抗結核藥組合物和方法
                            
            
                            
            文檔序號：3558090閱讀：2342來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：抗結核藥組合物和方法
            
技術領域：
              本發明涉及治療由微生物所致疾病、特別是結核的方法和組合物。本發明還涉及具有提高了的抗分枝桿菌活性的方法和組合物，也就是包含新穎的取代的乙二胺化合物的組合物。在某些實施方案中，本發明包括組合物，這些組合物包含取代的乙二胺化合物，進一步包含抗結核藥，諸如利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇。
            
 
            
背景技術：
              分枝桿菌感染經常表現為諸如結核這類疾病。由分枝桿菌所致人類感染自古以來一直廣為傳播，并且今天結核仍然是死亡的主導原因。盡管自從十九世紀中葉以來該疾病的發生率有所下降，并且生活標準不斷提高，不過分枝桿菌疾病仍然在醫療資源有限的國家中構成發病率和死亡率的主導原因。另外，分枝桿菌疾病能夠導致無免疫應答患者的壓倒性、傳播性疾病。盡管世界上很多健康組織都已付諸努力，不過從未實現分枝桿菌疾病的根除，也不會很快根除。世界人口有近三分之一被復合結核分枝桿菌感染，普遍稱之為結核(TB)，每年新增大約八百萬病例，并且二至三百萬死于TB。結核(TB)是歸因于單一病因中的人類最大數量中的死亡原因(Dye等，J.Am.Med.Association，282，677-686，(1999)；和2000 WHO/OMS Press Release)。
            
 在數十年下降之后，TB現在處于上升中。在美國，據信多達一千萬名個體被感染。1990年報道有幾乎28,000個新增病例，比1989年增加9.4％。從1985年至1990年觀察到TB病例增加16％。過度擁擠的生活條件和所分享的空間尤其有助于TB的傳播，可以解釋在監獄囚犯和美國大城市無家可歸者中所觀察到的病例增加。全部“獲得性免疫缺陷綜合征”(AIDS)患者中大約有一半將患上分枝桿菌感染，而TB是一種尤其有毀滅性的并發癥。AIDS患者面臨更高的形成臨床TB的危險，并且抗TB治療似乎不如在非AIDS患者中那樣有效。所以，該感染經常發展為致命的廣為傳播的疾病。
            
 在困擾AIDS患者的機會感染中逐漸發現除結核分枝桿菌以外的分枝桿菌。來自復合細胞內鳥分枝桿菌(MAC)、尤其第四與第八血清型的生物體在從AIDS患者分離的分枝桿菌中占到68％。發現有龐大數量的MAC(多達每克組織中有1010個耐酸性桿菌)，所以，被感染的AIDS患者的預后較差。
            
 世界衛生組織(WHO)一直鼓勵對抗TB，推薦主動性預防，例如″Expanded Program on Immunization″(EPI)，和主動性治療順應性，例如″Directly Observed Treatment Short-Course″(DOTS)。就TB的根除而言，診斷、治療和預防是同等重要的。活動期TB患者的迅速檢測將允許早期治療，由此預期治愈率為約90％。因此，早期診斷是對抗TB的關鍵。另外，治療順應性將不僅確保感染的消除，而且確保耐藥性菌株出現的減少。
            
 耐藥性結核分枝桿菌的出現是一種極為令人不安的現象。對至少一種標準藥物確有耐受性的新增TB病例的速率從早期1980年的10％增加到1991年的23％。對治療制度的順應性因此也是消除TB和防止耐藥性菌株出現的努力中的決定性因素。新治療劑的開發同樣重要，它們作為疫苗和治療都是有效的，用于由耐藥性分枝桿菌所致疾病。
            
 多重耐藥結核(MDR TB)為耐受用于治療結核的初級藥物中的兩種或多種的結核形式。在細菌發生抵抗抗生素攻擊并且將其效力傳播給子代時發生對一種或幾種形式的治療的耐藥性。由于細菌的菌株整體將這種能力遺傳以抵抗各種治療作用，所以耐藥性可以在人與人之間傳播。
            
 世界衛生組織估計全世界有達5千萬人可能感染了結核抗性株。此外，全世界每年診斷有300,000個MDR-TB新病例并且79％的MDR-TB病例目前表現出對常用于治療結核的三種或多種藥物的耐藥性。
            
 在2003年，疾病控制中心(Centre for Disease control)(CDC)報告在美國有7.7％的結核病例耐受用于治療結核的第一線藥物異煙肼。CDC還報告在美國有1.3％的結核病例耐受異煙肼和利福平。利福平為最常與異煙肼聯用的藥物。
            
 顯然在治療過程中或之前發生的結核耐藥菌株的幾率是衛生組織和衛生保健從業人員主要關注的。用于治療結核的藥物包括，但不限于乙胺丁醇、吡嗪酰胺、鏈霉素、異煙肼、莫西沙星和利福平。可以對特定的個體制定治療的確切過程和期限，不過，幾種策略為本領域技術人員眾所周知的。
            
 盡管已經鑒別了37種類以上分枝桿菌，不過全部人類感染有95％以上都是由六種分枝桿菌所致結核分枝桿菌(M.tuberculosis)、細胞內鳥分枝桿菌(M.avium intracellulare)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、偶發分枝桿菌(M.fortuitum)、龜分枝桿菌(M.chelonae)和麻風分枝桿菌(M.leprae)。人類中最普遍的分枝桿菌疾病是結核(TB)，它主要是由包含結核分枝桿菌、牛分枝桿菌(M.bovis)或非洲分枝桿菌(M.africanum)所致(Merck Manual 1992)。感染通常由感染性顆粒的吸入所引發，所述顆粒能夠到達肺中的末端路徑。在被肺泡巨噬細胞吞入后，桿菌能夠自由復制，最終破壞吞噬性細胞。繼而發生級聯效應，其中吞噬性細胞的破壞導致另外的巨噬細胞和淋巴細胞移行至感染部位，它們最終也被消除。疾病在最初階段因被感染的巨噬細胞移行并定位于淋巴結以及進入血流和其他組織而進一步傳播，所述其他組織例如骨髓、脾、腎、骨和中樞神經系統(參見Murray等Medical Microbiology，The C.V.Mosby Company 219-230(1990))。
            
 對分枝桿菌的毒力有貢獻的因素尚無清楚的認識。很多研究人員暗示細胞壁與細菌表面的脂質是集落形態和毒力的貢獻者。有證據表明，某些分枝桿菌細胞表面上的C-分枝桿菌糖苷脂在促進生物體在巨噬細胞內的存活上是很重要的。海藻糖6，6′-二霉菌酸酯是一種索狀因子，在其他分枝桿菌中都有牽連。
            
 集落形態學和毒力的相互關系在鳥分枝桿菌(M.avium)中特別突出。鳥分枝桿菌存在若干不同的集落形式。在常規實驗室培養基上生長成透明或粗糙集落的桿菌在組織培養物中的巨噬細胞內是可繁殖的，當注射到易感小鼠中時是有毒力的，對抗生素是有耐受性的。供養在實驗室培養基上的粗糙或透明桿菌經常自發地呈現不透明的R集落形態，此時它們在巨噬細胞中不是可繁殖的，在小鼠中是有毒力的，對抗生素是高度易感的。鳥分枝桿菌的透明、粗糙與不透明菌株之間的集落形態學差異幾乎是確定的，這是由于包在透明與粗糙生物體表面上的糖脂的存在，所述糖脂充當保護性被膜。這種被膜或包膜主要由C-分枝桿菌糖苷脂組成，它們明顯防護有毒力的鳥分枝桿菌生物體不受溶菌酶和抗生素的作用。相反，鳥分枝桿菌的無毒力、不透明形式在它們的表面上具有非常少的C-分枝桿菌糖苷脂。對抗生素的耐受性和對被巨噬細胞殺死的耐受性都已歸因于鳥分枝桿菌表面上的糖脂屏障。
            
 分枝桿菌感染的診斷得到病原體的分離和鑒別的確認，不過常規診斷基于唾液涂片、胸X-射線檢查(CXR)和臨床癥狀。培養基上分枝桿菌的分離花費長達四至八周。種屬鑒別花費另外兩周。檢測分枝桿菌還有若干其他技術，例如聚合酶鏈反應(PCR)、結核分枝桿菌直接試驗、或擴增結核分枝桿菌直接試驗(MTD)、和采用放射性標記的檢測測定法。
            
 一種廣泛用于檢測由結核分枝桿菌所致感染的診斷試驗是結核菌素皮試。盡管皮試有大量版本都是可用的，不過通常使用兩種結核菌素抗原制備物之一舊結核菌素(OT)或純化蛋白衍生物(PPD)。將抗原制品經真皮注入皮膚內，或者局部施用，然后利用multiprong接種器侵入性轉運至皮膚內(Tine試驗)。皮試診斷法存在若干問題。例如，Tine試驗不作一般性推薦，因為不能準確控制注射到真皮內層的抗原量(參見Murray等Medical Microbiology，The C.V.Mosby Company219-230(1990))。
            
 盡管結核菌素皮試被廣泛使用，不過它們通常需要二至三天才出結果，很多時候結果是不準確的，因為在已經暴露于分枝桿菌但是仍然健康的受試者中有時見到假陽性。另外，誤診的情形也是頻繁的，因為陽性結果不僅見于活動期TB患者，而且見于接種過卡介苗(BCG)的個人，和已經被分枝桿菌感染但是尚未形成該疾病的那些人。因此借助結核菌素皮試難以區分活動期TB患者和其他人，例如家庭TB接觸。另外，結核菌素試驗經常在被除結核分枝桿菌以外的分枝桿菌感染(MOTT)的那些個體中產生交叉反應。因此，利用目前可用的皮試進行診斷經常有誤差和不準確。
            
 由藥物敏感性生物體所致結核的標準治療是一種六個月的制度，由兩個月的四次給藥、繼之以四個月的兩次給藥組成。遍及六個月療程給予的兩種最重要的藥物是異煙肼和利福平。盡管該制度是相對簡單的，不過它的給藥是相當復雜的。在第一期治療期間經常要求每日攝入八粒或九粒藥丸；前景令人堪憂。進而更嚴重地，患者經常在數周內沒有癥狀，幾乎全部都在數月內被治愈。不過，如果沒有繼續治療至完成，患者可能經歷復發，沒有繼續治療至完成的患者的復發率很高。各種形式的患者護理用于促進對療法的堅持。確保患者服藥的最有效方式是采用直接觀察療法，這牽涉健康護理團隊成員觀察患者服用每劑每種藥物。可以在診所、患者居所或任意獲得互相承認的場所提供直接觀察療法。幾乎全部患有由藥物敏感性生物體所致結核并且完成療法的患者都將被治愈，復發的危險是非常低的(″EndingNeglectThe Elimination of Tuberculosis in the United States″ed.L.Geiter Committeeon the Elimination of Tuberculosis inthe United States Division of Health Promotion and DiseasePrevention，Institute of Medicine.Unpublished.)。
            
 不過，FDA批準了將三種主要用于治療結核的藥物(異煙肼、利福平和吡嗪酰胺)合并成一種藥丸的藥物。因此，減少了患者必需要每天服用的藥丸的數量并且使得患者僅服用三種藥物之一，即產生MDR-TB的常見路徑變得不可能，在治療結核的領域，尤其是在那些結核菌株為耐藥性的病例中仍然存在需求。
            
 亟需有效的治療制度，包括改進了的疫苗接種和治療方案。作為治療順應性問題的結果，目前可用的治療劑不再始終有效，治療順應性問題有助于耐藥性分枝桿菌菌株的形成。
            
 此外，本領域中對有效抗傳染病的新組合物和方法存在需求。更具體地說，對有效治療分枝桿菌疾病的新組合物和方法存在需求。
            
 乙胺丁醇(EMB)是一種廣泛使用的治療TB的抗生素，在1988年，結核療法交付使用了三億劑以上。
            
   
            
      乙胺丁醇   乙胺丁醇是在二十世紀五十年代由Lederle Laboratories開發的，具有低毒性，具有良好的藥動學。不過，乙胺丁醇具有相對高的最小抑制濃度(MIC)，約為5μg/ml，并且可能導致視神經炎。因而，日益需要新的和更有效的治療組合物(例如參見美國專利No.3,176,040、美國專利No.4,262,122、美國專利No.4,006,234、美國專利No.3,931,157、美國專利No.3,931,152、U.S.Re.29,358和  
            
     
            
等，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters11(2001)1679-1681)。自從發現乙胺丁醇的有益效果以來，在TB治療上沒有取得什么藥理學進展。而且，由于耐藥性菌株的聯合出現和分枝桿菌疾病的更普遍流行，顯然新治療組合物是對抗結核中的決定性因素。
            
 需要明顯有效的治療制度，包括改進了的疫苗接種和治療方案。治療性疫苗是可取的，它將預防結核的發生，因此消除對療法的需要。盡管目前可用的治療劑是有效的，例如乙胺丁醇，不過耐藥性菌株的出現已經使新的制劑和組合物成為必需，它們比乙胺丁醇更通用。作為治療順應性問題的結果，目前可用的治療劑不再始終有效，引起耐藥性分枝桿菌菌株的形成。亟需新的抗結核藥，它們提供高度有效的治療，縮短或者簡化結核化療。
            
 
            

            發明內容
            
   本發明包含這樣的方法和組合物，其中包含有效治療傳染病的乙二胺化合物。本發明還提供這樣的方法和組合物，其中包含具有提高了的抗分枝桿菌活性的取代的乙二胺類，包括具有提高了的抗結核活性的取代的乙二胺類。
            
 本發明涵蓋取代的乙二胺類，它們可以從各種胺化合物衍生而來。本發明中，取代的乙二胺類基于下列結構。
            
   
            
      取代的乙二胺   本文所述取代的乙二胺化合物是如下合成和篩選活性的。取代的乙二胺的化學文庫是在聚苯乙烯固相支持體上制備的，采用裂分和匯合技術。這種技術可以合成不同組取代的乙二胺類。利用體外生物學測定法篩選這些二胺類的抗TB活性，包括高通量篩選(HTS)測定法，基于最近完成的結核分枝桿菌基因序列，和最小抑制濃度(MIC)測定法。
            
 本文所述方法和組合物包含取代的乙二胺類，它們有效對抗由感染性生物體所致疾病，所述生物體包括但不限于細菌和病毒。本發明的一種實施方案提供包含取代的乙二胺類的方法和組合物，它們有效對抗分枝桿菌疾病。本發明的另一種實施方案提供包含取代的乙二胺類的方法和組合物，它們對分枝桿菌疾病具有50μM或更低的MIC。本發明的另一種實施方案包含取代的乙二胺，它們對分枝桿菌疾病具有25μM或更低的MIC。本發明的另一種實施方案包含取代的乙二胺類，它們對分枝桿菌疾病具有12.5μM或更低的MIC。本發明的另一種實施方案包含取代的乙二胺類，它們對分枝桿菌疾病具有5μM或更低的MIC。在本發明的另一種實施方案中，這些方法和組合物包含取代的乙二胺類，它們具有10％或更大的HTS Luc活性。在本發明的另一種實施方案中，這些方法和組合物包含取代的乙二胺類，其中一個胺基團是從伯胺衍生的，其中另一個胺基團是從伯胺或仲胺衍生的。在本發明的另一種實施方案中，這些方法和組合物包含取代的乙二胺類，其中一個胺是從順式-(-)-桃金娘烷基胺、環辛胺、2，2-二苯基乙胺、3，3-二苯基丙胺、(+)-冰片基胺、1-金剛烷甲胺、(+)-異松蒎基胺或(-)-異松蒎基胺衍生的。
            
 本發明涵蓋取代的乙二胺類的各種鹽復合物和其他取代的衍生物。本發明還涵蓋取代的乙二胺類和它們取代的衍生物的對映體和其他立體異構體。本發明進一步涵蓋對動物的治療，包括但不限于人類。
            
 此外，本發明涵蓋組合物，它們包含新穎的取代的乙二胺化合物，進一步包含抗結核藥，包括，但不限于利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇及其類似物。
            
 因此，本發明的一個目的是提供方法和組合物，用于治療和預防由微生物所致疾病。
            
 本發明的另一目的是提供方法和組合物，用于治療和預防傳染病。
            
 本發明的另一目的是提供方法和組合物，用于治療和預防分枝桿菌疾病，包括但不限于結核。
            
 本發明的另一目的是提供方法和組合物，用于使用包含取代的乙二胺類的組合物治療和預防傳染病。
            
 本發明的另一目的是提供方法和組合物，用于使用包含取代的乙二胺類的組合物治療和預防分枝桿菌疾病。
            
 本發明的另一目的是提供方法和組合物，用于使用包含取代的乙二胺類的組合物治療和預防結核。
            
 本發明的另一目的是提供方法和組合物，用于使用包含取代的乙二胺類的組合物治療和預防結核，其中該二胺具有50μM或以下的MIC。
            
 本發明的另一目的是提供方法和組合物，用于使用包含取代的乙二胺類的組合物治療和預防結核，其中該二胺具有25μM或以下的MIC。
            
 本發明的另一目的是提供方法和組合物，用于使用包含取代的乙二胺類的組合物治療和預防結核，其中該二胺具有12.5μM或以下的MIC。
            
 本發明的另一目的是提供方法和組合物，用于使用包含取代的乙二胺類的組合物治療和預防結核，其中該二胺具有5μM或以下的MIC。
            
 本發明的另一目的是提供方法和組合物，用于使用包含取代的乙二胺的組合物治療和預防結核，其中該二胺具有10％或更大的HTS Luc活性。
            
 本發明的另一目的是提供方法和組合物，用于使用包含取代的乙二胺類的組合物治療和預防結核，其中一個胺基團是從伯胺衍生的，另一個胺基團是從伯胺或仲胺衍生的。
            
 本發明的另一目的是提供方法和組合物，用于使用包含取代的乙二胺類的組合物治療和預防結核，其中一個胺是從順式-(-)-桃金娘烷基胺、環辛胺、2，2-二苯基乙胺、3，3-二苯基丙胺、(+)-冰片基胺、1-金剛烷甲胺、(+)-異松蒎基胺或(-)-異松蒎基胺衍生的。
            
 本發明的另一目的是提供治療制劑用組合物，所述制劑用于治療和預防分枝桿菌疾病。
            
 本發明的另一目的是提供治療制劑用組合物，所述制劑用于治療和預防由下列分枝桿菌種所致分枝桿菌疾病，包含結核分枝桿菌復合物、細胞內鳥分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶發分枝桿菌(M.fortuitum)、龜分枝桿菌(M.chelonoe)、麻風分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌(M.microti)、牛分枝桿菌BCG或牛分枝桿菌。
            
 本發明的另一個目的是提供用于治療或預防傳染病的組合物和方法，所述的傳染病由偶發分枝桿菌、海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)和白色念珠菌(Candida albicans)導致。
            
 本發明的另一個目的是提供在聯合療法中的一種或多種新化合物，以便提供對分枝桿菌疾病具有活性的協同作用。
            
 本發明的另一個目的是提供組合物，它們包含新穎的取代的乙二胺化合物，進一步包含抗結核藥，所述抗結核藥包括但不限于利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇及其類似物。
            
 本發明的另一個目的是提供用于傳染病的聯合療法，包含取代的乙二胺類和抗結核藥。
            
 本發明的另一個目的是提供用于分枝桿菌疾病的聯合療法，包含取代的乙二胺類和抗結核藥，所述抗結核藥包括但不限于單獨或組合的利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇及其類似物。
            
 本發明的另一個目的是提供用于分枝桿菌疾病，諸如結核病的聯合療法，包含取代的乙二胺類和抗結核藥，所述抗結核藥包括但不限于單獨或組合的利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇及其類似物。
            
 本發明的另一個目的是提供用于分枝桿菌疾，諸如結核病的聯合療法，包含取代的乙二胺類，諸如SQ 109、SQ 73或SQ 609；和抗結核藥，所述抗結核藥包括但不限于單獨或組合的利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇及其類似物。
            
 本發明的另一個目的是提供用于分枝桿菌疾，諸如結核病的聯合療法，包含取代的乙二胺類，諸如SQ 109、SQ 73或SQ 609；和抗結核藥，所述抗結核藥包括但不限于利福平和利福平類似物，諸如利福噴汀、利福拉齊和利福布汀。
            
 本發明的另一個目的是提供一種或多種新化合物與一種藥物的聯合用藥，以便提供對分枝桿菌疾病具有活性的協同作用。
            
 本發明的另一個目的是提供一種或多種新化合物與標準結核藥物的聯合用藥，以便提供對分枝桿菌疾病具有活性的協同作用。
            
 本發明的另一個目的是提供新穎的治療方法，其中將一種或多種新化合物與至少一種已知的藥物聯用以便提供協同作用，通過該方法可以治療或預防傳染病。
            
 在回顧下列實施方案的詳細說明和待批權利要求之后，本發明的這些與其他目的、特征和優點將變得顯而易見。
            
 
            

            

            
   圖1代表流程圖，顯示用于制備取代的乙二胺類的各種固相支持體合成法。
            
 圖2(a)-2(ac)提供各種伯胺類的化學結構。
            
 圖3(a)-3(f)提供各種無環仲胺類的化學結構。
            
 圖4(a)-4(i)提供各種環狀仲胺類的化學結構。
            
 圖5代表十種取代的乙二胺類的代表性反應集合的流程圖。
            
 圖6是發光數每秒(LCPS)-濃度圖，顯示所匯集的取代的乙二胺化合物的HTS Luc測定結果。
            
 圖7是LCPS-濃度圖，顯示個別取代的乙二胺化合物的HTS Luc測定結果。
            
 圖8是LCPS-濃度圖，顯示個別取代的乙二胺化合物的HTS Luc測定結果。
            
 圖9是柱狀圖，提供離散取代的乙二胺類的MIC活性總結。
            
 圖10是柱狀圖，提供離散取代的乙二胺的熒光素酶活性總結，關于3.1μM乙胺丁醇的活性為至少10％。
            
 圖11是柱狀圖，顯示選定胺單體在對TB有活性的取代的乙二胺化合物中出現的頻率。胺單體以數字編號表示。
            
 圖12代表流程圖，顯示N-香葉草基-N′-(2-金剛烷基)乙烷-1，2-二胺(化合物109)的合成。
            
 圖13代表流程圖，顯示作為鹽酸鹽的N-(環辛基)-N′-(1R，2R，3R，5S)-(-)-異松蒎基乙烷-1，2-二胺(化合物59)的合成。
            
 圖14是一種代表性樣本的質譜圖，所述樣本充分含有所匯集的取代的乙二胺化合物。
            
 圖15是化合物109，即N-香葉草基-N1-(2-金剛烷基)乙烷-1，2-二胺的質譜圖。
            
 圖16是化合物109，即N-香葉草基-N1-(2-金剛烷基)乙烷-1，2-二胺的質子NMR圖。
            
 圖17是集落形成單位/肺(CFU/肺)研究數據的柱狀圖，顯示不同化合物在數天時間內的CFU/肺生長。
            
 圖18是CFU/肺研究數據的柱狀圖，顯示不同化合物在數天時間內的CFU/肺生長。
            
 圖19是CFU/肺研究數據的柱狀圖，顯示不同化合物在數天時間內的CFU/肺生長。
            
 圖20是損害研究數據的柱狀圖，顯示用不同化合物處理一段時間內可見的損害。
            
 圖21提供證明候選藥物鑒別的圖解。
            
 圖22提供用于體內功效測試的化合物。
            
 圖23顯示化合物73和109的體內研究結果，劑量為1和10mg/kg(脾)。
            
 圖24顯示化合物73和109的體內研究結果，劑量為1和10mg/kg(肺)。
            
 圖25顯示化合物59和111的體內研究，劑量為1和10mg/kg(脾)。
            
 圖26顯示化合物59和111的體內研究，劑量為1和10mg/kg(肺)。
            
 圖27顯示化合物58、73、109和111在被結核分枝桿菌H 37Rv感染的C57BL.6小鼠中的功效試驗結果(脾)。用5×106CFU結核分枝桿菌H37Rv i.v.感染小鼠；在感染后18天開始藥物治療。EC-EC-早期對照，即化療開始當天小鼠肺中的CFU。小鼠接受1-未治療的小鼠；2-INH(25mg/kg)；3-EMB(100mg/kg)；4-化合物109(25mg/kg)；4*-化合物109(10mg/kg)；4**-化合物109(0.1mg/kg)；5-化合物58(25mg/kg)；6-化合物73(25mg/kg)；7-化合物111(25mg/kg)。
            
