgggtggctacggtccgaaaaaccagggtccatgcggcccgggtggctacggtcctggcggtccg用于鞭形蜘蛛絲的組件組件spc:GGTT11EDLDIT1DGADGPITICEELTI(SEQIDNO:14)ggtggcaccaccateattgaagatctggacateactattgatggtgcggacggcccgateacgatetgcgaagagctgaccate組件spK:GGTTIIEDLDITIDGADGP1TIKEELTI(SEQIDNO:15)ggtggcaccaccateattgaagatctggacateactattgatggtgcggacggcccgateacgateaaagaagagctgaccate組件Xc:GGAGGAGGAGGCGGAGGS(SEQIDNO:16)ggtggcgctggtggcgccggtggcgcaggtggctgcggcggtgcgggcggttcc組件XK:GGAGGAGGAGGKGGAGGS(SEQIDNO:17)ggtggcgctggtggcgccggtggcgcaggtggcaaaggcggtgcgggcggttcc組件Yc:GPGGAGPGGYGPGGSGPGGYGPGGCGPGGY(SEQIDNO:18)ggtccgggcggtgcgggcccaggtggctatggtccgggcggttctgggccgggtggctacggtcctggcggttgcggcccgggtggctac組件YK:GPGGAGPGGYGPGGSGPGGYGPGGKGPGGY(SEQIDNO:19)ggtccgggcggtgcgggcccaggtggctatggtccgggcggttctgggccgggtggctacggtcctggcggtaaaggcccgggtggctac這些組件可以與其它組件/蜘蛛絲蛋白目的性組合，以實現特異性修飾。作為組合的可能性的一個實例，應用構建體C,6。在這一方面，利用25組件Ce的可能的構建體可如下C^C「C廣r。C。rC。。rCrrC。戶CA7VAyv16匕,匕匕16,匕8匕匕8,。16,匕S^8，匕8。8,^4匕8。4,匕4^8^4,寺寺。在這些構建體中，通過半胱氨酸的硫醇基以及通過賴氨酸的氨基可以實現可控制的和靶向的偶聯。例如，通過將Ce與組件CK'組合，存在可30能性將適當的物質偶聯到半胱氨酸的硫醇基上和賴氨酸側鏈的氨基上。優選的構建體可以設計如下例如，將兩個氨基酸引入到一個單一的組件(組件CKe)中，其進一步開放了可能性(存在許多構建體變體)。由于不能排除在單一情形中氨基酸變換可導致裝配特性的改變或導致構建體改良的特性，所以，作為進一步優選的備選方案，本發明涉及利5用特殊的TAGs。這些標記(例如在SEQIDNO:20-28中公開的TAG、s，下文)含有如前面提及的半胱氨酸或賴氨酸。TAG的序列這樣選擇，以致可以最大可能程度地排除與其余蛋白質的相互作用和裝配行為的影響。因此，按照一個優選的實施方案，在步驟d)中回收的修飾的蜘蛛絲蛋白包含SEQIDNO:8-19的一個或多個組件。o開發下列TAG、s，用于在蜘蛛絲構建體中優選的應用氨基端TAGsNHCYS':GCGGGGGGSGGGG(SEQIDNO:20)ggttgcggcggtggcggtggcggttctggtggcggtggcNHCYS2:GCGGGGGG(SEQIDNO:21)5ggttgcggtggcggtggcggtggcNHcvs3:GCGGSGGGGSGGGG(SEQIDNO:22)ggttgcggtggctctggtggtggcgggtecggaggcggtggcNHLYSI:GKGGGGGGSGGGG(SEQIDNO:23)ggtaaaggcggtggcggtggcggttctggtggcggtggcNHLYS2:GKGGGGGG(SEQIDNO:24)'"ggtaaaggtggcggtggcggtggc羧基端TAGsCH^s':GGGGSGGGGSGGCG(SEQIDNO:25)ggcggtggcggttctggcggtggcggttctggcggttgcggcCHCYSZ:GGGGSGGCG(SEQIDNO:26)ggcggtggcggttctggcggttgcggcCjjLysi:GGGGSGGGGSGGKG(SEQIDNO:27)ggcggtggcggttctggcggtggcggttctggcggtaaaggcCHLYS2:GGGGSGGKG(SEQIDNO:28)ggcggtggcggttctggcggtaaaggc還如上文提及，例如，可以應用下列不同的變體NHCYS1C16,C16CHCYS1，NHCYSIC16CHLYS'，NHLYS1C16CHCYS'，等等。5用賴氨酸或半胱氨酸取代在蜘蛛絲蛋白中編碼一個或多個氨基酸的核酸，可以導致在所獲得的修飾的蜘蛛絲蛋白的特性中的改變。為了避免不需要的修飾，熟練的技術人員知道怎樣選擇取代反應的具體位置，從而避免這些不需要的改變或者從而向所述蜘蛛絲蛋白序列中引入其它需要的特性。因此，特別優選地使用非疏水性氨基酸，所述非疏水性氨基酸是10中性的，例如，在氨基酸側鏈上不攜帶任何電荷。另外，要取代進入初始蜘蛛絲蛋白序列的氨基酸應該具有相似的大小，以避免由于新引進的氨基酸引起的空間位阻。因此，特別優選將絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或蘇氨酸用來被賴氨酸或半胱氨酸取代。因此，可以將編碼按照SEQIDNO:20-24的氨基端TAG禾卩/或SEQID5NO:25-28的羧基端TAG的核酸添加到在步驟d)中回收的修飾的蜘蛛絲蛋白上或添加到在步驟a)中提供的蜘姝絲蛋白上。如上文所解釋，本文公開的氨基酸序列不限制于在SEQIDNos中提供的確切的序列。本文所示的氨基酸序列還包括變體。因此，本發明的蛋白質的氨基酸序列還包括通過氨基酸插入、刪除和取代而不同于本文公開20的序列的所有序列。優選地，氨基酸"置換(substitution)"是一種氨基酸被具有相似的結構和/或化學特性的另一種氨基酸取代，g卩，保守氨基酸取代的結果。氨基酸取代可以基于所涉及的殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性性質而進行。