 圖28顯示化合物58、73、109和111在被結核分枝桿菌H37Rv感染的C57BL.6小鼠中的功效試驗結果(肺)。用5×106CFU結核分枝桿菌H37Rvi.v.感染小鼠；在感染后18天開始藥物治療。EC-EC-早期對照，即化療開始當天小鼠肺中的CFU。小鼠接受1-未治療的小鼠；2-INH(25mg/kg)；3-EMB(100mg/kg)；4-化合物109(25mg/kg)；4*-化合物109(10mg/kg)；4**-化合物109(0.1mg/kg)；5-化合物58(25mg/kg)；6-化合物73(25mg/kg)；7-化合物111(25mg/kg)。
            
 圖29提供供試化合物的LC/MS數據。
            
 圖30提供顯示供試化合物對小鼠盒式給藥的PK研究結果圖。口服遞送。本研究中，將口服遞送的化合物NSC 722039獨為化合物37，NSC722040-化合物59，NSC 722041-化合物109。
            
 圖31提供供試化合物對小鼠盒式給藥的PK研究結果圖。腹膜遞送。本研究中，將化合物NSC 722039讀為化合物37，NSC 722040-化合物59，NSC 722041-化合物109。
            
 圖32提供供試化合物對小鼠盒式給藥的PK研究結果圖。靜脈內遞送。本研究中，將化合物NSC 722039讀為化合物37，NSC 722040-化合物59，NSC 722041-化合物109。
            
 圖33提供化合物109在小鼠中的PK研究結果圖。
            
 圖34109在小鼠中的組織分布(i.v.，3mg/kg)。
            
 圖35109在小鼠中的組織分布(p.o.，25mg/kg)。
            
 圖36化合物109在小鼠尿中的代謝。
            
 圖37在小鼠尿中發現沒有109的葡萄糖醛酸化代謝產物。
            
 圖38化合物109的結合試驗   圖39參比化合物的結合試驗   圖40化合物109的數據總結。
            
 圖41方案1乙胺丁醇類似物的100,000種化合物文庫在固相支持體上的合成。
            
 圖41方案2在固相支持體上合成SQBisAd的嘗試。
            
 圖42提供經由氨基酸酰化作用制備的代表性目標二胺類的結構。
            
 圖43提供表25，總結所合成的二胺主平板數據，用于制備目標20,000種乙胺丁醇類似物文庫。
            
 圖44提供方案5，顯示使用氨基酸作為連接基團合成二胺文庫。
            
 圖45提供胺單體在EMB類似物的原始100,000種化合物文庫中的命中率圖解。
            
 圖46提供伯胺結構多樣性圖解。
            
 圖47提供表26，列舉用在二胺文庫制備中的氨基酸。
            
 圖48提供在二胺文庫合成中作為試劑使用的羰基化合物。
            
 圖49提供表27，顯示用在二胺文庫合成用主平板中的羰基化合物。
            
 圖50提供二胺文庫的代表性MIC和Lux數據實例。
            
 圖51提供烷基化單體在具有抗TB活性的最終二胺產物中的出現率圖解。
            
 圖52提供代表性96孔去褶合平板的布局。
            
 圖53提供化合物命中列表和改性連接基團二胺文庫的結構。
            
 圖54提供顯示利福平、化合物109(SQ109)或異煙肼(INH)體內活性結構的示意圖。使用BACTEC系統進行本研究。RIF的MIC為0.2ug/ml，SQ109(化合物109)0.32ug/ml，且INH0.025ug/ml。
            
 圖55是顯示使用快速模型在小鼠中的體內研究結果的示意圖，其中將小鼠體重用作評估藥物功效的標記。結果屬于快速模型中進行的21天聯合療法研究。使C3H雌性小鼠i.v.感染106CFU結核分枝桿菌H37Rv(Pasteur)。在接種后7天開始化療并且持續2周(5天/周)。將用單一藥物治療，未感染和感染的未治療的安慰劑的小鼠用作對照組。Rif，2mg/kg；INH，1mg/kg；EMB，10mg/kg；Moxi，10mg/kg；PZA，50mg/kg。從第0天到第21天監測小鼠體重。
            
 圖56A和56B是顯示快速模型中使用SQ109(10mg/kg)、利福平(2mg/kg)和SQ109(化合物109)(10mg/kg)-Rif(2mg/kg)聯合用藥和安慰劑(感染的未治療的)治療的H37Rv感染動物的體重(圖56A)和死亡率數據(圖56B)動力學特征的示意圖。使C3H雌性小鼠i.v.感染106CFU結核分枝桿菌H37Rv(Pasteur)。在接種后7天開始化療并且持續2周(5天/周)。從第0天到化療結束時(第21天)監測小鼠體重。
            
 圖57是顯示使用聯合用藥Rif-EMB治療的小鼠體重的動力學特征的示意圖。使用乙胺丁醇(10mg/kg)、利福平(2mg/kg)和乙胺丁醇(10mg/kg)-Rif(2mg/kg)聯合用藥和安慰劑治療H37Rv感染的動物的體重的動力學特征。使C3H雌性小鼠i.v.感染106CFU結核分枝桿菌H37Rv(Pasteur)。在接種后7天開始化療并且持續2周(5天/周)。從第0天到化療結束時(第21天)監測小鼠體重。
            
 圖58提供顯示化合物109與利福平聯合用藥在慢性結核感染小鼠模型中的體內功效研究的示意圖。給C57BL/6雌性小鼠i.v.接種105CFU結核分枝桿菌H37Rv。在感染后3周開始化療并且持續4周。在療法結束時，處死小鼠；將在含有0.05％Tween-80的無菌2ml PBS中的肺勻化物以10-倍系列稀釋液鋪平板于7H10瓊脂平皿上，并且在37℃下孵育。在生長3周后計算CFU。使用16組小鼠(6只小鼠/組)。以0，0.1，1和10mg/kg使用化合物109(SQ109)；以0，1，2和20mg/kg使用RIF。
            
 圖59表示使用慢性小鼠模型的化合物109與Rif和INH聯合用藥在多-藥物加強期方案中的結果。給C57BL/6雌性小鼠i.v.接種105CFU結核分枝桿菌H37Rv。在感染后3周開始化療并且持續5周，其中取2，3，4和5周的時間點。在每一時間點時，處死用于測試聯合用藥的一組小鼠(6只小鼠/組)；將在含有0.05％Tween-80的無菌2ml PBS中的肺勻化物以10-倍系列稀釋液鋪平板于7H10瓊脂平皿上，并且在37℃下孵育。在生長3周后計算CFU。以25mg/kg使用INH，以20mg/kg使用RIF，以10mg/kg使用SQ109(化合物109)，以100mg/kg使用EMB。使用ANOVA檢驗進行統計學分析通過學生T-檢驗評估任何差異的顯著性，并且將p＜0.05視為具有統計學顯著性。3周*-p＝0.001，4周**p＝0.008，，且就5周而言***p＝0.005。
            
 圖60提供化合物109的控制特異性結合％的結合測定結果。
            
 圖61提供化合物109控制特異性結合抑制％的結合測定結果。
            
 圖62提供對SQ-109測試的革蘭氏陽性生物體的MIC結果。
            
 圖63A和63B提供對SQ-109測試的革蘭氏陰性生物體的MIC結果。
            
 圖64提供對SQ-109測試的厭氧菌的MIC結果。
            
 圖65提供對SQ-109測試的真菌的MIC結果。
            
 圖66提供對SQ-109測試的分枝桿菌的MIC結果。
            
 圖67提供表40，它顯示使用SQ109與INH、STR、EMB或PZA的兩-藥物組合測試的協同作用商數；和表41，它顯示使用SQ109與RIF組合測試的協同作用商數。
            
 圖68提供使用利福平(RIF)與SQ109或乙胺丁醇(EMB)聯合用藥處理的RIFR結核分枝桿菌分離物3185的生長分布圖。每天使用BACTEC460系統監測RIFR結核分枝桿菌菌株3185在包含不同濃度的RIF與0.5MIC SQ109(a)或0.5MIC EMB(b)的BACTEC小瓶中的生長指數(GI)。在37℃下孵育小瓶。在本實驗的前2天過后每天獲得GI讀數且直到1∶100接種物對照組小瓶在第8天時達到大于30的ΔGI值為止。RIF，SQ109和EMB在菌株3185中的MIC分別為24mg/L，0.32mg/L，和2.5mg/L。
            
 圖69提供使用RIF和SQ109處理的RIFR結核分枝桿菌分離物2482的生長分布圖。本實驗如圖68的圖例中所述使用BACTEC 460進行。獲得GI讀數且直到1∶100接種物對照組小瓶在第7天時達到大于30的ΔGI值為止。RIF和SQ109在菌株2482中的MIC分別為＞100mg/L和0.32mg/L。
            
 圖70提供下列研究結果的示意圖，其中使C57BL/6小鼠感染結核分枝桿菌H37Rv并且使感染進行21天。在第21天時，用INH(25mg/kg)+RIF(20mg/kg)+PZA(150mg/kg)+EMB(100mg/kg)或INH(25mg/kg)+RIF(20mg/kg)+PZA(150mg/kg)+SQ109(10mg/kg)將小鼠處理8周。
            
 圖71提供顯示SQ109-Rif聯合用藥的協同作用的示意圖。這種協同作用以兩種方式進行SQ109以協同作用方式增強RIF活性和RIF以協同作用方式增強SQ109活性。0.5MIC的SQ109與濃度低至0.1MIC的RIF共同起協同作用。在將0.2MIC SQ109與0.5MIC RIF聯用時也觀察到了協同作用。有意義的是，兩種藥物的聯合用藥低于它們的有效濃度(0.2MIC SQ109+0.25MIC RIF)，這種聯合用藥表現出加合的相互作用。體外數據顯示SQ109-Rif聯合用藥比INH-Rif聯合用藥更為有效。
            
 圖72提供使用RIF和SQ109處理的RIFR結核分枝桿菌分離物2482的生長分布圖。本實驗使用BACTEC 460進行。RIF和SQ109在菌株2482中的MIC分別為＞100μg/ml和0.32μg/ml。
            
 圖73提供21天時快速模型聯合療法研究的結果。使C3H雌性小鼠i.v.感染在先感染過小鼠的106CFU結核分枝桿菌H37Rv(Pasteur)。接種后7天開始使用抗-TB藥物化療并且持續至第21天。
            
 圖74提供SQ109，SQ609和SQ73的結構。
            
 圖75提供涉及慢性TB的研究的結果。給C57BL/6雌性小鼠i.v.接種104CFU結核分枝桿菌H37Rv。在感染后4周開始化療并且持續2周。對每一對照藥物和聯合用藥測試一組小鼠(6只小鼠/組)。在治療2周后，處死小鼠；將在含有0.05％Tween-80的無菌2ml PBS中的肺勻化物以10-倍系列稀釋液鋪平板于7H10瓊脂平皿上，并且在37℃下孵育。在生長3周后計算CFU。以25mg/kg使用INH，以10和25mg/kg使用SQ109，以10mg/kg使用SQ109；聯合用藥(圖上的“總計”)以10mg/kg使用SQ109；以10mg/kg使用SQ609，以5mg/kg使用SQ73。使用ANOVA檢驗進行統計學分析通過學生T-檢驗評估任何差異的顯著性，并且將p＜0.05視為具有統計學顯著性。
            
 詳細描述   參照下列本文包括的具體實施方案的詳細說明，可以更容易理解本發明。不過，盡管已經參照其某些實施方案的具體細節描述了本發明，這類細節不應被視為發明范圍的限制。本文提到的參考文獻的完整文本全文結合在此作為參考，包括2005年6月3日提交的美國專利申請序號11/145,499，2002年5月17日提交的美國專利申請序號10/147,587和2002年5月17日提交的美國臨時專利申請序號60/381,220。
            
 分枝桿菌感染、例如導致結核的那些，曾經被認為發生率有所下降，現在已有反彈，并且再次構成嚴重的健康威脅。結核(TB)是歸因于單一病因的最大數量人類死亡的原因，每年有二至三百萬患有結核的人死亡。逐漸發現在人群聚集的地區或者不夠標準的生活居所，人們易被分枝桿菌感染。無免疫應答個體面臨被分枝桿菌感染和死于這類感染的高危險。另外，耐藥性分枝桿菌菌株的出現已經引起這類被感染人的治療問題。
            
 很多被分枝桿菌感染的人要么貧困，要么生活在保健設施不足的地區。作為不同妨礙因素的結果(經濟、教育水平等)，這些個體很多不能遵照處方治療制度。最終，這些和其他個體的持續性非順應性導致疾病的流行。這種非順應性經常混雜著耐藥性分枝桿菌菌株的出現。以不同分枝桿菌菌株為目標的有效組合物和疫苗是控制日益增加的結核病例數量所必需的。
            
 化療是結核的標準治療。目前一些化療治療需要聯合使用三種或四種藥物，每日一次給藥達兩個月，或者每周兩次給藥達四至十二個月。表1列舉若干標準結核藥物制度的治療方案。
            
 表1   標準TB藥物制度的治療方案      數十年來，現有抗生素的濫用和長期復雜治療制度的順應性差已經引起結核分枝桿菌的突變，已經在世界范圍內產生耐藥性的流行，威脅結核的控制。目前大多數處方藥物、包括一線藥物，例如異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和鏈霉素，是于20世紀50年代至70年代開發的。因而，這種結核化療的早期開發沒有自行牽涉結核分枝桿菌基因組序列、最近十年藥物發現的革命和全國性藥物試驗與組合化學的使用。
            
 所以，耐藥性結核分枝桿菌菌株和潛伏性結核感染的治療需要新的抗結核藥，它們提供高度有效的治療，縮短和簡化結核化療。而且，需要這些藥物是由低成本的合成法制備的，因為疾病人口決定了成本是一種突出的因素。
            
 本發明提供方法和組合物，包含一類取代的乙二胺化合物，它們有效治療和預防由包括但不限于細菌在內的微生物所致疾病。確切而言，本發明的方法和組合物有效抑制微生物結核分枝桿菌的生長。本發明的方法和組合物打算用于治療人類以及其他動物的分枝桿菌感染。例如，本發明特別可用于治療被牛分枝桿菌感染的牛。
            
 本文所用的術語“結核”包含通常與由分枝桿菌種所致感染有關的疾病狀態，所述分枝桿菌種包含結核分枝桿菌復合物。術語“結核”也與由除結核分枝桿菌以外的分枝桿菌(MOTT)所致分枝桿菌感染有關。其他分枝桿菌種包括細胞內鳥分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶發分枝桿菌、龜分枝桿菌、麻風分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、副結核鳥分枝桿菌、細胞內分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、蟾分枝桿菌、海分枝桿菌或潰瘍分枝桿菌。
            
 本發明進一步包含有效治療傳染病的方法和組合物，所述傳染病包括，但不限于由細菌、真菌、寄生物和病毒病原體所致那些。這類傳染原的實例包括如下葡萄球菌(staphylococcus)、鏈球菌科(streptococcaceae)、neisseriaaceae、球菌(cocci)、腸桿菌科(enterobacteriaceae)、假單胞菌科(pseudomonadaceae)、弧菌科(vibrionaceae)、彎曲桿菌屬(campylobacter)、巴斯德氏菌科(pasteurellaceae)、博德特氏菌屬(bordetella)、博德特氏菌屬(francisella)、布魯氏桿菌屬(brucella)、軍團桿菌科(legionellaceae)、類桿菌科(bacteroidaceae)、革蘭氏陰性菌(gram-negative bacilli)、梭菌屬(clostridium)、棒桿菌屬(corynebacterium)、丙酸菌屬(propionibacterium)、革蘭氏陽性菌(gram-positive bacilli)、炭疽、放線菌屬(actinomyces)、諾卡氏菌屬(nocardia)、分枝桿菌屬(mycobacterium)、幽門螺桿菌、肺炎鏈球菌、白色念珠菌、密螺旋體屬(treponema)、疏螺旋體屬(borrelia)、鉤端螺旋體屬(leptospira)、枝原體屬(mycoplasma)、脲原體屬(ureaplasma)、立克次氏體屬(rickettsia)、衣原體屬(chlamydiae)、全身真菌病、機會真菌病、原生動物、線蟲、吸蟲、絳蟲、腺病毒、皰疹病毒、痘病毒、乳多空病毒、肝炎病毒、正黏病毒、副黏病毒、冠形病毒，、小RNA病毒、呼腸病毒、披膜病毒、蟲媒病毒、本揚病毒科(bunyaviridae)、彈狀病毒、人免疫缺陷病毒和逆轉錄病毒。
            
 本發明進一步提供可用于治療傳染病的方法和組合物，所述傳染病包括，但不限于結核、麻風、克羅恩病、獲得性免疫缺陷綜合征、萊姆病、貓抓病、落基山斑疹熱和流感。
            
 本發明的抗感染方法和組合物含有一種或多種取代的乙二胺化合物。確切而言，這些化合物涵蓋廣泛的取代的乙二胺化合物，具有下列通式     
            
      取代的乙二胺   其中“R1NH”通常是從伯胺衍生的，且“R2R3N”通常是從伯胺或仲胺衍生的。本發明的乙二胺是借助模塊法制備的，且使用伯胺和仲胺作為結構單元，使胺部分與亞乙基連接基結構單元偶聯。代表性伯胺、無環仲胺和環狀仲胺分別如圖2、3和4中所示。
            
 一般而言，本發明乙二胺化合物的化學部分R1、R2和R3獨立地選自H；烷基；芳基；鏈烯基；炔基；芳烷基；芳烯基；芳炔基；環烷基；環烯基；雜烷基；雜芳基；鹵化物；烷氧基；芳氧基；烷硫基；芳硫基；甲硅烷基；甲硅烷氧基；二硫化物基團；脲基；氨基等，包括其直鏈或支鏈衍生物、其環狀衍生物、其取代的衍生物、其雜原子衍生物、其雜環衍生物、其官能化衍生物、其鹽(這類鹽包括，但不限于鹽酸鹽和乙酸鹽)、其異構體或其組合。例如，含氮雜環部分包括但不限于吡啶基(從吡啶衍生并且通過環碳鍵合)、哌啶基(從哌啶衍生并且通過環氮原子或環碳鍵合)和吡咯烷基(從吡咯烷衍生并且通過環氮原子或環碳鍵合)。取代或官能化的R1、R2和R3衍生物的實例包括，但不限于含有取代基的部分，所述取代基例如酰基、甲酰基、羥基、酰鹵、酰胺、氨基、疊氮基、酸、烷氧基、芳氧基、鹵化物、羰基、醚、酯、硫醚、硫酯、腈、烷硫基、芳硫基、磺酸及其鹽、硫醇、鏈烯基、炔基、硝基、亞胺、酰亞胺、烷基、芳基、其組合等。而且，在所述部分的烷基化衍生物的情況下，烷基取代基可以附著于所述化學部分，或者用于通過該烷基取代基與胺氮鍵合。
            
 本發明的化學部分R1、R2和R3的實例包括，但不限于H；甲基；乙基；丙基；丁基；戊基；己基；庚基；辛基；乙烯基；丙烯基；丁烯基；乙炔基；丙炔基；丁炔基；環丙基；環丁基；環戊基；環己基；環辛基；環丁烯基；環戊烯基；環己烯基；苯基；甲苯基；二甲苯基；芐基；萘基；吡啶基；呋喃基；四氫-1-萘基；哌啶基；吲哚基；二氫吲哚基；吡咯烷基；2-(甲氧基甲基)吡咯烷基；哌嗪基；喹啉基(quinolinyl)；喹啉基(quinolyl)；烷基化1，3-二氧戊環；三嗪基；嗎啉基；苯基；吡唑基；二氫茚基；二氫茚酮基；吡唑基；噻二唑基；繞丹寧基；硫內酯基；氧芴基；苯并噻唑基；高哌啶基；噻唑基；奎寧環基；異噁唑烷酮基；其任意異構體、衍生物或取代的類似物、或者任意取代或未取代的種類，例如醇、醚、硫醇、硫醚、叔胺、仲胺、伯胺、酯、硫酯、羧酸、二醇、二酯、丙烯酸、丙烯酸酯、甲硫氨酸乙酯、芐基-1-半胱氨酸乙酯、亞胺、醛、酮、酰胺或二烯。本發明的化學部分R1、R2和R3的進一步實例包括，但不限于下列種類或者下列種類的取代或烷基化衍生物，與胺氮共價鍵合呋喃、四氫呋喃、吲哚、哌嗪、吡咯烷、吡咯烷酮、吡啶、喹啉、蒽、四氫喹啉、萘、吡唑、咪唑、噻吩、吡咯烷、嗎啉等。所述種類或者這些種類的取代或烷基化衍生物的一個特征是它們可以以任意方式與胺氮共價鍵合，包括通過懸掛的取代基或烷基、通過酌情的雜原子或者通過酌情的環原子，這都可以為本領域普通技術人員所理解。
            
 本發明的化學部分R1、R2和R3還包括，但不限于環狀烷烴和環狀烯烴，包括橋連和非橋連的環。橋連環的實例包括，但不限于下列基團異松蒎基、冰片基、降冰片基、adamantanetetyl、順式-(-)-桃金娘烷基、金剛烷基、降金剛烷基、6-氮雜二環[3.2.1]辛烷、外-降冰片烷等。
            
 在本發明的一種實施方案中，NR2R3是從環狀仲胺衍生的。本發明的環狀化學部分NR2R3的實例包括，但不限于4-芐基哌啶；3-哌啶甲醇；哌啶；色胺；嗎啉；4-哌啶子基哌啶；1-哌嗪甲酸乙酯；1-(2-氨乙基)哌嗪；十氫喹啉；1，2，3，4-四氫吡啶并吲哚(在二者胺之一處的反應)；3-氨基-5-苯基吡唑；3-氨基吡唑；1-(2-氟苯基)哌嗪；1-脯氨酸甲酯；組氨醇；1-胡椒基哌嗪；六亞甲基亞胺；4-羥基哌啶；2-哌啶甲醇；1，3，3-三甲基-6-氮雜二環[3.2.1]辛烷；3-吡咯烷醇；1-甲基哌嗪；(S)-(+)-(2-吡咯烷基甲基)吡咯烷；1-甲基高哌嗪；2-乙基哌啶；1，2，3，4-四氫異喹啉；1-(4-脯苯基)哌嗪；d，l-色氨酸甲酯；(15，45)-(-)-2，5-二氮雜二環[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯；六氫異煙酰胺；七亞甲基亞胺；α-甲基色胺；6，7-二甲氧基-1，2，3，4-四氫異喹啉；3-氨基吡咯烷；3，5-二甲基哌啶；2，6-二甲基嗎啉；1，4-二氧代-8-氮雜螺[4.5]癸烷；1-羥甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；1，3，4，5，6，7，8-六氫-2H-吡啶并(1，2-A)嘧啶；1，2，3，4-四氫喹啉；1-(2-甲氧基苯基)哌嗪；1-(2-(2-羥基乙氧基)乙基)哌嗪；(S)-(+)-2-(氨甲基)吡咯烷；(3S(3a，4Ab)，8Ab)-N-叔丁基-十氫-3-異喹啉酰胺；(R)-環絲氨酸；高哌嗪；2，6-二甲基哌嗪(在二者胺之一處的反應)；亞氨基二芐基；5-甲氧基色氨酸；4，4′-聯哌啶；1-(2-羥乙基)哌嗪；4-甲基哌啶；1-組氨酸甲酯；或2-哌啶甲酸甲酯。
            
 R1HN取代基是從伯胺衍生的。R2R3N取代基通常是從伯胺或仲胺衍生的，但是也可以來自于氨基酸或氨基酸前體。氨基酸可以轉化為氨基醇。當采用氨基酸作為R2R3N部分的來源時，前體化合物尤其可以選自下列化合物和它們的衍生物d，l-色氨酸甲酯；1-甲硫氨酸乙酯；1-賴氨酸甲酯(經由二者伯胺之一處的反應)；(S)-芐基-1-半胱氨酸乙酯；1-精氨酸甲酯(經由二者伯胺之一處的反應)；1-谷氨酸乙酯；1-組氨酸甲酯；或(3S(3a，4Ab)，8Ab)-N-叔丁基-十氫-3-異喹啉酰胺。
            
 本發明取代的乙二胺化合物的R4部分通常選自H、烷基或芳基，但是R4還可以構成鏈烯基、炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、環烷基、環烯基等。R4化學部分的實例包括，但不限于H、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、環丁基、環戊基、環己基、環丁烯基、環戊烯基、環己烯基、苯基、甲苯基、二甲苯基、芐基、萘基、其直鏈或支鏈衍生物、其環狀衍生物、其取代的、官能化與雜原子衍生物、其雜環衍生物等。通常，R4選自H、甲基、乙基、丁基或苯基。不過，當R4是“H”時，乙二胺不包含乙胺丁醇。
            
 大多數本文所述乙二胺化合物優選地是利用固相支持體合成法制備的，如圖1所示代表性反應方案之一所述。不過，當R4是H時，反應進行不充分，此時R1NH2采用空間位阻胺，或者采用二胺，例如氨基亞烷基嗎啉或氨基亞烷基哌啶。當R4是甲基或苯基時，用于R3R2NH的空間位阻胺由于反應部位處的空間位阻而不會充分發揮作用。在這種情況下，競爭性水解反應生成對應的氨基醇，并且酰氨基亞乙基胺類的不完全還原干擾反應方案。其結果是所需二胺產物的生成收率低。
            
 乙二胺的制備優選地分六步完成，使用rink-酸樹脂。合成的第一步是通過在四氫呋喃(THF)中用三苯膦和六氯乙烷處理，將rink-酸樹脂轉化為rink-氯。這步之后，在二氯乙烷中，在Hunig氏堿(EtN(i-Pr)2)的存在下，加入伯胺。第三步是與樹脂連接的胺的酰化，利用圖1所示兩種酰化途徑之一。酰化步驟優選地是用下列試劑完成的α-氯乙酰氯、α-溴-α-甲基乙酰溴、α-溴-α-乙基乙酰溴、α-溴-α-丁基乙酰溴或α-氯-α-苯基乙酰氯，各自在吡啶的存在下，在THF中進行。還可以使用本領域技術人員已知的其他酰化試劑，不過，α-溴乙酰鹵導致產物收率低，這可能歸因于HBr的消去。酰化作用還可以經由肽偶聯機理完成，使用α-溴-α-甲基乙酸或α-氯-α-甲基乙酸，在苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷子基磷六氟磷酸鹽(PyBrop)和N1N二異丙基乙胺(EtN(i-Pr)2)，在二氯甲烷(DCM)和二甲基甲酰胺(DMF)中進行。仍然還可以使用本領域技術人員已知的其他酰化試劑。酰化步驟優選地進行兩次，以達到更好的酰化產物收率。
            
 第二種氮部分的引入優選地是這樣實現的，在Hunig氏堿的存在下，在二甲基甲酰胺(DMF)中。中間體胺-酰胺的還原是使用Red-Al進行的(3.4M氫化雙(2-甲氧基乙氧基)鋁鈉的甲苯溶液)。使用10％(體積比)三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)溶液將最終產物從樹脂上裂解下來。蒸發溶劑，借助質譜分析最終二胺產物的TFA鹽，并且篩選對結核分枝桿菌的有效性。利用上述固相支持體合成法制備的一些取代的乙二胺類也是利用下述溶液相合成法制備的。
            
 取代的乙二胺文庫的生成   圖1所示固相支持體合成法優選地用于制備取代的乙二胺文庫。固相合成法提供至少三種主要優點(i)減少對色譜工藝的需求，(ii)使用過量試劑驅使反應向高收率進行，和(iii)采用合成大量化合物的裂分和匯合技術。1，2-二胺文庫的固相支持體合成法以前是借助短鏈肽的還原作用完成的(Cuervo等，Peptides 1994Proceedings of theEuropean Peptide Symposium；Maia HSL Ed.，EsomLeiden，1995，465-466)。不過，如本文所述，乙二胺文庫是用胺而非簡單氨基酸產生的，以便結構單元單體的多樣性更大。每種支持體合成的前三步Rink-酸樹脂的活化、第一種胺的加入和酰化步驟是在  
            
     
            
210合成儀上的10ml試管中進行的，所述合成儀是由ARGONAUT  
            
     
            
Inc.，Foster City，California制造的。合成儀在5ml或10ml反應容器中同時處理多達二十種反應，以便迅速合成目標化合物。合成儀提供可編程的溫度控制和攪拌，和向反應容器自動遞送溶劑。第二種胺的加入、用Red-Al還原和從固體載體上裂解是在96孔化學穩定性平板的2ml小孔中進行的。
            
 在固相支持體合成之前，將如圖2、3和4所示第1至288號每種胺溶于DMF，得到一摩爾溶液，在三只96孔平板中有機化(每孔一種胺)，得到這些胺的三種主平板。在支持體合成法的前三步中從每種伯胺和特定R4基團生成個別鹵代乙酰基酰胺。然后將個別鹵代乙酰基酰胺匯集成十種或三十種為一組。最后將所匯集的樹脂在DCM/THF的2∶1混合物中的懸液分配在一只、兩只或三只反應平板中，以保證每孔有15-20mg懸液。所用反應平板數是基于可用懸液量的。使每孔所匯集的樹脂與來自主平板的對應胺反應。圖5提供代表性匯集的流程圖。每一反應發生在單獨的小孔中，在Hunig氏堿的存在下，在DMF中，在70-75℃下，達16-20小時。將每種所得胺-酰胺用65+w％Red-Al在室溫下還原。還原之后，用10％vol.TFA的DCM溶液裂解。蒸發每一反應小孔中的溶劑，并且分析二胺的TFA鹽(質譜)，且對結核分枝桿菌進行篩選。對恥垢分枝桿菌(M.smegamatis)篩選一只平板所匯集的二胺。在每只平板中隨機選擇兩行；也就是每只96孔平板選擇24份樣本，或者選擇文庫的25％，進行質譜檢查。下列實施例提供具體方案和詳細方法。
            
 對結核分枝桿菌的篩選   將如上所述制備的所合成的取代的乙二胺類的完整文庫(化合物的目標數量為約100,000)在乙胺丁醇(EMB)敏感性Luc測定法中對結核分枝桿菌進行體外篩選。還測定了MI C(最小抑制濃度)。MIC是生長抑制劑、這里是取代的乙二胺的最小濃度，在該濃度下所檢查的微生物不存在增殖。篩選是利用高通量篩選(HTS)Luc測定法進行的，重組分枝桿菌含有熒光素酶與EB-誘導性基因的融合啟動子(Luc測定法)。下文詳細描述Luc測定和MIC測定。這些測定法是本領域技術人員眾所周知的。基于這種初步篩選，300+種化合物混合物顯示抗TB活性。圖6代表熒光素酶報告菌株中的典型測定數據，所述菌株含有Rv0341 EMB-誘導型啟動子。圖6代表在一只96孔平板一行(D行)中所匯集的化合物混合物的最大發光數每秒百分比(％Max.LCPS)。
            
 反應性小孔的去褶合   結核分枝桿菌篩選揭示了大約300種活性化合物混合物，選擇它們進行去褶合。確切而言，選擇在HTS Luc測定法中活性大約＜12.5μM的小孔和/或MIC大約＜12.5μM的小孔，總計336個小孔。
            
 在每種活性化合物匯集物中借助每種取代的乙二胺化合物的離散再合成，進行去褶合。在每一活性小孔中所匯集的化合物是單獨合成和篩選的。每種活性匯集物中目標二胺化合物的合成是在96孔平板中進行的，使用存檔的α-鹵代乙酰基酰胺(與樹脂連接的鹵代乙酰基酰胺)，按照前述反應步驟進行(第二種胺的加入、用Red-Al還原和從固體載體上裂解)。在4℃下貯存存檔樹脂作為個別化合物。使用96孔平板進行其余合成步驟，如前所述。
            
 對每種去褶合后的化合物進行同一篩選試驗、MIC和HTS Luc測定。去褶合化合物的代表性發光數據如圖7和8所示。圖7和8代表個別化合物的發光數每秒(LCPS)。
            
 篩選結果總結   總之，去褶合篩選結果揭示了約2,000乙二胺化合物具有抗結核分枝桿菌的抑制活性。這些化合物中有150種以上表現等于或低于大約12.5μM的MIC。圖9總結了MIC為50μM或以下的全部所合成的離散化合物的MIC數據。圖10總結了在每種濃度下表現至少10％活性的全部化合物的Luc測定數據(結果不是累積的)。所得MIC和Luc活性是未純化樣本的，化學收率為大約20％，假定每一反應步驟的收率為80％。在Luc測定法中，32種化合物在1.56μM下表現活性，在MIC測定法中，至少11種化合物具有3.13μM的MIC。
            
 對取代的乙二胺活性貢獻最大的前十三種胺如圖11所示，每種胺是由它的數字編號所代表的。這些胺包括如下   #112，3-二甲基環己胺   #183，3-二苯基丙胺   #441-金剛烷甲胺   #472，2-二苯基乙胺   #63(S)-2-氨基-1-丁醇   #74.1  (-)-順式-桃金娘烷基胺   #77.1環辛胺   #78.12-金剛烷胺   #105a(1R，2R，3R，5S)-(-)-異松蒎基胺   #231 2-甲氧基苯乙胺   #255 (S)-環己基乙胺   #266 十一烷基胺   #272 香葉草基胺   其他有助于取代的乙二胺類活性的胺類如表2所示。表2中的化合物根據它們的MIC結果歸類。其中一些化合物是在  
            
     
            
合成儀上以較大量合成的(2-60mg)，并且經過半制備型C18-柱HPLC純化，如表3所示。一般而言，表3中每種化合物的最終純度為至少90％。
            
 在一種實施方案中，本發明包括包含化合物109和化合物73的組合物。
            
 在另一種實施方案中，本發明包括包含化合物109和化合物73和標準結核藥物的組合物。
            
 在另一種實施方案中，本發明包括治療因傳染原導致的疾病的方法，包括給予有效量的化合物109。
            
 本發明的另一種實施方案包括治療因傳染原導致的疾病的方法，包括給予有效量的化合物109和化合物73。
            
 在另一種實施方案中，本發明包括治療因傳染原導致的疾病的方法，包括給予有效量的化合物109和化合物73和標準結核藥物。
            
 在另一種實施方案中，本發明包括治療因傳染原導致的疾病的方法，包括給予有效量的化合物109和化合物73和藥用載體。
            
 表2     
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
      表3   供進一步體外評價的大量合成的化合物     
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
        
            
      本發明還涉及新的可用于對抗傳染病的二胺化合物文庫。為了進一步增強在先二胺化合物的結構多樣性，已經開發了這樣一種合成流程，向兩種胺組分之間的橋連基團結合氨基酸。氨基酸的使用可以實現不同的連接要素以及偏光性，參見圖42的代表性實例。按照96孔格式、在mmol規模上制備二胺化合物，每孔匯集10種化合物(就大多數平板而言)。表25(圖43)總結了合成平板的數據。
            
 反應方案如圖44所示。
            
 采用Rink樹脂的固相合成   準備二十一只96孔平板。利用六步合成途徑，從與用于產生前100,000種化合物文庫相似的Rink樹脂開始(方案1，圖41)，制備目標二胺(方案5，圖44)。總之，這些方案的所有步驟都是相似的，其中一步除外(步驟4)，此時發生第二種氨基官能度的生成。在方案1中，經由連接基C1官能的親核置換向分子中引入第二種胺作為全部合成子，而在方案5中，這是通過現有氨基部分被羰基化合物的修飾。
            
 按照Garigipati方案進行第一種胺與載體的連接。借助在THF中用三苯膦和二氯乙烷處理，將Rink-酸樹脂(Novabiochem)轉化為Rink-氯。然后在二氯乙烷中，在Hunig氏堿的存在下加入胺N1，加載這種活化的樹脂。胺N1包括但不限于烷基和芳基伯胺。從以前在100,000文庫制備中用作N1的177種伯胺中，基于乙二胺衍生物(來自以前的～100K文庫)的體外活性數據以及結構多樣性(圖45和46)，在這種方案中僅選擇30種。
            
 下一步，在HATU(O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽)和EtN(i-Pr)2的存在下，在DCM/DMF中，在室溫下，經由與FMOC-保護的氨基酸的肽偶聯作用完成酰化反應。該反應進行兩次，以提高產物收率。用于產生這種文庫的氨基酸列表如表26(圖47)所示。
            
 借助在室溫下與哌啶的反應，進行去保護(FMOC基團的除去)。在NaBCNH3的存在下，在室溫下，時間72-96小時，借助與各種羰基化合物的還原性烷基化作用，實現氨基的衍生，所述羰基化合物例如醛、酮和羧酸。羰基化合物的選擇是這樣進行的，以便最終的二胺產物將攜帶與從以前乙胺丁醇類似物文庫產生的化合物相同或相似類型的取代基，以及結構多樣性(圖48)。所用羰基化合物的完整列表如表27(圖49)所示。
            
 在室溫下，使用可溶性還原劑65+w％Red-Al進行氨基亞乙基酰胺向對應二胺的還原。利用10％三氟乙酸的二氯甲烷溶液，實現產物從樹脂上的裂解，導致二胺TFA鹽的生成。
            
 就文庫的生成而言，在每管0.1-0.15g樹脂的規模上，利用Quest210合成儀進行合成方案的前三步(樹脂活化、胺加載和酰化)。在酰化之后，將所生成的樹脂徹底洗滌，干燥，然后每十份樹脂匯集在一起。在匯集之前將少量每份樹脂(～0.05g)存檔，以促進再合成和活性成分的去褶合。
            
 FMOC基團的去保護、羰基組分的加入、還原和裂解是在96孔反應組件中進行的，采用Whatman Polyfiltronics的Combiclamps系統或者Robbins Scientific的FlexChem系統。將所匯集的樹脂在DCM/THF的2∶1混合物中的懸液均勻分布在一只反應平板中，每孔大約10mg樹脂。將96種不同的羰基化合物排列在一只96孔平板模板中，每孔一種羰基化合物加入到十份樹脂的每一單獨匯集物中，預期每只平板生成960種二胺。按照相同的格式進行還原，裂解，過濾到貯存平板中，然后蒸發TFA，再進行生物測定。
            
 每只平板隨機選擇兩行(16份樣本)，占總數的17％，借助電子噴射電離質譜法進行所制備化合物的質量評估。化合物的成功生成基于計算質量的分子離子的出現。根據用于合成的氨基酸，觀測預測離子的百分比，因此生成所預測的化合物，從5-60％不等(表25，圖43)。基于MS分析，在目標20,000種化合物中，實際生成4,500種二胺。
            
 如上所述，本領域中需要有效性抗傳染病的新化合物和方法。更具體地說，對有效治療分枝桿菌疾病的新化合物和方法存在需求。本發明通過提供有效治療傳染病(包括，但不限于結核)的新穎的組合物和方法滿足了現有技術長期渴望的需求。
            
 在一個實施方案中，本發明包括用于治療傳染病的來自表3(化合物1-165)的至少兩種化合物。
            
 在另一個實施方案中，本發明包括一種或多種用于治療傳染病的表3(化合物1-165)的一種或多種新化合物與藥物的聯合用藥。
            
 在另一個實施方案中，將包含化合物1-165中的至少一種的組合物與一種或多種治療結核分枝桿菌的藥物聯用。
            
 在另一個實施方案中，將包含選自化合物1-165的一種或多種新化合物的組合物與一種或多種藥物聯用，以便提供作為治療分枝桿菌疾病的方法中有活性的協同作用。
            
 在一個實施方案中，本發明包括包含表3的一種或多種化合物與至少一種已知的標準結核藥物的組合物。
            
 在另一個實施方案中，治療傳染病的方法包括表3中的一種或多種化合物與至少一種已知標準結核藥物。盡管不希望受到如下理論的約束，但是認為標準結核藥物與包括化合物1-165的至少一種或多種化合物的聯合用藥產生了導致治療或預防傳染病(包括，但不限于結核)的協同作用。
            
 鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺單獨和聯用對結核分枝桿菌的殺菌活性由Dickinson等討論(Am Rev Respir Dis116(4)627-35)使結核分枝桿菌在Tween-清蛋白培養基中的對數期培養物接觸濃度范圍為可能存在于在治療患者過程中的血清中的鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺。將這些藥物的殺菌活性測定為在4和7天時的存活計數下降。單一藥物的活性是鏈霉素最高且接下來最高的是利福平和異煙肼，而乙胺丁醇僅在4天后開始殺菌。當接觸2種藥物時，使用鏈霉素/異煙肼和異煙肼/乙胺丁醇發現了殺菌協同作用；使用鏈霉素/利福平發現了相加作用；使用異煙肼利福平(isoniazid rifampin)和鏈霉素/乙胺丁醇發現無差別；并且使用利福平/乙胺丁醇和異煙肼/吡嗪酰胺發現了拮抗作用。當使培養物接觸3種藥物，異煙肼/利福平和乙胺丁醇時，發現了異煙肼與利福平之間顯著的拮抗作用，而添加異煙肼或增加其濃度提高了殺菌活性。如本文所述的包括新乙二胺組合物的聯合療法在本發明之前尚未得到確認。
            
 本發明涵蓋聯合療法，它包括如上文所述的新乙二胺組合物與一種或多種抗結核藥物，包括，但不限于利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇。本文還包括這類抗結核藥的類似物和化學等效物和取代物。例如，本發明涵蓋利福平及其類似物，包括，但不限于利福噴汀、利福拉齊和利福布汀的應用。
            
 在另一個實施方案中，本發明包括有效抗偶發分枝桿菌、海分枝桿菌、幽門螺桿菌、肺炎鏈球菌和白色念珠菌的組合物，它包含至少一種選自化合物1-165的化合物。
            
 在另一個實施方案中，本發明包括有效抗偶發分枝桿菌、海分枝桿菌、幽門螺桿菌、肺炎鏈球菌和白色念珠菌的組合物，它包含至少一種選自化合物1-165的化合物，可選地合并一種或多種抗結核藥，其中所述的抗結核藥包括但不限于利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇及其類似物。
            
 制劑   可以利用已知的技術，例如使用藥學上可接受的載體，將治療劑，包括含有本發明取代的乙二胺化合物的組合物制成生理學上可接受的制劑。例如，將取代的乙二胺化合物與藥學上可接受的賦形劑合并，制成治療組合物。
            
 本發明組合物可以以固體、液體或氣霧劑的形式給藥。固體組合物的實例包括丸劑、霜劑、皂劑和可植入的劑量單元。丸劑可以被口服給藥。治療性霜劑和抗分枝桿菌皂可以被局部給藥。可植入的劑量單元可以被局限性給藥，例如在肺中，或者可以被植入進行治療組合物的全身釋放，例如皮下方式。液體組合物的實例包括適合于肌內、皮下、靜脈內、動脈內注射的制劑和用于局部與眼內給藥的制劑。氣霧劑的實例包括吸入制劑，用于對肺給藥。
            
 本文所用緩釋基質的制成材料通常為聚合物，它們可被酶作用或酸/堿水解作用或者溶解作用所降解。一旦插入體內，基質受到酶和體液的作用。緩釋基質可取地是從生物相容性材料中選擇的，包括但不限于脂質體、聚交酯、聚乙醇酸交酯(乙醇酸的聚合物)、聚交酯-共-乙交酯(乳酸與乙醇酸的共聚物)、聚酐、聚(原)酯、多肽、透明質酸、膠原、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。優選的生物可降解性基質是聚交酯、聚乙醇酸交酯或聚交酯-共-乙交酯中的一種。
            
 組合物的劑量將依賴于所治療的病癥、所使用的特定組合物和其他臨床因素，例如患者的體重與條件和給藥的途徑。適合的劑量可以是100至0.1mg/kg。更優選的劑量可以是50至0.2mg/kg。更優選的劑量可以是25至0.5mg/kg。片劑或其他介質形式可以含有1至1000mg取代的乙二胺。可以采用與乙胺丁醇或其他抗結核藥相似的劑量范圍和給藥計劃。
            
 可以將組合物與其他用于治療其他與分枝桿菌疾病聯合發生的障礙的組合物和工藝聯合給藥。例如，結核經常作為與獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)有關的繼發性并發癥而發生。接受包括手術、放射或化療在內的AIDS治療的患者可以受益于本文所述方法和組合物。
            
 下列具體實施例將闡述發明，應用于取代的乙二胺化合物的確切合成和結核分枝桿菌集落生長的體外與體內抑制。另外，R.Lee et al.J.Comb.Chem 2003，5，172-187的教導全文結合在此作為參考。顯然，包括化學工藝上的微小變化在內的其他實施例對本領域技術人員而言將是顯而易見的，本發明并不限于這些具體闡述的實施例。
            
 實施例I   生成乙二胺文庫   Rink-酸樹脂是從  
            
     
            
Inc.，San Diego，California得到的。溶劑乙腈、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二氯乙烯、甲醇和四氫呋喃是從  
            
     
            
Milwaukee，Wisconsin購買的，買來即用。所有其他試劑都是從SIGMA-  
            
     
            
West Monroe Highland，Illinois購買的。固相合成是在  
            
     
            
210合成儀上進行的，來自ARGONAUT  
            
     
            
Foster City，California，借助組合化學設備，來自  
            
     
            
     
            
(Kent，England；Rockland，Massachusetts)和ROBBINS  
            
     
            
Sunnyvale，California。溶劑的蒸發是用  
            
     
            
AES進行的，來自  
            
     
            
Holbrook，NewYork。所有必要的色譜分離都是在WATERS′ALLIANCE HT  
            
     
            
Milford，Massachusetts上進行的。分析型薄層色譜是在  
            
     
            
硅膠60F254平板上進行的，購自SIGMA-  
            
     
            
West Monroe Highland，Illinois。
            
 Rink-酸樹脂的活化、第一種胺的加入和酰化步驟是在10ml試管中進行的，使用  
            
     
            
210合成儀。第二種胺的加入、用Red-Al還原和從固體載體上裂解是在96深孔(2ml)化學穩定性平板中進行的。
            
 A.Rink-酸樹脂的活化   Rink-酸樹脂的連接基團覆蓋率為每克樹脂0.43-0.63mmol。將四至五克這種樹脂懸浮在80ml二氯甲烷與四氫呋喃(THF)的2∶1混合物中，分布在十只10ml試管中，每管8ml樹脂懸液。將每份懸液過濾，用THF洗滌兩次。制備三苯膦(3.80g，14.5mmol)的30ml THF溶液，將3ml這種溶液加入到每只試管中，然后加入3ml六氯乙烷的THF溶液(3.39g/14.3mmol六氯乙烷/30ml THF)。在室溫下攪拌六小時后，將每份活化的樹脂用THF洗滌兩次，用二氯甲烷洗滌兩次。
            
 B.第一種胺的加入   向含有活化Rink樹脂的每只試管加入3ml二氯乙烷、0.3ml(1.74mmol)N1N-二異丙基乙胺(EtN(iPr)2)和相應的胺(1mmol左右)。如果選定胺在室溫下是固體，那么加入它在DMF中的溶液或懸液。向每只試管加入足量二氯乙烷至最終體積8ml。將反應混合物在45℃下加熱6-8小時。將樹脂過濾，用二氯甲烷與甲醇的2∶1混合物洗滌(1×8ml)，然后用甲醇洗滌(2×8ml)，然后在氬下干燥10分鐘。
            