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、25亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；帶正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸；和帶負電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。"插入"或"刪除"典型地在約1-5個氨基酸，優選地約1、2或330個氨基酸范圍內。氨基酸添加典型地不超過100個，優選地不超過80個，更優選地不超過50個，最優選地不超過20個氨基酸，其添加在本發明的蛋白質上和/或插入其中。注意到本發明僅考慮這樣的添加，即，所述添加不會對本文公開的蛋白質需要的性質具有不利影響。可以通過使用重組DNA技術系統進行蛋白質中的氨基酸的插入、刪5除或置換并測試得到的重組變體的活性來實驗性地確定容許的變化。這不需要本領域技術人員進行超出常規的實驗。注意到所述方法另外可以包括通過適當的方法將在步驟d)中制備的所述蛋白質紡成纖絲、納米纖維和線的步驟。為了這一目的，可以應用本身為本領域內已知的紡絲方法。例如，蜘10蛛絲蛋白的粘稠物溶液通過噴絲頭擠壓形成生物纖絲。所獲得的生物纖絲可以被牽拉或拉伸。當在生物纖絲中存在分子的晶體狀和非晶形排列時，牽拉或拉伸將應用足以為分子定向的充分的剪切力，從而使得它們更加平行所述纖絲的壁，并且增加生物纖絲的拉伸強度和韌性。優選地，所述粘稠物溶液為至少1%,5%,10%，15。/。重量/體積(w/v)修15飾的絲蛋白。更優選地，所述粘稠物溶液如20%，25%,30%,35%,40%，45%:或50。/。w/v絲蛋白一樣多。在優選實施方案中，所述粘稠物溶液含有基本上純的修飾的蜘蛛絲蛋白質。在優選的實施方案中，所述粘稠物具有大約6.9的pH值。"粘稠物溶液"意指包含絲蛋白的任何液體混合物，并且易于擠壓而20形成生物纖絲或薄膜鑄塑。除了蛋白質單體之外，粘稠物溶液還可以包含更高級的團聚體，其包括，例如二聚體，三聚體和四聚體。通常，粘稠物溶液是pH4.0-12.0的水溶液并具有少于40。/。的有機或離液劑(w/v)。優選地，所述粘稠物溶液不包含任何有機溶劑或離液劑，但是可以包括添加劑來增加溶液的防腐性、穩定性或可使用性。25"纖絲"是指不確定長度的纖維，范圍從納米等級和極微的長度到一英里或更長的長度。絲(silk)是天然的纖絲，而尼龍和聚酯是作為合成纖絲的實例。關于怎樣紡織(spin)蜘蛛絲蛋白纖維的其它信息可以見于WO03060099(Karatzas等)，其公開于2003年7月24日，將其并入本文30作為參考。17此外，本發明的修飾的蜘蛛絲蛋白可以作為薄膜等進行提供，即作為對于其不需要紡絲步驟的蜘蛛絲蛋白產物進行提供。按照第二方面，本發明提供可以通過上述方法獲得的修飾的蜘蛛絲蛋白。5優選的修飾的蜘蛛絲蛋白還包括SEQIDNO:8-28的一個或多個組件。按照第三方面，提供編碼在本發明方法的步驟d)中獲得的修飾的蜘蛛絲蛋白或者編碼如上文提及的要求的修飾的蜘蛛絲蛋白的核酸序列。術語"核酸序列"是指核苷酸的雜聚物或這些核苷酸的序列。術語"核io酸"和"多核苷酸"在本文互換地使用指示核苷酸的雜聚物。雜交的嚴格性，當用于本文時，是指這樣的條件，在所述條件下，所述多核苷酸雙鏈體是穩定的。如本領域那些技術人員已知的，雙鏈體的穩定性是鈉離子濃度和溫度的函數(參見，例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual2ndEd.(分子克隆實驗室手冊第二版)(Cold15SpringHarborLaboratory(冷泉港實驗室)，(l989))。用于雜交的嚴格性水平可以由本領域那些技術人員容易地改變。當用于本文時，短語"適度嚴格條件"是指這樣的條件，其容許DNA結合于互補核酸，所述互補核酸與所述DNA具有約60。/。的同一性，優選地約75%的同一性，更優選地約85%的同一性；其中與所述DNA具有大20于約90%的同一性是特別優選的。優選地，適度嚴格條件是這樣的條件，其等價于在50%甲酰胺，5XDenhart's溶液，5XSSPE，0.2%SDS中于42'C進行雜交，隨后在0.2XSSPE，0.2。/。SDS,于65。C進行洗滌。第四方面涉及表達載體，其包括上文定義的核酸序列和一種或多種調控序列。這種表達載體優選地包括一種或多種調控序列。術語"表達載體"25通常是指用于從DNA(RNA)序列表達多肽/蛋白質的質粒或噬菌體或病毒或載體。表達載體可以包含轉錄單位，其包含(l)遺傳元件或在基因表達中具有調控作用的元件，例如啟動子或增強子，(2)被轉錄成mRNA并翻譯成蛋白質的結構或編碼序列，和(3)適合的轉錄起始和終止序列的組合。傾向于用在酵母或真核生物表達系統中的結構單位優選地包括能夠使宿30主細胞胞外分泌翻譯的蛋白質的前導序列。備選地，當在無前導或轉運序列的情況下表達重組蛋白時，其可以包括氨基端甲硫氨酸殘基。隨后該殘基可以或可以不從表達的重組蛋白上裂解而提供最終的產物。所述載體優選是質粒或病毒載體，優選地是桿狀病毒載體系統或痘苗病毒載體系統。還可以在本發明中使用其它病毒載體系統。根據不同的情5況，可能需要對載體進行修飾。其它病毒載體的實例是腺病毒和所有的負鏈RNA-病毒，例如狂犬病毒、麻疹病毒、RSV、等。可以使用的遺傳構建體可以克隆在不同的商購表達載體中，例如pET(Novagen,麥迪遜，威斯康辛州，美國)或pQE-系統(QiagenGmbH,希爾敦(Hilden),德國)中。通過特別選擇載體或用于克隆的限制性酶，可以10將不同蛋白TAGs附著到蛋白上'(例如，T7-標記(Novagen,麥迪遜，威斯康辛州，美國)或6x組氨酸(6xhistidin)-標記)。此外，人們可以在不同的啟動子(例如T7或T5)之間進行選擇。優選地，所述載體包括編碼修飾的蜘蛛絲蛋白的上述核酸序列，并且優選地衍生于SEQIDNO:29的克隆載體(克隆載體pAZL)或其變體。