 C.鹵代酰氯的酰化   a.用氯乙酰氯酰化.將每份樹脂用THF預洗滌(2×8ml)，然后加入THF(8ml)、吡啶(0.3ml，3.67mmol)和氯乙酰氯(0.25ml，2.5mmol)。將反應混合物在45℃下攪拌8小時，然后在室溫下攪拌6-8小時。將每份樹脂過濾，用二氯甲烷/甲醇的2∶1混合物(1×8ml)、甲醇(2×8ml)和THF(2×8ml)洗滌。利用相同的試劑負載重復酰化，但是反應時間較短，在45℃下4小時和在室溫下2小時。然后將每份樹脂過濾用二氯甲烷與甲醇的2∶1混合物(1×8ml)、再用甲醇(3×8ml)洗滌。將每份樹脂在氬下干燥10分鐘。然后將每份樹脂轉移至小瓶中，在真空干燥器中干燥1小時。
            
 b.用α-苯基-α-氯乙酰氯酰化.利用與用氯乙酰氯酰化所述相同的工藝。使用2.5mmol過量的α-苯基-α-氯乙酰氯，相對于Rink-酸樹脂中連接基團的mmol量而言。
            
 c.用α-鹵代-α-甲基、α-鹵代-α-乙基和α-鹵代-α-丁基乙酰溴酰化.使用α-溴丙酰溴(R4＝Me)、α-溴丁酰溴(R4＝Et)與α-溴己酰溴(R4＝Bu)的1∶1∶1混合物(體積比)，得到摩爾比為0.52∶0.56∶0.42(mmol)。如果樹脂的原始覆蓋率為0.63mmol/g(0.5g樹脂每管)，摩爾過量分別為1.65、1.75和1.31，如果樹脂的原始覆蓋率為0.43mmol/g(0.5g樹脂每管)，摩爾過量分別為2.4、2.6和1.9。
            
 d.用α-氯-α-甲基乙酸酰化.將每份樹脂用二氯甲烷預洗滌。向每只試管加入3ml PyBrop(0.29g，0.62mmol)的二氯甲烷溶液、α-氯-α-甲基乙酸(0.095g，0.62mmol)的3ml DMF溶液和EtN(iPr)2(0.2ml，1.2mmol)。使每種反應混合物在室溫下反應16-18小時。然后將每份樹脂過濾，用二氯甲烷(2×8ml)和甲醇(2×8ml)洗滌，重復酰化。然后將每份樹脂過濾，用二氯甲烷(2×8ml)、甲醇(3×8ml)洗滌，在氬下干燥約10分鐘。將每份樹脂轉移至小瓶中，在真空干燥器中干燥1小時。
            
 D.第二種胺的加入   將十份或三十份從前三步制備的α-鹵代乙酰基酰胺樹脂匯集在一起，每種樹脂留出0.05-0.10克供必要的去褶合。將所匯集的樹脂混合物在100ml二氯甲烷與THF的2∶1混合物中的懸液分布在一只、兩只或三只96孔反應平板中。就一只反應平板而言，使用1.7至2.0克樹脂。就兩只反應平板而言，使用3.0至3.3克樹脂，就三只反應平板而言，使用4.7至5.0克樹脂。然后將所分布的懸液用一種過濾歧管過濾，這是一種小型輕量級歧管，一般用于從96孔反應平板空間中抽取溶劑和試劑。將反應平板轉移至  
            
     
            
(Huntington，WestVirginia)，加入10％EtN(iPr)2的DMF溶液，每孔0.2ml(每孔0.21mmolEtN(iPr)2)，然后加入來自相應主平板的1.0M適當胺的溶液，每孔0.1ml(每孔0.1mmol胺)。利用  
            
     
            
在合成期間容納96孔反應平板，以便向平板加入試劑，并且適當地密封，使試劑和溶劑在高溫下維持數小時。這些夾子由頂蓋和底蓋組成，帶有可變形的、化學穩定性密封墊。它們被設計成在頂蓋與底蓋之間容納96孔反應平板。將反應平板密封，在70-75℃烘箱中保持16小時。冷卻至室溫后，將樹脂過濾，用DCM/甲醇的1∶1混合物(1×1ml)、甲醇(2×1ml)洗滌，然后在真空干燥器中干燥2小時。
            
 E.用Red-Al還原   將反應平板置于  
            
     
            
中。加入Red-Al(65+w％甲苯溶液)與THF的1∶6混合物，每孔0.6ml(每孔0.28mmol Red-Al)，反應4小時。然后將每份樹脂過濾，用THF(2×1ml)和甲醇(3×1ml)洗滌。甲醇的加入應當加以小心。然后將每份樹脂在真空下干燥。
            
 F.最終乙二胺化合物的裂解   該步驟是利用裂解歧管進行的，這是一種涂有特氟隆的鋁制過濾/收集真空歧管，被設計成將裂解產物從反應平板中回收到收集平板中。歧管的設計確保了來自每孔的濾液流向接收性96孔收集平板的對應小孔。向反應平板(置于該歧管中收集平板頂部)加入TFA、二氯甲烷與甲醇的10∶85∶5混合物(每孔0.5ml混合物)。十五分鐘后，將溶液過濾，收集到收集平板上的適當小孔中。重復該工藝。在SPEED  
            
     
            
Holbrook，New York上蒸發溶劑，殘留樣本(TFA鹽)無需進一步純化即可試驗。
            
 實施例II   去褶合實施例   借助離散化合物從存檔α-鹵代乙酰基酰胺樹脂的再合成(10份樹脂，每份0.05-0.10g)，進行活性小孔的去褶合，所述樹脂在匯集之前的酰化步驟結束時被留出備用。為每份樹脂指定96孔過濾平板中的離散欄(1或2或3，參見模板)，分為X行(A，B，C等)，其中X是在原始篩選平板中所發現的命中數。向一行中的每一小孔加入選定N2(R3R2NH)胺(0.1mmol)、DMF(180ml)和EtNiPr2(20ml)第一種選定胺加入到“A”行樹脂中，第二種胺加入到“B”行樹脂中，第三種胺加入到“C”行樹脂中，等等。代表性96孔過濾平板的布局如表4所示。
            
 借助離散化合物從存檔α-鹵代乙酰基酰胺樹脂的再合成(10份樹脂，每份0.05-0.10g)，進行活性小孔的去褶合，所述樹脂在匯集之前的酰化步驟結束時被留出備用。為每份樹脂指定96孔過濾平板中的離散欄(1或2或3，參見模板)，分為X行(A，B，C等)，其中X是在原始篩選平板中所發現的命中數。向一行中的每一小孔加入選定N2(R3R2NH)胺(0.1mmol)、DMF(180ml)和EtNiPr2(20ml)第一種選定胺加入到“A”行樹脂中，第二種胺加入到“B”行樹脂中，第三種胺加入到“C”行樹脂中，等等。代表性96孔過濾平板的布局如表4所示。
            
 將反應平板密封，在70-75℃烘箱中保持16小時。冷卻至室溫后，將樹脂過濾，用DCM與甲醇的1∶1混合物(1×1ml)、甲醇(2×1ml)洗滌，在真空干燥器中干燥2小時。按照原始合成方案步驟5和6進行還原和裂解。用ESI-MS(電子噴射電離質譜)分析裂解產物小孔，以保證活性成分的同一性，在相同的Luc和MIC測定法中試驗。
            
 表4   代表性96孔過濾平板的布局      實施例III   利用  
            
     
            
210合成儀固相合成選定取代的乙二胺化合物   利用上述實施例I所述固相方案成規模地合成選定取代的乙二胺化合物。這里，從Rink-酸樹脂的活化到最終產物的裂解的所有反應步驟都是僅用  
            
     
            
儀器進行的，它允許二十種平行反應的同時合成。所有粗樣本的純化都是用HPLC進行的，得到所需產物的純度大于90％。表3列舉取代的乙二胺的規模。這里，描述一種活性化合物N-香葉草基-N′-(2-金剛烷基)乙烷-1，2-二胺的合成作為實例。
            
 N-香葉草基-N′-(2-金剛烷基)乙烷-1，2-二胺(化合物109)的制備如圖12所述。
            
   
            
      化合物109   1.Rink-酸樹脂的活化。Rink-C1樹脂的合成。將覆蓋率(連接基)為0.43至0.63mmol/g的Rink-酸樹脂(0.8g，0.5mmol)置于  
            
     
            
210合成儀的一只10ml試管，用THF洗滌兩次。加入三苯膦(0.380g，1.45mmol)的THF(3ml)溶液，繼之以加入六氯乙烷(0.4g，1.43mmol)的THF(3ml)溶液。加入THF至試管容量(大約2ml)。6小時后，將樹脂過濾，用THF(2×8ml)和二氯甲烷(2×8ml)洗滌。
            
 2.第一種胺的加入。與樹脂連接的香葉草基胺的合成。向含有活化樹脂的試管加入3ml二氯乙烷、EtN(iPr)2(0.3ml，1.74mmol)和香葉草基胺(0.230g，1.5mmol)。加入二氯乙烷至體積8ml。反應在45℃下進行8小時，在室溫下進行6-8小時。將加載有香葉草基胺的樹脂過濾，用二氯甲烷與甲醇的2∶1混合物洗滌(1×8ml)，然后用甲醇洗滌(2×8ml)，在氬下吸干10分鐘。
            
 3.用氯乙酰氯酰化。與樹脂連接的N-香葉草基-α-氯乙酰胺的合成。將樹脂用THF預洗滌(2×8ml)。向試管加入8ml THF、吡啶(0.3ml，3.67mmol)和氯乙酰氯(0.2ml，2.5mmol)，在45℃下攪拌8小時，在室溫(RT)下攪拌6-8小時。反應完全后，將樹脂過濾，用二氯甲烷與甲醇的2∶1混合物(1×8ml)、甲醇(2×8ml)洗滌，利用相同的試劑加載重復酰化，但是反應時間較短45℃下4小時和室溫下2小時。最后，將加載有α-氯乙酰胺的樹脂過濾，用二氯甲烷與甲醇的2∶1混合物(1×8ml)、甲醇(3×8ml)洗滌，在氬下吸干15分鐘。
            
 4.第二種胺的加入。與樹脂連接的N-香葉草基-N′-(2-金剛烷基)乙酰胺的合成。向含有樹脂的試管加入DMF(3ml)和EtN(iPr)2(0.6ml，4.4mmol)，繼之以加入2-金剛烷胺鹽酸鹽(2.0g，1.1mmol)的DMF(4ml)懸液，在70-75℃下攪拌16小時。冷卻至室溫后，將樹脂過濾，用DCM與甲醇的1∶1混合物(1×8ml)、甲醇(2×8ml)洗滌，在氬下吸干15分鐘。
            
 5.用Red-Al還原。與樹脂連接的N-香葉草基-N′-(2-金剛烷基)乙烷-1，2-二胺的合成。在試管中，將所得樹脂懸浮在無水THF(3ml)中，攪拌15分鐘。加入商業上可得到的Red-Al(65+w％甲苯溶液)(2.0ml，6.4mmol)，繼之以加入2-3ml無水THF(充滿試管容量)。使混合物反應4小時。反應后，將樹脂過濾，用THF(1×8ml)、THF與甲醇的1∶1混合物(1×8ml)(MeOH的加入應當加以小心)、甲醇(3×8ml)洗滌，然后干燥。
            
 6.從樹脂上裂解和純化。N-香葉草基-N′-(2-金剛烷基)乙烷-1，2-二胺乙酸鹽的合成。就這最后一步合成而言，向含有樹脂的試管加入TFA與二氯甲烷的10∶90混合物，將所形成的淺紅色懸液攪拌30分鐘。加入MeOH(0.5ml)后，將無色懸液過濾，將濾液收集在適當的試管中。重復該工藝，在  
            
     
            
上蒸發溶劑。將一半量粗的N-香葉草基-N′-(2-金剛烷基)乙烷-1，2-二胺(三氟乙酸鹽的形式)用HPLC純化，采用下列條件柱C18，流速4ml/min，運行30min，梯度開始于5％AcOH/MeOH(100％)、終止于乙腈(100％)。得到27mg N-香葉草基-N′-(2-金剛烷基)乙烷-1，2-二胺二乙酸鹽，收率24％，NMR純度98％。
            
 實施例IV   活性化合物的代表性溶液相合成   作為鹽酸鹽的N-(環辛基)-N′-(1R，2R，3R，5S)-(-)-異松蒎基乙烷-1，2-二胺(化合物59)的制備如圖13所述。
            
   
            
      化合物59   溴代環辛基乙酰胺。在0℃下，向環辛胺(3.3g，0.026mol)與吡啶(2.42g，0.031mmol)在無水THF(80ml)中的混合物經由注射器滴加溴乙酰溴(5.78g，0.029mol)。借助冰浴維持反應溫度。使反應混合物逐漸溫熱至室溫，在室溫下攪拌1小時。過濾除去沉淀，用乙醚洗滌(1×30ml)，將濾液在旋轉蒸發器上濃縮至干。溴代環辛基乙酰胺直接進行第二步無需另外的純化。
            
 N-(環辛基)-N′-(1R，2R，3R，5S)-(-)-異松蒎基-1-羰基乙烷-1，2-二胺。向溴代環辛基乙酰胺的DMF(60ml)溶液加入Hunig氏堿(4.64g，0.036mol)和(1R，2R，3R，5S)-(-)-異松蒎基胺(4.5g，0.029mol)，將反應混合物在80℃下攪拌16小時。冷卻至室溫后，將反應混合物用150ml乙醚稀釋，用1M NaOH溶液洗滌(2×50ml)。將有機層用鹽水洗滌(1×50ml)，經MgSO4干燥，在旋轉蒸發器上濃縮至干。殘余物(11.04g)為褐色的油，經過  
            
     
            
(Isco，Lincoln，Nebraska，USA)純化，采用商業上可從  
            
     
            
(Biotage，Inc.ofDyax Corp，Va，USA)得到的硅膠藥筒和下列移動相梯度運行30min，開始于DCM 100％、終止于DCM∶MeOH∶NH4OH混合物(600∶400∶10)。得到終產物(7.29g)，為褐色的油；收率76％，純度90％。
            
 N-(環辛基)-N′-(1R，2R，3R，5S)-(-)-異松蒎基乙烷-1，2-二胺。向來自前一步的酰胺的無水THF(160ml)溶液經由注射器滴加商業上可得到的(SIGMA-  
            
     
            
)Red-Al，為65wt％THF溶液(28ml，0.09mol)。將反應混合物在回流下攪拌20小時。冷卻至室溫后，將反應混合物倒入1.5M NaOH(200ml)中，用乙醚萃取(2×100ml)。將有機層用鹽水洗滌(1×100ml)，經MgSO4干燥，在旋轉蒸發器上蒸發至干，得到7.2g粗產物，為褐色的油。利用與前一步相同的設備和條件進行粗產物的色譜純化，得到3.5g二胺。將二胺用2.0M HCl的乙醚溶液(25ml)處理，在冰箱中保存過夜。生成暗黃色固體(4.2g)，濾出，從MeOH和乙醚中重結晶，得到1.5g二胺，為HCl鹽(純度大于98％，NMR和MS可用)，總收率19％。
            
 實施例V   質譜分析   質譜數據是借助電子噴射電離技術得到的，采用帶有自動進樣器的PERKIN  
            
     
            
API-300，TQMS，由  
            
     
            
Toronto，Canada制造。
            
 A.取代的乙二胺的文庫   質譜充當監測乙二胺文庫反應結果的手段。在每只反應平板上隨機選擇兩行(24份樣本)進行質譜，每孔匯集10種或30種化合物，共計大約28,000種化合物。因而，如果合成了每孔十種化合物，每孔的質譜應當含有十種信號，與每種化合物的適當分子離子有關。特定信號的存在與否表明特定合成的可行性。基于各種胺的質譜數據和反應性的一般分析，估計在112,000種化合物中生成了67,000種化合物。
            
 圖14是一個樣本小孔的代表性質譜圖形。代表性乙二胺化合物的質譜如圖15所示、下表5至8列舉代表性反應小孔的質譜數據范例，每孔含有十種取代的乙二胺。
            
 表5   代表性乙二胺的質譜數據范例(每孔十種化合物)         表6   所合成的乙二胺的質譜數據     
            
        
            
        
            
      表7   所合成的乙二胺的質譜數據，R4＝H和Me     
            
        
            
      表8   所合成的乙二胺的質譜數據，R4＝H和Me     
            
        
            
      實施例VI   1H NMR光譜   質子NMR數據是在  
            
     
            
核磁共振光譜計(Palto Alto，California)上記錄的，頻率500MHz。
            
 將代表性取代的乙二胺用HPLC純化，用質子NMR分析。代表性質子NMR圖形如圖16所示。一些代表性命中化合物的NMR和MS數據如下所示。
            
 化合物6.   N2-(1-金剛烷基甲基)-N1-(3，3-二苯基丙基)丙-1，2-二胺。55mg，36％收率。1H NMRδ7.28-7.15(m，5H)，3.95(t，J＝7.9Hz，1H)，2.94(br s 4H)，2.71(dd，J＝7.6，9.8Hz，2H)，2.41(s，2H)，2.32(dd，J＝7.6，7.9Hz，2H)，2.16(s)，2.08-1.98(m，4H)，1.72(m，6H)，1.62(m，6H)，1.51(d，J＝2.4Hz，3H)。質譜(ESI)m/z(MH)+417。
            
 化合物7.   N-(3，3-二苯基丙基)-N’-(1-金剛烷基甲基)乙-1，2-二胺。28mg，22％收率。1H NMR(500MHz)δ7.30-7.12(m，10H)；3.95(t，J＝7.6Hz，1H)；2.91(d，J＝1.2Hz，4H)；2.70(dd，J＝7.6和1.2Hz，2H)；2.40(d，J＝1.3Hz，2H)；2.32(q，J＝8.0Hz，2H)；1.98(brd，J＝1.7Hz，4H)；1.72(d，J＝12.2Hz，4H)；1.62(d，m？J＝12.2Hz，4H)；1.51(br s，6H)。質譜(ES I)m/z(MH)+403.6。
            
 化合物10.   N-(-)-順式-桃金娘烷基-N’-(3，3-二苯基丙基)乙-1，2-二胺。14mg，11％收率。1H NMR(500MHz)δ7.30-7.10(m，10H)；3.95(m，1H)；2.92-2.83(m，4H)；AB2.80(d，J＝7Hz，1H)；2.76(d，J＝8Hz，1H)；；2.65(dd，J＝9.6和7.6Hz，2H)；2.42-2.20(m，4H)，2.29(d，J＝8Hz，2H)，1.90(m，8H)；1.42(m，1H)；1.19(m，2H)；1.17(s，3H)；0.95(s，3H)；，1.00-0.8(m，2H)。質譜(ESI)m/z(MH)+391.3。
            
 化合物14.   N-(3，3-二苯基丙基)-N’-外-(2-降冰片基)乙-1，2-二胺。17mg，16％收率。1H NMR(500MHz)δ7.30-7.15(m，10H)；3.95(t，J＝7.9Hz，1H)；2.86(dd，J＝11.5和1.5Hz，4H)；2.73(dd，J＝8.0和3.3Hz，1H)；2.64(t，J＝7.6Hz，2H)；2.29(t，J＝7.5Hz，2H)，2.31-2.26(m，2H)2.30 1.96(s，3H)；1.63(ddd，J＝13.1，7.9和2.5Hz，1H)；1.60-1.50(m，1H)；1.50-1.43(m，2H)；1.30(dq，J＝4.0和13.5Hz，1H)，(1H，m)，1.20(dd，J＝10.4和1.1Hz，1H)，1.11(dd，J＝2.0，和8.5Hz，1H)，1.08(dd，J＝2.5，和8.5Hz，1H)，1.10(dq，J＝8.3和2.1，2H)。質譜(ESI)m/z(MH)+349.1。
            
 化合物21.   N-(3，3-二苯基丙基)-N’-(1S)-(1-乙基環己烷)乙-1，2-二胺。5mg，4％收率。質譜(ESI)m/z(MH)+365.5。
            
 化合物32.   N-(2，2-二苯基乙基)-N’  
            
     
            
(+)-冰片基乙-1，2-二胺。58mg，48％收率。1H NMR(500MHz)δ7.30-7.10(m，10H)；4.18(t，J＝6.8Hz，1H)；3.34(d，J＝7.6Hz，2H)；3.02(m，4H)；2.95-2.90(m，1H)；2.15-2.08(m，1H)；1.94(m，1H)；1.72-1.65(m，2H)；1.48-1.30(m，2H)；1.27-1.10(m，2H)；1.06(dd，J＝13.6和4.1Hz，1H)；0.82(s，3H)；0.81(s，3H)；0.78(s，3H)。質譜(ESI)m/z(MH)+377.2   化合物34.   N-(2，2-二苯基乙基)-N’-(1-金剛烷基甲基)乙-1，2-二胺。6.8mg，6％收率。1H NMR(500MHz)δ7.30-7.15(m，10H)；4.15(t，J＝7.6Hz，1H)；3.24(dd，J＝7.9和1.2Hz，2H)；2.79(t，J＝6.5Hz，2H)；2.74(t，J＝6.0Hz，m，2H)；1.95(m，8H)；1.69(d，J＝12.5Hz，4H)；1.59(d，J＝11.9Hz，4H)；1.40和1.39(br s，3H)；質譜(ESI)m/z(MH)+389.0。
            
 化合物37.   N-(2，2-二苯基乙基)-N’-(-)-順式-桃金娘烷基乙-1，2-二胺。54mg，38％收率。1H NMRδ7.31-7.18(m，10H)，4.13(t，J＝7.6Hz，1H)，3.26(d，J＝7.6Hz，2H)，2.86(dd，J＝4.3，8.0Hz，4H)，2.76(dd，J＝7.6，12.2Hz，2H)，2.37(ddd，J＝1.8，9.0，12.5Hz，1H)，2.12(dq，J＝1.8，7.6Hz，1H)，1.98(br s，2H)，1.98-1.84(m，4H)，1.39(ddd，J＝2.4，4.0，6.1Hz，1H)，1.18(s，3H)，0.95(s，3H)，0.91(d，J＝10.0Hz，1H)質譜(ESI)m/z(MH)+377.2。
            
 化合物38.   N-(-)-順式-桃金娘烷基-N’-(2，2-二苯基乙基)丙-1，2-二胺。39mg，30％收率。1H NMR(500MHz)δ7.30-7.15(m，10H)；4.13(t，J＝8.0Hz，1H)；AB3.28(d，J＝7.5Hz，1H)；3.24(d，J＝7.5Hz，1H)，3.26(d，J＝6.1Hz，2H)；2.96(m，1H)；2.88-2.75(m，2H)；2.71(ddd，J＝4.5，9.0，13.0Hz，1H)，2.58(ddd，J＝7.0，10.0，14.0Hz，1H)；2.35(m，1H)；2.21(m，1H)；2.00-1.80(m，6H)；1.40-1.20(m，1H)；1.17(s，3H)；；0.93(s，3H)；0.89(dd，J＝9.7和4.2Hz，1H)。質譜(ESI)m/z(MH)+391.0。
            
 化合物40.   N-(2，2-二苯基乙基)-N’-(1R，2R，3R，5S)-(-)-異松蒎基乙-1，2-二胺。33mg，23％收率。1H NMRδ7.31-7.18(m，10H)，4.13(t，J＝7.5Hz，1H)，3.27(d，J＝8.0Hz，2H)，3.14(d t，J＝6.0，10Hz，1H)，(4H)，2.36(qd，J＝2.0，6.0Hz，1H)，2.34(dt，J＝2.0，10Hz，1H)，2.07-1.96(m，3H)，1.82(d t，J＝2.0，6.0Hz，1H)，1.71(ddd，J＝2.5，5.5，13.5Hz，1H)，1.22(s，3H)，1.09(d，J＝7.0Hz，3H)，0.96(d，J＝10.5Hz，1H)，0.91(s，3H)。質譜(ESI)m/z(MH)+377.3。
            
 化合物47.   N-(-)-順式-桃金娘烷基-N’-(1R，2R，3R，5S)-(-)-異松蒎基乙-1，2-二胺。42mg，33％收率。1H NMRδ3.35-3.20(m，6H)，2.93(dd，J＝4.6，2.0Hz，2H)，2.45-2.33(m，4H)，2.17(s，3H)，2.06(五重峰，J＝7.0Hz，1H)，2.0-1.9(m，6H)，1.90(dd，J＝2.1，5.2Hz，1H)，1.87(dt，J＝1.8，4.6Hz，1H)，1.51(ddd，J＝4.6，10.0，13.0Hz，1H)，1.23(s，3H)，1.19(s，3H)，1.12(d，J＝8Hz，3H)，1.03(d，J＝10.3Hz，1H)，0.98(s，3H)，0.94(d，J＝9.8Hz，1H)，0.94(s，3H)。質譜(ESI)m/z(MH)+333.6。
            
 化合物52.   N-(3，3-二苯基丙基)-N’-環辛基乙-1，2-二胺。20mg，18％收率。1H NMR(500MHz)δ7.30-7.10(m，10H)；3.96(t，J＝7.9Hz，1H)；3.00(m，1H)；2.90(dd，J1＝J2＝5.5Hz，2H)；2.84(dd，J1＝J2＝5.0Hz，2H)；2.61(t，J＝7.3Hz，2H)，2.27(q，J＝7.6Hz，2H)；1.83(m，2H)；1.74(m，2H)；1.65-1.40(m，10H)。
            
 化合物55.   N-(1-金剛烷基甲基)-N’-環辛基乙-1，2-二胺。6.7mg，6％收率。1H NMR(500MHz)δ3.08-3.02(m，1H)，3.02-2.98(m，2H)；2.97-2.92(m，2H)；2.36(s，2H)；1.98(m，2H)；1.93-1.86(m，2H)；1.80-1.50(m，19H)。
            
 化合物57.   N-(-)-順式-桃金娘烷基-N’-(環辛基)乙-1，2-二胺。18mg，18％收率。1H NMR(500MHz)δ3.05-2.95(m，4H)；AB2.76(d，J＝7.5Hz，1H)，2.23(d，J＝8.0Hz，1H)；2.76(dd，J＝11.6和7.3Hz，1H)；2.73(dd，J＝11.9和8.2Hz，1H)；2.40-2.34(m，1H)；2.28(五重峰，J＝8.0Hz，，1H)；1.97(s，3H)；2.00-1.84(m，6H)；1.80-1.70(m，2H)；1.68-1.38(m，11H)；1.18(s，3H)；0.97(s，3H)；0.92(d，J＝9.8Hz，1H)。質譜(ESI)m/z(MH)+307.5。
            
 化合物58.   N-(2-金剛烷基)-N’-環辛基乙-1，2-二胺。25mg，23％收率。1HNMRδ3.06(m，1H)，3.00(t，J＝6.1Hz，2H)，2.93(t，J＝5，5Hz，2H)，2.83(br s，1H)，1.96(s，3H)，1.92-1.80(m，10H)，1.80-1.50(m，20H)。質譜(ESI)m/z(MH)+305.1。
            
 化合物59.   N-(環辛基)-N’-(1R，2R，3R，5S)-(-)-異松蒎基乙-1，2-二胺。
            
 15mg，14％收率。1H NMR(400MHz)δ3.47(d t，J＝6.0，10.0Hz，1H)，3.40-3.28(m，7H)，2.44(tq，J＝2.0，10.0Hz，1H)，2.36(dtd，J＝2.0，6.0，10.0Hz，1H)，2.09(dq，J＝2.0，7.2Hz，1H)，2.00-1.90(m，3H)，1.88-1.78(m，2H)，1.78-1.63(m，4H)，1.65-1.30(m，8H)，1.18(d，J＝6.0Hz，3H)，1.16(s，3H)，1.17(d，J＝7.2Hz，1H)，0.90(s，3H)。質譜(ESI)m/z(MH)+307.4。
            
 化合物62.   N-(-)-順式-桃金娘烷基-N’-(1S)-(1-乙基環己烷)乙-1，2-二胺。48mg，46％收率。1H NMR(500MHz)δ3.06-3.00(m，1H)；2.98-2.95(m，2H)；2.92-2.84(m，1H)；2.79(dd，J＝11.9和7.0Hz，1H)；2.75(dd，J＝11.9和7.9Hz，1H)；2.73(m，1H)；2.39(m，1H)；2.28(五重峰，J＝8.5Hz，1H)；2.00-1.86(m，6H)；1.82-1.76(m，2H)；1.68(m，2H)；1.54-1.42(m，2H)；1.32-1.10(m，6H)；1.19(s，3H)；1.13(d，J＝6.7Hz，3H)；1.07(dd，J＝12和3Hz，2H)；1.02(dd，J＝12和3Hz，2H)；0.98(s，3H)；0.93(d，J＝9.7Hz，1H)。質譜(ESI)m/z(MH)+306.9。
            
 化合物65.   N-反式-(2-苯基環丙基)-N’-(1-金剛烷基)乙-1，2-二胺。18mg，16％收率。質譜(ESI)m/z(MH)+311.3。
            
 化合物66.   N-(3，3-二苯基丙基)-N’-(1R，2R，3R，5S)-(-)-異松蒎基乙-1，2-二胺。2mg，2％收率。1H NMR(500MHz)δ7.26(m，10H)；3.96(t，J＝7.6Hz，1H)；3.09(m，1H)；2.92(m，1H)；2.84(m，2H)；2.62(m，2H)；2.35(m，4H)；1.97(s，3H)；1.82(m，1H)；1.68(m，1H)；1.21(s，3H)；1.12(d，J＝7.3Hz；3H)；1.01(m，1H)；0.92(s，3H)。質譜(ESI)m/z(MH)+391.4。
            
 化合物73.   N-(2-金剛烷基)-N’-[2-(2-甲氧基苯基)乙基]乙-1，2-二胺。21mg，19％收率。1H NMRδ7.22(dd，J＝8.2，7.3Hz，1H)，7.14(d，J＝7.3Hz，1H)，6.89(d，J＝7.1，Hz，1H)，6.87(d，J＝8.2，Hz，1H)，3.81(s，3H)，3.06(t，J＝7.1Hz，2H)，3.06(m，2H)，3.01(m，2H)，2.93(t，J＝7.1，2H)，1.95(br s，2H)，1.90-1.80(m，7H)，1.78-1.66(m，6H)，1.59(d，J＝2.5Hz，2H)。質譜(ESI)m/z(MH)+329.4。
            
 化合物78.   N-2-金剛烷基-N’-2，3-二氫-1H-茚-2-基-乙-1，2-二胺。4.3mg，3％收率。1H NMRδ7.20(dd，J＝4.9，8.5Hz，2H)，7.14(dd，J＝5.5，2.1Hz，2H)，3.71(五重峰，J＝6.1Hz，2H)，3.19(dd，J＝5.8，15.9Hz，2H)，3.13(br.s，1H)，3.05(m，4H)，2.86(dd，J＝4.8，15.8Hz，2H)，2.08(m，2H)，2.00(m，6H)，1.96-1.88(m，4H)，1.88-1.80(m，3H)，1.74(m，4H)，1.68-1.60(m，2H)。質譜(ESI)m/z(MH)+303.4。
            
 化合物109.   N-香葉草基-N’-(2-金剛烷基)乙-1，2-二胺。27mg，24％收率。1HNMR(400MHz)δ5.40(t，J＝7.2Hz，1H)，4.78(br s，2H)，3.64(d，J＝7.6Hz，2H)，3.34(m，2H)，2.07(m，2H)，2.08-1.95(m，4H)，1.95-1.85(m，4H)，1.82(m，2H)，1.88-1.70(m，4H)，1.70-1.62(m，3H)，1.67(s，3H)，1.56(s，3H)，1.50(s，3H)。質譜(ESI)m/z(MH)+307.4。
            
 化合物111.   N-香葉草基-N’-(2-乙基哌啶)乙-1，2-二胺。44mg，42％收率。1HNMR(500MHz)δ5.22(t，J＝6.1Hz，1H)；5.04(m，1H)，3.52(d，J＝7.3Hz，2H)；3.05-2.85(m，4H)；2.66(m，1H)；2.44(m，2H)；2.08(m，4H)；1.80-1.50(m，2H)；1.70(s，3H)；1.65(s，3H)；1.58(s，3H)；1.50-1.35(m，2H)，0.89(t，J＝7.3，3H)。質譜(ESI)m/z(MH)+293.4。
            
 化合物116.   N-香葉草基-N’-烯丙基-N’-(環戊基)乙-1，2-二胺。45mg，42％收率。1H NMRδ5.86(ddd，J＝10.0，16.1，6.7Hz，1H)，5.28(d，J＝15.9Hz，1H)，5.25(d，J＝8.7Hz，1H)，5.23(t，J＝7.3Hz，1H)，5.30(m，1H)，3.59(d，J＝7.3Hz，2H)，3.28(br d，J＝6.4Hz，2H)，3.16(五重峰，J＝8.2Hz，1H)，3.02(m，2H)，2.95-2.86(m，2H)，1.88-1.80(m，4H)，1.70(s，3H)，1.74-1.66(m，3H)，1.65(s，3H)，1.58(s，3H)，1.56-1.50(2H)，1.50-1.40(m，2H)。質譜(ESI)m/z(MH)+305.3。
            
 化合物117.   N香葉草基-N’-二苯基甲基乙-1，2-二胺。24mg，20％收率。1HNMR(500MHz)δ7.40(d，J＝7.2Hz，4H)；7.29(t，J＝7.3Hz，4H)；7.21(t，J＝7.0Hz，2H)；5.15(t，J＝7.5，1H)；5.01(m，1H)；4.89(br s，1H)；3.42(d，J＝7.0Hz，2H)；3.00-2.78 2.93(m，4H)；2.20-2.00 2.17(m，4H)；1.63(s，3H)；1.59(s，3H)；1.56(s，3H)。質譜(ESI)m/z(MH)+363.3。
            
 化合物125.   N，N’-雙-(-)-順式-桃金娘烷基丙-1，2-二胺。82mg，70％收率。1H NMR(500MHz)δ3.62(m，1H)；3.18(dd，J＝13.7和3.7Hz，1H)；3.05(dt，J＝11.5和7.5Hz，1H)；3.06-2.92(m，2H)；2.86(dt，J＝12.2和7.3Hz，1H)；2.40(m，4H)；2.06-1.84(m，10H)；1.56-1.46(m，2H)；1.37和1.36(兩個d，J＝6.7和J＝7.0Hz，3H)；1.20(s，3H)；1.19(m，3H)，0.99和0.98(兩個s，3H)Hz，H)；0.97(s，3H)；0.94(兩個d，J＝10.1Hz，2H)。質譜(ESI)m/z(MH)+346.9。
            
 化合物151.   N-[2-(2-甲氧基)苯基乙基]-N’-(1R，2R，3R，5S)-(-)-異松蒎基-乙-1，2-二胺。67mg，60％收率。1H NMR(500MHz)δ7.23(t，J＝5.8Hz，1H)；7.13(dd，J＝5.8和1.8Hz，1H)；6.88(m，2H)；3.81(s，3H)；3.13(m，1H)；3.1-3.0(m，3H)；3.01(t，J＝7.0Hz，2H)；2.89(t，J＝7.0Hz，2H)；2.42-2.35(m，2H)；2.00(m，3H)；1.82(dt，J＝6.0和2.0Hz，1H)；1.72(ddd，J＝2.5，5.5，13.5Hz，1H)；1.22(s，3H)1.13(d，J＝7.3Hz，3H)。0.99(d，J＝10.1Hz，1H)；0.93(s，3H)。質譜(ESI)m/z(MH)+331.5。
            
 N-2-(2-甲氧基苯基)乙基-N’-烯丙基-N’-環戊基-乙-1，2-二胺。8mg，7％收率。1H NMRδ7.26(dd，J＝7.3，8.5，1H)，7.18(d，J＝7.2Hz，1H)，6.91(m，2H)，5.61ddd，(J＝6.7，17.0，9.4Hz，1H)，5.13(d，J＝15.3Hz，1H)，5.10(d，J＝9.2Hz，1H)，3.83(s，3H)，3.13(dd，J＝7.0，6.7Hz，2H)，3.10(d，J＝6.7Hz，1H)，3.00(d，J＝7.3Hz，1H)，3.05-2.90(m，2H)，2.97(dd，J＝8.2，6.1Hz，2H)，2.75(t，J＝6.1Hz，2H)，1.73(m，2H)，1.62(m，2H)，1.50(m，2H)，1.22(m，2H)。質譜(ESI)m/z(MH)+311.4。
            
 N2-(3-苯基丙基)-N1-[2-(4-氟苯基)乙基]-1-苯基乙-1，2-二胺。23mg，19％收率。1H NMRδ7.35(d，J＝7.6Hz，2H)，7.34(quart，J＝7.Hz，1H)，7.26(d，J＝6.4Hz，3H)，7.23(d，J＝7.6Hz，2H)，7.17(dd，J＝7.3，6.4Hz，1H)，7.12(d，J＝7.0Hz，2H)，3.21(m，1H)，3.03(ddd，J＝4.2，8.0，12.8Hz，4H)，2.86(t，J＝8.0Hz，2H)，2.85-2.79(m，J＝12.Hz，2H)，2.74-2.64(m，4H)，2.61(t，J＝7.7Hz，2H)，1.96(五重峰，J＝7.6Hz，2H)。質譜(ESI)m/z(MH)+377.3。
            
 實施例VII   結核分枝桿菌Rv0341p Lucs藥物響應   使用含有熒光素酶與Rv0341 EMB-誘導性啟動子的融合啟動子的重組結核分枝桿菌，利用高通量篩選測定法試驗本文所述取代的乙二胺對結核分枝桿菌的活性。這種測定法快速、可靠地鑒別化合物混合物和/或個別化合物的抗分枝桿菌活性。在這種測定法中，當試驗活性化合物或活性化合物混合物對抗分枝桿菌的活性時，生物發光增加。在這種測定法期間，假定每種未純化取代的乙二胺的理論收率為100％，比較每份樣本與商業上可得到的乙胺丁醇(99.0％純度)的活性。結果以LCPS和基于3.1μM EMB活性而言的％Max LCPS表示。
            
 按照下列工藝分析取代的乙二胺。將二胺在Speed Vacuum中干燥至濃度大約6.3mmol每孔。然后將每種二胺或二胺混合物重新懸浮或溶解在200μl甲醇中，二胺濃度為31.5mM。將二胺溶液在7H9肉湯培養基中稀釋至濃度為200μM(將31.5mM儲備溶液按1∶15.75稀釋，繼之以1∶10稀釋；每次稀釋在7H9肉湯培養基中)。下面，將50μl經過稀釋的二胺溶液加入到不透明的96孔平板一行十二個小孔的第一個小孔中。將25μl 7H9肉湯培養基加入到該行其余小孔中(#2-12)。“孔1”中的二胺溶液如下進行系列稀釋將25μl從“孔1”轉移至“孔2”，重復將25μl從“孔2”轉移至“孔3”，等等，直至“孔11”。在“孔11”中，額外的25μl溶液棄去。使用“孔12”作為生長對照，以評估報告菌株的背景活性。然后蓋上平板，在37℃下孵育24小時。在分析前不久，制備下列底物含有50mM HEPES pH 7.0和0.4％Triton X-100的緩沖溶液。然后，將0.25ml 1M DTT和14μl 10mg/ml熒光素的DMSO溶液加入到5ml緩沖溶液中。在孵育期開始后不久將這種最終溶液(50μl)加入到每一十二個小孔中。在加入熒光素底物后20分鐘，利用  
            
     
            
(Downers，Grove，Illinois)NXT發光計測量每孔發光(55/孔)。
            
 圖6-8顯示利用96孔文庫平板12個小孔(1行)的系列稀釋液所得含有Rv0341 EMB-誘導性啟動子的熒光素酶報告菌株的典型測定數據。圖10顯示具有至少10％熒光素酶活性的取代的乙二胺數，基于3.1μM乙胺丁醇活性而言。
            
 圖6代表含有Rv0341 EMB-誘導性啟動子的熒光素酶報告菌株的典型測定數據。數據代表從96孔文庫一行(D行)化合物混合物的HTS Luc測定法所得數值。D行受到若干系列稀釋。化合物混合物在該測定法中的有效性是這樣測量的，測定發光的強度，再與3.1μM乙胺丁醇(100％強度，99％純度)比較。圖6中的每一曲線代表一個小孔或者十種化合物。結果以最大發光數每秒百分比(％Max.LCPS)表示。在篩選期間，假定每種未純化化合物的理論化學收率為100％。給出單一化合物的濃度。基于這種初步篩選，300+化合物混合物顯示抗TB活性。
            
 實施例VIII   代表性MIC實驗   最小抑制濃度(MIC)是生長抑制劑、這里是取代的乙二胺的濃度，在該濃度下不存在接種細胞的增殖。利用微量稀釋法測定取代的乙二胺能夠體外抑制結核分枝桿菌生長的MIC。在代表性MIC實驗中，將細菌、即結核分枝桿菌H37Rv菌株(M.tb)在7H9培養基中培養至600nm下的密度為0.2OD(光密度)。然后將細菌培養物按1∶100稀釋在7H9肉湯培養基中。在7H9培養基中分別制備異煙肼和乙胺丁醇的32μg/ml儲備溶液。在水中分別制備異煙肼和乙胺丁醇的3.2mg/ml溶液。然后將溶液過濾，按1∶100稀釋在7H9培養基中。每種藥物都是從Sigma購買的，是“僅供實驗室使用”級。在甲醇中制備每種取代的乙二胺的10mM溶液。下面，將100μl 7H9培養基加入到96孔平板的每一小孔中(A至H行×1至12欄)。向C至H行第一小孔加入另外80μl 7H9培養基。將異煙肼溶液100μl加入到孔A1中，將乙胺丁醇溶液100μl加入到孔B1中。將六種取代的乙二胺各20μl分別加入到孔C1至H1中(欄1)。跨越每行進行每種取代的乙二胺和異煙肼與乙胺丁醇對照的系列稀釋。例如，混合并且轉移100μl前一孔至下一連續孔，進行跨行C1-C12的系列稀釋。在“欄12”的每一小孔中，棄去100μl最終稀釋液。下面，將100μl經過稀釋的M.tb H37Rv菌株加入到每孔中。然后蓋上96孔平板，在37℃下孵育10天。利用反轉平板讀數器讀取平板的細菌生長或者不生長。測定MIC，為取代的乙二胺抑制可見的M.tb生長的最低濃度。
            
 代表性平板布局如表9所示，列出每孔中的濃度。表10列舉選定化合物的MIC和LD50數據。LD50是取代的乙二胺殺死50％細胞(M.tb的H37Rv菌株)的濃度。表11列舉純化取代的乙二胺的MIC數據，與乙胺丁醇(EMB)對比。圖9顯示在各種濃度水平下具有MIC活性的取代的乙二胺化合物的數量。
            
 表9   基于欄1-12每一小孔中的濃度(μM)   藥物      表10   選定化合物的選擇性指數      上述工藝也用于檢查成批的化合物(每孔10種化合物)。將所合成的取代的乙二胺批次在速度真空機(Speed Vacuum)中干燥，然后重新懸浮在DMSO或無菌水中，濃度為2.5mg/ml。
            
 表11   純化樣本的MIC數據   平板設置                  實施例IX   取代的乙二胺對抗耐藥性患者種群的次級篩選和評價   對一些取代的乙二胺化合物進行次級篩選，以檢查它們對抗三種臨床耐受性MDR患者分離物的活性。MDR菌株TN576被歸入W1菌株(STPR，INHR，RIFR，EMBR，ETHR，KANR，CAPR)，菌株TN587被歸入W菌株(STPR，INHR，RIFR，EMBR，KANR)，第三種菌株TN3086被歸入W1菌株(STPR，INHR，RIFR，EMBR，KANR)。每種MDR菌株對乙胺丁醇都是高度耐受性的，MIC值超過12.5-25μM。測定下列取代的乙二胺MP116、MP117、RL241、化合物#59和#109對全部三種患者分離物的MIC。
            
   
            
      化合物MP 116     
            
        
            
      RL241(化合物37)     
            
      化合物59     
            
      化合物109   本研究所得結果如表12-13所示。表14根據它的耐受性表征每種MDR菌株。
            
 表12   取代的乙二胺類對抗耐藥性患者分離物的篩選(MIC值μg/ml)      WT＝M.tb的野生型   EMB為2HCl鹽   RL241為2HCl鹽   表13   取代的乙二胺類對抗耐藥性患者分離物的篩選(MIC值μg/ml)      化合物#59為2HCl鹽   化合物#109為2CF3COOH鹽   表14   每種MDR菌株的耐藥性      R＝耐受的   S＝易感的   STP＝鏈霉素   INH＝異煙肼   Rif＝利福平   Emb＝乙胺丁醇   Eth＝乙硫異煙胺   Kan＝卡那霉素   Cip＝環丙沙星   Cap＝卷曲霉素   Cyc＝環絲氨酸   實施例X   體內動物研究   在藥物發現周期的最終階段，利用動物模型評估一些取代的乙二胺化合物在代表性人疾病狀態系統中的抗微生物功效。體內試驗方法牽涉經由氣霧劑接種六周齡C57BL/6小鼠，所述氣霧劑含有大約200個集落形成單位的結核分枝桿菌H37Rv。
            
 A.CFU肺研究   在接種后，檢查用結核分枝桿菌H37Rv氣霧化治療過的小鼠達10至12周。將藥物(取代的乙二胺類)經由食管插管給藥(管飼法)7天/周，開始于感染后14天或21天。每組五只小鼠，借助可見的集落數測定肺中的細菌負載，間隔大約一周。直接比較供試藥物與一線抗結核藥異煙肼和二線藥物乙胺丁醇。異煙肼和乙胺丁醇的試驗濃度分別為25mg/kg和100mg/kg。取代的乙二胺化合物37、化合物59和化合物109各自在1mg/kg和10mg/kg下進行試驗。圖17至19代表三次獨立的CFU肺研究所得數據。在每項研究中，在不同時間間隔內(天數)測定可回收和可培養的集落形成單位(CFU)數。
            
 B.損害研究   聯合CFU/肺研究測定化合物59和化合物109防止由細菌負荷引起總體病變形成的能力。借助肺表面上可見的損傷量化確定總體病變。檢查量化是CFU測定的良好替代，直接與細菌負荷相關，取決于實際集落形成單位。首先肉眼檢查損傷，然后對肺進行加工和平板接種，供CFU量化。損傷研究證明藥物防止疾病病變形成的能力。圖20代表損害研究所得數據。對應的CFU結果如圖19所示。
            
 C.毒性研究   利用劑量擴大研究評估毒性。本研究利用C57BL/6小鼠進行，每種候選藥物十只。每兩天一次，向小鼠給以遞增濃度的藥物，監測有害后果。給藥安排是50、100、200、400、600、800和1000mg/kg。上限1000mg/kg是基于劑量擴大的目標和藥物在遞送載體中的溶解度。化合物37在100mg/kg下對小鼠有毒性。化合物59和化合物109分別在1000mg/kg和800mg/kg下被小鼠所耐受。
            
 應當理解，上文僅涉及本發明的優選實施方式，可以進行大量修飾或變化而不背離發明的精神和范圍。本文提到的每份參考文獻的完整文本都全文結合在此作為參考。
            
 實施例XI   符合要求的化合物的體外毒性和選擇性指數   利用本領域技術人員熟知的方法，在采用猴腎細胞(Vero)和人宮頸癌細胞(HeLa)的體外毒性模型中試驗26種化合物(包括37、59和109)。本毒性試驗所得數據和MIC數據用于計算選擇性指數(SI)，即IC50∶MIC之比(表15)。選擇性指數從1.76至16.67不等。化合物109具有最佳選擇性指數。
            
 表15   代表性化合物的體外數據      實施例XII   乙胺丁醇類似物的體內功效   選擇化合物58、59、73、109和111在小鼠TB模型中進行體內功效研究。化合物58和59在它們的分子中都有相同的環辛基片段；化合物58、73和109都有金剛烷基部分，109和111都有香葉草基碎片(圖22)。
            
 在這些研究中，使8周齡同系繁殖雌性小鼠C57BL/6靜脈內感染結核分枝桿菌。感染后3周開始藥物治療(提供了詳細方案)。藥物是通過管飼法口服給藥的。在三個時間點處死小鼠(感染后15、30和45天)，測定脾和肺中的CFU(圖23和24)。這些研究證明，化合物109在1和10mg/kg劑量下具有等于乙胺丁醇在100mg/kg下的活性。
            
 材料和方法   小鼠從Charles River(Raleigh，NC)購買8周齡雌性C57BL/6小鼠，喂養在BIOCAL，Inc.(Rockville，MD)的BSL-2設施中，在感染前適應至少4天。
            
 分枝桿菌將經過冷凍和融化的結核分枝桿菌H37Rv Pasteur樣本加入到含有0.5％BSA和0.05％吐溫80的5ml 7H10肉湯培養基中，在37℃下培育1周，然后將1ml加入到25ml培養基中(在2周期間第2代)。將培養物洗滌兩次，重新懸浮在含有0.5％BSA和0.05％吐溫80的PBS中，等量分配，冷凍在-80℃下。為了測定培養物的CFU，使等分試樣融化，將10倍稀釋液平板接種在瓊脂7H9上，20天后計算CFU數。
            