20tgtcgagaagtactagsggstcataatcagCC3t3CC3C3tttgtsgsggttttacttgc60tttaaaaaacctcccacscctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcatattgttgt120tgttcttgtttattgcagcttataatggagcaatagca180gcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgt240atcttatcatgtctggatctgatcaictgcttgagcctaggsgatccg站ccageitaagtg300aaatctsgttccaaactattttgtcatttttsattttcgtattagcttacgacgctacac360ccagttcccatctattttgtcactcttcccttaaa站ctccatttccacc42010152025cctcccagttcccaactattttgtccgcccscaigcggggcattttttcttcctgttatgtt480catcctgccaactccatgtgacaaaccgtcatcttcggctactttttctc540tgtcacaggatgaa-3att_tt一tctgtcatct—cttcgt.tat.taatgtttgtaat.tgactgaa-600tatcaacgcttatttgcagcctgaatggcgsatgggacgcgccctgtagcggcgcattsa660gcgcggcgggtgtggtggtt5tcgcgcaigcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgc720ccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag780ctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacc仁cg3cccc3840ttagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttc900gccctttgacgttggsgtccacgttctttaatsgtggactcttgttccaa960C5CtC33CCCteitctcggtctattcttttgatttat3agggattttgccgatttcggcct1020attggttaaasaatgagctgaatttaacgcgaattttascaaaatattaa1080cgtttacaatttcaggtggcacttttcggggsaatgtgcgcggsscccctatttgtttat1140ttttctaaiat3tgtstccgcataaccctgataaatgcttc1200eiataatattgagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttsttccct1260tttttgcggcsttttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtg1320atgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggta1380agatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttc1440tgctstgtggtcccgtattgscgccgggcsagagcaactcggtcgccgca1500tacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcatcttacgg1560atggcatgacttatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcgg1620ccaacttacttctga^ca^cgrstcggaggaiccgaaggagctaaccgcttttttgcacaaca1680tgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaa1740tgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaa1800ctggcgsactacttactctagcttcccggcaaceiattaatagactggatggaggcggata18S0aagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaat1920ctggagccggtgsgcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggteiagc1980cctcccgt3tcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatgga仁2040gscagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagttt2100actcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatctaggtga2160agatcctttttgatMtctctccct仁aacgtgagttttcgttccactgsg2220cgtc6Lgaccccgtag貼asgatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtas2280tctgctgctt貼51cc3ccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcsag23401015agctaccaactctttttccgaaggtsactggcttcagcagagcgcagataccaaatactg2400tccttctagtgtagccgtagttaggccaccctctgtagcaccgcctacat2460acctcgctctgctaatcctgttsccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtctta2520ccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggg2580gttcgtgcacacsgcccsgcttggsgcgaacgscctacsccgaactgeigatacctacagc2640gtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaa2700gcggcagggtcggaacaggagsgcgcacgagggsgcttccaggggg貼acgcctggtatc2760tttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgaicttgsgcgtcgatttttgtgatgctcgt2820caggggggcggagcctatgggcsscgcggcctttttacggttcctggcct2880tttgctggccttttgctcscstgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataacc2940gtattaccgcctttgagtgagctgstaccgctcgccgcagccgsscgsccgagcgcagcg3000agtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgaitgcggtsttttctccttacgcatctgt3060gcggtatttcacsccgcagaiccsgccgcgtaacctggcaaggttgagtaa3120taaatggatgccctgcgta3gcgggtgtgggcggacaatactgaacasaa3180tagatcgaggaggatccatgggacgasLttcacggctaatgaaagcttactgcacaigct3238本發明的第五方面涉及宿主，其已經用上述載體進行了轉化。所述宿主可以是原核生物細胞，優選大腸桿菌或枯草芽孢桿菌(^^7/w20w6"to)。例如，合成基因的表達可以在大腸桿菌^72或大腸桿菌B細胞中進行。表達的產量可以為每升細菌培養物約1g純化的蛋白質。所述宿主還可以是真核細胞，例如哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞或昆蟲細胞。優選地，它可以是CHO，COS,HeLa,293T，HEH或BHK細胞，酵母細胞(例如，釀酒酵母OSacc/^omF"cwevz'w'ae)，粟酒裂殖25酵母(Sc/n'zo騰c/iamm戸s;謂6e)，巴其萬德畢赤酉孝母(P油'a戸加&)，白念珠菌(Cawfeiba/6/cam0,多遜漢森酵母(7/araeww/a/o/_ymor//za))，昆蟲細胞，其選自鱗翅目(丄印W^fera)昆蟲細胞、優選選自草地貪夜蛾(&oob,ra如g—油)禾口選自粉夜蛾(7Wc—/固.am.)、更優選地Sf9、Sf21或高效(highfive)細胞，或植物細胞，優選地來自于煙草、馬鈴薯、30玉米、豌豆和番茄的植物細胞。昆蟲細胞表達系統，例如相對于細菌系統的一個優勢在于這樣的事實，即產生的蛋白質被糖基化，由此作為微生物降解的靶點。這種性質例如在醫藥領域，每當絲蛋白質傾向于其中需要生物降解的體內應用時，可能是重要的。這種性質可以特別應用在縫線材料和傷口閉合和覆5蓋系統中。在第六方面，本發明涉及由上述修飾的蜘蛛絲蛋白制成的纖維/線或纖絲。本文定義的蛋白、線、纖絲、薄膜、泡沫、球、納米纖維、水凝膠等可以用于生物技術和/或醫藥領域，優選地用于制備傷口閉合或覆蓋系10統，用在神經外科手術或眼科外科手術的縫線材料中。此外，所述蛋白/線可以優選地用于制備替代材料，優選地人造軟骨或腱材料。另外，本發明的線/纖維可以用于制備醫學裝置諸如醫學粘附帶，皮膚移植物，替代的韌帶，和外科手術網眼；和用于制備廣泛范圍的工業和商業產品，諸如衣服織物，防彈衣襯里，容器織物，包或錢包帶，纜，15繩，粘附性結合材料，非粘附性結合材料，皮帶材料，汽車覆蓋物和部件，飛行器構建材料，抗風化材料，柔性隔離材料，運動設備；以及事實上，在需要高拉伸強度和彈性特性的纖維或織物的幾乎任何應用中。本發明還意欲以其它形式存在的穩定的纖維產品，諸如干的噴霧涂層、珠樣顆粒的適應性和應用，或在與其它組合物的混合物中的應用。20如上文所提及，藥物物質可以通過它們的半胱氨酸/賴氨酸殘基偶聯到本發明修飾的蜘蛛絲蛋白上。特別地，這些偶聯的蛋白可以用于上述目的。例如，這樣偶聯的蛋白的一種預見的應用是制造縫合材料或傷口覆蓋系統，其使得抗生素或消炎藥物附著到制成它們的蛋白/線上。應該明確注意到，本發明修飾的蜘蛛絲蛋白的最優選的應用是制造和25加工衣服織物(紡織品)和皮革，汽車覆蓋物和部件，飛行器構建材料以及制造和加工紙。本發明的修飾的蜘蛛絲蛋白可以添加纖維素和角蛋白和膠原蛋白產物，并且因此，本發明還涉及包含纖維素和/或角蛋白和/或膠原蛋白和本發明的蜘蛛絲蛋白的紙或皮膚護理和頭發護理產品。其中結合了本發明的蛋白的紙和皮膚護理和頭發護理產品顯示出改善的特性，特別是提高的拉伸強度或撕扯強度。此外，本發明的修飾的蜘蛛絲蛋白可以用作紡織品和皮革制品的涂層，由此賦予被涂布的產品以穩定性和耐久性。絲蛋白特別顯示對于涂5布皮革制品的應用性，由于在這種情形中，可以避免或至少減少鞣革及其對環境的負作用。它們還可以用于食品包裝或電子裝置，例如，用在電池中。使用由所述修飾的蜘蛛絲蛋白制成的薄膜進行的實驗表明在浸入電池酸中后它們對酸的抗性和穩定性。10在第七方面，本發明提供含有上文定義的修飾的蜘蛛絲蛋白和藥用載體的藥物或化妝品組合物。本發明還通過附圖進一步舉例說明，其中圖1顯示用于本發明的克隆盒的示意性結構。圖2舉例說明本發明的DNA組件的多聚化的實例。15圖3顯示修飾的蜘蛛絲蛋白的分析。樣品用(+)或不用(_)還原齊lj(2-巰基乙醇)進行分析。(A)在用抗-T7-標記抗體進行蛋白質印跡后檢測重組絲蛋白的T7-標記。(B)將蛋白質進行SDS-PAGE，隨后進行銀染。(C)分別用275nm或295nm的激發波長顯示純化的C16CC(直線)、NHeYS3C16(長虛線)和CeC16(點虛線)的熒光發射光譜。在295rnn的激20發表明不存在色氨酸熒光。因此，所述蛋白樣品不表現出任何可檢測到的細菌蛋白的污染。圖4顯示修飾的蜘蛛絲蛋白的二級結構分析。在2(TC記錄C16(直線)，C16CC(長虛線)，NHeYS3c,6(點和虛線)禾卩CeC16(點虛線)的CD光譜。圖5描述修飾的合成蜘蛛絲蛋白的聚集。