 感染將冷卻的培養物樣本融化，稀釋至濃度約106CFU/ml。向側尾靜脈內注射相當劑量結核分枝桿菌H37Rv的0.2ml PBS溶液，使小鼠感染。
            
 抗微生物藥INH、EMB、乙胺丁醇類似物。
            
 藥物治療方案用化合物治療小鼠開始于感染后20天。將化合物溶于10％乙醇水溶液，通過管飼法給藥(0.2ml每只小鼠)。每周給以5天療法，持續四周或六周。在化療開始后兩周、四周和六周，處死小鼠(每組6只小鼠)，除去肺和脾，在含有0.05％吐溫80的無菌2ml PBS中均質化。將均質化物的系列稀釋液平板接種在7H10瓊脂平皿上，在37℃下培育。三周后計算CFU數。
            
 統計學分析為了分析器官中的CFU結果，進行ANOVA試驗；借助斯氏檢驗估計差異的顯著性，p＜0.05被視為統計學顯著的。
            
 結果   新化合物的體內活性這些化合物的活性列在圖21-24中。在圖21(脾)和22(肺)所列實驗中，使小鼠感染5×105CFU結核分枝桿菌H37Rv，在感染后20天開始化療。將小鼠用INH(25mg/kg)、EMB(100mg/kg)、化合物73和109(均為1mg/kg和10mg/kg)治療。結果表明在脾中，化合物73和109具有等于100mg/kg EMB的活性(圖21)。在脾中，在1mg/kg或10mg/kg這些化合物的活性之間不存在統計學差異。在肺中，10mg/kg化合物109在4和6周后比100mg/kg EMB更有效。在肺中，在1mg/kg與10mg/kg化合物109之間顯示有統計學充分的差異(圖22)。在脾和肺中INH都是最有活性的藥物。
            
 使用較高的感染劑量，在較短的模型中也試驗了化合物73和109(圖23和24)。使小鼠感染5×106CFU結核分枝桿菌H37Rv，在感染后15天開始化療。將小鼠用INH(25mg/kg)、EMB(100mg/kg)、化合物109(0.1mg/kg，10mg/kg和25mg/kg)、58、73和111(均為25mg/kg)治療。將小鼠治療4周。在脾和肺中，10mg/kg和25mg/kg化合物109都具有等于100mg/kg EMB的活性，在0.1mg/kg濃度下的活性最小，但是與未治療對照的差異明顯，出現在治療4周之后(圖23和24)。檢測了化合物73(25mg/kg)與109(25mg/kg)之間在統計學上充分的差異。在肺中，沒有檢測到這些化合物活性之間的顯著性差異。化合物58和111在脾和肺中都有體內活性；不過，化合物73和109是優選的。這些實驗的結果表明，化合物73和109在低濃度下顯示等于100mg/kg EMB的活性，在有些情況下化合物109顯示較高活性。
            
 化合物111和59的試驗是在感染有5×105CFU結核分枝桿菌H37Rv的B6小鼠中進行的，在感染后20天開始化療(圖25和26)。兩種化合物在10mg/kg濃度下都顯示與100mg/kg EMB相當的抗結核活性。
            
 在所有實驗中，INH顯示比EMB和其他化合物更高的活性，在4-6周化療期間減少器官中的細菌負荷達2-3個對數；新化合物與EMB(100mg/kg)相似，減少細菌負荷達1.0-2.0個對數。在所研究的化合物中，73和109是最優選的，因為減少器官中分枝桿菌的能力最高和它的毒性與藥理動力學參數。
            
 實施例XIII   體內毒性   小鼠初步劑量加速研究已經表明，化合物109在高達800mg/kg的劑量下、化合物59在高達1000mg/kg的劑量下能夠被良好耐受。化合物37在100mg/kg的劑量下是致命的(ClifBarry，NIAID，未公布的結果)。
            
 化合物109主要以二鹽酸鹽的形式在五種不同劑量下使用，37僅以鹽酸鹽形式在兩種劑量下使用。
            
 利用管飼法，向小鼠給以一次化合物，濃度為100、300或1000mg/kg。每劑每種化合物由一組3只小鼠組成。在實驗持續期間每天監測小鼠兩次。處死藥物給藥后一周仍存活的小鼠；無菌摘除關鍵器官，觀察異常和藥物毒性的跡象。MTD(mg/kg)是導致沒有致死/組織異常的最高劑量。
            
 方法   1.小鼠的治療利用管飼法向C57BL/6雌性小鼠(6-8周齡)給以一次化合物，濃度為100、300或1000mg/kg。將化合物溶于適當濃度乙醇在蒸餾水中的溶液，給藥體積為0.2ml每只小鼠。
            
 2.小鼠的觀察在給藥后4和6小時觀察小鼠，然后每日觀察兩次達一周。在整個研究期間密切監測小鼠的存活和體重。
            
 3.藥物毒性的評估表現任何異常表象或行為跡象的小鼠或者在其他小鼠沒有存活至第7天的組中剩下的小鼠將被處死，用于藥物毒性的評估。無菌摘除并觀測關鍵器官；從肝、心和腎提取組織，置于10％福爾馬林溶液中。將這些經過固定的組織制作切片，檢查由藥物毒性所導致的異常。
            
 這些研究表明，化合物109的最大耐受劑量為600mg/kg(表16)。觀察到器官沒有可見的改變。800mg/kg劑量是致命的在每組3只小鼠中，兩只動物在3天內死亡(表17)。化合物37在100和300mg/kg劑量下被良好耐受。觀察到器官沒有可見的改變。進行另外的實驗，以評價化合物37的最大耐受劑量和體內功效。
            
 表16   化合物109和37在小鼠中最大耐受劑量的測定     
            
      表17   化合物109和37在小鼠中最大耐受劑量的測定     
            
      實施例XIV   化合物37、59和109的藥動學研究   首先，開發了用于化合物測定的分析方法，以便進行全部PK實驗，參見圖29。這里是實驗的簡要說明(1)向血漿中供試化合物摻入，加入10μl特非那定或血漿樣本(200μl)；(2)加入ACN(2ml)，使蛋白質沉淀出來，在2,500r pm下自旋；(3)蒸發上清液至干；(4)加入200μl稀釋溶劑甲醇(含有0.1％三氟乙酸)∶乙酸銨(80/20)；(5)渦旋，自旋，使用上清液；(6)在Sciex API 3000上進行LC/MS/MS。
            
 使用1和15mg/ml濃度進行化合物在血漿中的生物穩定性研究。將化合物在37℃下培育1、2、3和6小時(表18)。另外，發現所有供試化合物在24℃、pH 2與7.4的血漿中長達24小時都是穩定的。
            
 表18   供試化合物在血漿中的生物穩定性      利用盒式給藥進行化合物37、59和109在小鼠中的試點PK研究將全部三種類似物都一起配制在鹽水中，濃度1.5mg/ml，對小鼠同時給藥，劑量為口服25mg/kg、腹膜方式6mg/kg和靜脈內方式。發現15和7.5mg/kg劑量導致小鼠死亡，3.75mg/kg在給藥后立即出現昏睡，但是在幾分鐘后出現正常表象；3mg/kg顯示沒有不良反應，因此用作靜脈內劑量。所得數據列在圖30、31和32中(在NCI′指數化NSC下研究供試化合物)，總結在表19中。
            
 表19   供試化合物37、59和109在對小鼠盒式給藥后的PK參數；N/A＝不可檢測      所進行的藥動學研究表明，化合物59(NCI指數為NSC 722040)具有相當差的PK圖形(AUC，Cmax)，放棄這種化合物的進一步試驗。基于初步毒性數據，也排除化合物37的候選可能。因此，選擇化合物109(NCI指數為NSC 722041)供進一步的PK分析。
            
 已經顯示化合物SQ 109在靜脈內(i.v.)或口服(p.o.)給藥時達到并且超過它的血漿最小殺菌濃度MBC(313ng/ml)，半衰期為5.2小時，總廓清率小于肝血流(圖33，表20)。
            
 表20   化合物109的藥動學參數      在p.o.給藥時它的口服生物利用度僅為3.8％，但是這被解釋為它的獨特組織分布模式。組織分布研究已經證明，SQ109主要分布于肺和脾(圖34和35)，這對特征性表現為肺疾病的感染是非常有利的。
            
 利用超速離心法，發現化合物109的血漿蛋白結合是濃度依賴性的，從15％(20ng/ml)至74％(200ng/ml)至48％(2000ng/ml)不等。i.v.給藥(3mg/kg)后，該化合物分布在血漿與紅細胞之間，比例為70.6∶29.4。
            
 對該化合物在體內的命運知之甚少，因為化合物在排泄(尿和糞便)后的總量不超過遞送劑量的3％(表21)。
            
 表21   化合物109在單次給藥后累積排泄在小鼠尿和糞便中的量     
            
      最初鑒別化合物109在尿中的代謝產物的嘗試沒有提供分解產物的證據，見圖36。例如，沒有證據表明在化合物給藥后前24小時內在小鼠尿中有共軛代謝產物(M+521)的生成，見圖37。共軛代謝產物是典型的代謝途徑N-葡萄糖醛酸化產物，由與葡萄糖醛酸的反應所生成(D.A.Williams and T.L.Lemke in Foye′s Principals of MedicinalChemistry，5th Ed.，p.202)。
            
 實施例XV   化合物109的體外藥動學研究   化合物109的體外藥理學和早期ADMET(吸收、分布、代謝、排泄、毒性)研究根據服務協議承包給CEREP(15318NE 95th Street，Redmond，WA 98052，USA，www.cerep.com，tel 425 895 8666)，包括對30種標準受體進行試驗(參見CEREP表22和23，圖38和39，五種CYP450酶、hERG(K+通道)、水溶性、所預測的腸滲透性和代謝穩定性(數據列在圖40表24(a-m)中)。
            
 實施例XVI   雙(2-金剛烷基)乙二胺，SQBisAd     
            
      化合物SQBisAd   具有最佳選擇性指數的化合物、例如109、58、73、78(表15)和體內數據良好的化合物都共有相同的金剛烷碎片(圖20)。考察了僅具有這種碎片(在亞乙基連接基兩側)的化合物。在乙胺丁醇類似物的目標100,000化合物文庫的制備期間，證實有70,000種化合物生成，30,000種失敗了。最初沒有檢測這種特定的化合物，也許因為它的合成收率非常低或者因為它由于空間因素從未被制成。
            
 在用于文庫制備的合成方案1(圖41)中，第二步中的空間位阻胺罕有得到產物。分析大量原始平板的MS數據可以說明，2-金剛烷胺在用作R1NH2時很少得到所需產物，這可以解釋為空間位阻反應部位在合成方案2步驟2或步驟3中的存在(圖41)。
            
 化合物SQBisAd可以借助“濕化學”制備，利用同一途徑，見流程3(圖41)，根據文獻記載2-金剛烷胺(使用商業上可得到的鹽酸鹽)當用于第1和2步時的確生成產物。由于對稱性，這種化合物可以借助替代途徑合成。我們已經使用氰基硼氫化鈉進行乙二胺與2-金剛烷酮的還原性烷基化，而制備了SQBisAd。終產物(無需另外的純化)證明MIC(最小抑制濃度)等于或好于化合物109。
            
 實施例VIII   生成具有改性連接基的二胺文庫   一般方法所有試劑都是從Sigma-Aldrich購買的。Rink-酸樹脂是從NovaBiochem，Inc.購買的。溶劑乙腈、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二氯乙烯、甲醇和四氫呋喃是從Aldrich購買的，買來即用。固相合成是在Quest 210合成儀(Argonaut Technologies)和組合化學設備(Whatman Polyfiltronics and Robbins Scientific)上進行的。溶劑的蒸發是用SpeedVac AES(Savant)進行的。質譜數據是借助電子噴射電離技術在帶有自動進樣器的Perkin Elmer/Sciex，API-300，TQMS上獲得的。
            
 Rink-樹脂的活化、胺的加入和酰化步驟是用Quest 210合成儀的10ml試管進行的。FMOC基團的除去、與羰基化合物的還原性烷基化反應、用Red-Al還原和從固體載體上裂解是在96深孔(2ml)化學穩定性平板中進行的。
            
 步驟1.Rink-酸樹脂的活化   將Rink-酸樹脂(覆蓋率為0.43-0.63mmol/g)，6g(至多3.78mmol)在80ml二氯甲烷與THF的2∶1混合物中的懸液分配在20只試管中，每管4ml，過濾，用THF洗滌兩次。加入三苯膦(5.7g，21.75mmol)的40ml THF溶液，2ml/管，繼之以加入六氯乙烷(5.09g，21.45mmol)的20ml THF溶液，1ml/管。6小時后，將樹脂用THF(2×4ml)和二氯甲烷(2×4ml)洗滌。
            
 步驟2.第一種胺的加入   向每只試管加入3ml二氯乙烷、EtNiPr2(0.2ml，1.15mmol)和相應的胺(1mmol)(當所選擇的胺是固體時，加入它在DMF中的溶液或懸液)。向每只試管加入二氯乙烷至充滿容量4ml。反應在45℃下進行8小時，在室溫下進行6-8小時。將樹脂過濾，用二氯甲烷與甲醇的2∶1混合物洗滌(1×4ml)，然后用甲醇洗滌(2×4ml)，吸干。
            
 步驟3.用Fmoc保護的氨基酸酰化   將樹脂用二氯甲烷預洗滌(2×4ml)。向每只試管加入2ml二氯甲烷、HATU(2mol過量于所加載的樹脂，0.14g，0.39mmol，溶于1ml DMF)和0.47mmol(2.5mol過量于所加載的樹脂)氨基酸的1ml DMF溶液，在45℃下攪拌8小時，在室溫下攪拌6-8小時。16小時后將樹脂過濾，用DMF與二氯甲烷的1∶1混合物(1×3ml)、二氯甲烷(1×3ml)洗滌，用等量試劑重復酰化。最后，將樹脂過濾，用DMF與二氯甲烷的1∶1混合物(1×3ml)和甲醇(3×3ml)洗滌，吸干(在Quest上)30分鐘，轉移至小瓶中(每瓶一份樹脂)，在真空干燥器中干燥1小時。該步驟之后利用MS光譜對全部樹脂進行質量控制。
            
 步驟4.氨基的烷基化   去保護。將十份從前三步制備的樹脂匯集在一起，在每一小瓶中各留下大約0.05g供所有必要的去褶合。將樹脂混合物(2.0-2.5g)在100ml二氯甲烷與THF的2∶1混合物中的懸液分配在兩個96孔過濾平板中，利用過濾歧管過濾。將發應平板轉移至Combiclamps，加入0.2ml20％哌啶的DMF溶液以除去Fmoc保護基團，留置10分鐘。10分鐘后，將平板過濾，用0.2ml DMF洗滌，用0.2ml 20％哌啶的DMF溶液重復去保護，留置20分鐘。然后將平板過濾，用DMF(每孔0.2ml)和二氯甲烷(每孔2×0.5ml)洗滌。
            
 與羰基化合物反應。向反應平板A行每孔加入0.1ml二氯甲烷、0.08ml來自主平板的1.0M適當酸的DMF溶液、0.05ml PyBrop的DMF溶液(0.015g，0.03mmol，2.5mol過量于所加載的樹脂)和0.05mlEtNiPr2的二氯甲烷溶液(0.022ml，0.13mmol，10mol過量于所加載的樹脂)。向B至H行每孔加入0.1ml THF、0.160ml來自主平板的1.0M適當醛或酮的DMF溶液，反應30分鐘。30分鐘后，加入0.075ml(0.075mmol)1.0M NaBCNH3溶液。將反應平板密封，在室溫下保持72小時。最后，將樹脂過濾，用THF、DCM(1×1ml)、甲醇(2×1ml)洗滌，在真空干燥器中干燥2小時。
            
 步驟5.用Red-Al還原   將反應平板置于Combiclamps中。加入Red-Al(65+w％甲苯溶液)與THF的1∶6混合物，每孔0.6ml(每孔0.28mmol Red-Al)，反應4小時。反應完成后，將樹脂過濾，用THF(2×1ml)、甲醇(3×1ml)洗滌，在過濾歧管中干燥。
            
 步驟6.裂解   利用裂解歧管進行該步驟。向反應平板(置于這種歧管中收集平板頂部)加入TFA、二氯甲烷與甲醇的10∶85∶5混合物，每孔0.5ml。15分鐘后，將溶液過濾，收集在收集平板的適當小孔中。重復該工藝。在Speedvac上蒸發溶劑，殘留樣本準備供試驗之用。
            
 去褶合實施例   借助離散化合物從存檔a-鹵代乙酰基酰胺樹脂的再合成(10份樹脂，每份0.05-0.10g)，進行活性小孔的去褶合，所述樹脂在匯集之前的酰化步驟結束時被留出備用。為每份樹脂指定96孔過濾平板中的離散欄(1或2或3等)，分為X行(A，B，C等)，其中X是在原始篩選平板中所發現的命中數。向一行中的每一小孔加入選定羰基化合物(命中者)以及其他所需試劑第一種選定羰基化合物加入到“A”行樹脂中，第二種羰基化合物加入到“B”行樹脂中，第三種羰基化合物加入到“C”行樹脂中，等等。代表性96孔去褶合平板的布局如表28、圖52所示。
            
 將反應平板密封，在室溫下保持72小時。最后，將樹脂過濾，用THF、DCM(1×1ml)、甲醇(2×1ml)洗滌，在真空干燥器中干燥2小時。按照合成方案步驟5和6進行還原和裂解。用ESI-MS(電子噴射電離質譜)分析裂解產物小孔，以保證活性成分的同一性，在MIC測定法中試驗。下文提供ESI-MS數據總結。表30、圖53提供化合物的命中與結構的列表。
            
 化合物673   N2-[(2-甲氧基-1-萘基)甲基]-3-苯基-N1-(3-苯基丙基)丙-1，2-二胺。質譜(ESI)m/z(MH)+439.2   化合物674   N2-[2-(芐氧基)乙基]-N1-(3，3-二苯基丙基)-4-(甲硫基)丁-1，2-二胺。質譜(ESI)m/z(MH)+463.4。
            
 化合物675   N1-(3，3-二苯基丙基)-4-(甲硫基)-N2-(3-苯基丙基)丁-1，2，-二胺。質譜(ESI)m/z(MH)+447.2   化合物676   N2-(環己基甲基)-N1-(3，3-二苯基丙基)-4-(甲硫基)丁-1，2，-二胺。質譜(ESI)m/z(MH)+425.1   化合物677   N1-(3，3-二苯基丙基)-N2-(2-乙氧基芐基)-4-(甲硫基)丁-1，2，-二胺。質譜(ESI)m/z(MH)+463.1   化合物678   N2-[2-(芐氧基)乙基]-N1-[(6，6-二甲基雙環[3.1.1]庚-2-基)甲基]-4-(甲硫基)丁-1，2，-二胺。質譜(ESI)m/z(MH)+405.3   化合物679   N1-[(6，6-二甲基雙環[3.1.1]庚-2-基)甲基]-4-(甲硫基)-N2-(3-苯基丙基)丁-1，2，-二胺。質譜(ESI)m/z(MH)+389.5   化合物680   N2-(2-氯-4-氟芐基)-4-甲基-N1-(4-甲基芐基)戊-1，2-二胺。質譜(ESI)m/z(MH)+363.3，365.5；(MCH3CN)403.3，405.3。
            
 化合物681.   N2-[2-(芐氧基)乙基]-N1-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]-4-甲基戊-1，2-二胺。質譜(ESI)m/z(MH)+385.1。
            
 化合物682.   N2-[3-(4-氯苯氧基)芐基]-N1-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]-4-甲基戊-1，2-二胺。質譜(ESI)m/z(MH)+467.1，469.2。
            
 化合物683.   N2-(4-異丙基芐基)-N1-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]-4-甲基戊-1，2-二胺。質譜(ESI)m/z(MH)+383.3   化合物684.   N1-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]-4-甲基-N2-[(2E)-3-苯基丙-2-烯基]戊-1，2-二胺。質譜(ESI)m/z(MH)+367.3；[M-(CH2CH＝CHPh)2H]+251。
            
 化合物685   N2-[2-(芐氧基)乙基]-4-甲基-N1-(3-苯基丙基)戊-1，2-二胺。質譜(ESI)m/z(MH)+369.1。
            
 化合物686.   N2-(2-氯-4-氟芐基)-4-甲基-N1-(3-苯基丙基)戊-1，2-二胺。質譜(ESI)m/z(MH)+377.2，378.9。
            
 化合物687.   N2-[3-(4-氯苯氧基)芐基]-4-甲基-N1-(3-苯基丙基)戊-1，2-二胺。質譜(ESI)m/z(MH)+451.1，453.3。
            
 化合物688.   N2-(4-異丙基芐基)-4-甲基-N1-(3-苯基丙基)戊-1，2-二胺。質譜(ESI)m/z(MH)+367.3。
            
 化合物689   4-甲基-N2-[(2E)-3-苯基丙-2-烯基]-N1-(3-苯基丙基)戊-1，2-二胺。質譜(ESI)m/z(MH)+351.2。
            
 化合物690   N2-(2-乙氧基芐基)-4-甲基-N1-(3-苯基丙基)戊-1，2-二胺。質譜(ESI)m/z(MH)+369.1。
            
 化合物691.   N2-十氫萘-2-基-N1-[2-(4-氟苯基)乙基]-3-噻吩-3-基丙-1，2-二胺。質譜(ESI)m/z(MH)+415.3。
            
 實施例XIX   利福平與化合物109或異煙肼的體外活性   化合物109作為單個化合物在體外和體內均顯示出對結核分枝桿菌的有效殺傷。在此處是提供多藥物制度的實施例以便評價表3的化合物在與標準結核藥物聯用時對體外抑制細菌生長和小鼠結核模型的作用。選擇利福平、化合物109和異煙肼用于體外活性(圖54)。使用BACTEC生長動力學進行本研究。RIF的MIC為0.2ug/ml，SQ109(化合物109)為0.32ug/ml且INH為0.025ug/ml。這些研究證實化合物109與利福平聯用在本研究期限內抑制生長指數。甚至在化合物109的MIC濃度為1/10th和1/20th MIC時也獲得了Rif和化合物109的生長抑制作用。顯然，Rif與化合物109的聯合用藥優于單獨的Rif或Rif和INH。化合物109在0.5MIC下與低至0.1MIC RIF聯用時抑制了99％以上的結核分枝桿菌(H37Rv)接種物生長。x/y商數值為0.29，這顯示協同的藥物作用。在將0.5MIC RIF與0.05，0.1和0.2MICSQ109聯用時也觀察到了這種協同作用，其中相應的x/y商數值分別為0.32，0.16，0.4。結果表明RIF和SQ109的聯合用藥對結核分枝桿菌的生長抑制作用的協同作用活性。
            
 實施例XX   化合物109與標準結核藥物的體內活性   其中感染動物體重減輕為結核病發展指示劑的TB快速體內模型用于提高的新化合物和組合療法。選擇利福平、INH、EMB、PZA、Moxi(標準結核藥物)和化合物109用于小鼠體內研究(圖55)。這些研究證實化合物109與一種或多種標準結核藥物聯用調節小鼠體重并且為藥物功效的指示劑。在本研究中，利福平和化合物109或INH和化合物109達到了與未感染對照組相差無幾的體重。相反，Moxi和化合物109或EMB和化合物109導致體重接近安慰劑治療的對照組。顯然，利福平和化合物109的聯合用藥優于單獨的利福平或INH。
            
 實施例XXI   快速模型，化合物109與標準結核藥物相比的體內活性   在本實施例中，選擇利福平和化合物109用于小鼠體內研究(圖56A和圖56B)。在本研究中，利福平和化合物109達到了與未感染對照組相差無幾的體重。相反，單獨的化合物109或利福平在化療過程中導致體重接近安慰劑治療的對照組。顯然，利福平與化合物109的聯合用藥優于單獨的利福平或化合物109。
            