在緩沖劑中，在(A)變化25的pH值或(B)變化的磷酸鉀濃度(見表2)條件下，溫育2小時后，確定蛋白質的聚集。對于C,6獲得的曲線用正方形表示，對于NHeY"C,6的曲線用圓圈表示，對于C^C,6用三角形，和對于C,6C^的曲線用倒三角形表示。圖6表示修飾的蜘蛛絲蛋白的裝配形式。(A)通過掃描電鏡(SEM)觀察的由C，6和修飾的蛋白形成的球體。(B)通過原子力顯微鏡觀察的納米纖維。(C)來自在HFIP中P/。w/vCaC,6溶液的薄膜鑄塑。圖7顯示由修飾的蜘蛛絲蛋白制成的蛋白質薄膜的CD光譜。(A)在薄膜鑄塑前分析在HFIP中的蛋白質溶液。(B)將薄膜從HFIP直接鑄塑到單色(plain)石英玻璃上，并通過CD光譜學進行分析。(C)來自用甲醇處理的HFIP的薄膜鑄塑的CD分析(對NEP"d6進行示例性顯示)。(D)來自甲酸直接鑄塑在單色石英玻璃上的薄膜的分析。由于在確定薄膜的厚度上的誤差，不能確定e證w。圖8描述羅丹明RefMC2馬來酰亞胺與NHeYSC16的偶聯。偶聯的蛋白通過SDS-PAGE進行分析。(A)蛋白通過銀染顯現。(B)羅丹明通過熒光成像而顯現。152025實施1實驗步驟//辨。如果沒有另外指出，化學品獲自默克KGaA(MerckKGaA)(達姆施塔特(Darmstadt),德國)。如前所述(/)進行DNA的操作和修飾。限制性酶獲自紐英倫公司(NewEnglandBiolabs)(貝弗利，馬薩諸塞，美國)，連接酶獲自普洛麥格生物科學公司(PromegaBiosciencesInc.)(圣路易斯-奧比斯波(SanLuisObispo),加利福尼亞，美國)。使用來自普洛麥格生物科學公司(圣路易斯-奧比斯波，加利福尼亞，美國)的試劑盒進行DNA純化。合成的寡核苷酸獲自MWG生物技術AG(Ebersberg，德國)。所有的克隆步驟在來自Novagen(麥迪遜，威斯康辛，美國)的大腸桿菌菌株DH10B中進行。獰參像游絲資伴,7^(^克虔，WZ丄載伴弘組件Cc(SEQIDNO:10)，通過使用組件C(SEQIDNO:3)作為模板核苷酸序列和引物pAZL-fwd(CACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGA)(SEQIDNO:30)禾口pAZLmut-revGGCCGCAAGGACCCTGG)(SEQIDNO:3l)通過PCR誘變產生。為了獲得最優化的引物，將初始組件C的一些密碼子突變(CCA(Pro24)突變為CCT(Pro),GGT(Gly28)突變為GGC(Gly),CCT(Pro32)突變為CCA(Pro),GGC(Gly33)突變為GGT和CCG(Pro35)突變為CCA(Pro))。在用爿/wNI和歷w/m消化后，將PCR-產物和pAZL載體(SEQIDNO:29)連接。組件NHCYS3(GCGGSGGGGSGGGG,ggttgcggtggctctggtggtggcgggtecggaggcggtggc)(SEQIDNO:22)通過將兩種合成的寡核苷酸NlGTGGCTAATGAA)(SEQIDNO:32)和N2(AGCTTTCATTAGCC(SEQIDNO:33)退火而產生。退火通過將50pmol/iil(每個)寡核苷酸溶液的溫度以0.1°C/S的增量從95。C下降到2(TC而完成。將錯配的雙鏈在70。C變性，然后再將溫度下降到2(TC。重復2(TC-7(rC-2(TC循環10次后，在65'C的變性溫度再進行10次循環。將得到的克隆盒與用5"wHI和消化的載體pAZL(SEQIDNO:29)連接。溝碧參像游合y^資^錄絲基厲。將兩個基因片段例如單一組件或組件聚合體連接代表克隆策略的基本步驟。為了這一目的，將含有指定的5'-端基因片段的pAZL載體用S犯/和^g/消化，同時將包含3'-端基因片段的載體分別用&ei/和&a/消化(圖1)。連接適當的質粒片段產生了兩個基因片段的連接，并且導致pAZL載體氨芐青霉素抗性基因(々/)的重建，所述氨芐青霉素抗性基因有利于鑒定正確的構建體。對于基因構建，將修飾的組件Ce(SEQIDNO:IO)或NHeYS3(SEQIDNO:22)與重復單位如C6連接。然后，用Sflm/7/禾I]歷^///將它們從pAZL載體上切下，并且與同樣消化的細菌表達載體pET21a(Novagen)連接，所述細菌表達載體pET21a提供T7-標記(MASMTGGQQMGR)(SEQIDNO:34)編碼序列(2)。所有構建體的保真度通過DNA測序進行證實。基^^表這。所有的絲基因都在大腸桿菌菌株BLR[DE3](Novagen)中表達。將細胞在LB培養基中在37。C生長至OD,=0.6-0.7。在用1mMIPTG(異丙基-fi-D-硫代半乳糖苷)培養后，分別在NHeYS3C16和C16Ce情形30中，將細胞轉換到25t:，且在C^d6情形中，轉換到3(TC。表達NHe^C的細胞在誘導3-4個小時后收集，而表達CeC16的細胞在4小時后收集，并且表達C16Ce的細胞在5小時后收集。^A質辨眾。將細胞用包含20mM1(2-羥乙基)哌嗪-#'-(2-乙磺酸)(HEPES)pH7.5,100mMNaCl,0.2mg/ml溶菌酶(希格瑪-Aldrich5(Sigma-Aldrich),圣路易斯(St.Louis),密蘇里(MO),美國)的5ml/g的緩沖液重懸，并在4X:溫育30分鐘。使用弗氏壓碎器(基本的Z型,APVDeutschlandGmbH,Liibeck,德國)通過高壓分解細胞。通過用0.1mg/ml脫氧核糖核酸酶I(羅氏(Roche),曼海姆(Mannheim),德國)和3mM的MgCl2在室溫下溫育細胞裂解物30分鐘來消化基因組DNA。于50,000xgo和4。C沉淀不可溶的細胞片段30分鐘。通過在80°C熱變性20分鐘，而將大腸桿菌裂解物的可溶性蛋白質沉淀下來。通過在50,000xg的30分鐘的沉淀去除沉淀的蛋白質。將在熱變性過程中仍舊可溶的絲蛋白用20%硫酸銨(800mM)在室溫進行沉淀，并通過在10,000xg離心10分鐘進行收集。沉淀物用8M尿素洗滌，并溶解在6M硫氰酸胍(GdmSCN)中。所15有的蛋白質針對10mMNH4HCO3進行透析。通過在50,000xg沉淀30分鐘來去除在透析過程中形成的沉淀物，并將余下的可溶性絲蛋白凍干。在分析前，將凍干的蛋白質溶解在6MGdmSCN中，隨后針對適合的緩沖劑進行透析。通過在125，000xg沉淀30分鐘去除聚集體。使用計算的消光系數(表1)(3)，在1cm通徑長的比色杯中于276nm通過光度法確定蛋20白質的濃度。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE;10。/。Tris-甘氨酸凝膠)，隨后在聚偏氟乙烯(PVDF)膜(密理博(Millipore)，比爾里卡(Billerica),馬薩諸塞，美國)上進行印跡法并使用小鼠抗-T7單克隆抗體(Novagen，1:10,000)作為一抗，使用抗-小鼠IgG過氧化物酶綴合物(希格瑪-Aldrich,l:5,000)作為二抗，而證實鑒定的蛋白質。使用來自安25瑪西亞生物禾斗學(AmershamBiosciences)(皮其ii卡塔市(Piscataway)，ff澤西，美國)的ECLP'us蛋白質印跡檢測試劑盒觀察過氧化物酶的活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表1:合成的蜘蛛絲的消光系數(按照Gill和HippdC5)計算)。資光。在FluoroMax3分光熒光計(喬平伊馮(JobinYvon)公司，埃迪遜，新澤西，美國)上記錄熒光光譜。在25'C在10mMNH4HCO3或105mMTris(羥甲基)氨基甲烷(Tris)/HC1(pH8.0)中記錄光譜。整合時間是1s，步長(stepsize)是0.5nm，帶寬分別是5nm(激發)和5nm(發射)。二級潛稱分析。使用裝備了溫度控制裝置(Jasco國際有限公司，東京,日本)的Jasco715分光偏振儀獲得遠紫外圓二色性(CD)光譜。于20°C，在0.1cm通徑長的石英比色杯中，以在10mMTris/HCl(pH8.0)中的150iolig/ml蛋白質濃度而記錄光譜。掃描速度是20nm/min，步長是0.2nm，整合時間設定為ls，且帶寬是lnm。將四次掃描平均，并緩沖液-校正。^^#/定。為了檢測蛋白分別在不同pH值和不同磷酸鹽濃度的溶解度，將凍干的蛋白溶解在6MGdmSCN中，并且在4'C針對10mMTris/HCl(pH8.0)進行透析。將所有的樣品在不同緩沖劑中(見下文)在室溫下15溫育2小時，通過在125,000xg沉降30分鐘，將蛋白質沉淀物從所述樣品中去除，并且通過光度法確定剩余的可溶性蛋白的量。由于可溶的和聚集的蛋白質的總量必須等于初始可溶性蛋白的量，所以可以通過將可溶性蛋白的量從最初使用的蛋白質的量中減去而計算聚集的蛋白質的百分比。作為對照，將蛋白在10mMTris/HCl(pH8.0)中溫育。20。H值的影響將蛋白溶液用不同pH值的緩沖劑(表2)1:IO稀釋。在皿^3(:16和(^<:16情形中，最終蛋白濃度為0.2mg/ml，且在C16Ce情形中為0.174mg/ml。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表2:應用的具有不同pH-值的緩沖液系統磷酸鹽濃度的影響將蛋白溶液以1:5稀釋在KxHxP04(pH8.0)中。最終蛋白濃度為0.45mg/ml，并且磷酸鹽濃度為50mM,100mM,200mM,300mM和500mM。羅丹欲與襲糜f嚴與藏,基錄疑。為了將小的有機化合物偶聯到修飾的蜘蛛絲蛋白上，將熒光染料羅丹明偶聯到蛋白NHGY"d6上。將在DMSO中的1mM羅丹明RedTMC2馬來酰亞胺(分子探針，萊頓(Leiden),荷io蘭)儲液添加到在10mMTris/HCl(pH7.5)中的蛋白質溶液中，以給予20的摩爾過剩。反應在黑暗處在4t:進行過夜。為了滅活剩余的未-偶聯的熒光染料，在進行大小排阻層析(PD10柱，葡聚糖凝膠G25,法瑪西亞生物技術(PharmaciaBiotech),烏普薩拉，瑞典)前向反應液中加入100mM2-巰基乙醇。收集級分，并且通過UV-光譜測定法檢測蛋白質的存在，且15最后通過SDS-PAGE進行分析。蛋白和熒光團的顯現分別通過銀染和通過熒光成像進行，熒光成像使用具有532nm激發波長和580nm發射波長的Typhoon9200可變型成像儀(分子動力學(MolecularDynamics),安瑪西亞法瑪西亞生物技術(AmershamPharmaciaBiotech),烏普薩拉，瑞典)進行。20結果夢像游合^##錄遂游沒^、合y^^7-絲眾。產生基于合成的蜘蛛絲組件C(SEQIDNO:3)的不同的修飾的組件，所述組件C衍生自花園蜘蛛十字園蛛的拖絲絲蛋白ADF-4。修飾在每種變體中包含一個半胱氨酸，其在25TAG中或在組件C中。在此處，由于兩種氨基酸相似的大小和極性，位置25的絲氨酸突變成半胱氨酸。另外，因為關于這種突變的疏水性預測只與組件C稍微不同，所以認為該位置沒有太多地影響蛋白特性。使用PCR誘變(參見實驗步驟)獲得得到的組件CC(SEQIDNO:10)。在隨后的步驟中，利用克隆載體pAZL(SEQIDNO:29)將組件Ce的核苷酸序列30克隆到編碼d6的核苷酸序列的上游或下游，產生蛋白C^d6和C16Ce。另外，將由甘氨酸、絲氨酸和一個半胱氨酸組成的編碼TAG(NEP^SEQIDNO:22)的寡核苷酸序列克隆到編碼CI6的5'-端核苷酸序列，以產生NHCYS3C16。在細菌合成之后，通過加熱步驟然后通過硫酸銨沉淀純化修飾的絲蛋5白。使用針對附著到所有絲蛋白的氨基末端的T7-肽標記序列的抗體，通過免疫蛋白印跡驗證蛋白的鑒定。應用未修飾的蛋白C，6進行比較。除了全長蛋白，觀察到具有更低分子量的痕量蛋白。與Cw相反，所有每種含有一個半胱氨酸的修飾的蛋白都在更高分子量處顯示出另一條蛋白條帶(圖3A和B"-")，所述蛋白條帶可以通過向樣品中加入還原劑如2-巰基io乙醇而去除(圖3B"+")。因此，它們代表由二硫鍵連接的蛋白二聚體。蛋白純度通過檢測熒光發射確定。275nm的入射光導致酪氨酸和色氨酸的激發和熒光發射。295nm的光專一地激發色氨酸。由于所設計的蜘蛛絲蛋白沒有一種包含色氨酸，所以當用295nm激發時的熒光發射將指示污染了大腸桿菌蛋白，其平均含有1.5%的色氨酸(4)。所有修飾的絲蛋白15制備物的熒光檢測揭示發射光譜與酪氨酸的光譜相似，所述酪氨酸大量存在于絲蛋白中。相反，沒有色氨酸熒光可被檢測到，這表示所述蛋白制備物的高純度(圖3C)。純蛋白的產量在每升培養基12-30mg范圍內。參像游Q鄉，錄絲表現幼與未參像游C/6/#廚游二級結/仏通過CD20光譜學研究二級結構。