 實施例XXII   聯合療法的體內活性   口服給予的10mg/kg的SQ109(化合物109)和2mg/kg的RIF的聯合療法在預防感染小鼠體重減輕方面比以相同劑量給予單一藥物療法更為有效(圖57)。通過3周的化療，接受RIF+SQ109聯合療法的6只小鼠的平均體重為24.3克并且與24.5g的未感染的對照組無差異。通過比較發現，接受相應劑量的單獨SQ109或RIF的小鼠分別具有21.3g和19.7g的平均體重未使用藥物治療的感染小鼠的平均體重為17g。
            
 實施例XXIII   聯合療法的體內活性(標準慢性模型)   通過使用標準慢性結核小鼠模型證實聯合療法的體內增強的活性(圖58)。在慢性TB模型中的4周療法過程中，SQ109通過自身將肺中的CFU從8.1log10CFU(對照組未治療的動物)降至6.6log10CFU；RIF(20mg/kg)通過自身將CFU降至5.8log10；但SQ109+RIF的聯合用藥(以分別為10和20mg/kg的其最有效劑量)將CFU降至4.8log10，額外的log10CFU低于任一單獨的藥物。INH+RIF+SQ109的聯合用藥(在25，20和10mg/kg下)在第3周時獲得了與INH+RIF+EMB(在25，20和100mg/kg下)在第4周時相同的CFU，比標準藥物組合早1周(圖59)。截止到第4周時，SQ109組合因一半的log10(3.2log10CFU)而比EMB聯合療法(3.7log10CFU)更有效。CFU下降的差異具有統計學顯著性。化合物109在與單獨的RIF或RIF+INH聯用時也強化了對TB中結核分枝桿菌的體內殺傷；基于這些結果，提出了化合物109與RIF的協同作用活性，從而提示它可以取代使用3-種或4-種藥物組合的TB療法的加強期中的乙胺丁醇。此外，化合物SQ 109在與RIF在持續期聯用時可以提供額外的有益作用，因為其自身具有有效活性。此外，由于作用方式不同于RIF，所以這方面有助于RIF脫離耐藥性生物體，同時提供協同的增強活性。
            
 實施例XXIV   化合物109的體外藥代動力學研究   在用于安卓全藥理學和早期ADMET的體外測試(Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion，Toxicity)中，將化合物109的研究與CEREP(15318NE 95th Street，Redmond，WA，98052，USAwww.cerep.com)簽定服務合約并且包括評價結合一組27種標準受體和三種轉運蛋白的抑制(參見圖60(表31)和圖61(表32))，所述的受體和轉運蛋白包括腺苷受體(A1和A2A)；腎上腺素能受體(α1，α2，β1)；血管緊張素II受體(AT1)；苯二氮  
            
     
            
類受體(BZD)；緩激肽受體(B2)；縮膽囊素受體(CCK1)；多巴胺受體(D1，D2S)；內皮縮血管肽受體(ETA)；GABA受體(GABA)；谷氨酸受體(NMDA)；組胺受體(H1中樞)；黑皮質素受體(MC4)；毒蕈堿性受體(M，非-選擇性)；神經激肽受體(NK1)；神經肽Y受體(Y)；煙堿性受體(神經元，α-BGTX-不敏感性)；阿片劑受體(非-選擇性阿片劑)；孤肽受體(ORL1)；苯環利定受體(PCP)；5-羥色胺受體(5-HT)；σ受體(σ非-選擇性)；類固醇受體(糖皮質類固醇受體，GR)；和NE、DA和5-HT轉運蛋白。
            
 將結合所述受體的特異性配體定義為在有過量未標記的配體存在下測定的總結合與非特異性結合之差。在10μM下測試化合物109(SQ109)并且將結果表示為占控制特異性結合的百分比(表31)或表示為占在有SQ109存在下獲得的控制特異性結合抑制(表32)的百分比。
            
 簡言之，可以對D1和D2S多巴胺受體觀察到大于50％的抑制作用(51％和73％)。類似地，對黑皮質素MC4受體觀察到了極為顯著的抑制作用(90％)，已知它可發揮對食物攝取的顯著影響。此外，對毒蕈堿性M受體觀察到了極為顯著的抑制作用(96％)。
            
 觀察到控制疼痛，免疫應答和功能并且與嗎啡和海洛因作用相關的阿片劑受體顯示出對控制特異性結合的58％的抑制。已經證實在抗抑郁作用中起重要作用的σ受體也表現出高度抑制(106％)。
            
 去甲腎上腺素NE轉運蛋白在抑郁癥的病理生理學中起重要作用并且在抗抑郁藥的作用機制中觀察到了對控制特異性結合具有87％的抑制作用。觀察到另一種轉運蛋白，即與物質濫用和注意力不集中的過度反應癥(ADHD)相關的多巴胺DA轉運蛋白顯示出63％的抑制作用。還觀察到了涉及幾種疾病狀態病因學的5-羥色胺5-HT轉運蛋白對控制特異性結合具有95％的抑制作用，其中所述的疾病狀態包括，但不限于精神病，例如抑郁癥、焦慮、精神分裂癥、進食障礙疾患、偏頭痛、強迫性精神失調和驚恐性障礙。盡管不希望受到如下理論約束，但是認為包含Ph-乙二胺組成部分的化合物，包括，但不限于化合物73也共有(分享)CNS活性。
            
 實施例XXV   活性測試譜-需氧和厭氧菌   對有代表性的一組通常遇到的臨床微生物，包括機會病原體、靶病原體和正常人菌群測試化合物109。通過對需氧和厭氧菌、真菌和分枝桿菌集合進行抗微生物敏感性測試評價化合物109的活性譜。使用合適的NCCLS(National Committee for Clinical LaboratoryStandards)推薦的標準方法和質量控制菌株建立所有生物體的MIC。
            
 化合物109顯示出對革蘭氏陽性需氧菌的活性。特別地，化合物109(SQ-109)表現出對肺炎鏈球菌的最佳活性，其中MICs在4-8ug/ml。所有供試腸球菌(enterococci)種類的MICs在16-64ug/ml，而所有供試葡萄球菌(Staphylococci)的MICs在16-32ug/ml(圖62，表33)。
            
 化合物109顯示出對革蘭氏陰性需氧菌的活性。SQ-109表現出對所有供試腸桿菌科(enterobacteriaceae)有限的活性，其中MICs在32-＞64ug/ml，在非腸桿菌科中觀察到稍低的MICs(16-＞64ug/ml)。供試流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)分離物的MICs在1-32ug/ml。SQ-109在對幽門螺桿菌測試時表現出最佳活性，其中所有三種供試菌株的MIC均為4ug/ml(圖63A和圖63B(表34))。
            
 化合物109顯示出對厭氧菌的活性。SQ-109對厭氧菌瘡皰丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)、脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)和艱難梭菌(Clostridium difficile)的MICs在16-64ug/ml(參見圖64，表35)。
            
 實施例XXVI   活性測試譜-真菌   對有代表性的一組通常遇到的臨床微生物，包括機會病原體、靶病原體和正常人菌群測試化合物109。通過進行推薦的肉湯微稀釋法評價化合物109的活性譜。酵母NCCLS M27-A2，2003；和霉菌NCCLSM38-A，2003。
            
 SQ-109對白色念珠菌表現出良好的活性，其中MICs在4-8ug/ml。另外，供試的三種煙曲霉(Aspergillus fumigatus)分離物的霉菌MICs均為16ug/ml(圖65，表36)。
            
 實施例XXVII   活性譜測試-分枝桿菌   對有代表性的一組通常遇到的臨床微生物，包括機會病原體、靶病原體和正常人菌群測試化合物109。通過使用BACTEC 460TB系統(Becton Dickinson，Cockeysville，MD，USA)，按照制造商的說明完成化合物109的活性譜。使用為測試緩慢生長的分枝桿菌種類推薦的瓊脂比例法測定MOTT的MICs，而使用推薦的肉湯微稀釋法(NCCLSM24-A，2003)完成較為快速生長的分枝桿菌的MICs。
            
 SQ-109在對結核分枝桿菌[MTB](0.25-0.5ug/ml)，牛分枝桿菌(0.25ug/ml)和牛分枝桿菌BCG(0.5ug/ml)測試時表現出極為良好的活性。在測試的抗性MTB株，SQ-109對INH-抗性MTB菌株具有的MIC為0.25ug/ml，且對EMB-抗性株的MIC為0.5ug/ml(表37)。
            
 SQ-109對非TB的分枝桿菌(MOTT)表現出較低的活性，其中對三種供試海分枝桿菌菌株的MIC均為8ug/ml，對測試的三種堪薩斯分枝桿菌的MIC均為16ug/ml，且對檢驗的三種鳥分枝桿菌(M.avium)分離物(MAC)的MICs在8-32ug/ml(表38)。
            
 SQ-109對較為快速生長的偶發分枝桿菌表現出良好的活性，其中對所有測試的菌株的MIC均為1ug/ml并且對龜分枝桿菌類(龜分枝桿菌和膿腫分枝桿菌(M.abscessus))中的更多抗性成員具有較低的活性，其中對三種供試菌株的MIC均為16ug/ml(圖66，表39)。
            
 實施例XXV-XXVII的結果顯示了對MTB復合物(結核分枝桿菌、牛分枝桿菌和牛分枝桿菌BCG)、偶發分枝桿菌、海分枝桿菌、幽門螺桿菌、肺炎鏈球菌和白色念珠菌中的分枝桿菌屬的幾個種類表現出最佳抑制活性。還發現SQ-109對結核分枝桿菌的敏感性和抗性株具有等效活性。
            
 實施例XXVII   SQ109與第一線抗結核藥在體外的協同相互作用   概述   本研究的目的在于測定SQ109與現存的抗結核藥物在體外的相互作用并且評價其在改善聯合用藥對結核分枝桿菌的活性方面的潛能。
            
 在體外使用BACTEC 460系統測試兩種-藥物組合在低于其最小抑制濃度(MIC)的不同濃度下對結核分枝桿菌的生長抑制作用。基于從使用單一抗生素或使用兩種抗生素聯合療法處理的培養物的生長指數以數字方式衍生的商數值評估藥物濃度。
            
 SQ109在0.5其MIC下與0.5MIC異煙肼和低至0.1MIC利福平一起表現出抑制結核分枝桿菌生長的強協同作用活性。在SQ109與鏈霉素之間觀察到加合的作用，但使用SQ109與乙胺丁醇或吡嗪酰胺的聯合用藥既無協同作用，又無加合的作用。使用利福平-抗性(RIFR)結核分枝桿菌菌株也證實了SQ109與利福平之間的協同作用，SQ109降低了利福平對這些藥物抗性株的MIC。
            
 SQ109以協同作用方式與異煙肼和利福平，即最重要的第一線TB藥物中的兩種發生相互作用。
            
 材料和方法   抗微生物藥異煙肼、利福平、鏈霉素和乙胺丁醇購自Sigma-Aldrich.St.Louis，MO。使用蒸餾水和去離子水制備10mg/mL的異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇的儲備溶液10mg/mL，通過過濾滅菌并且冷凍儲存在-80℃下。制備在甲醇中的1或10mg/mL利福平儲備溶液并且儲存在-80℃下。吡嗪酰胺作為重制藥物試劑盒購自BectonDickinson，Cockeysville，MD并且按照制造商的說明書制備儲備溶液。制備在甲醇中的SQ109的1mg/mL儲備溶液并且儲存在-80℃下。
            
 結核分枝桿菌菌株   結核分枝桿菌菌株H37Rv為用于上述記錄我們的文庫中的化合物活性的研究中采用的相同菌株。在本研究中使用的單RIFR結核分枝桿菌菌株分離物獲自Department of Health and Mental Hygiene，Central Laboratory，State of Maryland。在國家實驗室預先測定菌株3185和2482的藥物敏感性特征并且此后在Sequella證實。兩種菌株對0.1mg/L異煙肼，2.5mg/L乙胺丁醇和2mg/L鏈霉素均有敏感性。利福平MIC對菌株3185而言為24mg/L且對菌株2482而言＞100mg/L。并未測定與利福平抗性相關的rpoB突變性質。
            
 將補充了10％OADC(Difco)的Media Middlebrook 7H11瓊脂(Difco，Becton Dickinson)用于使結核分枝桿菌生長為BACTEC接種物。將BACTEC 7H12B培養基(Becton Dickinson)用于所有藥物組合實驗，但除去吡嗪酰胺+SQ109在PZA Test Medium(BectonDickinson)中評價這種聯合用藥。
            
 將藥物對結核分枝桿菌生長BACTEC 460系統(Becton Dickinson)的作用的評價用于測定每種單個藥物的MIC并且研究藥物在體外對結核分枝桿菌生長的聯合作用。使結核分枝桿菌H37Rv或RIFR結核分枝桿菌分離物生長在7H11瓊脂平板上。通過將菌環量轉入包含稀釋流體和玻璃珠的加蓋玻璃試管并且渦旋以破碎團塊制備來自4-6周齡平板的細菌接種物。將在1McFarland Standard的不含團塊的結核分枝桿菌懸浮液接種入包含不同組合的測試藥物(SQ109、異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素)的Middlebrook 7H12培養基。通過測定細菌在培養基中消耗14C標記的棕櫚酸后釋放的14CO2，每天監測表示為生長指數或GI的桿菌生長。為了測定吡嗪酰胺和SQ109的聯合作用，我們使用專用的來自Becton Dickinson的吡嗪酰胺測試培養基。在每次實驗中均包括無藥物的對照組，包括未稀釋和按照1∶100稀釋的細菌接種物，以便監測細菌生長。當1∶100接種小瓶的GI值達到30或30以上時，衍生了所有測試小瓶的最新的GI與在先的讀數之間的GI值的差ΔGI。將指定藥物的MIC定義為最低濃度，此時，藥物小瓶的ΔGI低于1∶100對照組的ΔGI。所有實驗均在5-8天內完成。
            
 數據分析使用上述技術9，基于GI值評價藥物組合的作用。將協同作用定義為x/y＜1/z，其中x為含有藥物組合的測試小瓶的GI，y為組合中單一藥物的最低GI，且z為聯用藥物的數量。就兩種藥物組合而言，＜0.5的商數表示協同作用，商數為1表示無相互作用，商數＞2表示拮抗作用，而商數＜0.75且＞0.5表示加合作用。
            
 結果   SQ109體外的抗微生物活性對實驗室菌株H37Rv結核分枝桿菌我們預先通過微量-肉湯稀釋測定SQ109MIC為0.2μM(0.11mg/L)或通過BACTEC測定為0.63μM(0.35mg/L)3。近來完成了對不超過30種結核分枝桿菌臨床分離物(藥物敏感性和藥物抗性，包括EMBR菌株)的SQ109MIC測定，發現這些臨床分離物的敏感性無法與H37Rv區分(MIC范圍0.16-0.64mg/L)。SQ109的這些體外活性提示它對藥物敏感性和藥物抗性結核分枝桿菌，包括對母體藥效團乙胺丁醇具有耐藥性的菌株，具有等效活性。
            
 SQ109與異煙肼，鏈霉素、乙胺丁醇，和吡嗪酰胺的相互作用   使用棋盤滴定，其中研究兩種抗生素單獨和組合方式的系列稀釋液在所有可能的濃度下對細菌生長抑制的作用，可以以代數方式測定兩種抗生素之間的相互作用。可以將兩種組合方式的抗生素之間的相互作用描述為協同作用，加合作用，無作用或拮抗作用。為了將實驗數據翻譯成藥物-藥物相互作用的類型，將商數x/y(其中x為兩種抗生素組合時獲得的數據，而y為以相同濃度分別測試時具有兩種活性劑的較低值的數據)。如果x/y值等于1，那么將其解釋為組合中的藥物之一無活性。如果對兩種藥物組合而言x/y小于0.5，那么其含義為兩種藥物在聯用時比單獨使用它們時更有效，從而提示了協同作用。如果x/y值落入0.5-0.75，那么在兩種藥物之間可能存在加合作用，從而提示了它們之間弱的強化作用。如果x/y值大于2，那么提示兩種藥物之間的相互拮抗作用。x/y之間的范圍大于1且小于2為從無作用到拮抗作用之間的過渡區。通過應用公布的和另外驗證的簡單代數學，我們可以評價兩種組合的藥物在體外測定系統中可能的結果。
            
 為了確定在未來人體功效試驗中可能包括SQ109的最佳藥物組合，我們分析了SQ109與目前用于治療TB患者的抗生素之間的相互作用。每種藥物的MIC為抑制99％細菌接種物生長的最低濃度，因此，顯然必須在低于MIC水平的單個藥物濃度下對所觀察到的作用評價協同作用，加合作用或拮抗作用。表40(圖67)對SQ109與異煙肼、鏈霉素乙胺丁醇和吡嗪酰胺的組合在低于其MIC值的藥物濃度下列舉了各單個藥物的MIC以及商數值(參見數據分析，材料和方法中的定義)。將用于組合中的藥物各自的濃度表示為MIC值的分數。該表僅包括觀察到協同作用或加合作用時的組合。對未觀察到作用的藥物組合而言，僅列舉出了獲自具有在實驗中測試的最高次佳劑量的組合的商數。SQ109在兩種藥物以0.5MIC使用時表現出與異煙肼的協同作用并且在與鏈霉素聯用時表現出加合作用。SQ109與乙胺丁醇或吡嗪酰胺未表現出任何正向相互作用(加合或協同作用)，不過，與乙胺丁醇的組合處于加合作用的邊緣。使用在本研究中測試的任意兩種藥物的組合均未觀察到拮抗作用。
            
 SQ109與利福平的相互作用   當SQ109與利福平聯用時，我們觀察到了兩種藥物之間顯著的協同作用，正如平均商數值所示(表41，圖67)。這種協同作用以兩種方式起作用SQ109以協同作用方式增強利福平的活性，而利福平以協同作用方式增強SQ109的活性。SQ109在0.5MIC下表現出與低至0.1MIC濃度下的利福平的協同作用。在0.2MIC SQ109與0.5MIC利福平聯用時也觀察到了協同作用。有意義的是，與低于0.5MIC的兩種藥物濃度的組合(0.2MIC SQ109+0.25MIC利福平)表現出加合相互作用。
            
 SQ109和利福平在RIFR結核分枝桿菌中的相互作用。為了檢驗SQ109與利福平之間的協同相互作用是否也有利于抑制藥物抗性結核分枝桿菌菌株，我們評價了與RIFR結核分枝桿菌臨床分離物的藥物相互作用。利福平對RIFR結核分枝桿菌分離物3185和2482的MIC分別為24mg/L和＞100mg/L，遠高于藥物敏感性結核分枝桿菌H37Rv的平均MIC(0.17mg/L，表41圖)。RIFR表型不會影響SQ109對這些菌株的MIC對兩者的MIC均為0.32mg/L，與對RIFs結核分枝桿菌H37Rv測定的值相同。圖68表示在有0.5MIC SQ109(a)或0.5MIC乙胺丁醇(b)存在下測試對利福平的敏感性時菌株3185的GI分布型。RIFR桿菌在0.6MIC利福平存在下生長充分(16mg/L，高于對結核分枝桿菌H37Rv測定的平均MIC 90-倍以上)。添加0.5MIC SQ109(0.16mg/L)到利福平-處理的RIFR細菌中抑制了99％以上的生長。利福平在有SQ109存在下對RIFR結核分枝桿菌生長的劑量依賴性抑制作用隨利福平在測試小瓶中的濃度的降低而下降。利福平在16，12和8mg/L下的x/y商數分別為0.35，0.40和0.48，表示了SQ109與利福平之間的協同相互作用。在6和4mg/L利福平下觀察到了加合的相互作用(x/y分別＝0.55和0.64)。這種協同作用在0.5MIC乙胺丁醇(不同的二胺抗生素)與利福平聯用時未觀察到(圖68(b))。
            
 使用不同的RIFR結核分枝桿菌菌株2482重復使用RIFR菌株3185的實驗，其利福平抗性甚至更顯著MIC＞100mg/L。正如圖68中所示，細菌在有100mg/L利福平存在下適當生長。添加0.5MIC SQ109到該培養物中抑制了99％以上的生長。利福平在100，50，和25mg/L下的x/y商數分別為0.33，0.39和0.497，表示了SQ109與利福平之間的協同相互作用。在12.5和6.25mg/L利福平下觀察到了加合相互作用(x/y分別＝0.62和0.71)。此外，在0.25MIC SQ109(0.08mg/L)和100mg/L利福平下也觀察到了加合作用(x/y＝0.66)。此外，0.5MIC乙胺丁醇未表現出與利福平對菌株2482的任何加合或協同作用活性(數據未顯示)。在這兩種情況中，觀察到SQ109與利福平之間的協同作用時的與MIC的濃度比，與對RIFs菌株獲得的值相似，其含義是這種協同相互作用不依賴于藥物的敏感性狀態。這些結果強烈提示SQ109與利福平之間的協同作用對這種藥物組合的特異性，并且增強的藥物相互作用抑制了RIFs和RIFR菌株中的結核分枝桿菌功能。
            
 討論   多-藥物療法對治愈TB感染是必需的并且避免了耐藥性細菌的出現。任何新的抗-TB藥物候選物需要評價聯合用藥的相互作用以便優化單個藥物的活性并且避免藥物拮抗作用。在本研究中，我們報告了我們有關SQ109(新的二胺抗結核藥候選物)與常用抗-TB藥物在體外的相互作用的發現。我們使用生長抑制在這些研究中可以測定的可能的相互作用包括拮抗作用，協同作用，加合作用或完全無作用。我們未發現SQ109與5種在本研究中供試的第一線TB藥物中任意種之間的拮抗相互作用。[SQ109+乙胺丁醇]或[SQ109+吡嗪酰胺]的聯合用藥未表現出相互作用，無論是正向作用還是反向作用，并且這些聯合用藥對結核分枝桿菌的作用與使用單一藥物治療獲得的那些結果相差無幾。未觀察到SQ109與鏈霉素之間在某些濃度下的加合相互作用，也未觀察到協同作用。相反，SQ109表現出與兩種不同第一線藥物的協同作用異煙肼和利福平。SQ109與利福平之間的協同相互作用特別有意義并且十分有效在各藥物極的低濃度下0.1MIC利福平+0.5MIC SQ109獲得的對結核分枝桿菌的抑制作用在99％以上。在本文中所述的體外協同作用結果與體內研究一致(Nikonenko，等，準備中)，所述的體內研究證實，在SQ109與利福平和異煙肼聯用時在感染了結核分枝桿菌的實驗動物中的藥物協同作用。這些體內結果通過含SQ109的藥物組合與含乙胺丁醇的類似組合的比較顯示了增強的殺菌活性和較快的結核分枝桿菌消除作用。在這兩種研究中提供的體外和體內數據共同可以指導我們獲得用于治療活動性TB疾病的未來SQ109臨床試驗中最有效的藥物組合設計。
            
 有意義的是，在本研究中的數據還證實SQ109完全對RIFR結核分枝桿菌臨床分離物具有活性。這一結果與獲自30種以上藥物敏感性和藥物抗性結核分枝桿菌的研究的近期結果一致，其中菌株具有相同的SQ109MIC(范圍0.16-0.64mg/L)，從而提示對本化合物不存在耐受性。在對RIFR分離物測試時也觀察到了SQ109與利福平之間的協同作用。在0.5MIC下，SQ109能夠以劑量依賴性方式提高利福平對抗性生物體的活性。使用0.5MIC乙胺丁醇未觀察到這一活性，從而提示了SQ109與利福平之間的特異性相互作用可能導致所述的觀察結果。盡管這一觀察結果不一定有直接的臨床相關性，但是它指出了SQ109與其母體藥效團乙胺丁醇之間的另外差異，并且可能為揭示出SQ109對結核分枝桿菌的作用的有意義的實驗模型。
            
 對利福平與SQ109對結核分枝桿菌的顯著協同作用的確定解釋尚未得到。據推定，盡管不希望受到下列理論約束，但是協同相互作用可能因藥物作用中的差異所致。盡管SQ109的精確靶標未知，但是它確實影響分枝桿菌細胞壁合成。可能是SQ109對分枝桿菌細胞壁的作用導致滲透性增加所致，從而使得利福平更易于進入細菌。經證實細胞壁抑制劑(諸如乙胺丁醇)的次級抑制濃度提高了克拉霉素對結核分枝桿菌的殺菌活性，據推定是通過減少藥物進入的滲透屏障所致。然而，細胞壁抑制劑乙胺丁醇在與利福平聯用時在用于我們使用RIFsH37Rv或RIFR結核分枝桿菌臨床分離物(圖68)或其他藥物敏感性菌株的實驗時未表現出任何協同作用，從而恰好提示了對分枝桿菌細胞壁結構的任何作用不一定提供利福平與其他藥物的協同相互作用。此外，已知利福平因其親脂性而可快速透入分枝桿菌疏水性細胞壁。作為結果，SQ109對細胞壁滲透性的作用可能并非是在體外觀察到的利福平與SQ109之間的協同作用的唯一貢獻者。
            