所有修飾的蛋白都表現出與C,6相似的光譜，C16表現出內部無結構蛋白質典型的光譜(圖4)。參像游CM#^#叢未參像游CM對錄麼i,p//^^^感。pH，離子如鉀和磷酸鹽，和機械壓力參與天然絲裝配。我們研究了與C,6比較不同的25磷酸鉀濃度和變化的pH值對修飾的蛋白CeC16、C,6(^和NHeY"C,6聚集行為的影響。所有修飾的蛋白都在低于5.0的pH值表現出顯著的聚集(〉10%)，CeC,6甚至在低于7.0的值表現出顯著聚集，并且在pHl表現出超過70%的聚集。相反，C16，只在這些條件下表現出中等程度的聚集(圖5A)。類似地，磷酸鉀在比關于C16所觀察到的那些更低的濃度導致修飾30的蛋白的聚集(圖5B)。由于它們的理論等電點與C16的等電點相同(NHCY"d6)或只是非常輕微的不同(對于CCd6為3.45和對于d6為3.48)，所以修飾的蛋白對于聚集的這種更大的敏感性不能由所述蛋白不同的電荷進行解釋。因此，這種作用可能是由于半胱氨酸的存在和形成穩定的二聚體的可能性。5修飾的合成蜘蛛絲蛋白的裝配衍生自蜘蛛絲序列ADF-3和ADF-4的合成的蜘蛛絲蛋白質可被裝配成形態上獨特的形式，如球體、納米纖維、泡沫和薄膜。進行下述實驗以證明關于不同的裝配行為修飾的蜘蛛絲蛋白表現出相同的特征。101.球體通過將2.4M的硫酸銨加入到在10mMTris-(羥甲基)-氨基甲烷(Tris)pH8.0中的1mg/mlCCC16,C16Ce,NHeYS3QanC,6溶液中來產生顯示直徑范圍在0.3到1.5tai之間的蛋白質球體(圖6A)。在由修飾的蛋白或d615形成的球體之間沒有觀察到顯著不同。2.納米纖維通過將在10mMTrispH8.0中的C16c3nNHGYS3C16溶液在4。C溫育數周然后在室溫溫育3天而形成納米纖維(圖6B)。203.薄膜由衍生自花園蜘蛛十字園蛛的拖絲絲蛋白ADF-4的合成的蜘蛛絲蛋白制成的薄膜可以從六氟-2-丙斷HFIP)或甲酸鑄塑(5)。將凍干的蛋白質直接溶解在HFIP中或甲酸中。如同關于d6觀察到的那樣，HFIP誘導修25飾的蛋白質Ced6，C,6Ce和NHeY"d6二級結構的增加。而這些蛋白在10mMTris(pH8.0)中的CD光譜只在低于200nm的波長表現出單一的最小值(圖4)，這是主要的隨機巻曲蛋白的指示，在HFIP中的蛋白溶液的CD光譜表現出在202-203nm的最小值和在220nm處的另一個肩峰，這是增加的(x-螺旋含量的指示(圖7)。30可以從HFIP和從甲酸鑄塑修飾的蜘蛛絲蛋白薄膜。薄膜鑄塑在聚苯30乙烯表面上，在所述表面上在溶劑蒸發之后它們可以容易地剝落(圖6C)。為了分析所述薄膜的二級結構，將0.01%W/V的蛋白溶液鑄塑到石英玻璃上。在溶劑蒸發后，檢測圓二色譜。從HFIP鑄塑的薄膜的光譜顯示在208nm和220nm的兩個最小值，這指示高a-螺旋含量(圖7)。為了使得薄5膜從HFIP水不溶物鑄塑(當與水接觸時，這樣鑄塑(as-cast)的薄膜易于溶解)，將它們用甲醇處理(5)。這種處理后，光譜表現出在218nm的單一最小值，這是富含(3-折疊的結構典型的(示例性為NHeY"C,6顯示，圖7)。當處理薄膜時在二級結構中的這種變化已經關于合成的蜘蛛絲薄膜進行了描述(5)。有趣地，從甲酸鑄塑的薄膜在它們的二級結構上不同，io這取決于所用的蛋白。盡管NH^^d6導致表現出富含!3-折疊的結構(在CD光譜中具有在218nm的最小值)的薄膜，如同對于C,6所述的(5)，但是來自(^(:16的薄膜的光譜表現出在208nm和220nm的兩個最小值。CwCe蛋白薄膜表現出具有在200nm的單一最小值的CD光譜。154.修飾的合成蜘蛛絲的標記用半胱氨酸或賴氨酸修飾合成的蜘蛛絲應該允許藥物、金屬、多肽、量子點等的特異性偶聯。為了證明半胱氨酸的SH-基團與小的有機分子的偶聯，將熒光團羅丹明偶聯到蛋白NHGY"d6上。羅丹明以馬來酰亞胺綴合的形式應用，其在pH7.0-7.5容易地并且非常特異性地與SH-基團反應。20有效的偶聯通過SDS-PAGE然后通過熒光成像和銀染顯現(圖8)。參考文獻1.Sambrook，J.和Russell,D.(2001」她/ec由c/纖'"g6^子克蘑9.252.Kroll，D.J.，Abdel-MalekAbdel-Hafiz,H.,Marcell，T.,Simpson,S.，Chen,C.Y.，Gutierrez陽Hartmann,A.，Lustbader,J.W.,禾口Hoeffler,J.P.(1993)Amultifunctionalprokaryoticproteinexpressionsystem:overproduction,affinitypurification,andselectivedetection(多功會g原核蛋白表達系統過量生產，親和純化，和選擇性檢測)，DA^Ce//^0/.f"DA^30潘應主激學J"^MSS-3.Gill,S.C.禾口vonHippel,P.H.(1989)CalculationofProteinExtinctionCoefficientsfromAmino-AcidSequenceData(從氨基酸序歹ll類女據計算蛋白質消光系數)，J加(K/ca/所oc/e附^^yf分析主笏眾學J/<52,319-326.54.Blattner,F.R.，Plunkett,G.，III,Bloch，C.A.,Perna,N.T.,Burland,V.，Ri]ey，M.，Collado-Vides,J.，Glasner，J.D.,Rode，C.K.，Mayhew,G.F.,Gregor，丄，Davis,N.W.，Kirkpatrick,H.A.,Goeden，M.A.,Rose,D.J.,Mau，B.,禾卩Shao,Y.(1997)ThecompletegenomesequenceofEscherichiacoliK-12(大腸桿菌K12的完整基因組序列)，6Wewce6^/學Jio277，1453-1474.'5.Slotta,U.，Tammer,M.,Kremer，F.,Koelsch,P.,Scheibel,T.(2006)Structuralanalysisofspidersilkfilms(蜘蛛絲薄膜的結構分析),Swpromo/ecw/arc/zew^^y(^Mpromo/ecM/ar^^f眾學J18,465-471.權利要求1.修飾蜘蛛絲蛋白的方法，其包括步驟a)提供編碼不包含賴氨酸或半胱氨酸殘基的蜘蛛絲蛋白或其片段或變體的核酸；b)用編碼賴氨酸或半胱氨酸的核酸序列取代編碼所述蜘蛛絲蛋白中一個或多個氨基酸的核酸，或為所述序列加入含有編碼賴氨酸和/或半胱氨酸的核酸的核酸序列；c)在適當的宿主中表達在b)中獲得的修飾的核酸序列，和d)回收所表達的修飾的蜘蛛絲蛋白。2.權利要求1的方法，其還包括將其它物質偶聯到在所述修飾的蜘蛛絲蛋白中的所述賴氨酸和/或半胱氨酸分子上。3.權利要求1或2的方法，其中在步驟b)中被取代的一個或多個氨15基酸選自由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和蘇氨酸組成的組。4.權利要求1-3的方法，其中要偶聯到賴氨酸和/或絲氨酸上的物質選自由多肽、多糖、標記分子、量子點(quantumdots)、金屬、核酸、脂質和低分子藥物組成的組。5.權利要求4的方法，其中所述低分子藥物選自含有羧基、羰基、亞氨基或硫醇基的藥物。6.前述權利要求中一項或多項的方法，其中在a)中提供的蜘蛛絲蛋白基于拖絲和/或鞭形蛋白。7.權利要求6的方法，其中在a)中提供的拖絲和域鞭形蛋白選自圓25網蜘蛛(園蛛科(Araneidae)和Araneoids)的拖絲或鞭形蛋白。8.權利要求7的方法，其中在a)中提供的所述拖絲蛋白和/或鞭形蛋白來自十字園蛛(^ra"eztffl^cfema^^)禾口/或棒絡新婦蛛(iV印/n7ac/a—es入9.權利要求8的方法，其中所述片段是一種組件，其中所述組件包30含一種或多種含有多聚丙氨酸的共有序列。10.權利要求9的方法，其中所述含有多聚丙氨酸的共有序列衍生自ADF-3并且具有氨基酸序列SEQIDNO:l(組件A)或其變體。11.權利要求8的方法，其中所述片段是衍生于ADF-3的組件，并且包括氨基酸序列SEQIDNO:2(組件Q)或其變體。12.權利要求10和11的方法，其中在步驟a)中提供的所述蜘蛛絲蛋白包含一個或多個(AQ)和/或(QAQ)。13.權利要求12的方法，其中所述蜘蛛絲蛋白包含(AQ)仏(AQ)24,(QAQ)8或(QAQ),6。14.權利要求8的方法，其中所述片段是衍生于ADF-4包括氨基酸序io列SEQIDNO:3(組件C)或其變體的組件。15.權利要求14的方法，其中在a)中提供的蜘蛛絲蛋白包含(:16或C32。16.權利要求8的方法，其中所述片段是衍生于鞭形蛋白的組件，并且是組件K(SEQIDNO:4)、組件sp(SEQIDNO:5)、組件X(SEQIDNO:6)、和/或組件Y(SEQIDNO:7)或它們的變體。17.權利要求16的方法，其中所述蜘蛛絲蛋白包含Y8,Y16,X8,X16，K8，K，6或Y6X鄰'K2Y2。18.前述權利要求中一項或多項的方法，其中在步驟d)中回收的修飾的蜘蛛絲蛋白包含SEQIDNO:8-19的一個或多個組件。19.前述權利要求中一項或多項的方法，其中將編碼按照SEQIDNO:氨基端TAG和/或SEQIDNO:25-28的羧基端TAG的核酸添加到在步驟d)中回收的修飾的蜘蛛絲蛋白上或添加到在步驟a)中提供的蜘蛛絲蛋白上。20.通過權利要求1-19中一項或多項的方法可以獲得的修飾的蜘蛛25絲蛋白。21.—種修飾的蜘蛛絲蛋白，其包含SEQIDNO:8-28的一個或多個組件。22.—種核酸序列，其編碼如在權利要求1的步驟d)中獲得的修飾的蜘蛛絲蛋白或者編碼權利要求20或21的修飾的蜘蛛絲蛋白。23.—種表達載體，其包含權利要求22的核酸序列和一種或多種調控序列。24.權利要求23的載體，其為質粒或病毒載體，優選地為桿狀病毒系統或痘苗病毒載體系統。25.—種載體，其包含權利要求22的核酸序列，并且其優選地衍生5于克隆載體SEQIDNO:29或其變體。26.—種宿主，其轉化了權利要求23-25的載體。27.權利要求26的宿主，其為原核細胞。28.權利要求27的宿主，其為大腸桿菌或枯草芽孢桿菌29.權利要求26的宿主，其為真核細胞。30.權利要求29的宿主，其為哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞或昆蟲細胞。31.權利要求30的哺乳動物細胞，其為CHO，COS,HeLa,293T，HEH或BHK細胞。32.權利要求31的宿主，其為酵母細胞。33.權利要求32的宿主，其為釀酒酵母(5^cc/wramycMcwevWae)，粟酒裂殖酵母(&Z2^w""/2o;w^ces戶07W&)，巴斯德畢赤酵母(乃'c/z/a)，白念珠菌(C(i^aa/6/cQ7s)，多形漢遜酉孝母(//arae"w/a戶/，07/7<3)。34.權利要求30的宿主，其中所述昆蟲細胞選自鱗翅目aepWo/fera)昆蟲細胞，優選地選自草地貪夜蛾(&o^^^^/h/g^rafo)和選自粉夜蛾(7Hc/2op/認'am')。35.權利要求34的宿主，其中所述昆蟲細胞是Sf9、Sf21或高效(highfive)細胞。36.權利要求30的宿主，其中所述植物細胞來源于煙草、馬鈴薯、玉米、豌豆和番茄。37.—種藥物或化妝品組合物，其含有權利要求20或21的修飾的蜘蛛絲蛋白和藥用載體。38.—種纖維/線、纖絲、薄膜、泡沫、球體、納米纖維、水凝膠等，30其由權利要求20或21的修飾的蜘蛛絲蛋白制成。39.—種紙產品，其包含權利要求20或21的修飾的蜘蛛絲蛋白。40.—種紡織品或皮革產品，其包含權利要求20或21的重組蜘蛛絲蛋白。41.權利要求39或40的紙產品、紡織品或皮革產品，其中所述重組蜘蛛絲蛋白作為涂層存在。42.—種凝膠或泡沫，其包含權利要求20或21中一項或多項的蛋白或由權利要求20或21中一項或多項的蛋白組成。全文摘要本發明涉及修飾蜘蛛絲蛋白的方法和可通過所述方法獲得的蜘蛛絲蛋白。本發明還涉及編碼修飾的蜘蛛絲蛋白的核酸序列，含有所述序列的載體，和用這種載體轉化的宿主細胞。此外，本發明涉及含有本文定義的修飾的蜘蛛絲蛋白的藥物或化妝品組合物，和所述修飾的序列在各種領域中的應用，特別是在醫藥、化妝品和技術應用領域中的應用。文檔編號C07K14/435GK101253193SQ200680031592公開日2008年8月27日申請日期2006年8月29日優先權日2005年8月29日發明者托馬斯·沙伊貝爾申請人:慕尼黑技術大學