 還可能的情況是SQ109的目前未知的主要靶標在轉錄水平上受到緊密調節。利福平為DNA轉錄的抑制劑。由于不同基因的mRNA轉錄物在半衰期上有差異，所以抑制轉錄可能對那些具有半衰期短于那些具有長半衰期的轉錄物具有顯著作用。因此，利福平甚至在次佳濃度下治療也可以發揮出對短壽命mRNA靶標對SQ109活性的水平的顯著作用。然而，這種推定與兩種藥物之間的協同作用不受結核分枝桿菌菌株RIFR表型影響這一觀察結果不一致。這提示利福平的其他作用(并非其僅僅作為抗生素起作用)貢獻了其與SQ109之間的協同相互作用。利福平抗生素活性可以確定為貢獻因素，但可能并非決定與SQ109的有意義的相互作用的唯一因素，這一結果由有關RIFR菌株的MIC數據提示。當利福平的MIC在RIFR中比在RIFs菌株中變得更高時，顯示與相同量的SQ109的協同作用的利福平濃度也較高，不過，以MIC的分數表示的聯合用藥在菌株研究之間類似。無論完整地評價利福平的作用，對SQ109活性的轉錄抑制需要鑒定SQ109靶標，這是我們實驗室中正在進行的工作。
            
 利福平對利福平與SQ109之間的藥物協同相互作用的另一種可能的作用在于利福平作為細胞色素P450(CYP)有效誘導物的作用。CYP為涉及廣泛NADPH/NADH-依賴性反應的含血紅素的酶的超家族，并且它們在化合物，諸如固醇類、膽固醇類和脂肪酸類的生物合成以及異生素和活性物質解毒中起中心作用。利福平為人肝細胞以及外周血淋巴細胞中各種CYP的有效誘導物。
            
 結核分枝桿菌完整基因組揭示了至少20種CYP，但這些基因的確切功能仍然需要闡明。類似于其哺乳動物負體(ounter part)，利福平誘導分枝桿菌CYP。Ramachandran和Gurumurthy測定了存在于提取自利福平-處理的恥垢分枝桿菌和結核分枝桿菌的細菌膜級分中的CYP活性。在兩種情況中，在處理的級分中的CYP活性均比未處理的對照組升高并且CYP活性的提高具有統計學顯著性。他們平行地發現異煙肼在其處理的級分中不會誘導CYP活性。利福平在結核分枝桿菌中誘導CYP的能力可以貢獻其與SQ109之間的協同作用。在這種情況中，CYP實際上可以通過在結核分枝桿菌內產生SQ109氧化代謝物活化SQ109，而并非使活性化合物失活。
            
 近期對SQ109代謝獲得的數據顯示SQ109在與人肝微粒體一起孵育后快速代謝僅8％SQ109在40分鐘孵育后保留。分析通過微粒體作用產生的SQ109代謝物揭示出基于分子量的4種化學基團。這些基團中的兩種包含氧化代謝物。此外，本研究發現SQ109被人CYP2D6和CYP2C19代謝成這些代謝物。基于SQ109被CYP快速代謝這一發現，可能的情況是其抗分枝桿菌活性可以來源于其代謝物之一。可以想像SQ109為前體藥物并且需要通過結核分枝桿菌CYP活化。我們推測當SQ109與利福平聯用時，后者誘導分枝桿菌內的某些CYP活性。升高的CYP活性更有效地活化了SQ109前體藥物，從而產生了兩種藥物的明顯的協同作用活性。實際上，使用SQ109+利福平的聯合用藥觀察到的增強的活性可以更為有效，并且可能是SQ109活性代謝物的有效活性而非利福平自身的活性增強。
            
 SQ109具有極窄的譜它對結核分枝桿菌和牛分枝桿菌BCG具有活性，但對恥垢分枝桿菌和鳥分枝桿菌的活性非常低(未公布數據)。通過比較存在于不同分枝桿菌基因組中的推定的CYP可讀框，Kelly等證實存在幾種唯一存在于結核分枝桿菌和牛分枝桿菌中的CYP。這些CYP為可能導致結核分枝桿菌內SQ109轉化成活性代謝物的作用物的強有力的候選物，并且它們為正在進行的研究中的受試者。
            
 實施例XXIX   多藥物研究   本實驗研究動物模型化實驗中的加強期療法過程中異煙肼(INH)+利福平(RIF)+吡嗪酰胺(PZA)+SQ109(INH/RIF/PZA/SQ109)在消除肺中的結核分枝桿菌中與標準DOTS INH+RIF+PZA+乙胺丁醇(EMB)(INH/RIF/PZA/EMB)相比的功效(參見圖70)。
            
 優選的II期研究為前瞻性的，多中心，雙盲，隨機化，安慰劑對照的SQ109臨床研究，將其設計為   ■在達0-50mg/天(TBD)SQ109與INH/RIF/PZA的兩個(2)月口服給藥過程中確定SQ109在具有陽性痰培養物的男性和女性結核病志愿者患者中的安全性和耐受性(主要目的)；   ■評價SQ109在截止到2個月或2個月內將患者轉化成痰培養物陰性的最低劑量(主要目的)。
            
 進行動物(小鼠)實驗以便增加SQ109劑量，同時保持INH/RIF/PZA在標準DOTS劑量下以便模擬本研究的設計并且預期可能的人體劑量。
            
 還進行了預先的INH，RIF&PZA藥物相互作用研究，包括小鼠中的ADME和體外藥物相互作用(微粒體)。
            
 交替多劑量(5天)EBA研究   交替II期多劑量研究為Dennis Mitchison為新TB藥物研發提出并且由Stephen Gillespie(London)進行的‘早期殺菌試驗(EarlyBactericidal Assay)(EBA)’研究，并且在這些研究中，將抗生素單一療法進行短期時間，同時監測痰中的細菌數量。這些研究能夠測定單一抗生素減少痰中的細菌的最低有效劑量并且可以擴展SQ109的安全性；然而，這些研究不能為聯合療法提供有效數據。就可預測的未來而言，預計用至少具有不同作用方式的3種藥物治療結核病。
            
 交替多劑量(5天)EBA研究可以隨機化的開放式的SQ109臨床研究，設計它是為了基于SQ109的EBA測定SQ109在具有肺結核的患者中的臨床功效，并且進一步評價其安全性。EBA研究提供了評價潛在活性劑在研究藥物單一療法的短期中治療結核病中的臨床功效的快速和經濟的方式(3-14天，通常為5天)。
            
 對約100位患者(參見下文的標準)每天口服給予一次SQ109(n＝40)或6-mg/kg INH(n＝10)，持續5天。在研究期后跟隨的是6個月的標準治療方案。基于其他研究確定用于本研究的SQ109劑量，諸如可以采用的具有良好PK參數且無有害副作用的最高藥物用量，還考慮到了使用實驗室動物的功效研究中獲得的治療劑量(30mg/m2)。
            
 登記包括的標準   年齡在18-60歲的成年男性或女性。
            
 新近診斷的肺結核初步發作。
            
 胸部X-光片和臨床發現與結核一致。
            
 痰涂片陽性患者適合于登記。結核的診斷還必須得到培養物的證實。隨后將發現AFB涂片陽性患者不具有TB(即那些無結核分支桿菌疾病的患者)和那些無培養物證實的患者從本研究中排除。
            
 登記排除標準   妊娠或人乳喂養   HIV-感染   在先結核病史或在先結核治療史   最初胸部X-光片上有結核空洞(取進入研究14天內)   接觸具有已知藥物抗性結核的人   具有藥物抗性結核的患者(耐受INH，RIF，PZA或EMB)   接受長期類固醇或其他免疫抑制藥的患者   肺外結核   在治療前2天(基線)和研究2和5天后采集痰和血。同時評價血液和生物化學參數。如所述的測定CFU計數/毫升(Jindani A，Dor éCJ，Mitchison DA，American Journal of Respiratory和CriticalCare Medicine 2003 Vol 167.pp.1348-1354)。根據公式對每位患者計算EBA(log CFU/ml第0天-log CFU/ml第5天)/5并且報告為平均值±標準偏差(SD)。正如幾位作者推薦的，我們將EBA定義為前5天治療過程中每天中log10CFU/毫升痰的下降。
            
 實施例XXX   SQ109與INH，SM，EMB和PZA在體外的相互作用   為了確定包括用于未來人體功效試驗中的SQ109的最佳藥物組合，我們分析了SQ109與目前用于治療TB患者的抗生素之間的相互作用。每種藥物的MIC為殺傷或抑制99％細菌接種物生長的最低濃度。顯然必須在低于觀察到作用的MIC水平的各藥物濃度下評價聯合用藥的協同作用，加合作用或拮抗作用。表41中列舉了每種單個藥物的MIC以及SQ109與在低于其MIC值的藥物濃度下的INH，STR，EMB和PZA的聯合用藥的商數值。將用于聯合用藥的藥物各自的濃度表示為MIC值的分數。一般而言，在聯合用藥的商數值不超過0.5時觀察到協同作用，在該商數值在0.5-0.75范圍內觀察到加合作用。
            
   
            
      表41.在與INH，SM，EMB或PZA MIC的兩種藥物組合中測試的SQ109的協同作用商數INH0.05μg/ml，SM0.25μg/ml，EMB1.25μg/ml，PZA100μg/ml，SQ1090.32μg/ml或0.64μg/ml。
            
 可以將這種協同作用實驗的結果概括如下   ●SQ109與INH在兩種藥物以1/2 MIC使用時表現出體外協同作用。
            
 ●SQ109與EMB無相互作用并且與SM僅有加合相互作用。
            
 ●SQ109在所有濃度下與1/2 MIC RIF均表現出顯著協同作用并且在1/2 MIC SQ109下具有較低濃度的RIF。
            
 ●SQ109與測試的4種藥物中的任意種在所有劑量組合下均無拮抗相互作用。
            
 當SQ109與RIF聯用時，我們觀察到兩種藥物之間的顯著協同作用，正如根據平均商數值表示的(表41和圖71)。
            
 實施例XXXI   SQ109和RIF在RIFR結核分枝桿菌中的相互作用   為了檢驗SQ109與RIF之間的協同相互作用是否也有利于殺傷藥物抗性結核分枝桿菌菌株，我們評價了藥物與RIFR結核分枝桿菌臨床分離物的藥物相互作用。對RIFR結核分枝桿菌分離物3185和2482的RIF MIC分別為24μg/ml和＞100μg/ml，遠高于藥物敏感性結核分枝桿菌H37Rv的平均MIC(0.17μg/ml)。RIFR表型不會影響SQ109對這些菌株的MIC對兩種菌株的MIC均為0.32μg/ml，該值與對RIFs結核分枝桿菌H37Rv測定的結果相同。我們已經發現(圖72)對兩種菌株而言，觀察到SQ109與RIF之間協同作用時的濃度與MIC比與對RIFs菌株獲得的那些結果類似，其含義是這種協同相互作用不依賴于藥物敏感性狀態。這些結果強烈提示SQ109與RIF之間的協同作用對這種藥物組合而言為特異性的并且增強的相互作用可以殺傷RIFs和RIFR菌株中的結核分枝桿菌功能。在0.5MIC EMB與RIF聯用時未觀察到協同作用。
            
 圖72提供了用RIF和SQ109處理的RIFR結核分枝桿菌分離物2482的生長分布型。使用BACTEC 460進行本實驗。RIF和SQ109在菌株2482中的MIC分別為＞100μg/ml和0.32μg/ml。
            
 聯合療法；在小鼠中的研究   我們已經進行了體內研究，其中測試了SQ109在與其他抗-TB藥物聯用時的功效利福平，異煙肼，乙胺丁醇，吡嗪酰胺，莫西沙星。首先，在快速小鼠模型(由Sequella科學家Dr.Boris Nikonenko研發)中研究聯合用藥的有效性，該模型能夠基于防止感染動物體重減輕的能力，快速和以足夠的精確度預測藥物功效，所述的體重減輕為TB嚴重性的體征之一。
            
 簡言之，給小鼠iv接種106CFU烈性結核分枝桿菌H37Rv以便發生快速和進行性的TB病。在接種后7天開始化療并且持續10天。將實驗單一藥物(SQ109，Rif，INH，EMB，PZA和Moxi)治療的小鼠以及未感染的動物和感染的未治療的安慰劑治療的動物用作對照組。在該模型中，所有標準藥物均以低于其最有效的劑量實驗以便觀察效果(當以其治療劑量使用時，藥物治療的小鼠未發生體重減輕)以2mg/kg研究Rif，以1mg/kg研究INH，以10mg/kg研究EMB，以10mg/kg研究Moxi，以50mg/kg研究PZA。從0時開始監測所有組中小鼠的體重。截止到第10天時，感染的安慰劑對照組小鼠開始發生體重減輕；截止到第20天時，該組中的小鼠的體重減少了25％以上。
            
 第21天的結果(圖73)表明SQ109與利福平和INH聯用可增強活性。SQ109-Rif聯合用藥完全防止了化療期過程中的體重減輕。此外，SQ109-Rif聯合用藥顯著延長了化療窗后的治療效果，圖73。在SQ109-乙胺丁醇聯合用藥中未觀察到效果，對SQ109-PZA而言獲得的適度改善可以歸因于單獨的SQ109功效。對SQ109-Moxi聯合用藥證實了拮抗作用，這一結果與在體外獲得的結果相反。在Rif-EMB聯合用藥中未觀察到改善。圖73提供了第21天的快速模型聯合療法研究。使C3H雌性小鼠i.v.感染106CFU預先傳播給小鼠的結核分枝桿菌H37Rv(Pasteur)。在接種后7天，開始使用抗-TB藥物化療并且持續至第21天。
            
 實施例XXXII   作為聯合用藥供試的Sequella的藥物候選物SQ109，SQ609和SQ73的體內功效   作為我們嘗試研發用于結核治療的新方案的組成部分，我們在慢性TB感染小鼠模型中研究了SQ109(10mg/kg)與Sequella的潛在藥物候選物-二哌啶SQ609(10mg/kg)和1，2-乙二胺SQ73(5mg/kg)的聯合用藥，圖75。
            
 以下列劑量使用所述的化合物SQ109，10mg/kg；SQ609，10mg/kg，SQ73，5mg/kg；總每日劑量之和25mg/kg。將該藥物組合的活性與在本研究中以25mg/kg用作對照組的最有效的抗-TB藥物之一異煙肼(INH)的功效進行比較。
            
 使小鼠感染低劑量的結核分枝桿菌H37Rv并且在感染后4周開始化療并且持續2周。
            
 在本研究中，SQ609-SQ109-SQ73聯合用藥表現出與INH在其最有效劑量下類似的活性。
            
 圖75提供了慢性TB研究結果。給C57BL/6雌性小鼠i.v.接種104CFU結核分枝桿菌H37Rv。在感染后4周開始化療并且持續2周。對一組小鼠(6只小鼠/組)測試每種對照組藥物和所述的聯合用藥。治療2周后，處死小鼠；將在含有0.05％Tween-80的無菌的2ml PBS中的肺勻化物以10-倍連續稀釋液鋪平板于7H10瓊脂平皿上并且在37℃下孵育。在生長3周后計算CFU。以25mg/kg使用INH，以10和25mg/kg使用SQ109，以10mg/kg使用SQ609；聯合用藥(圖上的“總和”)以10mg/kg使用SQ109，以10mg/kg使用SQ609，以5mg/kg使用SQ73。使用ANOVA檢驗進行統計學分析通過學生T-檢驗評估任何差異的顯著性并且將p＜0.05視為具有統計學顯著性。 
            
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權利要求
            
1.組合物，包含下式的取代的乙二胺化合物
            
其中R4選自H、烷基、芳基、雜原子取代的烷基與芳基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳炔基、環烷基、環烯基；
            
且其中R1、R2和R3獨立地選自H、烷基、芳基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、環烷基、環烯基、雜烷基、雜芳基、鹵化物、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、氨基；或者
            
其中R1選自H、烷基、芳基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、環烷基、環烯基、雜烷基、雜芳基、鹵化物、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、氨基，且NR2R3是從環狀仲胺衍生的，
            
該組合物進一步包含抗微生物藥、抗菌藥、抗真菌藥、抗寄生物藥、抗病毒藥。
            
2.權利要求1所述的組合物，其中所述的抗菌藥包括抗結核藥。
            
3.權利要求3所述的組合物，其中所述的抗結核藥包括利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇。
            
4.權利要求1所述的組合物，其中取代的乙二胺的NHR1或NR2R3具有如下化學結構
            
5.權利要求4所述的組合物，其中取代的乙二胺化合物選自
            
6.權利要求1所述的組合物，其中取代的乙二胺的NHR1或NR2R3具有如下化學結構
            
7.權利要求6所述的組合物，其中取代的乙二胺化合物選自
            
8.權利要求1所述的組合物，其中取代的乙二胺的NHR1或NR2R3具有如下化學結構
            
9.權利要求8所述的組合物，其中取代的乙二胺化合物選自
            
10.權利要求1所述的組合物，其中取代的乙二胺的NHR1或NR2R3具有如下化學結構
            
11.權利要求10所述的組合物，其中取代的乙二胺化合物選自
            
12.權利要求11所述的組合物，其中取代的乙二胺化合物為
            
13.權利要求1所述的組合物，其中取代的乙二胺化合物選自
            
14.制備下式的取代的乙二胺化合物的方法
            
其中R4選自H、烷基、芳基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳炔基、環烷基、環烯基；
            
且其中R1、R2和R3獨立地選自H、烷基、芳基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、環烷基、環烯基、雜烷基、雜芳基、鹵化物、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、氨基；或
            
其中R1選自H、烷基、芳基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、環烷基、環烯基、雜烷基、雜芳基、鹵化物、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、氨基，且NR2R2是從環狀仲胺衍生的；
            
該方法包括將含有羥基的固相支持體樹脂在堿的存在下用供鹵試劑活化，生成含有鹵代基團的固相支持體樹脂；
            
將鹵代基團用最初的伯胺置換，生成含有胺基團的固相支持體樹脂；
            
將胺基團在堿性化合物的存在下用鹵代酰鹵酰化，或者在堿的存在下用鹵代酰基酸酰化，生成含有α-鹵代乙酰基酰胺基團的固相支持體樹脂；
            
將α-鹵代乙酰基酰胺類的α-鹵代基團用仲胺或隨后的伯胺置換，生成含有α-胺酰亞胺基團的固相支持體樹脂；
            
將α-胺酰亞胺基團上的羰基部分用還原劑還原，生成含有被兩個碳原子隔開的兩個胺基團的固相支持體樹脂；
            
在酸的存在下從固相支持體樹脂上裂解被兩個碳原子隔開的胺基團，生成取代的乙二胺化合物。
            
15.權利要求12所述的方法，其中最初的伯胺為R1NH2。
            
16.權利要求12所述的方法，其中仲或隨后的伯胺為R2R3HN。
            
17.治療由傳染原所致疾病的方法，包括給予有效量的包含下式的取代的乙二胺化合物的組合物
            
其中R4選自H、烷基、芳基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳炔基、環烷基、環烯基；
            
且其中R1、R2和R3獨立地選自H、烷基、芳基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、環烷基、環烯基、雜烷基、雜芳基、鹵化物、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、氨基；或
            
其中R1選自H、烷基、芳基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、環烷基、環烯基、雜烷基、雜芳基、鹵化物、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、氨基，且NR2R2是從環狀仲胺衍生的；
            
該組合物進一步包含抗微生物藥、抗菌藥、抗真菌藥、抗寄生物藥、抗病毒藥。
            
18.權利要求17所述的組合物，其中所述的抗菌藥為抗結核藥。
            
19.權利要求17所述的組合物，其中所述的抗結核藥包括利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇。
            
20.權利要求17所述的方法，其中所述的傳染原包括細菌、真菌、寄生物或病毒病原體。
            
21.權利要求20所述的方法，其中所述的細菌病原體包括結核分枝桿菌(M.tuberculosis)、細胞內鳥分枝桿菌(M.avium-intracellulare)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansarii)、偶發分枝桿菌(M.fortuitum)、龜分枝桿菌(M.chelonae)、麻風分枝桿菌(M.leprae)、非洲分枝桿菌(M.africanum)、田鼠分枝桿菌(M.microti)、鳥副結核分枝桿菌(M.avium paratuberculosis)、細胞內分枝桿菌(M.intracellulare)、瘰疬分枝桿菌(M.scrofulaceum)、蟾分枝桿菌(M.xenopi)、海分枝桿菌(M.marinum)或潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)。
            
22.權利要求17所述的方法，其中所述的疾病包括結核或克羅恩病。
            
23.權利要求17所述的方法，其中取代的乙二胺化合物為
            
24.權利要求23所述的方法，進一步包含藥用載體。
            
25.組合物，包含取代的乙二胺化合物，該化合物包括
            
26.制備下式的取代的乙二胺化合物的方法
            
其中R4選自H、烷基、芳基、雜原子取代的烷基和芳基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳炔基、環烷基、環烯基；
            
且其中R1、R2和R3獨立地選自H、烷基、芳基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、環烷基、環烯基、雜烷基、雜芳基、鹵化物、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、氨基；
            
該方法包括將含有羥基的固相支持體樹脂在堿的存在下用供鹵試劑活化，生成含有鹵代基團的固相支持體樹脂；
            
將鹵代基團用最初的伯胺置換，生成含有胺基團的固相支持體樹脂；
            
將胺基團在偶聯試劑和堿的存在下用FMOC保護的氨基酸酰化，繼之以除去FMOC保護基團，生成含有α-氨基乙酰胺基團的固相支持體樹脂；
            
將α-氨基乙酰胺基團的α-氨基用羰基化合物修飾，生成含有對應的α-氨基乙酰胺基團衍生物的固相支持體樹脂；
            
將酰胺基團上的羰基部分用還原劑還原，生成含有被兩個碳原子隔開的兩個胺基團的固相支持體樹脂；并且
            
在酸的存在下從固相支持體樹脂上裂解被兩個碳原子隔開的胺基團，生成取代的乙二胺化合物。
            
27.治療傳染病的方法，包括給予藥學上有效量的權利要求25中所述的組合物。
            
28.組合物，包含下式對稱取代的乙二胺化合物
            
其中R4選自H、烷基、芳基、雜原子取代的烷基和芳基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳炔基、環烷基、環烯基；
            
且其中R1、R2和R3獨立地選自H、烷基、芳基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、環烷基、環烯基、雜烷基、雜芳基、鹵化物、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、氨基；或
            
其中R1選自H、烷基、芳基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、環烷基、環烯基、雜烷基、雜芳基、鹵化物、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、氨基，且NR2R2是從環狀仲胺衍生的；
            
該組合物進一步包含抗微生物藥、抗菌藥、抗真菌藥、抗寄生物藥或抗病毒藥。
            
29.權利要求28所述的組合物，其中所述的抗菌藥包括抗結核藥。
            
30.權利要求29所述的組合物，其中所述的抗結核藥包括利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇。
            
全文摘要
            
用于治療由傳染原導致的疾病，特別是結核的方法和組合物。特別地，提供了用于治療傳染性疾病的方法和包含取代的乙二胺類的組合物。在一個實施方案中，這些方法和組合物用于治療分枝桿菌感染，包括，但不限于結核。在某些實施方案中，本發明包括組合物，這些組合物包含新穎的取代的乙二胺化合物，進一步包含抗結核藥，諸如利福平、異煙肼、吡嗪酰胺和乙胺丁醇。
            
文檔編號C07C211/00GK101636376SQ200680031468 
            
公開日2010年1月27日 申請日期2006年7月3日 優先權日2005年7月1日
            
發明者M·N·普羅托波波娃, L·恩克, B·尼克南科, P·陳 申請人:賽奎拉公司
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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